JPH10500031A - 創傷治癒材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 創傷治癒（事故、外科的にまたは疾患によって生じた創傷を含む）の促進に用いられる器具であって、生物学的に許容し得る材料、例えば生体内で生分解するポリマー、で形成される基材を有し、この基材が、誘導された組織修復を可能とし、かつ正常な機能および形態を有する組織の再生を助長するために、基材上に細胞成長を方向付けることが可能な手段を有するものである。基材は、典型的な寸法が幅１ないし１０ミクロン、深さ１−１０ミクロンである一連の溝が刻まれているか、もしくはエンボス加工されている薄いポリマーシートである。このシートを、畳み、もしくは丸めて創傷内に挿入する前に特定の三次元形状にすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷治癒材料技術分野 本発明は、創傷の治癒（創傷が事故の結果であろうと、外科的な創傷であろう と、あるいは疾患によって引き起こされた創傷であろうと）の促進に用いられる 器具であって、正常な機能および形態を有する組織の再生が助長されるように組 織の修復を導くことが可能な器具に関する。背景 偶発的な被傷または手術の後に身体がそれ自身を修復する能力は、組織が不正 確に方向付けられ、もしくは方向付けられさえもしない構造で再生されるため、 あるいは組織内である種の細胞が他種の細胞をそれらの正しい位置から遠くへ押 しやるため、しばしば不完全である。例えば、線維芽細胞は、神経細胞の再生を 妨害し、または補綴装置への神経の適切な接続を妨げる線維性組織を、創傷治癒 の過程でしばしば形成する。同様にして、歯の置き換えの後、歯肉が回復する際 に、上皮と線維芽細胞との間で競合が生じる。切断され、もしくは損傷を受けた 腱の治癒でも問題が生じる。例えば、滑膜細胞が無指向性となってエピセノン細 胞（epitheno cells）に付着し、その結果、治癒後の腱が滑液管（synovial can al） 壁にくっついて滑液管内部に腱が存在するようになってしまう可能性がある。さ らに、腱が伸長された状態にあるため、腱自身の端部を再接合することが困難で あり、その結果、切断もしくは裂断した腱の端部間に隙間が存在するようになる ことがある。満足のゆく修復を達成するためには、この隙間を適切に整列したエ ピセノン細胞で埋めなければならない。皮膚の創傷でさえしばしば正しくない構 造に修復され、それが痛みを生じたり、あるいは外見を損なう結果となることが ある。同様にして、腹部または心臓血管手術創の治癒の過程で、不適切な細胞形 成が生じることがある。 創傷の治癒におけるさらなる問題は、創傷領域に炎症細胞のような不適性な細 胞が導入される可能性があることである。例えば、ラット屈筋腱の治癒における 滑液鞘およびエピセノン内での炎症細胞の堆積がB．WojciakおよびJ．F．Crossa nのClin．Exp．Immunol．1993; 93: 108-114に記述されている。 我々の欧州特許出願ＥＰ８４３０８２３０．６は、細胞付着増強区域および／ または細胞付着指向性区域を定義する複数の表面の不連続性、例えば、溝もしく は隆起、を付与することによる、非生物学的固体基材上の予め定められた空間的 配置での生物学的細胞の位置について開示する。しかしながら、これは、創傷治 癒に関するものではない。さらに最近では、溝を形成した基材を用いることによ る細胞挙動の微小表面形状（microtopography） 制御がClarkらによりDevelopment 108; 635-644(1990)に記述されている。 超微細格子の作製のためのレーザーホログラフィーおよびマイクロエレクトロ ニクス技術の使用並びに細胞の配列におけるこれらの格子の挙動が、Clarkらに より、Journal of Cell Science 99; 73-77(1991)に記述されている。 これらの刊行物はインビトロでの細胞の方向付けを記述してはいるが、インビ ボにおける創傷治癒の過程での秩序だった細胞形成の生成に対する回答を提示し てはいない。この問題に取組むことが本発明の目的である。発明の要約 一般的に述べると、本発明は、創傷治癒の過程での組織再生を誘導する手段を 用いることに基づくものであり、それにより正常な機能および形態を有する組織 の再生を助長するものである。 本発明は、創傷治癒における器具の使用を提供し、該器具は生物学的に許容し 得る材料で形成された基材を備え、該基材がその表面上に細胞成長を方向付ける ことが可能な手段を備えているものである。 別の側面においては、本発明は、創傷治癒に用いられる器具それ自身を提供す る。 さらなる側面においては、本発明は、創傷内または創傷部位の隣接部に前記器 具を配置することによる患者の創傷治癒方法を提供する。この方法では、創傷治 癒プロ セスの過程での細胞の秩序だった成長が、治癒した創傷の細胞の配列が本来の細 胞の構造および機能に、より厳密に一致するように促進される。 前記器具は、生体内で再吸収され、かつ創傷部位から有効に消失する生分解性 基材からなる生分解性の器具であってもよい。 しかしながら、創傷治癒が必要とされる恒久的な移植片の場合のような別の例 においては、器具は非再吸収性であってもよい。金属、プラスチックおよびセラ ミック移植片を含む移植片が、関節修復、例えば股関節補綴術に関連して用いら れる。このような移植片は、移植片それ自体の表面に一体に形成されているか、 もしくは表面に付与されている細胞成長方向付け手段（cell growth orienting means）を備えていてもよい。また、細胞成長方向付け手段は、移植片の表面上 に（例えば、移植片の周りを包み、もしくは移植片に付着させることにより）付 与される別々の基材シート上に存在していてもよい。この基材シートは、再吸収 性であっても、非再吸収性であってもよい。 “創傷”という用語は事故の結果として生じる創傷、外科もしくは歯学の結果 として生じる創傷、または疾患によって引き起こされる創傷を包含する、広範な 意味に理解されるべきものである。外科手術創には美容目的で生じる創傷、およ び口蓋裂もしくはガーゴイリスムのような遺伝学的な先天異常の修復のための生 じる創傷も含 まれる。また、創傷はさまざな疾患状態により、あるいは感染性微生物の結果と して生じたものであってもよく、例えば、潰瘍または敗血症に起因するものであ ってもよい。一般に、創傷は存在する組織中に断絶部位を含んでおり、治癒はこ の断絶部位を埋めるように組織端部からの細胞の成長を必要とする。創傷を治癒 するために存在する組織からの細胞の成長を、本発明の器具を用いることにより 促進することが可能であることを示す先行技術はない。 このように、驚くべきことに、細胞の成長、形状および伸長を方向付けること が可能な細胞成長方向付け手段を有する材料の使用が、秩序だった創傷治癒を助 けるのに有効であることが見出された。また、これは不適正な領域への細胞の浸 潤を妨げ、癒着の形成を妨げることも可能である。少なくとも創傷治癒の初期段 階における細胞成長方向付け手段が存在すれば、基材が創傷治癒の全過程を通し て存在しても、あるいは存在しなくても（生分解性基材の場合）、秩序だった細 胞配置を助ける付着性細胞の細胞成長パターンを開始するのに十分である。その 場合、一般に、細胞で埋められるべきである空間を基材自体が占有することがな く、したがって創傷治癒を妨げることがないように、治癒過程が完了する前に、 基材が生分解し、創傷部位内またはその周囲から消失することが有利である。創 傷の重篤性および特定の創傷型による治癒の速度にもよるが、生分解性基材は２ ないし１ ４日以内に完全に分解することが望ましいことが見出されている。これはまた、 特定の患者の生理にも依存するものである。 生分解の機構は創傷部位内またはその近傍の体内に普通に存在する物質に依存 している。通常、生分解は遊離しているかもしくは細胞表面に付着している酵素 によって行われるか、または細胞から放出された酸化性種によって行われる。他 の機構、例えば、通常体内には存在しないような種を含む細菌の作用による機構 は不適切である。 様々な生分解性の生物学的に許容しうる材料が周知であり、当業者は、必要な 細胞方向付け手段をもたらすことができ、かつ生体内で適切な生分解時間を示す 適切な材料を選択するであろう。適切なポリマー材料には、ポリ乳酸ホモポリマ ー、ポリグリコール酸ホモポリマー、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリジオキ サノン、ポリオキザレート、ポリジオキサノン−グリコール酸共重合体、ポリラ クトン（例えば、カプロラクトンおよびバレロラクトンのポリマー）、ポリヒド ロキシ酪酸、ポリヒドロキシバレレート、ポリオルソエステル、ポリ無水物、ポ リペプチド、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、および天然ポリマー類 （例えば、コラーゲンおよび多糖類）が含まれる。ホモポリマー性の材料の場合 には、他の材料との対応する共重合体を用いることもできる。生分解性ポリマー 類の詳細な検討は、S．J．Hollandお よびB．J．Tigheの"Biodegradable Polymers"，Advance in Pharmaceutical Sci ences，1992，p101-164にある。 特に、可溶性縫合糸の製造に通常用いられる材料が適切である。その不均一な 稠度が適切な微小表面形状への適用を妨げることもあるが、再構成コラーゲンを 基材として用いることができる。 非生分解性の医用グレードポリマーには、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプ ロピレン、ポリカーボネートおよびポリエステルが含まれる。 シート様基材については、その厚さは２５０ミクロンまであってもよいが、好 ましくは５０−１００ミクロンの範囲内である。厚みは器具の柔軟性を決定する 因子である。また、生分解が生じる時間も基材の厚さに依存する。 特定の態様において、器具は、それを創傷内に挿入することを可能ならしめる 柔軟性を有する。基材に三次元形状を付与することにより、三次元的な組織修復 を達成することができる。シート形状にある基材の場合には、それを畳み、丸め 、螺旋もしくは積層構造に形成するか、あるいは、特定な解剖学的部位もしくは 手術手法に適当な他の形状に形成することが可能である。特には、基材を畳み込 んだシートの形態にすることが可能である。基材を１回もしくは多数回畳んで、 蛇腹のようなひだのある形状にすることができる。このように、柔軟なシート構 造は創傷内への挿入に特に有用である。また、基材の 柔軟性は、それを、修復を要する、靭帯、腱、筋肉、血管または他の細長い構造 物のような構造物の周りに巻きつけることも可能にする。 また、この器具は、創傷部位、特に、創傷治癒プロセスの過程で細胞で埋めら れる必要がある実質的な隙間が創傷内に存在する創傷部位の内部もしくはその周 りに適合させるため、管の形態、任意に長さ方向に分割された管の形態で提供さ れてもよい。例えば、管を創傷内に配置して創傷の中心での細胞成長を促進させ ることができ、かつ、創傷の外部領域における適正な細胞成長を促進するため、 管状基材を創傷外部の周りに巻き付けることができる。したがって、腱の修復に おいては、腱の周囲を基材の管状シートで包むと共に創傷内の腱の分離端の間に 中心管を配置し、通常の縫合糸で各端部の周りを縛ることが有利であり得る。 特定の生分解性（すなわち、再吸収性）材料を使用するには、生体内における それらの生分解に先立って、器具を包装、外科的操作および移植に適する形状に 保持するスペーサーを形成する。そのような場合には、創傷治癒器具の一部が生 分解性であればよく、残りの部分は非生分解性材料で形成されていてもよい。 細胞成長方向付け手段は方向付けを指示し、かつ細胞の運動速度を制御するこ とができ、再成長に影響を及ぼす適切な微小表面形状および／または適切な微量 化学作用の形態にあればよい。細胞成長の方向付けを付与する のに適した微小表面形状は、以前に記述されているように、既に周知である。こ れは、細胞の方向付け、細胞形状、細胞の運動速度、および細胞分裂の水準の制 御に有効であり得る。創傷の治癒に適用するためには、微小表面形状は一連の突 起および樋状溝、例えば平行な溝（および／または隆起）の形態にあることが好 ましい。鋭角に縁取りされた実質的に矩形断面の溝が特に有用である。好ましく は、この溝は１−１０ミクロンの幅を有する。溝の幅および深さは、ある程度、 成長させようとする細胞の性質によって決定される。細胞が平坦な表面上に配置 される場合には、溝の深さは、好ましくは、細胞の平均幅の０．３ないし５倍で ある。実用的に述べると、これは、溝の深さが一般には１−１０ミクロンの領域 にあることを意味する。好ましくは、溝の深さに対する溝の幅の比（すなわち、 アスペクト比）は０．５ないし２の領域にあり、好ましくは実質的に１：１であ る。一般には、溝の縁の間の間隔は溝それ自体の幅と同じオーダーであり、すな わち、１−１０ミクロンである。中心から中心までの溝の間隔は、一般には、２ −２０ミクロンである。エピテナル（epitenal）細胞および筋細胞に用いられる 特定の好ましい態様の１例は、５ミクロンの溝幅、３ミクロンの溝深さ、および １０ミクロンの溝間隔（中心から中心）（すなわち、溝の縁の間隔が５ミクロン ）である。溝のサイズは、指定された領域から１種類の細胞（例えば、炎症細胞 ）を選択的に排除し、他種の細胞 を助力するように選択することができる。溝のサイズを適当に選択することによ り、マクロファージをナノメーターオーダーの深さの溝で誘導し、特定の部位（ 例えば、補綴物）から選択的に引き出すことが可能である。 所望の程度の細胞成長の方向付けを得ることが可能な他の微小表面形状構造は 、規則的な配列で配置された一連の丸められた突起または隆起の形態にある。好 ましくは、この配列は正方配列である（すなわち、突起は正方グリッド上に存在 する）。それにより、細胞は、隣り合う突起の列の間に与えられる谷に沿って成 長するようになる。 しかしながら、所望の治癒成長パターンに応じて、他の細胞成長方向付け配置 を用いることが可能である。これらには、円形もしくは蛇行パターンが含まれ得 る。螺旋パターンは、螺旋状に成長する細胞が最も低い曲率を有する領域に移動 する傾向にあることから、特殊な目的に用いることができる。これは、細胞が存 在しない、もしくは細胞数の少ない領域を螺旋の中心に与えることを可能にする 。 微小表面形状パターンは、先行技術において既に開示された方法で形成するこ とが可能であり、好ましくは、例えばエンボスローラー（embossing roller）と 平坦ローラー（smooth roller）との間に創出されたニップの間に基材を通過さ せることにより、基材上に直接エンボス加工することにより達成される。しかし ながら、所望 であれば、一対のエンボスローラーを用いることにより基材の両面にパターンを 形成することも可能である。両面に形成されるパターンは、同じであっても、異 なっていてもよい。 基材のエンボス加工は、フォトリソグラフィまたは電子ビームリソグラフィ、 次いでエッチングおよび電気メッキを用いて製造されるダイまたはローラーを用 いて行うことができる。 また、微量化学作用の手段により、すなわち、基材上に好ましい細胞成長の列 を化学的に付与することにより、細胞成長を方向付けることも可能である。細胞 の付着を促進し、それにより方向付けるのに適する材料は、欧州特許ＥＰ８４３ ９８２３０．６の明細書に開示されている。しかしながら、本発明による好まし い方法は、細胞付着性蛋白質または蛋白質様（protenacious）物質の細片を、そ の間にとりわけ非細胞付着性の細片の層を伴ってもよいが、提供することによる ものである。 器具は、生体負荷（bio-burden）制御、またはそれらの表面化学作用の変性を 達成するため、例えば酸素プラズマ技術を用いることにより表面処理することが できる。 本発明の器具は、必然的に生物学的に許容し得る材料で形成され、もちろん、 周知の方法、例えば酸化エチレン、ガンマ線照射、もしくは酸素プラズマエッチ ングにより、無菌化することが可能である。好ましい態様の詳細な説明 本発明の態様を、単に例として記述する。実施例１（生分解性プラスチックのエンボス加工） （ａ）メッキ素地上に堆積したポリイミドで形成されるスタンピングマスターの 製造。 減圧下において電子ビーム蒸発により、ガラス板上に０．１μｍ（ミクロン） のニクロムコーティングを蒸着し、メッキ素地を形成した。次いで、スピンコー ティングにより、ニクロム上に０．７μｍのポリイミドコーティングを行い、（ ３００℃で終了する一連のベークにより）ポリイミドを完全に硬化させた。ある いは、ポリイミドの代わりにフォトレジストを用いることができる。硬化したポ リイミド上に、熱蒸発により０．１μｍのアルミニウムコーティングを蒸着し、 その上にポジ型フォトレジストの０．５μｍの層を積層した。このフォトレジス トを、１０μｍ間隔で１０×１０ｍｍの領域をカバーする１０μｍ線パターンを ＵＶ光を用い密着プリンティングにより露光した。レジストの潜像をレジスト現 像液中で現像し、得られたレジストのレリーフパターンを、（オルトリン酸、硝 酸および水からなる）湿式エッチング浴中でのアルミニウムをエッチングする間 、エッチング耐性マスクとして用いた。このアルミニウムパターンを、次の酸素 中でのポリイミドの反応性イオンエッチングにおける酸素耐性マスクとして用い た。この工程にお いて、流速２０ｓｓｃｍ、および２０ｍＴの圧の酸素を１００Ｗ ｒｆ １３． ６ＭＨｚの放電によりイオン化した。このプラズマはポリイミドを垂直にエッチ ングし、エッチングはその下のニクロム層で止まる。アルミニウムエッチングで アルミニウムマスクを剥離し、この構造体を電気メッキする準備を整える。 （ｂ）スタンプの作製 この構造体をニッケルメッキ浴内に置いた。ここで、メッキ素地が一方の電極 を構成し、ニッケルシートが他方の電極を構成する。このメッキ浴は、エトン− オミ（Ethone-omi）から入手したレクトニック（Lectonic）である。メッキ浴を 、製造業者の指示に従い、硫酸ニッケルのメッキ溶液、活性化剤、湿潤剤および 付着剤で作製した。２０ｍＡ／ｃｍ²の電流密度で、ニッケルを５０ないし７０ μｍの厚さに析出させた。スカペル（scapel）を用い、ニッケル片（スタンプ） をガラス板から取り外した。 （ｃ）プラスチックシートのエンボス加工 エチコンＰＤＳ（Ethicon PDS）（商標）として知られる、エチコン社（Eth icon Inc.）から入手した生分解性ポリ−ｐ−ジオキサノンプラスチックを１１ ０℃で溶融し、ガラス製ペトリ皿内に流し込んだ。フィルムを切断し、剥離する ことによりガラスから取り外し、プレス機の頂部に前記スタンプを装着したプレ ス機内に置いた。プレス機を１００℃に加熱し、５ｋＮの力を加えた。 プラスチックフィルムは３−４μｍの深さにエンボス加工され、スタンプから容 易に取り外すことができた。 図１は、幅１０μｍのランド４で分離された幅１０μｍの溝２を有する、エン ボス加工されたシートの断片を拡大スケールで示している。実施例２（細胞の調製および成長） （ｉ）幼児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を集密的になるまで培養し、次いでト リプシン処理し、遠心し、エンボス加工構造の表面上に播種して、以下のように 観察した。 ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１ Ｃ１３）を、７５ｃｍ³ポリスチレン製培養フラス コ内で、ＢＨＫ２１培養培地（０．２２％重炭酸塩、１０％ウシ血清、１０％ト リプトース肉汁培地、２．８５ｍＭグルタミンおよび抗生物質を補充した変性最 小必須培地）中で培養した。細胞が集密的になったとき、ハンクス（Hanks）生 理的食塩水（カルシウムおよびマグネシウムイオンを含有しない）中０．５ｍＭ のＥＤＴＡ中、２５０ ＢＡＥＥ単位／ｍｌのトリプシン活性のトリプシンバー セン（trypsinversene）溶液を用い、３７℃で５分間トリプシン処理を行った。 次いで、細胞を１４００ｒｐｍで回転し、５ｍｌの培養培地に再懸濁して、室 温で１０分間保持した後再び回転した。ペレットをＢＨＫ２１培地に再懸濁し、 使用時 まで無菌状態に保管した。 エンボス加工した生分解性プラスチックシートもしくはガラスカバースリップ （対照）を収容する３３ｍｍ径のペトリ皿に、細胞を２×１０⁵細胞／ｍｌの密 度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。この細胞を光学顕微鏡で検査し た。溝の方向への細胞の配列の程度は非常に顕著であり、配列は実質的に完全で あった。細胞の形態は平坦表面上の細胞とは著しく異なっていた；細胞はより長 く、より薄かった。 （ii）別の実験において、３％フォズタル（Foztal）ウシ血清および補充物を補 充したハンスＦ１０（Hans F10）中で維持されているヒト内皮細胞（ＧＨＴＥＮ 系）をエンボス加工したプラスチックシート上に播種した。これらの内皮細胞は 毛細血管壁に存在する。これらのヒト内皮細胞は、エンボス加工したプラスチッ クシートの溝の方向に沿って良好な配列を示し、他の細胞よりも迅速に溝に沿っ て移動した。 最小必須培地（ＭＥＭ）、ハンクス（Hanks）生理的食塩水およびハンスＦ１ ０（Hans F10）は周知の培地であり、それらの組成は細胞培養法の標準的な教科 書に明らかにされている（例えば、Freshney R．Ian．”Culture of Animal Cel ls: A Manual of Basic Technique”（1987）第２版、Alan R．Liss，Inc．(NY) ）。実施例３（ラットの腱） 我々は、腱の器官培養に、多数の溝を有する溶融シリカ基材を用いた。腱の治 癒の動力学を、平坦およびパターン化した基材とで比較した。表面形状の特徴に 対するエピテノン（epitenon）細胞の感受性も研究した。（ｉ）基層のパターン形成 溶融シリカサンプル（マルチ−ラブ（Multi-lab））を、２５ｍｍ²×１ｍｍ厚 のサンプルに切断した。このシリカを、３：１の硫酸：過酸化水素の溶液に６０ ℃で５−１０分間浸漬し、次いでＲ．Ｏ．水で洗浄した後、フィルターを通した 空気を吹付け乾燥させることにより清浄化した。このシリカを、４００ｒｐｍで ３０秒間回転させフォトレジストをコートし、次いで９０℃で３０分間ソフトベ ークした。これにより、１．８μｍのレジスト厚が得られた。次に、所望の格子 パターンを形成したクロームマスタを通して、マスクアライナー（ＨＴＧ）を用 いて１０秒間Ｕ．Ｖ．光で露光することにより、レジストにパターンを形成した 。露光したレジストを、１：１のシップレイ（Shipley）現像剤：Ｒ．Ｏ．水の 溶液にサンプルを６５−７５秒間浸漬して現像し、次いでＲ．Ｏ．水で洗浄し、 吹付け乾燥を行った。 これらのサンプルに対して、ＲＩＥユニット（プラズマテクノロジー（Plasma Technology））内でドライエッチングを行った。エッチングの後、残留するレ ジストを除去した後、全てのサンプルのブランケットを１分間エッチングした。（ii）ラット腱の器官培 雄スプラーグドーリー（Sprague Dawley）ラットの後脚の中指から屈筋腱を単 離した。１２匹の８週齢ラットをハロタンを用いて麻酔した。滑液鞘を除去し、 腱を分断して２つの腱端部の間の隙間が幅０．５ｍｍとなるように平坦なおよび パターン化した溶融シリカ基材（深さ５μｍ、幅１０μｍの溝）上に配置した。 腱は溝の方向と平行に配置し、清浄なカバースリップで押圧した。腱を、０．５ ％重炭酸塩、１０％ウシ胎仔血清（Gibco BRL，Life Technologies，Paisley，U K））、１０％トリプトース肉汁培地（Gibco）、２８５ｍＭグルタミンおよび抗 生物質を補充したＢＨＫ培養培地（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝グラスゴー（Glas gow）変性ＭＥＭ（Gibco）中で、３週間インキュベートした。培地は４８時間毎 に変えた。３週間および５週間後に、腱を凍結切片および組織染色に用いた。治 癒腱の幾つかを、光走査共焦点顕微鏡下で調べた。 平坦基材上では、８週に亘って治癒は生じなかった。この期間中、エピトネン （epitonen）細胞の増殖が、分断された腱端部近傍の腱表面上で生じた。このエ ピトネン層は厚味を増して３−６細胞の厚みとなった。これらの増殖した細胞は 、その後、分断された端部の表面の周囲を移動し、そのため、それらの長軸が腱 の長軸に対して直角に位置した。腱のセグメント間の連続性を回復するための、 隙間を横切る意味のある移動の証拠はなかっ た。同様に、細胞外基質が同じ方向に貯えられ、そのため腱の端部が丸められた 。 対照的に、本発明による微小加工基材上の溝と同じ方向に腱セグメントを一緒 に配置した場合には、ほとんどの実験において、８週以内に腱の再構成が生じた 。腱の端部は丸まるよりもむしろ弾丸形となり、その結果互いに接近した。分断 部位近傍で相当程度のエピトネンの増殖を生じたが、腱の端部表面上を移動する 代わりに高度に前進する細胞性の前面を形成し、約３週で、これが向かい側の腱 からの類似の組織と融合し始めた。続く３週で、これらの前進する細胞の事実上 全てが、腱の長軸に沿って配列した緩く結合している細胞外基質の塊を残して消 失し、それにより連続性が回復した。復元された腱の組織構造は正常に近いもの であった。（iii）ラットのエピテノン細胞の培 雄スプラーグドーリー（Sprague Dawley）ラットのラット屈筋腱からラットエ ピテノン線維芽細胞を単離した。簡潔に述べると、工程１において、０．５％コ ラゲナーゼ（クロストリジオペプチダーゼＡ（Clostridiopeptidase Ａ）；ＥＣ ３．４．２４；シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）Poole，UK）中、３７ ℃で１０分間、腱をインキュベートすることにより滑液鞘を除去した。 工程２において、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（トリプシン、３００ ＢＡＥＥ （Ｎ α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル）単位／ｍｌ；ＥＤＴＡ 、０． ００１ｍＥＤＴＡ）中、３７℃で１．５、腱をインキュベートした後、放出され た細胞をＢＨＫ２１培地に懸濁させ、２００ｇで６分間遠心した。次いで、細胞 を培養培地（ＢＨＫ２１）に再懸濁し、２５ｃｍ²ファルコン（Falcon）培養フ ラスコ内に２×１０⁵細胞／ｍｌの細胞密度で播種した。実験には、１５ないし ２５継代培養したものを用いた。 実験のため、エピテノン細胞を、２×１０⁵細胞／ｍｌの細胞密度で、平坦お よびパターン化した溶融シリカ基材上に播種した。２４時間後、血清を含まない ハンク（Hank）の平衡塩類溶液で細胞を洗浄し、リン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｐ ＢＳ）中の４％のホルムアルデヒドで５分間固定化した。その後、細胞を再度Ｐ ＢＳで洗浄しケナシドブルー（Kenacid blue）（Sigma，UK）（水／メタノール ／酢酸、５０：５０：７中に０．１％）で１０分間染色して、画像分析システム を用いて分析した。 平坦基材並びに溝の深さおよび幅を変化させてパターン化した基材上で培養し たエピテノン細胞の、細胞の広がり面積、伸長および方向（溝の方向への配列） を測定した。この研究は、表面形状の特徴に対するエピテノン細胞の感受性を確 立し、腱細胞の誘導に最良の条件を創出する溝のパラメータを見出すために行な った。エピテノン細胞の誘導をＢＨＫ細胞の誘導と比較した。２つの細胞系は異 なる種から得られたものであるが、それらは同じ型（線維芽細胞）およびサイズ （２８００±１２０ ０μｍ²の広がり面積）の細胞を表わしている。 エピテノン細胞は、多数の溝を形成した基材により良好に誘導された。それら は、実質的な仲長によって表面形状の特徴に応答している。それらの仲長は溝の 幅には依存しなかったが、溝の深さにはある程度の依存性を示した（分散の一方 向検定で、ｐ＜０．０１）。最良の仲長が、２および５μｍの深さの溝で達成さ れた。ＢＨＫ細胞の仲長は溝の深さおよび幅の両者に依存した。エピテノン細胞 は、０．５および１μｍの深さの浅い溝で、ＢＨＫ線維芽細胞よりも有意に伸長 した（ｐ＜０．０５）。 エピテノン細胞は、０．５μｍの深さの浅い溝で成長した細胞では細胞の方向 付けに低下が見られたものの、溝が形成された全ての種類の基材の上で非常に良 好に方向付けられた。これは、被検サンプルの低い分散によって立証される。Ｂ ＨＫ細胞は、２および５μｍの深さの溝では良好に方向付けられたが、１および ０．５μｍの深さの溝では方向付けは劣っていた。ＢＨＫ細胞に対する分散は、 パターン化された全ての種類の基材について、エピテノン細胞に対するものより も高かった。これは、エピテノン細胞がＢＨＫ線維芽細胞よりも表面形状の特徴 に対してより感受性であることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月８日 【補正内容】 請求の範囲 １． 創傷治癒用の器具であって、該器具は生物学的に許容し得る材料で形成さ れる基材を有し、該基材はその上に、一連の溝および縁とを該基材の表面に形成 してなる細胞成長を方向付けることが可能な手段を備えている器具の創傷治癒に おける使用。 ２． 前記基材が生分解性であり、かつ使用中に再吸収されることに適合するも のである請求項１に記載の器具の創傷治癒における使用。 ３． 前記生分解性基材がポリ−ｐ−ジオキサノンポリマーである請求項２に記 載の器具の創傷治癒における使用。 ４． 前記基材が創傷内に挿入することが可能となるように柔軟性である請求項 １ないし３のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 ５． 前記基材がシートの形態にある請求項１ないし４のいずれか１項に記載の 器具の創傷治癒における使用。 ６． 前記シートが５０−１００ミクロンの範囲の厚みを有する請求項５に記載 の器具の創傷治癒における使用。 ７． 前記シートが、畳まれ、丸められ、あるいは創傷への挿入に適合する三次 元形状に形成されている請求項５または６に記載の器具の創傷治癒における使用 。 ８． 前記溝の深さがその上で成長させようとする細胞の型の平均幅の０．３な いし５倍であり、ここで、該細 胞の平均幅は細胞を平坦表面に配置した場合のそれらの幅である請求項１ないし ７のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 ９． 各溝の深さが１−１０ミクロンの範囲にある請求項１ないし８のいずれか １項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １０． 各溝の幅が１−１０ミクロンの範囲にある請求項１ないし９のいずれか １項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １１． 各溝の幅のその深さに対する比が０．５ないし２の範囲にある請求項８ ないし１０のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １２． 中心から中心の溝の間隔が２ないし２０ミクロンの範囲にある請求項１ ないし１１のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １３． 前記細胞成長を方向付けることが可能な手段が、スタンピングもしくは エンボス加工によって基材に付けられている請求項１ないし１２のいずれか１項 に記載の器具の創傷治癒における使用。 １４． 腱細胞、線維芽細胞または内皮細胞の細胞成長を方向付けるものである 請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １５． 創傷治癒に用いる器具であって、使用中に再吸収されることに適合する 生物学的に許容し得る生分解性材料で形成される基材を備え、該基材はその上に 、一連 の溝および縁とを該基材の表面に形成してなる細胞成長を方向付けることが可能 な手段を備えている創傷治癒用器具。 １６． 生分解性の前記基材がポリ−ｐ−ジオキサノンポリマーである請求項１ ５に記載の創傷治癒用器具。 １７． 前記基材が創傷内に挿入することが可能となるように柔軟性である請求 項１５または１６に記載の創傷治癒用器具。 １８． 前記基材がシートの形態にある請求項１５ないし１７のいずれか１項に 記載の創傷治癒用器具。 １９． 前記シートが５０−１００ミクロンの範囲の厚みを有する請求項１８に 記載の創傷治癒用器具。 ２０． 前記シートが、畳まれ、丸められ、あるいは創傷への挿入に適合する三 次元形状に形成されている請求項１８または１９記載の創傷治癒用器具。 ２１． 前記溝の深さがその上で成長させようとする細胞の型の平均幅の０．３ ないし５倍であり、ここで、該細胞の平均幅は細胞を平坦表面に配置した場合の それらの幅である請求項１５ないし２０のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具 。 ２２． 各溝の深さが１−１０ミクロンの範囲にある請求項１５ないし２１のい ずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２３． 各溝の幅が１−１０ミクロンの範囲にある請求項１５ないし２２のいず れか１項に記載の創傷治癒用器 具。 ２４． 各溝の幅のその深さに対する比が０．５ないし２の範囲にある請求項１ ５ないし２３のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２５． 中心から中心の溝の間隔が２ないし２０ミクロンの範囲にある請求項１ ５ないし２４のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２６． 前記細胞成長を方向付けることが可能な手段が、スタンピングもしくは エンボス加工によって基材に付けられている請求項１５ないし２５のいずれか１ 項に記載の創傷治癒用器具。 ２７． 創傷の内部もしくは隣接部に請求項１５ないし２６のいずれか１項に記 載の器具を配置し、治癒した創傷の細胞の方向付けが本来の細胞構造および機能 と一致するように、創傷治癒の過程で方向付けられた細胞成長を促進することに よる、患者の創傷を治癒する方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 創傷治癒用の器具であって、該器具は生物学的に許容し得る材料で形成さ れる基材を有し、該基材はその上に細胞成長を方向付けることが可能な手段を備 えている器具の創傷治癒における使用。 ２． 前記基材が生分解性であり、かつ使用中に再吸収されるのに適合するもの である請求項１に記載の器具の創傷治癒における使用。 ３． 前記生分解性基材がポリ−ｐ−ジオキサノンポリマーである請求項２に記 載の器具の創傷治癒における使用。 ４． 前記基材が創傷内に挿入することが可能となるように柔軟性である請求項 １ないし３のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 ５． 前記基材がシートの形態にある請求項１ないし４のいずれか１項に記載の 器具の創傷治癒における使用。 ６． 前記シートが５０−１００ミクロンの範囲の厚みを有する請求項５に記載 の器具の創傷治癒における使用。 ７． 前記シートが、畳まれ、丸められ、あるいは創傷への挿入に適合する三次 元形状に形成されている請求項５または６に記載の器具の創傷治癒における使用 。 ８． 前記基材がそれらの表面上に形成される一連の溝および縁を備える請求項 １ないし７のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 ９． 前記溝の深さがその上で成長させようとする細胞の型の平均幅の０．３な いし５倍であり、ここで、該細胞の平均幅は細胞を平坦表面に配置した場合のそ れらの幅である請求項８に記載の器具の創傷治癒における使用。 １０． 各溝の深さが１−１０ミクロンの範囲にある請求項８または９に記載の 器具の創傷治癒における使用。 １１． 各溝の幅が１−１０ミクロンの範囲にある請求項８ないし１０のいずれ か１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １２． 各溝の幅のその深さに対する比が０．５ないし２の範囲にある請求項８ ないし１１のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １３． 中心から中心の溝の間隔が２ないし２０ミクロンの範囲にある請求項８ ないし１２のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １４． 前記細胞成長を方向付けることが可能な手段が、スタンピングもしくは エンボス加工によって基材に付けられている請求項１ないし１３のいずれか１項 に記載の器具の創傷治癒における使用。 １５． 腱細胞、線維芽細胞または内皮細胞の細胞成長を方向付けるものである 請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の器具の創傷治癒における使用。 １６． 創傷治癒に用いる器具であって、使用中に再吸収されることに適合する 生物学的に許容し得る生分解性材料で形成される基材を備え、該基材はその上に 細胞成 長を方向付けることが可能な手段を備えている創傷治癒用器具。 １７． 生分解性の前記基材がポリ−ｐ−ジオキサノンポリマーである請求項１ ６に記載の創傷治癒用器具。 １８． 前記基材が創傷内に挿入することが可能となるように柔軟性である請求 項１６または１７に記載の創傷治癒用器具。 １９． 前記基材がシートの形態にある請求項１６ないし１８のいずれか１項に 記載の創傷治癒用器具。 ２０． 前記シートが５０−１００ミクロンの範囲の厚みを有する請求項１９に 記載の創傷治癒用器具。 ２１． 前記シートが、畳まれ、丸められ、あるいは創傷への挿入に適合する三 次元形状に形成されている請求項１９または２０記載の創傷治癒用器具。 ２２． 前記基材が、それらの表面上に形成される一連の溝および縁を備える請 求項１６ないし２１のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２３． 前記溝の深さがその上で成長させようとする細胞の型の平均幅の０．３ ないし５倍であり、ここで、該細胞の平均幅は細胞を平坦表面に配置した場合の それらの幅である請求項２２記載の創傷治癒用器具。 ２４． 各溝の深さが１−１０ミクロンの範囲にある請求項２２または２３に記 載の創傷治癒用器具。 ２５． 各溝の幅が１−１０ミクロンの範囲にある請求項２２ないし２４のいず れか１項に記載の創傷治癒用器 具。 ２６． 各溝の幅のその深さに対する比が０．５ないし２の範囲にある請求項２ ２ないし２５のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２７． 中心から中心の溝の間隔が２ないし２０ミクロンの範囲にある請求項２ ２ないし２６のいずれか１項に記載の創傷治癒用器具。 ２８． 前記細胞成長を方向付けることが可能な手段が、スタンピングもしくは エンボス加工によって基材に付けられている請求項１６ないし２７のいずれか１ 項に記載の創傷治癒用器具。 ２９． 創傷の内部もしくは隣接部に請求項１ないし１５のいずれか１項に記載 の器具を配置し、治癒した創傷の細胞の方向付けが本来の細胞構造および機能と 一致するように、創傷治癒の過程で方向付けられた細胞成長を促進することによ る、患者の創傷を治癒する方法。