JPH09505561A - Nervous system gene therapy - Google Patents

Nervous system gene therapy

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JPH09505561A
JPH09505561A JP7510881A JP51088195A JPH09505561A JP H09505561 A JPH09505561 A JP H09505561A JP 7510881 A JP7510881 A JP 7510881A JP 51088195 A JP51088195 A JP 51088195A JP H09505561 A JPH09505561 A JP H09505561A
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Abstract

(57)【要約】 一つの脊索動物宿主（望ましくは哺乳類宿主）にある神経系の悪化状態を治療する一つの方法であって、宿主の脳脊髄液に、神経系にある治療薬を発現するために細胞を形質導入出来る発現ベクターを投与することよりなる方法。発現ベクターは神経系の悪化状態を治療するための治療薬をコード化する核酸配列を含み、また神経系の悪化状態を治療するのに有効な量で投与される。この発明の方法は髄膜癌腫症の治療に特に有効であり、ここで負の選択マーカー（単純性ヘルペスチミジンキナーゼなど）をコード化する遺伝子を含むレトロウイルスベクターを含有する生産者細胞が患者の脳脊髄液に投与される。このような生産者細胞は髄膜癌腫症細胞を形質転換するウイルス粒子を生成する。形質転換髄膜癌腫症細胞は次いで負の選択マーカーと相互作用する相互作用薬（ガンシクロビルなど）の投与で死滅する。   (57) [Summary] A method of treating a deteriorating condition of the nervous system in a single chordate host, preferably a mammalian host, by transducing cells into the cerebrospinal fluid of the host to express a therapeutic agent in the nervous system. A method comprising administering an expression vector capable of expressing. The expression vector comprises a nucleic acid sequence encoding a therapeutic agent for treating a deteriorating nervous system condition and is administered in an amount effective to treat a deteriorating nervous system condition. The method of this invention is particularly effective in the treatment of meningeal carcinomatosis wherein a producer cell containing a retroviral vector containing a gene encoding a negative selectable marker (such as herpes simplex thymidine kinase) is expressed in the patient. Administered to cerebrospinal fluid. Such producer cells produce viral particles that transform meningeal carcinomatous cells. The transformed meningeal carcinomatous cells are then killed by the administration of an interacting drug (such as ganciclovir) that interacts with the negative selectable marker.

Description

【発明の詳細な説明】 神経系の遺伝子治療 この発明は、必ずしもそれに限定されないが、例えば髄膜癌腫症などの神経系 の腫瘍を含む神経系の悪化状態の治療に関する。より詳細には、中枢神経系の悪 化状態の治療のための治療薬をコード化する核酸配列を含む修飾ウイルス粒子を 生産するウイルス生産者細胞系に含有されたウイルスベクターのような発現ベク ターを、宿主の膿脊髄液に投与し、これにより修飾ウイルスが治療薬をコード化 する核酸配列を中枢神経系の細胞にまで運びこむことで、神経系、望ましくは中 枢神経系の悪化状態を治療することに関する。 軟髄膜癌腫症としても知られる髄膜癌腫症は、すべての癌患者の約５％から約 ２０％までに発生し、もっとも一般に肺癌、乳癌及び黒色腫から脳および脊髄の 軟髄膜被覆物のような癌の転移性蔓延から生じする。（クレイモン、他、乳癌の 研究および治療 、９巻、２１３−２１７ページ（１９８７年）。リャウ、他、Ta iwan I Hsueh Hui Tsa Chin ,９１巻、２９９−３０３ページ（１９９２年）。中 川、他、神経腫瘍学、１３巻、８１−８９ページ（１９９２年）。ニーテンズ、 他、ベルギー眼科学会紀要、２１５巻、１０９−１１５ページ（１９８５年）。 シャピロ、ウェスターン ジャーナル オブ メディスン．１５４巻、３５０− ３５１ページ（１９９１年）。髄膜癌腫症の標準的治療は放射線療法およびもし くは化学療法薬のクモ膜下投与よりなる。全神経軸 に放射線を放射する必要性は深刻な骨髄抑制を起こし、これは患者が耐えること の出来る全身あるいクモ膜下化学療法の量を制限する（シャピロ．１９９１年） 。 単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の腫瘍細胞への生体内レトロウイルス 媒介転移により固型脳腫瘍を治療する新しいアプローチは、抗ウイルス剤ガンシ クロビルに感受性を与えることが記述されている（カルヴァー、他、科学、２５ ６巻、１５５０−１５５２ページ（１９９２年）。ラム、他、癌研究１５３巻、 ８３−８８ページ（１９９３年））。ガンシクロビルは形質導入腫瘍細胞により 優先的に加リン酸反応し、ＤＮＡ合成を妨げる。遺伝子移転は単純性ヘルペスチ ミジンキナーゼ遺伝子を運ぶマウスレトロウイルスベクターでの腫瘍細胞の感染 、およびこの遺伝子の宿主細胞のゲノムへの組込みにより達成される。これらの ベクターは、この腫瘍塊に注射されたマウスベクター生産者細胞により連続的に 生産される。レトウイルスがＤＮＡを活発に合成する細胞（すなわち複製細胞） のみに感染出来るために、腫瘍細胞の優先的形質導入が達成される。このアプロ ーチは今や臨床試験で評価を受けつつある（オールドフィールド、他、ヒト遺伝 子療法 、４巻、３９−６９ページ（１９９３年））。 髄膜癌腫症および神経系の他の悪化状態は、このアプローチのも一つの適用を 提供する。例えば脳室系あるいは腰推もしくはクモ膜下腔への注射などにより脳 脊髄液に注射されるベクター生産者細胞は脳脊髄液内で循環し、ウイルスベクタ ー（例えばレトロウイルスベクター粒子など）を連続して放出する。 このようなウイルスベクターは腫瘍浸潤軟髄膜に接触し、複製腫瘍細胞を形質導 入し、またガンシクロビルの全身投与で腫瘍の選択的根絶を可能にする。 この発明の一見地に従って、脊索動物宿主にある神経系の悪化状態を治療する 一つの方法が提供される。この方法は、脊索動物宿主の脳脊髄液に、中枢神経系 で治療薬を発現するための細胞を形質導入出来る発現ベクターを投与することよ りなる。発現ベクターは、中枢神経系の悪化状態を治療するための治療薬をコー ド化する核酸配列を含む。発現ベクターは宿主にある中枢神経系の悪化状態を治 療するのに有効な量で投与される。発現ベクターで形質導入される細胞は、腫瘍 細胞および正常（すなわち非腫瘍）細胞であり、これは脈絡叢の上皮および内皮 細胞のような細胞である。 ここで使用される「脊索動物」という用語は、脊索動物門のいずれかの動物、 つまり脊髄のような脊索あるいは相似構造を含むいずれかの動物を意味する。こ のような動物は必ずしもそれに限定されないが（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む ）哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、および魚類を含む。 ここで使用される「神経系」という用語は、神経系機能およびもしくは運動支 配機能を持つ動物のいずれかの器官を意味する。このような器官は必ずしもそれ に限定されないが、脳、脊髄、脳神経、および運動支配機能に欠くことのできな い他の神経を含む。 ここで使用される「核酸配列」という用語はＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を意味 し、完全および部分遺伝子配列を含み、また 同様にポリヌクレオチドを含む。この用語はまた隣接するペントースの３′およ び５′炭素の間のホスホジエステル結合により交互に結合する一連のデオキシリ ボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを含む。 この発明の範囲はいずれかの理論的類推により限定されるものではないが、宿 主の脳脊髄液への投与により発現ベクターは脳脊髄液全体にわたり中枢神経系の 細胞に移り、これにより治療薬をコード化する核酸配列は中枢神経系の細胞へと 運ばれ、またこれによって治療薬はそのような細胞により発現される。形質導入 される細胞は必ずしもそれに限定されないが、中枢神経系、脳細胞、脳神経およ び運動支配機能に欠くことのできない神経の細胞、更に脊髄細胞などの腫瘍細胞 である。発現ベクターおよび治療薬により形質導入される細胞のタイプは治療さ れるべき神経系の悪化状態のタイプに依存する。 ここで使用される「神経系の悪化状態」という用語は、核酸配列を含む発現ベ クターが神経系の細胞に形質導入される遺伝子療法により治療される神経系の何 らかの疾病を含む。このような状況は必ずしもそれに限定されないが、中枢神経 系の腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、成人病、精神 障害、および神経系に新しい化合物を導入しあるいは現存するタンパク質の水準 を修飾することにより影響を受ける各種の疾患を含む。 発現ベクターは生体内で中枢神経系の悪化状態を治療するために細胞を形質移 入し治療薬を発現出来る何らかの発現ベクターである。使用される適切な発現ベ クターは必ずしもそれに 限定されないが真核ベクター、原核ベクター（例えば細菌性プラスミド）、およ びウイルスベクター、ＤＮＡモノクローナル抗体複合体などのＤＮＡタンパク質 複合体、および受容体媒介ベクターを含む。このベクターはリポソーム内に含ま れることもある。 一実施例において、発現ベクターはウイルスベクターである。使用されるウイ ルスベクターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスベクター、アデ ノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、およびヘルペスウイルス ベクターを含む。一実施例において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクタ ーである。 望ましい実施例において、パッケージング細胞系は、神経系の悪化状態を治療 するために治療薬をコード化する核酸配列を含有する一つのウイルスベクターで 形質導入され、ウイルスベクターを含む生産者細胞系を形成する。生産者細胞は 次いで宿主の脳脊髄液に投与され、それによって生産者細胞は脳脊髄液内の頭蓋 脊椎クモ膜下腔全体を通じて循環し、これによりそのようなウイルスベクターは そのような細胞内で治療薬を発現する。 一つの実施例において、神経系の悪化状態は中枢神経系の軟髄膜被覆物に浸潤 する腫瘍のような神経系の腫瘍である。望ましくは、中枢神経系の腫瘍は、宿主 生産者細胞を脳脊髄液に投与することにより治療され、この生産者細胞はウイル スベクターで形質転換され、またこの細胞は腫瘍細胞の成長を阻害し、妨げ、あ るいは破壊することの出来る治療薬をコード化す る核酸配列を含むウイルスを生産する。生産者細胞の脳脊髄液への投与に際し、 生産者細胞により生産されるウイルスは脳脊髄液全体を通じて循環して腫瘍細胞 を形質導入し、これにより腫瘍細胞成長の阻害、妨げ、あるいは破壊を提供する ことの出来る作用薬が腫瘍細胞により発現される。 治療される神経系の腫瘍は必ずしもそれに限定されないが、骨髄芽細胞腫のよ うな末梢あるいは一次脳腫瘍から生じる髄膜癌腫症、脳室上衣細胞腫、および脊 柱の腰仙部の腫瘍を含む。しかしこの発明の範囲は神経系の腫瘍の治療に限定さ れるものではないことが理解されねばならない。 望ましい実施例において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである 。使用されるレトロウイルスベクターの例は、必ずしもそれに限定されないが、 モロニーマウス白血病ウイルス；脾臓壊死ウイルス；およびニワトリ肉腫ウイル ス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄 増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスから誘導される ベクターを含む。望ましくはレトロウイルスベクターは、感染性ではあるが、複 製コンピテント（被感染能力を持つ）レトロウイルスベクターである。しかし複 製コンピテントレトロウイルスも、同じく使用することかできる。 レトロウイルスベクターはレトロウイルス媒介遺伝子転移を真核細胞に媒介す る作用薬として有用である。レトロウイルスは一般にウイルスの構造遺伝子をコ ードする多数の配列が欠失され対象となる遺伝子により代替されるように構築さ れる。 非常にしばしば構造遺伝子（すなわちｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）が従来周 知の遺伝子操作技術を用いてレトロウイルスバックボーンから除去される。これ は適切な制限エンドヌクレアーゼあるいは、ある場合にはＢａｌ ３１エキソヌ クレアーゼを用いる消化を含み、パッケージングシグナルの適切な部分を含有す る断片を生成する。 これらの新しい遺伝子はいくつかの一般的な方法でプロウイルスバックボーン にとり込まれる。もっともわかりやすい構築は、レトロウイルスの構造遺伝子が 単一遺伝子により代替され、後者が次いで長末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調 節配列の制御の下で転写される構築である。レトロウイルスベクターはまた、そ れが１個以上の遺伝子を標的細胞に導入出来るように構築された。通常このよう なベクターにおいて、１個の遺伝子はウイルスＬＴＲの調節制御下にあり、一方 第２の遺伝子はスプライスドメッセージとは切れて発現されるかもしくはそれ自 身の内部プロモーターの制御下にある。 ウイルスバックボーンのウイルス成分を最小にするよう努力が払われ、その努 力は主としてパッケージ細胞内でベクターとパッケージング欠損ヘルパーウイル スの間の組換えの機会を少なくさせるというものであった。パッケージング欠損 ヘルパーウイルスは、ベクター自身から欠失したレトロウイルスの構造遺伝子を 提供するのに必要である。 一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、一連のベクター（ベンダ ー、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻：１６３９−１６４９ページ（１９８７ 年）に記載されたもの） の一つであることが出来、これはベクターおよびパッケージングシステムの間の 相同性を絶対最小値にまで減少する一連の欠失および置換を含有するＮ２ベクタ ー（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻：１６４７−１６５０ ページ）に基づくものであった。これらの変化はウイルスタンパク質が発現され る亢度も減少させた。これらのベクターの最初のものとして、ＬＮＬ−ＸＨＣで は、部位指向突然変異誘発によりｇａｇの天然ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに変更 され、その結果その点からの意図しないタンパク質合成が除去された。モロニー マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の５′から真正ｇａｇ出発までにおいて 、読み取り枠が存在しそれはも一つのグリコシル化タンパク質（ｐＰｒ８０gag ）の発現を可能にする。モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）はフレー ムシフトおよびグリコシル化部位欠失を含めてこの５′領域で変更を有し、それ はｐＰｒ８０gagのアミノ末端の潜在的発現を未然に防ぐ。従ってベクターＬＮ Ｌ６が作られ、それはＬＮＬ−ＸＨＣの変更ＡＴＧおよびＭｏＭｕＳＶの５′部 をとり込んだ。ＬＮベクターシリーズの５′構造はかくして遺伝子形質導入標的 細胞にあるウイルス抗原の連続生産により、レトロウイルス読み取り枠発現の可 能性を除去する。パッケージング欠損ヘルパーウイルスでオーバーラップを減少 させる最後の変更において、ミラーはＬＮベクターの３′ＬＴＲ直前にある余分 のｅｎｖ配列を除去した（ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ ページ、１９８９年）。 遺伝子治療への適用に関していずれかの遺伝子転移システム で満足されねばならない最高の必要性は安全性である。安全性は感染性ベクター の生産に利用されるベクターゲノム構造およびパッケージングシステムの組合せ から誘導される。ミラー、他はレトロウイルス構造タンパク質発現のためのｐＰ ＡＭ３プラスミド（パッケージング欠損ヘルパーゲノム）とＬＮベクターシリー ズとを組合せ、組換え野生型レトロウイルスの生成がベクターゲノムとパッケー ジング欠損ヘルパーゲノム（すなわちｐＰＡＭ３を持つＬＮ）との間の組換えの ほとんどすべての部位で除去を通じて最小に少なくされるベクターパッケージン グシステムを生産することを開発した。 一つの実施例において、レトロウイルスベクターは前記記載のもののようなベ クターのＬＮシリーズのモロニーマウス白血病ウイルスであり、それは更にベン ダー、他（１９８７年）およびミラー、他（１９８９年）にも記述されている。 このようなベクターはマウス肉腫ウイルスから誘導されるパッケージングシグナ ルの一部、および突然変異したｇａｇ開始コドンを有している。ここで使用され る「突然変異した」という用語は、ｇａｇタンパク質あるいは断片もしくはその 切形が発現されないようにｇａｇ開始コドンが欠失あるいは変化したことを意味 する。 も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは少なくとも４個のクロー ニング、あるいは制限酵素認識部位を含み、ここで少なくとも２個の部位は１０ ，０００塩基対で１度以下の真核遺伝子出現平均頻度を持つ。すなわち制限産物 は少なくとも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有する。望まし いクローニング部位は、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩより なるグループから選択される。望ましい実施例において、レトロウイルスベクタ ーはこれらのクローニング部位のそれぞれを含む。このようなベクターは、更に 、１９９２年７月２３日に受理された米国特許出願番号９１９，０６２号で説明 されており、ここでも引用例としてとり込まれている。 このようなクローニング部位を含むレトロウイルスベクターが使用されると、 一つのシャトルクローニングベクターが提供され、このベクターは少なくとも２ 個のクローニング部位を含み、レトロウイルスベクターに立地するＮｏｔＩ、Ｓ ｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される少なくと も２個のクローニング部位と適合する。シャトルクローニングベクターは更に、 シャトルクローニングベクターからレトロウイルスベクターに転移され得る少な くとも１個の望ましい遺伝子を含む。 シャトルクローニングベクターは、クローニングあるいは制限酵素認識部位を 含む１個もしくはそれ以上のリンカーに結合される基本「バックボーン」ベクタ ーあるいは断片から構築される。クローニング部位に含まれるのは前記の適合性 、あるいは相補的クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に対応 する末端を持つ遺伝子およびもしくはプロモーターは従来の周知の技術を通じて シャトルベクターに結合される。 シャトルクローニングベクターは原核システムにあるＤＮＡ配列を増幅するた めに使用することが出来る。シャトルクロー ニングベクターは原核システム、とりわけ細菌で一般に使用されるプラスミドか ら調製出来る。かくして例えばシャトルクローニングベクターはＰＢＲ３２２、 ｐＵＣ１８等のようなプラスミドから誘導することが出来る。 ベクターは１個もしくはそれ以上のプロモーターを含む。使用されるプロモー ターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモ ーター；ミラー他、バイオテクニク、７巻、９号、９８０−９９０ページ（１９ ８９年）に記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ある いはいずれか他のプロモーター（例えば必ずしもそれに限定されないが、ヒスト ン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを含む真核細胞プロモー ターのような細胞プロモーター）を含む。使用される他のウイルスプロモーター は、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモ ーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターである。プロモーターはまた 組織特異的あるいは腫瘍特異的プロモーターを含む。適切なプロモーターの選択 はここでの教訓から従来の技術に通じた人達には明らかである。 ベクターは次いで生産者細胞系を形成するためのパッケージング細胞系を形質 導入するために使用される。形質移入されるパッケージング細胞の例は、必ずし もそれに限定されないが、ミラー、ヒト遺伝子療法、１巻、５−１４ページ（１ ９９０年）に記述されているように、ＰＥ５０１、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２ 、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９− １７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、 およびＤＡＮ細胞系を含む。作用薬をコード化する核酸配列の発現に際して腫瘍 細胞成長の阻害、妨げ、あるいは破壊を提供出来る作用薬をコード化する核酸配 列を含むベクターは従来周知の何らかの手段を通じてパッケージング細胞を形質 導入出来る。このような手段は必ずしもそれに限定されないが、電気穿孔法、リ ポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿を含む。 生産者細胞は次いで脳脊髄液に、腫瘍の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊す るのに有効な量で投与される。生産者細胞は約１×１０9から約１×１０10細胞 数／用量で、望ましくは約６×１０9から約１×１０10細胞数／用量で投与され る。投与される生産者細胞の正確な量は、必ずしもそれに限定されないが、腫瘍 の型および腫瘍のサイズを含む各種の要因に依存する。ある場合には、生産者細 胞の反復投与が必要とされる場合もある。 生産者細胞は患者への投与に適した調剤許容担体と併用して投与される。担体 は例えば食塩水、あるいは緩衝液もしくは他の同一モル水溶液のような液状担体 である。生産者細胞は脊髄クモ膜下腔を通すような脳室内、クモ膜下で脳脊髄液 に投与され、あるいは生産者細胞はウイルスベクター粒子を連続生成して脳脊髄 液に提供する脈絡叢に投与される。 生産者細胞の脳脊髄液への投与に際して、生産者細胞はウイルスベクター粒子 を生成する。ウイルス粒子は脳脊髄液全体を循環し、また腫瘍細胞を形質導入す る。腫瘍細胞、とりわけ癌 性腫瘍細胞が一般に活性複製細胞であるため、レトロウイルス粒子は正常細胞と は対照したものとして腫瘍細胞に優先的あるいは排他的にとり込まれかつ発現さ れることになる。 治療される神経系の腫瘍は悪性および非悪性腫瘍を含む。 この発明に従って、作用薬の発現に際し腫瘍細胞成長の阻害、妨げ、あるいは 破壊を提供出来るそのような作用薬は負の選択マーカー；すなわち腫瘍細胞の成 長を阻害し、妨げ、あるいは破壊する化学療法あるいは相互作用薬と併用される 物質である。 かくして、負の選択マーカーを用いて腫瘍細胞を形質導入する際に、相互作用 薬がヒト宿主に投与される。相互作用薬は腫瘍細胞の成長を阻害し、妨げ、ある いは破壊するために負の選択マーカーと相互作用する。 使用される負の選択マーカーは必ずしもそれに限定されないが、単純性ヘルペ スウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、水痘− 帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼなどのようなチミジンキナーゼ；およびシト シンデアミナーゼを含む。 一つの実施例において、負の選択マーカーは単純性ヘルペスウイルスチミジン キナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状疱疹ウイ ルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択されるウイルスチミジンキナー ゼである。そのようなウイルスチミジンキナーゼが使用される時、相互作用薬あ るいは化学療法薬は望ましくはヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビル、ア シクロビル、１−２−デオキ シ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡ Ｕ）、および６−メトキシプリン−アラビノヌクレオシド（ａｒａＭ）よりなる グループから選択されるものである。このような相互作用薬は基質としてウイル スチミジンキナーゼにより有効に利用され、またこのような相互作用薬はかくし てウイルスチミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のＤＮＡに致死的にとり込まれ 、これにより腫瘍細胞を死滅に到らしめる。 も一つの実施例において、負の選択マーカーはシトシンデアミナーゼである。 シトシンデアミナーゼが負の選択マーカーである時、望ましい相互作用薬は５− フルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは５−フルオロシトシンを５− フルオロウラシルに転換し、後者は非常に細胞毒性が強い。かくしてシトシンデ アミナーゼを発現する腫瘍細胞は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシル に転換し死滅する。 相互作用薬は形質導入腫瘍細胞の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに 有効な量で投与される。例えば、相互作用薬は、患者に対する全毒性に依存しな がら宿主の体重の約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでの量で投与される。 一つの実施例において、この用量は１日当り２回投与される。相互作用薬は望ま しくは、例えば静脈内投与により、非経口投与により、腹腔内投与により、ある いは筋肉内投与によるなど全身投与される。 生産者細胞あるいは負の選択マーカーを含む他の発現媒体が生体内で腫瘍に投 与される時、「第三者効果」が生じる。すな わち負の選択マーカーをコード化する核酸配列でもともと形質導入されなかった 腫瘍細胞は、相互作用薬の投与で死滅させられる。この発明の範囲はいずれの理 論的類推によっても制限されるものではないが、形質転換腫瘍細胞は、相互作用 薬に対し細胞外で作用するかもしくは隣接する非形質転換腫瘍細胞によりとり上 げられる負の選択マーカーの分散可能な形態を生産し、それは次いで相互作用薬 の作用を受けやすいものになる。負の選択マーカーおよび相互作用薬の一方もし くは両方とも腫瘍細胞との間で連通することも可能である。このような第三者効 果は１９９２年５月１日受理された米国特許出願番号０７／８７７，５１９号に も記述されており、ここで引用文献としてとり込まれている。 望ましい実施例において、パッケージング細胞系は前に記載されたもののよう な単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含むレトロウイルスベクタ ーで形質導入される。形質導入パッケージング細胞（生産者細胞）は、調剤許容 担体内で腫瘍の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに有効な量で脳脊髄液 に生体内投与される。生産者細胞の脳脊髄液への投与に際し、生産者細胞は負の 選択マーカーをコード化する遺伝子を含むウイルスベクター粒子を生成する。こ のようなウイルス粒子は脳脊髄液全体を通じて循環し、腫瘍細胞を形質導入する 。ヒト宿主は次いでガンシクロビル、アシクロビル、あるいは１−２−デオキシ −２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ ）のような一つの作用薬を与えられ、それが単純性ヘルペスウイルスチミジンキ ナーゼ と相互作用し形質導入腫瘍細胞を死滅させる。ここで記載したように、「第三者 効果」が同じく生じ、それにより非形質導入腫瘍細胞もまた同じように死滅させ られる。 も一つの実施例において、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。 使用されるアデノウイルスベクターは、１実施例では基本的に完全アデノウイ ルスゲノムを含むアデノウイルスベクターである。代替的にはアデノウイルスベ クターは、少なくともアデノウイルスゲノムの一部が欠失した修飾アデノウイル スベクターである。 一つの実施例において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス５′ＩＴ Ｒ、アデノウイルス３′ＩＴＲ；アデノウイルス包膜シグナル：治療薬をコード 化する少なくとも１個のＤＮＡ配列；および治療薬をコード化する少なくとも１ 個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。このベクターはアデノウイル スＥ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４ＤＮＡ配列とは離れており、またベクターはア デノウイルス主要遅発プロモーターにより促進されるアデノウイルスタンパク質 をコード化するＤＮＡ配列とは離れており、すなわち、このベクターはアデノウ イルス構造タンパク質をコード化するＤＮＡとは離れている。 このようなベクターは、標準の技術を用いてアデノウイルスゲノムからアデノ ウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、およびアデノウイルス包膜シ グナルを除去することで構築することが出来る。このような成分は、プロモータ ー（ア デノウイルスプロモーターあるいは非アデノウイルスプロモーターのいずれであ ってもよい）、三部分リーダー配列、ポリＡシグナル、および選択マーカーと共 に、標準的な技術によって、適切なクローニングベクターを形成するために例え ばピーブルースクリプトｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−（ストラータジ ーン社）のような塩基プラスミドつまり「スターター」プラスミドに結合される 。クローニングベクターは、治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列 をクローニングベクターに容易に挿入させる多重クローニングベクターを含む。 一般に、多重クローニングベクターは、「稀有」制限酵素部位；すなわち１０， ０００塩基対毎に約１個から１００，０００塩基対毎に約１個までの頻度で真核 遺伝子に見出される部位を含む。かくしてこの発明に従う適切なベクターは、多 重クローニング部位の適切な制限部位で標準技術によりクローニングベクターを 切断し、次いで治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列をクローニン グベクターに結合することで形成される。 ベクターは次いで必要な包膜材料を提供するヘルパーアデノウイルスを使って 感染性ウイルス粒子にパッケージされる。望ましくは、ヘルパーウイルスは、ヘ ルパーウイルスがそれ自身を包膜しないために欠損包膜シグナルを持つ。使用さ れる包膜欠損ヘルパーウイルスの例は、グレイブル、他、ウイルス学ジャーナル 、６６巻、７２３−７３１ページ（１９９２年）に記載されている。 ベクターおよび包膜欠損ヘルパーウイルスは、感染性ウイル ス粒子の生成のために適切な細胞系に形質移入される。形質移入は電気穿孔法、 リン酸カルシウム沈殿、顕微注射、あるいはプロテオリポソームを通して行われ る。適切な細胞系は、必ずしもそれに限定されないが、ヒーラ細胞あるいは２９ ３（胚腎臓上皮）細胞である。感染性ウイルスベクター粒子は次いで中枢神経系 の細胞に形質導入され、これにより治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮ Ａ配列が宿主の細胞により発現される。 も一つの実施例において、ベクターは、アデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウ イルス３′ＩＴＲ；アデノウイルス包膜シグナル；治療薬をコード化する少なく とも１個のＤＮＡ配列；および治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配 列を制御するプロモーターよりなる。このベクターは少なくとも多数のアデノウ イルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列から離れているが、すべてのＥ２およびＥ４Ｄ ＮＡ配列およびアデノウイルス主要遅発プロモーターにより促進されるアデノウ イルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列とは離れていない。１実施例におい て、ベクターはまたＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなるグループから選択される 少なくとも１個のＤＮＡ配列の少なくとも一部から離れている。も一つの実施例 において、ベクターは少なくとも多数のアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配 列から離れており、またＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列の一つから離れており、更に 他のＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列の一部から離れている。 更にも一つの実施例において、ベクターは少なくとも多数の Ｅ１およびＥ３ＤＮＡ配列から離れており、Ｅ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなる グループから選択される少なくとも１個のＤＮＡ配列の少なくとも一部から離れ ており、またアデノウイルス主要遅発プロモーターにより促進されるアデノウイ ルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列から離れている。 このようなベクターは、望ましい実施例において、標準の技術に従ってまずシ ャトルプラスミドを構築することで作られ、このシャトルプラスミドは５′末端 で始まり「臨界左末端要素」を含有し、それはアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデ ノウイルス包膜シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列；プロモーター（アデ ノウイルスプロモーターあるいは外部プロモーターのいずれであってもよい）； 三部分リーダー配列、多重クローニング部位（前記記載のもの）；ポリＡシグナ ル；アデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントを含む。こ のＤＮＡセグメントは修飾あるいは突然変異アデノウイルスを用いる相同性組換 えのための基質として役立ち、この配列は、例えばゲノムの３３２９塩基対から ６２４６塩基対以下のアデノウイルス５ゲノムのセグメントを包含する。このプ ラスミドはまた選択マーカーおよび複製起点を含む。この複製起点は細菌性複製 起点である。このようなシャトルプラスミドの代表例はｐＡＶＳ６を含み、図１ ４で示される。治療薬をコード化する望ましいＤＮＡ配列は、次いで多重クロー ニング部位に挿入される。次いで相同組換えが少なくとも多数のＥ１およびＥ３ アデノウイルスＤＮＡ配列を欠失している修飾あるいは突然変異アデノウイルス を使って行われる。このような相同組換 えは、ＣａＰＯ4沈殿によりシャトルプラスミドおよび修飾アデノウイルスを２ ９３細胞などのヘルパー細胞系に同時形質移入することで実施される。このよう な相同組換えの際に、組換えアデノウイルスベクターが形成され、それはＮｏｔ Ｉ部位と相同組換え断片の間のシャトルプラスミドから誘導されたＤＮＡ配列 、および相同組換え断片と３′ＩＴＲの間のＥ１およびＥ３欠失アデノウイルス から誘導されたＤＮＡを含む。 一つの実施例において、相同組換え断片は、アデノウイルス５ゲノムのヌクレ オチド３３２９から６２４６でオーバーラップする。 このような相同組換えを通じてベクターは形成され、このベクターは、アデノ ウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル；Ｅ１ａエンハンサー配列； プロモーター；三部分リーダー配列；治療薬をコード化する少なくとも１個のＤ ＮＡ配列；ポリＡシグナル；少なくとも多数のＥ１およびＥ３アデノウイルスＤ ＮＡ配列から離れているアデノウイルスＤＮＡ；およびアデノウイルス３′ＩＴ Ｒを含む。このベクターは次いで２９３ヘルパー細胞系のようなヘルパー細胞系 に形質移入されるが、この細胞系はＥ１ａおよびＥ１ｂＤＮＡ配列を含みそれは ウイルス複製に、また感染性ウイルス粒子の生成に必要なものである。 感染性ではあるが複製欠損ウイルス粒子よりなるベクターは治療薬をコード化 する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含み、宿主にある中枢神経系の悪化状態を治 療するのに有効な量で投与される。一つの実施例において、ベクター粒子は１ プラーク形成単位から約１０14プラーク形成単位まで、望ましくは約１×１０6 プラーク形成単位から約１×１０13プラーク形成単位までの量で投与される。宿 主はヒトあるいは非ヒト動物宿主である。 ベクター粒子は患者への投与に適した調剤許容担体と併用して投与される。担 体は液状担体（例えば食塩水）、もしくは固型担体、例えば顕微担体ビードであ る。 この発明は神経系の腫瘍の治療と関連して説明されるが、この発明の方法は他 の治療遺伝子製品をクモ膜下腔、脳室内、脊髄内注射、クモ膜下腔への注射、あ るいは脈絡叢への注射後に脳脊髄液を通じる循環により神経系に運ぶために使用 される。このような遺伝子製品は、神経伝達物質、神経修飾物質、神経ホルモン 、および神経親和性因子であるタンパク質およびペプチドを含む。かくしてこの 発明の方法は、必ずしもそれに限定されないが、外傷性損傷、卒中、アルツハイ マー病、パーキンソン病、ハンチントン病、成人病、精神障害、および脳脊髄液 に新しい化合物を導入し、あるいはそこに現存するタンパク質の水準を修飾する ことにより影響を受ける各種の疾患を含む神経系の悪化状態を治療するのに使用 することが出来る。かくしてこの発明は神経系の非癌性悪化状態を治療するため に、神経系の正常細胞あるいは組織を形質導入するために使用出来る。 この発明はここで以下の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範囲 はそれに限定されるものではない。 実施例１ Ａ．ｐＧｌＴｋＳｖＮａの構築 以下はｐＧｌＴｋＳｖＮａの構築を説明し、その概略図は図６で示される。こ のベクターはレトロウイルスプロモーターおよび細菌性遺伝子、ＳＶ４０プロモ ーターで駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮｅｏR）により 調節される単純性ヘルペスウイルスＩより得られるチミジンキナーゼ（ｈＴＫ） 遺伝子を含有する。ＨＴＫ遺伝子はＤＮＡ類似体アシクロビルおよびガンシクロ ビルに感受性を与え、一方ＮｅｏR遺伝子製品はネオマイシン類似体、Ｇ４１８ に耐性を与える。 ｐＧｌＴｋＳｖＮａを作るために、３段階のクローニング戦略が用いられた。 まず、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）はｐＧｌＴｋを 生産するためにＧｌプラスミドバックボーンにクローンされた。第２に、ＮｅｏR 遺伝子（Ｎａ）はｐＳｖＮａを作るためにプラスミドｐＳｖＢｇにクローンさ れた。最後にＳｖＮａはｐＳｖＮａから切除され、ｐＧｌＴｋＳｖＮａを生産す るためにｐＧｌＴｋに結合された。 プラスミドｐＧｌＴｋＳｖＮａはプラスミドＰＧｌから誘導された（図３）。 プラスミドｐＧｌはｐＬＮＳＸから構築された（パーマー、他、血液、７３巻、 ４３８−４４５ページ）。プラスミドｐＧｌの構築戦略は図１で示される。５′ モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥ ｃｏＲＩ断片、３′ＬＴＲを含有する３．０キロベースＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ断 片、細菌性複製起点およびアンピシ リン耐性遺伝子は別個に分離された。７個のクローニング部位を含有するリンカ ーがＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ断片をそれ自身に閉じるために用いられ、かくしてプ ラスミドｐＧＯが生成した。プラスミドｐＧＯは、５′ＬＴＲを含む１．６キロ ベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧＯのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより ベクタープラスミドｐＧｌを生成するために使用された（図３）。かくしてｐＧ ｌ（図３）は、ＭｏＭｕＳＶから誘導される５′部分、真正ＡＴＧ出発コドンが ＴＡＧに突然変異されたｇａｇの短部分（ベンダー、他、１９８７年）、５′か ら３′までＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏ Ｉ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｐａＩ、およびＣｌａＩを含む５４塩基対多重クローニン グ部位（ＭＣＳ）、更に７７６４から７８１３塩基対から得るＭｏＭｕＬＶの３ ′部分（数はヴァン ビーバレン、他、コールド スプリングハーバー、２巻、 ５６７ページ、１９８５年に記載されたもの）で構成されたレトロウイルスベク ターバックボーンよりなる（図２）。ＭＣＳはｐＧｌプラスミド、ｎｅｏr遺伝 子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ヒグロマイシンr遺伝子、およびＳＶ４０プロ モーターの非切断制限酵素のスクリーンにもとづいて最大数のユニーク挿入部位 を生成するように設計された。 ｐＢｇ（図４）を構築するために、βガラクトシダーゼをコード化する３．０ キロベースＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩｌａｃＺ断片がｐＭＣ１８７１から分離され た（ファルマチア）。この断片はβガラクトシダーゼ読み取り枠の５′および ３′最末端を欠いている。完全ｌａｃＺ読み取り枠を修復し、ｌａｃＺ遺伝子の 各末端に制限部位を加えるリンカーが合成され、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｌａ ｃＺ断片に結合された。５′リンカーの構造は以下の通りであった：５′−１／ ２ＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ−ＮｏｔＩ−ＳｎａＢＩ−ＳａｌＩ−ＳａｃｌＩ−Ａｃｃ Ｉ−ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ−ＩＩＩ２７塩基対リボソーム結合シグナルーコザッ クコンセンサス配列／ＮｃｏＩ−ｌａｃＺ読み取り枠の最初の２１塩基対−１／ ２ＢａｍＨＩ−３′。３′リンカーの構造は以下の通りであった：５′−１／２ 突然変異ＥｃｏＲＩ−ｌａｃＺ読み取り枠の最後の５５塩基対−ＸｈｏＩ−Ｈｉ ｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ−１／２ＥｃｏＲＩ−３′。リンカー内の制限部位が選ば れたが、それは制限部位がネオマイシン耐性遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子 、ヒグロマイシン耐性遺伝子、あるいはＳＶ４０プロモーターには存在していな いためであった。２７塩基対リボソーム結合シグナルは５′リンカーに含まれて いたが、それはｍＲＮＡの安定性を高めるものと考えられる（ハーゲンビュッヒ レ、他、細胞、１３巻：５５１−５６３ページ、１９７８年。およびローレンス ならびにジャクソン、分子生物学ジャーナル、１６２巻：３１７−３２４ページ 、１９８２年）。コザックコンセンサス配列(5′-GCCGCCACCATGG-3′)はｍＲＮ Ａ翻訳の開始をシグナルするために示された（コザック、核酸研究、１２巻：８ ５７−８７２ページ、１９８４年）。コザックコンセンサス配列はＡＴＧ翻訳開 始コドンをマークするＮｃｏＩ部位を含む。 ｐＢＲ３２２（ボリヴァール、他、遺伝子、２巻、９５号、１９７７年）はＮ ｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、アンピシリン耐性遺伝子および細菌性複製 起点が分離された。前記の結合された５′リンカー−１ａｃＺ−３′リンカーＤ ＮＡがｐＢｇを生成するためにｐＢＲ３２２ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩベクターに結 合された。ｐＢｇはシャトルプラスミドとして有用であるが、それはｌａｃＺ遺 伝子が切除され、も一つの遺伝子がｌａｃＺ遺伝子の５′および３′末端に存在 するいずれかの制限部位に挿入出来るためである。これらの制限部位はｐＧｌプ ラスミド内で反復されるために、シャトルプラスミド構築物内で代替するｌａｃ Ｚ遺伝子あるいは遺伝子群は容易にｐＧｌに移ることが出来る。 単純性ヘルペスウイルスタイプＩチミジンキナーゼ遺伝子（ジェンバンク、ア クセス番号Ｖ００４６７、引用例としてここにとり込まれる）を含有する１．７ ４キロベースＢｇＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ断片がｐＸｌプラスミド（ヒューバーマン 、他、指数細胞研究、１５３巻、３４７−３６２ページ（１９８４年）、引用例 としてここにとり込まれる）から切除され、ＤＮＡポリメラーゼＩの大型（クレ ノウ）断片で平滑化され、プラスミドｐＧｌＴｋを形成するためにｐＧｌ多重ク ローニング部位のユニークＳｎａＢＩ部位に挿入された（図５）。 プラスミドｐＳＶ２Ｎｅｏから得られる３３９塩基対ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩ ＩＩ ＳＶ４０初期プロモーター断片（サザン、他、分子および応用遺伝子学ジ ャーナル 、１巻：３２７−３４１ページ（１９８２年））が次いでプラスミド ｐＳｖＢｇを生成するためにユニークＮｒｕＩ部位にあるｐＢｇに挿入された（ 図５）。ｐＳｖＢｇプラスミドはｌａｃＺ遺伝子を除去するためにＢｇｌＩＩ／ ＸｈｏＩで消化され、その末端はクレノウ断片を使って平滑化された。ネオマイ シン耐性遺伝子のコード配列を含む８５２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ断片が ｐＮ２（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７−１６ ５０ページ（１９８７年））から除去され、クレノウ断片で平滑化され前記の通 り生成された２．５キロベース平滑ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片に結合され、ｐＳ ｖＮａを生じた。ＳＶ４０プロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子カセットが次 いで１１９１塩基対ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＳｖＮａから除去さ れた。ｐＧｌＴｋプラスミドは次いでＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ｐ ＧｌＴｋＳｖＮａを生成するためにＳＶ４０／ｎｅｏr断片で結合された（図６ ）。 Ｂ．生産者細胞系の生成 生産者細胞系はベクタープラスミドおよびパッケージング細胞から作られた。 ＰＡ３１７／ＧｌＴｋＳｖＮａ生産者細胞は、前に臨床的に関連するレトロウイ ルス生産者細胞系を作るのに使用されたものと同じ一般的な技術により作られた 。ベクタープラスミドｐＧｌＴｋＳｖＮａ ＤＮＡは、環境栄養性パッケージン グ細胞系、ＰＥ５０１に形質移入された。ＰＥ５０１形質移入細胞から得た上澄 みは、次いで両栄養性パッケージング細胞系（ＰＡ３１７）を形質移入するため に使用された。形質移入された生産者細胞クローンは、ＮｅｏR遺 伝子を含むクローンを選択するためにＧ４１８含有培地で生育された。クローン は次いでレトロウイルスベクター生産のため滴定された。いくつかのクローンは 、次いでさらなる検査のために選択され、最終的に一つのクローンが臨床用とし て選択された。 ５×１０5ＰＥ５０１細胞（ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９ ９０ページ（１９８９年）、引用例としてここにとり込まれている）は、１００ ｍｍ皿で１０ｍｌ高のグルコースダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）成長培地 を皿当り１０％ウシ胎児血清（ＨＧＤ１０）で補足したもので平板培養された。 細胞は３７℃、５％のＣＯ2／大気で一晩保温された。 プラスミドｐＧｌＴｋＳｖＮａは次いで下記の手続きによりＤＮＡ ５０μｇ を使ってＣａＰＯ4沈殿によりＰＥ５０１細胞に形質移入された。 ＤＮＡ ５０μｇ、１０×ＣａＣｌ2５０μｌ、および無菌水４５０μｌが１ ５ｍｌのポリプロピレン管で混合され、ＤＮＡ ５０μｇ、２×ＰＢＳ ０．５ ｍｌ（Ｎ−Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシルエチル）−２−アミノエタンスルホン 酸 ５０ｍＭ、ＮａＣｌ ２８０ｍＭ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．５ｍＭ、およびｐＨ６ ．９５、ヘペス５０ｍＭを含む）を含むＣａＣｌ2溶液０．２５Ｍを生成した。 ＤＮＡ溶液は次いで室温で約２０分から１時間放置された。皿は次いで３５℃で ＣＯ2 ３％／大気で一晩保温された。 一晩の保温に続き最適沈殿の行われた培養皿は次いで選別さ れた。皿は次いで塩および塩溶液を除去するためにＰＢＳで再び洗われた。ＨＧ Ｄ１０培地１０ｍｌが次いで皿に加えられ、皿は３７℃でＣＯ2 ５％／大気で 約４８時間保温された。 ４８時間後、上澄みが形質移入細胞から収集された。皿は次いでＰＢＳ ５ｍ ｌで洗われた。ＰＢＳが次いで除去され、細胞はトリプシン−ＥＤＴＡで除去さ れた。細胞の連続希釈液が次いでＨＧＤ１０およびＧ４１８ ０．８ｍｇ／ｍｌ を含む培地の６個の１００ｍｍ皿に接種された。 細胞皿６個は毎日検査された。培地は必要に応じて死滅細胞を除去するために 交換された。生細胞あるいはコロニーは、コロニーがクローンするのに十分な大 きさになる（つまりコロニーが裸眼で見える）ようなサイズにまで成長させられ た。ＰＥ５０１細胞のこのようなコロニーから得られるＰＥ５０１環境栄養性含 有上澄みは約５乃至１０ｍｌの量で収集され、冷凍チューブに入れられ、−７０ ℃の液体窒素で凍結された。 ＰＡ３１７（ミラー他、分子細胞生物学、６巻：２８９５−２９０２ページ、 （１９８６年））は次いで４．５ｇ／ｌのグルコース、グルタミン補足剤、およ びウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％を含むダルベッコ修飾必須培地で１００ｍｍ平 板当り５×１０4細胞数の濃度で平板培養された。 ＰＥ５０１上澄みは次いで解凍され、ポリブレン８μｇ／ｍｌが上澄みに加え られた。培地はＰＡ３１７細胞の平板から吸引され、ウイルス上澄み７乃至８ｍ ｌが加えられ一晩培養された。 ＰＥ５０１上澄みは次いで除去され、細胞は約１８−２０時 間新鮮なＰＢＳ１０％を再補給された。１日後、培地はＦＢＳ１０％およびＧ４ １８（８００μｇ／ｍｌ）で取り替えられた。平板は次いでモニターされ、培地 は必要に応じて死滅しつつあるあるいは死滅した細胞を除去するために新鮮なＦ ＢＳ１０％およびＧ４１８で取り替えられた。平板はＧ４１８耐性コロニーの外 観を少なくとも１０乃至１４日の間モニターされた。 クローニングリングがすべての選択されたコロニーの周りに置かれた。細胞は トリプシン化され、ＨＧＤ１０ ５ｍｌにヒポキサンチンアミノプテリンチミジ ン（ＨＡＴ）１×の加えられた６個のウエル皿でのウエルで培養された。 もしコロニーが密集に成長したなら、それらはトリプシン化され、１００ｍｌ 皿で培養された。１００ｍｌ皿のクローンが密集に近づくと、両栄養性ベクター を含む上澄みは除去され、細胞をペレット化してとり出すために１．２００乃至 １，５００ｒｐｍで５分間遠心分離された。 上澄みは６個の冷凍小びん（１ｍｌ／小びん）にアリコートされ、液体窒素に 貯蔵された。ＰＢＳ５ｍｌが皿に加えられ、細胞はすすぎ洗いされ、ＨＧＤ１０ を再補給され、ＤＭＳ０ １０％の１ｍｌアリコートで液体窒素により凍結され た。レトロウイルスベクターの最高力価を持つものを決定するために異なったク ローンがモニターされた。 ＰＡ３１７／ＧｌＴｋＳｖＮａ．５３として設計された最高力価を持つクロー ンが、マスター細胞バンクを生産するために使用された。 Ｃ．ｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａの調製 プラスミドｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａ（図８）は、図７で示される図形表示に従っ て調製された。それはｐＧｌＴｋＳｖＮａ（図６）から部分読み取り枠を除去し て調製された。 ｐＳＰＴＫ５′の生成： プラスミドｐＧｌＮａＳｖＴｋから得たＤＮＡが制限酵素ＢｇＩＩＩおよびＳ ｍａＩで消化され、１１６３塩基対ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）断片がア ガロースゲル電気泳動により分画され、分解された。この断片は、ＴＫ５′未翻 訳領域の５６塩基対およびＴＫ翻訳読み取り枠の１１０７塩基対を含有する。１ １６３塩基対断片はプラスミドベクターｐＳＰ７３（プロメガ コーポレイショ ン，マジソン，ウイスコンシン）に結合され、後者は制限酵素ＢｇＩＩＩおよび ＳａｍＩで消化されていた。生成する結合プラスミド構築物はｐＳＰＴＫ５′と 名付けられたが、それはこのプラスミドがＴＫ読み取り枠の５′部分は含むが、 読み取り枠の最後の２１塩基対および翻訳終止コドンを欠いているためである。 ＴＫ読み取り枠のＰＣＲ： ｐＧｌＮａＳｖＴｋプラスミドＤＮＡはそれをＢｇＩＩＩで消化することによ り線形化された。線形化ｐＧｌＮａＳｖＴｋはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） の鋳型として使用されたが、このＰＣＲはＴＫ読み取り枠の最初の１７塩基対を 含む正プライマー(5′-GCACCATGGCTTCGTACCCCTGC-3′)、およびＸｈｏＩ部位の 相補配列、ＴＫ翻訳終止コドン、およびＴＫ読み取り枠の最後の１９塩基対を含 む逆プライマー (5′-CCTGCATCGATTCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCC-3′)を使用するＰＣＲであっ た。ＰＣＲ３０サイクルが以下のように行われた：９４℃で１分間および６０℃ で２分間、更に７２℃の延長サイクルで最終７分間であった。ＰＣＲ製品はアガ ロースゲルで分画され、全長ＴＫ読み取り枠を含む期待された１２１５塩基対断 片が分離された。分離断片は制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、消化 製品はアガロースゲルで分画され、４２０塩基対が分離された。この断片は、Ｔ Ｋ読み取り枠のアミノ酸２４９−２５０をコードするヌクレオチドにあるＰｓｔ Ｉ部位から、ＴＧＡ翻訳終止コドンのすぐ下流にあるＸｈｏＩ部位まで延びる。 ｐＳＰＴＫ１の生成： ｐＳＰＴＫ５′はＰｓｔＩで消化され、ｐＳＰ７３ベクターおよびＴＫ読み取 り枠の５′部分を含む３９９３塩基対は、続くアガロースゲル電気泳動で分離さ れた。この３９９３塩基対断片はＴＫ読み取り枠（前記）の３′末端を含むＰＣ Ｒ生成４２０塩基対ＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片に結合された。結合プラスミドＤＮ Ａは大腸菌ＤＫ５αコンピテント細胞（被感染能力を持つ細胞）（ジブコ／ＢＲ Ｌ，ゲイザーズバーグ，メリーランド）に形質転換され、アンピシリン耐性コロ ニーから得られるＤＮＡは制限酵素消化によりスクリーンされた。全長ＴＫ読み 取り枠を含有すると見られるプラスミドはｐＳＰＴＫ１と名付けられた。いくつ かのｐＳＰＴＫ１クローンから得られるＤＮＡはＰｓｔＩ部位からＸｈｏＩ部位 に至るまでの領域（ＰＣＲにより生成された領域）において、ジデオキシ配列さ れた。ｐＳＰＴＫ１クローン＃４はこの領域で期待されたＴＫ配列に適合するこ とが判明し、ｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａの構築に使用された。 ｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａの生成： ｐＳＰＴＫ１ ＤＮＡはＢｇｌＩＩで消化され、５′張出し末端は大腸菌ＤＮ ＡポリメラーゼＩのデオキシヌクレオチドおよびクレノウ断片で消化ＤＮＡの培 養により修復された。ＤＮＡは次いでＴＫ５′−未翻訳領域の５６塩基対および 全長ＴＫ読み取り枠を持つ１２５５塩基対断片を生成するためにＸｈｏＩで消化 された。この平滑／ＸｈｏＩ断片は、ＳｎａＢＩおよびＳａｌＩで消化されたｐ ＧｌＸＳｖＮａ ＤＮＡに結合された。 ｐＧｌＸＳｖＮａを構築するために、１．２キロベースＳｖＮａ断片がＳａｌ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでＰｓｖｎａ（前記パートＡ）から切除された。この断 片はＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＧｌに結合された。結合プラ スミドはｐＧｌＸＳｖＮａと名付けられ、「Ｘ」は多重クローニング領域を示す 。 ｐＧｌＸＳｖＮａおよびＴＫ結合から得られたＤＮＡ製品はＤＨ５αに形質転 換され、アンピシリン耐性コロニーから得られたＤＮＡは前記の通りスクリーン された。診断用制限酵素消化によるＴＫ断片を含むものと見られるプラスミドは ｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａと名付けられた（図８）。クローン＃２は５′ＬＴＲの初 めから３′ＬＴＲの末端までジデオキシ配列化され、無傷ＴＫ読み取り枠を含む ことが発見された。 ｐＧｌＴｋ１ＳｖＮａは前記記載の方法（前記パートＢ）によりＰＡ３１７と の組合せにより生産者細胞を生産するために使用された。このような生産者細胞 系は生産者細胞系ＰＡ３１７／ＧｌＴｋ１ＳｖＮａ．７と呼ばれた。 Ｄ．単純性ヘルペスチミジンキナーゼ生産者細胞およびベクターに対する脳脊髄 液の影響；レトロウイルスベクター力価の評価 生産者細胞クローンＰＡ３１７／ＧｌＴｋＳｖＮａ．５３およびＰＡ３１７／ ＧｌＴｋ１ＳｖＮａ．７のそれぞれが６ウエル皿（１２ウエル／クローン）に４ −５×１０5細胞／ウエル（３７℃、ＣＯ2５％で２４時間あるいはほぼ密集にな るまで）で接種された。 一対のウエルは成長培地（０％、５％、１０％、２５％、５０％、および７５ ％）で脳脊髄液（ＣＳＦ）の濃度を高めていったものに露出された。培養は顕微 的に（１０分、１時間、４時間、２４時間および４８時間の）４８時間期間にわ たり細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察された。上澄みサンプルが次いで採取され力 価を検定された。別個に、力価の知られている上澄みサンプル（ＧｌＴｋＳｖＮ ａ．５３およびＧｌＴｋ１ＳｖＮａ．７）がＣＳＦと混合され力価が測定された 。検定上澄みの連続希釈（１０0、１０-1、１０-2、１０-3）が８μｇ／ｍｌの ポリブレンを含む成長培地で作られ、次いで６０分間室温で培養された。３ｍｌ の希釈物がＮＩＨ ３Ｔ３細胞を含む各ウエルに加えられた。皿は３２℃および ＣＯ2５％で培養され、１６乃至２０時間後に培 地がＧ４１８（ネオマイシン類似体）０．８ｍｇ／ｍｌを含む成長培地に取代え られ、３７℃で培養された。細胞は（ネオマイシン耐性遺伝子で形質導入され、 かくしてＧ４１８の毒性効果から保護される細胞から創出する）個別のコロニー が顕微鏡下で見えるようになるまでこの培地で成長した。細胞は次いでメチレン ブルーで染色され、コロニーが計数された。各希釈液でｍｌ当りの力価がウエル 内の平均コロニー数を希釈要素で乗じ３ｍｌで割ることで計算して決定された。 平均力価はすべての希釈液の力価の平均値を計算することにより決定された。Ｃ ＳＦで希釈しない正の対照として使用された上澄みは、１×１０5および４×１ ０6粒子／ｍｌ（ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａ．７）および１０3から１０4 粒子／ｍｌ（ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３）の間のネオマイシン耐性遺 伝子力価を有していた。 ヒト脳脊髄液に露出後１０分、１時間、４時間、２４時間、および４８時間で 生産者細胞に細胞変性効果は見られなかった。ＣＳＦの変化した濃度のものに露 出された各クローンに対するベクターの生産は以下の表Ｉで示される。 前記結果は、生産者細胞によるベクター生産がヒト脳脊髄液に対する露出では 影響を受けなかったことを示している。 同様に、（既知の力価の上澄みから得た）遊離した単純性ヘルペスチミジンキ ナーゼベクター力価は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞での培養前６０分露出の間脳脊髄液 により影響されなかった。 Ｅ．単純性ヘルペスチミジンキナーゼベクター生産者細胞およびガンシクロビル の注射の毒性研究 ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞が４匹のＳＤラット（Spraqu e-Dawley rats）（２３０乃至３５０ｇの重量）のそれぞれに大槽カテーテルで 短い吸入麻酔の下で注射（１０5細胞／１０μｌ）された。ラットは脳および脊 髄をヘマトキシリンおよびエオシン染色で組織試験するために細胞注射された後 ５日目および１０日目に犠牲にされた。神経性ある いは全身性毒性の何らの徴候も見ることはなく、また髄膜反応、あるいは実質脳 もしくは脊髄損傷の組織上の何らの証拠も見られなかった。 も一つの実施例において、ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞が 大槽クモ膜下腔カテーテルで４匹のＳＤラット（それぞれ２３０乃至３５０ｇの 重量）に注射（１０6細胞／１０μｌ）され、またガンシクロビルが７日後（腹 腔内に３０ｍｇ／ｋｇ／日で）投与された。動物はヘマトキシリンおよびエオシ ン染色で脳および脊髄の組織検査のためにガンシクロビル治療後３日、６日、１ ０日および１４日に犠牲にされた。脳および脊髄全体にわたって軟髄膜あるいは 実質損傷の炎症の証拠は見られなかったし、また、ラットは研究期間全体で神経 性あるいは全身性毒性の徴候を示さなかった。 も一つの実施例においてこれは非ヒト霊長類に関連し、６ｋｇから８ｋｇまで の重さの６匹のメスアカゲザルがそれぞれＰＢＳ １ｍｌに懸濁された（Ｘ−ガ ル染色で検知するための）ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞１× １０7およびβガラクトシダーゼ生産者細胞１×１０7の脳室内混合物を受け入れ た。ＧｌＢｇＳｖＮ．２９として知られるβガラクトシダーゼ生産者細胞系がＰ Ａ３１７を、ｌａｃＺ遺伝子が単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に代替し ているベクターであるｐＧｌＢｇＳｖＮａで形質移入させることにより形成され た。細胞注射１週間後にガンシクロビルが２匹のサルに（１０ｍｇ／ｋｇ／日で １４日間）静脈内で与えられ、（別の）２匹のサルには（ガンシクロビルが） （２００μｇ／日で１４日間）クモ膜下腔で与えられた。（また別の）２匹のサ ルは生産者細胞の注射を受けるに留まった。静脈内ガンシクロビル治療を受けた サルは、肩甲骨間部に位置する皮下アクセスポートで右外部頸静脈を経由する心 臓カテーテルの手術を受けた。動物は定位枠に置かれ、正中切開は矢状縫合およ び前頂に露出するように行われた。定位座標を使用し、脳室カテーテルが右側脳 室に置かれ、その位置は圧力追跡で確認された。生産者細胞は１分間にわたり注 射された。クモ膜下腔ガンシクロビルを受けた２匹のサルにおいては、脳室カテ ーテルは適所に残され、肩甲骨間部にある皮下アクセスポートに連通された。 ガンシクロビル治療の終了後、各グループから１匹ずつ計３匹のサルが、脳、 脊髄および末梢器官の組織評価のために犠牲にされた。残る３匹のサルは長期の 観察および連続反復クモ膜下腔細胞注射用に保存された。 血液および脳脊髄液のサンプルが細胞注射の前、細胞注射７日後、ガンシクロ ビル治療７日後、およびガンシクロビル治療終了時に採取された。脳脊髄液はタ ンパク質およびグルコース量を細胞学的に分析された。血液サンプルは従来の化 学および血液学プロフィールで分析された。 ガドリニウム強化脳ＭＲＩスキャンが、細胞注射前、細胞注射７日後、ガンシ クロビル治療７日後、およびガンシクロビル治療終了後で得られた。犠牲にされ なかった３匹のサルは、それぞれ細胞注射４５日後に追加のＭＲＩスキャンを受 けた。スキャンは脳室腫脹、脳室上衣増強、髄膜増強、塊状病巣、ある いは出血の証拠が評価された。 細胞注射およびガンシクロビル治療はすべてのサルで十分に許容された。治療 ３ケ月後まで神経系欠損あるいは全身性毒性の徴候はいずれの動物にも生じなか った。 末梢血計数および血清化学プロフィールは、研究全体を通じてすべての動物で 正常なままであった。脳脊髄液のタンパク質およびグルコース水準は正常であっ た。もっとも脳室内ガンシクロビル治療を受けた２匹のサルが軽い脳脊髄液細胞 増加症を成長させたが、それも無症候性であり、髄膜炎にまでは進行しなかった 。 いずれのサルも脳のＭＲＩスキャンで変化は観察されなかった。研究全体を通 じて脳室腫脹、軟髄膜増強、脳室上衣増強、塊状病巣あるいは出血の証拠は存在 しなかった。 犠牲とされた３匹のサルそれぞれの末梢器官は肉眼解剖試験では正常に見えた 。脳および脊髄の組織試験は構造的損傷、炎症、脈管炎、あるいは髄鞘脱落の証 拠を示さなかった。 ガンシクロビル治療動物（クモ膜下腔および静脈内投与の双方）の側脳室の脈 絡叢検査は正常な毛細管構造および毛細管ネットワークの破壊を示した。対照動 物の脈絡叢は正常に見えた。Ｘ−ガル染色は脈絡叢細胞のび漫性染色を示してい たが、βガラクトシダーゼベクターでの形質導入の証拠は脳実質あるいは脊髄で 検知されなかった。 生産者細胞の最初の注射の３ケ月後、犠牲にされなかったサルはより用量の多 い生産者細胞（ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞２×１０8をβ ガラクトシダーゼ生産者 細胞１×１０7と全量２ｍｌのＰＢＳで混和したもの）の反復脳室内注射を受け た。細胞注射７日後、２匹のサルは１４日間静脈内ガンシクロビル（１０ｍｇ／ ｋｇ／日）を受けた。臨床検査、血液および脳脊髄液サンプルの分析により毒性 が毎日評価され、脳のガドリニウム増強ＭＲＩスキャンが注射前、ガンシクロビ ル治療終了時および細胞注射９週後に行われた。また大槽および腰椎脳脊髄液サ ンプルが、脳室細胞注射の１日後、３日後、５日後に経皮吸引で集められ、クモ 膜下腔における生産者細胞およびベクター粒子分布の変遷の型を評価するために ベクター力価および細胞学で評価された。 レトロウイルスベクター力価は以下のように評価された。 培養ＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、ウシ胎児血清１０％を含むＤＭＥＭ培地で、１× １０5細胞数／ウエル皿で成育された。検定される脳脊髄液の連続希釈（０から ２×１０-2）がポリブレン８μｇ／ｍｌを含む増殖培地で行われた。希釈溶液２ ｍｌが各ウエルに加えられた。既知の力価のレトロウイルス上澄みの希釈液が正 の対照として使用された。皿は３２℃、ＣＯ2５％で保温された。１６−２０時 間後、培地はＧ４１８（ネオマイシン類似体）０．８ｍｇ／ｍｌを含む増殖培地 で取替えられた。細胞はこの培地で（ネオマイシン耐性遺伝子で形質導入され、 かくしてＧ４１８の毒性効果から保護される細胞から生じる）個別のコロニーが 顕微鏡下で見えるようになるまで成育された。細胞は次いでメチレンブルーで染 色され、コロニーが計数された。各希釈液でのｍｌ当り力価はウエル内のコロニ ーの平均数を計算し、希釈因子で乗じ、２ｍｌで割ることにより 決定された。平均力価はすべての希釈液の力価の平均を計算することにより決定 された。正の対照として使用された上澄みは１×１０5および４×１０6粒子／ｍ ｌの間のネオマイシン耐性遺伝子を有している。 神経性妥協あるいは全身性毒性は反復治療および３ケ月の追跡調査のコースで は起こらなかった。血液および脳脊髄液プロフィールは研究全体を通して正常な ままであった。脳のＭＲＩスキャンは軟髄膜シグナル特性には変化をもたらさず 、脳室腫脹あるいは実質損傷の証拠もなかった。ベクター力価は反復細胞注射の ２４時間後に脳脊髄液サンプル内で検出された。比較出来る力価は大槽および腰 椎脳脊髄液サンプルで発見された。 も一つの実験において、ＰＢＳ １０ｍｌの全量内でＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳ ｖＮａ．５３生産者細胞１０6とＧ１ＢｇＳｖＮ．２９生産者細胞１０6の混合物 が前頂および硬膜に関連して定位枠（座標軸ＡＰ−．９２、Ｌ−１．４、背腹− ３．６）を使用し４匹のＳＤラット（２３０ｇから３５０ｇまでの重量）のそれ ぞれの両側脳室に５分間２３ゲージ針および５０μｌのハミルトン注射器を用い て注射された。細胞注射の７日後に、２匹のラットはガンシクロビルを受け入れ （１４日間毎日３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）、一方２匹のラットは対照として役 立った。ガンシクロビル治療の終了時に、ラットは４％のホルムアルデヒドの心 臓内灌流で犠牲にされ、脳は組織学試験のために除去された。脈絡叢は側脳室お よび第４脳室から切開され、内因性βガラクトシダーゼ活性を遮 断するためにＥＧＴＡで予備培養した後にＸ−ガルで染色された。非ガンシクロ ビル処理およびガンシクロビル処理ラットの両方から得た脈絡叢は細胞注射を受 けなかった対照動物に比べていずれも側脳室および第４脳室で著しいＸ−ガル染 色を示した。ガンシクロビル治療ラットおよび対照ラットの脈絡叢の同じ破壊で Ｘ−ガル染色をした場合、その差異は最小であった。 も一つの実施例において、６匹のラット（ＳＤラット、２３０−２５０ｇ）の それぞれが留置大槽カテーテルを経由して低濃度のガンシクロビル（毎日５μｇ ／ＰＢＳ １０μｌで１４日間）あるいは高濃度のガンシクロビル（毎日２００ μｇ／ＰＢＳ １０μｌで１４日間）クモ膜下腔に注射された。ラットは神経性 毒性の証拠を毎日試験され、染色の組織学試験のためにガンシクロビル治療の１ ４日後に犠牲にされた。治療動物のいずれも神経系後遺症の証拠は見られず、ま た高濃度および低濃度のクモ膜下腔ガンシクロビル治療ラットの両方において、 脳および脊髄の組織学的外観は、髄膜反応もしくは実質損傷の兆候を示さなかっ た。 Ｆ．神経膠肉腫を持つラットへの生産者細胞投与 この実験では、フィッシャーラットにある髄膜癌腫症の９Ｌ同系神経膠腫モデ ルが使用された（コーイストラ、他、癌研究、４６巻、３１７−３２３ページ（ １９８６年））。 生産者細胞系ＰＡ３１７／ＧｌＴｋＳｖＮａ．５３がウシ胎児血清１０％（ハ イクローン ラボラトリーズ，インコーポレイテッド，ローガン，ユタ）、Ｌ− グルタミン２ｍＭ（ジブコ ＢＲＬ、ゲイザーズバーグ，メリーランド）、ペニシリン５０単位／ｍｌ（ジブ コ）、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ジブコ）、ファンギゾン２．５μｇ ／ｍｌ（バイオメディガルズ インコーポレイテッド，コスタメーサ，カリフォ ルニア）よりなるダルベッコ修飾イーグル培地での培養で養われた。生産者細胞 はＴ−１７５フラスコで成長した。生産者細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ（ジブコ ）で５−１０分間３７℃での培養によりクモ膜下腔注射の前に収穫された。細胞 はハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（バイオフルイズ，インコーポレイテッド ，ロックビル，メリーランド）に収集され、２回洗われ、注射用として８×１０6 細胞／ｍｌで再懸濁された。 生産者細胞のあるものはまた複製コンピテントレトロウイルス４０７０Ａで感 染された。細胞をそのようなレトロウイルスで感染させるために、４０７０Ａウ イルス含有上澄みが０．２２μｍフィルターを通して生産者細胞の単層に濾過さ れた。培養物の２継代が生産者細胞を４０７０Ａレトロウイルスで均質に感染さ れるようにされた。 ２３０−３００グラムの重さのフィッシャー３４４ラットが腹腔内（ｉ．ｐ． ）ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ、フォート ドッジ ラボラトリーズ，インコーポ レイテッド，フォート ドッジ，アイオワ）およびザイラジン（１０ｍｇ／ｋｇ 、モーベイ コーポレイション，ショーニー，カンサス）を用いて麻酔された。 無菌ＰＥ−１０管が大槽を経由して上胸部クモ膜下腔に挿入され、皮下軟組織に 固設され、また頸背部の皮膚を貫通した。管は次いで無菌着脱自在スチールロッ ドで遮断され た。ラットは次いで５乃至７日間観察され、その間に神経性欠損が成長するラッ トはいずれもこの研究から除去された。ラットはカテーテルを保護するためにか ご当り１匹ずつ入れられ、口腔からアモキシリン（２０ｍｌ／ラット／日の平均 水消費で計算された水で５ｍｇ／ｋｇ）、およびデキサメタゾン（テクアメリカ ，カンサスシティ．ミズーリ）を研究期間中０．５ｍｇ／ｋｇ／２０ｍｌの量で 投与された。１５９匹のラットは次いで吸入麻酔（Ｎ2Ｏ：Ｏ2：ハロタン混合物 ）を使って再麻酔され、８×１０4同系９Ｌ神経膠肉腫細胞を１０μｌハミルト ン注射器で採取した。１００匹のラットが８×１０4ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖ Ｎａ．５３生産者細胞（複製コンピテントウイルスで同時感染していないもの） で注射された。２８匹のラットは４０７０Ａ複製コンピテントレトロウイルスで 同時感染した８×１０4ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞を注射 された。２５匹のラットは８×１０4ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者 細胞で注射された。また６匹のラットβガラクトシダーゼ遺伝子を含むベクター 粒子を生成する８×１０4ＧｌＢｇＳｖＮ．２９生産者細胞で注射された。（こ のような生産者細胞はＰＡ３１７細胞系をｐＧｌＢｇＳｖＮａベクターで形質移 入することで形成され、このベクター内では１ａｃＺ（βガラクトシダーゼ）遺 伝子が単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子と代替する）。カテーテルは次い で食塩加リン酸緩衝液１０μｌで水流しされ、スチールロッドで閉じられた。β ガラクトシダーゼ生産者細胞系で注射されたラットは注射後３日、６日、および １０日目に犠 牲にされた。脳および脊髄が除去され、組織部分がβガラクトシダーゼを発現す る細胞を確認するためにＸ−ガル組織化学手法で染色された（ラム、他、１９９ ３年）。 ＰＡ３１７／ＧｌＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞、あるいは４０７０Ａウイル ス同時感染のＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞は７日後ガンシク ロビルで治療を始め、あるいはラットは食塩水の腹腔内用量を受けた。ガンシク ロビルを受けたラットは、腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ ＰＢＳ）あるい はクモ膜下腔注射（２５μｇ／ｋｇ、あるいは６００μｇ／ｋｇ、ＰＢＳ１０μ ｌ）により１４日間薬剤を受けた。低濃度のクモ膜下腔用量は５乃至１０μｇ／ ｍｌの脳脊髄液濃度を達成するために選択され、これは試験管内研究で有効な抗 腫瘍濃度であることが示された（カルバー、他、１９９２年。ラム、他、１９９ ３年）。高濃度のものはクモ膜下腔へ薬剤を過剰に受渡しするために選択された 。 ラットは毎日神経性欠損の進み具合を観察され、１２時間乃至２４時間で死に 導く急速に進行する対不全麻痺および対麻痺をいつも殆ど明示していた。マンテ ル−ヘンツェル試験（マンテル、癌化学療法報告、５０巻、１６３−１７０ペー ジ（１９６６年））は、生存実験におけるガンシクロビルおよび食塩水治療ラッ トの間の生存率を比較するために使用された。独立した実験が行われたために、 統計分析およびｐ値の決定は同じ実験グループ内でのみ実施された。生存率（日 数）の平均期間は以下の表ＩＩで示される。グループ１からグループ４（２グル ープはガンシクロビルで治療され、２グループは食塩 水で治療された）のそれぞれに追加された４匹のラットが治療の７日後に犠牲に され、脊髄が組織学的に検査されたことは注目すべきである。これらのラットは 生存率の統計データには含まれなかった。 グループ１に関して、食塩水治療ラット比較して、ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖ Ｎａ．５３生産者細胞の注射７日後のラットにガンシクロビルが腹腔内に投与さ れた時、生存率は著しく延びたことを前記結果が示している。グルー１のラット の生存曲線は図９で示される。 グループ２に関して、ガンシクロビル治療ラットの生存率は、食塩水治療ラッ トのものと比較して延長していた。しかし、グループ２のガンシクロビル治療ラ ットの平均生存時間は４０７０Ａ複製コンピテントレトロウイルスで感染されな かった生産者細胞で治療されたラットと著しい差異は見られなかった。脊髄の組 織学的外観は両グループで類似していた。グループ２のラットの生存曲線は図１ ０で示される。 グループ３および４に関しては、食塩水治療ラットの軟髄膜に侵入した腫瘍の 濕潤薄層が、ガンシクロビル治療動物では完全に根絶やされたことを脊髄の組織 学検査が示していた。 グループ５および６に関して、両グループの生存率は食塩水治療ラットに比べ てガンシクロビル治療のものが延びていた。ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７ 細胞による治療はＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３細胞による治療よりも優 れているように見えるが、その差異は統計的に有意というものではなかった。 脳および脊髄の軟髄膜被覆への腫瘍浸潤は、ユニークな治療上の挑戦を提供す る。この疾病のび漫的性質は放射線放射および化学治療を含む攻撃的なアプロー チを必要とし、しかしその結果、限定された腫瘍応答、生存率の限界的な延長、 および著 しい羅患率を生じることになる。 レトロウイルス媒介遺伝子治療は髄膜癌腫症の硬化に際して魅力的な治療上の オプションを提供する。レトロウイルスベクターは複製不能であり従って一つの 腫瘍細胞から他の腫瘍細胞への感染増殖及び遺伝子転移が出来ないため、ベクタ ーの効果的な配分が出来るだけ多くの腫瘍細胞に遺伝子転移を最大にすることが きわめて重要になる。効果的なベクターの受渡しはベクター生産者細胞の脳脊髄 液への注射により達成される。単純性ヘルペスチミジンキナーゼを含むレトロウ イルスベクター粒子は、循環するベクター生産者細胞から連続的に放出され、こ れにより腫瘍浸潤髄膜の全表面に到達する。自殺遺伝子（自己不活化遺伝子）の 増殖性腫瘍への選択的転移は、ガンシクロビルの硬化に対しそれを感作的にする 。 生産者細胞培養から得られる上澄みでのレトロウイルス力価の試験管内測定に おいて、各種濃度のヒトＤＳＦに培養細胞を露出して４８時間後においても、ベ クター生産の著しい減少が見られなかったことが明らかとなった。 ここで報告されたＨＳｔｋ遺伝子による生体内腫瘍形質導入に係る抗腫瘍効率 の研究は、著しい殺腫瘍性効果が全身性（腹腔内）ガンシクロビル治療で達成出 来ることを示した。クモ膜下腔ガンシクロビルを受けた髄膜癌腫症を持つラット の脊髄の組織学検査は、この髄膜癌腫症モデルの脊髄の周縁に特徴的に浸潤する 腫瘍の薄層を殆ど完全に根絶やしたことを示した。 第三者効果、すなわち単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝 子を含むベクターで形質導入された細胞の近辺にある非形質導入腫瘍細胞がガン シクロビルで完全に殺すことが出来る過程は、これまでに説明されている。この ような第三者効果の主要な成分の一つは、ギャップ結合を経て形質導入細胞から 非形質導入細胞へのリン酸化ガンシクロビルの転移に結合された。局所ガンシク ロビルが軟髄膜にある腫瘍細胞の表面層を相互作用する時に、この第三者効果が 生成され、脊髄の周辺にある浸潤腫瘍の有効な腫瘍拒絶を説明するものとなる。 実施例１に記載された髄膜癌腫症モデルに使用された９Ｌ腫瘍細胞の攻撃的性 質および急速な倍加時間は、腹腔内ガンシクロビルで治療されたラットで観察さ れる生存率の延長が腫瘍細胞の著しい殺害を表すことを示している。 ベクター−生産者細胞のクモ膜下腔受渡しおよび自殺遺伝子のび漫性浸潤髄膜 癌腫症への転移は、ガンシクロビルによる全身性治療後生存率を著しく延ばした という事実に帰着した。このようなアプローチが癌患者における破壊的な合併症 の治療にも一つの治療オプションを提供出来ることをこのデータが示している。 実施例２ 髄膜癌腫瘍のためのヒト遺伝子治療法 髄膜癌腫症を患う２０人のヒト患者が、フェースＡ、フェースＢ、フェースＣ 、およびフェースＤという名称の４グループにわけられる。フェースＡは３患者 、フェースＢは３患者、フェースＣは４患者、またフェースＤは１０人の患者を 含む。 各患者は脳脊髄液にアクセスするための脳室内カテーテルと連通するオマヤレ ザバーを受け入れる。オマヤレザバーは小さい気泡型レザバーおよび脳室カテー テルよりなる。オマヤレザバーの設置は丁度冠状縫合の前にある頭部の左前部の 髪をそる必要がある。この区域は次いで手術の用意をされ減菌布をかけられる。 皮膚は局所麻酔で浸潤され、小さな切開が冠状縫合の丁度前で正中線の右３ｃｍ の所で行われる。頭蓋のバー孔開口が行われ、カテーテルが次いでその側の側脳 室にさし込まれる。カテーテルはレサバーに付着され、皮膚は次いで閉ざされる 。 レザバー設置の後、患者は４８時間回復することが許され、その時間患者は抗 生物質を受ける。４８時間後、およびマウス生産者細胞投与の前に、脳脊髄液の サンプルがレザバーから取り出され、悪性細胞および各種の腫瘍マーカーの存在 がテストされる。 フェースＡの患者は２×１０9ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者細胞 をオマヤレザバー経由で脳室内注射で受ける。生産者細胞注射の７日後、患者は １４日にわたり１日２回体重５ｍｇ／ｋｇの用量で１時間にわたる静脈内注入に よりガンシクロビルを与えられる。 フェースＢの患者は２×１０9ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者細胞 をオマヤレザバー経由で右側脳室への注射で受け、また２×１０9ＰＡ３１７／ Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者細胞の注射を脊髄カテーテル経由で腰椎クモ膜下腔 に受ける。患者が細胞を注射されてから７日後に、患者はそれぞれ １４日にわたり１日２回体重５ｍｇ／ｋｇの用量で１時間にわたる静脈内注入に よりガンシクロビルを与えられる。 フェースＣの患者は２×１０9ＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者細胞 の２回の注射をオマヤレザバー経由で右側脳室に、計４×１０9細胞が右側脳室 に与えられ、また、２×１０9PＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ．７生産者細胞の２ 回の注射を脊髄カテーテル経由で腰椎クモ膜下腔に計４×１０9細胞がクモ膜下 腔に与えられた。患者が生産者細胞を注射されてから７日後に、患者は１４日に わたり１日２回体重５ｍｇ／ｋｇの用量で１時間の静脈内注入でガンシクロビル が与えられる。 フェースＡ、ＢおよびＣの患者の脳脊髄液サンプルが１日２回患者が生産者細 胞を与えられて以後最初の７日間、また生産者細胞を与えられてから１４日、２ １日、３５日、および４８日目にベクター力価が検定され、それ以後はベクター 力価の月次調査が続けられる。脳脊髄液サンプルはまた、腫瘍マーカーを分析さ れる。脳脊髄液、サンプルの評価、および患者内の毒性に出会わなかったという 所見に際して、フェースＤの患者１０人がフェースＣの患者と同じ実験記録に従 って治療される。 実施例３ アデノウイルス遺伝子の髄膜癌腫症への転移 Ａ．ｐＡｖＳ６の構築 アデノウイルス構造シャトルプラスミドｐＡｖＳ６はクローニング技術にもと づくポリメラーゼ連鎖反応を含む標準クロー ニング技術を用いるいくつかの段階で構築された。まず、２９１３塩基対Ｂｇｌ ＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ断片がＡｄ−ｄ１３２７から除去され、平滑断片としてピ ーブルースクリプト(pBluescript)ＩＩ Ｋｓ−（ストラータジェン、ラホーラ 、カリフォルニア）（図１１）のＸｈｏＩ部位に挿入された。Ａｄ−ｄ１３２７ （ジンマッパーヤ、他、細胞、３１巻、５４３ページ（１９８３年））は、アデ ノウイルス５ゲノムの２８５９１乃至３０４７４塩基（あるいは７８．５から８ ４．７までの地図単位）を含みＥ３領域に位置を占めるＸｂａＩ断片が欠失して いることを除けば、アデノウイルス５と同一である。この断片の指向（オリエン テーション）は、ＢｇｌＩＩ部位がピーブルースクリプトＩＩ ＫｓのＴ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近く、またＨｉｎｄＩＩＩ部位はピーブルース クリプトＩＩ ＫｓのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近いものであっ た。このプラスミドはｐＨＲと指名された（図１１）。 第２に、ＩＴＲ、包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウ イルス三部分リーダー（ＴＰＬ）配列および結合配列は、ＰＣＲ増幅を用いて一 つのブロックとして組立てられた（図１２）。ＩＴＲおよび包膜シグナル（Ａｄ −ｄ１３２７の１−３９２配列〔ジェンバンク、アクセス＃Ｍ７３２６０、Ａｄ ５からの配列と同一〕）は、ＮｏｔＩあるいはＡｓｃＩ制限部位を含むプライマ ーを使用してＡｄ−ｄ１３２７から一緒に増幅された（増幅１）。ラウス肉腫ウ イルスＬＴＲプロモーターは、ＡｓｃＩ部位およびＳｆｉＩ部位を 含むプライマーを使用してプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ（２０９から６０５配列： インヴァイトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア）から増幅された（増幅２ ）。増幅１および２からのＤＮＡ製品はＮｏｔＩプライマーおよびＳｆｉＩプラ イマーのみで「オーバーラップ」ＰＣＲ法を用いて結合された（増幅３）。反応 １および反応２からのそれぞれの初期ＤＮＡ増幅製品のＡｓｃＩ含有末端の間で の相補性が増幅中のこれら２個の部分の結合を可能にした。次いでＴＰＬが、そ れぞれＳｆｉＩおよびＸｂａＩ部位を含むプライマーを使ってＡｄ−ｄ１３２７ で１６時間感染させられた２９３細胞から分離されるＭＲＮＡから作られるｃＤ ＮＡから増幅された（増幅４）（Ａｄ−ｄ１３２７の６０４９から９７３０配列 ［ジェンバンク、アクセス＃Ｍ７３２６０、Ａｄ５からの類似の配列と同一のも の］）。増幅反応３および４から得たＤＮＡ断片は、次いでＮｏｔｉおよびＸｂ ａＩプライマーでＰＣＲを用いて結合され（増幅５）、かくして完全遺伝子ブロ ックを生成した。 第３として、ＩＴＲ−包膜シグナル−ＴＰＬ断片は次いで精製され、ＮｏｔＩ およびＸｂａＩで切断され、ＮｏｔＩ，ＸｂａＩ切断ｐＨＲプラスミドに挿入さ れた。このプラスミドはｐＡｖＳ６Ａと指名され、その指向は断片のＮｏｔＩ部 位がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ部位の隣に来るようにされた（図１３）。 第４としては、ＳＶ４０初期ポリＡシグナルはＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片とし てＳＶ４０ ＤＮＡから除去され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理されプラスミドｐＡｖＳ６−（図１３）のＳａｌＩ部 位に挿入され、ｐＡｖＳ６を生成した（図１３および１４）。Ｂ．Ａｖ１ＬａｃＺ４の構築 組換え体、複製欠損アデノウイルスベクターＡｖ１ＬａｃＺ４は核標的βガラ クトシダーゼ酵素を発現するが、これは２段階で構築された。まずＳＶ４０ Ｔ 抗原のアミノ酸１から４までをコード化するＤＮＡよりなる１個の転写単位はそ の後に（核標的ペプチドPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Valを含む）ＳＶ４０ Ｔ抗 原のアミノ酸１２７から１４７までをコード化するＤＮＡが続き、更に大腸菌β −ガラクトシダーゼのアミノ酸６から１０２１までをコード化するＤＮＡが続く が、この転写単位は従来のクローニングおよびＰＣＲ技術を使って構築され、ｐ ＡｖＳ６ｎ−ＬａｃＺを生成するためにｐＡｖＳ６のＥｃｏＲＩ部位に置かれた （図１５）。 感染性複製欠損Ａｖ１Ｌａｃｚ４は相同性組換えにより２９３細胞内で組立て られた。これを達成するために、プラスミドｐＡｖＳ６ｎ−ＬａｃＺはＫｐｎＩ での切断により線形化された。ゲノム型アデノウイルスＤＮＡはハート抽出法(H irt extraction)により精製Ａｄ−ｄ１３２７ウイルスから分離され、Ｃ１ａＩ で切断され、大型（約３５キロベース）断片はアガロースゲル電気泳動により分 離され、精製された。Ｃ１ａＩ断片はすべての第１世代アデノウイルスベクター のバックボーンとして使用され、これから誘導されるベクターはＡｖ１として知 られる。 線形プラスミドＤＮＡ（ｐＡｖＳ６ｎ−ＬａｃＺ）の５マイクログラムおよび Ａｄ−ｄ１３２７の大型ＣｌａＩ断片の２．５μｇが次いで混合され、リン酸カ ルシウム沈殿法により２９３細胞の皿に同時形質移入された。１６時間後、細胞 はシープラーク寒天（Sea Plaque agar，海溶菌斑寒天）２％および培地２ｘの １：１混合物で上塗りされ、３７℃、５％炭酸ガス／大気の渥潤化環境でプラー クが現れるまで（約１乃至２週間）保温培養された。プラークは選別され、細胞 内ベクターは３サイクルの凍結融解で培地に放出された。溶菌液は遠心分離によ り細胞砕片を除いて清澄化された。（３００μｌの）プラークは２９３細胞の感 染、ベクター放出および清澄化の第１ラウンドのために以下のように使用された 。 ２９３細胞の１個の３５ｍｍ皿がプラーク溶菌液１００μｌプラスＩＭＥＭ− ２（ＩＭＥＭプラスＦＢＳ２％、グルタミン２ｍＭ（バイオ ホウィッタッカー ０４６７６４））４００μｌプラスＩＭＥＭ−１０（改良最少必須培地（イーグ ル）プラスグルタミン２ｘプラスウシ胎児血清１０％容量／容量プラス補助グル タミン２ｍＭ（バイオ ホウィッタッカー））１．５ｍｌで感染され、細胞変性 効果、円形外観および「ブドウ状」房が観察されるまで約３日間保温培養された 。細胞および上澄みが収集され、ＣＶＬ−Ａと指名された。ＡｖｌＬａｃＺ４ベ クター（その構成概略図は図１６で示される）はＣＶＬ−Ａの３サイクルの凍結 融解で放出された。次いで２９３細胞の６０ｍｍ皿がＣＶＬ−Ａ ０．５ｍｌプ ラスＩＭＥＭ−１０ ３ｍｌで感染され、前記のように 約３日間保温培養された。この感染体から得る細胞および上澄みは次いで同じよ うに３回の凍結融解サイクルが処理され、ＣＶＬ−Ｂと名付けられた。ＣＶＬ− Ｂ ３ｍｌプラスＩＭＥＭ−２ ４２ｍｌ混合物のアリコート２．２５ｍｌが２ ９３細胞の１５ｃｍ皿２０皿それぞれを感染するため使用された。９０分の保温 培養後、ＩＭＥＭ−１０が追加され細胞変性効果が観察されるまでの約３日間保 温培養が続けられた。ＣＶＬ−Ｂからの細胞および上澄みが収穫され、５０ｍｌ 円錐形チューブに収集され、１０分間、１，５００ｒｇｍで遠心分離された。細 胞ペレットは貯蔵部で再懸濁され、２０℃冷凍装置で貯えられた。Ｃ．神経膠肉腫を持つラットへのＡｖｌＬａｃＺ４ウイルス投与 ＡｖｌＬａｃＺ４ウイルスのバッチが２９３細胞（アデノウイルス５ゲノムの 左方１１％を含むヒト腎臓上皮細胞系）をＡｖｌＬｚｃＺ４で１０プラーク形成 単位（ｐｆｕ）／細胞の多数の感染で生産された。この細胞での複製欠損ベクタ ーの成長は、ウイルス粒子生産に必要なＥ１Ａ構造上活性領域がこれらの細胞の トランス活性化領域として利用出来るために可能となる。ＡｖｌＬａｃＺ４ウイ ルスは精製されて２−３×１０11ｐｆｕ／ｍｌの濃度となった。 同系フィッシャーラット９Ｌ神経膠肉腫細胞がダルベッコ修飾イーグル培地（ ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清１０％（ハイクローン ラボラトリーズ，インコーポ レイテッド，ローガン，ユタ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（ジブコＢＲＬ、ゲイザ ーズ バーグ，メリーランド）、ペニシリン５０単位／ｍｌ（ジブコ）、ストレプトマ イシン５０μｇ／ｍｌ（ジブコ）およびファンジゾン２．５μｇ／ｍｌ（ＩＣＮ バイオメディカルズ，インコーポレイテッド，コスタメーサ，カリフォルニア） を加えたＴ−１７５組織培養フラスコで繁殖された。 髄膜癌腫症の９Ｌ神経膠腫モデルが使用された。（クーイストラ、１９８６年 ）。２３０−３５０ｇの１２匹のフィッシャー３４４ラットが麻酔を受け、無菌 ＰＥ−１０チューブが大槽経由で上胸部クモ膜下腔に挿入され、皮下軟組織に固 設され、頸背部の皮膚を貫通された。チューブは次いで、可撤スチールロッドで 閉塞された。ラットは５乃至７日間観察され、その間神経系欠損を示したいずれ のラットもこの研究から排除された。ラットはカテーテルを保護するために一匹 ずつ籠に入れられ、アモキシリン（５ｍｇ／ｋｇ／日、ビーチャム ラボラトリ ーズ、ブリストノレ、テネシー。２１ｍｌ／ラット／日の平均水消費量で計算さ れたもの）およびデキサメタゾン（テク アメリカ，カンサスシティ，ミズーリ ）０．５ｍｇ／ｋｇ／２０ｍｌを研究の継続期間中経口で受けた。ラットは次い で再麻酔を吸入麻酔（Ｎ2Ｏ：Ｏ2：ハロタン混合物）を使って施され、ハンク平 衡塩類溶液１０μｌで８×１０4同系９Ｌ神経膠肉腫細胞が１０μｌハミルトン 注射器を使ってクモ膜下腔に注射された。ＡｖｌＬａｃＺ４ウイルス粒子（ＰＢ Ｓ１０μｌに１×１０9あるいは２×１０8）が次いで腫瘍接種の日に６匹のラッ トに注射され、６匹のラットには接種７日後に注射された。カテーテルはＰＢＳ １０μｌの追加で水洗いされ、ス チールロッドで封入された。ラットはベクター注射の３日、７日および１０日後 に犠牲にされた。脳および脊髄は除去され、切開され、β−ガラクトシダーゼを 発現する細胞を確認するためＸ−ガルで染色された。 β−ガラクトシダーゼ発現は、Ｘ−ガル組織化学染色を用いて検出された（ボ ンディ、他、組織化学、７６巻、１５３−１５８ページ（１９８２年））。Ｘ− ガルを用いる染色は、インドリルがβ−ガラクトシダーゼの作用および続く酸化 と自己カップリングによりＸ−ガルから遊離する時にβ−ガラクトシダーゼ発現 細胞を青に変え、これが青色反応製品を形成する。培養細胞の試験管内染色は細 胞懸濁液で行われた。対比染色はヌクレアファースト赤法（ＮＦＲ法）（シュミ ットーゲーエムベーハー アンド カンパニー，コンゲン，ドイツ）ですべての 組織標本に対して行われた。 ９Ｌ細胞およびアデノウイルスベクターの同時クモ膜下注射の３日後に、腫瘍 塊の相同性形質導入がカテーテルのすぐ傍で検出された。希有ポジティブ染色ク モ膜下細胞もまた確認された。腫瘍細胞およびアデノウイルスベクターの同時注 射の７日後、多くの形質導入腫瘍細胞がカテーテル道近くで見られたが、また腫 瘍塊自身の中でも検出出来た。クモ膜下腫瘍は接種１０日後には著しく大きくな り、またクモ膜下腫瘍浸潤が認められた。この時点で形質導入腫瘍細胞は遠く離 れた腫瘍沈着物およびカテーテル道それ自身で検出された。予期された通り、形 質導入細胞の割合は、拡張する腫瘍塊および形質導入腫瘍細胞の希釈の結果とし て初期に観察されたものより低かった。 定着した軟髄膜腫瘍にＡｖｌＬａｃＺ４を注射した３日後に、β−ガラクトシ ダーゼ活性はカテーテルの周りにまた腫瘍塊の表面に沿うその両方で神経根を取 り巻く腫瘍浸潤巣を含む広範に浸潤した腫瘍の表層で検出された。形質導入の深 さは腫瘍のクモ膜下面からのいくつかの細胞層に限定されたが、一方腫瘍塊の中 心部はＸ−ガルポジティブ細胞を示さなかった。ベクター注射の７日後、形質導 入細胞は移植カテーテルの領域内に限定された。もっともいくつかのＸ−ガルポ ジティブ細胞は上胸脊髄および馬尾で腫瘍浸潤巣を確認することができた。ベク ター注射の１０日後かなりの形質導入が移植カテーテルに近接して検出されたが 、早い時点で観察されたものに比べてずっと小さい割合で検出された。 低濃度のＡｖ１ＬａｃＺ４ベクター（２×１０8ｐｆｕ／１０μｌ）が腫瘍摂 取と同時にもしくは定着した髄膜腫瘍内に注射された時に同じようなパターンが 観察された。形質導入率はしかし高濃度ベクターの注射で観察されたものよりも 著しく低かった。 前記の結果は、髄膜癌腫症を持つラットのクモ膜下区画へのＡｖ１ＬａｃＺ４ の注射が、クモ膜下腔の浸潤腫瘍にある形質移入遺伝子の形質導入および発現を 生じたことを示している。かくしてベクターは、脳脊髄液内で循環し、注射部位 から離れた地域で脳髄液に露出された髄膜腫瘍細胞を形質導入することを示した 。 実施例４ 脈絡叢にあるヒトＧＭ−ＣＳＦの発現 胚形成の間に脳室上衣細胞層の折り重ねから成長する分化した脳室内器官であ る脈絡叢は、毛細管の網目を取り囲む線毛上皮細胞よりなる。それは脳脊髄液（ ＣＳＦ）を脳室内に活発に分泌する。それは脳および脊髄の表面を洗いまた脳お よび脊髄のフィルヒョー−ロバン腔に深く浸み込ませるためにクモ膜下腔内で循 環する（レンネルズ、他、脳研究、３２６巻、４７−６３ページ（１９８５年） ）。それが形成される脳室上衣細胞とは対照的に、脈絡叢上皮および内皮細胞は 正常な成人脳ではもっとも有糸分裂活性の高い細胞であり（ジョンソン、他、癌 、１３巻、３３６−３４２ページ（１９６０年）；カプラン、解剖学的記録、１ ９７巻、４９６−５０２ページ（１９８０年））、また従ってレトロウイルスベ クターにより形質導入を優先的に受けやすいものである。この脈絡叢細胞の標的 形質導入は神経成長因子、神経伝達物質、酵素、およびホルモンなどの治療用タ ンパク質の治療あるいは研究のためにＣＦＳに絶えず分泌することを可能にする 。 神経叢の生体内形質導入およびＣＳＦへの遺伝子製品の分泌が行われるかどう かを評価するために、ヒト顆粒細胞マイクロファージコロニー剌激因子（ｈＧＭ −ＣＳＦ）遺伝子が、このアプローチのためのモデル分泌遺伝子として選択され た。ＰＡ３１７レトロウイルスベクターの生産者細胞（ミラー、他、分子細胞生 物学 、６巻、２８９５−２９０２ページ（１９８６年））はＧｌＧｍＳｖＮａと して知られるｈＧＭ−ＣＳＦレトロウイルスベクターを生産するために操作され 、これはモロニーマウス白血病ウイルスから誘導され（マクラ クリン、他、ウイルス学、１９５巻、１−５ページ（１９９３年））、５′長末 端反復（ＬＴＲ）プロモーターおよびレトロウイルスパッケージングシグナルの 下流にヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む。このベクターはまたＳＶ４０プロモータ ーにより内部的に促進されるネオマイシン耐性遺伝子を含む。Ｇ１ＧｍＳｖＮａ ベクターはＮＩＨ ３Ｔ３細胞から誘導される両栄養性レトロウイルスベクター 生産者細胞系ＰＡ３１７によりパッケージされる。クローンされ、Ｇ−４１８選 択の行われたヒトＧＭ−ＣＳＦベクター生産者細胞（ＰＡ３１７／Ｇ１ＧｍＳｖ Ｎａ．９）は培養で維持され、脳室注射の直前にトリプシン化で収穫された。 １５匹のフィシャー３４４ラット（２５０−３００ｇｍ）はＰＢＳ２０μｌで 懸濁された２×１０6ＰＡ３１７／Ｇ１ＧｍＳｖＮａ．９生産者細胞を定位枠（ 注射の座標：前項、および硬膜からそれぞれＡＰ −１．０ｍｍ、Ｌ １．５ｍ ｍ、およびＤＶ ３．５ｍｍ）を用いて側脳室へ両側性注射された。脳脊髄液お よび脈絡叢標本を得るためにラットは細胞注射後１日、２日、３日、４日および ７日に犠牲にされた（３匹の動物は各時点のための３幅対の標本を作るために前 記それぞれの日に犠牲にされた）。脳は除去され、側脳室および第４脳室の脈絡 叢は手術用顕微鏡を用いて切開された。 ＤＮＡが脈絡叢標本から抽出され、１．ベクター生産者細胞のｐＰＡＭ３ヘル パープラスミドにある包膜遺伝子に特異的にアニールするプライマー（ミラー、 他、体細胞分子遺伝学、１２巻、１７５−１８３ページ（１９８５年））、およ び ２．ｈＧＭ−ＣＳＦ読み取り枠に特異的にアニールするプライマー、でポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅された。かくしてｐＰＡＭ３配列増幅不 在下でのヒトＧＭ−ＣＳＦ配列の増幅はヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子による脈絡叢形 質導入の証拠を提供する。脈絡叢の形質導入はベクター生産者細胞注射３日後の １匹のラットおよびベクター生産者細胞注射７日後の３匹のラットにおけるＰＣ Ｒ製品についてのサザン分析により文書として提供された。脈絡叢の残りの標本 は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ配列増幅に加えてｐＰＡＭ３配列増幅が、脈絡叢に付着し 形質導入効果の見積りを許さなかった生存生産者細胞をこれらの標本が含んでい たということを示す証拠を提示した。脈絡叢から得たＰＣＲ帯の定量評価は、７ 日間で脈絡叢の約０．４％がｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子で形質導入された。ヒトＧＭ −ＣＳＦに対するマウスモノクローナル抗体を使用する免疫組織化学（マカタ、 他、免疫学ジャーナル、１４７巻、１２６６−１２７２ページ（１９９１年）） は、ヒトＧＭ−ＣＳＦベクター生産者細胞の脳室内注射の後の脈絡叢上皮細胞に あるヒトＧＭ−ＣＳＦの原位置発現を確認した。 脳脊髄液標本は大槽を手術で露出し毛細管を使用するＣＳＦの吸引により集め られた。サンプルはヒトＧＭ−ＣＳＦの酵素結合イムノソルベント検定法（エリ ザ）により評価された。最低のエリザ標準曲線値（１０ｐｇ／ｍｌ）よりも大き なヒトＧＭ−ＣＳＦの水準がすべてのＣＳＦサンプルで検出された。ＣＳＦで見 出されたヒトＧＭ−ＣＳＦのかなりの割合はヒトＧＭ−ＣＳＦベクター生産者細 胞それ自身が寄与したもので あった。しかしベクター生産者細胞が脈絡叢サンプルに全然存在しなかったおそ い時点で１１０ｐｇ／ｍｌも高いヒトＧＭ−ＣＳＦ水準が検出された。もしヒト ＧＭ−ＣＳＦがバルクフローメカニズムにより脳脊髄液から片付けられる場合に は、サイトカインの測定水準は、生産者細胞によりこれまで分泌されてきたヒト ＧＭ−ＣＳＦを衰えさせながら形質導入脈絡叢上皮および残渣からの分泌の組合 せから生じたことになる。 これらの結果は中枢神経系の正常な成分をレトロウイルスベクターで標的化す る可能性の原則を証明するものとなる。遺伝子ベクターのアクセスおよび受渡し は、脳室内での露出された脈絡叢およびクモ膜下腔内でＣＳＦを常時流すことで 頭蓋脊髄軸に沿った遺伝子製品の分布により促進される。脈絡叢形質導入の後、 ＣＳＦに分泌される遺伝子製品の発現の持続時間および水準は変化するが、それ は注射の繰返しおよび組織特異的プロモーターを含むベクターの使用を通じて調 節することが出来る。このアプローチはタンパク質をＣＳＦに運ぶ薬剤受渡しシ ステムとしての治療に適用され、あるいは特異遺伝子製品をＣＳＦに連続的に運 ぶ効果を研究するための研究手段として使用出来る。 この明細書で引用されるすべての特許、公開情報（公開特許出願を含む）、お よびデータベースエントリーは、あたかも個別のそのような特許、公開情報、お よびデータベースエントリーのそれぞれが特別にまた個別に引用文献としてとり 込まれるべきことが示された。 しかしこの発明の範囲は前記の特異な実施例に限定されるべ きものではないことは理解されねばならない。この発明は特に記述されたもの以 外にも実施することが出来、しかもなお以下に示す特許請求の範囲内にある。Detailed Description of the Invention                         Nervous system gene therapy   The invention is not necessarily limited to, for example, a nervous system such as meningeal carcinomatosis. Treatment of deteriorating conditions of the nervous system including tumors. More specifically, the central nervous system evil Modified viral particles comprising a nucleic acid sequence encoding a therapeutic agent for the treatment of an activated condition Expression vectors such as viral vectors contained in the producing virus producer cell line Is administered to the host's purulent spinal fluid, which causes the modified virus to encode the therapeutic agent. The nucleic acid sequence to be transferred to the cells of the central nervous system, It relates to treating deteriorating conditions of the central nervous system.   Meningeal carcinomatosis, also known as leptomeningeal carcinomatosis, accounts for about 5% to about 5% of all cancer patients. Occurs in up to 20%, most commonly from lung cancer, breast cancer and melanoma to the brain and spinal cord. It results from the metastatic spread of cancers such as leptomeningeal coatings. (Claymon and others,Breast cancer Research and treatment , Vol. 9, pp. 213-217 (1987). Liao, etc.Ta iwan I Hsueh Hui Tsa Chin , 91, 299-303 (1992). During ~ River, other,Neuro-oncology, 13: 81-89 (1992). Nitenz, other,Belgian Society of Ophthalmology215, pages 109-115 (1985). Shapiro,The Western Journal of Medicine. Volume 154, 350- 351 pages (1991). The standard treatment for meningeal carcinomatosis is radiation therapy and if It consists of subarachnoid administration of chemotherapeutic drugs. All nerve axes The need to irradiate the patient causes severe myelosuppression, which the patient can tolerate. Limit the amount of systemic or subarachnoid chemotherapy that can occur (Shapiro, 1991) .   Transfer of herpes simplex thymidine kinase gene to tumor cellsIn vivoRetro virus A new approach to the treatment of solid brain tumors by mediated metastasis is the antiviral drug GANCY. It has been described to sensitize clovir (Culver, et al.,Science, 25 Volume 6, pp. 1550-1552 (1992). Ram, etc.Cancer researchVolume 153, 83-88 (1993)). Ganciclovir is transduced by tumor cells It preferentially reacts with phosphoric acid to prevent DNA synthesis. Gene transfer is herpes simplex Infection of tumor cells with a mouse retroviral vector carrying the midine kinase gene , And the integration of this gene into the genome of the host cell. these The vector is continuously expressed by mouse vector producer cells injected into this tumor mass. Produced. Cells in which retovirus actively synthesizes DNA (ie, replicating cells) Preferential transduction of tumor cells is achieved because they can only infect. This appro Is now being evaluated in clinical trials (Oldfield, et al.,Human heredity Child therapy 4, pp. 39-69 (1993)).   Meningeal carcinomatosis and other deteriorating conditions of the nervous system make one application of this approach. provide. For example, the brain may be injected into the ventricular system, lumbar thrust, or the subarachnoid space. Vector producer cells injected into the spinal fluid circulate in the cerebrospinal fluid, -(Eg retroviral vector particles) are continuously released. Such viral vectors contact the tumor-infiltrating leptomeninges and transduce replicating tumor cells. In addition, systemic administration of ganciclovir allows selective eradication of tumors.   According to one aspect of the invention, treating a deteriorating condition of the nervous system in a chordate host One method is provided. This method applies to the cerebrospinal fluid of the chordate host in the central nervous system. By administering an expression vector capable of transducing cells to express the therapeutic agent in It becomes. The expression vector provides a therapeutic agent to treat a deteriorating condition of the central nervous system. Nucleic acid sequence to be converted into a nucleic acid sequence. The expression vector cures a host central nervous system deteriorating condition. Administered in an effective amount to treat. Cells transduced with the expression vector are tumor Cells and normal (ie non-tumor) cells, which are the choroid plexus epithelium and endothelium It is a cell-like cell.   The term "chordata" as used herein refers toChordateAny animal in the gate, In other words, it means any animal that contains notochord such as spinal cord or similar structures. This Animals such as, but not necessarily limited to (including human and non-human mammals) ) Includes mammals, reptiles, amphibians, birds, and fish.   The term "nervous system" as used herein refers to nervous system function and / or motor support. It means any organ of an animal that has a function of coordination. Such an organ is not always Indispensable for, but not limited to, the brain, spinal cord, cranial nerves, and motor function. Including other nerves.   The term "nucleic acid sequence" as used herein means a DNA or RNA molecule. Including full and partial gene sequences, and It also includes polynucleotides. This term also refers to the 3'and adjacent pentoses. And a series of deoxylytes linked alternately by a phosphodiester bond between the 5'and 5'carbons. Contains vonucleotides or ribonucleotides.   The scope of this invention is not limited by any theoretical analogy, When administered to the cerebrospinal fluid of the main, the expression vector The nucleic acid sequence that transfers to the cell and thereby encodes the therapeutic agent is transferred to a cell of the central nervous system. Is carried, and thereby the therapeutic agent is expressed by such cells. Transduction The cells to be treated include, but are not limited to, the central nervous system, brain cells, cranial nerves and Nerve cells that are indispensable for motor and motor control functions, and tumor cells such as spinal cord cells It is. The type of cell transduced by the expression vector and therapeutic agent is therapeutic. It depends on the type of deteriorating condition of the nervous system to be done.   As used herein, the term "degenerative condition of the nervous system" refers to an expression vector containing a nucleic acid sequence. What is the nervous system that is treated by gene therapy in which the vector is transduced into cells of the nervous system Including some diseases. Such situations include, but are not limited to, the central nervous system. System tumors, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, adult diseases, mental Disorders, and levels of existing proteins that introduce new compounds into the nervous system Various diseases that are affected by modifying   Expression vectorIn vivoTransfect cells to treat deteriorating conditions of the central nervous system It is any expression vector that can be inserted and express a therapeutic drug. The appropriate expression vector used Is not necessarily in it Without limitation, eukaryotic vectors, prokaryotic vectors (eg bacterial plasmids), and And viral proteins, DNA proteins such as DNA monoclonal antibody complex A complex, and a receptor-mediated vector. This vector is contained within a liposome It may be.   In one example, the expression vector is a viral vector. Used ui Virus vectors are not necessarily limited to retroviral vectors, Virus vector, adeno-associated virus vector, and herpes virus Including vectors. In one embodiment, the viral vector is a retroviral vector. It is.   In a preferred embodiment, the packaging cell line treats a deteriorating condition of the nervous system. In one viral vector containing a nucleic acid sequence encoding a therapeutic agent to Transduced to form a producer cell line containing the viral vector. Producer cells It is then administered to the cerebrospinal fluid of the host, which causes the producer cells to cranium within the cerebrospinal fluid. It circulates throughout the spinal subarachnoid space, which allows such viral vectors to The therapeutic agent is expressed in such cells.   In one embodiment, a deteriorating condition of the nervous system invades the leptomeningeal coating of the central nervous system. It is a tumor of the nervous system, such as a tumor that grows. Desirably, the central nervous system tumor is the host Treated by administering the producer cells to the cerebrospinal fluid, the producer cells Vector, which also inhibits and prevents the growth of tumor cells. Code a therapeutic drug that can be destroyed Producing a virus containing the nucleic acid sequence. When administering the producer cells to the cerebrospinal fluid, The virus produced by the producer cells circulates throughout the cerebrospinal fluid and tumor cells To provide inhibition, inhibition, or destruction of tumor cell growth A possible agonist is expressed by the tumor cells.   The nervous system tumors to be treated are not limited to, but include myeloblastoma. Meningeal carcinomatosis, ependymoma, and spinal cord arising from peripheral or primary brain tumors Includes tumor of the lumbosacral region of the pillar. However, the scope of this invention is not limited to the treatment of tumors of the nervous system. It has to be understood that this is not what is done.   In a preferred embodiment, the viral vector is a retroviral vector . Examples of retroviral vectors used are not necessarily limited to, Moloney murine leukemia virus; splenic necrosis virus; and chicken sarcoma virus , Harvey sarcoma virus, Avian leukemia virus, Human immunodeficiency virus, Bone marrow Derived from proliferative sarcoma virus and retroviruses such as breast cancer virus Including vectors. Desirably, the retroviral vector is infectious, but It is a retrovirus vector made by competent (having the ability to be infected). But multiple Competent retroviruses made by the same method can be used as well.   Retroviral vectors mediate retroviral-mediated gene transfer into eukaryotic cells It is useful as an active agent. Retroviruses commonly copy the viral structural gene. Are constructed so that the large number of sequences to be deleted are replaced by the gene of interest. It is. Very often the structural genes (ie gag, pol, and env) are It is removed from the retroviral backbone using known genetic engineering techniques. this Is a suitable restriction endonuclease or, in some cases, Bal 31 exonu Contains the appropriate portion of the packaging signal, including digestion with Crease To generate fragments.   These new genes are the provirus backbone in several common ways. Is taken up by. The most obvious construction is that the retrovirus structural gene The latter is then replaced by a single gene, the latter then the viral sequence within the long terminal repeat (LTR). It is a construct that is transcribed under the control of nodal sequences. Retrovirus vectors are also It was constructed so that one or more genes could be introduced into target cells. Usually like this In one vector, one gene is under the regulatory control of the viral LTR, while The second gene is either expressed separately from the spliced message or by itself. It is under the control of an internal promoter.   Efforts have been made to minimize the viral components of the viral backbone. The force is mainly in the packaging cells and the packaging-defective helper virus It was to reduce the chances of recombination between the two. Packaging loss The helper virus contains the retrovirus structural gene deleted from the vector itself. Necessary to provide.   In one embodiment, the retroviral vector is a series of vectors (vendor ー Other,Virology Journal, 61: 1639-1649 (1987) Year))) It can be one of the N2 vector containing a series of deletions and substitutions that reduce homology to absolute minimums -(Amentano, others,Virology Journal, 61: 1647-1650 Pages). These changes result in the expression of viral proteins It also reduced the hyperactivity. The first of these vectors was LNL-XHC Changes the natural ATG start codon of gag to TAG by site-directed mutagenesis Which resulted in the removal of unintended protein synthesis from that point. Moloney From mouse leukemia virus (MoMuLV) 5'to authentic gag start , There is an open reading frame, which is also a glycosylated protein (pPr80gag ) Can be expressed. Moloney Mouse Sarcoma Virus (MoMuSV) Have alterations in this 5'region, including mushift and glycosylation site deletions, Is pPr80gagPrevent potential expression of the amino terminus of Therefore the vector LN L6 is made, which is the modified ATG of LNL-XHC and the 5'part of MoMuSV. Captured. The 5'structure of the LN vector series is thus the gene transduction target The continuous production of viral antigens in cells enables the expression of retrovirus open reading frames. Eliminate performance. Reduced overlap with packaging-defective helper virus In the last change to make, the mirror is an extra just before the 3'LTR of the LN vector. Env sequence was removed (Mirror, et al.,Biotech, Volume 7, 980-990 Page, 1989).   Any gene transfer system for gene therapy applications The greatest need to be satisfied with is safety. Safety is an infectious vector Of vector genome structure and packaging system used for the production of rice Derived from Miller, others pP for expression of retroviral structural proteins AM3 plasmid (packaging defective helper genome) and LN vector series In combination with the vector genome to generate recombinant wild-type retrovirus. Of recombination with the Jing deficient helper genome (ie LN with pPAM3) Vector packaging minimized through removal at almost every site It has been developed to produce a video system.   In one embodiment, the retroviral vector is a vector such as those described above. Is the Moloney murine leukemia virus of the LN series of K. Dah, et al. (1987) and Miller, et al. (1989). Such a vector is a packaging signal derived from the mouse sarcoma virus. Part of the gene and a mutated gag start codon. Used here The term "mutated" refers to gag protein or fragments or fragments thereof. Meaning that the gag start codon was deleted or changed so that the truncation was not expressed I do.   In another embodiment, the retroviral vector comprises at least four clones. Or restriction sites, where at least two sites are It has an average frequency of occurrence of eukaryotic genes of 1 degree or less at 1,000 base pairs. Ie restricted products Has an average DNA size of at least 10,000 base pairs. Hope The cloning sites are NotI, SnaBI, SalI, and XhoI. Selected from the group In a preferred embodiment, a retrovirus vector -Includes each of these cloning sites. Such vectors are , US Patent Application No. 919,062, received July 23, 1992. And is included here as a quote.   When a retroviral vector containing such a cloning site is used, One shuttle cloning vector is provided and contains at least 2 NotI, S containing a cloning site and located in a retrovirus vector at least selected from the group consisting of naBI, SalI, and XhoI Also matches two cloning sites. The shuttle cloning vector is The few that can be transferred from the shuttle cloning vector to the retroviral vector Contains at least one desired gene.   Shuttle cloning vectors contain cloning or restriction enzyme recognition sites. A basic "backbone" vector attached to one or more linkers containing -Or constructed from fragments. Included in the cloning site is the compatibility , Or a complementary cloning site. Supports shuttle vector restriction sites Genes and / or promoters with Bound to the shuttle vector.   The shuttle cloning vector is used to amplify DNA sequences in the prokaryotic system. Can be used for Shuttle claw Is the cloning vector a plasmid commonly used in prokaryotic systems, especially bacteria? Can be prepared from Thus, for example, the shuttle cloning vector is PBR322, It can be derived from a plasmid such as pUC18.   The vector contains one or more promoters. Promo used But not necessarily limited to the retrovirus LTR; SV40 promoter. Data; mirror, etc.Biotech, Volume 7, Issue 9, Pages 980-990 (19 89) human cytomegalovirus (CMV) promoter, Or any other promoter (for example but not necessarily limited to hist Eukaryotic Promoters Containing the E. coli, pol III, and β-actin Promoter Cell promoter). Other viral promoters used Include, but are not necessarily limited to, the adenovirus promoter, the TK promoter. And the B19 parvovirus promoter. The promoter is also Contains tissue-specific or tumor-specific promoters. Choosing the right promoter Is obvious to those who are familiar with conventional techniques from the lessons here.   The vector then drives the packaging cell line to form the producer cell line. Used to introduce. Be sure to give an example of a packaging cell that will be transfected. But not limited to, mirrors,Human gene therapyVolume 1, Pages 5-14 (1 990), PE 501, ψ-2, ψ-AM, PA12. , T19-14X, VT-19- 17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP + E-86, GP + envAM12, And DAN cell lines. Tumor upon expression of nucleic acid sequence encoding agonist A nucleic acid sequence encoding an agonist that can provide inhibition, inhibition, or destruction of cell growth. The vector containing the row will be used to characterize the packaging cells by any means known in the art. Can be introduced. Such means include, but are not limited to, electroporation, Use of posomes and CaPOFourIncluding precipitation.   The producer cells then infuse the cerebrospinal fluid to inhibit, prevent or destroy tumor growth. Administered in an amount effective to Producer cells are about 1 x 109From about 1 × 10Tencell Number / dose, preferably about 6 × 109From about 1 × 10TenAdministered in cell number / dose You. The exact amount of producer cells administered may, but is not necessarily limited to, the tumor. It depends on various factors, including the type of tumor and the size of the tumor. In some cases, producer details Repeated administration of the vesicles may be required.   Producer cells are administered in combination with a pharmaceutical acceptable carrier suitable for administration to patients. Carrier Is a liquid carrier such as saline or a buffer or other equimolar aqueous solution It is. Producer cells pass through the subarachnoid space of the spinal cord, intracerebroventricularly Or the producer cells continuously generate viral vector particles Administered to the choroid plexus that provides fluid.   Upon administration of the producer cells to the cerebrospinal fluid, the producer cells become viral vector particles. Generate Viral particles circulate throughout cerebrospinal fluid and transduce tumor cells You. Tumor cells, especially cancer Because retrograde tumor cells are generally active replicating cells, retroviral particles are Is preferentially or exclusively taken up and expressed by tumor cells as a control. Will be done.   Tumors of the nervous system that are treated include malignant and non-malignant tumors.   In accordance with the invention, inhibition of tumor cell growth, inhibition of tumor cell growth, or Such agents capable of providing destruction are negative selectable markers; ie tumor cell growth. Used with chemotherapy or interacting drugs that block, block, or destroy length Substance.   Thus, when transducing tumor cells with a negative selectable marker, the interaction The drug is administered to a human host. Interacting drugs inhibit and prevent the growth of tumor cells Or interact with a negative selectable marker to destroy it.   Negative selectable markers used include, but are not necessarily limited to, simplicity herpes. Svirus thymidine kinase, cytomegalovirus thymidine kinase, chickenpox Thymidine kinase such as herpes zoster virus thymidine kinase and the like; and cyto Contains syndeaminase.   In one embodiment, the negative selectable marker is herpes simplex virus thymidine. Kinases, cytomegalovirus thymidine kinase, and varicella-zoster virus. Viral thymidine kinase selected from the group consisting of ruthymidine kinase It is Ze. When such viral thymidine kinase is used, it may The chemotherapeutic agent is preferably a nucleoside analogue, such as ganciclovir, Cyclovir, 1-2 deoki Ci-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil (FIA U), and 6-methoxypurine-arabinonucleoside (araM). It is selected from the group. Such interacting drugs are It is effectively utilized by thymidine kinase, and such interacting drugs are Lethal to the DNA of tumor cells expressing viral thymidine kinase , Thereby killing the tumor cells.   In another embodiment, the negative selectable marker is cytosine deaminase. When cytosine deaminase is a negative selectable marker, the preferred interacting drug is 5- Fluorocytosine. Cytosine deaminase is a 5-fluorocytosine 5- Converted to fluorouracil, the latter being very cytotoxic. Thus cytosinde Tumor cells that express aminase have 5-fluorocytosine as 5-fluorouracil. And then die.   Interacting drugs can inhibit, prevent, or destroy the growth of transduced tumor cells It is administered in an effective amount. For example, interacting drugs should not depend on total toxicity to the patient. The host body weight is about 5 mg / kg to about 10 mg / kg. In one example, this dose is administered twice per day. Interaction drugs desired For example, by intravenous administration, parenteral administration, intraperitoneal administration, Or systemically, such as by intramuscular administration.   Producer cells or other expression vehicles containing negative selectable markersIn vivoTo tumor When given, a "third party effect" occurs. sand Nucleic acid sequences encoding negative selectable markers were not originally transduced Tumor cells are killed by the administration of interacting drugs. The scope of this invention is Although not limited by theoretical analogy, transformed tumor cells interact with each other. Uptake by non-transformed tumor cells that act extracellularly or adjacent to the drug Produce a dispersible form of the negative selectable marker, which in turn interacts with the drug. Will be susceptible to the action of. One of the negative selectable marker and the interacting drug Alternatively, both may be in communication with the tumor cells. Such third party effect The fruits are in U.S. patent application Ser. No. 07 / 877,519, received May 1, 1992. Are also described and are incorporated herein by reference.   In a preferred embodiment, the packaging cell line is as previously described. Retroviral vector containing a simple herpesvirus thymidine kinase gene Transduction. Transducing packaging cells (producer cells) can be dispensed Cerebrospinal fluid in an amount effective to inhibit, prevent, or destroy tumor growth in the carrier ToIn vivoIs administered. Upon administration of the producer cells to the cerebrospinal fluid, the producer cells A viral vector particle is produced which contains the gene encoding the selectable marker. This Like viral particles circulate throughout cerebrospinal fluid and transduce tumor cells . The human host is then ganciclovir, acyclovir, or 1-2-deoxy. 2-Fluoro-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil (FIAU ), Which is a herpes simplex virus thymidine. Nase Interact with and kill the transduced tumor cells. As mentioned here, "Effect" also occurs, thereby killing non-transduced tumor cells as well. Can be   In another embodiment, the expression vector is an adenovirus vector.   The adenovirus vector used is essentially complete adenovirus in one example. It is an adenovirus vector containing the Rus genome. Alternatively, adenovirus vector Is a modified adenovirus in which at least part of the adenovirus genome has been deleted. It is a vector.   In one embodiment, the adenovirus vector is adenovirus 5'IT. R, adenovirus 3'ITR; adenovirus envelope signal: encodes therapeutic drug At least one DNA sequence that encodes; and at least one that encodes a therapeutic agent It consists of a promoter that controls individual DNA sequences. This vector is adenovirus Are separate from the E1, E2, E3, and E4 DNA sequences and the vector is Adenovirus proteins promoted by the denovirus major delayed promoter Is separate from the DNA sequence encoding It is separate from the DNA encoding the Ils structural protein.   Such a vector can be adenovirus-derived from the adenovirus genome using standard techniques. Virus 5'ITR, adenovirus 3'ITR, and adenovirus envelope membrane It can be constructed by removing the gnoll. Such components are ー (A Either a denovirus promoter or a non-adenovirus promoter , A tripartite leader sequence, a poly A signal, and a selectable marker. , To form an appropriate cloning vector by standard techniques. Pee blue script pBluescript II KS- (Strataji DNA base) or "starter" plasmid . The cloning vector comprises at least one DNA sequence encoding a therapeutic agent. It includes a multiple cloning vector that allows easy insertion into the cloning vector. Generally, multiple cloning vectors contain "rare" restriction enzyme sites; Eukaryotes with a frequency of about 1 per 000 base pairs to about 1 per 100,000 base pairs Contains sites found in genes. Thus, suitable vectors according to the present invention are Clone the cloning vector using standard techniques at the appropriate restriction sites in the double cloning site. Clonining at least one DNA sequence that cleaves and then encodes the therapeutic agent It is formed by binding to a vector.   The vector then uses a helper adenovirus to provide the necessary envelope material Packaged in infectious viral particles. Desirably, the helper virus is It has a defective envelope signal because the Rupervirus does not envelope itself. Used Examples of enveloped defective helper viruses include Greyble, et al.Virology Journal 66, 723-731 (1992).   Vectors and envelope-defective helper viruses It is transfected into a suitable cell line for the production of spurs. Transfection is electroporation, Through calcium phosphate precipitation, microinjection, or proteoliposomes You. Suitable cell lines include, but are not necessarily limited to, HeLa cells or 29 3 (embryonic kidney epithelium) cells. Infectious viral vector particles are then the central nervous system At least one DN transduced into the cells of, and thereby encoding a therapeutic agent The A sequence is expressed by the host cell.   In another embodiment, the vector is adenovirus 5'ITR; Irs 3'ITR; adenovirus envelope signal; less encoding therapeutic drug Together with one DNA sequence; and at least one DNA sequence encoding a therapeutic agent. It consists of a promoter that controls the row. This vector contains at least many adenoviruses. All E2 and E4D, but distant from the Ils E1 and E3 DNA sequences Adenovirus promoted by NA sequence and adenovirus major delayed promoter It is not separated from the DNA sequence encoding the Ils protein. 1 Example smell The vector is also selected from the group consisting of E2 and E4 DNA sequences. Separated from at least a portion of at least one DNA sequence. Another example In, the vector contains at least a large number of adenovirus E1 and E3 DNA Away from the row and away from one of the E2 and E4 DNA sequences, and Separated from some of the other E2 and E4 DNA sequences.   In a further embodiment, the vector contains at least a large number of It is separated from the E1 and E3 DNA sequences and consists of the E2 and E4 DNA sequences. Away from at least part of at least one DNA sequence selected from the group And adenovirus driven by the adenovirus major delayed promoter. Separated from the DNA sequence encoding the ruth protein.   Such a vector is first constructed according to standard techniques in the preferred embodiment. The shuttle plasmid was constructed by constructing a plasmid Contains the "critical left terminal element", which is the adenovirus 5'ITR Novirus envelope signal, and E1a enhancer sequence; promoter (addition May be a novirus promoter or an external promoter); Tripartite leader sequence, multiple cloning site (as described above); poly A signal A DNA segment corresponding to a segment of the adenovirus genome. This DNA Segments of Homologous Recombination Using Modified or Mutant Adenovirus This sequence serves as a substrate for It includes a segment of the adenovirus 5 genome of 6246 base pairs or less. This program Rasmid also contains a selectable marker and origin of replication. This origin of replication is bacterial replication It is the starting point. A representative example of such a shuttle plasmid contains pAVS6 and is shown in FIG. 4 is shown. The desired DNA sequence encoding the therapeutic agent is then It is inserted at the training site. Homologous recombination is then followed by at least a large number of E1 and E3 Modified or mutant adenovirus lacking adenovirus DNA sequence Is done using. Such homologous recombination Eh, CaPOFourShutdown plasmid and modified adenovirus 2 by precipitation It is carried out by co-transfecting a helper cell line such as 93 cells. like this Upon homologous recombination, a recombinant adenovirus vector is formed, which is Not   DNA sequence derived from shuttle plasmid between I site and homologous recombination fragment And E1 and E3 deleted adenovirus between homologous recombination fragment and 3'ITR DNA derived from   In one embodiment, the homologous recombination fragment is a nucleotide of the adenovirus 5 genome. Overlapping at Ochid 3329 to 6246.   A vector is formed through such homologous recombination, and the vector is Viral 5'ITR, adenovirus envelope signal; E1a enhancer sequence; Promoter; tripartite leader sequence; at least one D encoding a therapeutic agent NA sequence; poly A signal; at least multiple E1 and E3 adenovirus D Adenovirus DNA separate from the NA sequence; and adenovirus 3'IT Contains R. This vector is then used in helper cell lines such as the 293 helper cell line. Cell line containing the E1a and E1b DNA sequences It is necessary for viral replication and for the production of infectious viral particles.   Vector consisting of infectious but replication-defective viral particles encodes a therapeutic agent At least one DNA sequence that enables the host to treat a deteriorating condition of the central nervous system in the host. Administered in an effective amount to treat. In one embodiment, the vector particle is 1 About 10 from plaque forming units14Up to plaque forming units, preferably about 1 x 106 About 1 x 10 from plaque forming unit13It is administered in amounts up to plaque forming units. Inn Mainly human or non-human animal hosts.   Vector particles are administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier suitable for administration to a patient. Responsible The body may be a liquid carrier (eg saline) or a solid carrier, eg microcarrier beads. You.   Although this invention is described in the context of treating tumors of the nervous system, the method of this invention is not Therapeutic gene product of Subarachnoid, Intracerebroventricular, Intraspinal injection, Subarachnoid injection, Used for delivery to the nervous system by circulation through cerebrospinal fluid after injection into the choroid plexus Is done. Such gene products include neurotransmitters, neuromodulators, neurohormones. , And proteins and peptides that are neurotrophic factors. Thus this The methods of the invention include, but are not necessarily limited to, traumatic injury, stroke, Alzheimer's. Marr's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, adult diseases, mental disorders, and cerebrospinal fluid Introduce new compounds into, or modify the levels of existing proteins there Used to treat aggravated conditions of the nervous system, including various diseases affected by You can do it. Thus, the present invention is for treating non-cancerous degenerative conditions of the nervous system. And can be used to transduce normal cells or tissues of the nervous system.   The invention will now be described in connection with the following examples. But the scope of this invention Is not limited to this.                               Example 1 A.Construction of pGlTkSvNa   The following describes the construction of pGlTkSvNa, a schematic of which is shown in Figure 6. This Is a retroviral promoter and bacterial gene, SV40 promoter. -Driven neomycin phosphotransferase (NeoRBy) Thymidine kinase (hTK) derived from regulated herpes simplex virus I Contains genes. The HTK gene has DNA analogs acyclovir and ganciclo. Sensitize Bill while NeoRGene product is neomycin analogue, G418 Give resistance to.   A three-step cloning strategy was used to make pGlTkSvNa. First, the herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK) is called pGlTk. It was cloned into the G1 plasmid backbone for production. Second, NeoR The gene (Na) was cloned into the plasmid pSvBg to make pSvNa. Was. Finally SvNa is excised from pSvNa to produce pGlTkSvNa For ligation to pGlTk.   The plasmid pGlTkSvNa was derived from the plasmid PGl (Figure 3). Plasmid pGl was constructed from pLNSX (Permer et al.,blood, 73 volumes, 438-445). The construction strategy of plasmid pGl is shown in FIG. 5 ' 1.6 kilobase E containing Moloney murine sarcoma virus (MoMuSV) LTR A 3.0 kilobase EcoRI / ClaI fragment containing the coRI fragment, 3'LTR. Fragment, bacterial origin of replication and ampicy Phosphorus resistance genes were isolated separately. Linker containing 7 cloning sites Is used to close the EcoRI / ClaI fragment to itself, thus Rasmid pGO was generated. The plasmid pGO contains 1.6 kg containing 5'LTR. By inserting the base EcoRI fragment into the unique EcoRI site of pGO It was used to generate the vector plasmid pGI (Figure 3). Thus pG 1 (Fig. 3) is a 5'portion derived from MoMuSV, which has an authentic ATG start codon. Short part of gag mutated to TAG (Bender, et al., 1987) 5 '? 3'to 3'EcoRI, NotI, SnaBI, SalI BamHI, Xho 54 base pair multiple clonins containing I, HindII, ApaI, and ClaI Site (MCS) and 3 of MoMuLV obtained from 7764 to 7813 base pairs. ′ Part (the number is Van Bee Barren, others,Cold Spring HarborVolume 2, (Page 567, as described in 1985)). It consists of a ter backbone (Fig. 2). MCS is pGl plasmid, neorHeredity Offspring, β-galactosidase gene, hygromycinrGene and SV40 pro Maximum number of unique insertion sites based on a screen of motor uncleaved restriction enzymes Was designed to produce.   3.0 encoding β-galactosidase to construct pBg (FIG. 4) The kilobase BamHI / EcoRIlacZ fragment was isolated from pMC1871. (Pharmacia). This fragment is 5'of the β-galactosidase open reading frame and It lacks the 3'-most end. The complete lacZ open reading frame was repaired and the lacZ gene A linker was added to add restriction sites to each end, and BamHI / EcoRI la was synthesized. It was ligated to the cZ fragment. The structure of the 5'linker was as follows: 5'-1 / 2NdeI-SphI-NotI-SnaBI-SalI-SaclI-Acc I-NruI-BglII-III 27 base pair ribosome binding signal Kuconsensus sequence / first 21 base pairs of NcoI-lacZ open reading frame-1 / 2BamHI-3 '. The structure of the 3'linker was: 5'-1 / 2 The last 55 base pairs of the mutant EcoRI-lacZ open reading frame-XhoI-Hi ndIII-SmaI-1 / 2EcoRI-3 '. Choose a restriction site in the linker The restriction site is neomycin resistance gene, β-galactosidase gene. , Hygromycin resistance gene or SV40 promoter It was bad. A 27 base pair ribosome binding signal included in the 5'linker However, it is thought that it enhances the stability of mRNA (Hagenbüch). Re, et al., Cell, 13: 551-563, 1978. And Lawrence And Jackson, Journal of Molecular Biology, 162: 317-324. , 1982). Kozak consensus sequence (5'-GCCGCCACCATGG-3 ') is mRN Shown to signal the initiation of A translation (Kozak, Nucleic Acids Research, 12: 8. 57-872, 1984). The Kozak consensus sequence opens the ATG translation It contains an NcoI site which marks the start codon.   pBR322 (Bolivar, others,geneVol. 2, No. 95, 1977) is N ampicillin resistance gene and bacterial replication digested with deI and EcoRI The origin was separated. Said linked 5'linker-1acZ-3'linker D NA was ligated into the pBR322NdeI / EcoRI vector to generate pBg. Was combined. pBg is useful as a shuttle plasmid, but it is The gene was excised and another gene was present at the 5'and 3'ends of the lacZ gene. This is because it can be inserted into any of the restriction sites. These restriction sites are pGl Alternate lac in the shuttle plasmid construct to be repeated in the rasmid The Z gene or group of genes can be easily transferred to pGl.   Herpes simplex virus type I thymidine kinase gene (Genbank, A Accession number V00467, incorporated herein by reference) 1.7 The 4 kilobase BgIII / PvuII fragment is the pX1 plasmid (Huberman ,other,Exponential cell research, 153, pp. 347-362 (1984), Cited example As a result, the large size of DNA polymerase I (clea) is removed. Nou) fragment and blunted to form pGlTk to form plasmid pGlTk. It was inserted into the unique SnaBI site of the rolling site (Fig. 5).   339 base pairs PvuII / HindI obtained from plasmid pSV2Neo II SV40 early promoter fragment (Southern et al.,Molecular and applied genetics Journal Vol. 1: 327-341 (1982)) is the next plasmid. It was inserted into pBg at the unique NruI site to generate pSvBg ( Figure 5). The pSvBg plasmid islacZBglII / to remove the gene It was digested with XhoI and the ends were blunted with the Klenow fragment. Neo Mai A 852 base pair EcoRI / AsuII fragment containing the coding sequence for the syn resistance gene pN2 (Amentano, others,Virology Journal, 61, 1647-16 50 (1987)), blunted with Klenow fragment, Ligated to the 2.5 kilobase blunted BglII / XhoI fragment produced by yielded vNa. SV40 promoter / neomycin resistance gene cassette is next It was removed from pSvNa as a 1191 base pair SalI / HindIII fragment. Was. The pGlTk plasmid was then digested with SalI / HindIII, p SV40 / neo to generate GlTkSvNarFragment linked (Fig. 6) ). B.Generation of producer cell lines   Producer cell lines were made from vector plasmids and packaging cells. PA317 / GlTkSvNa producer cells have previously been associated with clinically relevant retroviruses. Made by the same general techniques used to make lus producer cell lines . The vector plasmid pGlTkSvNa DNA is an endotrophic packaging Cell line, PE501. Supernatant from PE501 transfected cells To transfect the amphotropic packaging cell line (PA317) Used to. The transfected producer cell clone was NeoRRemains It was grown in G418 containing medium to select for clones containing the gene. clone Was then titrated for retroviral vector production. Some clones , Then selected for further testing and finally one clone Was selected.   5 × 10FivePE501 cells (mirror, others,Biotech, Volume 7, 980-9 Page 90 (1989), here incorporated by reference) is 100 10 ml high glucose Dulbecco modified essential medium (DMEM) growth medium in mm dish Were plated with 10% fetal bovine serum (HGD10) per dish. Cells are 37 ° C, 5% CO2/ Incubated overnight in air.   The plasmid pGlTkSvNa was then added to 50 μg of DNA by the following procedure. Using CaPOFourPE501 cells were transfected by precipitation.   DNA 50 μg, 10 × CaCl250 μl and 450 μl of sterile water Mix in a 5 ml polypropylene tube, 50 μg DNA, 2 × PBS 0.5 ml (NN-bis- (2-hydroxylethyl) -2-aminoethanesulfone Acid 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPOFour1.5 mM, and pH 6 . 95, including Hepes 50 mM) CaCl containing2A solution of 0.25M was produced. The DNA solution was then left at room temperature for about 20 minutes to 1 hour. The dish is then at 35 ° C CO2  Incubated overnight at 3% / atmosphere.   Culture plates with optimal precipitation following overnight incubation were then sorted. Was. The dishes were then washed again with PBS to remove salts and salt solutions. HG 10 ml of D10 medium was then added to the dish and the dish was CO 2 at 37 ° C.2  5% / atmosphere It was kept warm for about 48 hours.   After 48 hours, supernatants were collected from transfected cells. The plate is then PBS 5m washed with l. PBS was then removed and cells were removed with trypsin-EDTA. Was. Serial dilutions of cells are then HGD10 and G418 0.8 mg / ml Were inoculated into 6 100 mm dishes of medium containing.   Six cell dishes were inspected daily. Medium to remove dead cells as needed Exchanged. Viable cells or colonies are large enough to allow the colonies to clone. To grow to a size that makes you feel like a colony (ie the colony is visible to the naked eye) Was. PE501 ectotrophic cells obtained from such colonies of PE501 cells A supernatant is collected in a volume of about 5 to 10 ml and placed in a freezing tube, -70 Frozen in liquid nitrogen at ° C.   PA317 (Miller et al., Molecular Cell Biology 6: 6: 2895-2902, (1986)) followed by 4.5 g / l glucose, glutamine scavenger, and 100 mm flat in Dulbecco's modified essential medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) 5 × 10 per plateFourPlated at cell number concentration.   The PE501 supernatant was then thawed and 8 μg / ml polybrene was added to the supernatant. Was done. The medium was aspirated from a plate of PA317 cells, and the virus supernatant was 7 to 8 m. 1 was added and incubated overnight.   The PE501 supernatant was then removed and cells were about 18-20 hours While being re-supplemented with fresh PBS 10%. After 1 day, the medium is FBS 10% and G4 18 (800 μg / ml). The plate is then monitored and the medium Fresh F to remove dying or dead cells as needed. Replaced with 10% BS and G418. Plate is outside G418 resistant colony Viewing was monitored for at least 10 to 14 days.   Cloning rings were placed around all selected colonies. Cells Trypsinized to 5 ml of HGD10 hypoxanthine aminopterin thymidine Incubated in wells in 6 well dishes with HAT 1 × added.   If colonies grow densely, they are trypsinized and 100 ml Cultured in dishes. As clones in 100 ml dishes approach confluence, an amphotropic vector The supernatant containing the cells was removed and 1.200 to pellet the cells for removal. It was centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes.   The supernatant was aliquoted into 6 frozen vials (1 ml / vial) and added to liquid nitrogen. It was stored. 5 ml PBS was added to the dish, cells were rinsed and HGD10 Re-supplemented and frozen in liquid nitrogen in 1 ml aliquots of DMS0 10% Was. Different clones were used to determine the one with the highest titer of retroviral vector. The loan was monitored.   PA317 / GlTkSvNa. Claw with the highest titer designed as 53 Was used to produce a master cell bank. C.Preparation of pGlTk1SvNa   The plasmid pGlTk1SvNa (FIG. 8) follows the graphical representation shown in FIG. Prepared. It removes the partial open reading frame from pGlTkSvNa (Figure 6) Prepared.     Generation of pSPTK5 ':   The DNA obtained from the plasmid pGlNaSvTk contains the restriction enzymes BgIII and S It was digested with maI to give the 1163 base pair herpes thymidine kinase (TK) fragment. It was fractionated and decomposed by Galose gel electrophoresis. This fragment is TK5 'untranslated It contains 56 base pairs of the translated region and 1107 base pairs of the TK translation open reading frame. 1 The 163 base pair fragment is the plasmid vector pSP73 (Promega Corporation). , Madison, Wisconsin), the latter being the restriction enzyme BgIII and It had been digested with SamI. The resulting ligated plasmid construct was named pSPTK5 '. It was named, although this plasmid contains the 5'portion of the TK open reading frame, This is because the last 21 base pairs of the open reading frame and the translation stop codon are missing.     PCR of TK reading frame:   pGlNaSvTk plasmid DNA was prepared by digesting it with BgIII. Was linearized. Linearized pGlNaSvTk is polymerase chain reaction (PCR) PCR was used as a template for the first 17 base pairs of the TK open reading frame. Including the positive primer (5'-GCACCATGGCTTCGTACCCCTGC-3 '), and the XhoI site Contains the complementary sequence, the TK translation stop codon, and the last 19 base pairs of the TK open reading frame. Mu reverse primer PCR using (5'-CCTGCATCGATTCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCC-3 ') Was. 30 cycles of PCR were performed as follows: 94 ° C for 1 minute and 60 ° C. For 2 minutes, followed by a 72 ° C. extension cycle for a final 7 minutes. PCR products are Aga Expected 1215 base pair breaks, including the full length TK open reading frame, fractionated on a rose gel The pieces were separated. The isolated fragment was digested with the restriction enzymes PstI and XhoI and digested The product was fractionated on an agarose gel and 420 base pairs separated. This fragment is T Pst at the nucleotide encoding amino acids 249-250 of the K open reading frame It extends from the I site to the XhoI site immediately downstream of the TGA translation stop codon.     Generation of pSPTK1:   pSPTK5 'was digested with PstI and read with pSP73 vector and TK The 3993 base pairs containing the 5'portion of the open frame were separated by subsequent agarose gel electrophoresis. Was. This 3993 base pair fragment contains PC containing the 3'end of the TK open reading frame (supra). It was ligated to the R-generated 420 base pair PstI / XhoI fragment. Binding plasmid DN A isE. coliDK5α competent cells (cells with infectivity) (ZIBCO / BR L, Gaithersburg, MD) and ampicillin resistant The DNA obtained from the knee was screened by restriction enzyme digestion. Full length TK reading The plasmid that appeared to contain the open frame was named pSPTK1. How many The DNA obtained from the pSPTK1 clone was from the PstI site to the XhoI site. In the region up to (the region generated by PCR) Was. pSPTK1 clone # 4 should match the expected TK sequence in this region. Was used to construct pGlTk1SvNa.     Generation of pGlTk1SvNa:   pSPTK1 DNA was digested with BglII and the 5'overhanging ends wereE. coliDN Culture of digested DNA with A polymerase I deoxynucleotide and Klenow fragment It was restored by feeding. The DNA then contains 56 base pairs of the TK5'-untranslated region and Digested with XhoI to generate a 1255 base pair fragment with the full length TK open reading frame. Was done. This blunt / XhoI fragment was digested with SnaBI and SalI It was ligated to GlXSvNa DNA.   To construct pGlXSSvNa, the 1.2 kilobase SvNa fragment was Sal. Excised from Psvna (Part A above) with I and HindIII. This disconnect The pieces were ligated into pGl digested with SalI and HindIII. Combined plastic The Sumid is named pGlXSvNa, "X" indicates multiple cloning region .   The DNA product obtained from pGlXSvNa and TK ligation was transformed into DH5α. The DNA obtained from the transformed and ampicillin resistant colonies was screened as described above. Was done. The plasmid which is considered to contain the TK fragment digested with the diagnostic restriction enzyme is It was named pGlTk1SvNa (FIG. 8). Clone # 2 is the first 5'LTR It has a dideoxy sequence to the end of the 3'LTR and contains an intact TK open reading frame. It was discovered.   pGlTk1SvNa was treated with PA317 by the method described above (Part B above). Was used to produce producer cells by the combination of Such producer cells The system is the producer cell line PA317 / GITklSvNa. Was called 7. D.Cerebrospinal to Herpes Simplex Thymidine Kinase Producer Cells and Vectors Effect of liquid; Evaluation of retrovirus vector titer   Producer cell clone PA317 / GITkSvNa. 53 and PA317 / GITklSvNa. 4 of 7 each in a 6-well dish (12 wells / clone) -5 x 10FiveCell / well (37 ℃, CO25% for 24 hours or almost crowded Vaccination).   One pair of wells contains growth medium (0%, 5%, 10%, 25%, 50%, and 75%). %) And the cerebrospinal fluid (CSF) concentration was increased. Culture is microscopic For 48 hour periods (10 minutes, 1 hour, 4 hours, 24 hours and 48 hours) An erythrocyte cytopathic effect (CPE) was observed. The supernatant sample is then collected and The value was tested. Separately, supernatant samples of known titer (GlTkSvN a. 53 and GlTk1SvNa. 7) was mixed with CSF and titer was measured . Serial dilution of assay supernatant (100, 10-1, 10-2, 10-3) Is 8 μg / ml Made in growth medium containing polybrene and then incubated for 60 minutes at room temperature. 3 ml Dilutions were added to each well containing NIH 3T3 cells. The plate is at 32 ° C and CO2Cultivated at 5% and cultivated after 16 to 20 hours Replaced with growth medium containing 0.8 mg / ml G418 (neomycin analog) And incubated at 37 ° C. Cells (transduced with the neomycin resistance gene, Individual colonies thus created from cells protected from the toxic effects of G418) Were grown on this medium until they became visible under the microscope. The cell is then methylene It was stained with blue and the colonies were counted. The titer per ml is well for each dilution Calculated by multiplying the average number of colonies in by the dilution factor and dividing by 3 ml. Mean titers were determined by calculating the mean titer of all dilutions. C The supernatant used as a positive control, not diluted with SF, was 1 x 10FiveAnd 4x1 06Particles / ml (PA317 / G1Tk1SvNa.7) and 10ThreeFrom 10Four Neomycin resistance between particles / ml (PA317 / G1TkSvNa.53) Had a gene titer.   10 minutes, 1 hour, 4 hours, 24 hours, and 48 hours after exposure to human cerebrospinal fluid No cytopathic effect was seen on the producer cells. Dew on CSF with varying concentration The production of vector for each clone issued is shown in Table I below.   The above results show that the production of vector by producer cells was not affected by exposure to human cerebrospinal fluid. It shows that it was not affected.   Similarly, free herpes simplex thymidine (obtained from supernatants of known titers) Nase vector titer was determined by the cerebrospinal fluid during exposure for 60 minutes before incubation in NIH 3T3 cells. Was not affected by. E. FIG.Herpes simplex thymidine kinase vector producer cells and ganciclovir Injection toxicity study   PA317 / G1TkSvNa. 53 SD rats with 4 producer cells (Spraqu e-Dawley rats) (weighing 230 to 350 g) with a large catheter Injection under short inhalation anesthesia (10FiveCells / 10 μl). Rat has brain and spine After being injected with cells for histological examination of the marrow with hematoxylin and eosin staining Sacrificed on days 5 and 10. Nervous Or no signs of systemic toxicity, meningeal reaction, or parenchymal brain Or there was no tissue evidence of spinal cord injury.   In one embodiment, PA317 / G1TkSvNa. 53 producer cells Four SD rats (230-350 g each, respectively) with an abdominal subarachnoid catheter Injection by weight (10)6Cells / 10 μl) and ganciclovir 7 days later (abdominal It was administered intracavity (at 30 mg / kg / day). Animals are hematoxylin and eosin 3 and 6 days after ganciclovir treatment for brain and spinal cord histology Sacrificed on days 0 and 14. The leptomeninges or the entire brain and spinal cord There was no evidence of inflammation of parenchymal damage, and rats were neurologic throughout the study period. There was no sign of systemic or systemic toxicity.   In another embodiment, this is associated with non-human primates, from 6 kg to 8 kg 6 Rhesus macaques of each weight were each suspended in 1 ml of PBS (X-Gas). PA317 / G1TkSvNa. 53 producer cells 1x 107And β-galactosidase producer cells 1 × 107Accepts intracerebroventricular mixture Was. G1BgSvN. The β-galactosidase producer cell line known as 29 A317 replaces the lacZ gene with the herpes simplex thymidine kinase gene Is formed by transfection with the vector pG1BgSvNa Was. One week after cell injection, ganciclovir was administered to two monkeys (at 10 mg / kg / day). Given intravenously (for 14 days), (another) two monkeys (with ganciclovir) (200 μg / day for 14 days) was given in the subarachnoid space. Two (other) Le only received an injection of producer cells. Received intravenous ganciclovir treatment The monkey is a subcutaneous access port located in the interscapular region and through the right external jugular vein. I had surgery for a visceral catheter. The animal is placed in a stereotaxic frame and a midline incision is made with sagittal sutures and And exposed to the forehead. Using stereotaxic coordinates, the ventricular catheter is in the right brain It was placed in a chamber and its location was confirmed by pressure tracking. Producer cells are poured for 1 minute Was shot. In two monkeys receiving subarachnoid space ganciclovir, ventricular catheterization was observed. The catheter was left in place and was connected to a subcutaneous access port in the interscapular region.   After treatment with ganciclovir, one monkey from each group, a total of three monkeys, Sacrificed for histological evaluation of spinal cord and peripheral organs. The remaining three monkeys are long-term Observed and preserved for repeated repeated intrathecal cell injections.   Blood and cerebrospinal fluid samples were collected before and 7 days after cell injection. Collected 7 days after treatment with Vill and at the end of ganciclovir treatment. Cerebrospinal fluid Protein and glucose levels were analyzed cytologically. Blood samples are becoming more conventional Analyzed by the biology and hematology profile.   Gadolinium-enhanced brain MRI scans were performed before and 7 days after cell injection. Obtained 7 days after clovir treatment and after termination of ganciclovir treatment. Sacrificed None of the three monkeys received an additional MRI scan 45 days after cell injection. I did. Scan with ventricular swelling, ventricular ependyma enhancement, meningeal enhancement, massive lesions, Evidence of bleeding was assessed.   Cell injection and ganciclovir treatment were well tolerated in all monkeys. Treatment No signs of nervous system deficits or systemic toxicity develop in any animal until 3 months later Was.   Peripheral blood counts and serum chemistry profiles are available for all animals throughout the study. It remained normal. Cerebrospinal fluid has normal protein and glucose levels Was. However, the two cerebrospinal fluid cells of the two monkeys who received intraventricular ganciclovir treatment were light Grew hypertension but was also asymptomatic and did not progress to meningitis .   No changes were observed on brain MRI scans in either monkey. Throughout the study Evidence of ventricular swelling, leptomeningeal enhancement, ventricular ependyma enhancement, lumpy lesions or bleeding I didn't.   Peripheral organs of each of the three sacrificed monkeys appeared normal in gross dissection studies . Brain and spinal cord histology shows evidence of structural damage, inflammation, vasculitis, or demyelination. No evidence was given.   Ventricle of the ventricles of ganciclovir-treated animals (both subarachnoid and intravenous) Plexus examination showed disruption of normal capillary structure and capillary network. Contrast The choroid plexus appeared normal. X-Gal staining shows diffuse staining of choroid plexus cells However, evidence for transduction with β-galactosidase vectors is present in brain parenchyma or spinal cord. Not detected.   Three months after the first injection of producer cells, non-sacrificed monkeys received higher doses. Producer cells (PA317 / G1TkSvNa.53 producer cells 2 × 108Β Galactosidase producer 1 x 10 cells7And a total volume of 2 ml of PBS). Was. 7 days after cell injection, the two monkeys were treated with intravenous ganciclovir (10 mg / day) for 14 days. (kg / day). Toxic by laboratory tests, analysis of blood and cerebrospinal fluid samples Was assessed daily and a gadolinium-enhanced MRI scan of the brain was taken before injection, ganciclovir. At the end of treatment and 9 weeks after cell injection. Also, cistern and lumbar cerebrospinal fluid Samples were collected by percutaneous suction one day, three days, and five days after the injection of ventricular cells. To assess the pattern of changes in producer cell and vector particle distribution in the submembrane space It was evaluated by vector titer and cytology.   The retrovirus vector titer was evaluated as follows.   Cultured NIH 3T3 cells were 1 × in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. 10FiveGrows in cells / well dish. Serial dilution of cerebrospinal fluid to be assayed (from 0 2 × 10-2) Was performed in growth medium containing 8 μg / ml polybrene. Diluted solution 2 ml was added to each well. Positive dilution of retrovirus supernatant with known titer Used as a control. Plate is 32 ℃, CO2It was kept warm at 5%. 16-20 o'clock After a period of time, the medium is a growth medium containing 0.8 mg / ml of G418 (neomycin analogue). Was replaced by. The cells are transduced in this medium (transduced with the neomycin resistance gene, Thus, individual colonies (resulting from cells protected from the toxic effects of G418) It was grown until it became visible under the microscope. The cells are then stained with methylene blue Colored and colonies counted. The titer per ml for each dilution is the colony in the well. By calculating the average number of cells, multiplying by the dilution factor and dividing by 2 ml It has been determined. Average titer is determined by calculating the average titer of all dilutions Was done. The supernatant used as a positive control was 1 x 10FiveAnd 4 × 106Particle / m It has a neomycin resistance gene between 1 and 1.   Neurocompromising or systemic toxicity is a course of repeat treatment and 3 months follow-up Did not happen. Blood and cerebrospinal fluid profiles were normal throughout the study. It remained. MRI scan of brain does not change leptomeningeal signal properties , There was no evidence of ventricular swelling or parenchymal damage. Vector titer of repeated cell injection It was detected in cerebrospinal fluid samples after 24 hours. Comparable titers are large tank and waist Found in a cerebrospinal fluid sample.   In another experiment, PA317 / G1TkS was added in a total volume of 10 ml PBS. vNa. 53 Producer cells 106And G1BgSvN. 29 producer cells 106Mixture of Shows a stereotaxic frame (coordinate axes AP-.92, L-1.4, dorsoventral- That of 4 SD rats (weight from 230 g to 350 g) using 3.6) Use a 23 gauge needle and 50 μl Hamilton syringe for 5 minutes in each bilateral ventricle Was injected. 7 days after cell injection, 2 rats received ganciclovir (30 mg / kg ip daily for 14 days), while 2 rats served as controls stood. At the end of ganciclovir treatment, rats will receive 4% formaldehyde Sacrificed by visceral perfusion, the brain was removed for histological examination. The choroid is the lateral ventricle And the 4th ventricle are incised to block the endogenous β-galactosidase activity. It was stained with X-gal after pre-incubation with EGTA to break. Non-gancyclo Choroid plexus from both Bil- and Ganciclovir-treated rats received cell injections. Severe X-gal staining was observed in the lateral and fourth ventricles as compared to the non-control animals. Color indicated. With the same disruption of the choroid plexus of ganciclovir-treated and control rats The difference was minimal with X-Gal staining.   In another example, 6 rats (SD rat, 230-250 g) Each of them had a low concentration of ganciclovir (5 μg daily via the indwelling cistern catheter). / PBS 10 μl for 14 days) or high concentration ganciclovir (200 daily) 10 μl of μg / PBS for 14 days) was injected into the subarachnoid space. Rat is nervous Evidence of toxicity is tested daily and 1 of ganciclovir treatment for histological examination of staining He was killed four days later. No evidence of neurological sequelae was found in any of the treated animals. In both high and low concentrations of subarachnoid space ganciclovir treated rats, Histological appearance of brain and spinal cord shows no signs of meningeal reaction or parenchymal injury Was. F.Producer cell administration to rats with gliosarcoma   In this experiment, a 9L syngeneic glioma model of meningeal carcinomatosis in Fisher rats was used. Was used (Coistra, et al.,Cancer research, 46, 317-323 ( 1986)).   Producer cell line PA317 / GlTkSvNa. 53 is fetal bovine serum 10% (ha Iclone Laboratories, Inc., Logan, Utah), L- Glutamine 2 mM (Jibco BRL, Gaithersburg, MD, penicillin 50 units / ml (jib Co), streptomycin 50 μg / ml (Zibco), fungizone 2.5 μg / Ml (Biomedicals Inc., Costa Mesa, Califo (Lunia) in a Dulbecco's modified Eagle medium. Producer cell Grew in T-175 flasks. Producer cells are trypsin-EDTA (Dibco ) For 5-10 minutes at 37 ° C prior to intrathecal injection. cell Is Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Biofluise, Inc. , Rockville, Maryland), washed twice and injected 8 × 106 Resuspended at cells / ml.   Some producer cells were also susceptible to the replication competent retrovirus 4070A. It was dyed. To infect cells with such a retrovirus, 4070A The virus-containing supernatant was filtered through a 0.22 μm filter into a monolayer of producer cells. Was. Two passages of culture infected producer cells homogeneously with 4070A retrovirus. I was told to.   Fisher 344 rats weighing 230-300 grams were intraperitoneally (ip). ) Ketamine (90mg / kg, Fort Dodge Laboratories, Inc. Rated, Fort Dodge, Iowa) and Zyrazine (10 mg / kg) , Mobay Corporation, Shawnee, Kansas). A sterile PE-10 tube is inserted into the subthoracic space of the upper chest via the cisterna magna, It was fixed and penetrated the skin on the back of the neck. The tube is then sterile removable steel lock Shut off by Was. The rats are then observed for 5-7 days, during which time the neurological defect develops. Both were removed from this study. Does the rat protect the catheter? One per dog, amoxicillin (20ml / rat / day average) 5 mg / kg of water calculated by water consumption, and dexamethasone (Tech America) , Kansas City. Missouri) at a dose of 0.5 mg / kg / 20 ml for the duration of the study Was administered. 159 rats were then inhaled anesthetized (N2O: O2: Halothane mixture ), And re-anesthetized using 8 × 10Four10 μl Hamilt of syngeneic 9L gliosarcoma cells It was collected with a syringe. 8 rats for 100 ratsFourPA317 / G1TkSv Na. 53 producer cells (not co-infected with replication competent virus) Was injected. 28 rats were 4070A replication competent retrovirus 8 × 10 co-infectedFourPA317 / G1TkSvNa. 53 producer cells injected Was done. 25 rats are 8 × 10FourPA317 / G1Tk1SvN. 7 producers Injected with cells. A vector containing 6 rat β-galactosidase genes 8 × 10 to generate particlesFourG1BgSvN. It was injected with 29 producer cells. (This Producer cells, such as, transfect the PA317 cell line with the pG1BgSvNa vector. It is formed by inserting1acZ(Β-galactosidase) Remains The gene replaces the herpes simplex thymidine kinase gene). Next catheter It was flushed with 10 μl saline-phosphate buffer and closed with a steel rod. β Rats injected with the galactosidase producer cell line received 3 days, 6 days, and Sacrifice on the 10th day Was sacrificed. Brain and spinal cord are removed and tissue parts express β-galactosidase Cells were stained with X-gal histochemistry to identify cells (Rum, et al., 199). 3 years).   PA317 / GlTkSvNa. 53 producer cells or 4070A virus PA317 / G1TkSvNa. 53 producer cells are 7 days later Treatment was initiated with robil or rats received an intraperitoneal dose of saline. Gangsik Rats receiving lovir were injected intraperitoneally (30 mg / kg / ml PBS) or Subarachnoid space injection (25 μg / kg, or 600 μg / kg, PBS 10 μ 1) received the drug for 14 days. Low intrathecal dose of 5-10 μg / was chosen to achieve a cerebrospinal fluid concentration of ml, which isIn test tubeEffective anti-research Tumor concentration has been shown (Culver et al., 1992. Rum et al., 199). 3 years). Higher concentrations were selected to overdeliver the drug to the subarachnoid space .   Rats were observed daily for neurological deficit and died 12 to 24 hours later. He was almost always demonstrating the rapidly progressing paraparesis and paraplegia that led. Mante Luhenzell test (Mantel,Cancer Chemotherapy Report, Volume 50, 163-170 pages J. (1966)) described the ganciclovir and saline treatment rat in a survival study. It was used to compare the survival rates between pigs. Because an independent experiment was conducted, Statistical analysis and p-value determination were performed only within the same experimental group. Survival rate (days The average duration of the numbers is shown in Table II below. Group 1 to Group 4 (2 groups Group treated with ganciclovir, 2 groups with salt 4 rats added to each (treated with water) were sacrificed 7 days after treatment Of note, the spinal cord was examined histologically. These rats It was not included in the survival statistics.   PA317 / G1TkSv for Group 1 compared to saline treated rats Na. 53 days after injection of producer cells, ganciclovir was administered intraperitoneally to rats. The results show that the survival rate was significantly extended when exposed. Glue 1 rat The survival curve of is shown in FIG.   For Group 2, the survival rate of ganciclovir-treated rats was determined by saline-treated rats. It was extended compared to that of G. However, group 2 ganciclovir treatment LA The average survival time of the virus is not infected with 4070A replication competent retrovirus No significant differences were seen with rats treated with different producer cells. Pair of spinal cords The weaving appearance was similar in both groups. The survival curve of the rats of group 2 is shown in FIG. It is indicated by 0.   For groups 3 and 4, tumor-invading tumors of saline-treated rats The spinal cord tissue was completely eradicated in ganciclovir-treated animals. The academic examination showed.   For groups 5 and 6, the survival rate of both groups was higher than that of saline-treated rats. The treatment for ganciclovir was extended. PA317 / G1Tk1SvN. 7 The treatment with cells is PA317 / G1TkSvNa. Superior to 53-cell therapy However, the difference was not statistically significant.   Tumor invasion of the leptomeningeal coating of the brain and spinal cord presents a unique therapeutic challenge You. The diffuse nature of this disease is due to its aggressive approach, including radiation and chemotherapy. But results in a limited tumor response, marginal prolongation of survival, And by This will cause a new morbidity rate.   Retrovirus-mediated gene therapy is an attractive therapeutic in the cure of meningeal carcinomatosis Providing options. Retroviral vectors are replication incompetent and therefore Infectious growth from tumor cells to other tumor cells and gene transfer are not possible, so vector To maximize gene transfer to as many tumor cells as possible Will be extremely important. Effective vector delivery is the spinal cord of vector producer cells This is achieved by injection into the liquid. Retroviruses containing herpes simplex thymidine kinase The virus vector particles are continuously released from the circulating vector producer cells, This reaches the entire surface of the tumor infiltrating meninges. Of suicide genes (self-inactivating genes) Selective metastasis to proliferative tumors sensitizes ganciclovir to hardening .   For in vitro determination of retrovirus titers in supernatants from producer cell cultures At 48 hours after exposing the cultured cells to various concentrations of human DSF, It was revealed that there was no significant reduction in kector production.   According to the HStk gene reported hereIn vivoAnti-tumor efficiency related to tumor transduction Show that significant tumoricidal effect was achieved with systemic (intraperitoneal) ganciclovir treatment. I showed you to come. Rats with meningeal carcinomatosis receiving subarachnoid space ganciclovir Histological examination of the spinal cord intestines characteristically invades the limbus of the spinal cord in this model of meningeal carcinomatosis It was shown that the thin layer of tumor was almost completely eradicated.   Third-party effect, herpes simplex thymidine kinase inheritance Non-transduced tumor cells in the vicinity of cells transduced with the offspring-containing vector are cancerous The process by which cyclovir can be completely killed has been previously described. this One of the major components of such third-party effects is It was associated with the transfer of phosphorylated ganciclovir to non-transduced cells. Local cancer This third-party effect occurs when robil interacts with the surface layer of tumor cells in the leptomeninges. It is generated and accounts for the effective tumor rejection of invasive tumors around the spinal cord.   Aggressiveness of 9L tumor cells used in the meningeal carcinomatosis model described in Example 1. Quality and rapid doubling time were observed in rats treated with intraperitoneal ganciclovir. It is shown that the prolonged survival rate exhibited marked killing of tumor cells.   Subarachnoid delivery of vector-producer cells and diffuse infiltrating meninges of suicide genes Metastasis to carcinomatosis significantly prolonged survival after systemic treatment with ganciclovir That resulted in the fact. Such an approach would be a devastating complication in cancer patients The data show that one treatment option can be provided for the treatment of.                               Example 2     Human Gene Therapy for Meningeal Cancer Tumors   Twenty human patients with meningeal carcinomatosis have face A, face B, face C , And Face D. Face A has 3 patients , Face B has 3 patients, face C has 4 patients, and face D has 10 patients. Including.   Each patient has an omare that communicates with an intraventricular catheter for access to cerebrospinal fluid. Accept the bar. Omaya reservoir is a small bubble reservoir and ventricular catheter It consists of tell. The Omaya reservoir is placed just in front of the coronal suture on the left front part of the head. I need to bend my hair. This area is then ready for surgery and sterilized. The skin was infiltrated with local anesthesia and a small incision was made 3 cm to the right of the midline just before the coronary suture. Will be held at. A burr hole opening in the skull is made and the catheter is then flanked by the lateral brain. Inserted in the room. The catheter is attached to the reservoir and the skin is then closed .   After setting up the reservoir, the patient is allowed to recover for 48 hours, during which time the patient will Receive raw material. After 48 hours and prior to administration of mouse producer cells, cerebrospinal fluid Sample removed from reservoir, presence of malignant cells and various tumor markers Will be tested.   2 x 10 for face A patients9PA317 / G1Tk1SvN. 7 producer cells Received an intracerebroventricular injection via the Omaya reservoir. Seven days after the producer cell injection, the patient For intravenous infusion over 1 day at a dose of 5 mg / kg twice a day for 14 hours You will be given more ganciclovir.   2x10 for face B patients9PA317 / G1Tk1SvN. 7 producer cells Received by injection into the right ventricle via Omaya reservoir9PA317 / G1Tk1SvN. Injecting 7 producer cells via spinal catheter to the lumbar subarachnoid space To receive. Seven days after the patient was injected with cells, each patient For intravenous infusion over 1 day at a dose of 5 mg / kg twice a day for 14 hours You will be given more ganciclovir.   2x10 for face C patients9PA317 / G1Tk1SvN. 7 producer cells 2 x injections into the right ventricle via Omaya reservoir for a total of 4 x 109The cell is the right ventricle Given to 2 × 109PA317 / G1Tk1SvN. 2 of 7 producer cells 4 injections into the lumbar subarachnoid space via spinal catheter9Subarachnoid cells Given to the cavity. 7 days after the patient was injected with the producer cells Ganciclovir by intravenous infusion over 1 hour at a dose of 5 mg / kg body weight twice daily Is given.   Cerebrospinal fluid samples from patients in faces A, B and C were given twice daily by the producer Cells for the first 7 days, and 14 days after receiving the producer cells, 2 Vector titers were assayed on days 1, 35, and 48; Monthly titer surveys will continue. Cerebrospinal fluid samples were also analyzed for tumor markers. It is. Cerebrospinal fluid, evaluation of samples, and no evidence of patient toxicity At the time of observation, 10 patients with face D follow the same experimental records as those with face C. Will be treated.                               Example 3     Adenovirus gene transfer to meningeal carcinomatosis A. Construction of pAvS6   The adenovirus structural shuttle plasmid pAvS6 is based on cloning technology. Standard claw containing polymerase chain reaction It was built in several stages using the training technique. First, 2913 base pairs Bgl II, HindIII fragment was removed from Ad-d1327, resulting in a blunt fragment. -Blue Script II Ks- (Stratagen, La Jolla) , California) (FIG. 11) at the XhoI site. Ad-d1327 (Jinmapaya, etc.cell, Vol. 31, p. 543 (1983)) 28591 to 30474 bases (or 78.5 to 8) of the Novirus 5 genome XbaI fragment occupying the E3 region, including the map units up to 4.7) Except that it is the same as adenovirus 5. Orientation of this fragment (Orient BgII site is T7R of Peablue Script II Ks Closest to NA polymerase site and HindIII site is pea blues Which is the closest to the T3 RNA polymerase site of Crypto II Ks. Was. This plasmid was designated pHR (Figure 11).   Second, ITR, envelope signal, Rous sarcoma virus promoter, adenovirus The Ils tripartite leader (TPL) sequence and the binding sequence were integrated using PCR amplification. It was assembled as one block (Fig. 12). ITR and envelope signal (Ad -D1327 1-392 sequence [GenBank, Access # M73260, Ad 5) is a primer containing a NotI or AscI restriction site. Was co-amplified from Ad-d1327 (amplification 1). Rous sarcoma The Ils LTR promoter has AscI and SfiI sites. Plasmid pRC / RSV (209-605 sequence: Amplified from Invitrogen, San Diego, CA (amplification 2) ). The DNA products from amplifications 1 and 2 are NotI primer and SfiI plasmid. Immers were ligated together using the "overlap" PCR method (amplification 3). reaction Between the AscI-containing ends of the respective initial DNA amplification products from 1 and reaction 2 Complementation allowed the binding of these two parts during amplification. Then TPL Ad-d1327 with primers containing SfiI and XbaI sites, respectively. Made from MRNA isolated from 293 cells infected for 16 hours with Amplified from NA (Amplification 4) (Ad-d1327 6049-9730 sequence) [Genbank, Access # M73260, also identical sequence from Ad5 of]). The DNA fragments obtained from amplification reactions 3 and 4 are then Noti and Xb It was ligated using PCR with the aI primer (amplification 5) and thus the complete gene block. Generated.   Third, the ITR-envelope signal-TPL fragment was then purified and NotI And digested with XbaI and inserted into NotI, XbaI digested pHR plasmid. Was. This plasmid was designated pAvS6A, and its orientation is the NotI part of the fragment. Positions were made to be next to the T7 RNA polymerase site (Figure 13).   Fourth, the SV40 early poly A signal was the HpaI-BamHI fragment. Removed from SV40 DNA by T4 SalI portion of plasmid pAvS6- (FIG. 13) treated with DNA polymerase Inserted in position to generate pAvS6 (Figures 13 and 14).B. Construction of Av1LacZ4   Recombinant, replication-defective adenovirus vector Av1LacZ4 It expresses the ctosidase enzyme, which was constructed in two steps. First, SV40 T One transcription unit consisting of DNA encoding amino acids 1 to 4 of the antigen is (Including the nuclear targeting peptide Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val) followed by SV40 T Followed by the DNA encoding the original amino acids 127 to 147, andE. coliβ -Followed by DNA encoding amino acids 6 to 1021 of galactosidase However, this transcription unit was constructed using conventional cloning and PCR techniques, It was placed in the EcoRI site of pAvS6 to generate AvS6n-LacZ. (FIG. 15).   Infectious replication-defective Av1Lacz4 is assembled in 293 cells by homologous recombination Was done. To achieve this, the plasmid pAvS6n-LacZ was KpnI. Linearized by cutting at. Genome-type adenovirus DNA is obtained by the heart extraction method (H was isolated from the purified Ad-d1327 virus by irt extraction) and C1aI The large fragment (about 35 kilobases), which was cleaved with, was separated by agarose gel electrophoresis. Separated and purified. C1aI fragment is for all first generation adenovirus vectors The vector that is used as the backbone of and is derived from this is known as Av1. Can be   5 micrograms of linear plasmid DNA (pAvS6n-LacZ) and 2.5 μg of the large ClaI fragment of Ad-d1327 was then mixed and the phosphate Dish of 293 cells were co-transfected by the Lucium precipitation method. 16 hours later, cells Is 2% of Sea Plaque agar and 2x of medium Topcoat with 1: 1 mixture and puller at 37 ° C in 5% carbon dioxide / atmosphere. Incubation was carried out until dark spots appeared (about 1 to 2 weeks). Plaques are sorted and cells The inner vector was released into the medium after three cycles of freeze-thaw. The lysate is centrifuged The cell debris was removed and clarified. Plaques (300 μl) were sensitive to 293 cells. Used for the first round of dyeing, vector release and clarification as follows .   One 35 mm dish of 293 cells contains 100 μl of plaque lysate plus IMEM- 2 (IMEM plus FBS 2%, glutamine 2 mM (Bio Whittaker 046764)) 400 μl plus IMEM-10 (improved minimal essential medium (Eag Le) plus glutamine 2x plus fetal bovine serum 10% volume / volume plus supplementary glue Infected with 1.5 ml of 2 mM tamin (Bio Whittaker), resulting in cell degeneration Incubated for about 3 days until an effect, circular appearance and "grapey" tufts were observed . Cells and supernatant were collected and designated as CVL-A. AvlLacZ4 Kter (schematic diagram of which is shown in Fig. 16) freezes CVL-A for 3 cycles. Released on melting. A 60 mm dish of 293 cells was then placed in a 0.5 ml CVL-A plate. Infected with 3 ml of Russ IMEM-10, as described above The culture was incubated for about 3 days. The cells and supernatant obtained from this infectious agent are then the same Three freeze-thaw cycles were processed and designated as CVL-B. CVL- B 3 ml plus IMEM-2 42 ml aliquot 2.25 ml 2 Used to infect each of 20 15 cm dishes of 93 cells. 90 minutes insulation After culturing, IMEM-10 was added for about 3 days until the cytopathic effect was observed. The warm culture was continued. Cells from CVL-B and supernatant were harvested, 50 ml Collected in conical tubes and centrifuged for 10 minutes at 1,500 rgm. Fine The cell pellet was resuspended in a reservoir and stored in a 20 ° C freezer.C. Administration of AvlLacZ4 virus to rats with gliosarcoma   A batch of AvlLacZ4 virus has 293 cells (of adenovirus 5 genome Human kidney epithelial cell line containing 11% on the left) 10 plaque formation with AvlLzcZ4 Produced in multiple infections of units (pfu) / cell. Replication-defective vector in this cell The growth of the E1A structurally active region required for viral particle production is This is possible because it can be used as a transactivation region. AvlLacZ4 ui The lus is refined 2-3 × 1011A concentration of pfu / ml resulted.   Syngeneic Fischer rat 9L gliosarcoma cells were transformed into Dulbecco's modified Eagle medium ( Fetal bovine serum 10% (DMEM) (Hyclone Laboratories, Inc. Rated, Logan, Utah, L-Glutamine 2 mM (Jibco BRL, Geiza) The Berg, Maryland), Penicillin 50 units / ml (Zibco), Streptoma Isine 50 μg / ml (Zibco) and fandizone 2.5 μg / ml (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, California) Were propagated in a T-175 tissue culture flask containing.   The 9L glioma model of meningeal carcinomatosis was used. (Cuistra, 1986 ). Twelve 230-350 g Fisher 344 rats were anesthetized and sterile A PE-10 tube was inserted into the upper subarachnoid space through the cisterna magna and fixed to the subcutaneous soft tissue. Was placed and penetrated the skin on the back of the neck. The tube is then a removable steel rod It was blocked. Rats were observed for 5 to 7 days, during which they showed nervous system deficits. Rats were also excluded from this study. One rat to protect the catheter Amoxicillin (5 mg / kg / day, Beecham Laboratories) Bose, Bristnole, Tennessee. Calculated as average water consumption of 21 ml / rat / day And dexamethasone (Tech America, Kansas City, Missouri) ) 0.5 mg / kg / 20 ml was taken orally for the duration of the study. Next rat Inhalation anesthesia (N2O: O2: Halothane mixture) 8 × 10 with 10 μl of salt solutionFourSyngeneic 9L gliosarcoma cells have 10 μl Hamilton It was injected into the subarachnoid space using a syringe. AvlLacZ4 viral particle (PB 1 x 10 per 10 μl of S9Or 2 × 108) Then 6 rats on the day of tumor inoculation And 6 rats 7 days after inoculation. The catheter is PBS Wash with water by adding 10 μl and Enclosed with a cheer rod. Rats received 3, 7, and 10 days after vector injection Was sacrificed by. The brain and spinal cord were removed, dissected, and β-galactosidase was removed. Stained with X-Gal to confirm expressing cells.   β-galactosidase expression was detected using X-gal histochemical staining (bodies. Ndi et al., Histochemistry, Vol. 76, pp. 153-158 (1982)). X- Staining with gall shows that indolyl has the effect of β-galactosidase and subsequent oxidation. Β-galactosidase expression when released from X-gal by self-coupling The cells turn blue, which forms a blue reaction product. Of cultured cellsIn test tubeFine dyeing Cell suspension. Counterstain is Nuclea Fast Red method (NFR method) All at Toggem Behr & Company, Kongen, Germany) It was performed on a tissue specimen.   Tumors 3 days after simultaneous subarachnoid injection of 9L cells and adenovirus vector Homologous transduction of the mass was detected right next to the catheter. Rare positive dyeing Subarachnoid cells were also identified. Simultaneous injection of tumor cells and adenovirus vector Many transduced tumor cells were seen near the catheter tract 7 days after injection, but It was also detected in the ulcer mass itself. Subarachnoid tumors grow significantly larger 10 days after vaccination In addition, subarachnoid tumor infiltration was observed. At this point, the transduced tumor cells are distant Tumor deposits were detected and were detected in the catheter tract itself. As expected, shape The percentage of transduced cells is a result of the expanding tumor mass and dilution of transduced tumor cells. And lower than what was initially observed.   3 days after injection of AvlLacZ4 into established leptomeningeal tumors, The dasase activity removes nerve roots both around the catheter and along the surface of the tumor mass. It was detected on the surface of extensively infiltrated tumors, including the surrounding tumor infiltrate. Depth of transduction Was confined to a few cell layers from the underside of the tumor arachnoid, while in the tumor mass The heart showed no X-gal positive cells. 7 days after vector injection, transduction The incoming cells were confined within the area of the implantation catheter. Most X-Garpo Giving cells could confirm tumor infiltrate in the superior thoracic spinal cord and cauda equina. Vek Although significant transduction was detected close to the implant catheter 10 days after injection of , At a much lower rate than what was observed earlier.   Low concentration of Av1LacZ4 vector (2 x 108pfu / 10 μl) A similar pattern was observed at the same time as the injection or when injected into the established meningeal tumor. Was observed. The transduction rate, however, is higher than that observed with injection of high-concentration vector It was extremely low.   The above results show that Av1LacZ4 was added to the subarachnoid compartment of rats with meningeal carcinomatosis. Injection induces transduction and expression of transgenes in subarachnoid invasive tumors It has occurred. Thus, the vector circulates in the cerebrospinal fluid and at the injection site. Was shown to transduce meningeal tumor cells exposed to cerebrospinal fluid in areas remote from .                               Example 4     Expression of human GM-CSF in the choroid plexus   A differentiated intraventricular organ that grows from the folding of the ependymal cell layer during embryogenesis. The choroid plexus consists of ciliated epithelial cells that surround the mesh of capillaries. That is cerebrospinal fluid ( CSF) is actively secreted into the ventricles. It cleans the surface of the brain and spinal cord and also the brain And circulate within the subarachnoid space to deeply penetrate the Filcho-Robin space of the spinal cord Cycle (Rennels, etc.,Brain research326, pp. 47-63 (1985) ). In contrast to the ependymal cells where it forms, choroid plexus epithelium and endothelial cells It is the most mitotically active cell in the normal adult brain (Johnson, et al.,cancer , 13: 336-342 (1960); Kaplan,Anatomical record1 97, pp. 496-502 (1980)), and therefore retrovirus vector Transducer preferentially receives transduction. The target of this choroid plexus cell Transduction is a therapeutic task involving nerve growth factors, neurotransmitters, enzymes, and hormones. Enables constant secretion into CFS for protein treatment or research .   Whether in vivo transduction of the plexus and secretion of gene products into CSF In order to evaluate whether or not human granule cell microphage colony stimulation factor (hGM -CSF) gene was selected as the model secretory gene for this approach. Was. Producer cells of PA317 retrovirus vector (Miller, et al.,Molecular cell life Physics , Vol. 6, pp. 2895-2902 (1986)) with GlGmSvNa. Engineered to produce the hGM-CSF retroviral vector known as , Which is derived from Moloney murine leukemia virus Krin and others,Virology195, pp. 1-5 (1993)) Of the terminal repeat (LTR) promoter and retroviral packaging signals The human GM-CSF gene is included downstream. This vector also contains the SV40 promoter Contains a neomycin resistance gene which is internally promoted by G1GmSvNa The vector is an amphotropic retrovirus vector derived from NIH 3T3 cells. Packaged by producer cell line PA317. Clone, G-418 selection Human GM-CSF vector producer cells (PA317 / G1GmSv Na. 9) was maintained in culture and harvested by trypsinization just prior to ventricular injection.   Fifteen Fischer 344 rats (250-300 gm) were treated with 20 μl of PBS. 2 x 10 suspended6PA317 / G1GmSvNa. 9 producer cells Injection coordinates: AP-1.0 mm, L 1.5 m from the previous paragraph and dura, respectively m, and DV 3.5 mm) was injected bilaterally into the lateral ventricles. Cerebrospinal fluid And to obtain choroid plexus specimens, rats were injected at 1, 2, 3 and 4 days after cell injection and Sacrificed on day 7 (three animals were pre-made to make three width-paired specimens for each time point). It was sacrificed each day). The brain is removed and the context of the lateral and fourth ventricles The plexus was dissected using a surgical microscope.   DNA was extracted from the choroid plexus sample, 1. Vector producer cell pPAM3 her A primer that specifically anneals to the envelope gene on the perplasmid (mirror, other,Somatic molecular genetics, Vol. 12, pp. 175-183 (1985)), and And 2. Polymers with primers that anneal specifically to the hGM-CSF open reading frame It was amplified using the polymerase chain reaction (PCR). Thus, no amplification of pPAM3 sequence Amplification of human GM-CSF sequence in the presence of human Provide evidence of quality introduction. Choroid plexus transduction was performed 3 days after injection of vector producer cells. PC in 1 rat and 3 rats 7 days after injection of vector producer cells Supplied in writing by Southern analysis on R product. The rest of the choroid plexus Shows that human GM-CSF sequence amplification, as well as pPAM3 sequence amplification, attaches to the choroid plexus. These specimens contained live producer cells that did not allow estimation of the transduction effect. He presented the evidence that Quantitative evaluation of PCR bands obtained from the choroid plexus About 0.4% of the choroid plexes were transduced with the hGM-CSF gene over days. Human GM -Immunohistochemistry using a mouse monoclonal antibody to CSF (Macata, other,Immunology journal147, 1266-1272 (1991)) To choroid plexus epithelial cells after intracerebroventricular injection of human GM-CSF vector producer cells In-situ expression of certain human GM-CSF was confirmed.   Cerebrospinal fluid samples are collected by surgically exposing the cisterna magna and using CSF suction using a capillary tube. Was done. Samples are human GM-CSF enzyme-linked immunosorbent assay (EL). The) was evaluated by. Greater than the lowest Eliza standard curve value (10 pg / ml) Human GM-CSF levels were detected in all CSF samples. Seen in CSF A significant proportion of the human GM-CSF produced is dependent on the human GM-CSF vector producer. The cells themselves contributed there were. However, there were no vector producer cells present in the choroid plexus sample. At that time point, a human GM-CSF level as high as 110 pg / ml was detected. If human When GM-CSF is cleared from cerebrospinal fluid by the bulk flow mechanism Measured levels of cytokines in humans previously secreted by producer cells Combined secretion from transduced choroid plexus epithelium and debris while attenuating GM-CSF It came from the cause.   These results target normal components of the central nervous system with retroviral vectors It proves the principle of Access and delivery of gene vectors By constantly flushing CSF within the exposed choroid plexus and subarachnoid space in the ventricles Facilitated by the distribution of gene products along the craniospinal axis. After the choroid plexus transduction, Although the duration and level of expression of the gene product secreted by CSF varies, Is controlled through repeated injections and the use of vectors containing tissue-specific promoters. You can save. This approach is a drug delivery system that delivers proteins to CSF. It is applied to the treatment as a stem, or the specific gene product is continuously delivered to CSF. It can be used as a research tool to study the effect of budding.   All patents, published information (including published patent applications) cited in this specification, And database entries are as if such individual patents, published information, And each database entry is specifically and individually It was shown that it should be included.   However, the scope of this invention should not be limited to the specific embodiments described above. It must be understood that it is not a kimono. This invention is not specifically described. It can be practiced outside and still be within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレーズ，アール．，マイケル アメリカ合衆国，20854 メリーランド, ロックヴィル，ランカシャー ドライブ 1986 (72)発明者 オールドフィールド，エドワード，エッ チ. アメリカ合衆国，22131 ヴァージニア, フイロモント，ボックス 309────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Inventor Blaise, Earl. ,Michael             20854 Maryland,             Rockville, Lancashire Drive             1986 (72) Inventor Oldfield, Edward, Ed             Ji.             22131 Virginia, United States of America,             Filomont, Box 309

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．哺乳類宿主にある神経系の悪化状態を治療する一つの方法であって； 神経系の前記悪化状態を治療するための治療薬をコード化する核酸配列を含む レトロウイルスベクターを前記哺乳類宿主の脳脊髄液に投与することよりなり、 ここで前記レトロウイルスベクターは生産者細胞系に含まれ、これにより前記生 産者細胞系は前記レトロウイルスベクターから一つのレトロウイルスベクター粒 子を生産し、また前記レトロウイルスベクター粒子は神経系に存在する細胞に前 記治療薬を発現するために前記細胞を形質導入することが出来、ここで前記生産 者細胞は前記宿主の神経系の前記悪化状態を治療するのに有効な量で投与される ことを特徴とする方法。 ２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記神経系の悪化状態が神経 系の腫瘍であり、またここで前記脳脊髄液への前記生産者細胞の投与に際し前記 生産者細胞により生産されるウイルスが前記腫瘍の細胞を形質導入し、また前記 治療薬が前記腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊を提供することの出来 る作用薬であることを特徴とする方法。 ３．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞の成長の阻害、 妨げ、あるいは破壊を提供することの出来る作用薬が前記腫瘍細胞に相互作用薬 に対する感受性を付与する作用薬であり、また前記方法が更に前記相互作用薬を 前記宿主に投与することよりなることを特徴とする方法。 ４．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで前記腫瘍細 胞に相互作用薬に対する感受性を付与する前記作用薬が単純性ヘルペスチミジン キナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、水痘−帯状疱疹ウイルスチ ミジンキナーゼ、およびシトシンデアミナーゼよりなるグループから選択される 負の選択マーカーであることを特徴とする方法。 ５．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記負の選択マーカーが単純 性ヘルペスチミジンキナーゼであることを特徴とする方法。 ６．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記相互作用薬がガンシクロ ビル、アシクロビル、および１−２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビ ノフラノシル−５−ヨードウラシルよりなるグループから選択されることを特徴 とする方法。 ７．前記相互作用薬がガンシクロビルであることを特徴とする請求の範囲第６項 記載の方法。 ８．前記生産者細胞が脳室内で投与されることを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。 ９．前記生産者細胞がクモ膜下で投与されることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 １０．前記生産者細胞が脊髄内で投与されることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 １１．前記生産者細胞が脈絡叢に投与されることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 １２．前記神経系の腫瘍が髄膜癌腫症であることを特徴とする請求の範囲第２項 記載の方法。 １３．前記生産者細胞が用量当り約１×１０9から約１×１０10細胞までの量で 投与されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 １４．前記相互作用薬が宿主体重の約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの量で 投与されることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。 １５．哺乳類宿主にある神経系の腫瘍を治療する一つの方法であって； 腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊を提供出来る一つの作用薬をコー ド化する核酸配列を含む一つのアデノウイルスベクターを前記哺乳類宿主の脳脊 髄液に投与することよりなり、ここで前記アデノウイルスベクターは前記宿主に ある神経系の前記腫瘍を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに有効な量で投与さ れることを特徴とする方法。 １６．請求の範囲第１５項記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスベク ターが前記宿主の脈絡叢に投与され、それによってアデノウイルスベクターが前 記宿主の脳脊髄液に運ばれることを特徴とする方法。 １７．前記腫瘍が髄膜癌腫症であることを特徴する請求の範囲第１５項記載の方 法。 １８．請求の範囲第１５項記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞の成長の阻 害、妨げ、あるいは破壊を提供出来る前記作用薬が前記腫瘍細胞に一つの相互作 用薬に対する感受性を付与する一つの作用薬であり、また前記方法が前記相互作 用薬を前記宿主に投与することよりなることを特徴とする方法。 １９．請求の範囲第１８項記載の方法であって、ここで前記腫瘍細胞に一つの相 互作用薬に対する感受性を付与する前記作用薬が単純性ヘルペスチミジンキナー ゼであることを特徴とする方法。 ２０．前記相互作用薬がガンシクロビルであることを特徴とする請求の範囲第１ ９項記載の方法。[Claims] 1. One method for treating a deteriorating condition of the nervous system in a mammalian host; a retroviral vector comprising a nucleic acid sequence encoding a therapeutic agent for treating the deteriorating condition of the nervous system is provided to the cerebrospinal cord of the mammalian host. Administering to a liquid, wherein the retroviral vector is contained in a producer cell line, whereby the producer cell line produces one retroviral vector particle from the retroviral vector, and the retroviral vector The vector particles are capable of transducing cells present in the nervous system to express the therapeutic agent, wherein the producer cells are effective in treating the exacerbated condition of the host nervous system. The method is characterized in that it is administered in a variable amount. 2. The method according to claim 1, wherein the deteriorating state of the nervous system is a tumor of the nervous system, and the administration of the producer cells to the cerebrospinal fluid is performed by the producer cells. The method wherein the virus produced transduces cells of said tumor and said therapeutic agent is an agent capable of inhibiting, preventing or destroying the growth of said tumor cells. 3. The method of claim 2 wherein the agent capable of inhibiting, hindering or destroying the growth of said tumor cells sensitizes said tumor cells to an interacting agent. And the method further comprises administering the interacting agent to the host. 4. 4. The method of claim 3, wherein the agent that sensitizes the tumor cells to an interacting agent is herpes simplex thymidine kinase, cytomegalovirus thymidine kinase, varicella-zoster virus thymidine kinase. , And a negative selectable marker selected from the group consisting of cytosine deaminase. 5. 5. The method of claim 4, wherein the negative selectable marker is herpes simplex thymidine kinase. 6. The method of claim 4, wherein the interacting agent comprises ganciclovir, acyclovir, and 1-2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil. A method characterized by being selected from a group. 7. 7. The method of claim 6, wherein the interacting drug is ganciclovir. 8. The method of claim 1, wherein the producer cells are administered intracerebroventricularly. 9. The method of claim 1, wherein the producer cells are administered subarachnoidally. 10. The method of claim 1, wherein the producer cells are administered intrathecally. 11. The method of claim 1, wherein the producer cells are administered to the choroid plexus. 12. The method according to claim 2, wherein the tumor of the nervous system is meningeal carcinomatosis. 13. The method of claim 1 wherein said producer cells are administered in an amount of about 1 × 10 9 to about 1 × 10 10 cells per dose. 14． 7. The method of claim 6, wherein the interacting agent is administered in an amount of about 5 mg / kg to about 10 mg / kg of host body weight. 15. A method of treating tumors of the nervous system in a mammalian host, comprising an adenoviral vector containing a nucleic acid sequence encoding an agonist capable of providing inhibition, inhibition or destruction of tumor cell growth. Administration to the cerebrospinal fluid of the mammalian host, wherein the adenovirus vector is administered in an amount effective to inhibit, prevent or destroy the tumor of the nervous system of the host. How to characterize. 16. 16. The method of claim 15, wherein the adenovirus vector is administered to the choroid plexus of the host, whereby the adenovirus vector is delivered to the cerebrospinal fluid of the host. . 17． 16. The method of claim 15, wherein the tumor is meningeal carcinomatosis. 18. 16. The method of claim 15, wherein the agent capable of providing inhibition, inhibition, or destruction of growth of the tumor cells sensitizes the tumor cells to an interacting agent. A method wherein the agent is an agonist and the method comprises administering the interacting agent to the host. 19. 19. The method of claim 18, wherein the agent that sensitizes the tumor cells to an interacting agent is herpes simplex thymidine kinase. 20. The method of claim 19 wherein said interacting agent is ganciclovir.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160035596A (en) * 2013-07-26 2016-03-31 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 Methods and compositions for treating brain diseases

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0707071B1 (en) 1994-08-16 2003-07-30 Crucell Holland B.V. Recombinant vectors derived from adenovirus for use in gene therapy
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
WO1998032869A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
JP4472866B2 (en) 1997-11-06 2010-06-02 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ Neisseria antigen
DE69941567D1 (en) 1998-01-14 2009-12-03 Novartis Vaccines & Diagnostic ANTIGENE FROM NEISSERIA MENINGITIDIS
WO1999045783A1 (en) * 1998-03-12 1999-09-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Producer cells for replication selective viruses in the treatment of malignancy
CN100379757C (en) 1998-05-01 2008-04-09 希龙公司 Neisseria meningitidis antigens and compositions
JP2003518363A (en) 1999-04-30 2003-06-10 カイロン エセ．ピー．アー． Conserved Neisseria antigen
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
GB2397063A (en) * 1999-10-21 2004-07-14 Cedars Sinai Medical Center A medicament comprising a cytotoxic pro drug activated by HSV TK
GB9924981D0 (en) 1999-10-21 1999-12-22 Univ Manchester Gene therapy
PT2275551E (en) 1999-10-29 2015-06-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Neisserial antigenic peptides
AU784518B2 (en) 2000-01-17 2006-04-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Outer membrane vesicle (OMV) vaccine comprising N. meningitidis serogroup B outer membrane proteins
MXPA03003690A (en) 2000-10-27 2004-05-05 Chiron Spa Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a b.
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
ES2386386T3 (en) 2001-12-12 2012-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunization against Chlamydia trachomatis
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
CA2561696C (en) 2004-03-29 2013-09-03 Galpharma Co., Ltd. Novel modified galectin 9 proteins and use thereof
US8420611B2 (en) 2004-08-12 2013-04-16 Cedars-Sinai Medical Center Combined gene therapy for the treatment of macroscopic gliomas
PT2054431E (en) 2006-06-09 2011-11-03 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
US8883493B2 (en) 2007-01-30 2014-11-11 Cedars-Sinai Medical Center Adenoviral vector comprising herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and a transgene for increasing the expression of the transgene
WO2022050885A1 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Johansson Swartling Fredrik Predicting cancer relapse and treatment of cancer diseases

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2051288C (en) * 1990-09-14 2002-02-05 Robert L. Martuza Viral targeted destruction of neoplastic cells
US5529774A (en) * 1991-08-13 1996-06-25 The Regents Of The University Of California In vivo transfer of the HSV-TK gene implanted retroviral producer cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160035596A (en) * 2013-07-26 2016-03-31 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 Methods and compositions for treating brain diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP0723460A1 (en) 1996-07-31
WO1995009654A1 (en) 1995-04-13
CA2171109A1 (en) 1995-04-13
EP0723460A4 (en) 1998-09-30

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