JPH0975083A - Test of mutagenicity - Google Patents

Test of mutagenicity

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JPH0975083A
JPH0975083A JP24205395A JP24205395A JPH0975083A JP H0975083 A JPH0975083 A JP H0975083A JP 24205395 A JP24205395 A JP 24205395A JP 24205395 A JP24205395 A JP 24205395A JP H0975083 A JPH0975083 A JP H0975083A
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JP
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Patent type
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dna
liver
substance
test
tested
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Application number
JP24205395A
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Japanese (ja)
Inventor
Osamu Morita
Hiroyuki Suzuki
修 森田
尋之 鈴木
Original Assignee
Kao Corp
花王株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for testing the mutagenicity of a substance to be tested, capable of easily detecting the damage of DNA in high sensitivity by culturing an animal liver cell to which the substance to be tested has been dosed in the presence of a DNA-repairing agent, treating the nucleus fraction of the culture product with an alkali, and measuring the mol.wt. distribution of the DNA. SOLUTION: This method for testing the mutagenicity of a substance to be tested comprises extracting a liver from an animal such as a rat, transferring the liver into a buffer solution containing collagenase, finely cutting the liver with a knife, dispersing the obtained liver cells in a Hank's liquid cooled with ice, filtering the cells with a cell filter comprising folded gauze, washing the collected liver cells with Hank's liquid to obtain the lever cell. Then, the animal liver cells are dispersed in a culture medium, the substance to be tested is dosed to the culture medium, the liver cells are cultured in the presence of a DNA repair-inhibiting agent (e.g. aphidicolin) at 37 deg.C under the condition of 5% CO2 , a nucleus fraction from the obtained culture liver cells is collected, the collected nucleus fraction is treated with an alkali, and the mol.wt. distribution of the obtained single strand DNA is measured with the elusion speed from a filter. Thus, the DNA-damaging property of a carcinogenic substance can easily and highly sensitively be detected to test the mutagenicity of the substance to be tested.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は化学物質の発癌性スクリーニング法として有用な変異原性試験法に関する。 The present invention relates to relates Useful mutagenicity test method as carcinogenic screening method chemicals.

【0002】 [0002]

【従来の技術】現在、化学物質の発癌性をスクリーニングする方法として、各種ガイドラインに記載された微生物を用いる復帰突然変異試験(Ames試験)、培養細胞を用いる染色体異常試験、マウス骨髄細胞を用いる小核試験の主に3つの試験法が広く一般に行われており、 At present, as a method for screening carcinogenic chemicals, reverse mutation test (Ames test) using microorganisms described in various guidelines, chromosomal aberration test using cultured cells, a small using mouse bone marrow cells three main test methods nuclear tests have been conducted in the widely,
医薬品の安全性試験に於ける必須試験項目になっている。 It has become in mandatory test items to the safety testing of pharmaceuticals. また医薬部外品においてはAmes試験及び染色体異常試験が必須試験項目になっている。 In the quasi drugs Ames test and chromosomal aberration test is in essential test items.

【0003】この中で、Amesらにより開発されたサルモネラ菌を用いる復帰突然変異試験(Ames試験) [0003] In this, reverse mutation test using Salmonella developed by Ames et al (Ames test)
(遺伝子レベルでの損傷を検出する試験法)や、培養細胞を用いる染色体異常試験(染色体レベルでの損傷を検出する試験法)は、in vitroの試験であり、迅速簡便である反面、吸収・分布・排泄といった要素が加味されておらず、試験結果を、そのまま動物個体を用いたin vivoの試験へ外挿したり、その結果のみから化学物質の長期毒性及びヒトへの影響を正確に予測することは困難である。 (Test Method for detecting damage at the genetic level) and, chromosomal aberration test using cultured cells (test method for detecting damage to the chromosomal level), the examination of the in vitro, although it is rapid and simple, absorption and not been taken into account factors such as distribution, excretion, test results, it or extrapolated to the test of in vivo using animal, to accurately predict the effect on the long-term toxicity and human chemicals from the result only it is difficult.

【0004】一方、マウスを用いた小核試験は、in [0004] On the other hand, the micronucleus test using the mouse, in
vivoでの骨髄細胞に対する染色体レベルでの異常を検出する試験法として位置づけられているが、一般に、 Although positioned as a test method for detecting the abnormality of the chromosome level to bone marrow cells in vivo, in general,
化学物質の発癌性を予測する際、遺伝子レベルと染色体レベルの2つの段階に於けるDNA損傷性を評価することが必要と考えられている。 Predicting the carcinogenic chemicals, be assessed in DNA damaging to the two stages of the genetic level and chromosomal level has been considered necessary. この意味で、新たにinv In this sense, the newly inv
ivoに於ける遺伝子レベルでのDNAに対する損傷性の有無を評価する試験法を加えることは、化学物質の遺伝毒性を知るうえで、重要な知見を与えてくれると考えられる。 Adding a test method for evaluating the presence or absence of damage against DNA at at the genetic level in ivo is for understanding the genotoxic chemicals considered gives an important finding.

【0005】in vivoに於いて遺伝子レベルでのDNA損傷性を評価する試験法としては、損傷に伴うD [0005] As the test method In in vivo to evaluate the DNA damaging at the genetic level, D associated with damage
NA修復を指標とした不定期DNA合成試験(UDS試験)が、イギリスを中心としたヨーロッパに於いて、検出感度や特異性の良さから近年注目されている。 Unscheduled DNA synthesis assay in which the NA repair index (UDS test) is, in the European around the UK, it has been attracting attention in recent years from the good detection sensitivity and specificity. しかし、試験に時間のかかることや、RIを使用するなどの制約からスクリーニング試験として広く普及しておらず、より迅速に評価可能な試験法の開発が求められている。 However, take and the time the test, not been widely used as a screening test to restrictions, such as using RI, development of more rapidly assess possible test method is demanded.

【0006】また、in vivoに於いて遺伝子レベルでのDNA損傷性(DNA一本鎖切断)を比較的短時間に評価可能な方法として、1976年にKohnらにより開発されたアルカリ溶出法がある。 Further, as a relatively short period of time to allow evaluation methods DNA damaging at the genetic level (DNA single strand break) In in vivo, there alkaline elution method developed by Kohn et al. In 1976 .

【0007】 [0007]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この従来のアルカリ溶出法により、発癌物質の最大の標的臓器である肝臓に対する遺伝子レベルでのDNA損傷性について既知物質を評価したところ、代表的な肝発癌物質についての試験結果が陰性となってしまい、この方法は発癌性スクリーニング法としては適切でないことが判明した。 [SUMMARY OF THE INVENTION However, this conventional alkaline elution method was evaluated a known material for DNA damaging at the genetic level to the liver is the largest target organ carcinogens, typical hepatocarcinogenesis becomes test results for materials with negative, this method proved to be not suitable as a carcinogen screening method.

【0008】従って、本発明の目的は化学物質によるD It is therefore an object of the present invention D with chemicals
NA損傷性をin vivoで簡便かつ高感度に検出することのできる新規試験法を提供することにある。 It is to provide a novel test method which can detect the NA damaging easily and highly sensitive in vivo.

【0009】 [0009]

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、アルカリ溶出法の欠点を克服すべく種々の検討を行った結果、被検物質投与動物の肝細胞を、DNA修復阻害剤の存在下に培養した後にアルカリ溶出することにより、化学物質によるDNA損傷性が簡便、かつ高い検出感度で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。 Means for Solving the Problems] The present inventor has conducted various studies to overcome the drawbacks of the alkaline elution method, hepatocytes of the test substance-treated animals, the presence of a DNA repair inhibitor by alkaline elution after culturing, chemicals with DNA damaging is simple, and found that can be detected with high detection sensitivity, thereby completing the present invention.

【0010】すなわち、本発明は被検物質を投与された動物の肝細胞をDNA修復阻害剤の存在下に培養し、得られた培養肝細胞より核分画を得、当該核分画をアルカリ処理して得られた一本鎖DNAの分子量分布を測定することを特徴とする変異原性試験法を提供するものである。 [0010] Namely, the present invention is a hepatocyte of animals administered a test substance and cultured in the presence of a DNA repair inhibitor, to obtain a nuclear fraction from the obtained cultured hepatocytes, alkali the nuclear fraction there is provided a mutagenicity test method characterized by measuring the molecular weight distribution of single-stranded DNA obtained by processing.

【0011】 [0011]

【発明の実施の形態】本発明に於いてはまず、動物に被検物質を投与するが、用いる動物としてはラット、モルモット、マウス、イヌ、ウサギ等が挙げられるが、ラットが特に好ましい。 The In DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention first will be administering a test substance to an animal, the rat as the animal used, guinea pigs, mice, dogs, rabbits, and the like, rats are particularly preferred. 被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与等いずれでもよいが、当該被検物質が通常採用される投与経路が好ましい。 As a method of administration of the test substance, oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration may be either subcutaneously or the like, the route of administration the test substance is usually employed is preferred.

【0012】被検物質を投与してから当該被検物質が肝臓にて処理されるのに充分な時間が経過した後(例えば経口投与の場合2〜16時間後)、動物より肝細胞を採取する。 [0012] (2-16 hours after For example, oral administration) after administration of test substance the after test substance has passed sufficient time to be processed by the liver, collecting hepatocytes from an animal to. 採取した肝細胞は、DNA修復阻害剤の存在下に培養する。 Harvested hepatocytes are cultured in the presence of a DNA repair inhibitor. なお、DNA修復阻害剤の添加に先立ち、 Prior to the addition of the DNA repair inhibitor,
肝細胞は2時間程度培養して生細胞をフラスコ表面へ接着させ、死細胞を除去しておくのが好ましい。 Hepatocytes allowed to adhere to cultured for about 2 hours viable cells to the flask surface, preferably keep remove dead cells.

【0013】用いられるDNA修復阻害剤としては、ポリメラーゼα阻害剤であるシトシンアラビノシド(Ar [0013] Examples of the DNA repair inhibitor used, cytosine arabinoside is a polymerase α inhibitor (Ar
a−C)、アフィジコリン(Aphidicoli a-C), aphidicolin (Aphidicoli
n);リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤であるヒドロキシウレア(HU);ポリメラーゼβ阻害剤である2′,3′−ジデオキシチミジン(ddThd)等が挙げられるが、ポリメラーゼα阻害剤がより好ましく、検出感度の点からアフィジコリンが特に好ましい。 n); hydroxyurea is ribonucleotide reductase inhibitors (HU); the polymerase β inhibitor 2 ', 3'-dideoxy-thymidine (ddThd), and the like, but more preferably polymerase α inhibitor, the detection sensitivity particularly preferred is aphidicolin from the point.

【0014】肝細胞の培養条件は、特に制限されず、3 [0014] The culture conditions of the liver cells is not particularly limited, 3
7℃、5%CO 2条件下で行えばよい。 7 ° C., may be carried out under 5% CO 2. DNA修復阻害剤の添加量は、用いるDNA修復阻害剤の種類により異なるが、通常、DNA修復阻害剤有効濃度であり、かつ検出に悪影響を及ぼさない濃度であればよくアフィジコリンの場合2〜50μM 、特に10〜40μM が好ましい。 Amount of DNA repair inhibitor may vary depending on the type of DNA repair inhibitor to be used, usually are effective concentration DNA repair inhibitors, and the case of may be a concentration that does not adversely affect the detection aphidicolin 2~50MyuM, especially 10~40μM is preferable. また、DNA修復阻害剤添加後の培養は、2〜6時間、特に3〜5時間が好ましい。 Further, the culture after the addition DNA repair inhibitor, 2 to 6 hours, especially 3-5 hours are preferred.

【0015】ところでアルカリ溶出法の原理は、次の如くである(Kohn,K.W.ら,Biochemis [0015] By the way the principle of the alkaline elution method is as follows (Kohn, K.W., Et al., Biochemis
try,21:4629−4637,1976)。 try, 21: 4629-4637,1976). 二本鎖DNAはアルカリ条件下で一本鎖に分離する。 Double-stranded DNA is separated into single strands under alkaline conditions. このとき、DNA上に鎖切断(DNA損傷)があると、一本鎖DNAの低分子量化により、その分子量分布は、DNA At this time, if there is a chain cleavage (DNA damage) on DNA, the low molecular weight of the single-stranded DNA, the molecular weight distribution, DNA
損傷のない一本鎖DNAの分子量分布とは異なるものとなる。 It becomes different from the molecular weight distribution of the single-stranded DNA with no damage. そこで、フィルターからの一本鎖DNAの溶出速度により分子量分布を測定すれば、DNA損傷の有無が判定できるというものである。 Therefore, by measuring the molecular weight distribution by the dissolution rate of the single-stranded DNA from the filter, it is that the presence of DNA damage can be determined. 従って、本発明におけるDNA修復阻害剤の作用は、化学物質によるin vi Thus, the action of DNA repair inhibitor in the present invention, in vi with chemicals
voに於けるDNA損傷に伴う修復過程を阻害し、損傷を蓄積させることにより、DNA損傷の検出感度を高めるものと考えられる。 Inhibit repair processes associated with in DNA damage vo, by accumulating damage is believed to increase the detection sensitivity of DNA damage.

【0016】DNA修復阻害剤の存在下に培養された肝細胞からの核分画の採取、アルカリ処理及びDNAの溶出は公知の手段により行えばよい。 [0016] Collection of nuclear fraction from hepatocytes cultured in the presence of a DNA repair inhibitor, alkali treatment and elution of DNA may be carried out by known means. すなわち、核分画の採取は、例えば肝細胞を2μm 程度の穴を有するフィルター上におき、プロテイナーゼK等の蛋白分解酵素を添加したSDS溶液を加えることにより行うことができる。 That is, taking the nuclear fraction, for example liver cells placed on a filter having a hole of about 2 [mu] m, it can be carried out by adding a SDS solution prepared by adding the proteolytic enzyme such as proteinase K. また、アルカリ処理及びDNAの溶出は、核分画の Moreover, alkaline treatment and elution of DNA, the nuclear fraction
pHを12〜13程度にすることにより行われ、例えば水酸化ナトリウム、テトラ−n−プロピルアンモニウムヒドロキシドの添加により行われる。 Done by a pH of about 12-13, such as sodium hydroxide, it is performed by the addition of tetra -n- propyl ammonium hydroxide. DNAの溶出速度は、一定時間毎の溶出液及びフィルター上の残されたD Dissolution rate of DNA left in the eluate and the filter every predetermined time interval D
NA量を測定することにより行うのが好ましい。 Preferably carried out by measuring the NA amount.

【0017】 [0017]

【発明の効果】本発明方法によれば、従来のアルカリ溶出法では検出できなかった発癌物質2,4−ジニトロトルエン、2−アセチルアミノフルオレン等のin vi According to the present invention a method according to the present invention, conventional carcinogen 2,4-dinitrotoluene can not be detected in the alkaline elution method, such as 2-acetylamino-fluorene in vi
voにおけるDNA損傷性を容易かつ高感度で検出できる。 The DNA damaging in vo can be detected with ease and high sensitivity.

【0018】 [0018]

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, examples illustrating the present invention in detail, but the present invention is not intended to be limited to these examples.

【0019】比較例1 (1)使用動物及び投与法 5〜6週令の雄性SD系ラット(150−200g,チャールズリバー社)を購入し、1週間順化飼育の後実験に用いた。 [0019] to buy a Comparative Example 1 (1) animals used and the method of administration 5-6-week-old male SD rats (150-200g, Charles River Co., Ltd.), was used in the experiments after one week acclimatization breeding. 飼料は固形飼料を、飲料水は水道水をプラスチック製吸水瓶にてそれぞれ自由に摂取させた。 Feed is a solid feed, drinking water, respectively libitum tap water in a plastic water bottle. 動物への投与は、試験する化学物質が液体の場合を除いて、乳鉢にて細粉化した後、特別に記載のない限り、コーン油(Hayashi Chemical.Co.,LT Administration to animals, except where chemicals to be tested is a liquid, after comminution in a mortar, unless otherwise stated, corn oil (Hayashi Chemical.Co., LT
D)を媒体として、経口ゾンデにより単回経口投与(1 The D) as a medium, a single oral dose by the oral sonde (1
0ml/kg)した。 0ml / kg) was.

【0020】(2)Kohnらの原法を一部改良したB [0020] (2) Kohn et al., The original method was improved some of the B
runborgらの方法(Mutation and runborg et al's method (Mutation and
Environment,Part D,Wiley− Environment, Part D, Wiley-
Liss,New York,pp. Liss, New York, pp. 43−52)に従った。 43-52 in accordance with). すなわち、被検物質投与2〜4時間後、ラットをエーテル麻酔下、下大静脈より脱血し、肝臓を摘出した。 That is, 2-4 hours after administration the test substance, under ether anesthesia rats were bled from the inferior vena cava was excised liver. 肝臓1gに対して10mMのEDTAを添加した氷冷Merchant's溶液〔M−EDTA〕(0.14 Ice cold Merchant's solution supplemented with 10mM of EDTA on the liver 1g [M-EDTA] (0.14
M NaCl,1.47mM KH 2 PO 4 ,2.7mMKC M NaCl, 1.47mM KH 2 PO 4 , 2.7mMKC
l,8.1mM Na 2 HPO 4 ,10mM Na 2 EDT l, 8.1mM Na 2 HPO 4, 10mM Na 2 EDT
A,pH7.4)3mlを加え、鋏で細切した。 A, pH 7.4) 3 ml was added, and minced with scissors. これにM− To this M-
EDTA3mlを新たに加え、ポッター型ホモジュナイザーにてホモジュネート(120r.pm,5往復)した。 Newly added EDTA3ml, homogenate at Potter homo Juna homogenizer (120r.pm, 5 roundtrip) was. 4
枚重ねのガーゼで濾過し、濾液を遠心(100×g,4 Filtered through a single lap of gauze, centrifuged filtrate (100 × g, 4
℃,4分)後上清を捨て、ペレットに新たに10mlのM ℃, discarded 4 minutes) after the supernatant, M of newly 10ml to pellet
−EDTA液を加えて分散させ、粗核分画とした。 The -EDTA solution was added and dispersed to obtain a crude nuclear fraction. 核数は、0.1%のクリスタルバイオレットを含む0.1M 0.1M number of nuclei, containing 0.1% crystal violet
のクエン酸水溶液で核を染色後、血球計算盤にて算出した。 After staining nuclei in the aqueous solution of citric acid, calculated in a hemacytometer. 約1.5×10 6細胞核を、アルカリ溶出液としてNaOHでpHを12.50に調整した20mM Na 2 About 1.5 × 10 6 nuclei, 20 mM Na 2 E adjusted to pH 12.50 with NaOH as the alkali eluent
DTA液を用いて溶出した。 DTA solution was eluted with.

【0021】(3)アルカリ溶出 アルカリ溶出は、Kohnらの原法に従った以下の方法にて行った。 [0021] (3) alkaline elution alkaline elution was carried out by the following method according to Kohn et al., The original method. ポリカーボネートフィルター(Nucle Polycarbonate filter (Nucle
pore,2μm ,25mmφ)をファネルに装着し、前記と同様のM−EDTA液に浮遊させた粗核分画をフィルター上で均一になるように、ゆっくり加え自然流出させた。 pore, 2 [mu] m, fitted with a 25 mm) to funnel and the crude nuclear fraction was suspended in M-EDTA solution similar to the above to be uniform on a filter, then air outflow slowly added. 冷却したM−EDTA液でフィルター上の細胞を洗浄後、ファネルをアルミ箔で覆い、直ちにプロテイナーゼK(30m Anson−E/mg,Merck) After washing the cells on the filter with cold M-EDTA solution, cover the funnel with aluminum foil, immediately proteinase K (30m Anson-E / mg, Merck)
0.5mg/mlを含むリシス溶液(1%SDS,0.1M Lysis solution (1% SDS containing 0.5 mg / ml, 0.1 M
グリシン,25mM Na 2 EDTA,pH9.6)5mlを加えて2mlを溶出させた後、室温で30分間放置して、 Glycine, 25mM Na 2 EDTA, pH9.6) After elution of 2ml by addition of 5 ml, and allowed to stand for 30 minutes at room temperature,
細胞膜及びDNA−タンパク結合の切断を行った。 The cleavage of the cell membrane and DNA- protein binding was performed. 次に、残りのリシス溶液を溶出させた後、20mM Na 2 Then, after elution of the remaining lysis solution, 20 mM Na 2
EDTA(pH9.6)10mlでフィルターを洗浄し、ファネル当たり30mlのアルカリ溶出液を静かに加え、流速0.033ml/分で90分毎に3mlずつ10分画/チャンネルを分取した。 Filters were washed with EDTA (pH 9.6) 10 ml, gently added alkaline eluate 30ml per funnel, was fractionated with 10 fractions / channel by 3ml every 90 minutes at a flow rate of 0.033 ml / min.

【0022】(4)DNA定量法 溶出の終了した分画中に含まれるDNA量及びフィルター上に残されたDNA量の定量はCesaroneらの方法(Anal.Biochem.,100:188− . [0022] (4) DNA Determination Determination of the terminated DNA amount contained in the fractions and the amount of DNA left on the filter elution Cesarone et al. Method (Anal.Biochem, 100: 188-
197,1979)により行った。 197,1979) by were carried out. すなわち、溶出の終了した各分画1mlに0.2M KH 2 PO 4を加えて(c That is, in addition to 0.2 M KH 2 PO 4 in each fraction 1ml ended elution (c
a. a. 0.27ml)pH7.0に調整後、SSC buff 0.27ml) was adjusted to pH7.0, SSC buff
er(0.154M NaCl−0.015M Na 3 er (0.154M NaCl-0.015M Na 3
−citrate,pH7.0)で2.0mlに希釈した。 -citrate, it was diluted to 2.0ml at pH7.0).
フィルター上に残されたDNA量を定量する場合には、 When quantifying the amount of DNA left on the filter,
フィルターを12mlのアルカリ溶出液中、40℃、1時間インキュベートした溶液について、同様の操作を行った。 In alkaline eluate filters 12 ml, 40 ° C., for 1 hour solution, the same operation was carried out. 次に1.5×10 -6 MHoechst 33258 Then 1.5 × 10 -6 MHoechst 33258
2[2−(4−ヒドロキシフェニル)−6−ベンズイミダゾール−6−(1−メチル−4−ピペラジル)ベンズイミダゾール・3塩酸塩]を含むSSC buffe 2 SSC containing [2- (4-hydroxyphenyl) -6-benzimidazole-6- (1-methyl-4-piperazyl) benzimidazole trihydrochloride] Buffe
r(0.154M NaCl−0.015M Na 3 r (0.154M NaCl-0.015M Na 3 -
citrate,pH7.0)1.0mlを加え、室温暗所で10分間放置した後、日立蛍光分光光度計F−401 citrate, pH 7.0) 1.0 ml and the mixture was allowed to stand 10 minutes at room temperature in the dark, Hitachi Fluorescence Spectrophotometer F-401
0を用い、Ex360nm,Em450nmに於ける蛍光強度を測定した。 With 0, Ex360nm, was measured in the fluorescence intensity in Em450nm. アルカリ溶出液に溶解させた既知濃度の仔牛胸腺DNAを標準とし、各分画のDNA含量を算出した。 The calf thymus DNA of known concentration dissolved in the alkaline eluate as a standard, was calculated DNA content of each fraction.

【0023】(5)結果の評価と検定 結果の評価はBrunborgらの方法により行った。 [0023] (5) evaluation and test results evaluation of the results was carried out by Brunborg et al's method.
各溶出画分中のDNA量と溶出に用いたフィルター上に残ったDNA量の総量に対して、各分画分取時のフィルター上のDNA量の割合を計算した。 The total amount of DNA amount remaining on the filter used for DNA amount and elution in each eluted fraction was calculated the ratio of the amount of DNA on the filter of each fraction fraction Totoki. 次に、この値を片対数グラフを用いて、分画数に対してプロットした時に得られる溶出曲線の面積〔NAAC(Normaliz Then, this value using the semi-log plot, the area of ​​the elution curve obtained when plotted against partial strokes [NAAC (Normaliz
ed Area Above Curve)〕を求め、 I asked the ed Area Above Curve)],
相互のデータを比較した。 They were compared each other's data.

【0024】(6)結果 表1に既存のアルカリ溶出法にて既知発癌物質のラット肝DNA損傷性を評価した結果を示した。 [0024] (6) Results Table 1 shows the results of evaluation of the rat liver DNA damaging known carcinogens in existing alkaline elution method. 表1に示したように、既存のアルカリ溶出法では、2,4−ジニトロトルエン、2−アセチルアミノフルオレン、ベンゼン、 As shown in Table 1, in the conventional alkaline elution method, 2,4-dinitrotoluene, 2-acetylaminofluorene, benzene,
1,2−ベンズアントラセンなどの一部の代表的な肝発癌物質のDNA損傷性を検出することができなかった。 It could not be detected DNA damage of some of the typical hepatic carcinogens such as 1,2-benzanthracene.

【0025】 [0025]

【表1】 [Table 1]

【0026】実施例1 (1)使用動物及び被検物質の投与は比較例と同様に行った。 [0026] Administration of Example 1 (1) using animals and test substance was carried out in the same manner as in Comparative Example.

【0027】(2)肝細胞の調製は、Sawadaらの方法(J.Cancer Res.Clin.Onco [0027] (2) Preparation of hepatocytes, Sawada et al. Method (J. Cancer Res.Clin.Onco
l. l. ,115:345−350,1989)に若干の改良を加えた、2段階コラゲナーゼ灌流法にて行った。 , 115: 345-350,1989 with minor modifications) which was conducted at two stages collagenase perfusion method. すなわち、ラットにネンブタール溶液を腹腔内投与(1ml That is, rats intraperitoneally Nembutal solution (1ml
/kg)し、麻酔後腹壁を切開した。 / Kg), and were dissected anesthesia after abdominal wall. 次に、門脈にカニューレ(ハッピーキャス・Z,18G)を挿入し、肝臓下の下大静脈を切断した。 Next, cannulated (Happy Cass · Z, 18G) to the portal vein was cut inferior vena cava under the liver. 切断と同時に、予め37℃に加温しておいた前灌流液〔0.5mM EGTA,10mM Cutting at the same time, previously 37 ° C. warmed in advance was pre perfusate [0.5 mM EGTA, 10 mM
HEPESをCa 2+ ,Mg 2+ ,free Hanks塩類液に溶かした液,pH7.2〜7.3〕をペリスタポンプを用いて14ml/分の流速で門脈より約5分間注入した。 HEPES and Ca 2+, Mg 2+, liquid dissolved in free Hanks saline solution, and about injected 5 minutes from the portal vein at a flow rate of 14 ml / min using a peristaltic pump the pH7.2~7.3]. 次に、胸郭を開いて右心房を切開した後、0.05 Then, after the incision in the right atrium open the rib cage, 0.05
%コラゲナーゼ液〔コラゲナーゼ(type IV,Sig % Collagenase solution [collagenase (type IV, Sig
ma Chem. ma Chem. Co. Co. )を10mMHEPES及び0. ) The 10mMHEPES and 0.
005%トリプシン・インヒビター(Sigma Ch 005% trypsin inhibitor (Sigma Ch
em. em. Co. Co. )を含むHanks塩類液に溶かした液, Liquid dissolved in Hanks salts solution containing a),
pH7.5〕に交換し、37℃、14ml/分の流速で同様に約7分間注入した。 Replace the pH7.5], 37 ° C., it was similarly injected about 7 minutes at a flow rate of 14 ml / min. 灌流終了後、肝臓を摘出し、少量のコラゲナーゼ液を入れたプラスチックシャーレに移し、2本の手術用メス(フタバNo.23)を軽く交叉させて肝臓を細切した。 After perfusion was completed, the livers were excised, transferred to a small amount of collagenase solution plastic petri-dishes, two scalpel (Futaba No.23) lightly to crossover was minced liver. 次に、シャーレに氷冷したHa Then, Ha ice-cold in a petri dish
nks液を約30ml加えて肝細胞を分散させた後、2枚のガーゼを重ねた細胞濾過器(メッシュロート,池本理化)で濾過し、粗肝細胞分散液を得た。 After nks liquid dispersed about 30ml added hepatocytes, cell strainer of repeated two gauze (mesh funnel, Rika Ikemoto) was filtered gave the crude hepatocyte dispersion. これを低速遠心(50×g,4℃,1min)によりHanks液で2回洗浄し、肝実質細胞とした。 This low speed centrifugation (50 × g, 4 ℃, 1min) by washing twice with Hanks solution, and the hepatocytes. 得られた肝実質細胞の生存率を、トリパンブルー排除法により算出した後、75cm The viability of the resulting hepatocytes was calculated by trypan blue exclusion, 75 cm
2培養フラスコに、約2×10 6生存細胞を硫酸カナマイシン(0.1mg/ml)、アンホテリシンB(2.5μg 2 culture flask, approximately 2 × 10 6 viable cells kanamycin sulfate (0.1 mg / ml), amphotericin B (2.5 [mu] g
/ml)、インシュリン(4μg /ml)、10%仔牛血清を含むWilliams'medium E培養液(W / Ml), insulin (4μg / ml), Williams'medium E medium containing 10% calf serum (W
E培地)20mlに分散させ、37℃、5%CO 2条件下で2時間培養し、細胞をフラスコ表面に接着させた。 E medium) were dispersed in 20 ml, 37 ° C., incubated for 2 hours under 5% CO 2, cells were allowed to adhere to the flask surface. 2
時間後、WE培地により細胞表面を2回洗浄して死細胞を除去した後、DMSOに溶解したDNA修復阻害剤(アフィジコリン)を添加し、引き続き4時間培養を継続した。 After time, after removing the dead cells were washed cell surface twice with WE medium, supplemented with DNA repair inhibitors were dissolved in DMSO (aphidicolin) and subsequently continued for 4 hours culture. 培養終了後、冷却したM−EDTA10mlで細胞表面を2回洗浄し、ラバーポリスマンで細胞を剥離した後、冷却したM−EDTA10mlに細胞を浮遊させた。 After completion of the culture, the cell surface was washed twice with cold M-EDTA10ml, after removing the cells with a rubber policeman and suspended the cells in cold M-EDTA10ml. これをアルカリ溶出液として、テトラ−n−プロピルアンモニウムヒドロキシドでpHを12.10に調整した20mM H 4 EDTA液を用いて溶出した。 This as alkaline eluate was eluted with 20 mM H 4 EDTA solution and the pH was adjusted to 12.10 with tetra -n- propyl ammonium hydroxide.

【0028】(3)その後比較例1と同様にしてアルカリ溶出、DNA定量及び検定を行った。 [0028] (3) Then Likewise alkaline elution with Comparative Example 1, was subjected to DNA quantification and assay. その結果を図1 Figure 1 and the results
に示す。 To show. 図1から明らかに、アフィジコリン20μM 添加により、発癌性のあることがわかっている2−アセチルアミノフルオレンでは明瞭なDNA損傷を検出できたのに対し、発癌性のない4−アセチルアミノフルオレンではDNA損傷は認められなかった。 Apparent from Fig. 1, by aphidicolin 20μM addition, while could be detected distinct DNA damage in and are 2-acetylamino-fluorene found to be carcinogenic, DNA damage is not carcinogenic 4-acetylamino-fluorene It was not observed.

【0029】実施例2 発癌物質2−アセチルアミノフルオレンの投与量を5mg [0029] The dose of Example 2 carcinogen 2-acetylaminofluorene 5mg
/kg〜100mg/kgに変化させる以外は実施例1と同様にして試験した。 / Except for changing the kg to 100 mg / kg were tested in the same manner as in Example 1. その結果を図2に示す。 The results are shown in Figure 2. 図から、明らかなように2−アセチルアミノフルオレンの不定期DN From the figure, apparent as 2-acetylamino-fluorene irregularly DN
A合成試験で報告されている検出最低投与用量(5mg/ Detection lowest dose as reported in A synthetic test (5 mg /
kg)を、本発明方法を用いた場合に於いても検出可能であることが明らかとなり、本発明方法は非常に検出感度の高い方法であることが確認できた。 The kg), becomes clear that it is detectable at the case of using the present invention method, the present method was confirmed to be high extremely detection sensitivity method.

【0030】実施例3 アルカリ溶出液としてNaOHでpHを12.50に調整した20mM Na 2 EDTA液を用いる以外は実施例1 [0030] except for using 20 mM Na 2 EDTA solution and the pH was adjusted to 12.50 with NaOH as in Example 3 alkaline eluate Example 1
と同様にして試験したところ、実施例1と同様の結果を得た。 It was tested in the same manner as to give the same results as in Example 1.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明方法に於ける2−アセチルアミノフルオレン(2AAF)と4−アセチルアミノフルオレン(4 [1] The present invention method in 2-acetylamino-fluorene (2AAF) and 4-acetylamino-fluorene (4
AAF)のDNA損傷作用を示す図である。 It is a diagram showing the DNA damaging effects of AAF).

【図2】本発明方法に於ける2−アセチルアミノフルオレン(2AAF)の投与量とDNA損傷作用との関係を示す図である。 It is a diagram showing the relationship between the dose and the DNA damaging effects of the present invention; FIG method in 2-acetylamino-fluorene (2AAF).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:91) ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 in identification symbol Agency Docket No. FI art display portion C12R 1:91)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 被検物質を投与された動物の肝細胞をD Hepatocytes D of 1. A animals administered test substance
    NA修復阻害剤の存在下に培養し、得られた培養肝細胞より核分画を得、当該核分画をアルカリ処理して得られた一本鎖DNAの分子量分布を測定することを特徴とする変異原性試験法。 Cultured in the presence of NA repair inhibitor, resulting to obtain a nuclear fraction from the cultured hepatocytes, and characterized in that the nuclear fraction to determine the molecular weight distribution of single-stranded DNA obtained by alkali treatment mutagenicity test methods.
  2. 【請求項2】 一本鎖DNAの分子量分布の測定が、一本鎖DNAのフィルターからの溶出速度を測定することにより行われるものである請求項1記載の試験法。 2. A measurement of the molecular weight distribution of single-stranded DNA is, test method according to claim 1, wherein it is intended to be carried out by measuring the dissolution rate of the filter single-stranded DNA.
  3. 【請求項3】 DNA修復阻害剤が、ポリメラーゼα阻害剤である請求項1記載の試験法。 3. A DNA repair inhibitor, test method according to claim 1 is a polymerase α inhibitor.
  4. 【請求項4】 DNA修復阻害剤が、アフィジコリンである請求項1記載の試験法。 4. A DNA repair inhibitor, test method according to claim 1, wherein the aphidicolin.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001211896A (en) * 1999-11-26 2001-08-07 Olympus Optical Co Ltd Image analysis method, device for it, and recording medium
JP2001269195A (en) * 2000-03-27 2001-10-02 Olympus Optical Co Ltd Method, device and recording medium for analyzing image of cell
JP2016106542A (en) * 2014-12-03 2016-06-20 国立大学法人 大分大学 Screening method of dna damaging substance

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