JPH09505462A - In vitro proliferation of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells in serum-free medium. - Google Patents

In vitro proliferation of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells in serum-free medium.

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JPH09505462A JP7507759A JP50775994A JPH09505462A JP H09505462 A JPH09505462 A JP H09505462A JP 7507759 A JP7507759 A JP 7507759A JP 50775994 A JP50775994 A JP 50775994A JP H09505462 A JPH09505462 A JP H09505462A
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Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトの好中球前駆細胞及び巨核球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖のために造血増殖因子と共に用いられるための無血清、動物蛋白質不含の培地組成を提供する。該培地は基本培地、コルチコステロイド、トランスフェリン、インシュリン、コレステロール、エタノールアミン、及びヒトアルブミンを含む。本発明は同様に当該細胞成分が少なくとも約１６％の好中球前駆細胞と少なくとも約１％の巨核球前駆細胞を含むヒトの造血前駆細胞の無血清、動物蛋白質不含の懸濁液を調製する方法を提供する。ヒトの造血細胞の無血清、動物蛋白質不含の懸濁液は、該細胞成分が少なくとも約３０％、好ましくは６０％より多く好中球前駆細胞を含むように調製される。該好中球前駆細胞は芽球、前骨髄球、好中性骨髄球、及び好中性後骨髄球からなる。同様に得られるのは、当該細胞成分が少なくとも約３％、好ましくは８％より多く巨核球前駆細胞を含む無血清、動物蛋白質不含の細胞懸濁液である。同様に得られるのは、該細胞成分はコロニー形成単位及びクラスター形成単位を含む、無血清、動物蛋白質不含の細胞懸濁液である。   (57) [Summary] The present invention provides a serum-free, animal protein-free medium composition for use with hematopoietic growth factors for the in vitro expansion of human neutrophil progenitor cells and megakaryocyte progenitor cells. The medium contains basal medium, corticosteroid, transferrin, insulin, cholesterol, ethanolamine, and human albumin. The present invention also prepares a serum-free, animal protein-free suspension of human hematopoietic progenitor cells, wherein the cellular components comprise at least about 16% neutrophil progenitor cells and at least about 1% megakaryocyte progenitor cells. Provide a way to do. A serum-free, animal protein-free suspension of human hematopoietic cells is prepared such that the cellular components comprise at least about 30%, preferably more than 60% neutrophil progenitor cells. The neutrophil progenitor cells consist of blasts, promyelocytes, neutrophils and postneutrophils. Also obtained is a serum-free, animal protein-free cell suspension in which the cellular constituents comprise at least about 3%, preferably more than 8% megakaryocyte progenitor cells. Also obtained is a serum-free, animal protein-free cell suspension in which the cellular constituents comprise colony forming units and cluster forming units.

Description

【発明の詳細な説明】 無血清培地内での好中球前駆細胞及び巨核球前駆細胞の 試験管内増殖 技術分野 本発明は、一般的には無血清培地中で培養されたヒトの造血細胞に関する。よ り具体的には、本発明は、好中球減少症と血小板減少症の治療に有用な好中球前 駆細胞と巨核球前駆細胞について濃厚化した、無血清細胞懸濁液に関する。 本発明の背景 高投与量の化学療法や高線量の照射のような癌治療は、骨髄中の造血細胞を破 壊し、該患者を好中球と血小板が激しく減少した状態に置く。このような治療の 後は、患者は好中球減少症からくる感染と発熱のため集中治療下でしばしば数週 間を過ごす。血小板減少症は、血小板輸血を必要とする凝固作用の減少や出血性 障害をもたらす。好中球と血小板の不足は、これらの癌治療の後の疾病と死亡の 第一原因であり、癌治療の高いコストの一因となっている。 幾つかの方法は治療後に該患者の免疫系を回復させることに向けられている。 成熟した感染防御細胞へと増殖し分化するよう残った幹細胞を刺激するために、 造血性増殖因子が治療後に投与される。造血性増殖因子は、好中球減少症の全体 の期間を短縮することができるが、該患者がおもい好中球減少でありこのため感 染しやすい、治療直後の重症の１０日から１５日の期間が残る。増殖因子による 刺激をしても該患者の幹細胞が増殖し、成熟した好中球に至るさまざまな分化の 段階を通って、進行するためには１０日から１５日が 必要とされる。巨核球と血小板の回復には、さらに長い、一般的には１５日より も長い時間が要求される。このように増殖因子治療は、該患者の感染防御細胞と 血液凝固能力がその間不足しているギャップを残す。 治療後の骨髄移植もまた、約１０日から１５日後に起こる好中球減少症を改善 することができる。異系同種骨髄移植はしばしばＧＶＨ病を合併することから、 自家骨髄移植が、実際に行えるなら常に好ましい。骨髄は治療前に該患者から収 穫され、凍結され、そして解凍されて治療後に該患者中に移植されて戻される。 自家骨髄移植は、移植された骨髄が腫瘍細胞を含むかもしれないというリスクを 伴う。いずれにしても、骨髄は治療後の重症の１０〜１５日の期間の間の該患者 の免疫を回復させるために十分な成熟した好中球又はそれらの直接の前駆細胞を 含んでいない。 「動員」として知られている現象も、好中球減少症の治療のために末梢血から より多くの数の幹／源細胞を取り出すために同様に利用されてきた。動員は、化 学療法又は造血増殖因子の投与又はその両方の結果として起こる。骨髄中の造血 幹細胞は、骨髄抑制された骨髄の回復の自然の結果として、又は造血増殖因子の 比較的多量の投与に応答して末梢血流の中に「動員」されるものと信じられてい る。動員のために用いられる増殖因子としては、インターロイキン−３（ＩＬ− ３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニ ー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＩＬ−３とＧＭ−ＣＳ Ｆの両方の活性部分を有する組換え融合蛋白質が挙げられる（Ｂｒａｎｄｔ，Ｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３１８：１６９，１９８８；Ｃｒ ａｗｆｏｒｄ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ３２５：１６４，１ ９９１；Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，ＪＣｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７： １６８５，１９８９）。動員された末梢血幹細胞は、化学療法又は増殖因子処置 の後、収穫され、そして次回の高投与の化学療法又は高線量の照射の後、該患者 中に再注輸される。そして該再注輸された幹細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖、分 化し、最終的に該患者の好中球と血小板の数を回復させる。 上記のアプローチの組み合わせは好中球減少の期間を約９日まで短縮させるこ とに成功している。 早期の好中球減少期間の間の患者を治療するための細胞を得るために、分化し た造血細胞が本発明者の研究所においてｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させられた（Ｓ ｍｉｔｈ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏ ｌｏｇｙ ２１：８７０−８７７，１９９３）。他に分化できない好中球の前駆 細胞が、胎仔牛及び馬血清含有培地を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで成功裏に発生さ せられた。しかしながら、該細胞の治療への使用の可能性は、もし該細胞が培養 培地中の動物の血清又は動物の蛋白質なしに増殖されたならば、大いに高められ たであろう。 伝統的には動物血清の補充は培養培地組成において、蛋白質と増殖因子との源 として頼りにされていた。外来の蛋白質の注入によって生じる、生命を脅かす免 疫反応の可能性のため、研究者達は治療のための細胞の増殖のための、動物蛋白 質を含まない培地組成を永い間探してきた。しかしながら、動物血清、特に胎仔 牛血清は、多くの未知の増殖因子を含んでおり、ある因子は、それぞれの細胞の タイプにとって多かれ少かれ重要である。たとえ胎仔牛血清中の全 ての因子が同定されて化学的に合成されても、どの因子がそれぞれの細胞のタイ プの増殖と分化を促進するかを見つけ出すことは、依然として試行錯誤と多くの 実験の問題であろう。該困難性にも係わらず、研究者達はその中で特定の造血細 胞が増殖することのできる無血清培地を処方化することに成功してきた。 牛血清アルブミンとさまざまな造血増殖因子を含んだ無血清培地組成が鼠の骨 髄細胞の増殖を促進することが示された（Ｐｏｎｔｉｎｇ，Ｉ．Ｌ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ４：１６５−１７３，１９９１；Ｍ ｅｒｃｈａｕｖ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ ２：３５６−３６７，１９８４；）。 無血清培地の１３の異なった組み合わせが、ヒトの造血源細胞のｉｎ ｖｉｔ ｒｏでの培養のための血清含有培地の代替物としては望みのないことが証明され た（Ｗｕ，Ｚ−Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２：１４５−１４ ８，１９９０）。白血病細胞の増殖に対する無血清培地の効果が報告された（Ｄ ａ，Ｗ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ７８： ４２−４７，１９９１）。無血清培地における赤血球造血細胞の増殖についても 報告された（Ｌａｎｓｄｏｒｐ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７５：１５０１−１５０９，１９９２）。上記の無血清組成の全ては牛血清 アルブミンの形で動物蛋白質を含んでいた。 ヒトの好中球前駆細胞と巨核球前駆細胞の増殖と分化を助ける無血清の、動物 蛋白質不含の培地組成に対する必要性が残っている。得られる細胞懸濁液は、癌 治療の直後の重症の期間の間、感染防御 細胞と栓球とを回復させるために患者に注入するのに適したものとなるであろう 。 本発明の要約 本発明は、ヒトの好中球前駆細胞と巨核球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増 殖のための、造血増殖因子と組み合わせて用いられるための無血清の、動物蛋白 質不含の培地組成を提供する。該培地は、基本培地、コルチコステロイド、トラ ンスフェリン、インシュリン、コレステロール、エタノールアミン、及びヒトの アルブミンからなる。 本発明はまた、その細胞成分が少なくとも約１６％の好中球前駆細胞と少なく とも約１％の巨核球前駆細胞を含む、ヒトの造血前駆細胞の無血清の、動物蛋白 質不含の懸濁液を製造する方法をも提供する。 その細胞成分が少なくとも約３０％、好ましくは６０％より多く好中球前駆細 胞を含む、ヒトの造血細胞の、無血清の、動物蛋白質不含の懸濁液が提供される 。好中球前駆細胞は、芽球、前骨髄球、好中性骨髄球、及び好中性後骨髄球から なる。 同様に提供されるのは、その細胞成分が少なくとも約３％、好ましくは８％よ り多く巨核球前駆細胞を含む、無血清の、動物蛋白質不含の細胞懸濁液である。 同様に提供されるのは、その細胞成分がコロニー形成単位とクラスター形成単 位を含む、無血清の、動物蛋白質不含の細胞懸濁液である。 図面の簡単な記述 図１は無血清培地（２９５−１）、血清含有培地（ＨＬＴＭ）中 で増残させた培養物の、及び２９５−１において１０日間増殖後その後の追加の １０日間ＨＬＴＭに移された培養物の、分化別細胞カウントを描いている。 図２は１０日間無血清培養における芽球（黒色矢印）を示している。 図３は１０日間無血清培養における前骨髄球（黒色矢印）と好中性後骨髄球（ 中空矢印）を示している。 図４は１０日間無血清培養における好中性骨髄球（黒色矢印）と好中性後骨髄 球（中空矢印）を示している。 図５はフローサイトメトリーにより決定された細胞の表現型を示している。 図６はコロニー（黒色矢印）とクラスター（中空矢印）の典型的な領域を示し ている。 図７は骨髄球細胞（青）の領域における免疫細胞化学的に標識された巨核球前 駆細胞（赤）を示している。 図８はフローサイトメトリーにおける該細胞の前方光散乱を示している。（ａ ）対照 （ｂ）抗ＣＤ４１ａ 図９はフィブリン凝塊アッセイにおいて発達した典型的な巨核球バーストを示 す。 図１０は通常の培地と比較した無血清培養における巨核球細胞増殖の動力学を 示している。 図１１は分離されたＣＤ３４+培養からの巨核球増殖に対する通常の培地と比 較した無血清の培養培地の効果を示している。 図１２は異なった培養における巨核球の増殖比較を示している。 図１３は巨核球増殖に対するさまざまなサイトカインの組み合わせの影響を示 している。 本発明の詳細な記述 本発明は、ヒトの好中球前駆細胞と巨核球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増 殖のための無血清の培地組成を提供する。得られる無血清の、動物蛋白質不含の 細胞懸濁液は、好中球減少症と血小板減少症の治療のために患者に注入するのに 適している。該細胞懸濁液中に動物蛋白質を含まないことは特に有利である。な ぜなら、動物蛋白質はヒトにおいて免疫反応を引き起こすことが知られているか らである。さらに、該懸濁液中の細胞の高い割合が、注入後すぐに患者内で分化 して成熟した好中球、巨核球及び血小板を形成すると期待される、適切に進行し た分化段階にある。 該無血清培地組成における必須の試薬は、基本培地、コルチコステロイド、ト ランスフェリン、インシュリン、コレステロール、エタノールアミン、及びヒト のアルブミンである。 該基本培地は無機塩、ビタミン、アミノ酸、及び、ブドウ糖又はピルビン酸塩 のような少なくとも１つのエネルギー源を含んだいかなる標準の細胞培養培地で あってもよい。好ましくは、該基本培地は重炭酸塩緩衝剤とフェノールレッドの ようなＰＨ指示薬を含む。該最終培地のＰＨは、制御された酸素／炭酸ガス雰囲 気を用いて６．８〜７．４、好ましくは約７．２に保たれる。該基本培地の浸透 圧は好ましくは２６０〜２９０ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲にある。 造血増殖因子が同様に必要である。増殖因子は次のものから選択される。即ち 、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ ）、顆粒球／マクロファージ−コロニー 刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイ キン−１１（ＩＬ−１１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−１（Ｉ Ｌ−１）、スロンボポエチン及びγ−インターフェロンである。増殖因子全体を 、１又はそれより多い因子の活性部分を持つキメラ蛋白質又は融合蛋白質によっ て置き換えることができる。例えば、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦに替えて、ＩＬ− ３とＧＭ−ＣＳＦの両方の活性部分を有する単一の融合蛋白質が用いられること ができる。 該増殖因子は微生物又は哺乳類の単一細胞宿主において組換えによって製造さ れ、そして該増殖因子は対応したヒトの増殖因子の活性部分と同一か又は高度に 相同性のアミノ酸配列を持っている。該因子は、ここに示した培地組成に加えら れたとき宿主蛋白質が検出されない程度にまで、それと関係したいかなる宿主蛋 白質からも高度に精製される。 ここに与えられた開示から、増殖因子の組み合わせと濃度が種々の結果を得る ために操作されてよいことは当業者に明らかであろう。例えば、Ｇ−ＣＳＦとＧ Ｍ−ＣＳＦは好中球の生産を増加させるであろうが、これに対し、スロンボポエ チンは巨核球の生産を増加させるであろう。ここに与えられる該無血清培地組成 は、血清からの混同因子がないことから、個々の増殖因子の機能の同定をさらに 可能にすることが期待される。 ここに、「無血清」という言葉は、動物やヒトのいかなる形の全血清も含んで いない培地組成をいう。ここに、他の血清成分から精製された蛋白質は無血清と 見なす。 ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ）は、該培地において蛋白質源を 提供する。造血細胞が育つことができるように血液の粘度と似た粘度を提供する ために蛋白質が要求されると一般に信じられている。さらには、蛋白質は、さも なければ細胞膜蛋白質を消化しかねないプロテアーゼのための基質として働く。 アルブミンは微量元素と必須脂肪酸のための担体として働くと考えられている。 ＨＳＡは、その低い免疫原性から牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のような動物由来 の蛋白質に対して大きな利点を持つ。該ＨＳＡはプールしたヒトの血漿画分から 得られ、又は細菌及び酵母のような宿主又はジャガイモとトマトのような植物細 胞中において組換えにより製造されることができる。好ましくは、本発明の組成 に使用されている該ＨＳＡはパイロージェンやウイルスを含まず、ヒト患者への 注入に関して規制当局から許可を受ける。該ＨＳＡは該培地に使用するに先立ち 、樹脂ビーズを用いてイオンを除去されてよい。 これらの無血清培地組成に使用されているトランスフェリンとインシュリンは 動物の血清由来でもよいが、組換えにより合成された生産物を使用するのが最も 好ましい。トランスフェリンとインシュリンが動物源由来であれば、それらは他 の動物蛋白質を除去するために精製され、少なくとも９９％純度である。トラン スフェリンは僅か２５〜１２５μｇ／ｍｌでこれらの組成中で使用され、一方イ ンシュリンは僅か１〜２５μｇ／ｍｌで使用される。従って、該培地中のインシ ュリンとトランスフェリン以外の動物蛋白質のいかなる痕跡も、ＨＰＬＣ及びゲ ル電気泳動といった標準の技術を使用しては検知不能である。ここに「動物蛋白 質の実質的不含」という語は、トランスフェリン又はインシュリン以外の動物蛋 白質が検知できない培地組成又は細胞懸濁液をいう。「動物」という語は微生物 とヒトを除外するものと理解される。 好ましくは、該トランスフェリンとインシュリンは細菌及び酵母のような微生 物によって生産された遺伝子工学による蛋白質である。最も好ましくは、該組換 えによるトランスフェリンとインシュリンのアミノ酸配列はヒトのものと同一か 、又は高度に相同性である。このように、ここでの最も好ましい無血清培地組成 は、動物由来の蛋白質を含まず、動物蛋白質の検知不能な存在さえも有さない。 該コルチコステロイド成分は、何らかの自然に存在する又は合成したグルココ ルチコイドホルモンであってもよく、好ましくは１〜１０μＭの濃度のヒドロコ ルチゾンである。該コルチコステロイドはまた、デキサメタゾン、メチルプルド ニゾン、又は臨床的使用に許可された他のグルココルチコイドであってもよい。 コレステロールは化学的に合成された、又はヒトの血清から精製されたもので あってよい。コレステロールは０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、最も好ま しくは０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地組成に使用される。 驚くべきことに、５０〜２００μＭの範囲、好ましくは１００μＭで無血清培 地に加えられたエタノールアミンが好中球と巨核球の前駆細胞の増殖と発生を大 きく増加させることが発見された。β−アミノエチルアルコールとしても知られ ているエタノールアミンは、薬剤の製造において界面活性剤として一般に使用さ れる粘性の、吸湿性の液体である。本培地組成におけるエタノールアミンの正確 な機能は知られていないが、しかしながらこのことは、特にここに与えられた該 特定の培地組成との関連において、その有益な効果の 発見の重要性を減らすものではない。 最も理想的な系においては、無血清培地は毎日新鮮に作られ、該培養物中に連 続的に新しく供給される。しかしながら、フリーラジカルの生成を減少させると 考えられているα−モノチオグリセロールとβ−メルカプトエタノールのような 還元剤が、２０日かそれより長くなる貯蔵時間の間安定性を高めるために該無血 清培地組成に加えられてもよい。還元剤はまた、該培地組成が静的な培養におい て使用され、数日の使用の後にのみ新しくされる場合にも助けとなるであろう。 該培養の細菌感染に対抗する予防措置としてゲンタマイシンのような抗生物質も 該培地に加えられてもよい。 培地”２９５−１”としてここで知られている上述の試薬を含んだ培地組成は 、下で述べられるように好中球前駆細胞の集団内での巨核球前駆細胞の発生に対 して最適であることが見いだされた。しかしながら、該上述の必須の試薬に他の 脂質を添加すると好中球前駆細胞の増殖潜在力を高めることができることが発見 された。所望により、トリグリセリド及び／又はリン脂質が付加的な脂質源とし ｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に代表される、大豆油と卵黄リン脂質から調製され る無菌の、非パイロージェン性の脂肪乳濁液である。このような調合剤は、好ま しくは主としてリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、及びステ アリン酸のような不飽和脂肪酸の中性トリグリセリドの混合物を含む。このよう な調合剤は、卵黄からのホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリ ンを含んでいてもよい。他の脂質源はエタノールによって沈殿され、好ましくは パスツール殺菌によってウイルス不含にされたヒトの 血漿画分である。例えば、増殖を高める培地補充剤、ＮｕｔｒｉｍａｘTM（Ｂａ ｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ）はコーン画分ＩＶ4に由来し、コレステロール並びに トリグリセリドを含む。コレステロール含有脂質調製物が使用される場合、該脂 質調製物が少なくとも約３０μｇ／ｍｌの最終濃度のコレステロールを供給する ことができる限り、上述の２９５−１組成におけるコレステロールを該脂質調製 剤で置き換えることができる。 上述の無血清組成を用いると、好中球と巨核球の前駆細胞の最善の集団がｉｎ ｖｉｔｒｏでつくられる。該細胞は骨髄、臍帯血又は末梢血のいずれからでも 生じる。骨髄サンプルは正常な供与者又は患者のいずれからでも得られることが できる。臍帯血は正常な妊娠後得られる。末梢血は通常の供与者又は癌患者のい ずれからでも得られる。ある場合には、癌患者は、「動員」即ち彼らの幹細胞を 骨髄から彼らの末梢血流に移動させ、それにより彼らの末梢血サンプルにおける 幹／源細胞の数を飛躍的に増加させるため彼らの幹細胞を刺激するため、造血増 殖因子によって処理される。 ここで、「幹／源細胞」という語はＣＤ３４＋細胞表面抗原を有する造血細胞 をいう（幹細胞とコロニー形成単位）。動員されていない末梢血においては、Ｃ Ｄ３４＋細胞の数は全白血球の約０．１％しか構成しない。動員は、ＣＤ３４＋ 細胞の数を全白血球の約１〜４％までにする。臍帯血においては、ＣＤ３４＋細 胞は全白血球の約０．１〜１％を構成する。典型的には正常な骨髄は１〜２％の ＣＤ３４＋細胞を含むのみである。 白血球は勾配による遠心分離のような標準的な方法によって骨髄又は臍帯血又 は末梢血のサンプルから最初に分離される。骨髄から の白血球集団は一般的に約１０〜１５％の骨髄芽球と前骨髄球しか含んでいない （Ｇｅｉｇｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｖｏｌ ３，Ｃ．Ｌｅｎ ｔｎｅｒ，ｅｄ．Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ，１９８４）。ライト−ギムザ染色液により認められるところでは、骨髄内の成 熟した巨核球は該白血球集団の約０．０５％しか構成していない一方、巨核球系 細胞に特異的な免疫染色は、約０．２％まで標識した。健康な個体内では、好中 球と巨核球との前駆細胞は該骨髄内で完全に分化するので、前駆細胞は正常な血 液中には極く稀にしか発見されない。 分離後、白血球は無血清培地において直ちに培養されてもよい。しかしながら 好ましくは、幹／源細胞は正の選択によって該白血球集団から分離される。幹／ 源細胞の正の選択は、ＣＤ３４＋に特異的な抗体へのそれらの結合、それに続く 常磁性のビーズを用いた抗体結合幹／源細胞の分離に基づくものであってもよい （Ｈａｒｄｗｉｃｋ，ＲＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ １：３ ７９−３８６，１９９２；Ｓｍｉｔｈ，ＳＬ，ｅｔ ａｌ．，上記）。 正の選択をされた幹／源細胞は、５，０００乃至１００，０００細胞／ｍｌの 密度範囲、好ましくは１０，０００細胞／ｍｌで培養中におかれる。いかなる標 準の組織培養フラスコ又はバッグが静的又は灌流培養システムのいずれにおいて 使用されてもよい（Ｋｏｌｌｅｒ，ＭＲ，ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯ ＬＯＧＹ １１：３５８−３６３；Ｅｍｅｒｓｏｎ，ＳＧ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣ Ｔ ＷＯ９２／１１３５５）。静的な培養システムが使用された場 合、該細胞は栄養物を補給し、老廃物を除去するために５日乃至７日の間隔で培 地供給される。 細胞は７〜１４日、より好ましくは９〜１２日間無血清培地で培養される。こ の時間において、該細胞懸濁液は好中球減少症と血小板減少症の治療において使 用されるのに適した好中球と巨核球との前駆細胞の集団を含んでいる。無血清培 地組成２９５−１が使用された場合、該細胞集団は少なくとも約１６％の好中球 前駆細胞と少なくとも約１％の巨核球前駆細胞を含んでいる。好ましくは、該細 胞集団は３０％を越える好中球前駆細胞、より好ましくは６０％を越える好中球 前駆細胞を含む。該好中球前駆細胞集団は、成熟した帯状の及び分節のある好中 球の前駆細胞である芽球、前骨髄球、好中性骨髄球、及び好中性後骨髄球からな る（Ｍａｒｍｏｎｔ，ＡＭ．，ｅｔ ａｌ．，ＩＮ ”Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ”，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ，Ｅｄｓ．Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１９０；Ｊａｎｄｌ，ＪＨ １９８７ Ｂｌｏｏｄ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉ ｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ＆Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ／Ｔｏｒｏｎｔｏ，ｐｐ．４４１ −４８０）。 該１０日無血清培養のフローサイトメトリー分析が細胞表面抗原による標識に 基づいて細胞表現型を決定するために行われた。ＣＤ１５抗原に関して正であり 、ＣＤ１１ｂ抗原に関して負である（ＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ−）細胞は主とし て骨髄球と前骨髄球であることが形態学的分析から示されている（Ｓｍｉｔｈ， ＳＬ，ｅ ｔ ａｌ．，上記）。ＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ＋である細胞は主として成熟した 分節のある好中球であることが示されてきた。本発明の該１０日無血清培養は２ ０〜６０％のＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ−の細胞を含んでいることが示された。該 培養が１０日目に無血清から血清含有の培地に移された場合、該表現型はＣＤ１ ５＋／ＣＤ１１ｂ＋標識によって同定されるように主として成熟した形へと前進 的分化するのが見られた（図５ｃ）。 偶然にも、無血清２９５−１で脂質の添加なしに増殖した培養物が巨核球前駆 細胞を高い割合で含んでいることが発見された。ここに「巨核球前駆細胞」とい う語は、免疫染色及び／又はフローサイトメトリーにより同定されるものとして 「ＣＤ４１ａ」としても知られる、血小板／巨核球特異的糖蛋白質IIｂ／IIIａ を発現している有核細胞をいう。該巨核球前駆細胞集団は主として前巨核芽球と 巨核芽球からなっている（Ｌｏｎｇ ＭＷ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １１：３３ −４４，１９９３；Ｐａｕｌｕｓ，ＪＭ，”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓ”，ｉｎ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＷＪ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ），Ｈｅｍａｔ ｏｌｏｇｙ ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｒ Ｙｏｒｋ：１２５１−１２６０ ，１９９０）。 好ましくは、該無血清９〜１２日培養の該巨核球前駆細胞成分は全細胞の約１ ％を構成し、より好ましくは少なくとも該全細胞の約３％、最も好ましくは該全 体細胞の８％より多く構成する。驚くべきことには、無血清培地２９５−１にお けるこれらの結果は対照である血清含有培地において得られたものよりも優れて いた。無血清培地における培養は、対照と比較して３〜２２倍の数の巨核球前駆 細胞を得た。このことは、該血清成分は巨核球前駆細胞の増殖に対して抑制効果 を持つかもしれないことを示唆した。さらに液体培養における巨核球前駆細胞に ついての該細胞集団のこの濃縮は、以前のｉｎ ｖｉｔｒｏでの巨核球培養の報 告に対する大きな進歩を示す（Ｎａｋｅｆ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒ Ｈｅ ａｍａｔ ８：４，１９７５；Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ７２：１７４４，１９７５；Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃ ｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：３３５，１９７７）。 巨核球前駆細胞の非常に濃縮された細胞懸濁液のこの発見は、癌治療によって 生じたものに加え、さまざまなタイプの血小板減少症に効果的な治療を可能にす る。このため、ここに与えられる細胞懸濁液は、血小板減少症の治療において血 小板注入に置き換わるかもしれない。さらに、好中球前駆細胞との巨核球前駆細 胞の高い割合での共存は、これらの無血清細胞懸濁液を血小板減少症と好中球減 少症の同時治療に理想的なものとする。 該上述の細胞集団は、剥奪療法の後の患者に投与された場合、該投与された細 胞は、成熟した好中球と最終的には血小板を生成する巨核球とを生成するために ｉｎ ｖｉｖｏでさらに分化することが期待される。該期待は、この細胞集団を さらに１０日間培養するために血清含有培地に移すと、該集団はより成熟した好 中球形態へと進行するという発見に基づいている（図１）。さらにフィブリン凝 塊アッセイの中においたとき、該巨核球前駆細胞は成熟した巨核球を形成しそし て血小板を放出することが観察される。これらのアッセイからの結果は、該無血 清培養からの細胞はそれらがｉｎ ｖｉ ｖｏの条件に帰された後でもさらなる成熟をすることができることを示唆する。 該７〜１４日の無血清細胞培養の基本的な利点の一つは、上述の通り、より成 熟した好中球と巨核球の前駆細胞のその集団にある。しかしながら、この細胞培 養の他の利点はより早期の細胞のタイプ、即ち増殖と分化の多くの連続したくり 返しが可能な「源細胞」のその小さな集団による。これらの源細胞の娘細胞は好 中球と巨核球のより遅れた集団を供給するために成熟化において該前駆細胞に続 き、それにより該元の細胞懸濁液の注入によって可能な有効な治療の持続を延長 させると期待される。 該好中球の系列内の源細胞はコロニー形成単位（ＣＦＵ）とクラスター形成単 位（ｃｌＦＵ）として同定される。ＣＦＵという語はここでは１４日間血清含有 メチルセルロース培養において平板培養した場合、増殖して、密接に連携した５ ０個又はそれより多い細胞よりなる集団（「コロニー」）を形成する単一の細胞 として定義される。同一の状況下で、ｃｌＦＵは５０個より少ない細胞よりなる 集団（「クラスター」）を形成する。コロニーはライトーギムザ染色によって同 定されるものとしての、それらが含んでいる該細胞のタイプによりさらに定義さ れる（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，上記）。最終的には成 熟した好中球と単球を形成すると期待される該コロニーは、「顆粒球／マクロフ ァージ」又はＧＭと名づけられる。該クラスターは早期の顆粒球前駆細胞とマク ロファージによって（顆粒球のタイプが支配的な状態で）構成される。 該２９５−１無血清組成への脂質の付加は、該集団においてＣＦ ＵとｃｌＦＵの割合を増加させることができることが発見された。コロニー形成 アッセイに示されるように、この細胞集団は好ましくはあわせて約０．５〜３． ０％のＣＦＵとｃｌＦＵが含まれている。上述の細胞集団において、ＧＭ−ＣＦ Ｕは好ましくは全ＣＦＵ／ｃｌＦＵの約５〜５０％をなす。該クラスター内の細 胞は該ＧＭコロニー内の細胞よりもより分化している。従って該集団内の該ｃｌ ＦＵは、該ＧＭ−ＣＦＵが該前駆細胞集団を補充するために十分な数の分割と分 化段階を通過してしまう前に、分化の限定された前駆細胞よりなる橋を提供する と期待される。好ましくは、上述の細胞集団においては、該ｃｌＦＵは、該全体 のＣＦＵ／ｃｌＦＵの約４０〜６０％を構成する。 好中性のＣＦＵとｃｌＦＵに比較して、該巨核球系の細胞コロニーは、それら の分化の独特の形態のため、より少ない細胞を含むであろう。１４日間のフィブ リン凝塊培養中に播種する場合、巨核球バースト形成単位（ＭＫ−ＢＦＵ）が増 殖して４０又はそれより多い巨核球の集団を形成し、多くのコロニーの巣状の発 生を見せる。このため該ＭＫ−ＢＦＵは早期の巨核球源細胞と考えられる。一個 の巨核球コロニー形成細胞（ＭＫ−ＣＦＣ）が増殖して２乃至３９個の巨核球を 形成し、ＭＫ−ＣＦＣは該ＭＫ−ＢＦＵより一層成熟した該巨核球源細胞と考え られる。該単一の巨核球形成単位（Ｓ−ＭＫ）は内分裂（細胞分裂なしのＤＮＡ 複製）をのみすることができ、そして該コロニー培養物中に単一の倍数細胞を形 成する。このように該Ｓ−ＭＫは該ＭＫ−ＣＦＣよりも一層成熟したものと考え られる。フィブリン凝塊アッセイにおける特異的免疫染色によって示されるよう に、ＭＫ−ＢＦＵは巨核球バースト／コロニー形成が できる５〜７日培養における全体細胞の３０〜５７％を示す。無血清培養の１２ 日までに、全ての該ＭＫコロニー形成単位はＭＫ−ＣＦＣ又はＳ−ＭＫまで進む 。フィブリン凝塊アッセイにおけるこれらの結果は、５〜１２日間無血清液体培 養において増殖された該巨核球前駆細胞は成熟した巨核球へ分化する能力がある ことを確認する。 ここに与えられる該無血清細胞懸濁液は、剥奪的癌療法に続く好中球減少症と 血小板減少症を終わらせるために十分な量で患者に投与することができる。これ らの細胞懸濁液における好中球と巨核球の前駆細胞の濃縮は、該患者に戻される 一層少ない全細胞によって望みの細胞の有効治療数を投与することを許容する。 当業者は彼ら自身の臨床的な経験に基づき及び幹細胞注入に関する文献からのガ イドラインを用いて、該細胞懸濁液の投与のための最適な量や条件を決定するこ とができるであろう（Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ５５ ：３１７−３２３；Ｄｏｕａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １４ ：３５８−３６５，１９８６）。 次の実験例は本発明を説明するものであって、その範囲を制限するものではな い。 実施例１無血清培地組成 無血清培地は次のように配合された。最適な濃度は細胞増殖を基礎として別個 の滴定によって決定された。 「２９５−１」組成 Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ，Ｓｉｇｍａ ）又はＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（Ｓｉｇｍａ） ＨＥＰＥＳ緩衝剤、１０〜２５ｍＭ、最適２５ｍＭ ヒドロコルチゾン、１〜１０μＭ、最適２００ｎｇ／ｍｌ トランスフェリン（ヒト完全）（Ｓｉｇｍａ）、２５〜１２５μｇ／ｍｌ、最 適７５μｇ／ｍｌ インシュリン（ヒト、組換え、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏ ｎ，Ｎ．Ｊ．）、１〜２５μｇ／ｍｌ、最適１０μｇ／ｍｌ セレン、０．０１７〜５ｎｇ／ｍｌ、最適５ｎｇ／ｍｌ α−モノチオグリセロール、１０〜１６０μＭ、最適２１６ｎｇ／ｍｌ β−メルカプトエタノール、２０〜１００μＭ、最適５０μＭ ゲンタマイシン、１０〜５０μｇ／ｍｌ、最適５０μｇ／ｍｌ 次のものから選ばれた組換えヒト造血増殖因子、即ちｒＩＬ−３（Ａｍｇｅｎ ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｒＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ）、ｒＧＭ −ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ）、ｒＳＣＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、 及びＰＩＸＹ−３２１（ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの活性部分よりなる組換え蛋白 質，Ｉｍｍｕｎｅｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）である。増殖因子のタイプと濃度 は下のそれぞれの実施例に述べられている。 コレステロール（Ｓｉｇｍａ又はＭｉｌｅｓ）、３０〜６０μｇ／ｍｌ、最適 ６０μｇ／ｍｌ エタノールアミン、５０〜２００μＭ、最適１００μＭ ヒトのアルブミン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ，Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）、０ ．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、最適１０ｍｇ／ｍｌ。ヒトの アルブミンは供給者から受けたままの状態で、及び樹脂ビーズでイオン除去した 後に使用された。該イオン除去の手順は、４°Ｃで０．５〜１．０ｇの混合され た樹脂ビーズ（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ） Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）と共に１００ｍｌの２５％アルブミ ン（ヒト）の溶液Ｂｕｍｉｎａｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ Ｃａｔ Ｎ ｏ．１４２−６４２５）を、該樹脂ビーズが青色から黄色に変わるまで攪拌する ことによって行われた。該溶液は該ビーズをペレット化させるために５分間１０ ００ｒｐｍで遠心分離された。該アルブミン溶液は傾捨され、新しい樹脂ビーズ とともに攪拌手順が繰り返された。該全体の手順が、該ビーズがもはや変色しな くなるまで（通常、４回）繰り返された。 示された実験において、３つの異なったタイプの脂質調製物が組成２９５−１ に加えられた。 ｅｓ Ｉｎｃ．，Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ；コレステロール，４．９６ｍｇ／ｍ ｌ；トリグリセリド，１．６７ｍｇ／ｍｌ）から得られた脂質が１：５０〜１： ５００の間の希釈、最適１：１００、で使用された。 ２．プールされたヒトの血漿からエタノールで沈殿されたコーン画分ＩＶ4か ら得られた脂質をウイルスを殺すためにパスツール殺菌したもの（Ｎｕｔｒｉｍ ａｘTM，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ，Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）の０．２〜５ｍｇ ／ｍｌ。 Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃｌａｙｔｏｎ，ＮＣ；５０％リノール酸、２ ６％オレイン酸、１０％パルミチン酸、９％リノレン 酸、及び３．５％ステアリン酸を含む脂肪酸残基を有する中性トリグリセリド； 主としてホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂 質）０．０３〜２％、最適１％。 それぞれの脂質の貯蔵溶液は、１：１０の希釈でエタノール中に 内で超音波処理された。 対照の血清含有培地（ＨＬＴＭ）は、上述の基本培地、標準補充物と増殖因子 に加え、１２．５％胎仔牛血清と１２．５％馬血清（Ｓｉｇｍａ）から構成され る。 実施例２造血幹／源細胞の調製 単核球細胞は骨髄、臍帯血、又は末梢血のサンプルから得られた。正常の個体 が骨髄と臍帯血を与えた。末梢血細胞は、造血増殖因子の投与によって骨髄から 末梢血に造血細胞が「動員」されている癌患者から得た（Ｂｒａｎｄｔ，ＳＪ， ｅｔ ａｌ．，上記；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上記；Ｎｅｉｄ ｈａｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，上記）。該サンプルの中の細胞はＨｉｓｔｏｐ じて遠心分離によって分離され、界面領域から単核球細胞が収集された（Ｓｍｉ ｔｈ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２１：８７０−８７ ７，１９９３）。 該単核球細胞の懸濁液は以下に述べるように磁性ビーズを使用してＣＤ３４＋ の正の選択性によって幹／源細胞について濃縮された。該単核球細胞を最初に１ ０6個の細胞当たり０．５μｇの抗ＣＤ３４抗体で氷上３０分間感作した〔無血 清細胞培養によって調製さ れ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、そして蛋白質Ｇ親 和性クロマトグラフィ（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓ ｉｏｎ）によって精製された抗ＣＤ３４ ♯９０６９〕。そして該細胞は結合し ていない抗体を除去するためにＩＭＤＭ中における遠心によって３回洗浄され、 ヒツジ抗マウスＩｇＧ1−Ｆｃで被覆した磁性ビーズと１：１のビーズ対細胞の 比率で混合された。次いでビーズと細胞の該混合物は４°Ｃで３０分間回転され た。次いで該ビーズ／細胞複合体は磁性の管ホルダーを用いて分離された。一連 の洗浄の後、ＣＤ３４＋細胞はＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）中で５０Ｕ／ｍ ｌのＣｈｙｍｏｄｉａｃｔ ｏｌｎｓｈｉｒｅ，ＩＬ）を加え、３７°Ｃの水浴内で１５分間インキュベート することによって該ビーズから解放された。次いで該ビーズから解放された該細 胞は、氷上で１５分間ＣＤ３４に対するＦＩＴＣ−８Ｇ１２モノクローナル抗体 （Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎ ｅ，ＣＡ）の染色によりＣＤ３４＋の純度を評価され、記述されたように（Ｓｍ トメーターにより定量された（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊ ｏｓｅ，ＣＡ）。 実施例３無血清培地における造血細胞の培養 ＣＤ３４＋細胞の濃厚化された調製物はポリスチレンフラスコ又はプラスチッ クバッグのいずれかの中で、５×１０3〜１×１０5細胞／ｍｌの初期濃度で無血 清培地で培養された。２５、７５及び １５０ｃｍ2の無処理フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）並び に、組織培養処理フラスコが使用された。該エチルビニルアセテート（ＥＶＡ） ガス透過性プラスチックバッグは２５０、５００、及び１０００ｍｌの容量のＰ Ｌ２６９型であった（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ ）。該２５０ｍｌバッグは２０〜６０ｍｌの細胞懸濁液で満たされ、該５００ｍ ｌバッグは６０〜１００ｍｌの細胞懸濁液で満たされ、そして該１０００ｍｌバ ッグは１００〜４００ｍｌの細胞懸濁液で満たされた。該培養物は以下の実施例 において示される該時間の間、５％ＣＯ2／５％Ｏ2、３７°Ｃ、高湿度の培養器 内に置かれた。該培養物は１：２又は１：４の希釈で５〜７日の間隔で補給され た。 該培養物中の非粘着性の細胞の濃度は、該培養物の０．５ｍｌを９．５ｍｌ， １０％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ）で希釈し、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＺＢＩ（Ｃｏｕ ｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）でカウントするこ とで決定された。 実施例４無血清培地における好中球前駆細胞の増殖の評価 実施例３の該細胞培養物は、培養中の指定された日にサンプルされ、ライト− ギムザ法によって染色され、そして形態学的特徴に基づいて分別的にカウントさ れた（Ｍａｒｍｏｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．”Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ”， ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｄｓ．Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆ ｒａｎｋｌｉｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９ −１９０；Ｊａｎｄｌ，Ｊ．Ｈ．（１９８７）Ｂｌｏｏｄ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏ ｗｎ＆Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ／Ｔｏｒｏｎｔｏ，ｐｐ．４４１−４８０）。 図１は血清含有培地（”ＨＬＴＭ”）における増殖と比較した無血清培地組成 ２９５−１（実施例１）において増殖させた典型的な細胞培養の分別細胞カウン トを表している。造血増殖因子が次のように両方の培地に加えられた。即ち、１ ０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、５００Ｕ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌのＧ Ｍ−ＣＳＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦである。培養の１０日目に、無血清培 地中で増殖させた細胞サンプルは追加の１０日間血清含有培地に移された。 さまざまな細胞タイプの形態例が次の図に示されている。 図２．芽球（黒矢印） 図３．前骨髄球（黒矢印）と好中性後骨髄球（白矢印） 図４．好中性骨髄球（黒矢印）と好中性後骨髄球（白矢印） 帯状核白血球と分節のある好中球（「Ｂａｎｄｓ／Ｓｅｇｓ」、図１）、（最 も成熟した好中性細胞）は標準的な基準に従って容易に認識された（Ｍａｒｍｏ ｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，上記）。図１において「その他」とされている 区分は、ライト−ギムザ染色によって同定されない単球、マクロファージ、及び 巨核球前駆細胞を含む。単球とマクロファージはＡｔｌａｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓにおいて記述されたように同定された（上記，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， ＲＢ，Ｊｒ．，Ｔｈｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｓｙｓ ｔｅｍ，ｐｐ．３２１−３７７）。巨核球前駆細胞は以下述べられるように免疫 細胞化学的な染色によって 同定された。肥満細胞は、それらのヘパリン顆粒のトルイジンブルー染色により 同定されることができるが、該全体細胞集団の０．０１％より少なかった。 分別細胞カウントは、正常の骨髄、臍帯血、そして癌患者から「動員された」 末梢血細胞といったさまざまな源から得られた個々のサンプルの間で大きな差の ため、実験間で変動した。しかしながら典型的には無血清培地で９〜１２日間増 殖させた培養物の好中性細胞分別カウントは、血清含有培地において増殖させた 同じサンプルからの培養と同等であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏで９日乃至１２日の 間の無血清細胞培養は、典型的には１０〜４０％の芽球、１５〜３０％の前骨髄 球、１０〜２５％の好中性骨髄球、１０〜４０％の好中性後骨髄球、及び１０〜 ２２％の「その他」（単球、マクロファージ、及び巨核球前駆細胞）を含んでい た。 細胞が１０日間無血清培地で培養され、そしてさらに追加の１０日間血清含有 培地に移された場合、それらはより成熟した形態に分化した（図１）。２０日目 のそれらの好中性細胞分別カウントは、２０日間全て血清含有培地において培養 されてきた細胞と同等であった 実施例５無血清培地において増殖させた好中球前駆細胞；フローサイトメトリーにより同 定される表現型 培養の１０日と２０日において、１〜２×１０5個の細胞の部分標本が該培養 容器から取り出され、０．０５％の牛血清アルブミンと０．１％のアジ化物（Ｐ ＡＢ）を含んだリン酸塩緩衝食塩水中で１〜２回洗浄された。次いで該細胞はＣ Ｄ１５（ＬｅｕＭ１）ＦＩ ＴＣ接合モノクローナル抗体及びＣＤ１１ｂ（Ｌｅｕ１５）ＰＥ接合モノクロー ナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で氷上１０分間標識された。Ｐ ＡＢ中でさらに１回洗浄された後、該細胞は１ｍｌのＰＡＢ中に懸濁され、そし てＣＤ１５とＣＤ１１ｂの同時発現についてフローサイトメトリーによって分析 された。 １０日目では、ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−表現型は無血清培養において該細胞の ２０〜６０％を構成しており、これは血清含有培養の１０日目のプロフィールと 似ていた（図５ａ，右下の象限）。２０日目では、無血清培地において保持され たきた培養物は依然としてＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−表現型を主として含んでいた （図５ｂ）。対照的に、２０日目においては、１０日目に無血清培地から血清含 有培地に移された培養物はＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋表現型の７０〜１００％分化 した細胞を含んでおり、これは２０日全て血清含有培地において増殖させた培養 物の表現型のプロフィールと類似していた（図５ｃ）。 ＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ−の細胞はＦＡＣＳ細胞分類によって分類され、分化 の前骨髄球と骨髄球の段階にある好中性前駆細胞として形態学的に同定された（ Ｓｍｉｔｈ，ＳＬ，ｅｔ ａｌ．，上記）。ＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ＋の細胞は 分類され、そしてより成熟した型、即ち後骨髄球、帯状核白血球及び分節のある 好中球として同定された。 実施例６無血清培養におけるコロニー形成単位及びクラスター形成単位 細胞は次の増殖因子を用いたさまざまな培地組成において培養された。即ち、 ３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、３００Ｕ／ｍｌのＧ−Ｃ ＳＦ、３００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦである。 培養の０日目及び１０日目において、コロニーアッセイが、ＩＭＤＭ、３０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、７％Ｌｅｐｔａｌｂ ７（Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ）及び１５０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ− ３、２００Ｕ／ｍｌのｒＧＭ−ＣＳＦ、１５０Ｕ/ｍｌのｒＧ−ＣＳＦ、１６０ Ｕ/ｍｌのｒＩＬ−６、及び１０Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（Ａｍｇｅｎ，Ｔ ｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）といった組換え増殖因子を含んだメチル−セ ルロース中において行われた。コロニーアッセイは３５ｍｌ皿（Ｎｕｎｃ）にお いて５乃至１０×１０3細胞／ｍｌで３重に行われ、３７°Ｃで５％ＣＯ2／５％ Ｏ2内でその後の１４日培養の後採点された。コロニーは５０個の細胞よりも大 きい集団と定義され、そしてクラスターは５０個の細胞よりも少ない集団と定義 された（図６をみよ）。該コロニーはライト−ギムザ染色を用いて選びだされた コロニーの周期的な形態学的多様性により、ＣＦＵ−ＧＭ、マクロファージ（Ｃ ＦＵ−Ｍ）、バースト形成単位エリスロイド（ＢＦＵ−Ｅ）又は混合型（ＣＦＵ −Ｍｉｘ）（ミエロイド及びエリスロイド）として肉眼により同定された。結果 は以下の表１〜４に示される。 表１−４のための凡例 Ｐ．Ｉ．＝増殖指数（１０日目の全細胞／０日目の全細胞） ＧＭ Ｉ．＝顆粒球／マクロファージ−コロニー形成指数（１０日培養から形成 されるＧＭコロニー／０日の懸濁液から形成されるＧＭコロニー） Ｍａｃ Ｉ．＝マクロファージコロニー形成指数 ＢＦＵＥ Ｉ．＝バースト形成単位−エリスロイド 指数 Ｍｉｘｅｄ Ｉ．＝混合型コロニー形成指数 Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｉ．＝クラスター形成指数 ＰＢ＝末梢血サンプル Ｂ．Ｍ．＝骨髄サンプル ＣＦＵ＝コロニー形成単位； ＣＥ＝クローニング効率 培養の１０日目における全ての細胞についての該増殖指数は１０〜６０倍の範 囲にわたった。 一般的に、１０日の培養ではＣＦＵ−ＧＭの数は０日目の５〜２０倍に増加し た。１０日の培養ではＣＦＵ−Ｍａｃの数は０日目の２〜１０倍に増加した。特 に１０日の無血清培養におけるクラスター形成単位の数は０日目の１０〜６００ 倍に増加した。 該メチルセルロースアッセイの１４日においては、ＧＭコロニーは全コロニー ／クラスターの約１０〜５０％を構成しており、Ｍａｃコロニーは全コロニー／ クラスターの約５〜２０％を構成しており、そしてクラスターは全コロニー／ク ラスターの約１０〜６０％を構成していた。 典型的には、１０日の無血清培養におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）＋クラ スター形成単位（ｃｌＦＵ）の割合は比較的低く、全細胞の約１乃至５％の範囲 にわたった（％ＣＥ＝％クローニング効率＝全コロニー＋全クラスター（×１０ ０）／播種された全細胞）。しかしながら、該全ＣＦＵ／ｃｌＦＵ内のｃｌＦＵ の割合は比較的高く、全ＣＦＵ／ｃｌＦＵの約１０乃至５０％の範囲にわたった 。１０，０００細胞当たりのクラスター形成単位の絶対数は１６乃至１３６の範 囲にわたった。クラスター形成単位は帯状核白血球及び分節のある好中球のよう な骨髄球のより成熟した形へと直接に増殖する個々の細胞である。 実施例７無血清培地において培養された巨核球前駆細胞の評価 細胞を実施例１において述べられたように無血清培地組成２９５−１によって 、実施例４において述べられたように増殖させた。選 択された培養日において、細胞は顕微鏡用スライド上に細胞遠心され、無水アセ トンによって固定され、そしてＰ２と名付けられた抗ＣＤ４１ａモノクローナル 抗体（ＡＭＡＣ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）と共にインキュベートされた。該 抗体は血小板／巨核球の固有の糖蛋白質質IIｂ／IIIａを認識する。糖蛋白質質I Iｂ／IIIａは巨核球前駆細胞、成熟した巨核球、そして血小板中には存在するが 、他の血球中には存在しない。該１次抗体と共に培養した後、２次抗体（ビオチ ン化ヤギ抗マウス ＩｇＧ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が加えられ、そして該１次抗体と結びつけられた。ス トレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションと、（巨核 球、それらの前駆細胞及びそれらの後代を特異的に標識して赤色を生成するもの である）ペルオキシダーゼ（ＡＥＣ）反応とがこれに続いた。次いで該培養物は 、細胞核に青色を生成するヘマトキシリンで対比染色され、これは陰性細胞の認 識を可能にした（図７をみよ）。 該同一の培養からの細胞はまた、抗ＣＤ４１ａで標識された細胞を検知するた めにフローサイトメトリーによっても分析された。結果は以下の表５〜７に示さ れる。 抗ＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂ（ＧＰ Ｉｂ）及びＣＤ６１（ＧＰ IIIａ）によ って陽性に染色された血小板が、巨核球の系列ではない他の細胞に接着するのが しばしば観察された。表６に示されたように、フローサイトメトリーは偽の陽性 細胞をカウントすることによる血小板接着のアンティファクトの影響を受けてい たことが見出された。このため同じモノクローナル抗体を使用したＣＤ４１ａ免 疫細胞化学が真の巨核球系列細胞を確認するために利用された。表５に示される ように、該粘着性の血小板（「ＰＬ−ＳＴＫ」）の殆どは培養の７〜１０日後に は消失し、同等の結果が免疫細胞化学とフローサイトメトリーから得られた。 フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４１ａ抗原の発現と細胞の大きさが同時 に分析された。図８は１０日間該無血清培地において増殖させた培養サンプルの フローサイトメトリーの点プロットを示している。Ｘ軸は細胞の大きさを計測す る前方光散乱（ＦＳＣ）を示している。より右の方にプロットされたそれらの細 胞はＦＳＣにおいてより高く（ｈＦＳＣ）、細胞の大きさがより大きい。Ｙ軸は ＦＩＴＣ接合抗体染色を測定する緑の蛍光強度を示している。ＦＩＴＣ接合抗マ ウスＩｇＧを用いた該サンプルのアイソタイプ対照染色が図８ａにあり、これは 該細胞への非特異的な抗体結合を示していない。ＦＩＴＣ接合抗ＣＤ４１ａ抗体 と共にインキュベートされた同じ細胞サンプルが図８ｂに示されており、該培養 物中に明確にＣＤ４１ａ陽性の巨核球を示している。該右上の象限にプロットさ れた細胞は大きな巨核球と考えられ、そしてそれらの細胞の大きさは該サンプル における細胞集団の大部分のものより大きい。左上の事象にプロットされた細胞 は小さい巨核球と考えられる。大きな巨 核球は小さな巨核球よりもより成熟していると報告されてきた（Ｔｏｍｅｒ，Ａ ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７０：１６３５−１７４２，１９８７）。表５に 示されるように、大きな巨核球（ｈＦＳＣ）は７〜８日培養における全標識細胞 集団の約１６％を構成した。培養の１０日後、大きな巨核球の頻度は約２２％に 増加し、巨核球成熟において統計的に有意な増加をみせた。 表７に示されるように、無血清培地（２９５）において培養した場合、同一の 供与者からの造血細胞は血清含有培地（ＨＬＴＭ）において培養した場合よりも より多くの巨核球（３〜２２倍）を与える。この結果は、該無血清培養培地は血 清含有培地よりも巨核球増殖のためにより好ましい微細環境を与えることを強く 示す。 実施例８フィブリン凝塊アッセイによって分析された巨核球コロニー形成 培養における選ばれた日において、細胞が無血清フィブリン凝塊コロニー培養 （ＭＫ−ＣＦＣ アッセイ）において播種され、巨核球コロニーを形成するそれ らの能力につき評価された。細胞（２×１０5／ｍｌ）はＩＭＤＭ中に１％ＢＳ Ａ（Ｓｉｇｍａ）、０．０２％フィブリノーゲン（ＫＡＢＩ，Ｓｗｅｄｅｎ）及 び０．０２Ｕ／ｍｌトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を含んだ半固形のフィブリン凝塊 培養培地に懸濁された（Ｚａｕｌｉ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏ ｌ ２０：８５０−８５４，１９９２）。ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、及び／ 又はＩＬ−１１を含むサイトカインが示されるように同様に使用された。該細胞 ／培地懸濁液の０．５ｍｌサンプルが通常の顕微鏡スライド上に置かれた。該ス ライドは湿らせた１５０ｍｍペトリ皿中に置かれ、そして１４日間３７°Ｃ、５ ％ＣＯ2で培養された。この時間の間、元の培養における巨核球前駆細胞は増殖 して、巨核球バースト及びコロニーを形成し又はより成熟した単独の巨核球に分 化した。そして該フィブリン凝塊培養は実施例７に示されたように固定されて免 疫染色された。 前述のＭＫ−ＣＦＣアッセイは以前示されたアッセイに対する幾つかの改良と 利点を提供する。第一にペトリ皿は該巨核球コロニー培養のための基質として顕 微鏡スライドによって置き換えられ、これはこれらの利点を与える： (1)該スライドは免疫細胞化学的検出のための蛋白質抗原を保存するための 最上の固定液である無水アセトンの使用を可能にする。伝統的には該コロニー培 養はアセトン中で溶解するであろうプラスチックのペトリ皿の中で培養されてい た。 (2)該スライドは、各培養のために使用する抗体の量を減少させ、そして染 色の間抗体を乾燥させてしまうことによるアンティファクトを少なくすることに よって免疫染色を容易にする。 (3)該スライドは高拡大能の顕微鏡対物レンズを使用することによりそのま まの状態の該コロニーの明瞭な検査を可能にする。 伝統的な評価方法は、いかなる染色もなしに倒立顕微鏡下に大きな、高屈折性 の細胞のクラスターとして巨核球コロニーが記述されるものである形態的認識（ Ｓｏｎｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８１：６２４−６３０，１９ ９３）、及び暗い緑色（背景）に対する明るい緑色として巨核球コロニーが他の コロニーから識別されるものである免疫蛍光顕微鏡法（Ｂｒｕｎｏ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：６７１−６７７，１９８９；Ｚａｕｌｉ，Ｇ．， ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０： ８５０−８５４，１９９２）を含んでいた。これらの方法はあいまいな結果を与 えた。なぜなら真の巨核球コロニーと、フィブリン凝塊中で同様に増殖する非巨 核球系列のコロニーとを区別することは困難だったからである。 本発明の方法は、該光顕微鏡下に、青色に標識された非巨核球内で特異的な赤 い標識によって巨核球コロニーが同定されるため（図９）、該巨核球コロニーの より正確なカウントを与える。結果が以下の表８にまとめられている。 表８に示されるように、該早期の巨核球源細胞（ＢＦＵ−ＭＫ）は５〜７日の 間は無血清培養（２９５）中においてのみ検出でき、血清含有（ＨＬＴＭ）培養 中には検出できなかった。１２日目においては、無血清培養は血清含有培養より もより多くの巨核球コロニー形成細胞（ＭＫ−ＣＦＣ）及び単一の巨核球（Ｓ− ＭＫ）を含んでいた。無血清培養へのＧＭ−ＣＳＦの添加は巨核球の増殖を容易 にするようであった。 実施例９無血清培地における巨核球の分化 この実施例は血清含有培地と比較して無血清培地内における巨核球へのＣＤ３ ４+細胞培養の増殖と分化をさらに評価する。巨核球分化に対する増殖因子の異 なった組み合わせの効果も同様に決定された。 骨髄（ＢＭ）と末梢血（ＰＢ）からのＣＤ３４+造血細胞の分離と培養は実施 例１乃至３において述べられたものと類似した方法によって実施された。簡潔に 言えば、ＰＢ細胞と血漿の血液成分分離製品が、Ｇ−ＣＳＦ及び／又は化学療法 動員の後４〜１５日の癌患者からＣＳ３０００TM血液細胞分離器（Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌ ｄ，ＩＬ）を使用して同時に収集された。細胞サンプルはクエン酸加ブドウ糖処 方Ａ（ＡＣＤＳ）中に収集され、２％胎仔牛血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含んだＩｓｃｏｖｅ’ｓの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって１：１に 希釈された。低密度ＭＮＣが３００×ｇで２０分間ＨｉｓｔｏｐａｑｕｅTM ｆ ｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）上の密度遠心分離後に得ら れた。血漿は、血小板を除去するために２００×ｇで１０分間回転され、０．４ ５μｍのフィルターを通過させられ、そして−２０°Ｃで貯蔵された。ヒトの線 維素欠乏血清はＤｅｂｉｌｉらによって示されたように（Ｂｌｏｏｄ ８０：３ ０２２（１９９２））ＢＭ移植後の血小板減少症の患者から得た。予備的選別試 験において巨核球刺激機能を示していた線維素欠乏血清及び血漿（ＡＳ）が約１ ０％の最終濃度にてこれらの実験中で使用された。 ＣＤ３４正細胞は少しの改良を伴って実施例２において既に示されたようにし て選択された。要するに、粘着性の細胞は被服されていないポリスチレンＤｙｎ ａｌ常磁性ビーズ（Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌ ｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）と該ＭＮＣを混合することにより除 去された。非粘着性の細胞は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｍＡＢ）９Ｃ５ （Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔ ｈｃａｒｅ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）とともにインキュベートされ、次いで 細胞１に対してビーズ０．５−１の比率でヒツジ抗マウスＩｇＧ1（Ｆｅｎｗａ ｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅ ｌｄ，ＩＬ）で被覆された磁性ビーズと混合された。ビーズ−細胞ロゼットが、 Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−１磁石（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）又はＩｓ ｏｌｅｘTM ５０磁気的細胞分離器（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓ ｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈ ｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を使用した正の選択の後、収 集された。細胞は３７°Ｃ、５％のＣＯ2にて２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３ととも に終夜インキュベーションすることでビーズから遊離された。定量のため、選ば れた細胞の小部分がＣＤ３４に対する別のｍＡＢ、フルオレスセイン（ＦＩＴＣ ）接合８Ｇ１２（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅ ｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）で染色された。フロー サイトメトリーが、該選択された細胞の約８０〜９７％がＣＤ３４陽性であるこ とを明らかにした。 ＢＭ単核球（ＭＮＣ）培養は１０5細胞／ｍｌで開始され、一方ＣＤ３４細胞 培養は１０4細胞／ｍｌで開始された。培養はヒト長期培養培地（ＨＬＴＭ）、 無血清培地（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はヒト血清又は血漿の補充された培地において増殖さ せた。免疫細胞化学及びフローサイトメトリーが実施例７において述べられたよ うに行われた。 培養における巨核球の増殖の動力学はＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６が補充さ れた無血清及びＨＬＴＭ培養において決定された。免疫細胞化学は、０日におけ る培養前にＣＤ４１ａ+細胞が選択されていないＢＭ ＭＮＣの０．０３％（０ ．０１〜０．０５％の範囲、ｎ＝５）を、及び精製されたＢＭ ＣＤ３４+又は ＰＢ ＣＤ３４+細胞の５．３％（２〜９％の範囲、ｎ＝５）をなすことを示し た（図１０、０日目）。播種後の最初の数日間は明らかな細胞増殖は観察されな かった。後の評価のため培養を保持するために、細胞は５日目まで収穫されなか った。培養は１０〜３０日の期間増殖さ れた。幾つかの基質巣がＨＬＴＭ ＢＭ ＣＤ３４細胞又はＭＮＣ培養において 時折形成された。無血清培養では数個の散在したマクロファージ様粘着性細胞は あったが、基質巣はなかった。 ５日目には、全てのＣＤ３４細胞培養が細胞充実性において４〜５倍増加し、 生存細胞は９５％を越えていた。分別細胞カウントは、５日目の無血清のＣＤ３ ４+細胞培養物が６６．２％の芽球（４０〜９８％の範囲）及び３７％の顆粒球 系細胞（９〜５３％の範囲）を含んでいたことを示した。１０〜１２日において は、無血清ＣＤ３４細胞培養物は２１．３±６．５％の芽球（９〜４７％の範囲 ）、７０．３±６．７％の顆粒球性細胞（４２〜８８％の範囲）、８．２±１． ８％のマクロファージ（２〜１４％の範囲）及び時折エリスロイド細胞（５％） を含んでいた。ＨＬＴＭ ＣＤ３４細胞培養は、一般的にはより少ない芽球（９ ．２±３．２％，１〜２２％の範囲）とより多い顆粒球性細胞（７８．２±５． ３％，６５〜９６％の範囲）を含んでいた。細胞の生存性と増殖は無血清培養よ りもＨＬＴＭ培養の方が僅かに高かった。形態学的に認識しうる成熟した巨核球 がＨＬＴＭ培養において発見されたが、無血清培養においては発見されなかった 。骨髄中に存在する成熟した巨核球と比べると、培養で誘導された形態学的に認 識しうる巨核球は、より小さな細胞サイズとより分葉の少ない核（２〜３葉）を 持っていた。 明確なＣＤ４１ａ+細胞が無血清ＣＤ３４培養において１０〜１４日に観察さ れた（図９）。無血清条件下では、ＣＤ４１ａ+巨核球源細胞の割合は血清含有 条件下で観察されるものよりも実質的に高かった。同様に、開始した細胞集団と 比較したこれらの細胞の拡張倍率は、血清含有培地における１４．１倍に対して 無血清培地においては５１倍であった（表９）。これらの細胞はサイトカインＣ Ｄ４１ａ免疫反応性を示し、単一の、分葉していない核と非顆粒性の細胞質を含 んでいた。それらのサイズは周囲の顆粒球と同じか又は僅かに大きかった。それ らは抗体染色なしには光学顕微鏡によって認識できなかった。これらのＣＤ４１ ａ+巨核球系細胞は、無血清ＣＤ３４細胞培養において５〜７日あたりで増加し （１．４±３ ．１％）、１０〜１２日にピークに達し（１６．２±４．３％）、そして１５〜 １７日あたりで減少した（１０．５±０．５％）（図１０）。しかしながら、Ｈ ＬＴＭ培養は全体の培養期間の最初から最後まで巨核球頻度の増加を示さなかっ た（図１０）；しかし巨核球の絶対数は増加し、やはり１０〜１２日においてピ ークに達した。これは主としてそのときの高い細胞充実性及び適度の巨核球頻度 による。形態学的に認識しうる巨核球は１０〜１２日目のＨＬＴＭ培養における 全ＣＤ４１ａ+細胞の約１／５を占めていた。他は、無血清培養において見出さ れるものに類似した形態学的に認識できない巨核球であった。巨核球は１５日目 あたりでＨＬＴＭ培養から消失した。３０日まで進めたＨＬＴＭ培養も巨核球を 回復しなかった。１０〜１２日における無血清又はＨＬＴＭ培養から得られた巨 核球はＣＤ４１ａによって鮮やかに染色され、そして免疫細胞化学及びフローサ イトメトリーによって容易に認識された。 対をなす末梢血ＣＤ３４+細胞培養が、巨核球増殖を維持するための異なった 培養培地の能力比較のために作られた。個々の供与者からの末梢血ＣＤ３４+細 胞を無血清及びＨＬＴＭ培養において増殖させた。培養物には同一のサイトカイ ンの組み合わせが補充され、同一の仕方で再補充された。６つの実験からの結果 が図１１に示されている。実験１〜３はＳＣＦ，ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ −ＣＳＦが補充されたのに対し、実験４〜６はＳＣＦ，ＩＬ−３及びＩＬ−６が 補充された。対をなす培養中の細胞生存性は類似していた。細胞カウントは実験 ２の例外を除いて無血清培養の方がＨＬＴＭ培養よりも通常低かった（図１１） 。無血清培養における巨核球頻度はそれらと対のＨＬＴＭ培養よりも７．６±３ ．１倍高かっ た（３〜２２の範囲）。無血清培養における巨核球の絶対数は、それらと比較さ れるＨＬＴＭ培養よりも１７．４±７．１倍高かった（２〜４５の範囲）（図１ １、巨核球細胞充実性）。 他の独立した実験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの全体の巨核球拡張が、推定 培養巨核球生産を最初の巨核球数で割ることによって計算され、そして該培養さ れた細胞の生存性によって標準化された。巨核球拡張倍率は無血清培地では５１ 倍であり、ＨＬＴＭ培養では１４倍であった（表９）。従って、該無血清培地は 該ＨＬＴＭ培地よりも良く巨核球増殖を維持したが、これはおそらくＣＤ３４+ 細胞からの巨核球分化と巨核球増殖とを容易にすることによるものであろう。 骨髄 ＭＮＣ，骨髄 ＣＤ３４+及び末梢血 ＣＤ３４+細胞を含む異なった細 胞集団からの巨核球増殖の培養培地による支持もまた研究された（図１２）。Ｓ ＣＦ，ＩＬ−３及びＩＬ−６が全ての培養に加えられた。陽性対照として、ＩＭ ＤＭ 骨髄 ＭＮＣ培養にはさらにＡＳが補充された。ＨＬＴＭ培養は、それら が精製されたＣＤ３４+細胞から又は未精製の骨髄 ＭＮＣから得られたもので あるとに関わりなく、２〜３％の巨核球を一定して与えた。骨髄 ＭＮＣを除い て、無血清培養はＨＬＴＭ培養よりもより高い割合の巨核球を与えた。加えて、 無血清末梢血 ＣＤ３４細胞培養は、無血清骨髄 ＣＤ３４細胞培養（９．３± １．６％巨核球，８．９±１．３拡張倍率）よりもより多くの巨核球（１６．１ ±４．３％）を増殖させ、さらにより拡張（２２．０±６．０倍）した（図１２ ）。両方の培養における細胞生存性は似ていた（８０．０±６．０％ 対 ８６ ．３±１．３％）。従って該無血清培地は骨髄 Ｃ Ｄ３４細胞培養におけるよりも末梢血 ＣＤ３４において巨核球増殖をよりよく 支持するように見え、又は始めにより多くの巨核球前駆細胞があったかもしれな い。他方では、該無血清培地はＨＬＴＭ 骨髄 ＭＮＣ培養に比較して不利であ った（図１２）。加えて、該細胞カウントはＨＬＴＭ 骨髄 ＭＮＣ中では増加 したが（４〜１０倍）、無血清骨髄 ＭＮＣ培養においては増加しなかった。骨 髄 ＭＮＣから巨核球の増殖は、ＩＭＤＭ（ヒトのＡＳ含有）及びＨＬＴＭ（動 物の血清含有）において形成されるが無血清培養においては形成されない基質巣 の存在に依存するようにみえた。０日においてＡＳを該無血清培地に添加するこ とは、ＨＬＴＭ及びＩＭＤＭ培地の両方において培地を、骨髄 ＭＮＣから巨核 球増殖を支持するようにした（図１２）。 サイトカインの影響を決定するために、対をなす末梢血 ＣＤ３４+細胞培養 が組み立てられ、そして巨核球増殖を支持する能力につきアッセイされた。典型 的な実験からの結果が図１３に示される。ＨＬＴＭ培養においては、唯一の効果 的なサイトカイン組み合わせはＳＣＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６であった。無血清培 養においては、ＳＣＦ＋ＩＬ−６又はＳＣＦ＋ＧＭ−ＣＳＦの組み合わせがベー スラインの巨核球増殖を支持した。これらの組み合わせのいずれかにＩＬ−３を 加えると巨核球増殖を増加させた（図１３）。ＧＭ−ＣＳＦはＳＣＦ及びＩＬ− ３と組み合わされると巨核球頻度を変化させることなしに、ＩＬ−６より多くの 細胞増殖を刺激した。このためＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＣＦ＋ＩＬ−３を補充された無 血清培養は、ＩＬ−６＋ＳＣＦ＋ＩＬ−３を補充された培養よりも高い全細胞カ ウントと巨核球数を含んでいた（図１３、巨核球細胞充実性）。同 じことは、ＳＣＦ，ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦを補充された無血清 培養（図１１における実験１〜３）をＳＣＦ，ＩＬ−３及びＩＬ−６を補充され た無血清培養（図１１における実験４〜６）と比較したときも真であった。該Ｓ ＣＦ＋ＩＬ−３＋ＧＭ−ＣＳＦの組み合わせに２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１１を加 えてもさらなる巨核球増殖を刺激しなかった（図１３）。不適当な投与量の可能 性を排除するために、ＩＬ−１１は、末梢血 ＣＤ３４+細胞培養においてＳＣ Ｆ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６の組み合わせで５０から８００Ｕ／ｍｌの間の濃度にお いて滴定された。高添加量ＩＬ−１１（４００Ｕ／ｍｌ）は細胞増殖を高めたか もしれないが、巨核球増殖に対するこのサイトカインの組み合わせとＩＬ−１１ との明らかな相乗効果は観察されなかった。 形態学的に認識しうる巨核球は血清含有培養においては発見されたか無血清培 養においては発見されていないため、巨核球増殖と形態学的な分化に対する血清 の効果が評価された。ヒトのＡＳが種々の時に培養に加えられた。０日目におい て、対をなす骨髄 ＣＤ３４細胞培養（ｎ＝３）にＡＳ単独、サイトカイン（Ｓ ＣＦ，ＩＬ−３及びＩＬ−６）単独、又はＡＳ＋サイトカインが補充された。１ ０〜１２日目においては、ＡＳ単独培養は高い巨核球頻度（約１５％）を示した がほとんど細胞拡張（０．５〜１倍）を示さなかった。−方、サイトカイン単独 とサイトカイン＋ＡＳ培養はより低い巨核球頻度（約８％）及び高い細胞拡張（ それぞれ約２０倍及び３８倍）を示した。形態学的に認識しうる巨核球はＡＳ単 独培養及びＡＳ＋サイトカイン培養のそれぞれにおいて、全ＣＤ４１ａ+細胞の １／３〜１／２及び１／７〜１／３の割合を占めた。実質的には巨 核球の形態を有する細胞はサイトカイン単独培養においては発見されなかった。 しかしながら、これらのサイトカイン単独培養に１０〜１２日においてＡＳが加 えられると、形態学的に認識しうる巨核球が３〜４日後に現れ、全ＣＤ４１+細 胞の１／５〜１／３の割合を占めた。対照培養（ＡＳ無添加）における巨核球は 形態学的に認識できないままであった。最初に巨核球形態を除去し、そしてＡＳ ＋サイトカインで刺激された骨髄ＭＮＣ培養は、培養の１０〜１２日後形態学的 に認識しうる巨核球を与えた（全ＣＤ４１ａ+細胞の１／５〜１／３）。これら の結果は、血清は巨核球の形態学的な分化を容易にするために使用されることが できるが、これに対し無血清の条件は未成熟な表現型を支持する傾向があること を示した。 該上の結果は、該無血清培地は、精製されたＣＤ３４+造血源細胞からの巨核 球増殖を維持する点では、該血清含有ＨＬＴＭ培地よりもよいことを示す。無血 清培地において増殖された場合、末梢血 ＣＤ３４+細胞は、骨髄 ＣＤ３４+細 胞より高い巨核球潜在能力を示した。無血清培養から誘導された巨核球の大部分 は該ＧＰIIｂ／IIIａ抗原を示し、そして形態学的には成熟した巨核球としては 認識できないものであった。それらはさらに分化をすることができ、線維素欠乏 血清によるさらなる刺激で巨核球の形態を得た。 実施例１０ヒトの造血細胞の無血清懸濁液 この実施例は先に述べた該２９５−１培地以外の培地におけるヒトの造血細胞 の無血清懸濁液の調製及び培養を示す。 化学療法とＧ−ＣＳＦによって事前処理された乳癌患者からの血 液成分分離された血液製品がシカゴ大学から得られた。ＣＤ３４+細胞はＩｓｏ ｌｅｘTM ５０（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗ ａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）又はＩｓｏｌｅｘTM ３００（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａ ｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）磁気的細胞分離器で血液成分分離された血液製品から選 択された。これらの装置は抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（９Ｃ５）を用いて血 液成分分離血液からＣＤ３４+細胞を選択し、Ｄｙｎａｌ ＩｇＧ1ＦＣ，ＳＴ磁 性ビーズを用いて回収するように設計されている。該９Ｃ５抗ＣＤ３４モノクロ ーナル抗体は該ＩｓｏｌｅｘTM ５０又はＩｓｏｌｅｘTM ３００カラム内で１ ×１０4細胞当たり０．５μｇ（１μｇ／μｌの貯蔵バイアル）で該血液成分分 離血液製品に加えられた。次いで該細胞は該ＩｓｏｌｅｘTM回転器により３０分 間回転された。該細胞は１％ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ）を含んだＲＰＭＩ １６４０中において、未結合の９Ｃ５モノクローナル抗体を除去するために２回 洗浄された。そして該細胞は１０ｍｇ／ｍｌ（１％）ＨＳＡと１ｍｇ／ｍｌ（０ ．１％）ＧａｍｍａｇａｒｄR（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒ ｐ．，Ｈｙｌａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）を含んだＲ ＰＭＩ １６４０で１〜２×１０7細胞／ｍｌまで該カラム内で希釈された。Ｄ ｙｎａｌ ＩｇＧ1ＦＣ，ＳＴ磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａ ｙ）が対細胞ビーズ比率０．５で該細胞懸濁液に加えられ、そして該Ｉｓｏｌｅ ｘTM回転器により３０分間回転された。そして該ＣＤ３４細胞：ビーズ複合体は 磁石を用いて除去された。 該ＣＤ３４+細胞：ビーズ複合物は１％ＨＳＡと１００ｎｇ／ｍｌのＰＩＸＹ ３２１を含んだＸ−ＶＩＶＯ １０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（完全培地）中に３×１０5細胞／ｍｌに再 懸濁された。ＰＩＸＹはＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方に活性なドメインを含む 融合蛋白質である。次いで、得られた細胞：ビーズ複合体の数によって、該懸濁 液はガス透過性の培養バッグ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｒｏｕｎｄｌａｋｅ，ＩＬ）中に 入れられ、そして３７°Ｃで５％二酸化炭素に設定された細胞培養インキュベー ター内で４８時間インキュベートされた。該開始時の培養培地は体積で２０〜５ ０ｍｌであった。これらの容器は第一の培養容器と呼ばれた。 ４８時間の培養遊離期間に続いて、該遊離された細胞はＭａｘＳｅｐTM細胞分 離器（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ ）を用いて該磁性ビーズの除去によって該培養から回収された（培養の９日目） 。そして該遊離された細胞は２次培養容器に移され、そして実施例３において示 されたように培養された。５日目において、該培養は血球計算盤とトリパンブル ー生存性染色を用いて細胞数と細胞生存性につき分析された。次いで該細胞濃度 は完全培地中に１×１０5細胞／ｍｌに再調整され、さらに５日間培養された。 フローサイトメトリー、コロニーアッセイ及び形態学的評価が実施例５〜７に示 されたように行われた。 下の表１０は５日目と１０日目における細胞増殖についての５つの実験結果を まとめており、その表中で、生存増殖指数（Ｐ．Ｉ．）は、５日目又は１０日目 における細胞の全数を０日における細胞の全数で割って、そして％生存性を掛け ることにより計算された。 培養の１０日目における細胞数、全ＣＦＵ、クラスター、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＤ １５+細胞、及び早期の顆粒球の増加もまた決定された。全ＣＦＵ、クラスター 及びＣＦＵ−ＧＭにおける増力は、該Ｐ．Ｉ．に関して０日目に存在する数の１ ０日目における最終数への変化から計算された（表１１）。培養の１０日目にお けるＣＤ１５+細胞と早期の顆粒球の増加は、０日目において該細胞の８０±１ ７％（平均純度）がＣＤ３４+であり芽球と定義されたことを考慮している。 これらの結果は、わずか１％のＨＳＡとＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦ増殖因子を補 充された該無血清Ｘ−ＶＩＶＯ １０培地が１０日の液体培養において好中球源 細胞の増殖を支持し、良好な細胞生存性（８９±３％）を維持することができた ことを示している（表１１）。上述のようにこれらの実験で用いられた該細胞は 、該磁気的細 胞分離器で選択された時に８０±２０％の平均ＣＤ３４純度を有していた（表１ ２）。ＣＤ１５+細胞、ＣＦＵの割合、及び細胞形態学が表１２〜１４に示され ている。細胞形態学によって観察したところでは、早期の顆粒球の頻度は表１４ に示されたように有意差がなかった。しかしながら早期の顆粒球の全数は、細胞 １００個当たりカウントされた細胞数に該Ｐ．Ｉ．を掛けた場合、有意に差があ った。 別の実験において、ＩＬ−３，ＳＣＦ及びＩＬ−６のさまざまな組み合わせが 補充されたＸ−ＶＩＶＯ １０中におけるＣＤ３４+細胞の増殖と巨核球への分 化が評価された。要するに、１％ＨＳＡ，３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３及び２０ｎ ｇ／ｍｌのＳＣＦを含み、４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の添加を伴う又は伴わない Ｘ−ＶＩＶＯ １０培地において、ＣＤ３４+細胞が培養された。培養の１１日 目において、細胞カウントが実施され、免疫細胞化学によってＣＤ４１ａ+細胞 の割合が分析された。５つの独立した実験からの結果 が表１５〜１７において下に示されている。このデーターは以下のことを示す。 即ち、１）ＣＤ４１ａ+細胞はこれらの条件下にこの無血清培地で発生されるこ とができること、及び２）ＩＬ−６の存在又は欠損におけるＣＤ３４+細胞の増 殖指数、ＣＤ４１ａ+細胞の割合、及び巨核球の総数には有意差が見られなかっ たこと。このようにここに記述されたヒトの造血細胞組成物は、ＩＬ−３とＳＣ Ｆをのみを例えば含んだ無血清培地において培養されることができる。 実施例１１ヒトの造血細胞の無血清懸濁液の比較 この実施例はさまざまな無血清培地中でのヒトの造血幹／源細胞の増殖を比較 し、異なった培養から産生される前駆細胞を特徴付ける。 末梢血（ＰＢ）からのＣＤ３４+造血細胞の分離と培養は実施例９に記述され たものと同様の方法によって行われた。シクロホスファミド化学療法からの回復 期にＧ−ＣＳＦを与えられた５ヒトの患者から血液成分分離製品が、増殖及び前 駆細胞の生成の比較のために用いられた。要するに、ＣＤ３４+細胞の分離に続 いて、培養はＸ−ｖｉｖｏ １０、Ｘ−ｖｉｖｏ １５又はＸ−ｖｉｖｏ ２０ （ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）のいずれかの中の１〜５×１０4細胞／ｍｌの密 度の選択された細胞を０日に播種された。これらの培地は３００Ｕ／ｍｌのＩＬ −３、４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを補充され、該培 養は８〜１２日間高湿度下３７°Ｃ、５％ＣＯ2、５％Ｏ2でインキュベートされ た。ＣＤ３４+細胞の割合は、実施例９に記されたようにして決定された。同様 に、フローサイトメトリー、細胞形態学決定及び免疫化学の手順が実施例９に記 述されたようにして行われた。 該３種の培地のいずれかがＣＤ３４+細胞の分別的単離をもたらすか否か決定 するために、ＣＤ３４+細胞の割合が培養の０日においてフローサイトメトリー によって決定された。その結果は、該培地各々において該培養物のＣＤ３４+細 胞の純度が９２％から９９％の間にあって差がないことを示した。同様にＸ−ｖ ｉｖｏ １０ 、Ｘ−ｖｉｖｏ １５又はＸ−ｖｉｖｏ ２０の培地いずれかに遊離された後の 細胞生存性又は形態学においても差は見られなかった。 該ＣＤ３４+細胞の拡張は増殖指数の計算によって培養期間の最後に決定され た（１０日目における細胞の総数／０日目における細胞の数）。全ての５つの培 養から決定された結果は、Ｘ−ｖｉｖｏ １０、１５及び２０について平均増殖 指数がそれぞれ９５．８±２２．０、１１２．０±７．４及び１７０．２±３９ ．５であり、これらの無血清培地間で有意差を見せなかった。しかしながら該５ つの培養のうちの３つにおいて、Ｘ−ｖｉｖｏ ２０で増殖させた細胞の増殖指 数は他の２つの培地のいずれを用いて観察されたものよりも有意に高かった（ｐ ＝０．０４７，対ｔ検定）。これらの結果は全ての３つの無血清培地はヒトの造 血細胞の増殖を助けることを示している。高度に増殖性の培養においては、Ｘ− ｖｉｖｏ ２０は細胞拡張のためにＸ−ｖｉｖｏ １０又はＸ−ｖｉｖｏ １５ のいずれよりも優れている。 早期の好中球前駆体（ＣＤ１５+／ＣＤ１１ｂ-）の割合もまた、該無血清培地 の各々において決定された。得られた該結果はやはり、該培地のいずれにおいて も有意差を示さなかった。具体的には、該５つの培養の各々の好中球前駆細胞の 平均パーセントは、Ｘ−ｖｉｖｏ １０、Ｘ−ｖｉｖｏ １５及びＸ−ｖｉｖｏ ２０についてそれぞれ、２０．７６±５．９８、１７．２０±６．６３及び１ ７．６３±６．２０であった。逆に、より成熟した好中球の割合は１０日間の期 間では全ての培養において５％未満であった。 巨核球の割合もまた上の培養において該培養期間の最後に決定さ れた。該結果は、Ｘ−ｖｉｖｏ １０はＸ−ｖｉｖｏ １５と２０に比べ、フロ ーサイトメトリーによって決定されたところによれば、ＣＤ４１ａ+細胞の有意 に高い割合を有していることを示した（それぞれｐ＝０．０２４７及びｐ＝０． ０２１１ 対ｔ検定）。免疫化学によって評価したとき、該データはフローサイ トメトリーから得られた結果と平行していた。この結果は下の表１８において示 される。 該３つの無血清培地の各々において拡張させた好中球前駆細胞及び巨核球細胞 の総数も同様に評価された。それぞれの系列についての細胞拡張はＣＤ３４+細 胞の初期数（１０6）に１０日目における増殖指数を掛け、そして個々の系列に おける細胞のパーセントを掛けることで決定された。両方の系列について、該結 果は該培地の それぞれの間で有意差がないことを示した。例えば、好中球前駆細胞の拡張倍率 は、Ｘ−ｖｉｖｏ １０、１５及び２０についてそれぞれ、２０．９±４．７、 １７．２０±２．９８及び１７．６３±２．７７であった。巨核球の拡張倍率は Ｘ−ｖｉｖｏ １０、１５及び２０についてそれぞれ、９．７７±３．１、６． ６±１．９及び１２．２±４．７と決定された。 ひとまとめにして上の結果はヒトの造血細胞の無血清懸濁液を得るための、無 血清培地におけるＣＤ３４+細胞の好中球前駆細胞や巨核球へのｉｎ ｖｉｔｒ ｏ拡張の可能性を示す。Detailed Description of the Invention         Neutrophil and megakaryocyte progenitor cells in serum-free medium      In vitro proliferation                              Technical field   The present invention relates generally to human hematopoietic cells cultured in serum-free medium. Yo More specifically, the present invention provides preneutrophils useful in the treatment of neutropenia and thrombocytopenia. It relates to a serum-free cell suspension enriched for progenitor cells and megakaryocyte progenitor cells.                              Background of the invention   Cancer treatments such as high-dose chemotherapy and high-dose irradiation destroy hematopoietic cells in the bone marrow. Disrupt and place the patient in a state of severely reduced neutrophils and platelets. Of such treatment Later, the patient is often under intensive care for several weeks due to infection and fever from neutropenia. Spend the time. Thrombocytopenia is a reduction in coagulation that requires platelet transfusion and hemorrhagic Cause obstacles. Deficiency of neutrophils and platelets causes morbidity and mortality after treatment of these cancers It is the primary cause and contributes to the high cost of cancer treatment.   Several methods are directed to restoring the patient's immune system after treatment. To stimulate the remaining stem cells to proliferate and differentiate into mature protective cells, Hematopoietic growth factor is administered after treatment. Hematopoietic growth factor is a major factor in neutropenia However, the patient has a significant neutropenia and There is a 10 to 15 day period of severe stains that are prone to staining and shortly after treatment. By growth factors Even when stimulated, the stem cells of the patient proliferate and undergo various differentiation leading to mature neutrophils. 10 to 15 days to progress through the stages Needed. Recovery of megakaryocytes and platelets is longer, generally from 15 days Also requires a long time. Thus, growth factor treatment is associated with the protective cells of the patient. Leaving gaps during which blood clotting ability is lacking.   Post-treatment bone marrow transplant also ameliorates neutropenia after about 10 to 15 days can do. Since allogeneic bone marrow transplants are often associated with GVH disease, An autologous bone marrow transplant is always preferred if it can be done. Bone marrow is harvested from the patient prior to treatment Harvested, frozen and thawed and transplanted back into the patient after treatment. Autologous bone marrow transplant carries the risk that the transplanted bone marrow may contain tumor cells. Accompany. In any case, the bone marrow will be treated by the patient during the severe 10-15 day period after treatment. Enough mature neutrophils or their direct progenitor cells to restore the immune system of Does not include.   A phenomenon known as "mobilization" is also used in peripheral blood for the treatment of neutropenia. It has also been utilized to remove higher numbers of stem / source cells. Mobilization It occurs as a result of physiotherapy and / or administration of hematopoietic growth factors. Hematopoiesis in bone marrow Stem cells are either a natural result of myelosuppressed bone marrow recovery or of hematopoietic growth factors. It is believed to be "mobilized" into the peripheral bloodstream in response to relatively large doses. You. As a growth factor used for mobilization, interleukin-3 (IL- 3), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony -Stimulatory factor (GM-CSF), stem cell factor (SCF) and IL-3 and GM-CS Recombinant fusion proteins having both active parts of F can be mentioned (Brandt, S J, et al. ,N Eng J Med  318: 169, 1988; Cr awford, J, et al. ,N Eng J Med325: 164,1 991; Neidhart, J, et al. ,JClin Oncol  7: 1685, 1989). Recruited peripheral blood stem cells are treated with chemotherapy or growth factors After harvesting and subsequent high dose chemotherapy or high dose irradiation, the patient Re-injected into. The re-transfused stem cells then grow and divide in vivo. And eventually restores the patient's neutrophil and platelet counts.   A combination of the above approaches could reduce the duration of neutropenia to about 9 days. And has been successful.   Differentiate to obtain cells to treat patients during the early neutropenia period Hematopoietic cells were generated in vitro in our laboratory (S mith, S.M. L. , Et al. ,Experimental Hemato logy   21: 870-877, 1993). The precursor of neutrophils that cannot be differentiated into other Cells were successfully generated in vitro using medium containing fetal bovine and horse serum. I was sent. However, the potential use of the cells in therapy is that if the cells are cultured Greatly enhanced if grown without animal serum or animal protein in culture Would have been.   Traditionally, supplementation of animal serum is the source of protein and growth factors in the culture medium composition. Was being relied upon. Life-threatening immunity caused by foreign protein infusion Due to the possibility of epidemics, researchers have decided to use animal proteins to grow cells for treatment. We have long sought a quality-free medium composition. However, animal serum, especially fetal Bovine serum contains many unknown growth factors, some of which are More or less important to the type. Even in fetal bovine serum No matter which factor is identified and chemically synthesized, which factor will To find out whether it promotes growth and differentiation of It may be a matter of experiment. Despite the difficulties, researchers have found that certain hematopoietic It has been successful to formulate a serum-free medium in which the cells can grow.   Mouse bone with serum-free medium composition containing bovine serum albumin and various hematopoietic growth factors It has been shown to promote proliferation of medullary cells (Ponting, IL, et al.   al. ,Growth Factors  4: 165-173, 1991; M erchauv, S .; , Et al. ,Internet J Cell C longing   2: 356-367, 1984;).   Thirteen different combinations of serum-free medium were used in human hematopoietic progenitor cells in vitro. Proven as a promising alternative to serum-containing media for ro culture (Wu, ZH., Et al.,Pathology  22: 145-14 8, 1990). The effect of serum-free medium on the proliferation of leukemia cells was reported (D a, W. M. , Et al. ,Brit J Haematology  78: 42-47, 1991). Regarding the proliferation of erythropoietic cells in serum-free medium Reported (Lansdorp, PM, et al.,J Exp Med   175: 1501-1509, 1992). All of the above serum-free compositions are bovine serum It contained animal proteins in the form of albumin.   Serum-free, animal that supports proliferation and differentiation of human neutrophil and megakaryocyte progenitor cells There remains a need for a protein-free medium composition. The resulting cell suspension is cancer Infection protection during the severe period immediately after treatment Will be suitable for injection into a patient to restore cells and thrombocytes .                            Summary of the invention   The present invention is directed to the expansion of human neutrophil progenitor cells and megakaryocyte progenitor cells in vitro. Serum-free, animal protein for use in combination with hematopoietic growth factors A quality-free medium composition is provided. The medium is basal medium, corticosteroid, tiger Insulin, insulin, cholesterol, ethanolamine, and human It consists of albumin.   The present invention is also low in neutrophil progenitor cells whose cellular components are at least about 16%. Serum-free, animal protein of human hematopoietic progenitor cells containing about 1% of megakaryocyte progenitor cells Also provided is a method of making a quality suspension.   Its cellular component is at least about 30%, preferably more than 60% neutrophil precursor cells; A serum-free, animal protein-free suspension of human hematopoietic cells containing cells is provided. . Neutrophil progenitor cells are derived from blasts, promyelocytes, neutrophils, and postneutrophils. Become.   Also provided is at least about 3%, preferably 8% of its cellular components. It is a serum-free, animal protein-free cell suspension containing abundant megakaryocyte progenitor cells.   Also provided is that the cellular components are colony-forming units and cluster-forming units. Is a serum-free, animal protein-free cell suspension containing the cells.                         Brief description of the drawing   Figure 1 is in serum-free medium (295-1), serum-containing medium (HLTM) Of the cultures that had been expanded in Depicts cell counts by differentiation of cultures transferred to HLTM for 10 days.   FIG. 2 shows blast cells (black arrow) in serum-free culture for 10 days.   Figure 3 shows promyelocytes (black arrows) and neutrophil posterior myelocytes ( Hollow arrow) is shown.   Figure 4 shows neutrophil myelocytes (black arrow) and post-neutrophil bone marrow in serum-free culture for 10 days. A sphere (hollow arrow) is shown.   FIG. 5 shows the cell phenotype determined by flow cytometry.   Figure 6 shows typical areas of colonies (black arrows) and clusters (hollow arrows). ing.   Figure 7: Immunocytochemically labeled megakaryocytes in the area of myeloid cells (blue) Shows the cells (red).   FIG. 8 shows forward light scatter of the cells in flow cytometry. (A ) Control (b) Anti-CD41a   Figure 9 shows a typical megakaryocyte burst developed in the fibrin clot assay. You.   Figure 10 shows the kinetics of megakaryocyte proliferation in serum-free culture compared to normal medium. Is shown.   FIG. 11 shows the separated CD34+Normal medium and ratio for megakaryocyte proliferation from culture The effect of the serum-free culture medium compared is shown.   Figure 12 shows a comparison of megakaryocyte proliferation in different cultures.   Figure 13 shows the effect of various cytokine combinations on megakaryocyte proliferation. doing.                       Detailed description of the invention   The present invention is directed to the expansion of human neutrophil progenitor cells and megakaryocyte progenitor cells in vitro. A serum-free medium composition for breeding is provided. The resulting serum-free, animal protein-free Cell suspensions can be infused into patients for the treatment of neutropenia and thrombocytopenia. Are suitable. It is particularly advantageous not to contain animal proteins in the cell suspension. What If so, is animal protein known to cause an immune response in humans? It is. Furthermore, a high percentage of cells in the suspension differentiated within the patient shortly after injection. Are expected to form mature neutrophils, megakaryocytes and platelets, which are properly advanced. It is in the differentiation stage.   The essential reagents in the serum-free medium composition are basal medium, corticosteroid, and Lanceferin, insulin, cholesterol, ethanolamine, and human Of albumin.   The basal medium includes inorganic salts, vitamins, amino acids, and glucose or pyruvate. In any standard cell culture medium containing at least one energy source such as There may be. Preferably, the basal medium comprises bicarbonate buffer and phenol red. Such PH indicators are included. The pH of the final medium is controlled in an oxygen / carbon dioxide atmosphere. It is kept at 6.8 to 7.4, preferably about 7.2. Penetration of the basic medium The pressure is preferably in the range 260-290 mOsm / Kg.   Hematopoietic growth factors are also needed. Growth factors are selected from: That is , Interleukin-3 (IL-3), granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) ), Granulocytes / macrophages-colony Stimulator (GM-CSF), interleukin-6 (IL-6), interleukin Kin-11 (IL-11), stem cell factor (SCF), interleukin-1 (I L-1), thrombopoietin and γ-interferon. Whole growth factor A chimeric or fusion protein having the active portion of one or more factors Can be replaced. For example, instead of IL-3 and GM-CSF, IL- Use of a single fusion protein having both 3 and GM-CSF active moieties Can be.   The growth factor is recombinantly produced in a microbial or mammalian single cell host. And the growth factor is the same as, or highly similar to, the active portion of the corresponding human growth factor. It has a homologous amino acid sequence. The factor was added to the media composition shown here. To the extent that host protein is not detected when exposed to any host protein associated with it. It is also highly purified from white matter.   From the disclosure provided here, different combinations of growth factors and concentrations can be obtained. It will be apparent to those skilled in the art that it may be manipulated to For example, G-CSF and G M-CSF will increase neutrophil production, whereas thrombopoie Chin will increase megakaryocyte production. The serum-free medium composition given here Further identifies the function of individual growth factors due to the lack of confusion factors from serum. Expected to be possible.   Here, the term "serum-free" includes all forms of serum of animals and humans. Refers to the medium composition. Here, the protein purified from other serum components is serum-free. Take a look.   Human serum albumin (HSA) is the source of protein in the medium. provide. Provides a viscosity similar to that of blood so that hematopoietic cells can grow It is generally believed that a protein is required because of. Furthermore, protein is It acts as a substrate for proteases that could otherwise digest cell membrane proteins. Albumin is believed to act as a carrier for trace elements and essential fatty acids. HSA is derived from animals such as bovine serum albumin (BSA) because of its low immunogenicity. Has a great advantage over other proteins. The HSA was derived from pooled human plasma fractions Obtained, or hosts such as bacteria and yeast or plant cells such as potato and tomato. It can be produced recombinantly in the cell. Preferably the composition of the invention The HSA used in is free of pyrogens and viruses, Obtain regulatory approval for infusion. Prior to using the HSA in the medium , Resin beads may be used to remove ions.   Transferrin and insulin used in these serum-free media compositions are It may be derived from animal serum, but it is best to use recombinantly synthesized products. preferable. If transferrin and insulin are of animal origin, they are Purified to remove animal proteins of at least 99% purity. Trang Spherin is used in these compositions at only 25-125 μg / ml, while Insulin is used at only 1-25 μg / ml. Therefore, the Any traces of animal proteins other than urin and transferrin can be analyzed by HPLC and gel. Undetectable using standard techniques such as gel electrophoresis. Here "animal protein The term "substantially free of quality" refers to animal proteins other than transferrin or insulin. A medium composition or cell suspension in which white matter cannot be detected. The term "animal" is a microorganism And is understood to exclude humans.   Preferably, the transferrin and insulin are microbes such as bacteria and yeast. It is a genetically engineered protein produced by a product. Most preferably, the recombinant The amino acid sequences of transferrin and insulin from E. coli are identical to those in humans , Or highly homologous. Thus, the most preferred serum-free medium composition herein Does not contain protein of animal origin and does not even have the undetectable presence of animal proteins.   The corticosteroid component is any naturally occurring or synthetic It may be a ruticoid hormone, preferably hydrocodone at a concentration of 1-10 μM. It is rutizone. The corticosteroids also include dexamethasone, methylplud It may be nizon or other glucocorticoids approved for clinical use.   Cholesterol is either chemically synthesized or purified from human serum. You can Cholesterol is most preferred at a concentration of 0.01-0.1 mg / ml. Preferably, it is used in the medium composition of the present invention at a concentration of 0.05 mg / ml.   Surprisingly, serum-free culture in the range of 50-200 μM, preferably 100 μM. Ethanolamine added to the ground increased the proliferation and development of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells. It was discovered that it would increase sharply. Also known as β-aminoethyl alcohol Ethanolamine is commonly used as a surfactant in drug manufacturing. It is a viscous, hygroscopic liquid. Accuracy of ethanolamine in this medium composition No specific function is known, however, this is especially the case given here. Of its beneficial effects in the context of a particular medium composition It does not diminish the importance of discovery.   In the most ideal system, serum-free medium is freshly made every day and is continuous in the culture. It will be newly supplied continuously. However, reducing the production of free radicals Like considered α-monothioglycerol and β-mercaptoethanol The reducing agent is used to improve stability during storage for 20 days or longer. It may be added to the clear medium composition. The reducing agent also has an effect on the culture in which the medium composition is static. It will also be helpful if used after a few days and only renewed after a few days of use. Antibiotics such as gentamicin may also be used as a preventive measure against bacterial infection of the culture. It may be added to the medium.   A medium composition containing the above-mentioned reagents known herein as medium "295-1" is , As described below, is associated with the development of megakaryocyte progenitor cells within a population of neutrophil progenitor cells. And was found to be optimal. However, other than the above essential reagents, Discovered that the addition of lipids can increase the proliferative potential of neutrophil progenitor cells Was done. If desired, triglycerides and / or phospholipids may be used as additional lipid sources. Bi Pharmacia), prepared from soybean oil and egg yolk phospholipids Sterile, non-pyrogenic, fat emulsion. Such formulations are preferred Mostly linoleic acid, oleic acid, palmitic acid, linolenic acid, and stearic acid. It contains a mixture of neutral triglycerides of unsaturated fatty acids such as formic acid. like this Different formulations include phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine from egg yolk. May be included. The other lipid source is precipitated by ethanol, preferably Of humans made virus-free by Pasteur sterilization Plasma fraction. For example, Nutrimax, a medium supplement that enhances growthTM(Ba xter Hyland) is a corn fraction IVFourDerived from Contains triglycerides. If a cholesterol-containing lipid preparation is used, the fat Quality preparation provides a final concentration of cholesterol of at least about 30 μg / ml As long as possible, the cholesterol in the above-mentioned composition 295-1 is added to the lipid preparation. It can be replaced by an agent.   Using the serum-free composition described above, the best population of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells is in   Made in vitro. The cells can be derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood. Occurs. Bone marrow samples can be obtained from either normal donors or patients it can. Umbilical cord blood is obtained after normal pregnancy. Peripheral blood is normal donor or cancer patient It can be obtained from the gap. In some cases, cancer patients "mobilize" or stem their stem cells. From the bone marrow into their peripheral blood flow, thereby Increase hematopoiesis to stimulate their stem cells to dramatically increase the number of stem / source cells Processed by a growth factor.   Here, the term "stem / source cell" refers to a hematopoietic cell having a CD34 + cell surface antigen. (Stem cells and colony forming unit). In unmobilized peripheral blood, C The number of D34 + cells constitutes only about 0.1% of total white blood cells. Mobilization is CD34 + Bring the number of cells up to about 1-4% of total white blood cells. For cord blood, CD34 + Vesicles make up about 0.1-1% of all white blood cells. Typically 1-2% of normal bone marrow It only contains CD34 + cells.   White blood cells can be harvested from bone marrow or cord blood by standard methods such as gradient centrifugation. Is first isolated from a sample of peripheral blood. From the bone marrow Leukocyte population generally contains only about 10 to 15% of myeloblasts and promyelocytes (Geigy Scientific Tables, Vol 3, C. Len tner, ed. Ciba-Geigy, Basel, Switzerland , 1984). Intramedullary growth was observed with Wright-Giemsa stain. Ripe megakaryocytes make up only about 0.05% of the leukocyte population while the megakaryocyte system Cell-specific immunostaining labeled up to about 0.2%. Neutral in healthy individuals Since the progenitor cells of spheres and megakaryocytes are completely differentiated in the bone marrow, the progenitor cells are normal blood cells. Very rarely found in the liquid.   After separation, leukocytes may be cultured immediately in serum-free medium. However Preferably, stem / source cells are separated from the leukocyte population by positive selection. stem/ Positive selection of source cells follows their binding to antibodies specific for CD34 +, followed by May be based on separation of antibody-bound stem / source cells using paramagnetic beads (Hardwick, RA, et al.,J Hematother  1: 3 79-386, 1992; Smith, SL, et al. ,the above).   Positively selected stem / source cells are 5,000 to 100,000 cells / ml Placed in culture at a density range, preferably 10,000 cells / ml. Any mark Associate tissue culture flasks or bags in either static or perfusion culture systems May be used (Koller, MR, et al.,BIO / TECHNO LOGY   11: 358-363; Emerson, SG, et al. , PC T WO92 / 11355). If a static culture system is used When the cells are fed, the cells are fed at 5-7 day intervals to supplement nutrients and remove waste products. Locally supplied.   The cells are cultured in serum-free medium for 7-14 days, more preferably 9-12 days. This At that time, the cell suspension is used in the treatment of neutropenia and thrombocytopenia. It contains a population of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells suitable for use. Serum-free culture The cell population is at least about 16% neutrophils when the geocomposition 295-1 is used. It contains progenitor cells and at least about 1% megakaryocyte progenitor cells. Preferably, the thin Cell population is greater than 30% neutrophil progenitor cells, more preferably greater than 60% neutrophils Contains progenitor cells. The neutrophil progenitor cell population is a mature zonal and segmented neutrophil It consists of sphere precursors, blasts, promyelocytes, neutrophils, and postneutrophils. (Marmont, AM., Et al., IN "Neutrophils ",Atlas of Blood Cells, Function and Pathology , Eds. Zucker-Franklin, D.M. , Et al. , 2nd Edition, pp. 159-190; Jandl, JH. 1987Blood, Textbook of Hematology, Li Title, Brown & Co. , Boston / Toronto, pp. 441 -480).   Flow cytometric analysis of the 10-day serum-free culture showed labeling with cell surface antigens. Based on the cell phenotype. Positive for the CD15 antigen , CD15 + / CD11b− cells that are negative for the CD11b antigen are predominantly Morphological analysis has shown that they are myelocytes and promyelocytes (Smith, SL, e t al. ,the above). Cells that are CD15 + / CD11b + are largely mature It has been shown to be a segmented neutrophil. The 10-day serum-free culture of the present invention is 2 It was shown to contain 0-60% of CD15 + / CD11b- cells. The When cultures were transferred from serum-free to serum-containing medium on day 10, the phenotype was CD1. Advance to predominantly mature form as identified by 5 + / CD11b + labeling It was seen to undergo specialized differentiation (Fig. 5c).   Coincidentally, cultures grown in serum-free 295-1 without the addition of lipids produced megakaryocyte precursors. It was found to contain a high percentage of cells. The term "megakaryocytic progenitor cell" The term is as identified by immunostaining and / or flow cytometry. Platelet / megakaryocyte-specific glycoprotein IIb / IIIa, also known as "CD41a" Nucleated cells expressing The megakaryocyte progenitor cell population is mainly composed of promegakaryoblasts It consists of megakaryoblasts (Long MW,Stem Cells  11:33 -44, 1993; Paulus, JM, "Platelet kinetic". s ", in: Williams, WJ, et al., (eds),Hemat logic , McGraw-Hill, Ner York: 1251-1260. , 1990).   Preferably, the megakaryocyte progenitor cell component of the serum-free 9-12 day culture is about 1% of total cells. %, More preferably at least about 3% of the total cells, most preferably the total cells. Make up more than 8% of somatic cells. Surprisingly, serum-free medium 295-1 These results are superior to those obtained in the control serum-containing medium. Was. Culturing in serum-free medium resulted in 3 to 22 times the number of megakaryocyte precursors compared to the control. Cells were obtained. This means that the serum component has an inhibitory effect on the proliferation of megakaryocyte progenitor cells. Suggested that you may have. In addition to megakaryocyte progenitor cells in liquid culture This enrichment of the cell population with respect to previous in vitro megakaryocyte culture reports Great progress on the announcement (Nakef, A., et al.,Ser He amat   8: 4,1975; Metcalf, D .; , Et al. ,PNAS   72: 1744, 1975; Dexter, T .; N. , Et al. ,J C ell Physiol   91: 335, 1977).   This discovery of a highly concentrated cell suspension of megakaryocyte progenitor cells was demonstrated by cancer treatment. Allows effective treatment of various types of thrombocytopenia in addition to those that have occurred You. For this reason, the cell suspension given here is used in the treatment of thrombocytopenia. It may replace platelet injection. In addition, megakaryocyte precursor cells with neutrophil progenitor cells Coexistence of a high proportion of cells causes these serum-free cell suspensions to thrombocytopenic and neutropenic. Ideal for simultaneous treatment of minor symptoms.   When the cell population described above is administered to a patient after deprivation therapy, the cell population administered. Vesicles to produce mature neutrophils and megakaryocytes that eventually produce platelets It is expected to be further differentiated in vivo. The expectation is that this cell population Upon transfer to serum-containing medium for a further 10 days of culture, the population became more mature and favorable. It is based on the finding that it progresses to a sphere shape (Fig. 1). Further fibrin tension When placed in the clot assay, the megakaryocyte progenitor cells form mature megakaryocytes. To release platelets. The results from these assays are The cells from the clear culture are It suggests that further maturation is possible even after being attributed to vo conditions.   One of the basic advantages of the 7 to 14 day serum-free cell culture is that it consists of It is in that population of mature neutrophils and megakaryocyte progenitor cells. However, this cell culture Another benefit of feeding is the earlier cell type, namely, the many sequential processes of proliferation and differentiation. Due to its small population of "source cells" that can be returned. The daughter cells of these source cells are Following the progenitor cells at maturation to supply a more delayed population of neutrophils and megakaryocytes Thus prolonging the duration of effective therapy possible by injecting the original cell suspension Expected to do.   Source cells within the lineage of neutrophils are colony forming units (CFU) and cluster forming single cells. Position (clFU). The term CFU is used here for 14 days containing serum When plated in methylcellulose culture, they proliferated and worked closely 5 Single cells forming a population ("colony") of zero or more cells Is defined as Under the same circumstances, clFU consists of less than 50 cells Form a group ("cluster"). The colonies were identified by Wright-Giemsa staining. Further defined by the type of cells they contain, as defined (Zucker-Franklin, et al., Supra). Finally achieved The colonies expected to form monocytes with ripe neutrophils were identified as "granulocytes / macrophages." "Age" or GM. The cluster consists of early granulocyte progenitor cells and It is composed by rophage (with the predominance of granulocyte type).   Addition of lipids to the 295-1 serum-free composition resulted in CF in the population. It has been discovered that the ratio of U to clFU can be increased. Colony formation As shown in the assay, this cell population is preferably combined to about 0.5-3. It contains 0% CFU and clFU. In the above cell population, GM-CF U preferably makes up about 5-50% of the total CFU / clFU. The clusters within the cluster Vesicles are more differentiated than cells within the GM colony. Therefore the cl within the population FU is a sufficient number of splits and splits for the GM-CFU to recruit the progenitor cell population. Provide a bridge of limited-differentiation progenitor cells before they go through the developmental stage Is expected. Preferably, in the above cell population, the clFU is CFU / clFU of about 40-60%.   Compared to neutrophil CFU and clFU, the megakaryocyte colonies It will contain fewer cells due to the unique morphology of the differentiation of. 14 days five When seeding during phosphorus coagulation culture, megakaryocyte burst forming units (MK-BFU) are increased. Breeding to form a population of 40 or more megakaryocytes, with nesting of many colonies Show life. Therefore, the MK-BFU is considered to be an early megakaryocyte source cell. one Megakaryocyte colony forming cells (MK-CFC) grow to produce 2 to 39 megakaryocytes. Formed, and the MK-CFC is considered to be the more mature megakaryocyte source cell than the MK-BFU. Can be The single megakaryocyte forming unit (S-MK) is an internal division (DNA without cell division). Replication) and form single ploidy cells in the colony culture. To achieve. Thus, the S-MK is considered to be more mature than the MK-CFC. Can be As shown by specific immunostaining in the fibrin clot assay In addition, MK-BFU has a megakaryocyte burst / colony formation Shows 30-57% of total cells in 5-7 day culture that can be done. 12 of serum-free culture By day, all the MK colony forming units have progressed to MK-CFC or S-MK . These results in the fibrin clot assay show that serum-free liquid culture for 5-12 days. The megakaryocyte progenitor cells propagated in culture are capable of differentiating into mature megakaryocytes Make sure that.   The serum-free cell suspension given here is associated with neutropenia following deprivation cancer therapy. It can be administered to a patient in an amount sufficient to end thrombocytopenia. this Enrichment of neutrophil and megakaryocyte progenitor cells in their cell suspension is returned to the patient Allowing an effective therapeutic number of desired cells with fewer whole cells. Those skilled in the art will be guided by their own clinical experience and from the literature on stem cell injection. Idline can be used to determine the optimal amount and conditions for administration of the cell suspension. (Spitzer, G., et al.,Blood  55 : 317-323; Douay, et al. ,Exp Hematol  14 : 358-365, 1986).   The following experimental examples illustrate the invention but do not limit its scope. Yes.                              Example 1Serum-free medium composition   The serum-free medium was formulated as follows. Optimal concentration is distinct based on cell growth Determined by titration.                          "295-1" composition   Isocove's modified Dulbecco's medium (IMDM, Sigma ) Or McCoy's 5A (Sigma)   HEPES buffer, 10-25 mM, optimal 25 mM   Hydrocortisone, 1-10 μM, optimal 200 ng / ml   Transferrin (human complete) (Sigma), 25-125 μg / ml, max. Suitable 75 μg / ml   Insulin (human, recombinant, Novo Nordisk, Princeto n, N. J. ), 1 to 25 μg / ml, optimal 10 μg / ml   Selenium, 0.017-5 ng / ml, optimal 5 ng / ml   α-monothioglycerol, 10-160 μM, optimal 216 ng / ml   β-mercaptoethanol, 20-100 μM, optimal 50 μM   Gentamicin, 10-50 μg / ml, optimal 50 μg / ml   Recombinant human hematopoietic growth factor selected from: rIL-3 (Amgen , Thousand Oaks, CA), rG-CSF (Amgen), rGM -CSF (Amgen), rSCF (Genzyme, Boston, MA), And PIXY-321 (recombinant protein comprising the active portion of IL-3 and GM-CSF Quality, Immunex, Seattle, WA). Growth factor type and concentration Are described in the respective examples below.   Cholesterol (Sigma or Miles), 30-60 μg / ml, optimal 60 μg / ml   Ethanolamine, 50-200 μM, optimal 100 μM   Human albumin (Baxter Hyland, Duarte, CA), 0 . 1-25 mg / ml, optimal 10 mg / ml. Human Albumin was deionized as received from the supplier and with resin beads Later used. The ion removal procedure was performed by mixing 0.5-1.0 g at 4 ° C. Resin beads (AG501-X8 (D)   Biorad, Richmond, CA) with 100 ml of 25% albumi Solution of human (human) Buminate (Baxter Hyland Cat N o. 142-6425) is stirred until the resin beads turn from blue to yellow Made by The solution is 10 for 5 minutes to pellet the beads. It was centrifuged at 00 rpm. The albumin solution is decanted and new resin beads are added. And the stirring procedure was repeated. The entire procedure is such that the beads no longer discolor Repeated until normal (typically 4 times).   In the experiment shown, three different types of lipid preparations have the composition 295-1 Was added to es Inc. , Kankakee, IL; Cholesterol, 4.96 mg / m 1; triglyceride, 1.67 mg / ml) of lipids obtained from 1:50 to 1: Used at a dilution of between 500, optimal 1: 100.   2. Corn fraction IV precipitated with ethanol from pooled human plasmaFourOr The obtained lipids were pasteurized to kill the virus (Nutrim axTM, 5 to 5 mg of Baxter Hyland, Duarte, CA). / Ml. Kabi Pharmacia, Clayton, NC; 50% linoleic acid, 2 6% oleic acid, 10% palmitic acid, 9% linolenic acid An acid and a neutral triglyceride having a fatty acid residue containing 3.5% stearic acid; Phospholipids containing mainly phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine Quality) 0.03 to 2%, optimal 1%.   Stock solutions of each lipid were diluted 1:10 in ethanol. Sonicated in.   Control serum-containing medium (HLTM) is the above-mentioned basal medium, standard supplement and growth factors. In addition to 12.5% fetal bovine serum and 12.5% horse serum (Sigma) You.                                 Example 2Preparation of hematopoietic stem / source cells   Mononuclear cells were obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood samples. Normal individual Gave me bone marrow and cord blood. Peripheral blood cells from the bone marrow by the administration of hematopoietic growth factors Obtained from a cancer patient whose hematopoietic cells have been "mobilized" to peripheral blood (Brandt, SJ, et al. , Above; Crawford, J .; , Et al. , Above; Neid Hart, J. et al. , Et al. ,the above). The cells in the sample are Histop Were then separated by centrifugation and mononuclear cells were collected from the interface region (Smi th, S. L. , Et al. ,Exp Hematol  21: 870-87 7, 1993).   The mononuclear cell suspension was prepared using magnetic beads as described below for CD34 +. Enriched for stem / source cells by the positive selectivity of The mononuclear cell is first 1 06Sensitization with 0.5 μg of anti-CD34 antibody per cell for 30 minutes on ice [bloodless Prepared by clear cell culture (Baxter Hyland, Hayward, CA), and protein G parent Compatibility Chromatography (Baxter Immunotherapy Divis Ion) anti-CD34 # 9069]. And the cells are bound Washed 3 times by centrifugation in IMDM to remove unreacted antibody, Sheep anti-mouse IgG1Of Fc coated magnetic beads and 1: 1 beads to cells Mixed in proportion. The mixture of beads and cells is then spun at 4 ° C for 30 minutes. Was. The bead / cell complex was then separated using a magnetic tube holder. Series CD34 + cells were washed in RPMI 1640 (Sigma) at 50 U / m Chromody of l olnsire, IL) and incubate in 37 ° C water bath for 15 minutes Released from the beads. The cells then released from the beads The cells are FITC-8G12 monoclonal antibody against CD34 for 15 minutes on ice. (Baxter Immunotherapy Division, Irvin e, CA) and CD34 + purity was assessed by staining (Sm) as described. Quantified by a tomometer (Becton Dickenson, San J ose, CA).                                 Example 3Culture of hematopoietic cells in serum-free medium   A enriched preparation of CD34 + cells can be used in polystyrene flasks or plastics. 5x10 in one of the bagsThree~ 1 × 10FiveBlood free at an initial concentration of cells / ml Cultured in clear medium. 25, 75 and 150 cm2Untreated flasks (Corning, Corning, NY) A tissue culture treated flask was used. The ethyl vinyl acetate (EVA) Gas permeable plastic bags are available in P with capacities of 250, 500 and 1000 ml. L269 type (Baxter Fenwall, Deerfield, IL ). The 250 ml bag is filled with 20-60 ml of cell suspension and 1 bag is filled with 60-100 ml of cell suspension and the 1000 ml bag is filled. The cells were filled with 100-400 ml of cell suspension. The culture was prepared according to the following Examples 5% CO during the time indicated in2/ 5% O2, 37 ° C, high humidity incubator Placed inside. The cultures were supplemented at 1: 2 or 1: 4 dilutions at 5-7 day intervals. Was.   The concentration of non-adherent cells in the culture was 0.5 ml of the culture to 9.5 ml, Dilute with 10% cetrimide (Sigma), Coulter ZBI (Cou lter Electronics, Hialeah, FL). Was decided by.                                Example 4Evaluation of proliferation of neutrophil progenitor cells in serum-free medium   The cell culture of Example 3 was sampled at designated days in culture and was Stained by Giemsa method and counted differentially based on morphological features. (Marmont, AM, et al. "Neutrophils", inAtlas of Blood Cells, Eds. Zucker-F rankin, D.R. , Et al. , 2nd Edition, pp. 159 -190; Jandl, J .; H. (1987)Blood, Textbook of Hematology , Little, Bro wn & Co. , Boston / Toronto, pp. 441-480).   Figure 1 shows serum-free medium composition compared to growth in serum-containing medium ("HLTM"). 295-1 (Example 1) Typical cell culture fractionated cell count grown in It represents Hematopoietic growth factors were added to both media as follows. That is, 1 000U / ml IL-3, 500U / ml G-CSF, 500U / ml G M-CSF and 20 ng / ml SCF. Serum-free culture on day 10 of culture Cell samples grown in the ground were transferred to serum-containing medium for an additional 10 days.   Examples of morphology of various cell types are shown in the following figures.       FIG. Blast (black arrow)       FIG. Promyelocytes (black arrows) and post-neutrophil myelocytes (white arrows)       FIG. Neutrophil myelocytes (black arrow) and post-neutrophil myelocytes (white arrow)   Neutrophils with zonule leukocytes and segments ("Bands / Segs", Figure 1), (most Mature neutrophils) were easily recognized according to standard criteria (Marmo nt, A.N. M. , Et al. ,the above). It is called "other" in FIG. Sections are monocytes not identified by Wright-Giemsa staining, macrophages, and Includes megakaryocyte progenitor cells. Monocytes and macrophages are Atlas of Blood   Was identified as described in Cells (supra, Johnston, RB, Jr. , The mononuclear phagocyte sys tem, pp. 321-377). Megakaryocyte progenitor cells are immunized as described below. By cytochemical staining Identified. Mast cells are stained with toluidine blue on their heparin granules. Can be identified, but less than 0.01% of the total cell population.   Sorted cell counts are "mobilized" from normal bone marrow, cord blood, and cancer patients Large differences between individual samples obtained from various sources such as peripheral blood cells Therefore, it varied between experiments. However, serum-free medium is typically added for 9-12 days. Neutrophil cell differential counts of cultivated cultures grown in serum-containing medium It was equivalent to a culture from the same sample. 9 to 12 days in vitro Serum-free cell cultures between are typically 10-40% blasts, 15-30% promyelocytic Spheres, 10-25% neutrophil myelocytes, 10-40% post-neutrophil myelocytes, and 10 Contains 22% of "other" (monocytes, macrophages, and megakaryocyte progenitor cells) Was.   The cells were cultured in serum-free medium for 10 days, and additionally contained serum for 10 days When transferred to medium, they differentiated into a more mature form (Figure 1). 20th day Of their neutrophil cell differential counts were all cultured for 20 days in serum-containing medium. Was equivalent to the cells that have been                                 Example 5Neutrophil progenitor cells grown in serum-free medium; the same by flow cytometry Phenotype determined   1 to 2 × 10 at 10 and 20 days of cultureFiveSubculture of individual cells is the culture Removed from the container, 0.05% bovine serum albumin and 0.1% azide (P Washed 1-2 times in phosphate buffered saline with AB). The cell is then C D15 (LeuM1) FI TC-conjugated monoclonal antibody and CD11b (Leu15) PE-conjugated monochrome Labeled with null antibody (Becton Dickenson) for 10 minutes on ice. P After being washed once more in AB, the cells were suspended in 1 ml of PAB and By flow cytometry for co-expression of CD15 and CD11b Was done.   On day 10, the CD15 + CD11b− phenotype of the cells in serum-free culture 20-60%, which is the 10th day profile of serum-containing cultures. It was similar (Fig. 5a, lower right quadrant). On day 20, it was retained in serum-free medium Cultivated cultures still contained predominantly the CD15 + CD11b-phenotype (FIG. 5b). In contrast, on day 20, serum-free medium was added to serum-containing medium on day 10. Cultures transferred to medium have 70-100% differentiation of CD15 + CD11b + phenotype Cultures grown in serum-containing medium for 20 days. It was similar to the phenotypic profile of the object (Fig. 5c).   CD15 + / CD11b- cells are sorted by FACS cell sorting and differentiated. Morphologically identified as neutrophil progenitor cells in the promyelocyte and myelocyte stages of Smith, SL, et al. ,the above). CD15 + / CD11b + cells Assorted and more mature types, namely postmyelocytes, zonular leukocytes and segmented Was identified as a neutrophil.                                 Example 6Colony forming unit and cluster forming unit in serum-free culture   Cells were cultured in various media compositions with the following growth factors. That is, 300 U / ml IL-3, 300 U / ml GC SF, 300 U / ml GM-CSF, and 20 ng / ml SCF.   At day 0 and 10 of culture, colony assay was IMDM, 30% FBS (Sigma), 7% Leptalb 7 (Armor Pharma) Ceuticals, Kankakee, IL) and 150 U / ml rIL- 3, 200 U / ml rGM-CSF, 150 U / ml rG-CSF, 160 U / ml rIL-6, and 10 U / ml erythropoietin (Amgen, T House-Oaks, CA) containing recombinant growth factors. It was performed in lulose. Colony assay in a 35 ml dish (Nunc) 5 to 10 × 10ThreeCells / ml were performed in triplicate and 5% CO at 37 ° C2/ 5% O2Scored after 14 days in culture. Colonies are larger than 50 cells Defined as a threshold population, and a cluster defined as a population of less than 50 cells (See Figure 6). The colonies were picked using Wright-Giemsa staining Due to the cyclic morphological diversity of colonies, CFU-GM, macrophages (C FU-M), burst forming unit erythroid (BFU-E) or mixed type (CFU -Mix) (myeloid and erythroid) macroscopically identified. result Are shown in Tables 1-4 below.       Legend for Tables 1-4 P. I. = Proliferation index (all cells on day 10 / all cells on day 0) GM I. = Granulocyte / Macrophage-Colony formation index (formed from 10-day culture GM colonies / GM colonies formed from day 0 suspension) Mac I. = Macrophage colony formation index BFUE I. = Burst forming unit-Erythroid index Mixed I.D. = Mixed colony formation index Cluster I. = Cluster formation index PB = peripheral blood sample B. M. = Bone marrow sample CFU = colony forming unit; CE = cloning efficiency   The proliferation index for all cells on day 10 of culture was in the range of 10 to 60 times. I went over the fence.   Generally, the number of CFU-GM was increased by 5 to 20 times on day 0 in 10 days of culture. Was. The number of CFU-Mac increased 2 to 10 times on day 0 in 10 days of culture. Special The number of cluster-forming units in serum-free culture for 10 days was 10 to 600 on day 0. Doubled.   On day 14 of the methylcellulose assay, GM colonies were whole colonies. / Make up about 10 to 50% of the cluster, and Mac colonies are all colonies / Make up about 5-20% of the cluster, and the cluster is It comprised about 10-60% of the raster.   Typically, colony forming units (CFU) + club in 10 days serum-free culture The proportion of star forming units (clFU) is relatively low, in the range of about 1-5% of total cells (% CE =% cloning efficiency = all colonies + all clusters (× 10 0) / whole seeded cells). However, the clFU within the entire CFU / clFU Is relatively high, ranging from about 10 to 50% of total CFU / clFU . The absolute number of cluster forming units per 10,000 cells is in the range 16 to 136. I went over the fence. Cluster-forming units are like zonule leukocytes and segmented neutrophils These are individual cells that grow directly into the more mature form of myeloid cells.                                 Example 7Evaluation of megakaryocyte progenitor cells cultured in serum-free medium   Cells were treated with serum-free medium composition 295-1 as described in Example 1. Proliferated as described in Example 4. Selection On selected culture days, cells were cytocentrifuged on microscope slides and dehydrated Anti-CD41a monoclonal fixed by ton and named P2 Incubated with antibody (AMAC, Westbrook, ME). The The antibody recognizes the unique glycoprotein IIb / IIIa of platelets / megakaryocytes. Glycoprotein I Ib / IIIa is present in megakaryocyte progenitor cells, mature megakaryocytes, and platelets , Not present in other blood cells. After culturing with the primary antibody, the secondary antibody (biotin Goat anti-mouse IgG, Kirkegaard & Perry, Gait (Hersburg, MD) and added to the primary antibody. S Incubation with treptavidin-peroxidase complex, Those which specifically label spheres, their progenitor cells and their progeny to produce a red color This was followed by a peroxidase (AEC) reaction. Then the culture , Counterstained with hematoxylin, which produces a blue color in the cell nuclei, which indicates the recognition of negative cells. It made sense (see Figure 7).   Cells from the same culture also detected cells labeled with anti-CD41a. It was also analyzed by flow cytometry. The results are shown in Tables 5-7 below. It is.   Anti-CD41a, CD41b (GP Ib) and CD61 (GP IIIa) Platelets stained positively adhere to other cells that are not megakaryocyte lineages. Often observed. As shown in Table 6, flow cytometry shows false positives. Under the influence of platelet adhesion artifacts by counting cells It was found that Therefore, CD41a exemption using the same monoclonal antibody Epidemiology was used to identify true megakaryocyte lineage cells. Shown in Table 5 As described above, most of the adherent platelets (“PL-STK”) are after 7 to 10 days of culture. Disappeared and comparable results were obtained from immunocytochemistry and flow cytometry.   Simultaneous expression of CD41a antigen and cell size using flow cytometry Was analyzed by. FIG. 8 shows a culture sample grown in the serum-free medium for 10 days. A flow cytometry point plot is shown. The X axis measures the size of the cell Figure 7 shows forward light scatter (FSC). Those details plotted to the right The vesicles are higher in FSC (hFSC) and the cell size is larger. Y axis The green fluorescence intensity measuring FITC-conjugated antibody staining is shown. FITC-bonded anti-ma The isotype control staining of the sample with Uss IgG is in Figure 8a, which It does not show non-specific antibody binding to the cells. FITC-conjugated anti-CD41a antibody The same cell sample incubated with is shown in FIG. CD41a-positive megakaryocytes are clearly shown in the object. Plotted in the upper right quadrant Cells are considered to be large megakaryocytes and the size of those cells is Larger than most of the cell populations in. Cells plotted in upper left event Is considered a small megakaryocyte. Big giant Nuclear cells have been reported to be more mature than small megakaryocytes (Tomer, A , Et al. ,Blood  70: 1635-1742, 1987). In Table 5 As shown, large megakaryocytes (hFSCs) are all labeled cells in 7-8 day culture. It made up about 16% of the population. After 10 days of culturing, the frequency of large megakaryocytes was approximately 22%. , And there was a statistically significant increase in megakaryocyte maturation.   As shown in Table 7, when cultured in serum-free medium (295), the same Hematopoietic cells from the donor are more likely than when cultured in serum-containing medium (HLTM) Gives more megakaryocytes (3 to 22 times). This result shows that the serum-free culture medium Stronger to give a more favorable microenvironment for megakaryocyte proliferation than clear-containing medium Show.                                 Example 8Megakaryocyte colony formation analyzed by fibrin clot assay   Serum-free fibrin clot colony culture on selected days in culture That seeded in (MK-CFC assay) to form megakaryocyte colonies They were evaluated for their ability. Cells (2 × 10Five/ Ml) is 1% BS in IMDM A (Sigma), 0.02% fibrinogen (KABI, Sweden) and And fibrin clot containing 0.02 U / ml thrombin (Sigma) Suspended in culture medium (Zauli, G, et al.,Exp Hemato l   20: 850-854, 1992). SCF, IL-3, IL-6, and / or Alternatively, cytokines including IL-11 were used as well as indicated. The cells /0.5 ml sample of media suspension was placed on a regular microscope slide. The The rides were placed in a damp 150 mm Petri dish and left for 14 days at 37 ° C, 5 % CO2Cultured. During this time, megakaryocyte progenitor cells in the original culture proliferate To form megakaryocyte bursts and colonies or to become more mature single megakaryocytes. It has become. The fibrin clot culture was then immobilized as described in Example 7. Epidemiologically stained.   The MK-CFC assay described above has several improvements over the previously shown assay. Provide benefits. First, the Petri dish was exposed as a substrate for the megakaryocyte colony culture. Replaced by a microscopic slide, which gives these advantages:     (1) The slide is for storing protein antigens for immunocytochemical detection Allows the use of the highest fixative, anhydrous acetone. Traditionally, the colony culture The nutrients were cultivated in plastic Petri dishes which would dissolve in acetone. Was.     (2) The slide reduces the amount of antibody used for each culture and stains To reduce the artifacts caused by drying the antibody between colors Thus facilitating immunostaining.     (3) The slide is kept as it is by using a high-magnification microscope objective lens. It allows a clear examination of the colony in its original state.   The traditional evaluation method is a large, high refractive index under an inverted microscope without any staining. Morphological recognition that describes megakaryocyte colonies as clusters of cells ( Sonoda, Y. , Et al. ,Blood  81: 624-630, 19 93), and megakaryocyte colonies as light green against dark green (background) Immunofluorescence microscopy (Bruno, E., et.   al. ,Blood  73: 671-677, 1989; Zauli, G .; , et al. ,Exp. Hematol.  20: 850-854, 1992). These methods give ambiguous results. I got it. Because it is a true megakaryocyte colony and a non-giant colony that also grows in fibrin clots. It was difficult to distinguish them from the colonies of the nuclear lineage.   The method of the present invention, under the light microscope, a specific red color in non-megakaryocytic cells labeled in blue. Since the megakaryocyte colonies are identified by the labeling (Fig. 9), Gives a more accurate count. The results are summarized in Table 8 below.   As shown in Table 8, the early megakaryocyte source cells (BFU-MK) were 5-7 days old. In between, it can be detected only in serum-free culture (295), and serum-containing (HLTM) culture It was not detected inside. On day 12, serum-free cultures were better than serum-containing cultures. More megakaryocyte colony forming cells (MK-CFC) and single megakaryocytes (S- MK). Addition of GM-CSF to serum-free culture facilitates the growth of megakaryocytes It seemed to be.                                 Example 9Differentiation of megakaryocytes in serum-free medium   This example compares CD3 to megakaryocytes in serum-free medium compared to serum-containing medium. 4+Further evaluate the proliferation and differentiation of cell culture. Differences in growth factors for megakaryocyte differentiation The effects of the combined combinations were also determined.   CD34 from bone marrow (BM) and peripheral blood (PB)+Separation and culture of hematopoietic cells It was carried out by a method similar to that described in Examples 1-3. Briefly In other words, PB cell and plasma blood component separation products are used for G-CSF and / or chemotherapy. CS3000 from cancer patients 4 to 15 days after mobilizationTMBlood cell separator (Fenwal   Division, Baxter Healthcare, Deerfield d, IL) were collected simultaneously. Cell sample is citrated glucose 2% Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma, St. . Louis', MO) containing Iscove's modified Dulbecco medium ( IMDM) (Gibco, Grand Island, NY) 1: 1 Diluted. Low density MNC at 300 xg for 20 minutes HistopaqueTM  f Obtained after density centrifugation on icoll-hypaque (1.077 g / ml) Was. Plasma was spun at 200 xg for 10 minutes to remove platelets and 0.4 It was passed through a 5 μm filter and stored at −20 ° C. Human line Fibrin deficient sera have been demonstrated by Debili et al. (Blood 80: 3). 022 (1992)) Obtained from a patient with thrombocytopenia after BM transplantation. Preliminary selection test The fibrin-deficient serum and plasma (AS) that showed megakaryocyte-stimulating function in the test were about 1 Used in these experiments at a final concentration of 0%.   CD34 positive cells were prepared as previously shown in Example 2 with minor modifications. Was selected. In short, the adherent cells are not coated with polystyrene Dyn al Paramagnetic beads (Fenwal Division, Baxter Heal) (thcare, Deerfield, IL) by mixing the MNC with I was left. Non-adherent cells are anti-CD34 monoclonal antibody (mAB) 9C5 (Immunotherapy Division, Baxter Health hcare, Santa Ana, CA), then Sheep anti-mouse IgG at a ratio of 0.5-1 beads to 1 cell1(Fenwa l Division, Baxter Healthcare, Deerfie ld, IL) mixed with magnetic beads coated. Beads-cell rosette Dyna MPC-1 Magnet (Immunotherapy Division , Baxter Healthcare, Santa Ana, CA) or Is olexTM  50 Magnetic Cell Separator (Immunotherapy Divis ion, Baxter H yieldcare, Santa Ana, CA) followed by positive selection. Gathered Cells are 37 ° C, 5% CO2At 200U / ml with IL-3 It was released from the beads by overnight incubation. Selected for quantification A small portion of the isolated cells is another mAb to CD34, fluorescein (FITC ) Bonding 8G12 (Immunotherapy Division, Baxte rHealthcare, Santa Ana, CA). flow Cytometry showed that about 80-97% of the selected cells were CD34 positive. And revealed.   10 BM mononuclear cell (MNC) culturesFiveCells / ml, whereas CD34 cells Culture is 10FourStarted at cells / ml. The culture is human long-term culture medium (HLTM), Serum-free medium (Immunotherapy Division, Baxter Healthcare) or human serum or plasma supplemented medium. I let you. Immunocytochemistry and flow cytometry were described in Example 7. It was done like this.   The kinetics of megakaryocyte proliferation in culture was complemented by SCF, IL-3 and IL-6. Determined in serum-free and HLTM cultures. Immunocytochemistry at day 0 CD41a before culturing+0.03% of BM MNC (0 . 01-0.05% range, n = 5), and purified BM CD34+Or PB CD34+Shows that it makes up 5.3% of the cells (range 2-9%, n = 5) (Fig. 10, day 0). No apparent cell proliferation was observed during the first few days after seeding. won. Cells were not harvested by day 5 to retain cultures for later evaluation Was. The culture is grown for a period of 10 to 30 days. Was. Some substrate nests in HLTM BM CD34 cells or MNC cultures Occasionally formed. In serum-free culture, some scattered macrophage-like adherent cells However, there was no substrate nest.   On day 5, all CD34 cell cultures had a 4-5 fold increase in cellularity, Viable cells were over 95%. Sorted cell counts were 5 days serum-free CD3 4+Cell culture is 66.2% blast cells (range 40-98%) and 37% granulocytes It was shown to contain lineage cells (range 9-53%). In 10-12 days 21.3 ± 6.5% blasts (9-47% range) for serum-free CD34 cell cultures. ), 70.3 ± 6.7% of granulocytic cells (range 42-88%), 8.2 ± 1. 8% macrophages (range 2-14%) and occasionally erythroid cells (5%) Was included. HLTM CD34 cell cultures generally resulted in fewer blast cells (9 . 2 ± 3.2%, 1-22% range) and more granulocytic cells (78.2 ± 5. 3%, 65-96% range). Cell viability and growth are better than serum-free culture The HLTM culture was slightly higher. Morphologically recognizable mature megakaryocytes Was found in HLTM culture, but not in serum-free culture . Compared to mature megakaryocytes present in bone marrow, morphologically induced in culture Visible megakaryocytes have a smaller cell size and nuclei with fewer lobules (2-3 lobes). had.   Clear CD 41a+Cells were observed in serum-free CD34 culture for 10-14 days. (Fig. 9). Under serum-free conditions, CD41a+Serum content of megakaryocyte source cells It was substantially higher than that observed under the conditions. Similarly, with the starting cell population Fold expansion of these cells compared to 14.1 fold in serum-containing medium It was 51 times in serum-free medium (Table 9). These cells are cytokine C D41a shows immunoreactivity and contains a single, undivided nucleus and non-granular cytoplasm. I was there. Their size was the same as or slightly larger than the surrounding granulocytes. That Et al. Could not be recognized by light microscopy without antibody staining. These CD41 a+Megakaryocytic cells increased in serum-free CD34 cell culture around 5-7 days (1.4 ± 3 . 1%), peaking at 10-12 days (16.2 ± 4.3%), and 15- It decreased about 17 days (10.5 ± 0.5%) (FIG. 10). However, H LTM cultures show no increase in megakaryocyte frequency from beginning to end of the whole culture period (Fig. 10); however, the absolute number of megakaryocytes increased, again at 10-12 days. Reached the peak. This is mainly due to the high cellularity and moderate megakaryocyte frequency at that time. by. Morphologically recognizable megakaryocytes were found in HLTM culture on days 10-12. All CD41a+It occupied about 1/5 of the cells. Others found in serum-free culture It was a morphologically unrecognizable megakaryocyte similar to that described above. Day 15 for megakaryocytes Around it disappeared from the HLTM culture. The megakaryocytes were also used for the HLTM culture that was advanced to 30 days. I didn't recover. Giant obtained from serum-free or HLTM culture at 10-12 days Nucleocytes were brightly stained by CD41a, and immunocytochemistry and flow cytometry It was easily recognized by itometry.   Paired peripheral blood CD34+Cell cultures differ for maintaining megakaryocyte proliferation Made to compare the capacity of the culture medium. Peripheral blood CD34 from individual donors+Fine Vesicles were grown in serum-free and HLTM cultures. Identical cytokai for culture Combinations were replenished and replenished in the same way. Results from 6 experiments Are shown in FIG. Experiments 1-3 are SCF, IL-3, GM-CSF and G -CSF was supplemented, while experiments 4-6 showed that SCF, IL-3 and IL-6 It was replenished. Cell viability in paired cultures was similar. Cell count is experimental Serum-free cultures were usually lower than HLTM cultures with the exception of 2 (Figure 11). . Megakaryocyte frequency in serum-free culture is 7.6 ± 3 compared to HLTM culture paired with them. . 1 times higher (Range 3-22). The absolute number of megakaryocytes in serum-free culture was compared to those Compared to the HLTM cultures used (1 to ± 7.1 times higher) (range of 2-45) (Fig. 1). 1, megakaryocyte cellularity).   In another independent experiment, total megakaryocyte expansion in vitro was estimated. Calculated by dividing the culture megakaryocyte production by the initial number of megakaryocytes, and Cell viability. Megakaryocyte expansion factor is 51 in serum-free medium Doubled and 14-fold in HLTM culture (Table 9). Therefore, the serum-free medium It maintained megakaryocyte proliferation better than the HLTM medium, which was probably due to CD34+ It may be due to facilitation of megakaryocyte differentiation from cells and megakaryocyte proliferation.   Bone marrow MNC, bone marrow CD34+And peripheral blood CD34+Different cells containing cells The support of megakaryocyte proliferation from cell populations by culture medium was also studied (Figure 12). S CF, IL-3 and IL-6 were added to all cultures. IM as a positive control DM bone marrow MNC cultures were further supplemented with AS. HLTM culture Purified CD34+From cells or from unpurified bone marrow MNC Regardless of the presence, 2-3% of megakaryocytes were constantly given. Excluding bone marrow MNC Thus, serum-free cultures gave a higher proportion of megakaryocytes than HLTM cultures. in addition, Serum-free peripheral blood CD34 cell cultures are serum-free bone marrow CD34 cell cultures (9.3 ± More megakaryocytes (16.1, 1.6% megakaryocytes, 8.9 ± 1.3 expansion) ± 4.3%) were expanded and further expanded (22.0 ± 6.0 fold) (FIG. 12). ). Cell viability in both cultures was similar (80.0 ± 6.0% vs 86). . 3 ± 1.3%). Therefore, the serum-free medium is bone marrow C Better megakaryocyte proliferation in peripheral blood CD34 than in D34 cell culture Seems to support, or may have had more megakaryocyte progenitor cells at the beginning Yes. On the other hand, the serum-free medium is disadvantageous compared to HLTM bone marrow MNC cultures. (Fig. 12). In addition, the cell count was increased in HLTM bone marrow MNC. However (4-10 fold), there was no increase in serum-free bone marrow MNC cultures. Bone Proliferation of megakaryocytes from medullary MNC can be achieved by IMDM (containing human AS) and HLTM (movement). Substrate nests that are formed in serum-free culture) but not in serum-free culture Seemed to depend on the existence of. Add AS to the serum-free medium at day 0 Is the medium from both bone marrow MNC and megakaryocytes in both HLTM and IMDM medium. It was adapted to support sphere proliferation (Fig. 12).   Paired peripheral blood CD34 to determine the effects of cytokines+Cell culture Were assembled and assayed for their ability to support megakaryocyte proliferation. Typical Results from the experimental experiment are shown in FIG. Only effect in HLTM culture The typical cytokine combination was SCF + IL-3 + IL-6. Serum-free culture For feeding, a combination of SCF + IL-6 or SCF + GM-CSF is used. Suline supported megakaryocyte proliferation. IL-3 in either of these combinations Addition increased megakaryocyte proliferation (Fig. 13). GM-CSF is SCF and IL- More than IL-6 without changing megakaryocyte frequency when combined with 3 Stimulated cell proliferation. Therefore, GM-CSF + SCF + IL-3 was supplemented Serum cultures were higher in whole cell culture than cultures supplemented with IL-6 + SCF + IL-3. Und and number of megakaryocytes were included (FIG. 13, megakaryocyte cellularity). same Serum-free supplemented with SCF, IL-3, GM-CSF and G-CSF Cultures (Experiments 1-3 in Figure 11) were supplemented with SCF, IL-3 and IL-6. It was also true when compared to serum-free cultures (Experiments 4-6 in Figure 11). The S 200 U / ml IL-11 was added to the combination of CF + IL-3 + GM-CSF. Even so, it did not stimulate further megakaryocyte proliferation (Fig. 13). Possibility of inappropriate dosage In order to eliminate sex, IL-11 was added to peripheral blood CD34+SC in cell culture With the combination of F + IL-3 + IL-6, a concentration between 50 and 800 U / ml was obtained. And titrated. Did High Additive IL-11 (400 U / ml) Enhance Cell Proliferation? Possibly, this combination of cytokines on megakaryocyte proliferation and IL-11 No clear synergistic effect with was observed.   Are morphologically recognizable megakaryocytes discovered in serum-containing cultures? Serum against megakaryocyte proliferation and morphological differentiation as it has not been discovered in feeding The effect of was evaluated. Human AS was added to the culture at various times. Smell on day 0 Then, AS alone, cytokine (S) was added to paired bone marrow CD34 cell culture (n = 3). CF, IL-3 and IL-6) alone or supplemented with AS + cytokines. 1 On day 0-12, AS alone culture showed high megakaryocyte frequency (about 15%) Showed almost no cell expansion (0.5-1 fold). -Way, cytokine alone And cytokine + AS culture had lower megakaryocyte frequency (about 8%) and higher cell expansion ( About 20 times and 38 times respectively). The morphologically recognizable megakaryocyte is AS Total CD41a in monoculture and AS + cytokine culture, respectively+Cellular It accounted for 1/3 to 1/2 and 1/7 to 1/3. Practically huge Cells with morphology of karyosphere were not found in cytokine alone culture. However, AS was added to these cytokines alone in 10 to 12 days. When obtained, morphologically recognizable megakaryocytes appeared after 3 to 4 days and total CD41+Fine They accounted for 1/5 to 1/3 of the vesicles. Megakaryocytes in control culture (without AS) It remained morphologically unrecognizable. First remove megakaryocyte morphology, then AS + Cytokine-stimulated bone marrow MNC cultures were morphologically 10-12 days after culture. To give recognizable megakaryocytes (all CD41a+1/5 to 1/3 of cells). these The results show that serum can be used to facilitate the morphological differentiation of megakaryocytes. Yes, but serum-free conditions tend to favor an immature phenotype showed that.   The above results indicate that the serum-free medium was purified CD34.+Meganuclei from hematopoietic source cells It is shown to be better than the serum-containing HLTM medium in maintaining the proliferation of spheres. Bloodless Peripheral blood CD34 when grown in clear medium+The cells are bone marrow CD34+Fine Cells showed higher megakaryocyte potential than vesicles. The majority of megakaryocytes derived from serum-free culture Represents the GPIIb / IIIa antigen, and as a morphologically mature megakaryocyte, It was unrecognizable. They can undergo further differentiation and fibrin deficiency Further stimulation with serum gave megakaryocyte morphology.                              Example 10Serum-free suspension of human hematopoietic cells   This example illustrates human hematopoietic cells in media other than the 295-1 media described above. 2 shows the preparation and culture of a serum-free suspension of.   Blood from breast cancer patients pretreated with chemotherapy and G-CSF A liquid separated blood product was obtained from the University of Chicago. CD34+The cell is Iso lexTM  50 (Baxter Healthcare, Corp., Fenw al Division) or IsolexTM  300 (Baxter Hea lthcare, Corp. , Immunotherapy Division , Irvine, CA) selected from blood products whose blood components have been separated by a magnetic cell separator. Was chosen. These devices use anti-CD34 monoclonal antibody (9C5) Liquid component separated blood from CD34+Select cells, Dynal IgG1FC, ST magnet It is designed to be recovered using sex beads. The 9C5 anti-CD34 monochrome Internal antibody is said IsolexTM  50 or IsolexTM  1 in 300 columns × 10FourThe blood component content at 0.5 μg per cell (1 μg / μl storage vial) Added to blood removal products. The cells are then isolated from the IsolexTM30 minutes by rotator Was rotated for a while. The cells contained RPMI containing 1% human serum albumin (HSA). Twice to remove unbound 9C5 monoclonal antibody in 1640 Washed. Then, the cells contained 10 mg / ml (1%) HSA and 1 mg / ml (0%). . 1%) GammagardR(Baxter Healthcare Cor p. , Hyland Division, Glendale, CA) 1-2 x 10 with PMI 16407It was diluted in the column to cells / ml. D yinal IgG1FC, ST magnetic beads (Dynal, Oslo, Norway) y) was added to the cell suspension at a ratio of 0.5 to cell beads and the Isole xTMIt was rotated by a rotator for 30 minutes. And the CD34 cell: bead complex is It was removed using a magnet.   The CD34+Cell: bead complex is 1% HSA and 100 ng / ml PIXY   321 containing X-VIVO 10 (BioWhittaker, Inc., 3 x 10 in Walkersville, MD) (complete medium)FiveCells / ml again Suspended. PIXY contains domains active in both IL-3 and GM-CSF It is a fusion protein. The suspension is then determined by the number of cell: bead complexes obtained. The liquid is placed in a gas-permeable culture bag (Baxter, Roundlake, IL). Cell culture incubator placed and set to 5% carbon dioxide at 37 ° C Incubation for 48 hours. The starting culture medium is 20-5 by volume. It was 0 ml. These vessels were called the first culture vessels.   Following a 48 hour culture release period, the released cells were separated by MaxSep.TMCell content Separator (Baxter Healthcare, Corp., Irvine, CA ) Was used to recover the magnetic beads by removal of the magnetic beads (day 9 of culture) . The released cells are then transferred to a subculture vessel and shown in Example 3. Cultured as described above. On day 5, the culture was hemocytometer and trypan -Cell number and cell viability were analyzed using viability staining. Then the cell concentration 1 × 10 in complete mediumFiveThe cells were readjusted to cells / ml and further cultured for 5 days. Flow cytometry, colony assay and morphological evaluation are shown in Examples 5-7. It was done as was done.   Table 10 below shows the results of five experiments on cell proliferation on days 5 and 10. In the table, the survival growth index (P.I.) is shown on the 5th or 10th day. Divided by the total number of cells at day 0 and multiplied by% viability Calculated by   Cell number, total CFU, cluster, CFU-GM, CD on day 10 of culture Fifteen+An increase in cells and early granulocytes was also determined. All CFU, cluster And CFU-GM increase in the P. I. The number 1 that exists on day 0 for Calculated from the change to the final number at day 0 (Table 11). On the 10th day of culture CD15+The increase of cells and early granulocytes was 80 ± 1 of the cells at day 0. 7% (average purity) is CD34+And that it is defined as a blast cell.   These results show that only 1% of HSA, IL-3 and GM-CSF growth factor are complemented. The filled serum-free X-VIVO 10 medium was used as a neutrophil source in a 10-day liquid culture. We were able to support cell growth and maintain good cell viability (89 ± 3%) (Table 11). The cells used in these experiments as described above were , The magnetic thin Had an average CD34 purity of 80 ± 20% when selected on a cell separator (Table 1 2). CD15+The cells, percentage of CFU, and cell morphology are shown in Tables 12-14. ing. The frequency of early granulocytes, as observed by cell morphology, is shown in Table 14. There was no significant difference as shown in. However, the total number of early granulocytes The number of cells counted per 100 cells was calculated based on the P. I. When multiplied by, there is a significant difference. Was.   In another experiment, various combinations of IL-3, SCF and IL-6 CD34 in supplemented X-VIVO 10+Cell proliferation and division into megakaryocytes Was evaluated. Briefly, 1% HSA, 300 U / ml IL-3 and 20n With g / ml SCF with or without the addition of 40 ng / ml IL-6 CD34 in X-VIVO 10 medium+The cells were cultured. 11 days of culture In the eye, cell counts were performed and by immunocytochemistry CD41a+cell Were analyzed. Results from 5 independent experiments Are shown below in Tables 15-17. This data shows the following: That is, 1) CD41a+Cells should be generated in this serum-free medium under these conditions. And 2) CD34 in the presence or absence of IL-6+Increase of cells Breeding index, CD41a+No significant difference was found in the percentage of cells and the total number of megakaryocytes Was it. Thus, the human hematopoietic cell composition described herein will contain IL-3 and SC It can be cultured in a serum-free medium containing only F, for example.                              Example 11Comparison of serum-free suspensions of human hematopoietic cells   This example compares the growth of human hematopoietic stem / source cells in various serum-free media. And characterize progenitor cells produced from different cultures.   CD34 from peripheral blood (PB)+Separation and culture of hematopoietic cells is described in Example 9. It was done in a similar way to what was done. Recovery from cyclophosphamide chemotherapy Separation of blood components from 5 human patients given G-CSF during It was used for the comparison of the generation of cartilage cells. In short, CD34+Following cell separation And the culture is X-vivo 10, X-vivo 15 or X-vivo 20. 1 to 5 × 10 in any of (BioWhittaker)FourCells / ml dense Degrees of selected cells were seeded on day 0. These media contain 300 U / ml IL -3, 40 ng / ml IL-6 and 20 ng / ml SCF, Nourishing for 8 to 12 days at high humidity 37 ° C, 5% CO25% O2Incubated in Was. CD34+Cell percentage was determined as described in Example 9. As well The procedures for flow cytometry, cell morphology determination and immunochemistry are described in Example 9. It was done as described.   CD34 in any of the three media+Determine whether to bring about differential isolation of cells CD34 to do+Flow cytometry when the percentage of cells is 0 days in culture Determined by The result is that the CD34 of the culture in each of the media+Fine The cell purity was between 92% and 99%, showing no difference. Similarly, Xv ivo 10 , X-vivo 15 or X-vivo 20 after being released into the medium No difference was seen in cell viability or morphology.   The CD34+Cell expansion is determined at the end of the culture period by calculating the growth index (Total number of cells on day 10 / number of cells on day 0). All 5 cultures Results determined from feeding are average growth for X-vivo 10, 15 and 20. The indices are 95.8 ± 22.0, 112.0 ± 7.4 and 170.2 ± 39, respectively. . 5, which showed no significant difference between these serum-free media. However, the 5 Growth indicators for cells grown in X-vivo 20 in three of the two cultures The numbers were significantly higher than those observed with either of the other two media (p = 0.047, paired t-test). These results show that all three serum-free media are human It is shown to help the growth of blood cells. In highly proliferative cultures, X- Vivo 20 is X-vivo 10 or X-vivo 15 for cell expansion. Better than any of.   Early neutrophil precursor (CD15+/ CD11b-) Is also the serum-free medium. In each of the. The results obtained are again in any of the media Also showed no significant difference. Specifically, the neutrophil progenitor cells of each of the five cultures The average percentages are X-vivo 10, X-vivo 15 and X-vivo.   20 for 20.76 ± 5.98, 17.20 ± 6.63 and 1 respectively It was 7.63 ± 6.20. Conversely, the percentage of more mature neutrophils is 10 days In between was less than 5% in all cultures.   The percentage of megakaryocytes was also determined in the above culture at the end of the culture period. Was. The results show that X-vivo 10 has a higher flow rate than X-vivo 15 and 20. -CD41a, as determined by cytometry+Cell significance Have higher proportions (p = 0.0247 and p = 0. 0211 vs. t-test). When evaluated by immunochemistry, the data are flow cytometric. It was parallel to the results obtained from totometry. The results are shown in Table 18 below. Is done.   Neutrophil progenitor cells and megakaryocyte cells expanded in each of the three serum-free media The total number of was also evaluated. Cell expansion for each lineage is CD34+Fine Initial number of cells (106) Multiplied by the growth index at day 10 and then for each series It was determined by multiplying the percentage of cells in the. For both series Fruits of the medium It was shown that there was no significant difference between each. For example, the expansion factor of neutrophil progenitor cells Is 20.9 ± 4.7 for X-vivo 10, 15 and 20, respectively. The values were 17.20 ± 2.98 and 17.63 ± 2.77. The expansion ratio of megakaryocytes X-vivo 10, 15 and 20 for 9.77 ± 3.1, 6. It was determined to be 6 ± 1.9 and 12.2 ± 4.7.   Collectively, the above results show that there is no need to obtain a serum-free suspension of human hematopoietic cells. CD34 in serum medium+In vitro to neutrophil progenitor cells and megakaryocytes o Indicates the possibility of expansion.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キアオ，ジャオイン アメリカ合衆国60085イリノイ、ウオーキ ーガン、グランドアベニュー ナンバー４ 1401 (72)発明者 マキーカス，スーザン，エム アメリカ合衆国94530カリホルニア、エル セリット、エベレットストリート 924 (72)発明者 ベンダー，ジェームス，ジー アメリカ合衆国60046イリノイ、リンデン ハースト、ホワイトバーチロード 565 (72)発明者 バン エップス，デニス，イー アメリカ合衆国60013イリノイ、ケリー、 リバードライブ 197 (72)発明者 ルドバリス，モーリーン，エフ アメリカ合衆国60030イリノイ、グレイス レイク、メインセイルドライブ 114────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Inventors Kiao and Jaoin             United States 60085 Walk, Illinois             Gun, Grand Avenue Number 4               1401 (72) Inventor Mackiecus, Susan, Em             United States 94530 El, California             Cerrito, Everett Street 924 (72) Inventor Bender, James, Gee             United States 60046 Linden, Illinois             Hearst, White Birch Road 565 (72) Inventor Van Epps, Dennis, Yi             United States 60013 Illinois, Kerry,             River drive 197 (72) Inventor Ludovalis, Maureen, F             Grace United States 60030 Illinois             Lake, Mainsail Drive 114

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． ヒトの好中球前駆細胞及び巨核球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖 のための、造血増殖因子と共に用いられるための無血清培地であって、 基本培地と、コルチコステロイドと、トランスフェリンと、インシュリ ンと、コレステロールと、エタノールアミンと、そしてヒトのアルブミンと、 を含む無血清培地。 ２． 該ヒトのアルブミンが脱イオンされているものである、請求項１の無血 清培地。 ３． 該コルチコステロイドがヒドロコルチゾンである、請求項１の無血清培 地。 ４． トリグリセリド及びリン脂質よりなる群より選ばれる少なくとも１つの 脂質を更に含むものである、請求項１の無血清培地。 ５． 該脂質がリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、及びス テアリン酸よりなる群より選ばれる脂肪酸側鎖を有するトリグリセリドである、 請求項４の無血清培地。 ６． 該脂質がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンよ りなる群より選ばれるリン脂質である、請求項４の無血清培地。 ７． セレン、α−モノチオグリセロール、β−メルカプトエタノール、及び ＨＥＰＥＳ緩衝剤を更に含むものである、請求項３の無血清培地。 ８． 請求項７の無血清培地であって、 更に ヒドロコルチゾン，１〜１０ μＭ コレステロール，０．０１〜０．１ ｍｇ／ｍｌ トリグリセリド，０．００３４〜０．０３４ ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，２５乃至１２５ μｇ／ｍｌ インシュリン，１乃至２５ μｇ／ｍｌ α−モノチオグリセロール，１０〜１６０ μＭ β−メルカプトエタノール，２０〜１００ μＭ エタノールアミン，５０乃至２００ μＭ ヒトアルブミン，０．１乃至２５ ｍｇ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ 緩衝剤，１０乃至２５ ｍＭ を含むものである、無血清培地。 ９． 請求項８の無血清培地であって、 ヒドロコルチゾン，２００ ｎｇ／ｍｌ コレステロール，０．０５ ｍｇ／ｍｌ トリグリセリド，０．０１７ ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，７５ μｇ／ｍｌ インシュリン，１０ μｇ／ｍｌ α−モノチオグリセロール，２１６ ｎｇ／ｍｌ β−メルカプトエタノール，５×１０-5 Ｍ エタノールアミン，１００ μＭ ヒトアルブミン，１０ ｍｇ／ｍｌ ＨＥＰＥＳ 緩衝剤，２５ ｍＭ を含むものである、無血清培地。 １０． 当該細胞成分が少なくとも約１６％の好中球前駆細胞及び少なくとも約 １％の巨核球前駆細胞を含むヒトの造血前駆細胞の無血清懸濁液の調製方法であ って、 （ａ）骨髄、末梢血、又は臍帯血から造血幹／源細胞を得るステップと 、 （ｂ）該幹／源細胞を、造血増殖因子を含む無血清培養培地であって、 基本培地と、コルチコステロイドと、トランスフェリンと、インシュリンと、コ レステロールと、エタノールアミンと、そしてヒトアルブミンと、を含む培地内 において約７乃至１４日間培養するステップと、 を含む方法。 １１． 該ヒトアルブミンが脱イオンされているものである、請求項１０の方法 。 １２． 該コルチコステロイドがヒドロコルチゾンである、請求項１０の方法。 １３． トリグリセリド及びリン脂質よりなる群より選ばれる少なくとも１つの 脂質を更に含むものである、請求項１０の方法。 １４． 該脂質がリノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、及びス テアリン酸よりなる群より選ばれる脂肪酸側鎖を有するトリグリセリドである、 請求項１３の方法。 １５． 該脂質がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンよ りなる群より選ばれるリン脂質である、請求項１３の方法。 １６． セレン、α−モノチオグリセロール、β−メルカプトエタノール、及び ＨＥＰＥＳ緩衝剤を更に含むものである、請求項１２ の方法。 １７． 請求項１０乃至１６のいずれかの方法によって調製された、細胞懸濁液 。 １８． 当該細胞成分が少なくとも約１６％の好中球前駆細胞と少なくとも約１ ％の巨核球前駆細胞を含み、当該細胞懸濁液が実質的に動物蛋白質を含まないも のである、ヒトの造血細胞の無血清懸濁液。 １９． 該細胞成分が少なくとも約３０％の好中球前駆細胞を含むものである、 請求項１８の細胞懸濁液。 ２０． 該細胞成分が少なくとも約６０％の好中球前駆細胞を含むものである、 請求項１９の細胞懸濁液。 ２１． 該好中球前駆細胞が芽球、前骨髄球、好中性骨髄球、及び好中性後骨髄 球よりなる群より選ばれるものである、請求項１８の細胞懸濁液。 ２２． 該細胞成分が少なくとも約３％の巨核球前駆細胞を含むものである、請 求項１８の細胞懸濁液。 ２３． 該細胞成分が少なくとも約８％の巨核球前駆細胞を含むものである、請 求項２２の細胞懸濁液。 ２４． 約３乃至２５％の単球と、約０．０１％未満の肥満細胞を更に含むもの である、請求項１８の細胞懸濁液。 ２５． コロニー形成単位（ＣＦＵ）及びクラスター形成単位（ｃｌＦＵ）を更 に含むものである、請求項１８の細胞懸濁液。 ２６． 該合計ＣＦＵ／ｃｌＦＵの少なくとも約４０％が顆粒球−マクロファー ジコロニー形成単位であり、かつ該合計ＣＦＵ／ｃｌＦＵの少なくとも約４０％ が顆粒球クラスター形成単位である、請 求項２５の細胞懸濁液。 ２７． 該細胞の少なくとも約２０％がＣＤ１５＋／ＣＤ１１ｂ−であり、該細 胞懸濁液が実質的に動物蛋白質不含である、ヒトの造血細胞の無血清懸濁液。 ２８． 造血細胞の懸濁液中の巨核球前駆細胞の数を決定するための方法であっ て、 （ａ）混合物を形成するために該細胞懸濁液のサンプルをフィブリノー ゲンとトロンビンと混合し、 （ｂ）該混合物を顕微鏡スライド上におき、該混合物に該造血細胞を含 んだフィブリン凝塊を形成させ、 （ｃ）該細胞を１４日間該フィブリン凝塊中で培養し、該巨核球前駆細 胞を増殖させて巨核球を形成させ、 （ｄ）該フィブリン凝塊中の該細胞を固定し、 （ｅ）該固定された細胞を血小板糖蛋白質質IIｂ／IIIａに特異的な１ 次抗体と接触させて、それにより巨核球に特異的に結合させ、 （ｆ）該巨核球を２次抗体及び免疫ペルオキシダーゼ呈色反応によって 標識し、それにより該巨核球に特有な色を獲得させ、 （ｇ）該全細胞集 団内の該特有な色によって標識された巨核球の数を評価し、そして （ｈ）該造血細胞の元の懸濁液中に存在した該巨核球前駆細胞の数を外 挿すること、 を含む方法。 ２９． 当該細胞成分が該ＣＤ４１ａ+細胞集団の形態学的に認識 しうる巨核球を含むものであるヒトの巨核球の分化した懸濁液を調製するための 方法であって、 （ａ）骨髄、末梢血、又は臍帯血から造血幹／源細胞を得るステップと 、 （ｂ）該幹／源細胞を少なくとも１つの造血増殖因子を含む無血清培養 培地内で培養するステップと、そして （ｃ）その後、該培養物に血清を補充するステップと、 を含む方法。 ３０． 該血清が線維素欠乏血清である、請求項２９の方法。 ３１． 該造血増殖因子がＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、スロ ンボポエチン、又は造血増殖因子の１又はより多くの活性部分を含む組換え蛋白 質よりなる群より選ばれるものである、請求項２９の方法。 ３２．請求項２９の方法によって調製された細胞懸濁液。[Claims] 1. A serum-free medium for growth of human neutrophil progenitor cells and megakaryocyte progenitor cells in vitro, for use with a hematopoietic growth factor, comprising a basal medium, a corticosteroid, transferrin, and insulin. A serum-free medium containing, cholesterol, ethanolamine, and human albumin. 2. The serum-free medium according to claim 1, wherein the human albumin is deionized. 3. The serum-free medium of claim 1, wherein the corticosteroid is hydrocortisone. 4. The serum-free medium according to claim 1, further comprising at least one lipid selected from the group consisting of triglycerides and phospholipids. 5. The serum-free medium according to claim 4, wherein the lipid is a triglyceride having a fatty acid side chain selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, palmitic acid, linolenic acid, and stearic acid. 6. The serum-free medium according to claim 4, wherein the lipid is a phospholipid selected from the group consisting of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. 7. The serum-free medium according to claim 3, further comprising selenium, α-monothioglycerol, β-mercaptoethanol, and a HEPES buffer. 8. The serum-free medium according to claim 7, further comprising hydrocortisone, 1-10 μM cholesterol, 0.01-0.1 mg / ml triglyceride, 0.0034-0.034 mg / ml transferrin, 25-125 μg / ml. Insulin, 1 to 25 μg / ml α-monothioglycerol, 10 to 160 μM β-mercaptoethanol, 20 to 100 μM ethanolamine, 50 to 200 μM human albumin, 0.1 to 25 mg / ml HEPES buffer, 10 A serum-free medium containing from 25 to 25 mM. 9. The serum-free medium according to claim 8, wherein hydrocortisone, 200 ng / ml cholesterol, 0.05 mg / ml triglyceride, 0.017 mg / ml transferrin, 75 μg / ml insulin, 10 μg / ml α-monothioglycerol. , 216 ng / ml β-mercaptoethanol, 5 × 10 −5 M ethanolamine, 100 μM human albumin, 10 mg / ml HEPES buffer, 25 mM serum-free medium. 10. A method for preparing a serum-free suspension of human hematopoietic progenitor cells, wherein the cell component comprises at least about 16% neutrophil progenitor cells and at least about 1% megakaryocyte progenitor cells, comprising: (a) bone marrow, peripheral Obtaining hematopoietic stem / source cells from blood or umbilical cord blood, and (b) using said stem / source cells as a serum-free culture medium containing hematopoietic growth factors, a basal medium, a corticosteroid, and transferrin. Culturing in a medium containing insulin, cholesterol, ethanolamine, and human albumin for about 7 to 14 days. 11. 11. The method of claim 10, wherein the human albumin is deionized. 12. 11. The method of claim 10, wherein the corticosteroid is hydrocortisone. 13. 11. The method of claim 10, further comprising at least one lipid selected from the group consisting of triglycerides and phospholipids. 14． 14. The method of claim 13, wherein the lipid is a triglyceride having a fatty acid side chain selected from the group consisting of linoleic acid, oleic acid, palmitic acid, linolenic acid, and stearic acid. 15. 14. The method of claim 13, wherein the lipid is a phospholipid selected from the group consisting of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. 16. 13. The method of claim 12, further comprising selenium, α-monothioglycerol, β-mercaptoethanol, and HEPES buffer. 17． A cell suspension prepared by the method according to claim 10. 18. A human hematopoietic cell, wherein the cell component comprises at least about 16% neutrophil progenitor cells and at least about 1% megakaryocyte progenitor cells, and the cell suspension is substantially free of animal proteins. Serum-free suspension. 19. 19. The cell suspension of claim 18, wherein the cellular component comprises at least about 30% neutrophil progenitor cells. 20. 20. The cell suspension of claim 19, wherein the cellular component comprises at least about 60% neutrophil progenitor cells. 21. 19. The cell suspension according to claim 18, wherein the neutrophil progenitor cells are selected from the group consisting of blast cells, promyelocytes, neutrophil myelocytes, and postneutrophil myelocytes. 22. 19. The cell suspension of claim 18, wherein the cell component comprises at least about 3% megakaryocyte progenitor cells. 23. 23. The cell suspension of claim 22, wherein the cell component comprises at least about 8% megakaryocyte progenitor cells. 24. 19. The cell suspension of claim 18, further comprising about 3 to 25% monocytes and less than about 0.01% mast cells. 25. 19. The cell suspension of claim 18, further comprising colony forming units (CFU) and cluster forming units (clFU). 26. 26. The cell suspension of claim 25, wherein at least about 40% of said total CFU / clFU are granulocyte-macrophage colony forming units and at least about 40% of said total CFU / clFU are granulocyte cluster forming units. 27. A serum-free suspension of human hematopoietic cells, wherein at least about 20% of said cells are CD15 + / CD11b- and said cell suspension is substantially free of animal proteins. 28. A method for determining the number of megakaryocyte progenitor cells in a suspension of hematopoietic cells, comprising: (a) mixing a sample of the cell suspension with fibrinogen and thrombin to form a mixture; ) Place the mixture on a microscope slide to allow the mixture to form a fibrin clot containing the hematopoietic cells, and (c) culture the cells in the fibrin clot for 14 days to expand the megakaryocyte progenitor cells. To form megakaryocytes, (d) fixing the cells in the fibrin clot, (e) contacting the fixed cells with a primary antibody specific for platelet glycoprotein IIb / IIIa Thereby specifically binding to megakaryocytes, (f) labeling the megakaryocytes with a secondary antibody and an immunoperoxidase color reaction, thereby obtaining a color unique to the megakaryocytes, and (g) the whole cells. The characteristic color within the cell population Assessing the number of recognized megakaryocytes and (h) extrapolating the number of said megakaryocyte progenitor cells present in the original suspension of said hematopoietic cells. 29. A method for preparing a differentiated suspension of human megakaryocytes, wherein the cellular components include morphologically recognizable megakaryocytes of the CD41a + cell population, comprising: (a) bone marrow, peripheral blood, Or obtaining hematopoietic stem / source cells from cord blood, (b) culturing the stem / source cells in a serum-free culture medium containing at least one hematopoietic growth factor, and (c) thereafter the culturing Replenishing the object with serum. 30. 30. The method of claim 29, wherein the serum is fibrin deficient serum. 31. The hematopoietic growth factor is selected from the group consisting of IL-3, G-CSF, GM-CSF, SCF, thrombopoietin, or a recombinant protein containing one or more active portions of the hematopoietic growth factor. 29 ways. 32. A cell suspension prepared by the method of claim 29.
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