JPH0975090A - Member for adhering cell - Google Patents

Member for adhering cell

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JPH0975090A
JPH0975090A JP26227195A JP26227195A JPH0975090A JP H0975090 A JPH0975090 A JP H0975090A JP 26227195 A JP26227195 A JP 26227195A JP 26227195 A JP26227195 A JP 26227195A JP H0975090 A JPH0975090 A JP H0975090A
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JP
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Patent type
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protein
lfa
cells
attachment member
column
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Pending
Application number
JP26227195A
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Japanese (ja)
Inventor
Takeshi Okasaki
Takaaki Oohara
Toru Sumiya
高秋 大原
武士 岡▲さき▼
徹 角谷
Original Assignee
Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd
鐘淵化学工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a member useful for blood transfusion side effect prevention, T-cell vaccine therapy, genetic diagnosis, etc., by immobilizing an LFA-3 derivative protein not having a D2 region and a TM region, partially having an intracytoplasmic region and having a single cysteine residue at the carboxyl terminal on a carrier. SOLUTION: A polystyrene plate as a carrier is washed with an acid, a base and distilled water, adding a tetramethylene sulfone solution containing N-hydroxymethyl-2-bromoacetoamide and trifluoromethylsulfonic acid to the washed polystyrene plate, and subsequently leaving the mixture at room temperature for 5hrs in a sealed state shut to the outside air to prepare the activated halogenated polystyrene plate. An LFA-3 derivative protein not having a D2 region and a TM region, partially having an intracytoplasmic region, and having only a cysteine residue at the carboxyl terminal is immobilized on the prepared carrier through the thiol group of the protein, and CD2 positive cells such as T-cells are subjected to an adsorptive separation to obtain the objective member useful for the prevention of autoimmunity diseases, post-transfusion side effects, T-cell vaccine therapy, etc.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な、細胞付着タンパク質の誘導体を担体に固定化した細胞付着部材およびそれを用いてCD2陽性細胞を付着分離する方法に関する。 BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to novel, relates to a method for the derivatives of cell adhesion proteins attach separate the CD2-positive cells using the same cell attachment member and immobilized on a carrier. さらに詳しくは、本発明は、遺伝子工学を用いた生産による、該誘導体を担体に固定した細胞付着部材、該細胞付着部材を用いてCD2陽性細胞、とくに白血球を付着分離する方法、白血球を除去しうる該細胞付着部材、T細胞を分離回収しうる細胞付着部材および白血球からのDNAあるいはRNAの分離を可能とする該細胞付着部材に関する。 More particularly, the present invention is by production using genetic engineering, the derivative fixed cell attachment member to a support, CD2-positive cells using the cell adhesion member, a method of particular attaching separating leukocytes, to remove white blood cells the cell attachment member that may, related to the cell attachment member to enable separation of the DNA or RNA from cell attachment member and leukocytes can be separated recovered T cells.

【0002】 [0002]

【従来の技術】従来の白血球を分離する技術には、遠心分離を用いた血球分離装置を用いる方法やコットンおよびポリエステル繊維のフィルターがある。 BACKGROUND OF THE INVENTION separating conventional leukocyte art, there is a filter method or cotton and polyester fibers using a blood cell separation apparatus using a centrifuge. T細胞を分離する技術には、T細胞の表面抗原であるCD3、CD4 The T cells are separation techniques, a surface antigen of the T cell CD3, CD4
あるいはCD8に対する抗体を担体に固定化したビーズを充填したカラムやプレートがある。 Or antibody is a column or plate filled with immobilized beads carrier for CD8.

【0003】 [0003]

【発明が解決しようとする課題】従来の遠心分離を用いた血球分離装置を用いる方法は、たとえば血球分離装置としてIBM2997を用いたばあい、体外循環した血液を遠心して比重の違いから血球成分の分離層が形成される。 A method using a blood cell separation apparatus using INVENTION Problems to be Solved conventional centrifugal separation, for example, when using the IBM2997 as blood cell separation device, an extracorporeal circulation blood from the difference in specific gravity by centrifugation of the blood cell component separation layer is formed. ここで操作ダイアルを調節して、赤血球や血小板は排出せずに体内に戻すことになるが、装置が複雑なために本操作はかなり習熟しないと必要な成分まで除去されてしまうことになるという問題点を有している。 Here by adjusting the operation dial, that red blood cells and platelets are thus returned to the body without the discharge, so that the device will be removed to the required component if no significant skilled present operation for complex there is a problem. コットンおよびポリエステル繊維のフィルターにより白血球を付着分離するばあいは、施行にあたり、抗凝固剤として、メシル酸ナファモスタットまたはクエン酸を使用し、ヘパリンは使用できないという問題点と、原理的に非特異的付着であるという問題点および血小板の付着量が多いという問題点がある。 When adhering separating leukocytes by cotton and polyester fiber filter, when enforced, as an anticoagulant, using nafamostat mesilate or citric acid, and a problem that heparin can not be used, in principle non-specific there is a problem that the adhesion amount of problems and platelets that it is attached is large.

【0004】T細胞の表面抗原であるCD3、CD4あるいはCD8に対する抗体を担体に固定化したビーズを充填したカラムやプレートは、末梢血から直接T細胞を分離できないか、あるいは、非常に回収率が低いという問題点がある。 [0004] T cell columns or plates antibodies to CD3, CD4 or CD8 is a surface antigen was packed with immobilized beads carriers are either not be separated directly T cells from peripheral blood, or a very recovery there is a problem that low.

【0005】本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、今までに知られていない、新規な、 [0005] The present inventors, as a result of overlapping to solve intensive study of the problem, not known so far, novel,
細胞付着タンパク質の誘導体を固定化した細胞付着部材を見いだし、該タンパク質の誘導体を遺伝子工学で生産して、本発明を完成するにいたった。 Derivatives of cell adhesion proteins found immobilized cell attachment member, and a derivative of the protein produced by genetic engineering, have accomplished the present invention.

【0006】つまり、本発明は前記の背景のもとになされたものであり、本発明の細胞付着タンパク質の誘導体を担体に固定化した新規な細胞付着部材は、前記の課題を解決する方法を提供することを目的とするものである。 [0006] That is, the present invention has been made on the basis of the background, a novel cell attachment member derivatives of cell adhesion proteins of the present invention immobilized on a carrier, a method for solving the above problems it is an object to provide.

【0007】 [0007]

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、D That SUMMARY OF THE INVENTION The present invention, D
2領域およびTM領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有するLFA−3誘導体タンパク質を担体に固定化した細胞付着部材ならびにD2領域およびTM領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有するLFA−3誘導体タンパク質のチオール基を介して該タンパク質を担体に固定化した細胞付着部材に関する。 No cell attachment member and D2 regions and TM region LFA-3 derivative protein was immobilized on a carrier having only one cysteine ​​residue cytoplasmic domain without the second region and the TM region to the carboxyl terminus with partially not related to cell attachment member immobilized the protein carrier via the thiol group of the LFA-3 derivative proteins having only one cysteine ​​residue cytoplasmic domain to the carboxyl terminus partially have.

【0008】前記細胞付着部材において好ましくは、前記LFA−3誘導体タンパク質がヒツジまたはヒトに由来し、さらに好ましくは、前記LFA−3誘導体タンパク質が、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるヒツジ由来のタンパク質または配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のタンパク質である。 [0008] In the above preferred cell attachment member, derived from the LFA-3 derivative protein sheep or human, more preferably, the LFA-3 derivative protein from sheep comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 a protein of human origin consisting of an amino acid sequence represented by the protein or SEQ ID NO: 2. また、 Also,
前記細胞付着部材は、好ましくは白血球を除去しうる、 The cell adhesion member preferably can remove leukocytes,
T細胞を分離回収しうる、白血球からのDNAあるいはRNAの分離を可能とする細胞付着部材である。 T cells can be separated and recovered, a cell attachment member to enable separation of the DNA or RNA from leukocytes.

【0009】さらに本発明は、前記細胞付着部材を用いて、CD2陽性細胞または白血球を付着分離する方法に関する。 [0009] The present invention uses the cell adhesion member, to a method of attaching separate the CD2-positive cells or white blood cells. 好ましくは、前記方法は前記細胞付着部材と、 Preferably, the method and the cell attachment member,
CD2陽性細胞または白血球を含みうる体液を接触させることにより付着分離する方法である。 A method of attaching separate by contacting the CD2-positive cells, or body fluids may include leukocytes.

【0010】 [0010]

【発明の実施の形態】本発明にしたがい担体への固定化に用いるタンパク質について説明する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention will be described protein used for immobilization onto the carrier in accordance with.

【0011】本発明に用いるタンパク質である、D2領域およびTM領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつLFA−3誘導体タンパク質は、特開平5−27129 [0011] a protein for use in the present invention, LFA-3 derivative protein partially with intracytoplasmic region no D2 region and TM regions, Hei 5-27129
2号公報に示している通り、一本鎖のポリペプチドで、 As is shown in 2 discloses, in a single polypeptide chain,
タンパク質部分の分子量約13,000のタンパク質であり、LFA−3タンパク質(T細胞に存在するCD2 A molecular weight of about 13,000 proteins of the protein portion, present in the LFA-3 protein (T cell CD2
に対する受容体)からD2領域およびTM領域が除かれ、かつ細胞質内領域が部分的に除かれたものでカルボキシル末端に唯一のシステイン残基が存在する構成を有している。 Receptor) D2 region and TM regions from is removed, and the cytoplasmic region has a configuration in which the only cysteine ​​residue present in the carboxyl-terminus at those partially removed for. ここでD2領域とは、LFA−3タンパク質の2つの免疫グロブリン様領域のうち、アミノ末端から2番目の免疫グロブリン様領域であって、ゲノム性DN Here D2 region and, among the two immunoglobulin-like regions of the LFA-3 protein, a second immunoglobulin-like region from amino terminus, genomic DN
A上でイントロンによって他の領域と分断されてコードされている領域をいい、ヒトおよびヒツジでは6つのシステイン残基を有する。 By introns on A refers to a region encoded is divided with other regions, with the six cysteine ​​residues in the human and sheep. LFA−3に比べ、カルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有するD2領域をもたない本発明に用いられるLFA−3誘導体タンパク質は低分子量であり、LFA−3では分子内に複数のジスルフィド結合があるのに対して、本発明に用いられるLF Compared to LFA-3, LFA-3 derivative protein used in the present invention without a D2 region having only one cysteine ​​residue at the carboxyl terminus is a low molecular weight, a plurality of disulfide bonds in the molecule in LFA-3 relative located in, employed in the present invention LF
A−3誘導体タンパク質では2つ以上ない。 Two or more not in A-3 derivative proteins. したがって、本発明に用いるタンパク質は抗原性が低く、遺伝子組み換え技術によって生産する上で、誤ったジスルフィド結合を形成する心配のないことから、大変有利である。 Thus, the proteins used in the present invention has a low antigenicity, in order to produce by genetic recombination technology, since there is no worry of forming a wrong disulfide bonds, is very advantageous. このようにして唯一のシステイン残基が導入された誘導体からは、そのシステイン残基のチオール基を介して種々の担体に固定化することができる。 From this way, the only cysteine ​​residue was introduced derivatives, it can be immobilized on various carriers through a thiol group of the cysteine ​​residue. 疎水結合により担体に固定化する方法に関しては、すでに、特開平5 For the method for immobilizing the carrier by hydrophobic bonds, already, JP-5
−271292号公報に示している通りである。 It is as shown in -271,292 JP.

【0012】本発明に用いるLFA−3誘導体タンパク質を担体に固定化する方法を説明する。 [0012] The LFA-3 derivative protein used in the present invention describes a method for immobilizing on a carrier. 前記担体の材料としては、ポリスチレン、ガラス、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリサルフォン、シリカゲルなどがあげられる。 The material for the carrier, polystyrene, glass, cellulose, polyvinyl alcohol, polysulfone, such as silica gel and the like. 固定化に用いる担体の形状としては、タンパク質を固定化しうるものであれば何でも用いられうる。 The shape of the support used for immobilization, can anything be used as long as it can immobilize the proteins.
たとえば、ポリスチレンを用いるときにはリガンドであるタンパク質を固定化する面積が広くなるので、好ましくはプレート、シャーレおよびビーズ、より好ましくはビーズである。 For example, since the wide area of ​​immobilizing proteins is a ligand when using polystyrene, preferably plates, petri dishes and beads, more preferably beads. 本発明に用いるタンパク質は共有結合などの結合によって担体に固定化することができる。 Protein used in the present invention can be immobilized on a carrier by a bond such as covalent bond.

【0013】より効果的に本発明に用いるタンパク質を固定化するには、カルボキシル末端に存在するシステイン残基のチオール基を介して担体に固定化する。 To immobilize the protein used to more effectively present invention [0013] is immobilized on a carrier via a thiol group of a cysteine ​​residue present at the carboxyl terminus. このことによりタンパク質分子の方向性を揃えることが可能になる(図1参照)。 It is possible to align the direction of the protein molecule by this (see Figure 1). さらに加えてタンパク質分子をより高密度に固定化するには、チオール基を活性ハロゲン法、活性エステル法、ビピリジンジスルフィドの交換反応法、マレイミド法やチオフタルイミド法などを用いて共有結合的に担体に固定化する。 To further fix the protein molecules more densely in addition, the active halogen method thiol group, active ester method, exchange reaction method bipyridine disulfide, maleimide method or Thiophthalimides method covalently carrier with immobilized.

【0014】ここで「CD2陽性細胞」とはCD2分子を細胞表面に発現している細胞を意味する。 [0014] Here in the "CD2-positive cells" refers to cells expressing the CD2 molecule on the cell surface.

【0015】本発明に用いるタンパク質を担体に固定化した細胞付着部材を用いて、CD2陽性細胞の付着分離を行うには、担体がプレートのばあいは、CD2陽性細胞とCD2陰性細胞の混合細胞を前記タンパク質固定化プレートの上にまき、ついでリン酸緩衝液などでプレートを洗浄したのちにプレート上の細胞が、CD2陽性か陰性かを細胞を回収してフローサイトメトリーを用いた方法によって調べればよい。 [0015] The protein used in the present invention using a immobilized cell attachment member to the support to do adhesion separation of CD2 positive cells, if the carrier is a plate, mixed cell of CD2 positive cells and CD2-negative cells It was plated on the protein-immobilized plate, followed by plates of cells After washing the plate with a phosphoric acid buffer solution, is examined by a method using flow cytometry to recover the cells were either CD2 positive or negative Bayoi. 担体がビーズのばあいは、 If the carrier is a bead,
ビーズをカラムに充填したものに、CD2陽性細胞とC The beads that packed in a column, CD2 positive cells and C
D2陰性細胞の混合細胞をアプライし、ついでリン酸緩衝液などでカラムを洗浄したのちにカラム内の細胞がC Was applied a mixed cell D2-negative cells, then the cells in the column after washing the column with phosphoric acid buffer solution C
D2陽性か陰性かを前記と同様に調べればよい。 Or D2 positive or negative it is checked in the same manner as described above.

【0016】本発明によるタンパク質を担体に固定化した細胞付着部材を用いて、白血球の付着分離を行うには、担体がビーズのばあいは、ビーズをカラムに充填したものに、末梢血を直接アプライし、ついでリン酸緩衝液などでカラムを洗浄したのちにカラム内の細胞を同定するか、もしくはカラムを通過してきた細胞を同定し、 [0016] Proteins according to the present invention using a immobilized cell attachment member to a support, to perform adhesion separation of leukocytes, if the carrier is a bead, the ones filled with beads into a column, directly peripheral blood was applied, then identify which identifies the cells in the column after washing the column with phosphoric acid buffer solution, or passed through the column cells,
カラム内の細胞を推定することにより前記カラムに白血球細胞、中でも主にT細胞、単球、そして好中球が付着することを示すことができる。 It can be shown that white blood cells to the column by estimating the cell in the column, among others mainly T cells, monocytes, and neutrophils adhering.

【0017】ここで「体液」とは血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた画分成分、ならびにその他の生体由来の液性成分を意味する。 [0017] Here, the "body fluid" as blood, plasma, serum, ascites, lymph, synovia and these Karae was fraction component, and means humoral components derived from other biological.

【0018】本発明の細胞付着部材が、T細胞の表面抗原であるCD3、CD4あるいはCD8に対する抗体を担体に固定化したビーズを充填したカラムやプレートに比べて、CD2陽性細胞の回収率が高いことを示すには、たとえばCD3に対する抗体との比較であれば、C The cell adhesion member of the present invention, as compared to antibodies against the surface antigens of T cells CD3, CD4 or CD8 on a column or plate filled with immobilized beads support, a high recovery rate of CD2 positive cells to indicate that, if the comparison of the antibodies to e.g. CD3, C
D3に対する抗体と本発明に用いる誘導体タンパク質の等量を担体の1例としてポリスチレンビーズに固定化してカラムを作製し、このカラムに細胞、たとえばT細胞の株化細胞であるジャーカット細胞(CD2陽性細胞) Equal amounts of derivative protein used in the antibody and the invention for D3 immobilized on polystyrene beads to produce a column as an example of the carrier, the cells in this column, Jurkat cells (CD2 positive is a cell line, for example T cell cell)
やヒト末梢血をアプライし、溶出された細胞数を数えることで示すことができる。 And human peripheral blood was applied, it can be shown by counting the number of eluted cells.

【0019】慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の主たる病因物質は自己抗体および自己抗体と抗原の複合体であるとされているので、自己抗体の産生に関係する白血球を除去することにより、自己免疫疾患の根本的な治療となる。 [0019] Since the main etiological agent of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis is to be a complex of autoantibodies and autoantibodies and the antigen, by removing the leukocytes involved in production of autoantibodies, autoimmune become a fundamental treatment of the disease. 本細胞付着部材は白血球を付着除去できるので、自己免疫疾患患者の末梢血を本細胞付着部材に接触させ自己抗体を産生する白血球を除去することができる。 Since the cell attachment member can adhere removing leukocytes can be removed leukocytes that produce autoantibodies is brought into contact with peripheral blood of patients with autoimmune diseases in the present cell attachment member.

【0020】輸血後の副作用として知られている移植片対宿主反応や非溶血性発熱反応、サイトメガロウイルス、HTLV−1などのウイルスの伝播は輸血中に含まれる白血球が原因で起こることが知られているので、白血球を除去することにより、これらの副作用を防止することができる。 [0020] Post-transfusion as known graft-versus-host reaction side effects and non-hemolytic exothermic reaction, cytomegalovirus, the spread of the virus, such as HTLV-1 that leukocytes contained in blood transfusions occurs due knowledge since being, by removing the white blood cells, it is possible to prevent these side effects. 本発明の細胞付着部材は白血球を付着除去できるので、輸血する血液を本細胞付着部材で処理することによりこれらの副作用を防止することができる。 Since cell attachment members of the present invention can adhere removing leukocytes, it is possible to prevent these side effects by treating the transfusion blood in this cell attachment member.

【0021】また本細胞付着部材は、コーエンら(ベン−ヌン エー、ウェカール エイチおよびコーエン アイアール(Ben−Nun,A.,Wekerle, [0021] The cell adhesion member, Cohen et al (Ben - Nun er, Wekaru H. and Cohen International Rectifier (Ben-Nun, A., Wekerle,
H. H. &Cohen,I. & Cohen, I. R. R. ):ワクシネーション・アゲインスト・オートイムン・エンセファロマイリティス・ウイズ・ティー・リンホサイト・ライン・セルズ・リアクティブ・アゲインスト・ミエリン・ベーシック・プロテイン(Vaccination against ): Frame. The Nation Against Otoimun en cephalometric Meili Sevilla, Uiz Tea Rinhosaito line Sells Reactive Against myelin basic protein (Vaccination against
autoimmune encephalomyeli autoimmune encephalomyeli
tis with T lymphocyte lin tis with T lymphocyte lin
e cellsreactive against m e cellsreactive against m
yelin basic protein)、ネイチャー(Nature)、292巻:60頁、1981年参照)が提唱したT細胞ワクチンの考え方を治療に応用するばあいの、T細胞を大量に回収する際に利用することができる。 yelin basic protein), Nature (Nature), 292 Volume: 60 pages, can be used when a large amount recovered in the case, the T cells that application in the treatment of the concept of T cell vaccine reference 1981) was proposed . 多発性硬化症などの自己免疫疾患患者の末梢血から、本細胞付着部材を用いて白血球、中でも主としてT細胞を撹拌、もしくはトリプシンなどのタンパク質分解酵素処理により回収してから、抗原もしくはコンカナバリンAのようなマイトジェンで活性化し、X線照射やマイトマイシン処理して不活化したのち、患者に免疫することにより、抗原特異的な免疫寛容が誘導されて、 From peripheral blood of patients with autoimmune diseases such as multiple sclerosis, the cell attachment member with leukocytes from collected by among others primarily stirring T cells, or proteolytic enzyme treatment such as trypsin, antigen or concanavalin A mitogen activated as, after inactivation by X-ray irradiation or mitomycin treatment, by immunizing the patient is induced tolerance antigen-specific immunity,
自己免疫疾患が治療できる。 Autoimmune disease can be treated.

【0022】さらに本細胞付着部材を使って非常に簡便に、白血球からDNAあるいはRNAを分離することもできる。 [0022] In a further very easy with the present cell attachment member, it is also possible to separate DNA or RNA from leukocytes. 本発明に用いるタンパク質をビーズに固定化してカラムを作製し、そのカラムに末梢血をアプライすると、カラムには白血球、主としてT細胞が付着しているので、動物細胞からのDNAの調製方法にしたがい、まずドデシル硫酸ナトリウム(以下、SDSともいう)およびプロテインキナーゼKを含むリシス緩衝液をカラム内にアプライし、50℃で3時間加温する。 The protein used in the present invention to prepare a column with immobilized on beads, when applied to peripheral blood for the column, white blood cells in the column, because mainly T cells are attached, according to a process for the preparation of DNA from animal cells firstly sodium dodecyl sulfate (hereinafter, SDS also called) a lysis buffer containing and proteinase K was applied to the column for 3 hours warming at 50 ° C.. つぎに細胞中の高分子DNAをカラムから溶出し、フェノール抽出によりDNAを精製することによりDNAがえられる。 Then the polymer DNA in cells eluted from the column, DNA will be obtained by purifying the DNA by phenol extraction.
RNAのばあいはグアニジン−イソチオシアネイト液をカラム内にアプライし細胞を溶解してトータルRNAを抽出する。 For RNA guanidine - by dissolving it was applied to isothiocyanates Nate liquid into the column cells extracted total RNA. あるいはより簡便に行うには、加温したフェノールをアプライし、ホットフェノール法によりトータルRNAを調製することもできる。 Or, more conveniently carried out, warmed phenol was applied, may also be prepared total RNA by the hot phenol method. これに対しRT−P In contrast RT-P
CRを行い相補的DNAを調製することもできる。 Complementary DNA performs CR may be a prepared.

【0023】このようにして調製したDNAを鋳型にして、PCR法により、遺伝子診断を行うこともできる。 [0023] The DNA thus prepared as a template, the PCR method, it is also possible to perform gene diagnosis.

【0024】 [0024]

【実施例】つぎに本発明を実施例にもとづいて説明するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, the present invention based on examples will be described, but the present invention is not limited only to those embodiments as well.

【0025】実施例1 a. [0025] Example 1 a. ポリスチレンと反応する活性化ハロゲンの作製 2−ブロモアセトアミド(アルドリッチ社製)37gを蒸留水75mlに懸濁し、そこに37%ホルムアルデヒド20mlと炭酸カリウム2.5gを加え、スターラーで10分間、室温で撹拌して沈殿を完全に溶解した。 Was suspended Preparation of 2-bromoacetamide (Aldrich) 37 g of an activated halogen which reacts with the polystyrene in distilled water 75 ml, there 37% formaldehyde 20ml potassium carbonate 2.5g was added, 10 minutes with a stirrer, stirred at room temperature was completely dissolve the precipitate was. この溶液をナス型フラスコに入れて、4℃で一晩静置したのち、上清をデカンテーションにより捨て、蒸留水を5 Put the solution in an eggplant-shaped flask, then was allowed to stand overnight at 4 ° C., the supernatant was discarded by decantation, and distilled water 5
0ml加えたのち42℃で沈殿を溶解し、4℃で一晩再び静置した。 The precipitate was dissolved in 42 ° C. After addition 0 ml, and allowed to stand again overnight at 4 ° C.. この操作を4回繰り返してから、生じた沈殿をG−3のガラスフィルター(フィルター径30m Repeat this operation 4 times, a glass filter of the resulting precipitate G-3 (filter size 30m
m:日本理化学器械(株)社製)を通過させることにより回収し、1時間アスピレーターにて吸引乾燥してから、24時間凍結乾燥し、ポリスチレンと反応する活性化ハロゲンであるN−ヒドロキシルメチル−2−ブロモアセトアミドを調製した。 m: is recovered by passing the Japanese SCIENTIFIC INSTRUMENTS Co., Ltd.), after suction dried at 1 hour aspirator, and freeze dried for 24 hours, is active halogen which react with polystyrene N- hydroxymethyl - 2-bromoacetamide was prepared.

【0026】b. [0026] b. 活性化ハロゲンポリスチレンプレートの作製 ポリスチレンプレート(高さ20mm×直径90mm: Preparation polystyrene plate activated halogen polystyrene plates (height 20 mm × diameter 90 mm:
西部(株)社製)はガンマー線滅菌処理していないものを用い、1M塩酸で室温、1時間処理後、蒸留水で洗浄し、つぎに1M水酸化ナトリウムで室温、1時間処理し、蒸留水で洗浄した。 Western Co., Ltd.) is used as untreated gamma sterilization, at room temperature with 1M hydrochloric acid, after 1 hour, washed with distilled water, then at room temperature 1M sodium hydroxide, and 1 hour, distilled and washed with water. つぎに前記aで調製したN−ヒドロキシルメチル−2−ブロモアセトアミド335mg It was then prepared by the a N-hydroxy-methyl-2-bromoacetamide 335mg
をテトラメチレンスルホン10mlに溶解し、一方、トリフルオロメチルスルホン酸3mlをテトラメチレンスルホン7mlに混合したものと前記溶液を合体し、それを速やかに前記の洗浄後のポリスチレンプレート上にアプライした。 Was dissolved in tetramethylene sulfone 10 ml, whereas, the trifluoromethylsulfonate 3ml coalesce said solution and a mixture of tetramethylene sulfone 7 ml, it was applied to rapidly the cleaning after the polystyrene plates. 外気を遮断し密封した状態で室温で5時間振とうした。 Was shaken at room temperature for 5 hours in a state sealed shut outside air. さらに反応液を捨てたのち、蒸留水で1回プレートを洗浄して乾燥し、活性化ハロゲンポリスチレンプレートを作製した。 After further discarding the reaction liquid, washed once plate with distilled water and dried, to prepare an activated halogen polystyrene plates.

【0027】c. [0027] c. LFA−3誘導体タンパク質のポリスチレンプレートへの固定化 以下の参考例に記載されたように大腸菌を宿主にして作製したLFA−3誘導体タンパク質(1mg/ml) LFA-3 derivative protein prepared by the E. coli host as described in Reference Example below immobilization onto polystyrene plates LFA-3 derivative protein (1 mg / ml)
2.5mlにジチオスレイトールを最終濃度50mMになるように加え、室温で1時間反応させたのち、速やかにゲル濾過カラムPD10(9.1ml、口径15mm Added so as dithiothreitol to a final concentration of 50mM to 2.5 ml, mixture was reacted at room temperature for one hour, rapidly gel filtration column PD10 (9.1 ml, diameter 15mm
×高さ50mm:ファルマシア社製)にアプライし、ホウ酸0.62g、塩化カリウム0.75g、1M水酸化ナトリウム2mlおよび蒸留水148mlを混合して作製した50mMホウ酸緩衝液(pH8.5)3.0ml × height 50 mm: and applied to Pharmacia), 0.62 g of boric acid, potassium chloride 0.75 g, 1M sodium hydroxide 2ml and distilled water 148 ml 50 mM borate buffer solution was prepared by mixing (pH 8.5) 3.0ml
で溶出し、タンパク質画分のみを回収した。 In eluted were collected protein fraction only. この回収画分(100μg/ml)300μlを前記bでえた活性化ハロゲンポリスチレンプレート上に加え、室温で2時間静置したのち、前記の50mMホウ酸緩衝液に2−メルカプトエタノールを最終濃度50mMになるように加えた溶液300μlに置換し、室温で1時間静置した。 In addition the recovered fraction (100μg / ml) 300μl in the b Dee was activated halogen polystyrene plates, after allowing to stand at room temperature for 2 hours, to 50mM borate buffer of the 2-mercaptoethanol to a final concentration of 50mM It was replaced so as added solution 300 [mu] l, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
前記プレート上の溶液を捨ててから、プレート表面を等張リン酸緩衝液300μlで2回洗浄した。 After discarding the solution on the plate was washed 2 times with the plate surface in isotonic phosphate buffer 300 [mu] l.

【0028】d. [0028] d. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンプレートへのCD2陽性細胞の付着 LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンプレート上に、等張リン酸緩衝液に懸濁したヒト株化細胞であるCD2陽性のジャーカット細胞とCD2陰性のジャーカット細胞(2×10 6個/ml)300μlをそれぞれ4℃で1時間静置し、一方、対照として、2−メルカプトエタノールをLFA−3誘導体タンパク質と同様にして固定化したポリスチレンプレートにも同様の細胞を静置した。 The LFA-3 derivative protein immobilization of CD2 positive cells in polystyrene plates attached LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene plates, CD2 positive Jurkat cells, a human cell line were suspended in an isotonic phosphate buffer When left for 1 hour CD2-negative Jurkat cells (2 × 10 6 cells / ml) and 300μl respectively 4 ° C., whereas, as a control, was immobilized by the 2-mercaptoethanol in the same manner as LFA-3 derivative protein It was allowed to stand for a similar cell in a polystyrene plate. 1時間後、細胞懸濁液を捨て、等張リン酸緩衝液1mlでプレートを洗浄した。 After 1 hour, discarded cell suspension, the plates were washed with isotonic phosphate buffer 1 ml. 前記プレートを倒立顕微鏡(倍率×100)で見て付着している細胞の有無を確認すると、LFA−3誘導体タンパク質を固定化したプレートにCD2陽性の細胞はほとんど付着していたが、CD2陰性の細胞はほとんど付着していなかった(図2参照)。 Check whether the cells adhering to the plate as viewed in an inverted microscope (magnification × 100), although the cells of CD2 positive plate immobilized with LFA-3 derivative protein was almost no adhesion, the CD2-negative cells were observed almost no adhesion (see FIG. 2). 一方、タンパク質を用いなかった以外は前記cと同様にして作製した、対照の2−メルカプトエタノールを固定化したプレートには、CD2陽性、陰性いずれの細胞もほとんど付着しなかった。 Meanwhile, except for using no protein was produced in the same manner as the c, the plate immobilized with the control of 2-mercaptoethanol, CD2 positive, negative both cell also hardly adheres.

【0029】実施例2 e. [0029] Example 2 e. 活性化ハロゲンポリスチレンビーズの作製 ポリスチレンビーズ(直径450μm:鐘淵化学工業株式会社製)はガンマー線滅菌処理していないものを用い、1.5gをメタノール5mlに懸濁し、ガラスカラム(口径1.0cm×高さ2.0cm:バイオラッド社製)に充填した。 Preparation of an activated halogen polystyrene beads Polystyrene beads (diameter 450 [mu] m: Kaneka Corporation) is used as untreated gamma ray sterilization, and 1.5g was suspended in methanol 5 ml, glass column (diameter 1.0cm × height 2.0 cm: packed in Bio-Rad). つぎにメタノール15mlでポリスチレンビーズを洗浄後、さらにテトラメチレンスルホン1 Then after washing the polystyrene beads with methanol 15 ml, further tetramethylene sulfone 1
5mlで洗浄、ついで蒸留水15mlで洗浄した。 Washed with 5 ml, then washed with distilled water 15 ml. 引き続き1M塩酸15mlで1時間処理後、蒸留水で洗浄し、つぎに1M水酸化ナトリウム15mlで1時間処理し、蒸留水で洗浄した。 Subsequently after 1 hour treatment with 1M hydrochloric acid 15 ml, and washed with distilled water, then 1 hour treated with 1M sodium hydroxide 15 ml, and washed with distilled water. つぎに再びポリスチレンビーズをテトラメチレンスルホン15mlで洗浄後、前記aで調製したN−ヒドロキシルメチル−2−ブロモアセトアミド335mgをテトラメチレンスルホン10mlに溶解し、一方、トリフルオロメチルスルホン酸3mlをテトラメチレンスルホン7mlに混合したものと前記溶液を合体し、そのうち7.5mlを前記のポリスチレンビーズカラムにアプライした。 Then washed again polystyrene beads in tetramethylene sulfone 15 ml, the N- hydroxymethyl-2-bromoacetamide 335mg prepared in a dissolving tetramethylene sulfone 10 ml, whereas, the trifluoromethylsulfonate 3ml tetramethylene sulfone coalesce said solution and a mixture into 7 ml, of which was applied a 7.5ml polystyrene bead column of the. 外気を遮断し密封した状態で室温で2.5時間振とうした。 Was shaken at room temperature for 2.5 hours in a state sealed shut outside air. さらに反応液を捨てたのち、再び7.5mlの合体溶液をカラムにアプライし、密封状態で室温にて2.5時間振とうしたのち、蒸留水で1回カラムを洗浄してから、デシケーター内で乾燥し、活性化ハロゲンポリスチレンビーズを作製した。 After further discarding the reaction liquid was applied to the column coalescence solution of 7.5ml again, after shaking at room temperature for 2.5 hours in a sealed state, washed once column with distilled water, in a desiccator in drying to produce an activated halogen polystyrene beads.

【0030】f. [0030] f. LFA−3誘導体タンパク質のポリスチレンビーズへの固定化 前記cと同様に大腸菌を宿主にして作製したLFA−3 LFA-3 LFA-3 that a similar to the immobilization said c to polystyrene beads of derivative protein Escherichia coli was prepared in the host
誘導体タンパク質(1mg/ml)2.5mlにジチオスレイトールを最終濃度50mMになるように加え、室温で1時間反応させたのち、速やかにゲル濾過カラムP Added to a final concentration 50mM dithiothreitol to derivative protein (1mg / ml) 2.5ml, mixture was reacted at room temperature for one hour, rapidly gel filtration column P
D10(9.1ml、口径15mm×高さ50mm:ファルマシア社製)にアプライし、ホウ酸0.62g、塩化カリウム0.75g、1M水酸化ナトリウム2mlおよび蒸留水148mlを混合して作製した50mMホウ酸緩衝液(pH8.5)3.0mlで溶出し、タンパク質画分のみを回収した。 D10 (9.1 ml, diameter 15 mm × height 50 mm: manufactured by Pharmacia) was applied to, boric acid 0.62 g, potassium chloride 0.75 g, 50 mM boric prepared by mixing 1M sodium hydroxide 2ml of distilled water 148ml and eluted with acid buffer (pH 8.5) 3.0 ml, it was recovered protein fraction only. 活性化ハロゲンポリスチレンビーズ0.5gを充填したカラム(直径1.0cm、孔径100μm、高さ7mm:バイオラッド社製)に対し、 Column packed with activated halogen polystyrene beads 0.5 g (diameter 1.0 cm, pore size 100 [mu] m, height 7 mm: manufactured by Bio-Rad) to,
この回収画分(100μg/ml)0.5mlをアプライし、タンパク質溶液を0.1ml/分の流速で通過させ、通過液を再びカラムに通し、この操作を5回繰り返した。 The collected fraction was applied to (100μg / ml) 0.5ml, the protein solution was passed at a flow rate of 0.1 ml / min, effluent again passed through the column, this operation was repeated 5 times. つぎに前記cで調製した50mMホウ酸緩衝液に1%ウシ血清アルブミンを加えた溶液5mlを、同様の流速でカラムを通過させ、さらに等張リン酸緩衝液5m Then a solution 5ml plus 1% bovine serum albumin in 50mM borate buffer prepared in the c, is passed through the column with the same flow rate, further isotonic phosphate buffer 5m
lを通過させた。 It was passed through a l.

【0031】g. [0031] g. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムでの末梢血からの白血球の付着除去 ヒト末梢血0.5mlを10%クエン酸ナトリウム採血し、前記fでえられたLFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムに0.02ml/分の流速でアプライし、さらに等張リン酸緩衝液1.0mlにて0.06〜0.18ml/分の流速で3回カラムを洗浄した(えられたカラムを以下、「LFA−3カラム」という)。 LFA-3 derivatives attachment removed human peripheral blood 0.5ml of leukocytes from the peripheral blood of a protein-immobilized polystyrene bead columns and 10% sodium citrate blood, LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene beads which are caught in the f column was applied at a flow rate of 0.02 ml / min, and further washed three times column at a flow rate of 0.06~0.18Ml / min at an isotonic phosphate buffer 1.0 ml (the obtained column below referred to as "LFA-3 column"). 対照としてLFA−3誘導体タンパク質のかわりにウシ血清アルブミン(BSA)を固定化したポリスチレンビーズカラムでも全く同様の操作を行った(えられたカラムを以下、「BSAカラム」という)。 As a control was carried out exactly the same operations in a polystyrene bead columns with immobilized bovine serum albumin (BSA) in place of the LFA-3 derivative protein (The obtained column hereinafter, referred to as "BSA columns"). 10% 10%
クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血0.5mlに等張リン酸緩衝液3mlを加えたものと、カラムを通過した回収血液からそれぞれ2mlを血液成分検査に供し、 And plus the isotonic phosphate buffer 3ml human peripheral blood 0.5ml was sodium citrate blood, a 2ml from each collected blood which has passed through the column was subjected to a blood component test,
残りは標識抗体を用いたフローサイトメトリー実験(コールター社製フローサイトメーター使用)に用いた。 The remainder was used in flow cytometry experiments using labeled antibody (manufactured by Coulter Electronics, Inc. flow cytometer used).

【0032】以下にフローサイトメトリー実験の条件について述べる。 [0032] described the conditions of the following in flow cytometry experiments.

【0033】ポリスチレンチューブ(直径12mm×高さ75mm、ベクトンディッキンソン社製)に、抗CD The polystyrene tubes (diameter 12 mm × height 75 mm, Becton Dickinson) in an anti-CD
3抗体(PE標識、コールター社製)10μlを分注した。 3 antibodies (PE labeled, manufactured by Coulter, Inc.) was dispensed 10 [mu] l.

【0034】つぎにカラムを通過した回収血液1.5m [0034] then collected blood 1.5m that has passed through the column
lおよび10%クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血0.5mlに等張リン酸緩衝液3mlを加えたものから1.5mlをそれぞれ前記の抗体を入れたチューブに加え、ボルテックスミキサー(井内盛栄堂社製)で5秒間よく混和した。 In addition l and 10% sodium citrate blood human peripheral blood 0.5ml of 1.5ml from plus isotonic phosphate buffer 3ml each tube containing the antibody, vortex mixer (Iuchi Co. It was thoroughly mixed for 5 seconds Etsu Chemical Co., Ltd.). 前記チューブを砕氷を入れた保冷箱に入れ、アルミホイルで遮光し、30分間放置した。 Placed in a cold box and the tube was placed crushed ice, protected from light with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes. 塩化ナトリウム8.26gに、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム45mgおよび重炭酸カリウム1.0gを加え、 Sodium chloride 8.26 g, disodium ethylenediaminetetraacetate 45mg and potassium bicarbonate 1.0g was added,
蒸留水に溶解し1lにした溶血試薬の1.5mlを前記チューブに加え、ボルテックスミキサーで10秒間よく混和し、再度、前記溶血試薬1.5mlをチューブに加え、ボルテックスミキサーで10秒間よく混和した。 It added 1.5ml of hemolysis reagent in dissolved 1l of distilled water to the tube and mix well for 10 seconds with a vortex mixer again, adding the hemolytic reagent 1.5ml to tube and mix well for 10 seconds with a vortex mixer . つぎに37℃で15分間遮光放置し、赤血球を溶血させ、 Then 15 minutes shielding standing at 37 ° C., lysed erythrocytes,
1,400rpm(410×g)、4℃で3分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去した。 1,400rpm (410 × g), and centrifuged for 3 min at 4 ° C., the supernatant was removed by suction with an aspirator. 細胞を洗浄するために、ボルテックスミキサーで3秒間細胞ペレットをほぐし、0.1%アジ化ナトリウムを含む等張リン酸緩衝液3mlを前記チューブに加え、ボルテックスミキサーで5秒間よく混和し、1,400rpm(410 To wash the cells, loosen 3 seconds the cell pellet with a vortex mixer, the isotonic phosphate buffer 3ml containing 0.1% sodium azide was added to the tube, mixed well for 5 seconds with a vortex mixer, 1, 400rpm (410
×g)、4℃で3分間遠心し、上清をアスピレーターで吸引除去した。 × g), and centrifuged for 3 min at 4 ° C., the supernatant was removed by suction with an aspirator. これに0.1%アジ化ナトリウムを含む等張リン酸緩衝液1mlを加え、ボルテックスミキサーで軽く混和し、フローサイトメーターの測定サンプルとした。 This isotonic phosphate buffer 1ml containing 0.1% sodium azide was added, mixed gently with a vortex mixer to form a measurement sample flow cytometer.

【0035】フローサイトメーターでの測定にあたっては、リンパ球領域にゲーティングし、PE(抗体CD3 [0035] In measuring the flow cytometer, gating on lymphocytes region, PE (antibody CD3
抗体)の陽性比率を分析した。 Were analyzed the positive ratio of antibody).

【0036】血液成分検査では白血球数、赤血球数、血小板数は多項目自動血球分析装置(東亜医用電子社製) The number of white blood cells in a blood component test, red blood cell count, platelet count automated hematology analyzer (manufactured by Toa Medical Electronics Co., Ltd.)
を用いて測定算出した。 It was measured calculated using. 白血球像はメイギムザ染色により観察した。 White blood cell image was observed by Giemsa staining. このようにして実施したカラム通過前後の細胞分析では、赤血球数(アプライ時77×10 4 /m In this way, the column before and after passing through the cell analysis performed, the number of red blood cells (applied at 77 × 10 4 / m
3 、LFA−3カラム通過80×10 4 /mm 3 、BS m 3, LFA-3 through the column 80 × 10 4 / mm 3, BS
Aカラム通過77×10 4 /mm 3 )、血小板数(アプライ時3.20×10 4 /mm 3 、LFA−3カラム通過2.75×10 4 /mm 3 、BSAカラム通過3.10× A column passes 77 × 10 4 / mm 3) , platelet count (when applied 3.20 × 10 4 / mm 3, LFA-3 through the column 2.75 × 10 4 / mm 3, BSA passed through the column 3.10 ×
10 4 /mm 3 )にはほとんど変化は認められなかったが、白血球数は減少(アプライ時700/mm 3 、LF 10 4 / mm 3) in but was little change was observed, the white blood cell count decreased (applied at 700 / mm 3, LF
A−3カラム通過467/mm 3 、BSAカラム通過6 A-3 through the column 467 / mm 3, BSA passed through the column 6
67/mm 3 )しており、LFA−3カラムには白血球が付着していることが示された。 67 / mm 3) and which, in the LFA-3 column was shown that white blood cells are attached. その白血球の中でも、 Among the white blood cells,
白血球像解析の結果から、顆粒球(アプライ時46.8 From the results of white blood cell image analysis, granulocytes (when applied 46.8
%(好塩基球:1.35%+好酸球:4.05%+好中球:41.35%)、LFA−3カラム通過56.6% % (Basophils: 1.35% + eosinophil 4.05% + Neutrophils: 41.35%), LFA-3 column pass 56.6%
(好塩基球:1.85%+好酸球:5.60%+好中球:49.10%)、BSAカラム通過48.3%(好塩基球:2.05%+好酸球:5.45%+好中球:4 (Basophils 1.85% + eosinophils: 5.60% + Neutrophils: 49.10%), BSA column pass 48.3% (basophils: 2.05% + eosinophils: 5.45% + neutrophils: 4
0.80%))、単球(アプライ時8.2%、LFA− 0.80%)), monocytes (applied at 8.2%, LFA-
3カラム通過8.1%、BSAカラム通過8.7%)の比率よりもリンパ球(アプライ時44.8%(リンパ球中のT細胞(CD2 +およびCD3 + )の比率:53.7 3 passing through the column 8.1%, the proportion of BSA column pass 8.7%) lymphocytes than the ratio of ((44.8%) when applied (T cells in lymphocyte (CD2 + and CD3 +): 53.7
%)、LFA−3カラム通過35.1%(リンパ球中のT細胞(CD2 +およびCD3 + )の比率:42.0 Ratio of%), LFA-3 column pass 35.1% (T cells in lymphocyte (CD2 + and CD3 +): 42.0
%)、BSAカラム通過42.9%(リンパ球中のT細胞(CD2 +およびCD3 + )の比率:55.0%)の比率の減少が認められた。 %), The proportion of BSA column pass 42.9% (T cells in lymphocyte (CD2 + and CD3 +): reduction ratio 55.0%) was observed. そのリンパ球の解析には、T細胞はCD3抗体(PE標識)を用いたフローサイトメトリー実験により行った。 Its lymphocyte analysis, T cells was performed by flow cytometry experiments using CD3 antibody (PE labeling). その結果、カラムアプライ時のCD3 +率(標識CD3抗体と結合したCD3陽性細胞の%)が53.7%に対して、LFA−3カラム通過後では42.0%と減少していた。 As a result, CD3 + ratio at column apply (% of CD3 positive cells bound to the labeled CD3 antibody) against 53.7%, after the LFA-3 through the column was reduced 42.0%. 以上のデータを総合して考えると、カラムアプライ時のT細胞を100%とすると、本LFA−3カラムによりT細胞の59.1%が除去できたことになる。 Taken together the above data, when the T cells upon column apply to 100% 59.1% of the T cells would could be removed by the LFA-3 column. 同様にして算出したLFA−3 LFA-3, which was calculated in the same manner
固定化カラムおよびBSAカラムのヒト末梢血細胞の除去率を表1に示す。 The removal rate of immobilized column and BSA columns of human peripheral blood cells shown in Table 1.

【0037】 [0037]

【表1】 [Table 1] 実施例3 h. Example 3 h. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムとCD3抗体固定化ポリスチレンビーズカラムへのジャーカット細胞の付着率の比較 CD3抗体固定化ポリスチレンビーズカラムおよびウシ血清アルブミン(BSA)固定化ポリスチレンビーズカラムの作製は以下のように実施した。 LFA-3 Preparation of derivative protein-immobilized polystyrene bead column and CD3 antibody-immobilized polystyrene comparison adhesion rate of Jurkat cells to bead column CD3 antibody-immobilized polystyrene bead column and bovine serum albumin (BSA) immobilized polystyrene beads column It was carried out as follows. 等張リン酸緩衝液を用いて調製した、ジチオスレイトールによる還元処理を行っていない800μg/mlのタンパク質濃度のC Was prepared using isotonic phosphate buffer, the protein concentration of 800 [mu] g / ml not subjected to a reduction treatment by dithiothreitol C
D3抗体溶液およびウシ血清アルブミン溶液をそれぞれ、実施例2のeと同様にしてえた0.5gの活性化ハロゲンポリスチレンビーズを充填したカラム(口径1. D3 antibody solution and bovine serum albumin solution were each filled with an activated halogen polystyrene beads 0.5g that E in the same manner as e of Example 2 column (diameter 1.
0cm×高さ7mm:バイオラッド社製)(以下、前者を「CD3抗体カラム」、後者を「BSAカラム」という)にアプライし、タンパク質溶液を0.1ml/分の流速で通過させ、通過液を再びカラムに通し、この操作を5回繰り返した。 0 cm × height 7 mm: manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc.) (hereinafter, the former "CD3 antibody column", the latter was applied to as "BSA columns"), the protein solution was passed at a flow rate of 0.1 ml / min, effluent again passed through the column, this operation was repeated 5 times. つぎに、前記cで調製した50mM Then, 50 mM prepared by the c
ホウ酸緩衝液に1%BSAを加えた溶液5mlを、同様の流速でカラムを通過させ、さらに等張リン酸緩衝液5 The solution 5ml plus 1% BSA in borate buffer was passed through the column with the same flow rate, further isotonic phosphate buffer 5
mlを通過させた。 The ml was passed through. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラム(以下、「LFA−3カラム」という)は活性化ハロゲンポリスチレンビーズ0. LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene bead column (hereinafter, referred to as "LFA-3 column") is an activated halogen polystyrene beads 0.
5gを用い前記fの方法で作製した(0.5gのビーズ中LFA−3誘導体タンパク質の固定化量は300μg 5g was prepared by the method of the f using (immobilization amount of LFA-3 derivative protein beads of 0.5g is 300μg
であった)。 Met). これら3つのカラムに、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地5mlを通したのち、C These three columns, then through RPMI1640 medium 5ml containing 10% fetal bovine serum, C
D2陽性かつCD3陽性のジャーカット細胞2×10 6 D2-positive and CD3-positive jar cut cells 2 × 10 6
を10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地1m RPMI1640 medium 1m containing 10% fetal bovine serum
lに懸濁して、カラムに0.2ml/分の流速でアプライし、通過してきた細胞を回収した。 Was suspended in l, it was applied at a flow rate of 0.2 ml / min onto the column and recovering cells that has passed through. つぎに、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地1mlでカラムを4回洗浄した。 It was then washed four times the column with RPMI1640 medium 1ml containing 10% fetal bovine serum. このときに通過してきた細胞も回収した。 Cell that has passed through at this time was also recovered. カラムを通過してきた細胞数を血球計算盤で数えると、各カラムの全溶出細胞数は、LFA−3カラムで8.5%、CD3抗体カラムで46.0%、そしてBS Counting the number of cells passed through the column with hemocytometer, total elution cell number in each column, 8.5% by LFA-3 column 46.0 percent CD3 antibody column, and BS
Aカラムで81.8%であった。 Was 81.8% in the A column. 逆にいうと、LFA− Conversely, LFA-
3カラムは91.5%の細胞を付着し、CD3抗体カラムは54.0%、BSAカラムは18.2%の細胞しか付着できなかったことを示している。 3 column adheres 91.5% of the cells, CD3 antibody column is 54.0%, BSA column indicates that it could not adhere only 18.2% of the cells.

【0038】i. [0038] i. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムとCD3抗体固定化ポリスチレンビーズカラムへのヒト末梢血からのリンパ球の付着率の比較 LFA−3カラム、CD3抗体カラムおよびBSAカラムの作製方法は前記hと同様にして行った。 LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene bead column and Comparative LFA-3 column adhesion rate of lymphocytes from human peripheral blood to CD3 antibody-immobilized polystyrene bead column, a method for manufacturing a CD3 antibody column and BSA columns and the h It was carried out in the same manner. これら3つのカラムに、10%ウシ胎児血清を含むRPMI164 These three columns, containing 10% fetal bovine serum RPMI164
0培地5mlを通したのち、10%クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血1.2mlを前記カラムにアプライした。 After through 0 medium 5 ml, of human peripheral blood 1.2ml was 10% sodium citrate blood was applied to the column. 1.2mlの等張リン酸緩衝液で前記カラムを洗浄し、さらに、1.6mlの等張リン酸緩衝液で再度洗浄した。 Washing the column with isotonic phosphate buffer of 1.2 ml, it was further washed again with isotonic phosphate buffer 1.6 ml. ここで各カラム通過画分からフィコールパック(ファルマシア社製)でリンパ球画分を調製し、リンパ球数を血球計算盤で数えた。 Here lymphocytes fraction prepared in Ficoll pack (Pharmacia) from each column flow-through fraction, were counted lymphocytes hemocytometer. 各カラムの溶出リンパ球数は、LFA−3カラムで57.3%、CD3抗体カラムで88.4%、そしてBSAカラムで87.4%であった。 Elution lymphocyte count each column 57.3% for LFA-3 column 88.4 percent CD3 antibody column, and 87.4% in the BSA column. 逆にいうと、LFA−3カラムは42.7%のリンパ球を付着し、CD3抗体カラムは11.6%、BSA Conversely, LFA-3 column was deposited 42.7% of the lymphocytes, CD3 antibody column is 11.6%, BSA
カラムは12.6%のリンパ球しか付着できなかったことを示している。 Column indicates that it could not adhere only 12.6% of the lymphocytes.

【0039】実施例4 j. [0039] Example 4 j. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムでの、簡便な白血球からのDNAの分離 前記fで作製したLFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムに、10%クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血0.5mlをアプライし、さらに等張リン酸緩衝液1.0mlにて、0.06〜0.18m LFA-3 derivative of a protein-immobilized polystyrene bead column, to LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene beads column manufactured by separating the f of DNA from simple leukocytes, human peripheral blood 0 was 10% sodium citrate blood. It was applied to 5 ml, at more isotonic phosphate buffer 1.0ml, 0.06~0.18m
l/分の流速で3回カラムを洗浄すると、カラムには白血球、主としてT細胞が付着しているので、動物細胞からのDNA調製方法にしたがい、150mM塩化ナトリウム、15mM酢酸ナトリウム、100mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(pH8.0)、100μg When washing the column three times with l / min flow rate, since the column leukocytes are mainly adhered T cells, in accordance DNA preparation from animal cells, 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium acetate, 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium (pH8.0), 100μg
/mlプロテイナーゼKおよび1%SDSからなるリシス緩衝液を5mlカラムにアプライし、リシス緩衝液がカラムから流出しないようにして、50℃で3時間加温した。 / Ml proteinase K and 1% consisting SDS lysis buffer was applied to 5ml column, as lysis buffer does not flow out from the column and allowed to 3 hours pressurized at 50 ° C.. この操作によりDNAは細胞外に出てくるので、 Since the DNA comes out to the outside of the cell by this operation,
こののち、リシス緩衝液をカラム内から流出させてDN Thereafter, by discharging the lysis buffer from the column DN
Aを回収した。 It was collected A. さらにDNAの精製を行なうために、えられたDNA5ml(100μg含有)に10mMトリスおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液(pH8.0)で飽和したフェノールを等量加えて、混和したのち、3,000回転で室温で10分間遠心分離し、フェノール層を除去し、水層を回収した。 Furthermore in order to perform the purification of DNA, but added an equal volume of the obtained DNA5ml (100μg contained) in 10mM Tris and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid phenol saturated with disodium consisting of a solution (pH 8.0), After mixing, 3 , centrifuged for 10 minutes at room temperature 000 rotated to remove the phenol layer, the aqueous layer was collected. 再度このフェノール抽出を繰り返した。 Again it was repeated this phenol extraction. さらに、この水層を透析チューブ(和光純薬工業社製)に移し、1 Furthermore, transferring the aqueous layer into a dialysis tubing (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1
0mMトリスおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液(pH8.0)1000mlに対し1回目は室温で12時間透析し、2回目、3回目の透析は4℃で12時間ずつ実施した。 First to 0mM Tris and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid consisting disodium solution (pH 8.0) 1000 ml was dialyzed for 12 hours at room temperature, a second time, dialysis third was carried by 12 hours at 4 ° C.. 透析チューブからポリアロマーチューブにDNAを移し、100分の1量のアールエヌエースA液(10mg/ml)を加え、37 A polyallomer tube from the dialysis tube was transferred DNA, 1 of Earle N. Ace A solution of 100 minutes (10 mg / ml) was added, 37
℃で3時間インキュベートした。 It was incubated for 3 hours at ℃. 等量のフェノール/クロロホルムを加え、混和し、3,000回転、5分間遠心分離し、フェノール/クロロホルム層を捨て、さらにもう1回この操作を繰り返した。 An equal volume of phenol / chloroform, mix and, 3,000 rpm, and centrifuged for 5 minutes, discard the phenol / chloroform layer, once more this operation was repeated. 最後に、10mMトリスおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液(pH8.0)1000mlに対し1回目は室温で12時間透析し、2回目、3回目の透析は4℃で12時間ずつ実施した。 Finally, the first to solution (pH 8.0) 1000 ml consisting of 10mM Tris and 1mM disodium ethylenediaminetetraacetate was dialyzed for 12 hours at room temperature, a second time, dialysis third was carried by 12 hours at 4 ° C..

【0040】k. [0040] k. LFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムでの、簡便な白血球からのRN LFA-3 with derivatives protein-immobilized polystyrene bead column, RN from simple leukocytes
Aの分離 前記fで作製したLFA−3誘導体タンパク質固定化ポリスチレンビーズカラムに、10%クエン酸ナトリウム採血したヒト末梢血0.5mlをアプライし、さらに等張リン酸緩衝液1.0mlにて0.06〜0.18ml The LFA-3 derivative protein-immobilized polystyrene beads column manufactured by A separating said f, was applied to human peripheral blood 0.5ml was 10% sodium citrate blood, further in isotonic phosphate buffer 1.0 ml 0 .06~0.18ml
/分の流速で3回カラムを洗浄すると、カラムには白血球、主としてT細胞が付着しているので、10mMトリス塩酸、100mM塩化ナトリウムおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液(pH7. And washed / min at a flow rate of 3 times the column, since leukocytes to the column, mainly T cells are attached, 10 mM Tris-HCl, 100 mM sodium chloride and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid consisting disodium solution (pH 7.
5)5mlをカラムに通したのち、氷冷した10mMトリス塩酸、100mM塩化ナトリウムおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる溶液(PH 5) After the through 5ml to column, 10 mM Tris-HCl with ice-cold, 100 mM sodium chloride and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid consisting disodium solution (PH
7.5)5mlをカラムにアプライし、カラムから流出させないようにして、ビーズごと細胞を懸濁した。 7.5) The 5ml applied to the column, so as not to flow out from the column and suspended beads per cell. これに0.25mlの10%SDSを加え、直ちにあらかじめ65℃に加温したフェノールを加えた。 To this was added 10% SDS in 0.25 ml, was added immediately warmed phenol in advance 65 ° C.. 撹拌しながら、65℃に15分間放置したのち、さらに室温で10 While stirring, slurry was allowed to stand in 65 ° C. 15 min, at room temperature for an additional 10
分間振とうした。 Minutes shaking was shaken. ここでカラム中の溶液を通過させ、通過してきた溶液を3,000回転、10分間遠心し、水層を回収した。 Here passed through a solution in the column, the solution 3000 rotate which has passed through, and centrifuged for 10 minutes, the aqueous layer was collected. さらにフェノール抽出を2回、クロロホルム抽出を1回行い、エタノール沈殿した。 Two more times with phenol extraction, performed once a chloroform extraction, and ethanol precipitation. この沈殿を10mMトリス塩酸および10mM塩化マグネシウムからなる溶液(pH7.5)300μlに溶解し、140 The precipitate was dissolved in a solution (pH 7.5) 300 [mu] l consisting of 10mM Tris-HCl and 10mM magnesium chloride, 140
単位のディーエヌエースIを加え、4℃、3時間反応させた。 It added DeNA over scan I units, 4 ° C., and allowed to react for 3 hours. このものからRNAをフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿し、精製したRNAをえた。 RNA from this one phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to give a purified RNA.

【0041】実施例5 l.固定化方法のちがいによるLFA−3誘導体タンパク質へのCD2陽性細胞の付着の比較 実施例1のbで作製した活性化ハロゲンポリスチレンプレートでは、チオール基を介した結合のほうがアミノ基を介した結合よりも優先的に反応するので、LFA−3 [0041] In Example 5 l. Manufactured in b of Comparative Example 1 of the attachment of CD2 positive cells due to difference in immobilization method to LFA-3 derivative protein activation halogen polystyrene plates, the coupling via the thiol group since more reacts preferentially over coupling via amino groups, LFA-3
誘導体タンパク質を実施例1のcに記載の方法で固定化ポリスチレンプレート上に固定化した付着部材と、以下の参考例に記載されたように作製したLFA−3誘導体タンパク質を200μg/mlとなるように等張リン酸緩衝液400mlに溶解し、その溶液を活性化ポリスチレンプレート(実施例1のbで作製したもの)上で室温、1時間静置することによりアミノ基を介して固定した付着部材とを作製した。 So that the attachment member derivatives protein was immobilized to the immobilized polystyrene plates by the method described in c of Example 1, the LFA-3 derivative protein prepared as described in the following Reference Examples and 200 [mu] g / ml was dissolved in isotonic phosphate buffer 400ml to room temperature the solution on activation polystyrene plates (as prepared in b) of example 1, adhesion member fixed via an amino group by 1 hour stand to prepare a door. 等張リン酸緩衝液に懸濁したヒトT細胞株化細胞であるCD2陽性のジャーカット細胞とCD2陰性のジャーカット細胞(2×10 6個/m Human T cells cell line is a CD2-positive Jurkat cells and CD2-negative Jurkat cells suspended in isotonic phosphate buffer (2 × 10 6 cells / m
l)300μlをそれぞれ4℃で1時間静置した。 l) 300 [mu] l of each was allowed to stand for 1 hour at 4 ° C.. 一方、対照として、フリーのシステイン残基を1つもつカルボニックアンヒドラーゼ200μg/mlおよび2− On the other hand, as a control, carbonic anhydrase 200 [mu] g / ml with one free cysteine ​​residue and 2-
メルカプトエタノール50mMを前記と同様にして固定化ポリスチレンプレートおよび活性化されたポリスチレンプレートに前記と同様にして細胞を静置した。 Cells were allowed to stand mercaptoethanol 50mM in the same manner as the immobilized polystyrene plate and activated polystyrene plates in the same manner as above. 1時間後、細胞懸濁液を捨ててから、等張リン酸緩衝液で各プレートを洗浄した。 After 1 hour, the discard of the cell suspension was washed each plate in isotonic phosphate buffer. 各プレートを倒立顕微鏡(倍率×1 Each plate an inverted microscope (magnification × 1
00)で観察し、付着している細胞の有無を確認した。 It was observed at 00), to confirm the presence or absence of cells adhering.
写真をとり、一定面積下の付着している細胞数をカウントした。 Taking photos were counted the number of cells adhering under certain area. その結果、チオール基を介して固定化したLF LF Consequently, immobilized via a thiol group
A−3誘導体タンパク質を固定化したプレートには、C The plate immobilized with A-3 derivative protein, C
D2陽性の細胞がほとんど付着していたが、CD2陰性の細胞はほとんど付着していなかった。 D2-positive cells were almost no adhesion but cells CD2-negative was observed almost no adhesion. 一方、対照のカルボニックアンヒドラーゼおよび2−メルカプトエタノールを固定化したプレートには、CD2陽性、陰性いずれの細胞もほとんど付着しなかった。 On the other hand, the plate immobilized with control carbonic anhydrase and 2-mercaptoethanol, CD2 positive, negative both cell also hardly adheres. またアミノ基を介して固定化したプレートにはいずれの細胞もほとんど付着しなかった。 The one to the plate immobilized via an amino group cells also hardly adheres. なお、LFA−3誘導体タンパク質(M Incidentally, LFA-3 derivative protein (M
W:約13,000)およびカルボニックアンヒドラーゼ(MW:約30000)のプレートへの固定化されたタンパク質量はそれぞれ4.5μg/cm 2および3. W: about 13,000) and carbonic anhydrase (MW: each immobilized protein mass to the plate of about 30,000) is 4.5 .mu.g / cm 2 and 3.
6μg/cm 2であった。 It was 6μg / cm 2.

【0042】表2に、0.05%クリスタルバイオレットにより染色した各プレートを写真に撮り、写真(3c [0042] Table 2, take each plate were stained with 0.05% crystal violet in the photo, photo (3c
m×3cm)の細胞数をカウントした結果を示す。 Shows the result of counting the number of cells m × 3 cm).

【0043】 [0043]

【表2】 [Table 2] 実施例6 m. EXAMPLE 6 m. LFA−3誘導体タンパク質とCD3抗体を固定化したプレートのCD2陽性およびCD3陽性細胞の付着の比較 実施例5のlと同様にして、LFA−3誘導体タンパク質をチオール基を介してプレートに固定化した(以下、 LFA-3 in the same manner as l in Comparative Example 5 of adhesion of CD2-positive and CD3-positive cells of derivative protein and CD3 antibody immobilized plate, the LFA-3 derivative protein was immobilized on the plate via a thiol group (Less than,
LFA−3固定化プレートともいう)。 Also referred to as LFA-3-immobilized plate). 固定化したタンパク質量は4.5μg/cm 2であった。 Amount of protein immobilized was 4.5 .mu.g / cm 2. 一方、等張リン酸緩衝液を用いて調製した、CD3抗体100μg/ On the other hand, was prepared with isotonic phosphate buffer, CD3 antibody 100 [mu] g /
ml(3.1μg/cm 2 )およびウシ血清アルブミン(BSA)300μl(3.6μg/cm 2 )を室温で1時間静置することによりアミノ基を介してプレートに固定化した(以下、「CD3抗体固定化プレート」および「BSA固定化プレート」ともいう)。 ml (3.1μg / cm 2) and bovine serum albumin (BSA) 300μl (3.6μg / cm 2) was immobilized on the plate via the amino group by 1 hour standing at room temperature (hereinafter, "CD3 antibody-immobilized plate "and also referred to as" BSA-immobilized plate "). フローサイトメーター(コールター社製)により等張リン酸緩衝液に懸濁したCD2、CD3共に同程度ジャーカット細胞の表面に発現していることを確認している細胞(CD2 + Cells has been confirmed to be expressed in a flow cytometer CD2 were suspended in isotonic phosphate buffer solution (manufactured by Coulter Co.), CD3 both surfaces of the same degree Jurkat cells (CD2 +
およびCD3 +のジャーカット細胞)および両者共に発現していないジャーカット細胞(CD2 -およびCD3 - And CD3 + Jurkat cells) and Jurkat cells that do not express Both (CD2 - and CD3 -
のジャーカット細胞)をプレートに(2×10 6個/m The Jurkat cells) to the plate (2 × 10 6 cells / m
l)300μlアプライし、4℃で1時間静置し、そののち細胞懸濁液を捨て、等張リン酸緩衝液で洗浄した。 l) was 300μl applied, allowed to stand for 1 hour at 4 ° C., After that discarded cell suspension was washed with isotonic phosphate buffer.
その結果、LFA−3誘導体タンパク質をチオール基を介して固定化したプレートにのみCD2 +およびCD3 + As a result, only the plate immobilized via a thiol group of LFA-3 derivative protein CD2 + and CD3 +
のジャーカット細胞が付着した。 Jurkat cells are attached. その他のプレートには付着しなかった。 The other plate did not adhere. またCD2 -およびCD3 -のジャーカット細胞はいずれのプレートにもほとんど付着しなかった。 The CD2 - and CD3 - are the Jurkat cells hardly adhere to either of the plates. 付着の程度はプレートに付着しているジャーカット細胞を0.05%クリスタルバイオレットで染色することにより観察した。 The degree of adhesion was observed by staining Jurkat cells adhering to the plates with 0.05% crystal violet.

【0044】図3にその結果を示す。 [0044] The results are shown in Figure 3.

【0045】参考例 大腸菌を宿主としたLFA−3誘導体タンパク質の作製 a. [0045] Preparation a of LFA-3 derivative protein Reference Example Escherichia coli as a host. ヒツジD2領域欠失型LFA−3様タンパク質(以下、ヒツジ△D2タンパク質と呼ぶ)cDNAのPCR Sheep D2 region deletion type LFA-3 like protein (hereinafter, referred to as sheep △ D2 protein) cDNA of PCR
用プライマーの合成 ヒツジCD2抗原受容体については配列番号3に示したように29アミノ酸残基からなるN末端アミノ酸配列が開示されている(特開昭63−150228号公報参照)。 The synthesis of sheep CD2 antigen receptor of use primers N-terminal amino acid sequence consisting of 29 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 3 has been disclosed (see JP-A-63-150228). ヒツジ△D2タンパク質cDNAのPCR用プライマーとして、制限酵素BamHIの認識配列を含む配列と引き続く配列番号3の1番から7番のアミノ酸配列から予想されるDNA配列とを有する配列番号4で示される混合プライマー、および制限酵素PstIの認識配列を含む配列と引き続く配列番号3の27番から22番のアミノ酸配列から予想されるDNA配列とを有する配列番号5で示される混合プライマーをDNA合成機(アプライドバイオシステムズ社、モデル381A)を使用し合成した。 As PCR primers sheep △ D2 protein cDNA, mixed as shown in SEQ ID NO: 4 and a DNA sequence deduced from the number 1 from No. 7 of the amino acid sequence of and subsequent sequence containing the recognition sequence of restriction enzyme BamHI SEQ ID NO: 3 primers, and the restriction enzyme PstI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a DNA sequence deduced from the 22 th amino acid sequence from No. 27 sequence followed SEQ ID NO: 3 comprising mixed primers DNA synthesizer (Applied Biosystems Systems, Inc., has been using a model 381A) synthesis.

【0046】b. [0046] b. ヒツジ細胞由来二重鎖cDNAの調製 ヒツジから血液100mlをヘパリン採血し、350 Blood 100ml heparinized blood from preparation Sheep sheep cell-derived double-stranded cDNA, 350
G,10分の遠心によりバフィーコート画分をえた。 G, by 10 minutes of centrifugation to give a buffy coat fraction. 赤血球溶解液で赤血球を溶解後、等張リン酸緩衝液で2回洗浄しヒツジ白血球細胞をえた。 After lysis of erythrocytes in erythrocyte lysate to give a washed sheep white blood cells twice with isotonic phosphate buffer. つぎにヒツジ白血球細胞からチオシアン酸グアニジン法によりRNAを抽出し、さらにオリゴ(dT)セルロースカラムによりポリ(A) + RNAを精製した(ラボマニュアル遺伝子工学、村松正実編、丸善 1988年)。 Next, the RNA was extracted from sheep white blood cells by guanidine thiocyanate method and purified further poly (A) + RNA by oligo (dT) cellulose column (Laboratory Manual Genetic Engineering, Masami Muramatsu., Eds., Maruzen, 1988). ポリ(A) + Poly (A) + R
NAからの二重鎖cDNAの合成は市販のキット(Yo Synthesis of double-stranded cDNA from the NA commercially available kit (Yo
u−Prime cDNA合成キット ファルマシア社製)を用いて合成した。 It was synthesized using the u-Prime manufactured cDNA synthesis kit Pharmacia).

【0047】c. [0047] c. ヒツジ△D2タンパク質のDNA配列のPCR法による増幅とクローニング ヒツジ△D2タンパク質のcDNAをPCR法によって試験管内で増幅した。 It was amplified in vitro by cDNA PCR methods of amplification and cloning of sheep △ D2 protein by PCR of the DNA sequence of ovine △ D2 protein. すなわち10mMトリス塩酸(p That is 10mM Tris-HCl (p
H8.3),100mM塩化カリウム,1.5mM塩化マグネシウム,0.01%ゼラチン,前記aで合成した2 H8.3), 100mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 0.01% gelatin were synthesized by the a 2
種類の混合プライマー各々10μM,前記bで調製したヒツジ白血球cDNA 10ng,0.2mM 4種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸,Taq DNAポリメラーゼ2.5単位を含む反応混合物100μlを9 Type of mixed primers each 10 [mu] M, wherein b sheep leukocytes cDNA was prepared in 10 ng, 0.2 mM 4 types of deoxyribonucleotide triphosphates, the reaction mixture 100μl containing 2.5 units of Taq DNA polymerase 9
4℃1分、37℃2分、72℃2分の反応条件で35サイクルのPCRを行なった。 4 ° C. 1 min, 37 ° C. 2 minutes was performed 35 cycles of PCR reaction conditions 72 ° C. 2 minutes. 反応後、PCR生成物の大きさをポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した結果、約100塩基対のDNAが増幅されていることを認めた。 After the reaction, the size of the PCR product results measured by polyacrylamide gel electrophoresis showed that the DNA of about 100 base pairs are amplified. この約100 塩基対のDNAをゲルから抽出し、 The approximately 100 base pairs of DNA extracted from the gel,
制限酵素BamHI,PstI処理後、M13mp19 Restriction enzyme BamHI, after PstI processing, M13mp19
ファージベクター(宝酒造製)のBamHI−PstI BamHI-PstI of phage vector (Takara Shuzo Co., Ltd.)
部位に組み込み、大腸菌JM109を宿主として用いてクローニングした。 Built on site, it was cloned using E. coli JM109 as a host.

【0048】d. [0048] d. PCRによって増幅された遺伝子の配列決定 前記cでえられた陽性クローンから調製した約100塩基対のDNAの配列をダイデオキシヌクレオチド三リン酸を用いた常法により決定した。 The sequence of the DNA of about 100 base pairs prepared from a positive clone was example by sequencing the c of the amplified gene was determined by a conventional method using the dideoxy nucleotide triphosphates by PCR. その結果、PCRに用いた2種のプライマー間の配列は、配列番号6で示されるDNAの配列の19番から65番までの塩基配列であると決定された。 As a result, the sequence between the two primers used for PCR were determined from number 19 sequence of the DNA represented by SEQ ID NO: 6 and a nucleotide sequence of up to 65 th. この配列はのちに決定されたヒツジ△ This sequence was determined later sheep △
D2タンパク質のアミノ酸配列である配列番号7の7番のGlyから22番のProに対応しており、ヒツジ△ It corresponds to the number 22 of the Pro from the 7th of Gly of SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of the D2 protein, sheep △
D2タンパク質のcDNAが前記の塩基配列を有することを示している。 D2 protein cDNA is shown to have a base sequence of the. このDNA配列は配列番号7の7番から22番のアミノ酸をコードしている。 This DNA sequence encodes amino acids # 22 7 of SEQ ID NO: 7.

【0049】e. [0049] e. ヒツジ△D2タンパク質のcDNAの取得 ヒツジ△D2タンパク質の全長のcDNAをクローニングするために、前記dで決定したヒツジ△D2タンパク質のN末端のcDNA配列をプローブとしてヒツジcD To clone the cDNA of sheep △ D2 entire length of the acquired sheep △ D2 protein cDNA of protein, sheep cD the cDNA sequence of the N-terminus of sheep △ D2 protein, determined by the d as probes
NAライブラリーをスクリーニングした。 It was screened NA library. すなわち、前記bで作ったヒツジ白血球由来の二重鎖cDNAをDN That is, the double-stranded cDNA from sheep white blood cells made in the b DN
Aポリメラーゼ処理で平滑末端にし、EcoRIリンカー(ファルマシア社製)を接続し、さらにEcoRIで切断し、アルカリフォスファターゼ処理したλgtll Blunt ended with A polymerase treatment, and connect EcoRI linkers (Pharmacia), and further cleaved with EcoRI, and alkaline phosphatase treated λgtll
(ストラタジーン社製)の左右のアームを接続した。 It was connected to the left and right arms of (Stratagene). インビトロパッケージングを行ないcDNAライブラリーを作製した。 A cDNA library was prepared subjected to in vitro packaging. ヒツジ△D2タンパク質のN末端近傍のc c near the N terminus of sheep △ D2 protein
DNA配列を有するプローブ、配列番号8および配列番号9を合成した。 Probe having a DNA sequence, the SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were synthesized. 約20万の組換えファージをこれらのプローブでスクリーニングした結果、1.0kb(キロベース)〜1.2kbのインサートcDNAを含有する3株の陽性クローン(SL−6、SL−40、SL−4 200,000 recombinant phages result of screening with these probes, 1.0 kb (kilobases) 3 strains positive clones containing the insert cDNA of ~1.2kb (SL-6, SL-40, SL-4
3)をえた。 3) to give a. これらの陽性クローンのうち、SL−40 Of these positive clones, SL-40
のcDNA配列をM13ファージを用いたダイデオキシ法により決定した結果、ヒツジ△D2タンパク質は配列番号6に示した塩基配列によりコードされ、また配列番号7に示したアミノ酸配列を有することがわかった。 Result of the cDNA sequence was determined by dideoxy method using M13 phage, sheep △ D2 protein is encoded by nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6, also was found to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. またメチオニンから始まる28アミノ酸残基のシグナルペプチドを有することもわかった。 Further it has also been found to have a signal peptide of 28 amino acid residues starting with methionine. このえられたヒツジ△ This painting was sheep △
D2タンパク質のcDNA塩基配列の情報にもとづき天然型のヒツジ△D2タンパク質および誘導体を、遺伝子工学的に組換え体で生産できる。 Sheep △ D2 proteins and derivatives of native based on information of the cDNA nucleotide sequence of D2 protein can be produced by genetic engineering techniques recombinant. 配列番号10は、ウォルナーら(ビー ピー ウォルナーら、(1987年)ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン166 SEQ ID NO: 10, Wallner et al. (Bee P. Wallner, et al., (1987) Journal of Experimental Medicine 166
巻、923頁)によって報告されているヒトLFA−3 Winding, human have been reported by 923 pages) LFA-3
のアミノ酸配列、配列番号11はそのDNA配列である。 Amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is the DNA sequence.

【0050】f. [0050] f. 可溶性であるヒツジ△D2タンパク質誘導体(以下、ヒツジD1HCタンパク質と呼ぶ)の大腸菌の発現ベクターの作製 ヒツジD1HCタンパク質を大腸菌で発現するための発現ベクターを構築した。 Soluble in a sheep △ D2 protein derivative (hereinafter, referred to as sheep D1HC protein) Preparation of sheep D1HC protein expression vector E. coli to construct an expression vector for expression in E. coli.

【0051】すなわち、前記eでえられたcDNAクローンSL−40に含まれるインサートDNAを制限酵素EcoRIで切り出し、プラスミドpUC18のEco [0051] That is, cut the insert DNA contained in the cDNA clone SL-40 which is caught in the e with restriction enzymes EcoRI, the plasmid pUC18 Eco
RI部位にサブクローニングした。 It was subcloned into the RI site. つぎに、このプラスミドについてPCRを行なった。 Next, PCR was carried out on this plasmid. 使用した5′側プライマーは配列番号12に示されている。 5 'side primers used are shown in SEQ ID NO: 12. このプライマーはBamHI認識配列、NcoI認識配列および配列番号6の1番から7番のアミノ酸配列から予想されるDNA DNA The primers predicted from the BamHI recognition sequence, NcoI recognition sequence and 1 from No. 7 No. amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
配列とから構成されている。 It is composed of a sequence. 使用した3′側プライマーは配列番号13に示されている。 3 'side primers used are shown in SEQ ID NO: 13. このプライマーはPs This primer Ps
tI認識配列、終止コドンの配列、配列番号6の371 tI recognition sequence, the sequence of the stop codon, 371 of SEQ ID NO: 6
番から358および301から277の塩基配列とから構成されている。 And a 358 and 301 277 and the base sequence from turn. 配列番号12と13のプライマーを用いてPCRを行ない、増幅されたDNA断片を制限酵素BamHIとPstIで切断しM13mp19ファージベクターのBamHI−PstI部位に挿入し、ダイデオキシ法により導入されたDNAの塩基配列を確認した。 Performs PCR using primers SEQ ID NO: 12 and 13, the amplified DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and PstI and inserted into BamHI-PstI site of M13mp19 phage vector, bases of DNA that has been introduced by the dideoxy method the sequence was confirmed. つぎにM13ファージベクターからヒツジD1HC Then the sheep from the M13 phage vector D1HC
タンパク質の遺伝子を制限酵素NcoIおよびPstI Limit the gene of the protein enzymes NcoI and PstI
で切りだし、発現用ベクターpKK233−2(ファルマシア社製)のNcoI−PstI部位に接続し、発現ベクターを作製した。 In's a cut, to connect to the NcoI-PstI site of the expression vector pKK233-2 (manufactured by Pharmacia) to prepare an expression vector. この発現ベクターをpKSLD1 This expression vector pKSLD1
HCと呼ぶ。 It referred to as HC. pKSLD1HCに含まれるヒツジD1H Sheep is included in the pKSLD1HC D1H
Cタンパク質誘導体をコードする開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を配列番号14に示した。 The nucleotide sequence of the stop codon in SEQ ID NO: 14 from the start codon encoding the C protein derivatives.

【0052】g. [0052] g. システイン残基を含むヒツジD1HC Sheep D1HC containing cysteine ​​residue
タンパク質(以下、ヒツジD1HCcysタンパク質と呼ぶ)誘導体の大腸菌用発現ベクターの作製 システイン残基をカルボキシ末端に持つヒツジD1HC Protein (hereinafter, referred to as sheep D1HCcys protein) sheep with making cysteine ​​residues of the E. coli expression vector of the derivative at the carboxy terminus D1HC
タンパク質を大腸菌で発現するための発現ベクターを構築した。 Protein expression vector was constructed to express in E. coli. 前記fでえられたヒツジD1HCタンパク質のcDNAを持つプラスミドpKSLD1HCのDNAを鋳型にしてPCRを行なった。 The DNA of plasmid pKSLD1HC with cDNA sheep D1HC proteins were caught in the f PCR was carried out in the mold. 使用した5′側プライマーは前記fで使用したものであり、配列番号12に示されている。 5 'side primers used are those used in the f, it is shown in SEQ ID NO: 12. 使用した3′側プライマーは配列番号15に示されている。 3 'side primers used are shown in SEQ ID NO: 15. このプライマーは、HindIII認識配列、PstI認識配列、終止コドン配列、システイン残基の配列、続いて配列番号14の318から295の塩基配列とから構成されている。 This primer, HindIII recognition sequence, PstI recognition sequence, termination codon sequence, the sequence of the cysteine ​​residues, followed is composed of a 318 295 of the base sequence of SEQ ID NO: 14. 配列番号12と15のプライマーを用いてPCRを行い、増幅されたDNA断片を制限酵素BamHIとPstIで切断しM13mp PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 12 and 15, to cut the amplified DNA fragment with restriction enzymes BamHI and PstI M13mp
19ファージベクターのBamHI−PstI部位に挿入し、ダイデオキシ法により導入されたDNAの塩基配列を確認した。 19 was inserted into BamHI-PstI site of phage vector to confirm the nucleotide sequence of the introduced DNA by dideoxy method. つぎにM13ファージベクターから、ヒツジD1HCcysタンパク質の遺伝子を制限酵素Nc Then the M13 phage vector, limits the gene of sheep D1HCcys protein enzymes Nc
oIおよびPstIで切りだし、発現用ベクターpKK It's cut with oI and PstI, expression vector pKK
233−2(ファルマシア社製)のNcoI−PstI 233-2 NcoI-PstI of (manufactured by Pharmacia)
部位に接続し、発現ベクターpKSLD1HCcysを作製した。 Connected to the site, to prepare an expression vector PKSLD1HCcys. pKSLD1HCcysに含まれるヒツジD Sheep D included in pKSLD1HCcys
1HCcysタンパク質(以下、「LFA−3誘導体タンパク質」という)をコードする開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を配列番号1に示した。 1HCcys protein (hereinafter, referred to as "LFA-3 derivative protein") The nucleotide sequence from the initiation codon encoding to the stop codon in SEQ ID NO: 1.

【0053】h. [0053] h. 大腸菌を宿主としたLFA−3誘導体タンパク質の生産 LFA−3誘導体タンパク質の発現ベクターpKSLD Production of LFA-3 derivative protein E. coli as a host LFA-3 expression vector derivative protein pKSLD
1HCcysを持つ大腸菌JM109(宝酒造製)を前培養後、10mgのアンピシリンを含む100mlのL After the pre-culture of E. coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) with a 1HCcys, of 100ml containing ampicillin of 10mg L
B培地に接種し、500mlの坂口フラスコでA500が0.3になるまで37℃で振とう培養した。 Were inoculated in B medium, and cultured with shaking at 37 ° C. until A500 in Sakaguchi flask 500ml became 0.3. つぎにIP Then IP
TGを終濃度1mMで加え、さらに6時間培養した。 Adding TG in a final concentration of 1 mM, and further cultured for 6 hours. 培養した菌体を遠心により集め、50mMEDTA、5% Collected by centrifugation cultured cells, 50 mM EDTA, 5%
TritonX−100、2mMジチオスレイトール、 TritonX-100,2mM dithiothreitol,
8%ショ糖を含有する50mMTris−HCl(pH 50 mM Tris-HCl (pH containing 8% sucrose
8.0)10mlに懸濁し、リゾチームを終濃度0.1 8.0) were suspended in 10 ml, final concentration 0.1 Lysozyme
%加えた。 %added. この菌体懸濁液を超音波処理、遠心分離し不溶性の顆粒体をえた。 The cell suspension was sonicated to give a granulate of centrifuged insoluble. この顆粒体をSDSで溶解させ、 The granules dissolved in SDS,
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動するとMrが約13,000のバンドが検出された。 Mr was detected about 13,000 band is when SDS- polyacrylamide gel electrophoresis.

【0054】i. [0054] i. LFA−3誘導体タンパク質の顆粒体の可溶化と再活性化 前記hでえられた顆粒体全量を6M塩酸グアニジン、2 LFA-3 derivative solubilized and granules total amount of 6M guanidine hydrochloride, which is caught in reactivation the h of granules of protein, 2
mM EDTA、5mM 2−メルカプトエタノールを含有する50mMトリス塩酸(PH7.4)10mlで溶解し、遠心後上清をとった。 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 5 mM 2-mercaptoethanol were dissolved in 10 ml, were taken after centrifugation the supernatant. 上清を等張リン酸緩衝液に透析し、LFA−3誘導体タンパク質を含む溶液をえた。 The supernatant was dialyzed against isotonic phosphate buffer to give a solution containing LFA-3 derivative proteins.

【0055】 [0055]

【発明の効果】本発明により、CD2陽性細胞、とくに白血球を付着分離することができ、自己免疫疾患を治療するための細胞付着部材、輸血後の副作用を防止するための輸血用血液から白血球を除去しうる細胞付着部材、 Effect of the Invention] The present invention, CD2 positive cells, in particular can be attached separating white blood cell attachment members to treat autoimmune diseases, leukocytes from blood for transfusion for preventing the side effects of post-transfusion cell attachment member can be removed,
T細胞を分離回収しうる細胞付着部材、T細胞の分離回収がT細胞ワクチン療法を単時間にかつ簡単に行なうことを実施するための細胞付着部材、および白血球からのDNAあるいはRNAの分離を短時間にかつ簡便に行なうことを可能とするための細胞付着部材が提供される。 T cells separated and recovered may cell attachment member, cell attachment member for separating and recovering the T cells to practice the performing the T cell vaccine therapy single time and easily, and the separation of DNA or RNA from leukocytes short cell attachment member is provided for enabling and conveniently be performed on time.

【0056】本発明の細胞付着部材を用いることにより、自己免疫疾患の治療、輸血後の副作用防止、T細胞ワクチン療法および遺伝子診断が可能となる。 [0056] By using the cell attachment member of the present invention, the treatment of autoimmune diseases, side effects preventing post-transfusion, it is possible to T cell vaccine therapy and gene diagnosis.

【0057】 [0057]

【配列表】 [Sequence Listing]

配列番号:1 配列の長さ:324 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 ハイポセティカル配列:No 配 列 ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 9 SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 324 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms Topology: linear hypothemycin Pharmaceutical sequence: No sequence ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 9 0 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TGT TAG 324 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser Cys 100 105 配列番号:2 配列の長さ:336 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 ハイポセティカル配列:No 配 列 ATG TTT TCC CAA CAA ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC 48 Met Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 CAT GTA CCA AGC AAT GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA 96 His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GCA GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA 144 Lys Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGG GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr 50 55 60 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG 0 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TGT TAG 324 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser Cys 100 105 SEQ ID NO: length of the two sequences: 336 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms Topology : linear hypothemycin Pharmaceutical sequence: No sequence ATG TTT TCC CAA CAA ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC 48 Met Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 CAT GTA CCA AGC AAT GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA 96 His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GCA GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA 144 Lys Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGG GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr 50 55 60 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGT TGA 336 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn Cys 100 105 110 配列番号:3 配列の長さ:29 配列の型:アミノ酸 トポロジー:不明 配列の種類:ペプチド ハイポセティカル配列:Yes フラグメント型:N末端ペプチド 配列の特徴 配列中、12番目および28番目のXaa は天然に存在するアミノ酸を表わし、ここで12番目のXaa は好ましくはセリンである。 AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGT TGA 336 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn Cys 100 105 110 SEQ ID NO: the length of the 3 sequences: 29 SEQ type: amino acid topology: unknown sequence type: peptide hypothemycin Pharmaceutical sequence: Yes fragment type: N-terminal peptide sequence in feature sequence, the 12 th and 28 th Xaa represents a naturally occurring amino acid, wherein the 12 th Xaa is preferably serine.

【0058】1番目のアミノ酸はバリンまたはフェニルアラニン、3番目のアミノ酸はグルタミンまたはセリンである。 [0058] The first of the amino acid valine or phenylalanine, the third amino acid is glutamine or serine. 配 列 Val/Phe Ser Gln/Ser Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Xaa Lys 20 25 配列番号:4 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No 配 列 GTTGGATCCT TYWSNCARGA YATHTAYGG 29 配列番号:5 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配 列 ACACTGCAGC ATDATYTCNG TRAANGG 27 配列番号:6 配列の長さ:393 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No 起 源 生物名:オーヴィス(Ovis) 細胞の種類:白血球細胞 配 列 GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Al Sequence Val / Phe Ser Gln / Ser Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Xaa Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Xaa Lys 20 25 SEQ ID NO: 4 sequence length of: type 29 sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No sequence GTTGGATCCT TYWSNCARGA YATHTAYGG 29 SEQ ID NO: 5 SEQ length: 27 sequence type: number of nucleic acid strands: single strand topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No antisense: Yes array ACACTGCAGC ATDATYTCNG TRAANGG 27 SEQ ID NO: 6 SEQ length: type 393 sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand topology: linear sequence type: cDNA-to mRNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No Origin organism: Ovisu (Ovis) cell type: leukocyte cell array GTT TCC CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT TAC 48 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Al a Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT TAT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 GCA AGG CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC ATA CTG CCA GCA GTA ATA TGT 336 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 GGC TTG CTG TTT TTA AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC 384 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu G a Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG AAG 96 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT CAG 144 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC ACC 192 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA TCC 240 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT TAT 288 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 GCA AGG CAT AGG TAT GTG CTT TTT GCC ATA CTG CCA GCA GTA ATA TGT 336 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 GGC TTG CTG TTT TTA AAA TGT TTT CTG GGA CGT CGT AGC CAA CGA AAC 384 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu G ly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 TCA GGG CCC 393 Ser Gly Pro 130 配列番号:7 配列の長さ:131 配列の型:アミノ酸 起 源 生物名:オーヴィス(Ovis) 細胞の種類:白血球細胞 配 列 Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 Ser Gly Pro 130 配列番号:8 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポ ly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 TCA GGG CCC 393 Ser Gly Pro 130 SEQ ID NO: 7 SEQ Length: 131 Type of sequence: amino acid Origin Organism: Ovisu (Ovis) Cell Type: leukocyte cell array Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe Tyr 1 5 10 15 Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly Lys 20 25 30 Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe Gln 35 40 45 Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu Thr 50 55 60 Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu Ser 65 70 75 80 Pro Ser Val Lys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp Tyr 85 90 95 Ala Arg His Arg Tyr Val Leu Phe Ala Ile Leu Pro Ala Val Ile Cys 100 105 110 Gly Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe Leu Gly Arg Arg Ser Gln Arg Asn 115 120 125 Ser Gly Pro 130 SEQ ID NO: 8 SEQ length: type 24 sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypo セティカル配列:No 配 列 AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT 24 配列番号:9 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No 配 列 ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA 24 配列番号:10 配列の長さ:222 配列の型:アミノ酸 ハイポセティカル配列:No 起 源 生物名:ホモ サピエンス(Homo sapiens) 細胞の種類:PBL (末梢血リンパ球(Peripheral Blood Setikaru sequence: No sequence AGCTATGAAC GGGAATGTAA CCTT 24 SEQ ID NO: 9 SEQ Length: type 24 sequence: the number of a nucleic acid strand: single strand Topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceuticals sequence : No sequence ACCTTTTACG TTTCAGAGTC TCAA 24 SEQ ID NO: 10 SEQ length: 222 type of sequence: amino acid hypothemycin Pharmaceutical sequence: No Origin organism: homo sapiens (homo sapiens) cell type: PBL (peripheral blood lymphocytes (Peripheral Blood
Lymphocytes)) 配 列 Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His 1 5 10 15 Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys 20 25 30 Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser 35 40 45 Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val 100 105 110 Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met 115 120 125 Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr 165 170 175 Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly 195 200 20 Lymphocytes)) sequence Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His 1 5 10 15 Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys 20 25 30 Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser 35 40 45 Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro 65 70 75 80 Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val 100 105 110 Gln Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met 115 120 125 Tyr Ser Trp Asp Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Phe Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr 145 150 155 160 Leu Ser Asn Pro Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr 165 170 175 Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly 195 200 20 5 Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 210 215 220 配列番号:11 配列の長さ:753 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 配列の種類:cDNA to mRNA ハイポセティカル配列:No 起 源 生物名:ホモサピエンス(Homo sapiens) 配 列 ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48 Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val -28 -25 -20 -15 GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96 Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln -10 -5 1 ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144 Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn 5 10 15 20 GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192 Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala 25 30 35 GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG 240 Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg 40 45 50 5 Ile Leu Lys Cys Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 210 215 220 SEQ ID NO: 11 SEQ Length: 753 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms array type: cDNA-to mRNA hypothemycin Pharmaceuticals sequence : No Origin organism: homo sapiens (homo sapiens) sequence ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG GTC CTC AGC GTG 48 Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val -28 -25 -20 -15 GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT GGT TTC ATC AGC TGT TTT TCC CAA CAA 96 Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln -10 -5 1 ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT 144 Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn 5 10 15 20 GTG CCT TTA AAA GAG GTC CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT AAA GTT GCA 192 Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala 25 30 35 GAA CTG GAA AAT TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG 240 Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg 40 45 50 GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 288 Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr 55 60 65 TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT 336 Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp 70 75 80 ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GAG TCT CTT CCA TCT CCC ACA 384 Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr 85 90 95 100 CTA ACT TGT GCA TTG ACT AAT GGA AGC ATT GAA GTC CAA TGC ATG ATA 432 Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile 105 110 115 CCA GAG CAT TAC AAC AGC CAT CGA GGA CTT ATA ATG TAC TCA TGG GAT 480 Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp 120 125 130 TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC AGT ATA TAT TTT AAG 528 Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Ans Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys 135 140 145 ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576 Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro 150 155 GTT TAT TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 288 Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr 55 60 65 TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG CCA AAT ATT ACT GAT 336 Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp 70 75 80 ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GAG TCT CTT CCA TCT CCC ACA 384 Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr 85 90 95 100 CTA ACT TGT GCA TTG ACT AAT GGA AGC ATT GAA GTC CAA TGC ATG ATA 432 Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile 105 110 115 CCA GAG CAT TAC AAC AGC CAT CGA GGA CTT ATA ATG TAC TCA TGG GAT 480 Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp 120 125 130 TGT CCT ATG GAG CAA TGT AAA CGT AAC TCA ACC AGT ATA TAT TTT AAG 528 Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Ans Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys 135 140 145 ATG GAA AAT GAT CTT CCA CAA AAA ATA CAG TGT ACT CTT AGC AAT CCA 576 Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro 150 155 160 TTA TTT AAT ACA ACA TCA TCA ATC ATT TTG ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624 Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser 165 170 175 180 AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA TTA GCA 672 Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala 185 190 195 GTA ATT ACA ACA TGT ATT GTG CTG TAT ATG AAT GGT ATT CTG AAA TGT 720 Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys 200 205 210 GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 753 Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 215 220 配列番号:12 配列の長さ:32 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No 配 列 TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATATTTAT GG 32 配列番号:13 配列の長さ:51 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配 列 CAACTGCA 160 TTA TTT AAT ACA ACA TCA TCA ATC ATT TTG ACA ACC TGT ATC CCA AGC 624 Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser 165 170 175 180 AGC GGT CAT TCA AGA CAC AGA TAT GCA CTT ATA CCC ATA CCA TTA GCA 672 Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala 185 190 195 GTA ATT ACA ACA TGT ATT GTG CTG TAT ATG AAT GGT ATT CTG AAA TGT 720 Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys 200 205 210 GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 753 Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 215 220 SEQ ID NO: 12 length of sequence: 32 SEQ type: nucleic acid strands number of: single-stranded topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No sequence TGGGGATCCA TGGTAAGTCA AGATATTTAT GG 32 SEQ ID NO: 13 SEQ length: 51 sequence types: of a nucleic acid strand number: single strand topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No antisense: Yes array CAACTGCA GC TACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCTTGCA TAATCAATCA C 51 配列番号:14 配列の長さ:321 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 ハイポセティカル配列:No 配 列 ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val L GC TACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCTTGCA TAATCAATCA C 51 SEQ ID NO: 14 SEQ Length: 321 SEQ types: the number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear hypothemycin Pharmaceutical sequence: No sequence ATG GTA AGT CAA GAT ATT TAT GGA GCT ATG AAT GGG AAT GTA ACC TTT 48 Met Val Ser Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Met Asn Gly Asn Val Thr Phe 1 5 10 15 TAC GTT TCA GAG TCT CAA CCG TTT ACA GAG ATT ATG TGG AAG AAG GGG 96 Tyr Val Ser Glu Ser Gln Pro Phe Thr Glu Ile Met Trp Lys Lys Gly 20 25 30 AAG GAT AAA GTT GTA GAA TGG GAT CAA ACA TCT GGA CTC GAA GCT TTT 144 Lys Asp Lys Val Val Glu Trp Asp Gln Thr Ser Gly Leu Glu Ala Phe 35 40 45 CAG TCT TTT AAA AAT AGA GTT CAT TTA GAC ATT GTG TCA GGT AAC CTC 192 Gln Ser Phe Lys Asn Arg Val His Leu Asp Ile Val Ser Gly Asn Leu 50 55 60 ACC ATC ACC GGG TTA ACA AAA TTA GAT GAA GAT GTG TAT GAA ATT GAA 240 Thr Ile Thr Gly Leu Thr Lys Leu Asp Glu Asp Val Tyr Glu Ile Glu 65 70 75 80 TCC CCA AGT GTT AAA AAG AGC TCC CAG TTC CAC CTC AGA GTG ATT GAT 288 Ser Pro Ser Val L ys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 90 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TAG 321 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 100 105 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 333 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 100 105 110 配列番号:15 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配 列 TTTTTTCGAA CTGCAGCTAA CACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCT 46 ys Lys Ser Ser Gln Phe His Leu Arg Val Ile Asp 85 90 95 TAT GCA AGG CAT AGG TTT TCT GGG ACG TCG TAG 321 Tyr Ala Arg His Arg Phe Ser Gly Thr Ser 100 105 ATC TAC AAC TTA ACA TCA TCA GAT GAA GAT GAG TAT GAA ATG GAA TCG 240 Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser 65 70 75 80 CCA AAT ATT ACT GAT ACC ATG AAG TTC TTT CTT TAT GTG CTT GGT CAT 288 Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Gly His 85 90 95 TCA AGA CAC AGA GAC AGA AAA CCA GAC AGA ACC AAC TCC AAT TGA 333 Ser Arg His Arg Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 100 105 110 SEQ ID NO: 15 sequence length: 46 sequence types: the number of nucleic acid strands: single strand topology: linear sequence type: other nucleic acid synthetic DNA hypothemycin Pharmaceutical sequence: No antisense: Yes array TTTTTTCGAA CTGCAGCTAA CACGACGTCC CAGAAAACCT ATGCCT 46

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明に用いるLFA−3誘導体タンパク質の担体への結合を示す図である。 1 is a diagram showing the binding to the carrier of the LFA-3 derivative protein used in the present invention. (a)は従来の方法にしたがいLFA−3誘導体タンパク質をアミノ基を介して担体に結合した図を示し、(b)は本発明にしたがいL (A) L in accordance with the the LFA-3 derivative proteins according to conventional methods shows a diagram linked to a carrier via an amino group, (b) the present invention
FA−3誘導体タンパク質をチオール基を介して担体に結合した図を示している。 The FA-3 derivative protein shows a diagram attached to the carrier via the thiol group. 図中、○は唯一のシステイン残基、白抜き三角はアミノ基に特異性をもつ分子、斜線を付した三角はアミノ基よりもチオール基に特異性をもつ活性化ハロゲン分子を示す。 In the figure, ○ shows only cysteine ​​residues, molecular white triangles with specificity to amino groups, the triangular hatched activation halogen molecule having specificity for thiol groups than amino groups.

【図2】本発明の細胞付着部材および対照である2−メルカプトエタノールを固定化した部材について付着したCD2陽性および陰性のジャーカット細胞を0.05% [2] The cell attachment members and 2-mercaptoethanol to immobilized CD2 positive and negative Jurkat cells attached on member in the control of the present invention 0.05%
クリスタルバイオレットにより染色した結果を示す図である。 The results are shown in the figure was stained with crystal violet.

【図3】プレートに付着されたCD2およびCD3陽性のジャーカット細胞、またはCD2およびCD3陰性のジャーカット細胞を0.05%クリスタルバイオレットにより染色した結果を示す図である。 3 is a diagram showing the results of staining by the plate to the deposited CD2 and CD3 positive Jurkat cells or CD2 and CD3-negative Jurkat cells with 0.05% crystal violet. LFA−3誘導体タンパク質がチオール基を介して結合されたプレート、 LFA-3 plates derivative protein is bound via a thiol group,
CD3抗体がアミノ基を介して結合されたプレートおよびBSAがアミノ基を介して結合されたプレートを用いたばあいの結果をそれぞれ示す。 It shows CD3 antibody the results when the plate is bonded via an amino group and BSA were used plate coupled via an amino group, respectively.

フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // B01D 15/08 C12N 5/00 E Front page continued (51) Int.Cl. 6 in identification symbol Agency Docket No. FI art display portion // B01D 15/08 C12N 5/00 E

Claims (17)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 D2領域およびTM領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有するLFA−3誘導体タンパク質を担体に固定化した細胞付着部材。 1. A cell adhesion member of LFA-3 derivative protein was immobilized on a carrier having only one cysteine ​​residue cytoplasmic domain without the D2 region and a TM region to the carboxyl terminus partially have.
  2. 【請求項2】 D2領域およびTM領域をもたず細胞質内領域を部分的にもつカルボキシル末端に唯一のシステイン残基を有するLFA−3誘導体タンパク質のチオール基を介して該タンパク質を担体に固定化した細胞付着部材。 2. A immobilized on a carrier to the protein via a thiol group of LFA-3 derivative proteins having only one cysteine ​​residue cytoplasmic domain without the D2 region and a TM region to the carboxyl terminus partially with cell adhesion member.
  3. 【請求項3】 該LFA−3誘導体タンパク質がヒツジに由来する請求項1記載の細胞付着部材。 3. A cell attachment member according to claim 1 wherein said LFA-3 derivative protein is derived from sheep.
  4. 【請求項4】 該LFA−3誘導体タンパク質がヒトに由来する請求項1記載の細胞付着部材。 4. A cell attachment member according to claim 1 wherein said LFA-3 derivative proteins are derived from a human.
  5. 【請求項5】 該LFA−3誘導体タンパク質が、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる、ヒツジ由来のタンパク質である請求項1記載の細胞付着部材。 Wherein said LFA-3 derivative protein, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, cell adhesion member according to claim 1, wherein the protein from sheep.
  6. 【請求項6】 該LFA−3誘導体タンパク質が、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト由来のタンパク質である請求項1記載の細胞付着部材。 Wherein said LFA-3 derivative protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, cell attachment member according to claim 1, wherein the protein derived from human.
  7. 【請求項7】 該LFA−3誘導体タンパク質がヒツジに由来する請求項2記載の細胞付着部材。 7. A cell attachment member according to claim 2, wherein said LFA-3 derivative protein is derived from sheep.
  8. 【請求項8】 該LFA−3誘導体タンパク質がヒトに由来する請求項2記載の細胞付着部材。 8. A cell attachment member according to claim 2, wherein said LFA-3 derivative proteins are derived from a human.
  9. 【請求項9】 該LFA−3誘導体タンパク質が、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる、ヒツジ由来のタンパク質である請求項2記載の細胞付着部材。 9. The LFA-3 derivative protein, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, cell adhesion member according to claim 2, wherein the protein from sheep.
  10. 【請求項10】 該LFA−3誘導体タンパク質が、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト由来のタンパク質である請求項2記載の細胞付着部材。 10. The LFA-3 derivative protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, cell attachment member according to claim 2 wherein the protein derived from human.
  11. 【請求項11】 白血球を除去しうる請求項1ないし1 11. The claims 1 may remove leukocytes 1
    0のいずれかに記載の細胞付着部材。 Cell attachment member according to any one of 0.
  12. 【請求項12】 T細胞を分離回収しうる請求項1ないし10のいずれかに記載の細胞付着部材。 12. Cell attachment member according to any one of claims 1 to 10 capable of separating and recovering T cells.
  13. 【請求項13】 白血球からのDNAあるいはRNAの分離を可能とする請求項1ないし10のいずれかに記載の細胞付着部材。 13. Cell attachment member according to any one of claims 1 to 10 to enable separation of DNA or RNA from leukocytes.
  14. 【請求項14】 請求項1ないし10のいずれかに記載の細胞付着部材を用いてCD2陽性細胞を付着分離する方法。 14. The method of attaching separate the CD2-positive cells using cell attachment member according to any one of claims 1 to 10.
  15. 【請求項15】 該細胞付着部材とCD2陽性細胞を含みうる体液を接触させる請求項14記載の方法。 15. The method of claim 14, wherein contacting a body fluid that can include the cell attachment member and CD2 positive cells.
  16. 【請求項16】 請求項1ないし10のいずれかに記載の細胞付着部材を用いて白血球を付着分離する方法。 16. The method of attaching separate the leukocytes using cell attachment member according to any one of claims 1 to 10.
  17. 【請求項17】 該細胞付着部材と白血球を含みうる体液を接触させる請求項16記載の方法。 17. The method of claim 16, wherein contacting a body fluid that can include the cell attachment member and leukocytes.
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