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JPH0998782A - Mutation gene inducing defect in mitochondria homologous recombination - Google Patents

Mutation gene inducing defect in mitochondria homologous recombination

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JPH0998782A
JPH0998782A JP25616495A JP25616495A JPH0998782A JP H0998782 A JPH0998782 A JP H0998782A JP 25616495 A JP25616495 A JP 25616495A JP 25616495 A JP25616495 A JP 25616495A JP H0998782 A JPH0998782 A JP H0998782A
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JP
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gene
acid
sequence
amino
mitochondria
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Application number
JP25616495A
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Japanese (ja)
Inventor
Kaede Riyou
Takehiko Shibata
楓 凌
武彦 柴田
Original Assignee
Rikagaku Kenkyusho
理化学研究所
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new gene coding for a polypeptide containing a sequence varied at a single amino acid of a specific position among amino acid sequences of a wild-type MHR1 protein and useful for the diagnosis, treatment, etc., of diseases relating to mitochondria. SOLUTION: This new variant mhr1 gene codes for a polypeptide containing an amino acid sequence varied at least the 99th amino acid in the amino acid sequence of a wild-type MHR1 protein expressed by the formula. It acts for the homologous recombination of mitochondria and is usable for the diagnosis and treatment of diseases caused by the genetic variation of mitochondria and the prevention of aging, etc., by the detection and correction of the varied gene of mitochondria. The gene can be produced by extracting a genom from a wild-type yeast to construct a genom library, selecting a strain containing wild-type MHR1 gene from the library, determining the base sequence, comparing with a base sequence determined after the PCR amplification of a genom extracted from an mhr1 mutant strain and determining the varied site.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ミトコンドリアの相同的組換えの欠損を引き起こす、核染色体上の変異型 The present invention relates to cause a defect in the homologous recombination of mitochondria, variants on the nuclear chromosomes
mhr1遺伝子に関する。 mhr1 about the gene.

【0002】 [0002]

【従来の技術】ミトコンドリアは、真核細胞に存在する細胞小器官であり、電子伝達系を介して物質の酸化的リン酸化によるエネルギーであるATPを合成する役割を担っている。 BACKGROUND OF THE INVENTION Mitochondria are organelles present in eukaryotic cells, are responsible for synthesizing ATP is the energy by oxidative phosphorylation of material through the electron transport system. ミトコンドリアは、高いレベルの活性酸素種を酸素呼吸の副産物として生ずるが、この活性酸素種は、常にミトコンドリアDNAに損傷を与えている。 Mitochondria, but produce high levels of reactive oxygen species as a byproduct of aerobic respiration, the active oxygen species are constantly damaging mitochondrial DNA. ミトコンドリアDNAの維持及び器官の機能を維持するためには、ミトコンドリアはかかるDNA損傷を修復し、ミトコンドリアDNA異常を引き起こさないようDNA異常の抑制機構を持たなければならない。 To maintain the maintenance and function of organs mitochondrial DNA, mitochondria repair such DNA damage, must have a reduction mechanism for DNA aberrations so as not to cause mitochondrial DNA abnormalities. その機構として重要と考えられる機能の一つが、真核細胞の核DNA並びに細菌及びウイルスのDNA修復に不可欠であるとされる相同的組換えである。 One of the functions is considered important as a mechanism, a homologous recombination that are essential to DNA repair nuclear DNA, as well as bacteria and viruses of eukaryotic cells.

【0003】相同的組換えとは、一対のDNA分子内で塩基配列が数百塩基対以上にわたりほとんど同じ部分があると、その部分の中で互いに正確に対応する箇所でDNA [0003] Homologous recombination, the nucleotide sequences in a pair of DNA molecules is almost identical parts throughout the several hundred base pairs or more, DNA from each other exactly corresponding positions in that part
鎖の切断、再結合を通してDNA分子がつなぎ換わる、生物界で普遍的に見られる現象をいう。 Chain scission, switched joining DNA molecules through recombination, a phenomenon observed universally in the living world. そして、相同的組換えの結果一方のDNAにおける損傷を他方のDNAが補うことにより、DNAの正常な機能を維持する役割を果たすことにも働いている。 By supplementing the damage in result one DNA homologous recombination and the other DNA, working also play a role in maintaining the normal function of DNA. 相同的組換え遺伝子の機能が低下すると、DNAの損傷を修復することができなくなることによりDNA異常が増加するばかりでなく、また、相同的組換え遺伝子が異常な機能をすると、対立遺伝子以外の部位にある一対の繰り返し配列間で異常な不等交差が起こり、欠失のごときDNA異常を誘導する。 When the function of homologous recombination gene is reduced, not only DNA abnormality is increased by no longer able to repair damage to the DNA, also the homologous recombination gene abnormal function, other than the allelic It occurs abnormal unequal crossing between a pair of repeat sequences in the region, to induce such a deletion DNA aberrations. ミトコンドリアD Mitochondrial D
NAにおけるこのタイプの欠失は、ミトコンドリアの病気(例えば、ミトコンドリアのエネルギー産生系酵素の欠損を病因とするミトコンドリア脳筋症等)、老化等と関連する可能性が指摘されている(Holt,IJ et al., Na This type of deletion in NA mitochondrial diseases (e.g., mitochondrial encephalomyopathy and the like that the pathogenesis of deficiency of energy production system mitochondrial enzyme), it has been pointed out a possibility that associated with aging or the like (Holt, IJ et al., Na
ture(London),331,717-719(1988)) 。 ture (London), 331,717-719 (1988)).

【0004】従って、上記相同的組換え異常に関与する変異遺伝子を単離し、その役割を知ることにより、該変異遺伝子の検出やその修正をミトコンドリアに関する病気の診断や治療、老化の予防等に利用することが可能となる。 [0004] Thus, isolated mutant genes involved in the homologous recombination abnormal, usage by knowing its role, the detection and the correction of the mutant gene diagnosis and treatment of diseases related to mitochondrial prevention of aging etc. it is possible to become. ところで、ほとんどのミトコンドリアのタンパク質は核染色体上でコードされており、ミトコンドリアの相同的組換えも、ほとんど核内の遺伝情報に依存することが予測されている。 Incidentally, most of mitochondrial proteins are encoded on the nuclear chromosome, homologous recombination mitochondria, are expected to be dependent on the genetic information of most the nucleus.

【0005】従って、ミトコンドリアの相同的組換えの役割及び機構を理解するためのステップとして、ミトコンドリアの相同的組換えの欠損を引き起こす変異を持つ遺伝子、すなわち、核内における変異遺伝子を単離することが挙げられる。 Accordingly, as a step toward understanding the homologous recombination of the role and mechanism of mitochondrial gene with a mutation that causes a defect in the homologous recombination of mitochondrial, i.e., isolating the mutant gene in the nucleus and the like.

【0006】 [0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ミトコンドリアの相同的組換えをもたらす核染色体の遺伝子及びその突然変異遺伝子を提供することを目的とする。 [0008] The present invention aims at providing a gene and its mutant gene of a nuclear chromosome resulting in homologous recombination mitochondria.

【0007】 [0007]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、有核細胞と無核細胞とを細胞融合させることにより、細胞核内のミトコンドリア相同的組換えに働く変異遺伝子を検出し、これをクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。 Means for Solving the Problems The present inventor has conducted intensive research based on the above-mentioned problems, the nucleated cells and non-nucleated cells by cell fusion, the mitochondrial homologous recombination in the cell nucleus detecting a mutant gene that acts, which was succeeded in cloning, and have completed the present invention.

【0008】すなわち、本発明は、配列番号1で表される野性型MHR1タンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくとも第99番目の1個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変異型mhr1遺伝子である。 Namely, the present invention is the amino acid sequence of wild type MHR1 protein represented by SEQ ID NO: 1, variants encoding a polypeptide comprising at least a 99 th one amino acids are mutated mhr1 it is a gene. 変異したアミノ酸配列としては、配列番号2で表されるものが挙げられる。 The mutated amino acid sequence, include those represented by SEQ ID NO: 2. ここで、「MHR1タンパク質」とは、野性型MHR1遺伝子(細胞核内のミトコンドリア相同的組換えに働く野性型遺伝子)の発現によって得られるタンパク質をいい、「変異型mhr1遺伝子」とは、MHR1遺伝子の変異型、すなわち、細胞核内のミトコンドリア相同的組換えの欠損を引き起こす変異型の遺伝子をいう。 Here, "MHR1 protein" refers to a protein obtained by expression of wild-type MHR1 gene (wild-type gene acting mitochondrial homologous recombination in the cell nucleus), a "mutant mhr1 gene", the MHR1 gene mutant, namely, it refers to a mutant gene that causes a defect in mitochondrial homologous recombination in the cell nucleus.

【0009】また、「変異したアミノ酸配列」とは、ミトコンドリア相同的組換えの欠損を引き起こす機能を有する遺伝子によってコードされ、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第99番目に位置するアミノ酸を含む少なくとも1個のアミノ酸が、別のアミノ酸に置換、挿入又は欠失された配列であることを意味する。 Further, the term "mutated amino acid sequence", is encoded by a gene having a function of causing a defect in mitochondrial homologous recombination, comprising the amino acids located 99th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 means that at least one amino acid substitution by another amino acid, which is inserted or deleted sequences. したがって、 Therefore,
上記第99番目のアミノ酸に置換、挿入、欠失等が起こり、かつ、ミトコンドリア相同的組換えの欠損を引き起こす機能を有するかぎり、第99番目以外のアミノ酸が、 Substituted to the 99th amino acid, insertion occurs deletions, etc., and, as long as having the function of causing a defect in mitochondrial homologous recombination, amino acids other than the 99 th,
該アミノ酸配列とは異なるアミノ酸に置換され、該アミノ酸が欠失し、又はアミノ酸が挿入されてもよいことを意味する。 Is substituted with a different amino acid than the amino acid sequence, the amino acid is deleted, or amino acids means that may be inserted.

【0010】さらに、本発明は、前記遺伝子を含む組換え体プラスミドである。 Furthermore, the present invention is a recombinant plasmid containing the gene. 以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail. 本発明の遺伝子をクローニングするにあたり、まず、ミトコンドリアDNAの相同的組換え欠損を示す変異遺伝子の有無を検出する。 Upon cloning the gene of the present invention first detects the presence or absence of a mutant gene that indicates a homologous recombination deficient in mitochondrial DNA. 次に、検出の結果、変異遺伝子を持つことがわかった細胞に対して野性型遺伝子を含む酵母ゲノムライブラリーを導入し、目的とする野性型遺伝子をクローニングする。 Then, the result of the detection, by introducing a yeast genomic library containing the wild-type gene to the cell in which it was found that with a mutant gene, cloning the wild-type gene of interest. クローニングは、変異株細胞において変異された特定の性質、例えばDNA傷害修復欠損、組換え欠損又は温度感受性変異等に関与する遺伝子の変異を相補する遺伝子、すなわち野性型遺伝子を釣り上げることにより行う。 Cloning is carried out specific properties that are mutated in the mutant cell lines, such as DNA damage repair deficient, gene complementing a mutation in a gene involved in recombination deficient or temperature sensitive mutation or the like, namely by lifting the wild-type gene. 次に、本発明の変異型遺伝子をクローニングするために、野性型遺伝子の塩基配列にしたがってプライマーを設計する。 Next, in order to clone the mutant gene of the present invention, primers are designed according to the base sequence of the wild-type gene. そして、変異株細胞の全ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行う。 Then, PCR perform the total genomic DNA of the mutant cells as a template. 最後に、得られた変異型遺伝子の塩基配列を決定し、野性型の塩基配列と比較して変異部位を求めることにより本発明の遺伝子をクローニングすることができる。 Finally, it is possible to obtained to determine the nucleotide sequence of the mutant gene, cloning the gene of the present invention by obtaining a comparison to the mutation site and the base sequence of the wild type. 1. 1. 変異遺伝子の検出 変異遺伝子の有無の検出は、特定のマーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子等)を有するミトコンドリアを含む有核細胞と、前記マーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子を有するミトコンドリアを含む無核細胞とを細胞融合させ、得られる融合細胞の中から前記マーカー遺伝子に対応するそれぞれの抗生物質耐性で選択することにより、ミトコンドリア相同的組換え頻度を測定し、 Detection of the presence or absence of the detection mutant gene of the mutant gene, specific marker genes (e.g., antibiotic resistance gene, etc.) and nucleated cells containing mitochondria having a seedless containing mitochondria having a different marker gene and the marker gene the cells were cell fusion, by selecting the respective antibiotic resistance corresponding to the marker gene from the obtained fused cells were measures mitochondrial homologous recombination frequency,
その低下よりミトコンドリア相同的組換えに関与する遺伝子の変異の有無を検出することにより行われる。 It is performed by detecting the presence or absence of a mutation of a gene involved in mitochondrial homologous recombination than its decrease. ここで、変異遺伝子については、優性であると劣性であるとを問わず、その有無を検出することができる。 Here, the mutated gene, regardless of the which is recessive to be dominant, it is possible to detect the presence or absence.

【0011】その手法は以下のように行われ、図1にその概要を示す。 [0011] As a technique is performed as follows, it shows the outline in Figure 1. 図1において、まず、細胞融合の対象となる2種類の細胞を調製する。 In Figure 1, first, prepare two cells to be cell fusion. 一方の細胞を受容細胞1 One of the cell receptor cell 1
(レシピエント細胞)、他方の細胞を供与細胞2(ドナー細胞)とする。 (Recipient cells), to the other cells and donor cells 2 (donor cells). 受容細胞1は検出の対象となる細胞であり、その細胞内に核5及びミトコンドリア3を含む有核細胞である。 Recipient cell 1 is a cell to be detected, a nucleated cell comprising a nucleus 5 and mitochondria 3 in its cell. そして、核5内には、ミトコンドリア相同的組換え正常遺伝子又は劣性若しくは優性変異遺伝子のいずれかが存在する。 Then, the nucleus 5, there either mitochondrial homologous recombination normal gene or recessive or dominant mutant gene. 受容細胞1の種類としては、酵母細胞又は動物若しくは植物の培養細胞等が挙げられる。 The types of the recipient cell 1 include cultured cells of the yeast cells or animal or plant.

【0012】一方、供与細胞2は、その細胞内のミトコンドリア4を受容細胞1内に提供する役割を果たす細胞であり、薬剤(例えばノコダゾール等)処理により予め核6が除かれており、前記ミトコンドリア4は含むが核6は含まない無核細胞である。 Meanwhile, donor cell 2, the mitochondria 4 in the cell is a serving cell provided within the recipient cell 1, the drug (e.g., nocodazole, etc.) are pre-nucleus 6 is removed by the process, the mitochondria 4 is a seedless cells do not include nuclear 6 comprises. 従って、供与細胞2内のミトコンドリアが相同的組換えを起こすか否かは、核6 Therefore, whether the mitochondria in donor cell 2 causes homologous recombination, nuclear 6
の遺伝情報とは無関係である。 It is independent of the genetic information of. なお、供与細胞2としては、受容細胞と同一生物種の細胞が挙げられる。 As the donor cell 2 include recipient cell of the same species cells.

【0013】なお、細胞の調製、細胞継代(培養)等については、従来より一般的に知られている手法を用いて行うことができる。 [0013] Preparation of a cell, for such cell passages (culture) can be carried out using techniques known from the general prior art. 受容細胞1内のミトコンドリア3及び供与細胞2内のミトコンドリア4それぞれのDNA内には、それぞれ別のマーカー遺伝子が存在する。 The recipient cell mitochondria 3 and mitochondria 4 in the respective DNA in donor cells 2 in 1, separate marker gene is present. ミトコンドリア3内の耐性遺伝子をマーカー遺伝子(I)とし、 Resistance gene in the mitochondria 3 and marker gene (I),
ミトコンドリア4内の耐性遺伝子をマーカー遺伝子(I Marker genes resistant gene in mitochondria 4 (I
I) とする。 I) to be. マーカー遺伝子は、後述する融合細胞の選択の際必要となる遺伝子である。 Marker gene is a gene that is required in the selection of which will be described later fused cells. 例えば、マーカー遺伝子(I)がクロラムフェニコール耐性遺伝子であれば、 For example, a marker gene (I) is as long as the chloramphenicol resistance gene,
かかる遺伝子は選択に用いる抗生物質をクロラムフェニコールとしたときに必要であり、マーカー遺伝子(II) Such genes are required when a chloramphenicol antibiotic used for selection, marker gene (II)
がオリゴマイシン耐性遺伝子であれば、かかる遺伝子は選択に用いる抗生物質をオリゴマイシンとしたときに必要である。 There if oligomycin resistance gene, such a gene is necessary when the antibiotic used for selection and oligomycin.

【0014】但し、マーカー遺伝子(I)又は(II) [0014] However, the marker gene (I) or (II)
は、それぞれ同一の遺伝子とはならず、また、その種類に特に限定はなく、例えばオリゴマイシン耐性遺伝子、 Is not the same gene, respectively, also are not particularly limited in its kind, for example, oligomycin resistance gene,
クロラムフェニコール耐性遺伝子又はアンチマイシン耐性遺伝子等を適宜組み合わせて用いることができる。 Chloramphenicol resistance gene or antimycin resistance gene to can be combined as appropriate. 本発明では、その一例として、受容細胞1のミトコンドリア3についてはマーカー遺伝子(I)としてクロラムフェニコールに耐性の遺伝子(以下「Chl R 」という)、 In the present invention, as an example, genes resistant to chloramphenicol as a marker gene (I) for the mitochondria 3 recipient cell 1 (hereinafter referred to as "Chl R"),
供与細胞2のミトコンドリア4についてはマーカー遺伝子(II) としてオリゴマイシンに耐性の遺伝子(以下「Oli 1 R 」という)を有するミトコンドリア遺伝子を挙げて説明する。 Donor for the mitochondria 4 cell 2 will be described by way of mitochondrial gene having a gene for resistance to oligomycin (hereinafter referred to as "Oli 1 R") as a marker gene (II).

【0015】次に、上記受容細胞1と供与細胞2とを細胞融合法により細胞融合を行う。 [0015] Next, the cell fusion by a cell fusion method the recipient cell 1 and the donor cell 2. 細胞融合法は、適当な薬剤(例えばリティカーゼ等)で両細胞の細胞壁を除いた後、ポリエチレングリコール等を用いた一般に知られている細胞融合法により行えばよい。 Cell fusion method, after removing the cell wall of both cells with a suitable agent (e.g. lyticase etc.), may be performed by a cell fusion method known commonly with polyethylene glycol, and the like. また、細胞壁再生についても、一般的な方法を利用すればよい。 As for the cell wall regeneration may be using a general method. 細胞融合が正常に行われると、新たな受容細胞(融合細胞7)内にミトコンドリア3及びミトコンドリア4が混合して含まれる。 When cell fusion is successful, mitochondria 3 and mitochondrial 4 are included by mixing into new recipient cell (fused cells 7). そして、細胞融合後は、ミトコンドリアDNAの相同的組換えについては受容細胞1由来の核5内における遺伝情報のみに依存する(支配される)ことになる。 After cell fusion, the homologous recombination of mitochondrial DNA will depend only on the genetic information in the nucleus 5 from the recipient cell 1 (dominated).
但し、この段階では核5内の相同的組換え遺伝子が、正常のものであるか、又は劣性若しくは優性変異のものであるかは不明である。 However, homologous recombination gene in the nucleus 5 at this stage, whether those of normal, or is of recessive or dominant mutation is unknown.

【0016】そこで、まず、カナバニン(2-アミノ-4- [0016] Accordingly, first, canavanine (2-amino-4-
(グアニジノオキシ) 酪酸) を添加した培地で培養することで核5をもつ細胞のみを選択する。 To select only cells with nuclei 5 by culturing in medium supplemented with (guanidino oxy) butyric acid). この目的のために、核5の染色体にはカナバニン耐性の劣性変異遺伝子、例えば「can1」を予め持たせておく。 For this purpose, the chromosomal nuclear 5 advance by previously have recessive mutant gene of canavanine resistance, for example, "can1". その結果、供与細胞の中に混在することが避けられない核6をもつ細胞、及び核6をもつ細胞との融合の結果できる2 As a result, cells with nuclei 6 is inevitably mixed into the donor cells, and can result in fusion with the cell with nucleus 6 2
倍体細胞が完全に除かれる。 Diploid cells are completely eliminated. また、この培養の間に、個々の細胞はミトコンドリア3、ミトコンドリア4又は両者の組換え型ミトコンドリア8のいずれかのみをもつようになる。 Furthermore, during the culture, the individual cells will have only one of the mitochondria 3, mitochondrial 4 or both recombinant mitochondria 8.

【0017】次に、前記融合細胞の中から、オリゴマイシン添加培地で培養してOli 1 R (受容細胞1由来のマーカー遺伝子)を受け継いだミトコンドリアをもつ融合細胞を選択する。 Next, from among the fused cells, selecting fused cells with mitochondria inherited the (marker gene from recipient cells 1) Oli 1 R and cultured with oligomycin-added medium. 次に、クロラムフェニコールを添加した培地で培養することでChl R (供与細胞2由来のマーカー遺伝子)を受け継いだ組換え型ミトコンドリアをもつ細胞を選択する。 Next, select the cells with Chl R recombinant mitochondria inherited the (marker gene from donor cells 2) by culturing in a medium supplemented with chloramphenicol.

【0018】ここで、核5内の相同的組換え遺伝子が変異遺伝子である場合は、該変異遺伝子はミトコンドリア相同的組換えに働くことができず、細胞融合とそれに続く培養の結果、融合細胞7内にミトコンドリア3又はミトコンドリア4がそれぞれ単独で存在する。 [0018] Here, if the homologous recombination gene in the nucleus 5 is a mutant gene, the mutant gene can not work in mitochondrial homologous recombination, the result of cell fusion and subsequent culture, the fused cells mitochondrial 3 or mitochondrial 4 is present singly in the 7. 従って、オリゴマイシン及びクロラムフェニコールによってそれぞれミトコンドリア3をもつ細胞及びミトコンドリア4をもつ細胞が除去され、最終的に組換え型ミトコンドリアを含む細胞は得られない。 Therefore, cells with cells and mitochondrial 4 with mitochondrial 3 respectively are removed by oligomycin and chloramphenicol, final cells containing recombinant mitochondria can not be obtained.

【0019】一方、核5内の相同的組換え遺伝子が正常遺伝子である場合は、該遺伝子はミトコンドリア3のDN Meanwhile, if the homologous recombination gene in the nucleus 5 is a normal gene, said gene DN mitochondrial 3
Aとミトコンドリア4のDNAとの相同的組換えに働き、受容細胞1及び供与細胞2双方由来のミトコンドリアが組換えられた形態であるミトコンドリア8(同一ミトコンドリアDNA上にChl R及びOli 1 Rの両方のマーカー遺伝子を有する)が得られる。 Both A and Functions for homologous recombination with the DNA of mitochondria 4, Chl R and Oli 1 R mitochondrial 8 (on the same mitochondrial DNA in the form of the recipient cell 1 and donor cell 2 both derived from mitochondria recombined of a marker gene) can be obtained. 従って、オリゴマイシン及びクロラムフェニコール選択によってミトコンドリア8をもつ細胞のみが死滅せずに結果物として得られる。 Therefore, the resulting product without killing only cells with mitochondria 8 by oligomycin and chloramphenicol selection.

【0020】最終的に組換え型ミトコンドリアを含む細胞が得られた場合は、受容細胞1内の核5は、ミトコンドリア相同的組換えに対する正常遺伝子を持つものであると判断し、組換え型ミトコンドリアを含む細胞が得られなかった場合は、受容細胞1内の核5は劣性又は優性の変異遺伝子を持つものであると判断することができる。 [0020] When finally cells containing recombinant mitochondria were obtained, nuclear 5 in the recipient cell 1 is determined to be those with a normal gene for mitochondrial homologous recombination, recombinant mitochondria If cells containing is not obtained, the nuclear 5 in the recipient cell 1 can be determined to be those with the mutant gene recessive or dominant.

【0021】なお、変異遺伝子が優性変異遺伝子であるか劣性変異遺伝子であるかの判断は、本発明によって得られた組換え体の出現頻度と、従来法(供与細胞の核を除かない細胞と受容細胞とを細胞融合させる方法)によって得られた組換え体の出現頻度とを比較すればよい。 [0021] Incidentally, the judgment of whether the mutant gene is a recessive mutant gene or a dominant mutant gene, and frequency of recombinants obtained by the present invention, the conventional method (cells not exclude the nuclei of donor cells the recipient cells may be compared with the frequency of the resulting recombinant by the method) for cell fusion.
即ち、従来法により変異遺伝子をもつ一倍体細胞と正常遺伝子をもつ一倍体細胞とを掛け合わせを行った結果、 That is, a result of multiplying the haploid cells with a haploid cells and normal genes with mutated gene by conventional methods,
正常遺伝子をもつ一倍体細胞同士を掛け合わせた場合と同じ頻度で組換え型ミトコンドリアをもつ二倍体細胞が出現した場合、変異遺伝子は劣性変異遺伝子と判断する。 If diploid cells with a recombinant mitochondrial as often as when multiplied by the haploid cells together with normal genes has appeared, the mutant gene is determined that the recessive mutant gene. 一方、組換え型ミトコンドリアをもつ二倍体細胞が現れない場合、変異遺伝子は優性変異遺伝子と判断する。 On the other hand, if no appear diploid cells with a recombinant mitochondrial mutant gene determines the dominant mutant gene. 2. 2. 遺伝子のクローニング 以上の検出方法によって検出された優性又は劣性変異の原因遺伝子を、分子生物学的手法によりそれぞれクローニングする。 The gene responsible for the detected dominant or recessive mutation by cloning or detection method of gene, respectively cloned by molecular biological techniques.

【0022】本発明では、ミトコンドリアDNAの相同的組換えを損う核染色体の劣性変異遺伝子mhr1の原因遺伝子を取得するため、まず、野性型の酵母DNAであるMHR1 [0022] In the present invention, in order to obtain the gene responsible for recessive mutant gene mhr1 of waste cormorants nuclear chromosome homologous recombination of mitochondrial DNA, it is first wild-type yeast DNA MHR1
をクローニングする。 The cloning. 次に、得られた野性型MHR1遺伝子のオープンリーディングフレームの周辺領域の塩基配列をプライマーとして変異型遺伝子を有する細胞の全DNA Then, all of the cells with the mutant gene the nucleotide sequence around the region of the open reading frame of the wild-type MHR1 gene obtained as a primer DNA
を鋳型としてPCR(ポリメラーゼチェーン反応)を行うことにより変異型遺伝子をクローニングすることができる。 It is possible to clone the mutant gene by performing PCR (polymerase chain reaction) as template. (1) 野性型の酵母ゲノムDNAライブラリーの作成 上記検出方法によって検出された野性型の細胞から染色体DNAを抽出する方法としては、公知のいずれの方法をも使用できる。 (1) As a method for extracting a wild-type yeast genomic DNA library for creating the detection method chromosomal DNA from to wildtype cells detected by you can also use any known method.

【0023】次に、得られた染色体DNAを制限酵素Sau3A [0023] Next, limit the obtained chromosomal DNA enzyme Sau3A
Iにより完全消化し、染色体DNAの制限酵素Sau3AI断片を得る。 It was completely digested with I, to obtain a restriction enzyme Sau3AI fragment of chromosomal DNA. 次いで、Sau3AI断片を通常のアガロースゲル電気泳動法に供し、所望の鎖長の断片を含むゲルを切り出す。 Then subjected to Sau3AI fragment to conventional agarose gel electrophoresis, cut out a gel containing a fragment of the desired chain length. 切り出したゲル中のDNA断片を、フェノール/クロロホルム等により精製し、更にエタノール沈殿等により濃縮して、純化された断片を得る。 The DNA fragments in the excised gel, purified by phenol / chloroform, and further concentrated by ethanol precipitation or the like to obtain the purified fragment.

【0024】純化されたSau3AI断片を、適当なベクター [0024] The purified the Sau3AI fragment, a suitable vector
DNAのBamHI切断部位に挿入して組み換え体DNAを作成し、該組み換え体DNAを用いて、宿主細胞を形質転換又は形質導入すれば、ゲノミックDNAライブラリーを作成することができる。 And inserted into the BamHI cleavage site of the DNA to create recombinant DNA, by using the recombinant DNA, if a host cell transformed or transduced, it is possible to create a genomic DNA library. ここで用いられる宿主細胞としては、大腸菌のDH5α、JM109 などが挙げられる。 As the host cell used herein, DH5 [alpha E. coli, and the like JM109. (2) プラスミドDNAの抽出 導入されたゲノムライブラリーを、変異株に導入する。 (2) the extracted introduced genomic library of plasmid DNA, is introduced into the mutant strain.
酵母の形質転換法は以下の通りである(H.Ito et al., Transformation method of yeast is as follows (H.Ito et al.,
J. Bacteriol. 153 (1983), 163.)。 J. Bacteriol. 153 (1983), 163.).

【0025】30℃でYPD液体培地(1%酵母エキス,2 The YPD liquid medium at 30 ° C. (1% yeast extract, 2
%ポリペプトン及び2%グルコース)で生育した変異株細胞を10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5 )の存在下で1mMの塩化リチウムで処理する。 Treatment with 1mM of lithium chloride in the presence of hydrochloric acid buffer (pH 7.5) -% polypeptone and 2% glucose) mutant cells grown with 10mM Tris. その後、約75mg/ml のサケ精子と40%ポリエチレングリコール4000の存在下で、ゲノムライブラリーを処理後、変異株細胞に形質転換する。 Thereafter, in the presence of salmon sperm and 40% polyethylene glycol 4000 to about 75 mg / ml, after treatment a genomic library, transformed into mutant cells.

【0026】このようにして導入された変異株を、ヒスチジン及びトリプトファンを含むSD寒天培地(2%グルコース,0.67%のアミノ酸不含酵母エキス及び2%寒天を含む培地)にまき、生育するコロニーを得る。 [0026] Such mutants introduced in the, SD agar medium containing histidine and tryptophan were seeded (2% glucose, culture medium containing 0.67% amino acid non 含酵 base extract and 2% agar), and colonies grown obtain. 次に、得られるコロニーをグリセロールを含む寒天培地にレプリカし、37℃で生育するコロニーを得る。 Then, the replica obtained colonies on an agar medium containing glycerol, obtain colonies growing at 37 ° C.. 得られたコロニーを、ヒスチジン及びトリプトファンを含むSD液体培地(2%グルコース,0.67%のアミノ酸不含酵母エキス)で培養し、培養菌体を得る。 The obtained colony was cultured in SD liquid medium containing histidine and tryptophan (2% glucose, 0.67% amino acid non 含酵 mother extract), obtaining cultured cells. ガラスビーズで酵母の菌体を破壊し、得られた無細胞抽出液を大腸菌(例えばDH5α)に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン,0.5 %酵母抽出物,0.5 %Na With glass beads to disrupt the cells of yeast, obtained cell-free extract was introduced into E. coli (e.g. DH5 [alpha), LB agar medium (1% Bacto tryptone containing ampicillin, 0.5% yeast extract, 0.5% Na
Cl, 2%寒天,pH7.2)に塗布する。 Cl, 2% agar, is applied to pH 7.2). 生育したコロニーを、さらにアンピシリンを含むLB液体培地で培養することにより、プラスミドDNAを抽出することができる。 The grown colonies, further by culturing in LB liquid medium containing ampicillin, can be extracted plasmid DNA. (3) DNAのサブクローニング及び塩基配列決定 得られたプラスミドを、ClaI、BamHI、MluIなどの制限酵素を用いて消化し、DNA断片を切り出す。 (3) Subcloning and sequencing the resulting plasmid DNA, digested with ClaI, BamHI, a restriction enzyme such as MluI, cut out DNA fragments. その中から、mhr1変異株の組換え欠損、温度感受性変異又は紫外線照射によるDNA 傷害修復欠損等に対して相補性を示す Among them, shows complementarity to the recombination deficient, DNA damage repair deficient due temperature-sensitive mutations or ultraviolet irradiation mhr1 mutant
DNA断片をサブクローニングする。 Subcloning the DNA fragment. サブクローニングは、短く切断したDNA断片をYCp50 プラスミドに挿入し、前記酵母への形質転換法(H.Ito et al., J. Bacte Subcloning inserts the shortened cleaved DNA fragments YCp50 plasmid transformation method to the yeast (H.Ito et al., J. Bacte
riol. 153 (1983), 163.)を用いて、これらのDNA断片を変異株細胞に導入することにより行う。 riol. 153 (1983), 163.) using, carried out by introducing these DNA fragments in mutant cells. 得られた最も短いDNA断片をさらにプラスミドpUC118に挿入する。 The shortest DNA fragment obtained further inserted into plasmid pUC118 to. そして、公知方法(例えばジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等)によりその塩基配列を決定する。 The known methods (e.g. dideoxy method, Maxam - Gilbert method) to determine its nucleotide sequence by.

【0027】なお、この遺伝子が酵母の染色体のどの位置に存在するか否かは、断片をプローブとして、パルスフィールド電気泳動で分けた酵母の16本の染色体上に対して、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより調べることができる。 [0027] Note that whether this gene is present in any position of the chromosome of yeast, the fragment as a probe against 16 of the upper chromosomes of yeast separated by pulsed field gel electrophoresis, performing Southern hybridization it can be examined by. (4) mhr1遺伝子のクローニングと変異部位の決定 変異株のmhr1遺伝子をクローニングし、さらに該遺伝子の変異部位を検索する。 (4) Cloning of mhr1 gene was cloned mhr1 genes determining mutants mutation sites, further searches the mutation site of the gene.

【0028】mhr1変異株から、まず全ゲノムDNA を調製する。 [0028] from mhr1 mutant strain, first prepared the total genomic DNA. すなわち、YPD液体培地で30℃、48時間生育したm That, 30 ° C. in YPD liquid medium and grown for 48 hours m
hr1変異株細胞をチモリアーゼ100T(Zymolyase-100T; S hr1 mutant cells Chimoriaze 100T (Zymolyase-100T; S
eikagaku Corporation, Tokyo, Japan)で細胞壁を除去した後、1%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム; Sodium eikagaku Corporation, Tokyo, Japan) after removal of the cell wall in, 1% SDS (sodium lauryl sulfate; Sodium
Lauryl Sulfate)の存在下、細胞を破砕させる。 The presence of Lauryl Sulfate), to disrupt the cells. そして、抽出液に対して、公知のDNA分離・精製手順(C.Gut Then, the extract, known DNA separation and purification steps (C.Gut
hrie and GRFink; Molecular Biology Academic Pres hrie and GRFink; Molecular Biology Academic Pres
s Inc. San Diego, California, 1991)に従って、mhr1 s Inc. San Diego, according to the California, 1991), mhr1
変異株の全ゲノムDNAを調製する。 To prepare the total genomic DNA of the mutant strain.

【0029】mhr1変異株から得られた全ゲノムDNAについて、PCR を行う。 [0029] The total genomic DNA obtained from the mhr1 mutant, perform PCR. PCRは、前記クローニングしたMHR1 PCR was the cloned MHR1
遺伝子のオープンリーディングフレームの周辺領域の塩基配列をプライマー(プライマーは、化学合成により得ることができる)として行う。 The nucleotide sequence around the region of the open reading frame of the gene (primer may be obtained by chemical synthesis) performed as. そして、10mMTris-HCl、 Then, 10mMTris-HCl,
1.5mM MgCl 2 、50mM KCl、0.125mMの各dNTP、1pmolのプライマー、1.25 Uのtaq DNA ポリメラーゼ(Boehringe 1.5mM MgCl 2, 50mM KCl, each dNTP 0.125 mM, primers 1 pmol, 1.25 U of taq DNA polymerase (Boehringe
r Mannheim 社製)を含む反応混合液で行うことができる。 r Mannheim Co.) can be carried out in a reaction mixture containing.

【0030】次に、得られたmhr1遺伝子をpUC118のHinc [0030] Next, the mhr1 gene obtained of pUC118 Hinc
IIの位置に挿入し、その塩基配列を決定する。 Insert the II position to determine its nucleotide sequence. 塩基配列の決定法は、前記方法と同様である。 Determination of nucleotide sequence is the same as the method.

【0031】 [0031]

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, will be described more specifically by the present invention through examples. 但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 However, the present invention is not limited to these examples. 〔実施例1〕 変異遺伝子の検出 (1) 供与細胞の調製 ω - -Oli 1 Rのミトコンドリア遺伝子型を示す供与細胞(「ω - 」はミトコンドリア遺伝子内にω・イントロンがないことを意味し、「ω + 」はミトコンドリア遺伝子内にω・イントロンがあることを意味する)を調製するため、OP11c-55R5細胞(酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) 由来)を、1%DMSOを含む15μg/mlノコダゾール(新たに娘細胞を形成する際に核の移動を阻害する(Jacobs,CW et al., J. Cell EXAMPLE 1 Preparation of Detection (1) donor cells mutated genes ω - -Oli 1 donor cells showing mitochondrial genotype R ( "omega -" means that no omega · intron in the mitochondrial genes, "omega +" is to prepare the meaning) that there is omega-intron in mitochondrial genes, OP11c-55R5 cells (yeast Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) origin), 15 [mu] g / ml containing 1% DMSO nocodazole (freshly inhibit movement of the nuclei in forming daughter cells (Jacobs, CW et al., J. cell
Biol.,107, 1409-1426 (1988); Sigma社製))を添加した . Biol, 107, 1409-1426 (1988); was added Sigma))
10mlのYPGly 培地に1.5 ×10 6細胞/ml で50ml Falcon 50 ml Falcon at 1.5 × 10 6 cells / ml in YPGly medium 10ml
チューブに懸濁した。 It was suspended in a tube. 18℃で20時間インキュベートした後、4本のチューブ(それぞれ約2.2 ×10 6細胞/ml)を遠心し(1,400×g,4℃で5分間)、および20mlのK 18 After incubation for 20 hours at ° C., and centrifuged four tubes (approximately 2.2 × 10 6 cells / ml, respectively) (1,400 × g, 4 ° C. for 5 minutes), and 20ml of K
PS緩衝液(1.2 M ソルビトール, 50mMリン酸カリウム緩衝液, pH7.5)で1回の洗浄を行い、1本の50mlチューブ(Falcon) に細胞を回収した。 PS buffer (1.2 M sorbitol, 50mM potassium phosphate buffer, pH 7.5) for 1 wash, the cells were collected into one 50ml tube (Falcon). 母細胞から無核細胞を分離するために、上記細胞を10mlのKPS緩衝液に再懸濁し、超音波破壊機(UR-200P 型, トミー精巧社製) を用いて0℃で3分間音波処理を行った(強度4/11)。 In order to separate the non-nucleated cells from the mother cell, resuspended the cells in KPS buffer 10 ml, 3 min sonication at 0 ℃ using an ultrasonic disrupter (UR-200P type, manufactured by Tomy elaborate Co.) It was performed (intensity 4/11).

【0032】本発明者は、DAPI-染色後の蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡により、懸濁液中に完全な無核細胞が形成されていることを確認した。 [0032] The present inventors have, DAPI-by fluorescence microscopy and phase contrast microscopy after staining, it was confirmed that complete non-nucleated cells are formed in the suspension. 処理した懸濁液を遠心し(1,400×g,4℃,5分間)、沈殿物を200 μl のKPS緩衝液中に再懸濁した。 The suspension thus treated was centrifuged (1,400 × g, 4 ℃, 5 min) and resuspended the precipitate in KPS buffer 200 [mu] l. この懸濁液をガラス管(12.5(D)×105(L)mm) 内で、それぞれ1mlの10%、15 The suspension glass tube in (12.5 (D) × 105 (L) mm), 10% of 1ml respectively, 15
%、20%、25%及び30%Ficoll 400 (Pharmacia Biopro %, 20%, 25% and 30% Ficoll 400 (Pharmacia Biopro
cess Technology AB) を用いたFicoll勾配を行った。 cess Technology AB) was Ficoll gradient was used. 15 15
0×gで30分間、30℃で勾配遠心した後は、15%Ficoll 0 × g for 30 minutes, after the gradient centrifugation at 30 ° C., 15% Ficoll
画分は、DAPI染色後の顕微鏡観察において約70%の無核細胞を含んでいた。 Fraction comprised about 70% seedless cells in a microscope observation after DAPI staining. 従って、15%Ficoll画分を回収し、 Accordingly, it recovered 15% Ficoll fraction
KPS緩衝液で2倍に希釈し、1,400 ×gで5分間、30 It diluted 2-fold with KPS buffer, 5 minutes at 1,400 × g, 30
℃で遠心分離することにより細胞を回収した。 Cells were harvested by centrifugation at ° C.. 3mlのK 3ml of K
PS緩衝液で1度洗浄後、母細胞と無核細胞との混合物を1,400×gで5分間、30℃で遠心分離し、1mlのKP After once washing with PS buffer, 5 minutes a mixture of the mother cell and non-nucleated cells in 1,400 × g, it was centrifuged at 30 ° C., 1 ml of KP
S緩衝液に再懸濁した。 And resuspended in S buffer.

【0033】なお、上記OP11c-55R5細胞はSaccharomyce [0033] It should be noted that the above-mentioned OP11c-55R5 cells Saccharomyce
s cerevisiae OP11-55R5と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-14988として寄託されている。 Referred to as an s cerevisiae OP11-55R5, the Agency life Institute of Advanced Industrial Science and Technology, it has been deposited as FERM P-14988. (2) 受容細胞の調製 受容細胞として、IL166-187 細胞、この細胞株の変異体及びUV11細胞を調製した。 (2) Preparation recipient cell recipient cell, IL166-187 cells, mutants were prepared and UV11 cells of this cell line. IL166-187 細胞は、酵母であるサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevi IL166-187 cells, Saccharomyces cerevisiae is a yeast (Saccharomyces cerevi
siae) の1株であり、正常遺伝子「MHR1」を核内に持ち、ミトコンドリア遺伝子型が「ω + Chl R 」である野性型ものである。 siae) is 1 share of, have a normal gene "MHR1" in the nucleus, but wild-type mitochondrial gene type is "ω + Chl R". IL166-187 細胞株の変異体であるFL67 IL166-187 is a variant of the cell lines FL67
細胞は、前記IL166-187 細胞をエチルメタンスルフォン酸処理で変異を導入した細胞であり、変異遺伝子「mhr Cells are cells transfected with the mutant said IL166-187 cell with ethyl methanesulfonic acid treatment, the mutant gene "mhr
1」を核内に持ち、ミトコンドリア遺伝子型が「ω + Chl Has 1 "in the nucleus, mitochondrial genotype" ω + Chl
R 」のものである。 R "is intended. また、UV11細胞も、前記IL166-187 In addition, UV11 cells also said IL166-187
細胞を、FL67細胞を作製したのと同様の処理で調製した細胞であり、正常遺伝子であるか、劣性又は優性変異遺伝子であるかは不明の遺伝子を核内に持ち、ミトコンドリア遺伝子型が「ω + Chl R 」のものである。 The cells are cells which were prepared in a similar process to that prepared FL67 cells, whether the normal gene, or a recessive or dominant mutant gene has an unknown gene in the nucleus, mitochondria genotype "ω + Chl R "is intended.

【0034】なお、上記IL166-187 細胞はSaccharomyce [0034] It should be noted that the above-mentioned IL166-187 cells Saccharomyce
s cerevisiae IL166-187と称し、及びFL67細胞はSaccha Called s cerevisiae IL166-187, and FL67 cells Saccha
romyces cerevisiae FL67 と称し、工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれFERM P-14989、FERM P-149 Referred to as the romyces cerevisiae FL67, the Agency life Institute of Advanced Industrial Science and Technology, respectively, FERM P-14989, FERM P-149
87として寄託されている。 It has been deposited as 87. (3) 細胞融合 無核細胞及び母細胞の懸濁液(前記(1)で調製した供与細胞)と、前記(2) で調製した受容細胞とを、それぞれ3:1(3×10 6細胞:1×10 6細胞)の割合で100μl (3) a cell fusion anuclear cells and mother cells suspension (the (donor cells prepared in 1)), the a recipient cell prepared in (2), respectively, 3: 1 (3 × 10 6 cells : 100 [mu] l at a ratio of 1 × 10 6 cells)
KPS緩衝液中に混合した。 KPS was mixed in a buffer solution. 50単位のリティカーゼ(Boe Of 50 units lyticase (Boe
hirnger Mannheim Gmbh, 10,000 単位/ml)を混合液に加え、30℃で30分保温してスフェロプラスト(細胞壁が取り除かれた細胞)を形成した。 hirnger Mannheim Gmbh, added to the mixture of 10,000 units / ml), it was formed spheroplasts (cells cell wall has been removed) by incubating 30 minutes at 30 ° C.. スフェロプラストは1,00 Spheroplasts 1,00
0×gで5分間、30℃で遠心分離することにより回収し、更に1mlのKPS緩衝液で2回洗浄し、1,000×g 0 × g for 5 min, and collected by centrifugation at 30 ° C., then washed twice with KPS buffer 1 ml, 1,000 × g
で5分間、30℃で遠心分離後回収した。 In 5 minutes to recover after centrifugation at 30 ° C.. スフェロプラストについて細胞融合を行うため、ペレットを250μlの35 Order to carry out the cell fusion for spheroplasts, 35 pellets of 250μl
%ポリエチレングリコール4,000 (KPS緩衝液中に溶解)に懸濁し、30℃で15分間保温し、そして1,000×g % Was suspended in polyethylene glycol 4000 (dissolved in KPS buffer), incubated for 15 minutes at 30 ° C., and 1,000 × g
で5分間、30℃で遠心分離することにより沈殿させた。 In 5 minutes, and precipitated by centrifugation at 30 ° C..
1mlのKPS緩衝液で一度スフェロプラストを洗浄し、 Washed once spheroplasts in KPS buffer of 1ml,
処理したスフェロプラストを、必要なアミノ酸及びカナバニン(1.5μg/ml) を添加した2mlのSD培地中に懸濁し(ガラス管12.5(D) ×105(L)mm) 、そして回転式振盪により30℃でインキュベートした(93rpm で3日間)。 The treated spheroplasts were suspended in SD medium 2ml supplemented with required amino acids and canavanine (1.5μg / ml) (glass tubes 12.5 (D) × 105 (L) mm), and by rotary shaking 30 and incubated at ° C. (3 days 93 rpm). 次いで、培養物を100倍に希釈し、同じ条件で更に3日間インキュベートした。 The cultures were then diluted 100-fold and incubated for further 3 days under the same conditions. そして、受容細胞由来の核を有する融合細胞を得た。 Then, to obtain a fused cell having a receptor cell-derived nuclei. (4) 抗生物質処理(細胞の選択) 次に、前記融合細胞をオリゴマイシン(3μg/ml)を含むYPGlyプレート上にまき、供与細胞からのOli 1 R -ミトコンドリアマーカーを受け取った細胞を選択した。 (4) Next antibiotic treatment (selection of cells), the seeded in YPGly plates containing fused cells oligomycin (3μg / ml), Oli 1 R from donor cells - to select for cells having received the mitochondrial marker . オリゴマイシンに耐性であることを示したコロニー(Ol Colonies were shown to be resistant to oligomycin (Ol
i 1 R )をクロラムフェニコール(4mg/ml)及びオリゴマイシンを含むYPGプレート上で培養した。 i 1 R) were cultured with chloramphenicol (4 mg / ml) and YPG plate containing oligomycin. Oli 1 Rコロニー中のクロラムフェニコール耐性(Chl R )-コロニーの割合(%)をω位での遺伝子変換頻度として計算した。 Oli 1 chloramphenicol resistance in R colonies (Chl R) - percentage of colonies (%) was calculated as a gene conversion frequencies at position omega.
なお、遺伝子変換は、遺伝的組換えの一つの型である。 Note that gene conversion is a type of genetic recombination. (5) 結果 結果を表1に示す。 (5) Results The results are shown in Table 1. 表1において、各細胞名の下の括弧内にアルファベットの大文字(例えば「MHR1」)で記載されたものは核内の遺伝子が正常遺伝子であることを、 In Table 1, the gene in the nucleus to that described in capital letters (e.g. "MHR1") in parentheses below each cell name are normal genes,
小文字(例えば「mhr1」)で記載されたものは核内の遺伝子が変異遺伝子であることを意味する。 Those described in lowercase (eg "mhr1") means that the gene in the nucleus is mutated gene. また「[ ]」 Also"[ ]"
内に記載されたものはミトコンドリアの遺伝型を意味する。 Those described within means genotype of mitochondria. ω + 、ω - 、Chl R及びOli 1 Rの意味は前記の通りである(以下同様)。 ω +, ω -, the meaning of Chl R and Oli 1 R are as defined above (hereinafter the same).

【0035】 [0035]

【表1】 [Table 1] 表1より、受容細胞であるIL166-187 細胞は、その核内の遺伝子がミトコンドリア相同的組換えを起こさせたことから(98.2%の組換え体が得られた)、変異遺伝子を有さない細胞であることがわかった。 From Table 1, IL166-187 cells are recipient cells, since the gene within the nucleus to cause a mitochondrial homologous recombination (98.2% of the recombinants were obtained), no mutation gene it was found that a cell. これに対し、FL67 On the other hand, FL67
細胞は、その核内の遺伝子がミトコンドリア相同的組換えを起こさせなかったことから(わずか4%の組換え体が得られたのみであった)、変異遺伝子を有する細胞であることがわかった。 Cells, since the gene within the nucleus did not cause mitochondrial homologous recombination (only 4% of the recombinants were only obtained), it was found that a cell having a mutant gene . 更に、UV11細胞は、相同的組換えに関わる変異遺伝子を持つものではない細胞であることがわかった。 Furthermore, UV11 cells were found to be cell does not have the mutated gene involved in homologous recombination.

【0036】〔比較例1〕供与細胞については核を除かない従来法、即ち、異なる接合型(αとa)をもつ一倍体細胞同士を接合させる方法によって、FL67のもつ変異遺伝子が劣性であるか又は優性であるかの検定試験を行った。 [0036] Comparative Example 1 Conventional Method not remove the nucleus for donor cells, i.e., by a method of bonding the haploid cells to each other with different mating type (alpha and a), with the mutant gene FL67 is recessive there is or was carried out examinations of dominant in either. 受容細胞、供与細胞ともに、使用した細胞はIL16 Receptor cells, in both the donor cell, the cells used were IL16
6-187 及びその誘導体、FL67の誘導体並びにUV11の誘導体である。 6-187 and its derivatives, derivatives and derivatives of UV11 of FL67. これらの細胞はいずれも、発明者がIL166-18 Both of these cells, the inventors have IL166-18
7 細胞をエチルメタンスルフォン酸処理することにより調製したものである。 7 in which cells were prepared by treating ethyl methane sulfonate.

【0037】その結果を表2に示す。 [0037] The results are shown in Table 2.

【0038】 [0038]

【表2】 [Table 2] 表2より、供与細胞の核内に正常の遺伝子(例えばNo.6 From Table 2, the normal gene into the nucleus of the donor cell (e.g. No.6
を参照) を持つものは、受容細胞の核内の遺伝子が変異をもつかもたないかを問わず、ミトコンドリアの組換えを起こさせる。 Those with a reference), genes in the nucleus of the recipient cell, regardless of whether without or with mutations, to cause recombination of the mitochondria. この結果は、前記表1のNo.2の結果と比較して対照的である。 This result is in contrast compared with the results of Table 1 of No.2.

【0039】従って、受容細胞の核内の変異遺伝子(mh [0039] Thus, the mutant gene in the nucleus of the recipient cell (mh
r1)は、供与細胞側の正常遺伝子によって隠されてしまい、結局ミトコンドリアの組換えを起こさせてしまう劣性変異遺伝子であることがわかる。 r1) is will be hidden by the normal gene of the donor cell side, it can be seen that after all a recessive mutant gene thus to cause a recombinant mitochondrial. 以上より、本発明の検出法により劣性変異遺伝子をも検出することができる。 From the above, it is possible to detect even a recessive mutant gene by detection method of the present invention. 〔実施例2〕MHR1遺伝子のクローニング 変異株FL67(mhr1) の表現型(紫外線照射によるDNA傷害修復欠損、組み換え欠損、及び温度感受性変異)を支配する遺伝子を取得する目的で、mhr1変異株の温度感受性を相補する遺伝子を狙ってMHR1遺伝子のクロニーングを行った。 EXAMPLE 2 MHR1 phenotypic Cloning mutant FL67 (Mhr1) of (ultraviolet irradiation by DNA damage repair deficient, recombinant defective, and temperature-sensitive mutation) in order to obtain the gene that controls the, Mhr1 temperature of mutants aimed at the gene complementing the sensitivity was Kuroningu of MHR1 gene.

【0040】(1) ゲノムライブラリーの構築 実施例1に記載の野性型酵母IL166-187 細胞(FERM P-14 [0040] (1) wild-type yeast IL166-187 cells according to Construction Example 1 of the genomic library (FERM P-14
989)を用いて、公知の方法によりMHR1遺伝子のゲノムライブラリーを構築した。 989) was used to construct a genomic library MHR1 gene by known methods. ゲノムライブラリーの構築には、シングルコピーベクターであるYCp50 を用いた。 The construction of the genomic library was used YCp50 a single copy vector. 次に、mhr1変異株 FL67(FERM P-14987; MET α,ura3, h Next, Mhr1 mutant FL67 (FERM P-14987; MET α, ura3, h
is1, trp1) に、YCp50 で構築した前記酵母ゲノムライブラリーを以下の通り導入した。 is1, the trp1), the yeast genomic library constructed in the YCp50 was introduced as follows.

【0041】30℃でYPD液体培地(1%酵母エキス,2 The YPD liquid medium at 30 ° C. (1% yeast extract, 2
%ポリペプトン及び2%グルコース)で生育した変異株細胞を10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5 )の存在下で1mMの塩化リチウムで処理した。 It was treated with 1mM of lithium chloride in the presence of hydrochloric acid buffer (pH 7.5) -% polypeptone and 2% glucose) tris mutant cells grown 10mM in. その後、約75mg/ml のサケ精子と45%ポリエチレングリコール4000の存在下で、ゲノムライブラリーを処理後、変異株細胞に形質転換した。 Thereafter, in the presence of salmon sperm and 45% polyethylene glycol 4000 to about 75 mg / ml, after treatment genomic library was transformed into mutant cells.

【0042】このようにして導入された変異株を、ヒスチジン及びトリプトファンを含むSD寒天培地(2%グルコース,0.67%のアミノ酸不含酵母エキス及び2%寒天を含む培地)にまき、生育するコロニーを得た。 [0042] Such mutants introduced in the, SD agar medium containing histidine and tryptophan were seeded (2% glucose, culture medium containing 0.67% amino acid non 含酵 base extract and 2% agar), and colonies grown Obtained. 次に、 next,
得られたコロニーをグリセロールを含む寒天培地にレプリカし、37℃で生育するコロニーを得た。 The resulting colonies were replicated on an agar medium containing glycerol, to obtain colonies grown at 37 ° C.. 得られたコロニーを、ヒスチジン及びトリプトファンを含むSD液体培地(2%グルコース,0.67%のアミノ酸不含酵母エキス)で培養し、培養菌体を得る。 The obtained colony was cultured in SD liquid medium containing histidine and tryptophan (2% glucose, 0.67% amino acid non 含酵 mother extract), obtaining cultured cells. ガラスビーズで酵母の菌体を破壊し、得られた無細胞抽出液を大腸菌DH5αに導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン,0.5 %酵母抽出物,0.5 %NaCl, 2%寒天, Destroying cells of the yeast with glass beads, the resulting cell-free extract was introduced into E. coli DH5 [alpha, LB agar medium (1% Bacto tryptone containing ampicillin, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% agar-agar,
pH7.2)に塗布した。 It was applied to pH7.2). 生育したコロニーを、さらにアンピシリンを含むLB液体培地で培養することにより、プラスミドDNAを抽出した。 The grown colonies by further cultured in LB liquid medium containing ampicillin, and plasmids were extracted DNA.

【0043】次に、ヒスチジン(8mg/20ml プレート) Next, histidine (8mg / 20ml plate)
及びトリプトファン(8mg/20ml プレート)を含むSD寒天培地(2%グルコース,0.67%のアミノ酸不含酵母エキス,2%寒天)で、30℃で5日培養し、生育するコロニーをグリセロール寒天培地にレプリカーした。 And SD agar medium containing tryptophan (8 mg / 20 ml plate) (2% glucose, 0.67% amino acid non 含酵 mother extract, 2% agar) at, and 5 days of culture at 30 ° C., the replica colonies growing on glycerol agar over did. その中から、37℃においてグリセロール寒天培地で生育できるコロニーを選び、一つの候補を得た。 Among them, select the colonies which can grow in glycerol agar at 37 ° C., to obtain a single candidate.

【0044】この候補(コロニー)を2mlのヒスチジン(8mg/20ml プレート) とトリプトファン(8mg/20ml [0044] histidine of the candidates (colonies) 2ml (8mg / 20ml plate) and tryptophan (8mg / 20ml
プレート) を含むSD液体培地(2%グルコース,0.67% SD liquid medium (2% glucose containing plates), 0.67%
のアミノ酸不含酵母抽出物)で、30℃で一晩培養した後、0.5mmのガラスビーズで酵母の菌体を破壊した。 In the amino acid non 含酵 mother extract) was incubated overnight at 30 ° C., to destroy cells of yeast 0.5mm glass beads. 得られた無細胞抽出液を、D.Hanahan(J.Mol.Biol.,166(19 The resulting cell-free extract, D.Hanahan (J.Mol.Biol., 166 (19
83),557-580)の方法に従って、大腸菌DH5αに導入し、 83), according to the method of 557-580), was introduced into E. coli DH5α,
アンピシリン(50μg/ml) を含むLB寒天培地(1%バクトトリプトン,0.5 %酵母エキス,0.5 %NaCl, 2%寒天,pH7.2)に塗布した。 Ampicillin (50 [mu] g / ml) LB agar medium containing (1% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% agar, pH 7.2) was applied to.

【0045】37℃で1日培養し、生育したコロニーから一つを選び、さらにアンピシリン(50μg/ml)を含むLB [0045] and cultured for one day at 37 ℃, select one from the grown colonies, LB further containing ampicillin (50μg / ml)
液体培地で培養した(37℃で1日)。 They were cultured in a liquid medium (1 day at 37 ° C.). これより、アルカリ法(Nucleic Acid Res.,7,1513) を用いてプラスミド From this, the alkali method (Nucleic Acid Res., 7,1513) plasmid using
DNAを抽出した。 It was extracted DNA. 得られたプラスミドのBamHI 部位には Into the BamHI site of the resulting plasmid
9.6kbpのDNA断片が含まれていた。 DNA fragment of 9.6kbp were included.

【0046】この9.6kbpのDNA断片をClaI, BamHI, MluI [0046] ClaI the DNA fragment of this 9.6kbp, BamHI, MluI
などの制限酵素で切断し、その中から、mhr1変異株の組換え、及び温度感受性に対する相補性を示す約0.7kbpの Was digested with restriction enzymes such as, among them, the mhr1 mutant recombination, and about 0.7kbp showing complementarity to the temperature sensitive
DNA断片までにサブクローニングした。 It was subcloned in to DNA fragment. これをさらにpUC In addition pUC this
118のHincII部位に挿入した。 It was inserted into the HincII site of 118. そして、ALFDNA Seque Then, ALFDNA Seque
ncer(フアルマシャー社製)でその塩基配列を決定した。 The nucleotide sequence was determined by Ncer (Fuarumasha Co.).

【0047】結果を配列番号3に示す。 [0047] The results are shown in SEQ ID NO: 3. 配列番号3で表される塩基配列は、変異の性質を相補した遺伝子をクローニングすることにより得られたもので、野性型遺伝子の塩基配列である。 Nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, was obtained by cloning the gene complement the nature of the mutation is a nucleotide sequence of the wild-type gene. 配列番号3の中に、推定153 アミノ酸をコードする459bp のオープンリーディングフレームが存在した。 Some SEQ ID NO: 3, an open reading frame of 459bp encoding the putative 153 amino acid were present. オープンリーディングフレームにおけるアミノ酸配列を配列番号1に示す。 The amino acid sequence in the open reading frame in SEQ ID NO: 1.

【0048】この遺伝子断片をプローブとして、パルスフィールド電気泳動で分けた酵母の16本の染色体上に対して、サザンハイブリダイゼーションを行った結果、この遺伝子はXII番目の染色体上にあることを明らかにした。 [0048] The gene fragment as a probe against 16 of the upper chromosomes of yeast separated by pulsed field electrophoresis, as a result of Southern hybridization, the gene reveals that on XII-th chromosome did. 野性型のMHR1遺伝子によって変異株のもつすべての表現型が相補されたことを考え、この遺伝子は目的のものであることは間違いがないと判断した。 Consider that all phenotypically complemented with the mutant by MHR1 gene wild type, the gene was judged to have no doubt be of interest.

【0049】〔実施例3〕mhr1遺伝子のクローニングと変異部位の決定 変異株のmhr1遺伝子をクローニングし、さらに該遺伝子の変異部位を検索した。 [0049] Example 3 Cloning and mhr1 gene was cloned mhr1 genes determining mutants mutation sites, further retrieves the mutation site of the gene. mhr1変異株(FL67; FERM P-149 mhr1 mutant (FL67; FERM P-149
87) から、以下の手法により全ゲノムDNAを得た。 From 87) to give a total genomic DNA by the following method.

【0050】YPD液体培地で30℃、48時間生育したmhr1 [0050] 30 ℃ in YPD liquid medium, and grown 48 hours mhr1
変異株細胞をチモリアーゼ100T(Zymolyase-100T; Seik Mutant cells Chimoriaze 100T (Zymolyase-100T; Seik
agaku Corporation, Tokyo, Japan)で細胞壁を除去した後、1%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム; Sodium Lauryl agaku Corporation, Tokyo, Japan) after removal of the cell wall in, 1% SDS (sodium lauryl sulfate; Sodium Lauryl
Sulfate)の存在下、細胞を破砕させた。 The presence of Sulfate), were allowed to disrupt the cells. そして、抽出液に対して、公知のDNA分離・精製手順(C.Guthrie and Then, the extract, known DNA separation and purification steps (C.Guthrie and
GRFink; Molecular Biology Academic Press Inc. S GRFink; Molecular Biology Academic Press Inc. S
an Diego, California, 1991)に従って、mhr1変異株の全ゲノムDNAを調製した。 an, Diego, according to California, 1991), was prepared total genomic DNA of mhr1 mutant.

【0051】得られた100ngの全ゲノムDNAのPCRを、10m [0051] PCR of total genomic DNA of the resulting 100ng a, 10m
MTris-HCl、1.5mM MgCl 2 、50mM KCl、0.125mMの各dNT MTris-HCl, 1.5mM MgCl 2, 50mM KCl, each of 0.125 mM dNTs
P、1pmolのプライマー、1.25 Uのtaq DNA ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim 社製)を含む反応混合液で行った。 P, primer 1 pmol, were carried out in a reaction mixture containing 1.25 U of taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim Corp.). 94℃でのインキュベーション25秒、続いて55℃でのアニーリング30秒、さらに68℃でのポリメラーゼ反応1分を1サイクルとし、これを35回サイクル行った。 Incubation 25 seconds at 94 ° C., followed by a 55 annealing 30 seconds at ° C., further 68 polymerase reaction 1 cycle 1 min at ° C., this was done 35 cycles. その後、68℃でのポリメラーゼ反応を7分間に延長した。 Then, it extended the polymerase reaction at 68 ° C. for 7 minutes.
なお、プライマーとしてフォワードプライマー(配列番号5)及びリバースプライマー(配列番号6)を用いた。 Incidentally, using forward primer (SEQ ID NO: 5) and reverse primer (SEQ ID NO: 6) as primers.

【0052】得られたmhr1遺伝子をpUC118のHinc IIの位置に挿入し、その塩基配列を決定した。 [0052] mhr1 gene obtained was inserted at the Hinc II of pUC118, and their nucleotide sequences were determined. 結果を配列番号4に示す。 The results are shown in SEQ ID NO: 4. 配列番号4には、配列番号3で表したオープンリーディングフレーム上の296番目の位置(配列番号3の塩基配列中、第421 番目の位置)に、一箇所の突然変異(GからAへの置換)があった。 The SEQ ID NO: 4, (in the base sequence of SEQ ID NO: 3, a 421-th position) position 296 on the open reading frame represented by SEQ ID NO: 3, substitution of A from mutations one place (G )was there. これによって蛋白質レベルで、99番目のアミノ酸がグリシンからアスパラギン酸に変わっているものと推定される。 Thus at the protein level, 99 amino acid is presumed to be changed from glycine to aspartic acid. そのアミノ酸配列を配列番号2に示す。 It shows the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.

【0053】 [0053]

【発明の効果】本発明により、ミトコンドリアの相同的組換えの欠損を引き起こす突然変異遺伝子及びこれら遺伝子を含む組換え体プラスミドが提供される。 According to the present invention, recombinant plasmids containing mutant genes and their gene cause defects of homologous recombination of mitochondrial is provided. 本発明の遺伝子は、真核生物の細胞呼吸機能の維持に不可欠であるミトコンドリアDNAの安定維持に必須であるので、ヒトの老化に伴う呼吸機能の低下の検出、及び発酵生産に適用する強力な酵母菌株の育種に有用である。 Gene of the present invention are the essential stable maintenance of mitochondrial DNA is essential for the maintenance of eukaryotic cells respiratory function, powerful to apply the detection of depression of the respiratory system caused by the aging of human, and the fermentation it is useful in breeding of yeast strains.

【0054】 [0054]

【配列表】 [Sequence Listing]

配列番号:1 配列の長さ:153 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列: Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln Arg Lys 20 25 30 Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val Trp Tyr 35 40 45 Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala Glu Lys 65 70 75 80 Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu Asp Pro Trp 85 90 95 Arg Met Gly Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe Asn Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile Ala Arg 115 120 125 Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser His Pro 130 135 140 Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 153 SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 153 SEQ type: amino acid Topology: linear sequence type: protein sequence: Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln Arg Lys 20 25 30 Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val Trp Tyr 35 40 45 Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala Glu Lys 65 70 75 80 Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu Asp Pro Trp 85 90 95 Arg Met Gly Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe Asn Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile Ala Arg 115 120 125 Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser His Pro 130 135 140 Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 153

【0055】配列番号:2 配列の長さ:153 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列: Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln Arg Lys 20 25 30 Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val Trp Tyr 35 40 45 Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala Glu Lys 65 70 75 80 Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu Asp Pro Trp 85 90 95 Arg Met Asp Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe Asn Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile Ala Arg 115 120 125 Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser His Pro 130 135 140 Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 153 [0055] SEQ ID NO: 2 sequence Length: 153 SEQ type: amino acid Topology: linear sequence type: protein sequence: Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln Arg Lys 20 25 30 Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val Trp Tyr 35 40 45 Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala Glu Lys 65 70 75 80 Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu Asp Pro Trp 85 90 95 Arg Met Asp Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe Asn Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile Ala Arg 115 120 125 Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser His Pro 130 135 140 Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 153

【0056】配列番号:3 配列の長さ:680 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces [0056] SEQ ID NO: 3 Length of sequence: 680 SEQ types: the number of nucleic acid strands: double-stranded Topology: linear sequence type: Genomic DNA Origin Organism: Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces
cerevisiae) 株名:IL166-187 配列: AGAGTATGGA CAAGTACTAT ATTCTCAATT TCCCAACTTT TCGCAAACAC AGGTGGATAA 60 GCTGTTTGTG AGACCAAACT GGAGCAACAG AAAGCCATCA TTGAGAAGGG ACATCTGGAA 120 AATGT ATG TGT GTA GTG AAC TTG CAA AAC TAT AAG CAG AGT GTC CAT 167 Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His 1 5 10 CTA TAC CAG AAC CTC TGC CGG TTG AGA TAC CTC CGT GAT GTG GCA CAG 215 Leu Tyr Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln 15 20 25 30 CGT AAG GAG AGT GAC AAG CTA AGA AAA AAG GAC TCT AAC GGG CAC GTC 263 Arg Lys Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val 35 40 45 TGG TAT AGC GGA CAG TAT AGA CCT ACA TAT TGT CAA GAG GCA GTG GCA 311 Trp Tyr Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala 50 55 60 GAC TTG CGG GAG TCC TTG TTG AAG GTG TTT GAG AAT GCC ACA CCA GCA 359 Asp Leu Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala 65 70 75 GAA AAG CAG ACA GTA CCC GCC AAA AAA CCG TCC ATA TAC TGG GAG GAC 407 Glu Lys Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp cerevisiae) strain name: IL166-187 sequence: AGAGTATGGA CAAGTACTAT ATTCTCAATT TCCCAACTTT TCGCAAACAC AGGTGGATAA 60 GCTGTTTGTG AGACCAAACT GGAGCAACAG AAAGCCATCA TTGAGAAGGG ACATCTGGAA 120 AATGT ATG TGT GTA GTG AAC TTG CAA AAC TAT AAG CAG AGT GTC CAT 167 Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His 1 5 10 CTA TAC CAG AAC CTC TGC CGG TTG AGA TAC CTC CGT GAT GTG GCA CAG 215 Leu Tyr Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln 15 20 25 30 CGT AAG GAG AGT GAC AAG CTA AGA AAA AAG GAC TCT AAC GGG CAC GTC 263 Arg Lys Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val 35 40 45 TGG TAT AGC GGA CAG TAT AGA CCT ACA TAT TGT CAA GAG GCA GTG GCA 311 Trp Tyr Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala 50 55 60 GAC TTG CGG GAG TCC TTG TTG AAG GTG TTT GAG AAT GCC ACA CCA GCA 359 Asp Leu Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala 65 70 75 GAA AAG CAG ACA GTA CCC GCC AAA AAA CCG TCC ATA TAC TGG GAG GAC 407 Glu Lys Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu Asp 80 85 90 CCA TGG AGG ATG GGT GAC AAG GAC AAA CAT TGG AAT TAC GAT GTG TTC 455 Pro Trp Arg Met Gly Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe 95 100 105 110 AAT GCT CTG GGG CTG GAA CAC AAG CTT ATT CAG CGT GTG GGG AAC ATT 503 Asn Ala Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile 115 120 125 GCG AGG GAA GAA AGC GTT ATT CTG AAG GAA CTA GCT AAG CTC GAA TCA 551 Ala Arg Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser 130 135 140 CAT CCT ACA GAG CAG ACG GAA GTG TCT TCC CAG TAG AACGCTTCGT 597 His Pro Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 CATTAGATAT ACAAATGCAG GTAGAAAAAA AAACATATAT AAGCTCATGT AAATAGTGCA 657 ATGCAAACCT TTCTGCCAAA TCC 680 Glu Asp 80 85 90 CCA TGG AGG ATG GGT GAC AAG GAC AAA CAT TGG AAT TAC GAT GTG TTC 455 Pro Trp Arg Met Gly Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe 95 100 105 110 AAT GCT CTG GGG CTG GAA CAC AAG CTT ATT CAG CGT GTG GGG AAC ATT 503 Asn Ala Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile 115 120 125 GCG AGG GAA GAA AGC GTT ATT CTG AAG GAA CTA GCT AAG CTC GAA TCA 551 Ala Arg Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser 130 135 140 CAT CCT ACA GAG CAG ACG GAA GTG TCT TCC CAG TAG AACGCTTCGT 597 His Pro Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 CATTAGATAT ACAAATGCAG GTAGAAAAAA AAACATATAT AAGCTCATGT AAATAGTGCA 657 ATGCAAACCT TTCTGCCAAA TCC 680

【0057】配列番号:4 配列の長さ:680 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces [0057] SEQ ID NO: 4 Length of sequence: 680 SEQ types: the number of nucleic acid strands: double-stranded Topology: linear sequence type: Genomic DNA Origin Organism: Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces
cerevisiae) 株名:FL67 配列: AGAGTATGGA CAAGTACTAT ATTCTCAATT TCCCAACTTT TCGCAAACAC AGGTGGATAA 60 GCTGTTTGTG AGACCAAACT GGAGCAACAG AAAGCCATCA TTGAGAAGGG ACATCTGGAA 120 AATGT ATG TGT GTA GTG AAC TTG CAA AAC TAT AAG CAG AGT GTC CAT 167 Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His 1 5 10 CTA TAC CAG AAC CTC TGC CGG TTG AGA TAC CTC CGT GAT GTG GCA CAG 215 Leu Tyr Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln 15 20 25 30 CGT AAG GAG AGT GAC AAG CTA AGA AAA AAG GAC TCT AAC GGG CAC GTC 263 Arg Lys Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val 35 40 45 TGG TAT AGC GGA CAG TAT AGA CCT ACA TAT TGT CAA GAG GCA GTG GCA 311 Trp Tyr Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala 50 55 60 GAC TTG CGG GAG TCC TTG TTG AAG GTG TTT GAG AAT GCC ACA CCA GCA 359 Asp Leu Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala 65 70 75 GAA AAG CAG ACA GTA CCC GCC AAA AAA CCG TCC ATA TAC TGG GAG GAC 407 Glu Lys Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu A cerevisiae) strain name: FL67 SEQ: AGAGTATGGA CAAGTACTAT ATTCTCAATT TCCCAACTTT TCGCAAACAC AGGTGGATAA 60 GCTGTTTGTG AGACCAAACT GGAGCAACAG AAAGCCATCA TTGAGAAGGG ACATCTGGAA 120 AATGT ATG TGT GTA GTG AAC TTG CAA AAC TAT AAG CAG AGT GTC CAT 167 Met Cys Val Val Asn Leu Gln Asn Tyr Lys Gln Ser Val His 1 5 10 CTA TAC CAG AAC CTC TGC CGG TTG AGA TAC CTC CGT GAT GTG GCA CAG 215 Leu Tyr Gln Asn Leu Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Arg Asp Val Ala Gln 15 20 25 30 CGT AAG GAG AGT GAC AAG CTA AGA AAA AAG GAC TCT AAC GGG CAC GTC 263 Arg Lys Glu Ser Asp Lys Leu Arg Lys Lys Asp Ser Asn Gly His Val 35 40 45 TGG TAT AGC GGA CAG TAT AGA CCT ACA TAT TGT CAA GAG GCA GTG GCA 311 Trp Tyr Ser Gly Gln Tyr Arg Pro Thr Tyr Cys Gln Glu Ala Val Ala 50 55 60 GAC TTG CGG GAG TCC TTG TTG AAG GTG TTT GAG AAT GCC ACA CCA GCA 359 Asp Leu Arg Glu Ser Leu Leu Lys Val Phe Glu Asn Ala Thr Pro Ala 65 70 75 GAA AAG CAG ACA GTA CCC GCC AAA AAA CCG TCC ATA TAC TGG GAG GAC 407 Glu Lys Gln Thr Val Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ile Tyr Trp Glu A sp 80 85 90 CCA TGG AGG ATG GAT GAC AAG GAC AAA CAT TGG AAT TAC GAT GTG TTC 455 Pro Trp Arg Met Asp Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe 95 100 105 110 AAT GCT CTG GGG CTG GAA CAC AAG CTT ATT CAG CGT GTG GGG AAC ATT 503 Asn Ala Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile 115 120 125 GCG AGG GAA GAA AGC GTT ATT CTG AAG GAA CTA GCT AAG CTC GAA TCA 551 Ala Arg Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser 130 135 140 CAT CCT ACA GAG CAG ACG GAA GTG TCT TCC CAG TAG AACGCTTCGT 597 His Pro Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 CATTAGATAT ACAAATGCAG GTAGAAAAAA AAACATATAT AAGCTCATGT AAATAGTGCA 657 ATGCAAACCT TTCTGCCAAA TCC 680 sp 80 85 90 CCA TGG AGG ATG GAT GAC AAG GAC AAA CAT TGG AAT TAC GAT GTG TTC 455 Pro Trp Arg Met Asp Asp Lys Asp Lys His Trp Asn Tyr Asp Val Phe 95 100 105 110 AAT GCT CTG GGG CTG GAA CAC AAG CTT ATT CAG CGT GTG GGG AAC ATT 503 Asn Ala Leu Gly Leu Glu His Lys Leu Ile Gln Arg Val Gly Asn Ile 115 120 125 GCG AGG GAA GAA AGC GTT ATT CTG AAG GAA CTA GCT AAG CTC GAA TCA 551 Ala Arg Glu Glu Ser Val Ile Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser 130 135 140 CAT CCT ACA GAG CAG ACG GAA GTG TCT TCC CAG TAG AACGCTTCGT 597 His Pro Thr Glu Gln Thr Glu Val Ser Ser Gln 145 150 CATTAGATAT ACAAATGCAG GTAGAAAAAA AAACATATAT AAGCTCATGT AAATAGTGCA 657 ATGCAAACCT TTCTGCCAAA TCC 680

【0058】配列番号:5 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: GGACATCTGG AAAATGTATG [0058] SEQ ID NO: 5 SEQ Length: 20 sequence types: the number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA sequence: GGACATCTGG AAAATGTATG

【0059】配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: TCTAATGACG AAGCGTTCTA [0059] SEQ ID NO: 6 SEQ Length: 20 sequence types: the number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA sequence: TCTAATGACG AAGCGTTCTA

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】ミトコンドリア相同的組換えに関与する変異遺伝子検出方法の概略図である。 1 is a schematic diagram of the mutated gene detection methods involving mitochondrial homologous recombination.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1…受容細胞,2…供与細胞,3…ミトコンドリア,4 1 ... recipient cells, 2 ... donor cell, 3 ... mitochondria, 4
…ミトコンドリア,5…核,6…核,7…融合細胞,8 ... mitochondria, 5 ... nuclear, 6 ... nuclear, 7 ... fusion cell, 8
…組換え型DNAをもつミトコンドリア Mitochondria ... with a recombinant DNA

Claims (3)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】配列番号1で表される野性型MHR1タンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくとも第99番目の1個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変異型mhr1遺伝子。 [Claim 1] of the amino acid sequence of wild type MHR1 protein represented by SEQ ID NO: 1, mutant mhr1 gene encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least the 99 th one amino acid is mutated.
  2. 【請求項2】変異したアミノ酸配列が、配列番号2で表されるものである請求項1記載の変異型mhr1遺伝子。 2. A mutated amino acid sequence, mutant mhr1 gene according to claim 1, wherein is represented by SEQ ID NO: 2.
  3. 【請求項3】請求項1又は2記載の遺伝子を含む組換え体プラスミド。 3. A recombinant plasmid containing the gene of claim 1 or 2, wherein.
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