JPH10506407A

JPH10506407A - 睡眠の誘導方法

Info

Publication number: JPH10506407A
Application number: JP8512064A
Authority: JP
Inventors: リチャードエイラーナー; デイルボガー; ベンクラヴァット; ゲアリーイーシューズダック; スティーヴンジェイヘンリクセン
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-09-27
Filing date: 1995-09-27
Publication date: 1998-06-23
Also published as: DE69532130T2; ATE253907T1; DE69532130D1; EP0781130B1; EP0781130A4; CA2200208A1; EP0781130A1; WO1996009817A1; US5612380A

Abstract

(57)【要約】睡眠がシス−９，10−オクタデセノアミドを含む脂肪酸一級アミドの投与により誘発し得る。更に、断眠が、シス−９，10−オクタデセノアミドを含む脂肪酸一級アミドの存在に関して脳脊髄液を分析することにより評価し得る。脳脊髄液中のシス−９，10−オクタデセノアミドの存在は比較の断眠と相関関係がある。

Description

【発明の詳細な説明】睡眠の誘導方法発明の分野本発明は、睡眠の誘導方法及び睡眠剥奪の評価に関する。特に本発明は、cis- 9,10- オクタデセノアミドを含む脂肪酸の第一アミドの投与による睡眠の誘導方法、及びcis-9,10- オクタデセノアミドを含む脂肪酸の第一アミドに関して脳脊髄液を分析することにより睡眠剥奪を評価する方法に関する。背景睡眠は、その間に身体が休息してその生理学的な力が回復する、自然の周期的な行動状態である。それは、環境に対する反応性の損失を特徴とする。睡眠中には、身体及び脳の両方のある種の生理学的プロセスが、油断なく気を配っている眠らないでいる状態とは異なって機能する。通常の睡眠は少なくとも２種類の行動状態からなる。脳電図が大きい振幅のゆっくりした波からなる同調睡眠、及び脳電図のパターンが高周波数及び低振幅の波を特徴とする非同調睡眠（ＤＳ）又は迅速な眼の動きを特徴とする賦活睡眠（レム睡眠）である。同調睡眠は更に、ゆっくりした規則的な呼吸、比較的一定の心拍数及び血圧、及びデルタ波の支配を特徴とする。同調睡眠は通常、そのあとに一定期間の賦活睡眠が続く４段階からなる。各サイクルは８０乃至１２０分継続する。これに対し、非同調睡眠は更に、不規則な心拍数及び呼吸、不随意筋の反射及び運動の期間、及び覚醒の高い限界値を特徴とする。非同調睡眠の期間は５乃至２０分継続し、通常の夜の睡眠には約９０分間隔で起こる。睡眠の剥奪は、種々の睡眠障害及び環境因子のいずれかから生ずる。不眠症は、個体が睡眠を開始又は維持することができない一般的な睡眠障害である。先行技術には、完全な睡眠サイクルを誘導する公知の薬学的方法も、睡眠の剥奪を評価するための生理学的試料を使用する公知の方法もない。睡眠障害の診断及び治療は、患者の睡眠剥奪の程度の確認及び／又は定量が助けになる。不幸なことに、患者により報告される睡眠剥奪の程度を客観的に定量又は確認することが困難であることがしばしばである。睡眠剥奪と相互に関連しうる患者により発生する生化学的生成物が必要である。脳脊髄液は、脳の４つの脳室及び脳及び脊髄のまわりのクモ膜下腔内を循環する透明な無色の流体である。脳脊髄液は、第三及び第四の側脳室脈絡叢により分泌される血液の限外濾過液として生ずる。脳脊髄液は又、神経リンパ液と呼ばれる場合もある。４つの脳室及びクモ膜下腔を通過した後、脳脊髄液は主としてクモ膜柔毛を経て静脈系に再吸収される。脳脊髄液は、それに浸された組織から異化代謝産物、排出物、及び廃棄物質を除去するための媒体として役立つ。現在まで、睡眠剥奪と相互に関連すると報告された脳精髄液から誘導された因子はない。睡眠剥奪と相互に関連する、被験者より発生する生化学的因子を識別するための脳精髄液を分析する方法が必要である。例えばB.Samuelsson,Les Prix Nobel 1982,pp.153-174 のように、精液のプロスタグランジンの発見から、重要な生理学的プロセスにおける脂肪酸及びそれらの誘導体の役割の認識が増大してきた。脂肪酸の第一アミドは先行技術においては睡眠誘導又は睡眠剥奪の分析とは結び付けて考えられてはいない。脂肪酸の第一アミドはウシの腸間膜からの血管由来の成分として認識されている。（K.Wakamatsu,T.Masaki,F.Itoh,K.Kondo,K.Su do,Biochemical and Biophysical Research Communications(1990):vol.168(2), pages423-429。）脂肪酸の第一アミドは又、いかなる機能にも帰することなくヒトの血漿中に認められている。(E.Arafat,J.W.Trimble,R.N.Andersen,C.Dass,D. M.Desiderio,Life Sciences(1989):vol.45(18)pages1679-1687。)要約睡眠が剥奪されたネコの脳脊髄液から、分子を単離し、化学的に特性決定して、cis-9,10- オクタデセノアミドであると確認した。この化合物の構造は、質量スペクトル（ＭＳ）、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外スペクトル（ＩＲ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び化学的分解法により決定した。cis-9,10- オクタデセノアミド以外の脂肪酸の第一アミドは、ネコ、ラット及びヒトの脳脊髄液の天然成分として確認され、それらの化合物が異なる系統の脳脂質を構成することを示した。特別意味深いことに、合成したcis-9,10- オクタデセノアミドは、ラットに注射すると睡眠誘導性を示した。総合すればこれらの結果は、脂肪酸の第一アミドが新しい種類の生化学的な信号分子であることを教示する。本発明の一面は、脂肪酸の第一アミドの投与により被験者に睡眠を誘導する方法に関する。好ましい脂肪酸の第一アミドには不飽和を有するアルキル連鎖が含まれ、以下の式：ＮＨ₂Ｃ(Ｏ)(ＣＨ₂)_nＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ₂)_mＣＨ₃ （式中、ｎは６≦ｎ≦１１であり、ｍは５≦ｎ≦８である。）で表される。アルキル連鎖の不飽和はcis 配置でもtrans配置でもよい。好ましい脂肪酸の第一アミドはcis-9,1 0-オクタデセノアミドである。その他の好ましい脂肪酸の第一アミドには、tran s-9,10- オクタデセノアミド、cis-8,9-オクタデセノアミド、cis-11,12-オクタデセノアミド、及びcis-13,14-オクタデセノアミドが含まれる。脂肪酸の第一アミドの好ましい投与経路には、腹腔内注射(ip)、皮下注射(sc)、筋肉内注射(im) 、経口摂取(pi)、脊髄注射、及び頭部注射が含まれる。好ましい１日量は１mg乃至１０ｇである。本発明の別の面は、患者の相対的な睡眠剥奪の程度を評価する方法に関する。相対的な睡眠の剥奪は、対照標準の被験者に対して測定する。脳脊髄液の試料を患者から得た後、脂肪酸の第一アミドに関連するＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）ピークの存在を確認するために分析する。好ましい分析方法においては、脳脊髄液の試料をＨＰＬＣにより分別する。次いで脂肪酸の第一アミドに関連するピークを質量スペクトル分析により確認する。次いで、患者の相対的な睡眠剥奪の程度を決定するために、患者の脳脊髄液を、対照標準の被験者から得られた脳脊髄液と比較し、同様にして分析する。本発明の別の面は、脂肪酸の第一アミドと結合する分子を単離する方法に関する。その方法は、被験者の分子を固相支持体に固定させた脂肪酸の第一アミドと接触させる工程を用いる。次いで結合した分子を、固定させた脂肪酸の第一アミドから溶離することにより単離してもよい。図面の簡単な説明図１は、対照標準の被験者から得られた脳脊髄液のＨＰＬＣ分別を示す。脊髄液のＨＰＬＣ分析は、Micro monitor を用い、Pharmacia LKB Biotechnology SM ART Systemで実施する。分別を実施するのに、“μRRC C2/C18,SC 2/10”カラムを使用した。１％のアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）勾配を用い、１００ μl/min の流量を保持した。分別回収器により、２つの波長、２１５及び２８０ nmにおける吸収を追跡する検出器から直接試料を回収した。図２は、睡眠を剥奪された被験者から得られた脳脊髄液のＨＰＬＣ分別を示す。ＨＰＬＣ分別を分析すると、５４分に生ずる主要な新しいピークがcis-9,10- オクタデセノアミドの存在と関連することが分かる。図３は、図２に示されるピークに対応するフラクションから得られる化合物の質量スペクトルを示す。非共有結合二量体とNa⁺（[M + Na⁺]⁺= 304 Da）及びK⁺ （[M + K⁺]⁺= 320 Da）付加物の観察から、観察された問題の化合物の質量（[M + H⁺]⁺= 282 Da）はより大きな化合物のフラグメントではないことが確認される。図４は、親イオン、m/z = 282 に関するMS²データを示す。図５は、娘イオン、265 に関するMS³データを示す。明らかにするために、スペクトルに親イオン、282 が加えてある。図６は、娘イオン、247 に関するMS³データを示す。明らかにするために、スペクトルに親イオン、282 が加えてある。図７は、天然の薬剤、cis-9,10- オクタデセノアミド（１）、関連類似物（２ −６）、及び（３）の前駆物質である化合物（７−１１）の構造を示す。化合物（６）は、天然に産出するＣ₂₂脂肪酸アミドの好ましい構造である。図８は、脳脊髄液から単離された天然の化合物及びそれらの合成物に関して得られた縦並びの質量スペクトルを示す。スペクトル（Ａ）及び（Ｃ）は、それぞれ天然のＣ₁₈及びＣ₂₂薬剤に関して得られたフラグメント化データを表す。スペクトル（Ｂ）及び（Ｄ）は、それぞれ合成したcis-9,10- オクタデセノアミド及びcis-13,14-オクタデセノアミドに関して得られたフラグメント化データを表す。詳細な説明略語：衝突誘導解離（ＣＩＤ）、質量分析法／質量分析法（ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ²）、質量分析法／質量分析法／質量分析法（ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ³）、特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）。睡眠剥奪及びネコの脳脊髄液の採取法：これらの研究には、４匹の成熟した特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）のネコ（ニュージャージー州リバティー・コーナー(Liberty Corner)にあるリバティー研究所(Liberty Laboratories)）を使用した。試料を採取する際の被験者の体重は３．０乃至４．２kgであった。長期にわたる脳室内カニューレを確立するために、被験者をまず一般的な麻酔（ハロタン）下におき、挿管してネコの脳定位固定装置(カリフォルニア州ツジュンガ(Tu junga)にあるデイピド・コフ・インコーポレーテッド(David Kopf Inc.))内に拘束した。次いで頭の円蓋に穿頭孔をあけ、第四の脳室（２匹のネコ）又は右の側脳室（２匹のネコ）のいずれかにステンレス鋼のカニューレ（バージニア州ローノーク(Roanoke)にあるプラスチック・プロダクツ(Plastic Products)）を挿入した。配置したカニューレの開通性は、カニューレの外側先端から透明な脳脊髄液（ＣＳＦ）が自然に流れるのを観察することにより、又はマイクロリットルシリンジ（ネバダ州レノ(Reno)にあるハミルトン・カンパニー(Hamilton Company) ）でカニューレから脳脊髄液を抜きうることにより確認した。次いでカニューレ及び固定した内部スタイレットを頭蓋内に入れて歯科用のアクリルセメントで固定した。生化学的な流体を採取する前に被験者を少なくとも２週間回復させた。被験者は、調整した温度で１２時間の明／暗照明周期（照明は午前６時３０分につけ、午後６時３０分に消す）で飼育室内に集団で飼った。脳脊髄液の試料は午前１０時及び１２時３０分の間に抜き取った。脳脊髄液を採取するには、内部スタイレットを除去して移植したカニューレの先端より１mm先に小さな直径のカニューレを挿入した。次いで脳脊髄液を１００μl の容量のハミルトンシリンジに抜き取り、直ちに小さなプラスチックの容器(Eppendorf微小遠心管）に入れ、ドライアイスを充填したバケットに入れた。次いで分析するまで試料を−７０℃の冷凍庫に移した。このようにして全部で６つの試料を採取した。個々の試料の容量は１５０乃至３００μl であった。この手順の他に、２匹のネコを密閉したゆっくり動く足踏み車上に２２時間おき、睡眠剥奪を強いた。これらの被験者の脳脊髄液試料をこの睡眠剥奪期間中に採取した。最後に、大槽内に鋭形の皮膚を通す穿刺を刺すことにより脳脊髄液試料を採取した。ＨＰＬＣ実験：脳脊髄液の予備的なＨＰＬＣ分析は、Micro monitor を用い、 Pharmacia LKB Biotechnology SMART Systemで実施した。分別を実施するのに、 “μRRC C2/C18,SC 2/10”カラムを使用した。１％のアセトニトリル／水（0.1 ％ＴＦＡ）勾配を用い、１００μl/min の流量を保持した。分別回収器により、２つの波長、２１５及び２８０nmにおける吸収を追跡する検出器から直接試料を回収した。ＨＰＬＣと質量分析計との直結もMichrom ＨＰＬＣを用いて実施した。物理的分析睡眠を剥奪されたネコの脳脊髄液からの、化学式がＣ₁₈Ｈ₃₅ＮＯの化合物の単離を報告する。モデル化合物の合成及び評価及び候補の構造に基づいて、データは末端が第一アミドのモノ不飽和アルカン連鎖に匹敵しうることが分かった(M.K .Jain et.al.,(1992):J.Med.Chem.,vol.35,page 3584)。電気噴霧ＭＳ、ＧＣ− ＭＳ、ＴＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、及び化学的分解法を使用することにより、単離したＣ₁₈Ｈ₃₅ＮＯの構造が、図７の化合物（１）として示されるcis-9,10- オクタデセノアミドであることが示された。この結果は速い原子衝撃（ＦＡＢ）及び電気噴霧質量スペクトル分析と一致する。cis-9,10- オクタデセノアミドがアルキル連鎖の長さ及びオレフィンの位置及び立体配置が異なる脂肪酸の第一アミドの一群のほんの一であることが示され、ラット及びヒトの脳脊髄液中には関連化合物も検出しうる。重要なことに、合成したcis-9,10- オクタデセノアミドは、被験者の動物、例えばラットに注射した場合に睡眠を誘導する性質を示すことも本出願人は示す。天然化合物の初期電気噴霧質量分析は、m/z 282[M + H]⁺、304[M + Na]⁺、320 ［M + K］⁺、及び564［2M + H］⁺の質量ピークを示し、化合物の分子量が281 Da (1)であることを示す。高分解能ＦＡＢ−ＭＳ分析によれば、［M + Na］⁺イオンの正確な質量測定が可能であり、観察された質量はm/z 304.2614±0.0006 Daであった。この測定により元素の組成が決定され、[M + Na]⁺の計算値がm/z 304.2 616 Da である分子式Ｃ₁₈Ｈ₃₅ＮＯに最もよく適合する。縦に並んだ質量分析は、低分子量範囲の独特なフラグメント化パターンが他の連鎖アルカンと一致することを示した（図８Ａ）。親イオンからの連続した１７及び３５の中性損失は、アンモニア次いで水の損失を示した。m/z 265 及び247（1）の娘イオンについて追加のＭＳ³実験を実施した。種々の合成した候補物質の構造についてＭＳ²及びＭＳ³のような質量分析を実施した。α‐アミノケトンはフラグメント化パターン分析により天然の薬剤とは容易に区別可能であた。△^3,4-1-ヒドロキシ-2 - アミノオクタデカジエン(1)は、ＭＳ²実験における低分子量フラグメントの相対的強度が違うだけで天然脂質とほとんど同一のフラグメント化を示した。数種の生成物は天然物質のスペクトルと全く同様スペクトルを示すけれども、図７Ｂに示すように、cis-9,10- オクタデセノアミドのようなモノ不飽和脂肪酸アミドから発生するフラグメント化パターンだけは、内生脂質のそれと正確にあう。cis-9,10- オクタデセノアミドの親イオンからの１７質量単位の中性損失は、分子がまずその末端アミド基の炭素−窒素結合においてフラグメント化し、アンモニアを放出することを示す。図９Ｃ及び９Ｄに示されるように、ＭＳ²及びＭＳ³フラグメント化パターンが合成したcis-13,14-ドコセノアミドのそれと区別できないことから、質量分析からも、ヒト及びラットの脊髄液から得られる化合物の分子式はＣ₂₂Ｈ₄₃ＮＯであることが確認された。天然化合物のＣ₂₂Ｈ₄₃ＮＯ及び合成したcis-13,14-ドコセノアミドはＴＬＣ上に同一の溶離特性を示し、オゾン分解実験は、Ｃ₂₂天然薬剤のオレフィンが13,14-位であることを示す。 cis-9,10- オクタデセノアミド及びＣ₁₈天然脂質は、ＴＬＣ及びＧＣ−ＭＳ上に同一の溶離特性を示す。ＴＬＣ（SiO₂）は７５％のアセテート／ヘキサンを用いると０.３のＲ_fを提供した。ＧＣ−ＭＳ分析は、5971A Hewlett Packard 質量選択的検出器を具備する5890 Hewlett Packard GC で実施した。分割は、長さ３０ｍ、内径０.２５mmのDB-5（０.２５mmフィルム）毛細管カラムで実施した。カラム温度は、５０℃から２９０℃まで２０℃／分の速度で上昇させるように計画した。カラムは、２９０℃の最終温度において更に１０分間保持した。インゼクターの温度は２５０℃で、検出器の温度は２９０℃であった。化合物は、ＣＨ₂C l₂溶液としてＧＣに注入した。ＥＩ測定における電子エネルギーは、１スキャン／秒で７０eVであった。保持時間：合成したcis-9,10- オクタデセノアミド、１６.９５分；天然化合物、１６.９６分。しかしながら、これらの分析的技術では密接に関連する合成した脂肪酸アミドの二重結合の位置及び立体配置は検出できず、cis-8,9（3）、cis-8,9（1）、ci s-11,12（4）、及びtrans-9,10（2）オクタデセノアミドはＴＬＣ及びＧＣでは天然化合物とは区別できなかった。 cis-9,10- オクタデセノアミド、cis-11,12-オクタデセノアミド、及びtrans- 9,10- オクタデセノアミドを以下のようにしてそれぞれの酸から調製した。cis- 9,10- オクタデセン酸（オレイン酸）のＣＨ₂Cl₂（０.２Ｍ）溶液を０℃において塩化オキサリル（３当量）で処理し、２５℃において４時間攪拌した。溶媒を除去して、０℃においてＮＨ₄ＯＨの飽和水溶液で処理するとcis-9,10- オクタデセノアミドが得られ、このものをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（４０〜７５％酢酸エチル−ヘキサン勾配溶離）で精製した。cis-8,9-オクタデセノアミドは以下のようにして合成した。１）スベリン酸モノメチルエステルのＴＨＦ溶液を−２０℃においてＢＨ₃-ＴＨＦ(１.０５当量)で処理し、２５℃において１２時間攪拌するとメチル8-ヒドロキシオクタノエート（１８）が得られる。２）メチル8-ヒドロキシオクタノエートのＣＨ₂Cl₂溶液を０℃においてＣBr₄(１. ３当量)及びPh₃Ｐ（１.４当量）で逐次処理し、４℃において１０時間攪拌するとメチル8-ブロモオクタノエートが得られる。３)メチル8-ブロモオクタノエートをＣＨ₃ＣＮ（０.８Ｍ）中に溶解させ、還流温度に暖めた。Ph₃Ｐ（１.１当量）を溶液に添加し、２０時間攪拌を継続すると対応するホスホニウム塩が得られた。４）メチル8-ブロモオクタノエートのホスホニウム塩を２５℃においてＴＨＦ中に溶解させ、ＫＨＭＤＳ（１.１当量）で処理した。還流温度で１時間攪拌した後、溶液を−７８℃に冷却し、デカナール（１.５当量）を添加した。混合物を２５℃に暖め、３０分間攪拌すると、メチルcis-8,9-オクタデセノエートが得られる。５）メチルcis-8,9-オクタデセノエートをＴＨＦ−ＣＨ₃ＯＨ−Ｈ₂Ｏ (３：１：１)中でLiＯＨ（３当量）を用いて加水分解すると、cis-8,9-オクタデセン酸が得られる。６）cis-8,9-オクタデセン酸のcis-8,9-オクタデセノアミドへの変換は以下のようにして実施した。ＩＲ、ＮＭＲ、及び化学的分解法により、そのオレフィンの位置及び立体配置を含む内生脂質の正確な構造をあいまいでなく決定した。天然化合物のアルキル連鎖に沿った二重結合の位置は化学的分解により決定した。(O.S.Privett,Progr ess in the Chemistry of Fats and Other Lipids(1966):vol.9,page 91)。化学的分解技術をまず合成した脂肪酸アミドについて使用し、このものの分析に貢献するオゾン分解で確認した。天然薬剤のオゾン分解は以下のようにして実施した。約１００mgの天然脂質をＣＨ₂Cl₂（３００ml）中に溶解させ、−７８℃に冷却した。６００mlのオゾン飽和ＣＨ₂Cl₂（−７８℃で発生）を混合物に添加し、−７８℃において３０分間攪拌を継続した。反応混合物をアルゴンでパージすることにより、過剰のオゾンを除去し、オゾン生成物をジメチルスルフィド(過剰)の添加により還元した。反応混合物を０℃に暖めて１時間攪拌し、次いで２５℃で１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を５０mlのジエチルエーテル中に再び溶解させ、ＧＳ／ＭＳにより直接分析した。天然脂質から誘導されたオゾン分解反応混合物のＧＳ−ＭＳ分析により、存在する唯一のＣ−末端アルデヒドがノニルアルデヒドであることが明らかになった。ＧＳ／ＭＳ分析は前述のようにして実施した。アルデヒド生成物を分析するのに使用したＧＳプログラムは以下のとおりであった。５０℃の初期温度において４分後、カラムの温度を２００℃の最終温度に達するまで１０℃／分の速度で上昇させた。カラムの温度を２００℃に更に５分間保持した。保持時間：ノニルアルデヒド、１０.７８分；天然化合物のオゾン分解反応、１０.７６分。ノニルアルデヒドは、アルキル連鎖の末端メチル基から７つのメチレンを除去したオレフィンの位置に対応し、Ｃ₁₈脂肪酸の第一アミドの場合には9,10- 位である。その天然化合物（ニート）のIRスペクトルは3354及び3320（アミドN-H 伸縮）、2923及び2851（アルカン伸縮）、1656及び1630（アミドＩバンド及びIIバンド）、1466、及び1410cm^-1で吸収を示した。シス−９，10−オクタデセノアミドは天然薬剤のFTIRスペクトルと同一のFTIRスペクトルを示したが、単一の特徴の相違が内在性脂質及びトランス−９，10−オクタデセノアミドのIRスペクトルで観察された。何となれば、トランス異性体のみが960cm^-1で強い吸収ピークを示したからである。天然化合物又はシス−９，10−オクタデセノアミドのいずれもが二置換トランスアルケンの特徴的なこのIR吸収バンドを示さなかった(W.W.Chris tie，Lipid Analysis，Pergamon Press，Oxford，1973，128頁)。徹底的な単離努力により、本発明者らは最終的に内在性脂質約300mg を得ることができ、これはその化合物についてプロトンNMR データを得るのに充分な量と判明した。前記天然化合物のHPLC単離後に、HPLCフラクションを合わせ、濃縮し、最小容積のCH₂Cl₂中で再度懸濁させた。粗生成物のシリカゲルクロマトグラフィー（40〜75％の酢酸エチル／ヘキサン）は天然化合物約300mg を与えた。d1.2におけるグリースを含む残留不純物は、合成シス−９，10−オクタデセノアミドと比較した時にこの領域における¹H NMRピーク強さの変化の原因である。¹H NMRスペクトル(CD₃OD，400 MHz)は下記のピークを示した。d5.24(多重線，2H，オレフィン性プロトン)，2.09(三重線，2H，H₂NC(O)CH₂)，1.93(多重線，4H，アリルのプロトン)，1.50(多重線，2H，H₂NC(O)CH₂CH₂)，1.50-1.23(多重線，アルキルメチレンプロトン),及び0.805(三重線，3H，CH₃)。トランス−及びシス−９，10− オクタデセノアミドの¹H NMRスペクトルと比較した時、天然化合物及びシス−９，10−オクタデセノアミドは同一であり、トランス−９，10−オクタデセノアミドとは明らかに異なっていた。天然脂質及びシス−９，10−オクタデセノアミドのサンプルはトランス異性体とは¹H NMRスペクトルのオレフィン性領域及びアリルの領域の両方で区別することができた。トランス異性体のオレフィン性プロトンはCD₃OD 中でd 5.28にあるが、天然化合物及びシス異性体のオレフィン性プロトンはわずかに上の磁場にd 5.24にシフトされる。NMR スペクトルのアリルの領域において、天然化合物及び合成シス異性体の両方がd 1.94から1.91までの範囲の４プロトンピークを有し、一方、トランス異性体のアリルのプロトンがd 1.88 〜1.86で観察される。痕跡量のトランス脂肪酸アミドは天然サンプル中に同様に存在することが明らかであり、おそらくこの薬剤がまた脳の内在性成分であることを示す。非反芻生物からの組織脂質中の殆どのトランス脂肪酸はおそらく食事源のみに由来する(R.P.Mensink及びM.B.Katan，Prog.Lipid Res.32，111(1993)) 。証拠はこれらの外在性トランス脂肪酸が正常に代謝され、脳脊髄液からのトランス−９，10−オクタデセノアミドの同定が食用エライジン酸からそのアミド誘導体への自然変換を示し得ることを示唆する。エライジン酸はヒト脳脂質の痕跡成分として同定されていた(R.O.Adlof及びE.A.Emken，Lipids21，543(1986))。また、単離操作中のわずかな異性化が少量のトランス異性体の存在を説明することができた。こうして、MS、GC、TLC、IR、NMR、及びオゾン分解の使用により、未知の天然脂質の構造がシス−９，10−オクタデセノアミドであると測定された。質量分析法質量分析法実験をAPI III パーキン・エルマーSCIEX 三−四極質量分析計及びFisons/VG ZAB-VSE 高分解能磁気セクター質量分析計で行った。 SCIEX に関する空気補助電子噴霧インターフェースを5.0 kVに維持されたインターフェース噴霧装置の電位によるサンプル導入に使用した。インターフェースプレートとサンプリングオリフィスの間の超純粋な窒素のカーテンガス(1.0リットル／分)を適用して帯電された液滴の脱溶媒和(desolvation)を助け、粒状物が分析装置領域に入ることを防止した。サンプルを4.0 ml／分の速度でインターフェースを通って導入した。イオン蒸発法により生じた陽イオンがインターフェースプレート及び100 mmのオリフィスを通って分析装置に入った。デクラスタリング (declustering)電位を50-250 V(典型的には100 V)に保って侵入イオンの衝突エネルギーを調節した。低温ポンプを使用して分析計中の表面を冷却(14-18K)して 2x10^-5トールの作用圧力及び分析装置領域中の8x10^-8トールのシール圧力を保った。Fisons/VG ZAB-VSE 装置を使用して高速原子衝撃(FAB)分析による未知の化合物の正確な質量測定を行った。10,000の分解能(10 ％のバレイ・デフィニッション(valley definition))を得て0.7ppm以内までの正確な質量測定を行った。衝突誘導解離(CID) CID 実験をAPI III パーキン・エルマーSCIEX 三−四極質量分析計で衝突ガスとして超純粋アルゴン(>99.99 ％の純度)を用いて行った。陽イオンMS/MS データを、第一四極による前駆体イオンの質量選択、第二四極で生じた解離中のアルゴンとの衝突(3 x 10¹⁴原子/cm²のターゲット厚さ)により獲得した。第三の四極は得られた娘イオンを質量分析した。80 eV の衝突エネルギーをこれらの実験で維持した。示されたCID スペクトルは、50以上のシグナル対ノイズを得るのに必要なスキャンの数に応じて50〜100 スキャンの平均の結果であった。また、MS/MS/MS(MS³)データを、オリフィスで生じた娘イオンを第一の四極質量分析装置で質量選択することにより得た。第二の四極衝突セル中のアルゴンとの衝突(3 x 10¹⁴原子/cm²のターゲット厚さ)は更なる解離を生じ、得られた孫娘イオンを第三の四極質量分析装置で分析した。結果ネコの脳脊髄液のHPLC分析は、正常なネコではなく断眠ネコ中に存在するピークを生じた。その同定を、質量分析法を含む物理的特性決定により測定した。このピークの初期電子スプレー質量分析はm/z=282、304、320、及び564 を明らかにした（図３）。これらのピーク［M+ H⁺］⁺（m/z=282）、［M+Na⁺］⁺(m/z= 304)、［M+ K⁺］⁺（m/z=320）、及び［2M+H⁺］⁺（m/z=564）の観察は、化合物の分子量が281 Daであるという指標であった。陽イオン付加物及び非共有結合二量体は、そのイオンが更に高い分子量の化合物の断片ではないことを示唆する。加えて、282［M+ H⁺］⁺ピークの同位元素パターンの分析（図３）は１質量単位により分離された同位元素を明らかにし、こうしてこれが更に高い分子量の化合物に相当する多重荷電イオンであるという可能性を排除した。高速原子衝撃質量分析法による高分解能分析は質量=304.2614 ±.0006 Daで観察された［M + Na⁺ ］⁺イオンの正確な質量測定を可能にした。この測定は元素組成の測定及び分子式C₁₈H₃₅NO、計算［M + Na⁺］⁺質量=304.2616 Daに関する最良のフィットを可能にした。強いプロトン化シグナルは、その化合物がNa⁺の存在下でさえも高いプロトンアフィニティーを有することを示し、その化合物がアミンであることを示唆した。この化合物に関する構造上の情報を得るために、タンデム質量分析を行った。このフラクションのタンデム質量分析（図４）はその他の長鎖アルカンと合致して低分子量範囲に特有の断片化パターンを明らかにした。親イオンからの17及び35の中性損失はアンモニア続いて水の損失を示した。付加的なMS³実験を娘イオン265 及び247 について行った。MS³実験（図６）は、265 娘イオンが断片化して247 孫娘イオンを生成することを明らかにした。これは、247 が265 娘イオンとは独立の中性損失とは反対に連続の損失（17｛-NH₃）｝続いて18｛-H₂O）｝の損失）の結果であることを示唆する。 265 イオンのMS³スペクトル中に生じた249 イオンはHPLCフラクション中の別の成分からのものであることが測定された。281 イオンのCID 分析は夫々イオン 265 及び249 を生成する16及び32の損失を明らかにした。249 イオンはおそらく m/z=265 の娘イオンから生じた、親イオン、m/z=281 からの孫娘イオンである。シス−９，10−オクタデセノアミドについて集めたデータを表１に一部要約する。睡眠の誘発に関するプロトコル合成シス−９，10−オクタデセノアミドを、異なる投薬量：１(n=2)、２(n=2) 、５(n=7)、10(n=10)、20(n=2)、及び50(n=2)mg（ｎ＝試験したラットの数）で自発行動に関するその効果を試験するためにラットに注射(ip)した。光サイクルをオフにした２時間後の反転暗期間(12:12)中にラットに注射し、それらのホームケージ中で観察した。低投薬量（１mg及び２mg）では、自発行動に関する顕在効果が見られなかった。しかしながら、５mgの閾値及びその上では、正常な睡眠に特徴的な閉じられた眼、鎮静された挙動と関連する長く持続する運動休止の誘発からなる顕著な効果があった。また、正常な睡眠について、ラットは依然として定位反射による聴覚刺激に応答し、刺激の源に対する注意を持続した。加えて、運動挙動が損なわれた。投与後の挙動鎮静の潜伏期は約４分であり、被験者は通常１時間（５mg）、２時間（10mg）、又は2.5 時間（20mg及び50mg）後に再度活性であった。本発明者らはシス−９，10−オクタデセノアミドをビヒクル及び図７にリストされた合成類縁体と比較してその睡眠誘発ポテンシャルの構造特異性を推定した。ビヒクル（食塩溶液中５％のエタノール）又はオレイン酸(5)のいずれもが顕在挙動効果を示さなかった。トランス−９，10−オクタデセノアミドはそのシス相対物と同様の薬理効果を示したが、その睡眠誘発性について比較的短い期間により測定して効力が極めて小さかった（ラット当たり10mgでは、生物学的効果はトランス異性体について１時間持続し、またシス異性体について２時間持続した）。オレフィンがアルキル鎖に沿っていずれかの方向に（8,9（3）位又は11,12 （4）位に）移動された場合、又はアルキル鎖長が22の炭素まで延長された時(6) 、薬理効果の程度及び期間の両方のかなりの減少が観察され、又ラットの運動性が依然として低下している間に、それらの眼は開いたままであり、それらの警戒はほんのわずかに影響されることが明らかであった。最後に、シス−９，10−オクタデセノアミドを注射されたラットに関するポリソムノグラフィー(polysomno graphic)研究は、ビヒクル対照と比較した時に徐波睡眠(SWS)の全時間だけでなくSWS 個々期間の平均の増加を示す。更に特別には、雄SDラット（手術時に300g ）にハロタン麻酔（２〜３％）下に睡眠記録のための電極の通常のセットを移植した。これは被験者の脳電図(EEG)を記録するための海馬の上の頭頂骨中に置かれた二つのスクリュー電極と、筋電活性(EMG)により体位トーンを記録するための頸部筋系中に挿入された二つのワイヤ電極を含んでいた。ラットを食物及び水への随時の接近により個々に収容した。暗−光サイクルを調節した(12:12、10:00p .m.に光)。手術の１週間後に、ラットを少なくとも３日にわたって記録条件に順応させた。順応期間の完結後に、ラットは２ml(ip)のビヒクル（５％のエタノール／食塩溶液）、シス−９，10−オクタデセノアミド(10mg)、又はオレイン酸(1 0mg)のいずれかを受けた。ラットをip注射後の４時間(12:00 p.m．〜4:00 p.m.) にわたって連続的に記録した。ラットを一方向ウィンドーにより挙動の自発変化について観察した。睡眠記録を目視でスコアーを付け、４段階：覚醒、徐波睡眠１(SWS1)、徐波睡眠２(SWS2)、及び急速眼球運動(REM)睡眠を測定した。徐波睡眠(SWS)に関するこれらの増加は覚醒を犠牲にした。REM 睡眠の分布は変化されないように思われる。一緒になって、これらのデータは、シス−９，10 −オクタデセノアミドが徐波睡眠変調に重要な役割を果たし得ることを示唆する。細胞構築の受動的構造要素としての脂質分子の従来の考えは、これらの薬剤が細胞シグナルを変換し、細胞挙動を変更する際に果たす活性な役割の絶えず増大している見解に迅速に屈しつつある（例えば、M.Liscovitch及びL.C.Cantley,Ce ll(1994): 77巻，329頁）。ここで研究された脂肪酸アミドの魅力的な特徴は、それらが簡単な分子のファミリーに属し、その中で多くの多様性がアルカン鎖の長さ並びにその一つ以上のオレフィンの位置、立体化学、及び数を単に変化することにより生じ得ることである。重要なことに、それらのカルボキシ末端にアミド修飾を有するその他の神経活性シグナリング分子が、カルボキサミド末端ペプチドからアラキドニルエタノールアミドに至るまで報告されていた。カルボキサミド末端ペプチドを使用する神経活性シグナリング分子がB.A.Eipper、D.A.Stof fers、及びR.E.Mains によりAnnu.Rev.Neurosci．(1992): 15 巻，57頁に開示されている。アラキドニルエタノールアミドを使用する神経活性シグナリング分子がW.A.Devane、L.Hanus、A.Breuer、R.G.Pertwee、L.A.Stevenson、G.Griffin、 D.Gibson、A.Mandelbaum、A.Etinger、及びR.Mechoulam によりScience(1992): 258巻，1946頁に開示されている。シス−９，10−オクタデセノアミドはコア化学構造の簡単な変化が特異な生理学的成果を有する生物学的エフェクターの新規なクラスの一員であることが本明細書に開示される。固定された脂肪酸一級アミドの製造 18−ヘミスクシネート−シス−９，10−オクタデセノアミド(12)を使用して固定された脂肪酸一級アミドを製造でき、その合成が以下に示される。次いで18− ヘミスクシネートを、例えば、シグマキットにより与えられるような通常の材料及びプロトコルを使用して固相アフィニティークロマトグラフィーマトリックス材料にカップリングし得る。次いでその固定された脂肪酸一級アミドをそれとのアフィニティーを有する分子を結合し、又溶離によりこのような分子を単離するのに使用し得る。脂肪酸一級アミドの合成例示の脂肪酸一級アミドを合成するのに好ましいプロトコルがスキーム１及びスキーム２に示される。中間体及び最終生成物を特性決定する物理データと一緒にこれらの合成プロトコルの詳細が以降の節に示される。全ての脂肪酸一級アミドの基本的な合成プロトコルは、出発物質の異なる鎖長、生成物収率、及び種々のシス生成物及びトランス生成物の分離を除いて同一である。それ故、シス−９，10−オクタデセノアミド及び幾つかのその他の脂肪酸一級アミドの合成に関する合成プロトコルの例示の記載が示され、脂肪酸一級アミドの全クラスに関する合成プロトコルを説明するのに利用できる。合成方法シス−９，10−オクタデセノアミド(1) ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のオレイン酸(1.0g、3.55ミリモル、1.0 当量）の溶液を塩化オキサリル(5.32 mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64 ミリモル、3.0 当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH 水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル(EtOAc)(100 mL)とH₂O(100 mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、40〜100 ％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて白色の固体(0.810g、理論量0.996g、81. 3％)として１を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ6.06(bs，1H，NH₂C(O))，5.5 8(bs，1H，NH₂C(O))，5.32(m，2H，CH=CH)，2.16(t，2H，J=7.5 Hz，CH₂C(O)NH₂ )，2.02(m，4H，CH₂CH=CHCH₂)，1.61(m，2H，CH₂CH₂C(O)NH₂)，1.29(b s，14H, アルキルプロトン)，0.87(t，3H，CH₃); FABHRMS（NBA/NaI m/e282.2804（C₁₈H₃ ₅ NO + H⁺は282.2797を要する）。シス異性体とトランス異性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3 から5.2 までのオレフィンプロトン及びδ2.0 から1.8 までのアリルプロトンである。これらの領域は天然化合物をシス−９，10−オクタデセノアミドとして同定する。トランス−９，10−オクタデセノアミド(2) ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のエライジン酸(1.0g、3.55ミリモル、1.0 当量 )の溶液を塩化オキサリル(5.32 mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64 ミリモル、3.0 当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH 水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル(EtOAc)(100 mL)とH₂O(100 mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、40〜100 ％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて白色の固体として２を得た。シス異性体とトランス異性体を区別するスペクトルの領域はδ5.3 から5.2 までのオレフィンプロトン及びδ2.0 から1.8 までのアリルプロトンである。これらの領域はその化合物をトランス−９，10−オクタデセノアミドとして同定する。シス−８，９−オクタデセノアミド(3) ０℃のCH₂Cl₂(1.5mL、0.31M)中の11（0.130g、0.461 ミリモル）の溶液を塩化オキサリル(0.69 mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、1.38ミリモル、3.0 当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH 水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル( EtOAc)(100 mL)とH₂O(100 mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、40〜100 ％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離）にかけて白色の固体(0.105g、理論量0.130g、80.8％)として３を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz):δ5.70-5.34(m，4H，NH₂C(O)及びCH=CH)，2.2 1(t，2H，J=7.5 Hz，CH₂C(O)NH₂)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂)，1.63(m,2H,CH₂C H₂C(O)NH₂)，1.47-1.23(m，20H,アルキルプロトン),0.87(t，3H，RCH₃);FABHRMS （NBA/CSI m/e 414.1762（C₁₈H₃₅NO + Cs⁺は414.1773を要する）。シス−11，12−オクタデセノアミド(4) ０℃のCH₂Cl₂(8.9mL、0.4M)中のΔ11,12 オクタデセン酸(1.0g、3.55ミリモル、1.0 当量)の溶液を塩化オキサリル(5.32 mL、CH₂Cl₂中2.0Mの溶液、10.64ミリモル、3.0 当量）で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃に冷却し、飽和NH₄OH 水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物を酢酸エチル(EtOAc)(100 mL)とH₂O(100 mL)の間に分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15c m、40〜100 ％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて白色の固体として４を得た。オレイン酸(5) オレイン酸(5)(CAS #112-80-1)をアルドリッチ・ケミカル社（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から入手した。エルカミド(6) エルカミド(6)(CAS #28,057-7)をアルドリッチ・ケミカル社（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から入手した。メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート(7) -20 ℃のテトラヒドロフラン(THF)(32.0mL、0.25M)中のスベリン酸モノメチルエステル(1.5g、7.97ミリモル、1.0 当量)の溶液をBH₃・THF（THF中1Mの溶液、7 .97mL、7.97ミリモル、1.0 当量）で滴下して処理した。その反応混合物を一夜攪拌し、続いて室温に到達させた。次いでその反応混合物を酢酸エチル(100mL) で希釈し、メタノール(10 mL)及び10％のHCl（10 mL）で反応停止した。NaHCO₃( 1X 20mL)、水(2X 10mL)、そして食塩水(1X 10mL)で抽出して、メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート(7)を粗白色固体として得た。メチル−８−ブロモ−オクタノエート(8) ０℃のCH₂Cl₂(15 mL、0.48M)中の粗メチル−８−ヒドロキシ−オクタノエート（7、1.24g、7.13ミリモル、1.0 当量）の溶液をCBr₄(3.07g、9.27ミリモル、1. 3 当量)及びPPh₃(2.61g、9.98ミリモル、1.4 当量)で連続して処理し、その反応混合物を４℃で10時間攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O（ 8 x 10mLで洗浄）で繰り返して洗浄した。Et₂O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、ヘキサン)にかけて透明な無色の油(1 .25g、理論量1.69g、74.0％)として８を得た。¹H NMR(CDCl₃，250MHz): δ3.64( s,3H，C(O)OCH₃)，3.38(t，2H，J=6.8 Hz，CH₂Br)，2.29(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂ C(O)OCH₃)，1.83(p，2H，CH₂CH₂Br)，1.63(m，2H，CH₂CH₂C(O)OCH₃)，1.47- 1.2 8（m，6H，アルキルプロトン）。メチル−８−トリフェニルホスホラニル−オクタノエート−ブロミド(9) CH₃CN(4.0mL、1.31M)中の８（1.25g、5.23ミリモル、1.0 当量）の溶液をトリフェニルホスフィン(1.52g、5.75ミリモル、1.1 当量)で処理し、10時間にわたって還流させて攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン(0.685g、2.61ミリモル、0.5 当量)を反応混合物に添加し、攪拌を５時間にわたって還流下に続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O（5 x 10mLで洗浄）で繰り返して洗浄した。次いで残っている残渣を最小容積のCH₂Cl₂に溶解し、減圧で濃縮して無色のフォーム(2.20g、理論量2.61g、84.3％)として９を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ7.82-7.51(m，15H，ArH)，3.70-3.46(m，5H，CH₃OC(O)R及びCH₂PPh₃)， 2.13(t，2H，J=7.4 Hz，CH2C(O)OCH₃)，1.62-1.43(m，6H，アルキルプロトン)， 1.30-1.02(m，4H，アルキルプロトン); FABHRMS（NBA）m/e 419.2154(C₂₇H₃₂BrO₂ P-Br ^- は419.2140を要する)。メチル−シス−８，９−オクタデセノエート(10) 25℃のTHF（7.0mL、0.2M）中の９（0.71g、1.42ミリモル、1.0 当量）の溶液をKHMDS（3.0mL、THF 中0.5Mの溶液、1.5 ミリモル、1.06当量）で処理し、その反応混合物を還流下に１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78 ℃に冷却し、デシルアルデヒド(0.321mL、1.71ミリモル、1.2 当量)で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH₄Cl水溶液で処理し、EtO Ac(100mL)とH₂O（100mL）の間で分配した。有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、０〜２％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて無色の油(0.290g、理論量0.422g、68.7％)として10を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ5.34(m，2H，CH=CH)，3.65(s，3H，CH₃OC(O))，2 .29(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂C(O)OCH₃)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂)，1.61(m，2H ，CH₂CH₂C(O)OCH₃)，1.29(bs，20 H，アルキルプロトン)，0.86(t，3H，RCH₃) シス−８，９−オクタデセン酸(11) ０℃のTHF-MeOH-H₂O（3-1-1 比、4.1 mL、0.2M）中の10（0.245g、0.825 ミリモル、1.0 当量）の溶液をLiOH・H₂O（0.104g、2.48ミリモル、3.0 当量）で処理した。その反応混合物を25℃に温め、８時間攪拌し、次いでEtOAc（100mL）と H₂O（100mL）の間で分配した。有機層を10％のHCl H₂O 溶液(100mL)及び飽和NaC l水溶液(100mL)で連続して洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、10〜30％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて無色の油 (0.156g、理論量0.233g、67.0％)として11を得た。¹H NMR(CDCl₃，250MHz): δ5 .34(m，2H，CH=CH)，2.34(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂COOH)，2.01(m，4H，CH₂CH=CHC H₂)，1.61(m，2H，CH₂CH₂COOH)，1.47-1.23(m，20H，アルキルプロトン)，0.87( t，3H，RCH₃) 18−ヘミスクシネート−シス−９，10−オクタデセノアミド(12) CH₂Cl₂- CHCl₃（3-1、1.60mL、0.1M）中の18（0.047g、0.160M、1.0 当量）の溶液をEt₃N（0.045 mL、0.320 ミリモル、2.0 当量）、無水コハク酸(0.033g、0 .320 ミリモル、2.0 当量)及びDMAP（0.002g、0.016 ミリモル、0.1 当量）で連続して処理し、その反応混合物を25℃で10時間攪拌した。次いでその反応混合物をCH₂Cl₂(50 mL)とH₂O（50 mL）の間で分配し、その有機層を10％のHCl 水溶液( 50 mL)及び飽和NaCl水溶液(50 mL)で連続して洗浄し、乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、3cmx15cm、0〜10％のMeOH-EtOAc)にかけて白色の固体(0.051g、理論量0.063、80.3％)として12を得た。¹ H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ6.95(bs，1H，H₂NC(O))，5.72(b s，1H，H₂NC(O)) ，5.34(m，2H，CH=CH)，4.08(t，3H，J=6.6 Hz，CH₂OC(O)R)，2.61(m，4H，ROC( O)CH₂CH₂COOH)，2.21(t，2H，J=7.5 Hz，CH₂C(O)NH₂)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂ )，1.70-1.52(m，4H，CH₂CH₂C(O)NH₂及びCH₂CH₂OH)，1.29(b s，18H，アルキルプロトン); FABHRMS（NBA）m/e 398.2893（C₂₂H₃₉NO₅+ H⁺は398.2906を要する）。メチル−９−ブロモ−ノナノエート(13) ０℃のCH₂Cl₂(30 mL、0.2M)中のメチル−９−ヒドロキシ−ノナノエート(1.1g 、5.85ミリモル、1.0 当量)の溶液をCBr₄(2.5g、7.54ミリモル、1.3 当量)及びP Ph₃(2.15g、8.19ミリモル、1.4 当量)で連続して処理し、その反応混合物を４℃ で10時間攪拌した。次いでその反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O（8 x 10mLで洗浄）で繰り返して洗浄した。Et₂O洗浄液を合わせ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、ヘキサン)にかけて透明な無色の油(1.02g、理論量 1.47g、69.5％)として13を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ3.64(s，3H，C(O) OCH₃)，3.38(t，2H，J=6.8 Hz，CH₂Br)，2.29(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂C(O)OCH₃) ，1.83(p，2H，CH₂CH₂Br)，1.63（m，2H，CH₂CH₂C(O)OCH₃）1.47-1.28（m，8H, アルキルプロトン）。メチル−９−トリフェニルホスホラニル−ノナノエート−ブロミド(14) CH₃CN(3.5mL、1.16M)中の13（1.02g、4.06ミリモル、1.0 当量）の溶液をトリフェニルホスフィン(1.17g、4.47ミリモル、1.1 当量)で処理し、還流下で10時間攪拌した。追加のトリフェニルホスフィン(0.532g、2.03ミリモル、0.5 当量) を反応混合物に添加し、攪拌を還流下で５時間続けた。その反応混合物を減圧で濃縮し、Et₂O（5 x 10mLで洗浄）で繰り返して洗浄した。次いで残っている残渣を最小容積のCH₂Cl₂に溶解し、減圧で濃縮して無色のフォーム(1.90g、理論量2. 08g、91.3％)として14を得た。¹H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ7.82-7.51(m，15H， ArH)，3.70-3.46(m，5H，CH₃OC(O)R及びCH₂PPh₃)，2.13(t，2H，J=7.4Hz，CH₂C( O)OCH₃)，1.62-1.02(m，12H，アルキルプロトン); FABHRMS（NBA）m/e433.2312 （C₂₈H₃₄BrO₂P -Br ^- は433.2296を要する）。メチル−18−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10オクタデセノエート(15) 25℃のTHF（6.5mL、0.3M）中の14（1.0g、1.95ミリモル、1.0 当量）の溶液を KHMDS（3.9mL、THF 中0.5Mの溶液、1.95ミリモル、1.0 当量）で処理し、その反応混合物を還流下で１時間攪拌した。次いでその反応混合物を-78 ℃に冷却し、３(0.93g、2.35ミリモル、1.2 当量)で処理し、25℃に温め、更に30分間攪拌した。次いでその反応混合物を飽和NH₄Cl 水溶液で処理し、EtOAc（100mL）とH₂O( 100mL)の間で分配した。有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、０〜２％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて無色の油(0.82g、理論量1.07g、76.3％)として15を得た。¹ H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ7.67(m，4H，ArH)，7.41(m，6H，ArH)，5.34(m，2H ，CH=CH)，3.65(m，5H，CH₃OC(O)及びCH₂OTBDPS)，2.29(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂C (O)OCH₃)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂)，1.55(m，4H，CH₂CH₂C(O)OCH₃及びCH₂CH₂ OTBDPS)，1.29（b s，18H,アルキルプロトン）、1.04（s，9H，(CH₃)₃C） 18−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセン酸(16) ０℃のTHF-MeOH-H₂O(3-1-1 比、7.3 mL、0.2 M)中の5（0.81g、1.47ミリモル、 1.0 当量）の溶液をLiOH・H₂O（0.188g、4.48ミリモル、3.0 当量）で処理した。その反応混合物を25℃に温め、８時間にわたって攪拌し、次いでEtOAc（100mL ）とH₂O（100mL）の間で分配した。有機層を10％のHCl 水溶液(100mL)及び飽和N aCl水溶液(100mL)で連続して洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、10〜30％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて無色の油(0.700g、理論量0.790g、88.7％)として16を得た。¹H NMR(CDCl₃，250MHz): δ7.67(m，4H，ArH)，7.41(m，6H，ArH)，5.34(m，2H，CH=CH)，3.65(t，3H，J= 6.5 Hz，CH₂OTBDPS)，2.34(t，2H，J=7.4 Hz，CH₂COOH)，2.00(m，4H，CH₂CH=CH CH₂)，1.65-1.50(m，4H，CH₂CH₂COOH及びCH₂CH₂OTBDPS)，1.47-1.23(m，18H，アルキルプロトン)，1.05(s，9H，(CH₃)₃C); FABHRMS（NBA/CsI）m/e 669.2772（C₃₄ H₅₂O₃Si + Cs ⁺ は669.2740を要する）。 18−Ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−シス−９，10−オクタデセノアミド (17) ０℃のCH₂Cl₂(4.3mL、0.3 M)中の16（0.685g、1.28ミリモル、1.0 当量）の溶液を塩化オキサリル(1.92 mL、CH₂Cl₂中2Mの溶液、3.84ミリモル、3.0 当量)で滴下して処理した。その反応混合物を25℃で４時間攪拌し、減圧で濃縮し、０℃ に冷却し、飽和NH₄OH 水溶液(2.0mL)で処理した。次いでその反応混合物をEtOAc (100mL)とH₂O（100mL）の間で分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、5cm x 15cm、40〜100 ％のEtOAc-ヘキサン勾配溶離)にかけて無色の油(0.520g、理論量0.684g、76.0％)として17を得た。¹ H NMR(CDCl₃，250 MHz): δ7.67(m，4H，ArH)，7.41(m，6H，ArH)，5.70-5.34(m ，4H，H₂NC(O)及びCH=CH)，3.65(t，3H，J=6.5 Hz，CH₂OTBDPS)，2.21(t，2H，J =7.5 Hz，CH₂C(O)NH₂)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂)，1.65-1.50(m，4H，CH₂CH₂C (O)NH₂及びCH₂CH₂OTBDPS)，1.47-1.23(m，18H，アルキルプロトン)，1.05(s，9H ，(CH₃)₃C); FABHRMS（NBA/CsI m/e 668.2929（C₃₄H₅₃O₂NSi + Cs⁺は668.2900を要する）。 18−ヒドロキシ−シス−９，10−オクタデセノアミド(18) THF(1.1mL、0.31M)中の17（0.185g、0.345 ミリモル、1.0 当量）の溶液をテトラブチルアンモニウムフルオリド(0.69 mL、THF 中1.0Mの溶液、2.0 当量）で処理し、その反応混合物を25℃で２時間攪拌した。次いでその反応混合物をEtOA c(50 mL)とH₂O（50 mL）の間で分配し、有機層を乾燥させ（Na₂SO₄）、減圧で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO₂、3cm x 15cm、０〜５％のMeOH-EtOAc勾配溶離)にかけて白色の固体(0.097g、理論量0.103g、94.6％)として18を得た。¹H NM R(CDCl₃，250 MHz): δ5.65-5.34(m，4H，H₂NC(O)及びCH=CH)，3.62(t，3H，J=6 .5 Hz，CH₂OH)，2.21(t，2H，J=7.5 Hz，CH₂C(O)NH₂)，2.00(m，4H，CH₂CH=CHCH₂ )，1.65-1.50(m，4H，CH₂CH₂C(O)NH₂及びCH₂CH₂OH)，1.29(b s，18H,アルキルプロトン); FABHRMS（NBA）298.2732（C₁₈H₃₅NO₂ + H⁺は298.2746を要する）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クラヴァットベンアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴレボーンドライヴ 3435 ＃1024 (72)発明者シューズダックゲアリーイーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴポルテラパズ 4080 ＃９ (72)発明者ヘンリクセンスティーヴンジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92075 ソラナビーチグレンクレストドライヴ 410

Claims

【特許請求の範囲】１．脂肪酸一級アミドを患者に投与する工程を含み、その脂肪酸一級アミドが単一不飽和を有するアルキル鎖を含むことを特徴とする睡眠の誘発方法。２．脂肪酸一級アミドが下記の式：を有する請求の範囲第１項に記載の睡眠の誘発方法。３．アルキル鎖の不飽和がシス配置を有する請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。４．アルキル鎖の不飽和がトランス配置を有する請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。５．脂肪酸一級アミドがシス−９，10−オクタデセノアミドである請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。６．脂肪酸一級アミドがトランス−９，10−オクタデセノアミドである請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。７．脂肪酸一級アミドがシス−８，９−オクタデセノアミドである請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。８．脂肪酸一級アミドがシス−11，12−オクタデセノアミドである請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。９．脂肪酸一級アミドがシス−13，14−ドコセノアミドである請求の範囲第２項に記載の睡眠の誘発方法。 10．脂肪酸一級アミドを腹腔内注射(ip)、皮下注射(sc)、筋肉内注射(im)、経口摂取(pi)、脊髄注射、及び頭蓋注射からなる方法の群から選ばれた方法により投与する請求の範囲第１項に記載の睡眠の誘発方法。 11．投薬量が毎日１mgから10g までの範囲である請求の範囲第１項に記載の睡眠の誘発方法。 12．対照被験者に対する比較の断眠の患者のレベルの分析方法であって、その方法が下記の工程：工程Ａ：患者から脳脊髄液のサンプルを得、次いで工程Ｂ：前記工程Ａで得られた脳脊髄液のサンプルをシス−９，10−オクタデセノアミドと関連するHPLC（高性能液体クロマトグラフィー）ピークの存在を確かめるために分析し、次いで工程Ｃ：比較の断眠の患者のレベルを測定するために前記工程Ｂで誘導された分析を対照被験者からの脳脊髄液の分析と比較することを含むことを特徴とする分析方法。 13．分子を固相基質に固定された脂肪酸一級アミドと接触させる工程を含むことを特徴とする脂肪酸一級アミドに結合する分子の単離方法。 14．請求の範囲第13項に記載の方法により得られた脂肪酸一級アミドに結合する分子。