JPH09501318A

JPH09501318A - Methods and reagents for inhibiting human immunodeficiency virus replication

Info

Publication number: JPH09501318A
Application number: JP7506461A
Authority: JP
Inventors: ドレイパー，ケネス・ジー; チョーリラ，ブハラット; マクスウィゲン，ジェームズ; スティンクコーム，ダニエル・ティー; トンプソン，ジェームズ・ディー
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1994-08-04
Publication date: 1997-02-10
Also published as: CA2168566A1; EP0716693A1; MX9406022A

Abstract

(57)【要約】免疫不全ウイルスＲＮＡをウイルス複製に必要な遺伝子、例えばｎｅｆまたはｔａｔ遺伝子領域中で開裂する酵素的核酸分子。 (57) Summary An enzymatic nucleic acid molecule that cleaves immunodeficiency virus RNA in a gene required for viral replication, such as the nef or tat gene region.

Description

【発明の詳細な説明】ヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害するための方法および試薬本出願は、ドレーパー（Draper）の、いずれも”Method and Reagent for Inh ibiting Human Immunodeficiency Virus Replication”と題する、１９９２年５月１４日に出願された米国特許出願第０７／８８２，８８６号および１９９３年８月６日に出願された米国特許出願第０８／１０３，４２３号（本出願人に譲渡されている）の一部継続出願である。これらの出願は放棄されており、この内容のすべて（図を含む）を本明細書の一部としてここに引用する。本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製の阻害剤、特にＨＩＶ−１の複製の阻害剤としてのリボザイムの使用に関する。たとえば、ドレーパー（Dr aper）ら、ＰＣＴ／ＷＯ９３／２３５６９を参照のこと、この出願を本明細書の一部としてここに引用する。後天性免疫不全症候群（エイズ）はウイルスＨＩＶ−１の感染により引き起こされると考えられる。現在、それはアジドチミジン（ＡＺＴ）の投与により治療されており、これはこの疾患の進行を遅延させるが、治癒させるのではないと考えられる。ＨＩＶ−１のＡＺＴ耐性株は１年間の治療後に発現することが認められた。ある患者においてはＡＺＴの有効性は限られており、不耐性であることが認められる場合がある。比較的最近、ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）およびジデオキシシチジン（ＤＤＣ）などの薬物がエイズの治療用として試験された。これらの化合物はいずれも患者のウイルス負荷を低下させないが、それらは実際にこの疾患の症状を治療する。以下は、関連する技術の議論である。これらのいずれも、本発明に対する従来技術であると認めるものではない。ロッシ（Rossi）ら，8 Aids Research and H uman Retroviruses 183,1992は、抗-ＨＩＶ−１療法薬としてのリボザイムの使用についての概説を示している。彼らは下記のように述べている：ウイルス感染の治療における新たな戦術は、ウイルス転写体と対合してその発現を遮断するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの使用である。ＲＮＡは情報分子であるほかに、酵素的活性をも保有しうる。従ってアンチセンス機能と酵素的機能を単一の転写体中に組み込むことにより、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイムを設計することができ、これは実質的にいかなるウイルスＲＮＡにも特異的に対合して、特定の位置でホスホジエステル主鎖を開裂させ、これによりウイルスＲＮＡを機能的に不活性化する。この開裂を行うに際してリボザイム自身は変化せず、従って再循環させて他の分子を開裂させることができ、これによりそれは真の酵素となる。酵素的活性を保有する数種類の異なる触媒モチーフがあり、これらのそれぞれを部位特異性開裂能を備えた酵素的アンチセンスに取り込むことができる。ロッシらは、この研究は翻訳開始コドン付近のｇａｇ遺伝子ＲＮＡを標的とするハンマーヘッドリボザイムが全細胞性ＲＮＡの複雑な環境でその標的を特異的に開裂しうることを証明したとも述べている。ＨＩＶ−１中のリボザイム標的の同定に関して、彼らは２種類の調節蛋白質ｔａｔおよびｒｅｖが明らかに優れた標的であり、彼らはｔａｔｍＲＮＡ中、およびｔａｔとｒｅｖが共有するエキソン中の潜在的なリボザイム開裂部位を調べつつあると述べている。さらに彼らは下記のように述べている：標的選択の問題に対する合理的な研究方法は、下記の基準による。第１に、機能的に重要な標的、たとえばｔａｔ、ｒｅｖ、ｉｎｔ、ｐｓｉ（パッケージング部位）、またはｔＲＮＡ^lsyのプライミング部位を選ぶべきである。遺伝子または標的領域が決定されると、そのヌクレオチド配列を種々の単離体間での強い配列保存性につき判定すべきである。これらの保存領域内で、潜在的開裂部位、好ましくはＧＵＣまたはＧＵＡ（他は十分ではあるが、開裂効果がより低いように思われる）を選ぶべきである。この領域を潜在的な二次構造につき調べ、次いで最も有望な部位を選ぶべきである。最後に、細胞培養においてリボザイムを試験する前に、長い（少なくとも１００ヌクレオチドの長さ）基質を用いて一連のｉｎｖｉｔｒｏ開裂反応（好ましくは反応速度論的分析）を実施し、選ばれた部位が開裂に対して真に好ましいことを証明することが推奨される。［引用文献は省略。］ロッシらはさらに、潜在的リボザイム開裂部位としてさらに考慮および試験するに値する標的はウイルスパッケージングシグナルまたはｐｓｉ配列であると述べている。スードおよびドロリカ（Sioud,Drlica），88 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7303,1 991 は、ＨＩＶのインテグラーゼ遺伝子を開裂させるように設計されたリボザイムにつき記載している。彼らは、そのリボザイムが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプラスミドから転写されると、それはインテグラーゼＲＮＡの破壊およびインテグラーゼ蛋白質合成の完全な遮断をもたらすと述べている。彼らは、ＨＩＶ−１インテグラーゼ遺伝子は療法用リボザイムに対する有用な標的であろうと述べている。ハイデンライヒおよびエックスタイン（Heidenreich,Eckstein），267,J.Biol .Chem .1904,1992 は、ＨＩＶ−１のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）ＲＮＡ上の異なる部位を標的とする３種類のリボザイムにつき記載している。彼らは、リボザイム内の化学的修飾がＬＴＲＲＮＡの開裂に及ぼす影響についても記載している。これには２′−フルオロシチジン置換およびヌクレオチド間ホスホロチオエート結合が含まれる。ウィーラジンゲ（Weerasinghe）ら，65 J.Virology 5531,1991 は、ＨＩＶ− １ＲＮＡの５′リーダー配列内の保存領域に対して設計されたリボザイムにつき記載している。チャン（Chang）ら，2 Clinical Biotechnology 23,1990 は、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子内の異なる２部位およびウイルス５′−ＬＴＲ領域内の１部位を標的とすべく設計されたリボザイムにつき記載している。ロレンツェン（Lorentzen）ら，5 Virus Genes 17,1991 は、ＨＩＶ−１のビリオン感染因子（ｖｉｆ）を標的とするリボザイムにつき記載している。サーバー（Sarver）ら，247 Science 1222,1990 は、ＨＩＶ−１ｇａｇ転写体を標的とするハンマーヘッド群のリボザイムにつき記載している。彼らは、ＨＩＶ−１で攻撃された細胞が非リボザイム発現細胞の場合と比較してＨＩＶ−１ｇａｇＲＮＡレベルの実質的低下を示し、このｇａｇＲＮＡの低下は抗原ｐ２４レベルの低下に反映されたと述べている。彼らは、この結果はＨＩＶ−１などのヒト病原体に対する療法薬としてのリボザイムの開発に実現性があることを示唆すると述べている。ハンペル（Hampel）ら，“特異的ＲＮＡ配列を開裂させるためのＲＮＡ触媒“ −−１９８９年９月２０日出願、米国特許出願第０７／２４７，１００号明細書（１９８８年９月２０日出願）の一部継続出願−−はヘアピン型リボザイムにつき記載し、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子に対して特異的であると思われるリボザイムの例を提示している。ハンペルおよびトリッツ（Hampel,Tritz），28 Biochem istry 4929,1989、ならびにハンペル（Hampel）ら，18 Nucleic Acids Research 299,1990 もヘアピン型触媒性ＲＮＡモデルにつき記載し、１標的部位はＨＩＶ −１のｔａｔ遺伝子であると述べている。ゴールドバーグ（Goldberg）ら、ＷＯ９１／０４３１９、ロバートソンおよびゴールドバーグ（Robertson,Goldberg）、ＷＯ９１／０４３２４は、デルタ肝炎ベクター内で発現したリボザイムにつき記載し、デルタウイルスのゲノムがＨＩＶのｅｎｖまたはｇａｇｍＲＮＡに対するリボザイムを保有する可能性があると述べている。ロッシ（Rossi）ら、ＷＯ９１／０３１６２は、ＨＩＶ−１ｇａｇ転写体または５′ＬＴＲスプライス部位を開裂するために用いられるキメラＤＮＡ−ＲＮＡ触媒配列につき記載している。オジャン（Ojwang）ら、89 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 10，802，1992 およびユー（Yu）ら、90 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 6340，1993 は、ＨＩＶ−１発現を阻害しうると主張されるヘアピンリボザイムを記載する。ヨゼフおよびバーケ（Joseph,Burke） 268 J．Biol．Chem. 24，515，1993 は、抗−ＨＩＶヘアピンリボザイムの最適化を記載する。ドロプリック（Dropulic）ら、66 J．Viro logy 1432，1992 は、ＨＩＶ−１ＲＮＡの＋１１５のヌクレオシドで開裂するＵ５リボザイムを記載する。他の関連する技術には、ロッシ（Rossi）ら、米国特許第５，１４４，０１９号および第５，１４９，７９６号：アルトマン（Altman）ら、米国特許第５，１６８，０５３号；ザイア（Zaia）ら、660 Ann．N．Y．Acad．Sci. 95，1992；グァテリ（Guatelli）ら、16E J．Cell Biochem. 79，1992；ジーン（Jeang）ら、 267 J．Biol．Chem. 17891，1992；ドロプリック（Dropulic）ら、66 J．Virol. 1432，1992；リズィービック（Lisziewicz）ら、国際公開ＷＯ９１／１０４５３；国際公開ＷＯ９１／１５５００；ロッシ（Rossi）ら、14A J．Cell Biochem . D428，1990；および”The Papovaviridae”,Ed．Salzman et al.，Vol．2，The Viruses ，Plenum Press，N.Y.1987 が挙げられる。リボザイムは、他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的に反復開裂しうる、酵素的活性をもつＲＮＡ分子である。これらの酵素的ＲＮＡ分子は実質的にいかなるＲＮＡ転写体をも標的とすることができ、ｉｎｖｉｔｒｏで効果的な開裂が達成されている。キム（Kim）ら，84 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878 8,1987；ヘイゼロフおよびゲルラッハ（Haseloff,Gerlach）,334 Nature 585, 1988；セク(Cech),260 JAMA 3030,1988；ならびにジェフェリーズ（Jefferies）ら，17 Nucleic Acids Research 1371,1989。リボザイムは、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は、標的ＲＮＡを開裂させる作用をするＲＮＡの酵素的部分に近接して保持された、リボザイムの標的ＲＮＡ結合性部分により行われる。従ってリボザイムは、まず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの開裂法により、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊する。リボザイムはそれのＲＮＡ標的に結合して開裂させたのち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復結合して開裂させることができる。リボザイムの酵素的性質は他の手法、たとえばアンチセンス法（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して、その転写を阻止するだけである）より有利である。療法処置を行うのに必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。たとえば１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を開裂しうる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の特異性は結合の塩基対合メカニズムのみでなく、その分子がそれの結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する。すなわち阻害はＲＮＡ標的の開裂により引き起こされ、従って特異性は非標的ＲＮＡの開裂速度に対する標的ＲＮＡの開裂速度の比率として定義される。この開裂メカニズムは、塩基対合に関与するもの以外の因子に依存する。従って、リボザイムの作用の特異性は同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより大きいと考えられる。発明の概要本発明は、新規な酵素的ＲＮＡ分子、すなわちリボザイム、およびそれらを免疫不全ウイルス（たとえばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＦＩＶ−１およびＳＩＶ−１を含む関連のウイルス）の複製の阻害に用いる方法を特徴とする。それらのリボザイムは、ヒトおよび他の動物においてこれらの関連するウイルスにより引き起こされる疾病の治療法に用いることができる。本発明はまた、リボザイムを用いてこれらのウイルスのＲＮＡを開裂させることを特徴とする。特に、本明細書に記載されるリボザイム分子はＬＴＲ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｔａｔおよびｒｅｖウイルス遺伝子または領域を標的とする。これらの遺伝子は当技術分野において知られている。たとえばマツクラ（Matsukura）ら，86 Proc.Natl.Acad.Sci .USA 4244,1989、チェン-マイヤー（Cheng-Mayer）ら，246 Science 1629,1989 、ビシジ（Viscidi）ら，246 Science 1606,1989、マリム（Malim）ら，86 Proc .Natl.Acad.Sci.USA 8222,1989、ターウィリガー（Terwilliger）ら，88 Proc.N atl.Acad.Sci.USA 10971,1991、およびバーテル（Bartel）ら，67 Cell 529,199 1、ならびに図２Ａおよび２Ｂを参照されたい。従って第１の観点においては、本発明は、ＨＩＶ−１ＲＮＡ、またはその均等物、ウイルス複製（たとえば蛋白質合成）に必要な領域、たとえばｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔまたはｒｅｖ遺伝子領域、またはウイルス遺伝子発現を制御することが知られれている構造（たとえばｔａｒ、ｒｒｅまたは３’−ＬＴＲ領域）を特異的に開裂する酵素的ＲＮＡ分子（すなわちリボザイム）を特徴とする。 “酵素的ＲＮＡ分子”とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有し、かつその標的内のＲＮＡを特異的に開裂する作用をする酵素的活性をも有するＲＮＡ分子を意味する。すなわち酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡを分子間開裂し、これにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は、開裂を起こさせるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的ＲＮＡ分子をハイブリダイゼーションさせる機能を有する。１００％の相補性が好ましいが、５０− ７５％程度の低い相補性も本発明に有用である。ＨＩＶ−１に“均等な”ＲＮＡは、ヒト、ネコおよびサルを含めた種々の動物において免疫不全疾患に関連する天然に生ずるＲＮＡ分子を包含するものとする。これらのウイルスＲＮＡは互いに類似の構造および均等な遺伝子、たとえばｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子を有する。 “遺伝子”は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｍＲＮＡの蛋白質コード領域、ＨＩＶゲノム、プロウイルスゲノムまたはそのｍＲＮＡの蛋白質合成もしくは安定性を制御する、ＲＮＡ中のいずれかの制御領域を表すものとする。好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドのモチーフで形成されるが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連する）のモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例はロッシ（Rossi）ら（上述の引用文献を参照のこと）；ヘアピンモチーフの例はハンペル（Hampel）ら（上述の引用文献を参照のこと）に記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例はペロッタおよびビーン（Perrotta,Been），31 Biochemistry 16,1992；ＲＮａｓｅＰモチーフの例はゲリエル−タケダ（Guerrier-Takeda）ら，35 Cell 849,1983；グループＩイントロンはセク（Cech）ら，米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。これらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的ＲＮＡ分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ開裂活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることは、当業者には認識されるであろう。特に好ましい態様においては、ＨＩＶ−１ＲＮＡ内の開裂するＲＮＡは、以下に示す配列のうち１または２以上から選ばれる。配列は、ロスアラモスヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳデータベース中のＨＩＶＰＣＶ１２配列から取得した。折りたたまれる配列は、２．３ｋｂのサブゲノムｍＲＮＡの第１番目のヌクレオチドから始まる。この領域は、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子産物のコード領域を含む。第２の関連する観点においては、本発明は上記の酵素的ＲＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞を特徴とする。好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞、たとえば細胞表面にＣＤ４レセプター分子を有するＴ４リンパ球である。第３の関連する観点においては、本発明は、たとえば哺乳動物細胞内でその酵素的ＲＮＡ分子の発現を可能にする様式でベクター内に位置する、上記の酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含有する発現ベクターを特徴とする。第４の関連する観点においては、本発明はｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔまたはｒｅｖ遺伝子領域においてＨＩＶ−１ＲＮＡまたは関連するＲＮＡを開裂する酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与することにより、ヒト免疫不全疾患を治療する方法を特徴とする。他の関連する観点においては、本発明は本発明のリボザイムでネコまたはサルを処置することを特徴とする。それらのリボザイムはＨＩＶ−１ＲＮＡを開裂しうるものと等しくてもよく、またはＦＩＶおよびＳＩＶウイルスＲＮＡ内の類似の位置を標的とするように変更してもよい。本発明は、ＨＩＶ−１タイプのウイルス感染細胞のウイルスＲＮＡに対して高度の特異性を示す、一群の化学的開裂剤を提供する。所望によりそれらのリボザイムは、当技術分野で知られている方法により、均等な一本鎖ＤＮＡを標的とするように設計することができる。リボザイム分子は、好ましくはＨＩＶ−１のすべての株を単一のリボザイムで処置しうるように、ＨＩＶ−１の高度に保存された配列領域を標的とする。これらの酵素的ＲＮＡ分子は、感染細胞に対し外的または内的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフにおいては、分子が小型（４０ヌクレオチド未満、好ましくは３２−３６ヌクレオチドの長さ）であるため他のリボザイムモチーフと比較して治療の経費を低下させることができる。ＨＩＶ感染の治療のために送達される、今日報告されている最も小さいリボザイム（ロッシ（Rossi）ら，1992、前掲）は、１４２ヌクレオチドの長さのｉｎｖｉｔｒｏ転写体である。１００ヌクレオチドを越える長さのリボザイムの合成は自動化された方法によっては極めて困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。発現ベクターによるリボザイムの送達は、原則としてｅｘｖｉｖｏ処置のみによって可能である。これがこの方法の有用性を制限している。本発明においては、小型のリボザイムモチーフ（たとえば一般的に図１に示すハンマーヘッド構造のもの）および外的送達を用いる別の方法を用いる。これらの分子の構造が簡単であることも、リボザイムがｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。従ってハンマーヘッド構造体がより長い転写体に含有される状況と異なり、リボザイム構造体の適正な折りたたみまたはｍＲＮＡ標的領域へのリボザイムの相補的結合を妨害する非リボザイム−フランキング配列がない。本発明の酵素的ＲＮＡ分子は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の双方により引き起こされるものを含めたヒト免疫不全ウイルス感染症の治療に用いることができる。それらの治療は、サルおよびネコの免疫不全ウイルスを含めたヒト以外の霊長類に感染する他の関連ウイルスにも拡張することができる。感染動物を増殖性感染の時期に治療することができる。この治療のタイミングは感染細胞におけるウイルス負荷を低下させ、かつ増殖性感染のその後のいずれかのラウンドにおけるウイルスの複製を不可能にする。これが可能なのは、ウイルス蛋白質合成の開始が成功するのに必要な構造を、これらのリボザイムが不能にするからである。本発明において選ばれる標的は、従来の標的より有利である。これは感染に際してウイルス吸着または逆転写の時点で作用するだけでなく、潜在性感染細胞およびウイルスによりトランスフォームされた細胞にも作用するからである。さらにそれらのリボザイムの存在下で感染の第１ラウンドにおいて放出されるウイルス粒子は、それらのキャプシドが無傷であるため、なお免疫原性であろう。従って本発明の１方法によれば、欠損性ではあるが、免疫原性であるウイルス粒子を形成し、従って治療動物において免疫反応を開始する可能性を維持することができる。さらに本発明の酵素的ＲＮＡ分子は、ＨＩＶ−１または関連するウイルスに感染した細胞培養物にｉｎｖｉｔｒｏで使用して、無傷のキャプシドおよび欠損ゲノムＲＮＡを有するウイルス粒子を産生することができる。次いでこれらの粒子を、予防的に免疫応答を誘因するために、または感染動物の治療に用いることができる。また本発明は、本発明方法により形成された欠損性ＨＩＶ−１ウイルス（または関連の粒子）から調製された免疫感作用調製物、およびこれらの欠損性粒子、たとえば適切なプロモーターの制御下に本発明のリボザイムをコードするＤＮＡまたはベクターを含むものを用いて免疫感作または予防接種する方法を特徴とする。診断的使用本発明のリボザイムは、罹患細胞内における遺伝的浮動およびウイルスの突然変異を調べる診断道具として用いることができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間に密接な関連があるため、分子のいかなる領域においても、標的ＲＮＡの塩基対合および三次元構造を変化させる突然変異を検出することができる。本発明に記載する多重リボザイムの使用により、ＲＮＡの構造および機能にとって重要なヌクレオチド変化をｉｎｖｉｔｒｏで、ならびに細胞および組織内でマッピングすることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの開裂を利用して遺伝子発現を阻害し、疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）判定しうる。この方法で、他の遺伝子標的がその疾病の重要な仲介物質であると判定される可能性がある。これらの実験は、併用療法（たとえば異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム、既知の小分子型阻害剤と結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的または生物学的分子の併用による間欠的な処置）の可能性を提示することによって、疾病進行に対するより良い処置をもたらすであろう。本発明のリボザイムの他のｉｎｖｉｔｒｏの使用は、当該技術分野でよく知られており、ＨＩＶ−１関連状態に付随するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。これらのＲＮＡは、リボザイムを用いて処置した後、開裂生成物の存在を標準的な方法を用いて判定することにより検出する。特定の例においては、野生型ＨＩＶまたは標的ＲＮＡの突然変異型のみを開裂しうるリボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し、第２のリボザイムを用いて試料中の突然変異型ＲＮＡの存在を同定する。反応対照として、野生型および突然変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボザイムで開裂させて、反応におけるリボザイムの相対的効力および”非標的”ＲＮＡ種を開裂させないことを示すことができる。合成基質からの開裂生成物はまた、試料集団中の野生型および突然変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを発生させる。すなわち、それぞれの分析は、２つのリボザイム、２つの基質および１つの未知試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応とする。開裂生成物の存在は、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて判定し、それぞれのＲＮＡの完全長および開裂フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分析することができる。標的細胞における突然変異型ＲＮＡの発現および所望の発現型の変化の推定リスクについての知識を得るためには、その結果を定量化することは必ずしも必要ではない。その蛋白質産物が発現型（すなわちＨＩＶ）の発生に関係するｍＲＮＡの発現は、リスクを確立するのに適当である。両方の転写体について同等の比活性を有するプローブを用いれば、ＲＮＡレベルの定性的比較が適当であり、初期診断のコストを下げるであろう。ＲＮＡレベルを定性的または定量的のいずれで比較しても、野生型に対する突然変異型の比率がより高いことは、よりリスクが高いことと相関するであろう。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載まず、図面を簡単に説明する。図面図１は、ハンマーヘッドモチーフのリボザイムを図示したものであり、ＨＩＶ −１標的領域と相互作用するステムＩ、IIおよびIII（それぞれ（Ｉ）、（II）および（III）と符号を付けてある）を示す。リボザイムおよび標的双方の５′ および３′末端を示す。ダッシュは塩基対合したヌクレオチドを示す。図２Ａおよび２Ｂは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の種々の遺伝子および遺伝子領域を図示したものである。図３Ａ−３Ｃは、本発明の３種類のリボザイムを図示したものである。図４Ａ−４Ｇは、化学的に修飾した本発明のリボザイムを図示したものである（黒丸は修飾された塩基を示す）。詳しくは、図４Ａは非修飾ＨＣＨ−ｒ３７であり、図４Ｂはチオ置換ＨＣＨ−ｒ３７Ｓ２であり、図４Ｃはチオ置換ＨＣＨ− ｒ３７Ｓ４であり、図４Ｄ−Ｇはチオ置換ＨＣＨ−ｓ３７Ａ−Ｄである。図５は、化学的に修飾した本発明のリボザイムを図示したものであり（丸で囲んだ塩基は２′−Ｏ−メチルで修飾されている）、詳しくはリボザイムは２’− Ｏ−メチルＨＣＨ−０３７Ａである。図６ａ−ｆは、Ｖｅｒｏ細胞およびＨｅＬａ細胞の細胞質、膜および核からの抽出物中におけるリボザイムの安定性を図示したものである。図７、８および９は、種々のハンマーヘッドリボザイムをその活性およびヌクレアーゼ耐性とともに図示したものである。図１０は、ＬＴＲを標的とする種々のリボザイムの活性を図示したものである。図１１は、種々のアーム長さのリボザイムの活性を図示したものである。図１２は、異なる糖修飾を有するリボザイムを図示したものである。図１３は、ＴＡＴを標的とする種々のリボザイムの活性を図示したものである。図１４は、塩基番号を示してハンマーヘッドリボザイムを図示したものである。それぞれのＮおよびＮ’は、同一であっても異なっていてもよい。図１５は、ＨＩＶＲＮＡに対して活性を有する２つのヘアピンリボザイムを図示したものである。標的部位ＨＩＶ−１のゲノムは、そのＲＮＡ含有および逆転写のエラーの性質のため、急激な遺伝的浮動を受ける。しかしウイルスの複製に必須であるゲノムの領域（遺伝子）は、長期間にわたって定常配列を維持する（すなわち保存する）と予想される。これらの領域は異なるタイプまたは株の免疫不全ウイルス間で比較的保存されやすく、従ってそれらのウイルスすべてを破壊するために１種類のリボザイムが必要であるにすぎないので、これらの領域は本発明において好ましい標的部位である。このように１種類のリボザイムを用いて、すべてのＨＩＶ−１ウイルス、ならびにすべてのＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＦＩＶウイルスを標的とすることができる。本発明者らはＨＩＶ−１のこのような遺伝子を幾つか選び、それらのヌクレオチド配列を、これらの領域を標的とするリボザイムにより開裂しうる保存領域の存在につき調べた。ｖｉｆおよびｎｅｆ遺伝子の２つを詳細に分析した；ｔａｔ、ｒｅｖおよび上述の他の遺伝子も、以下に記載されるものと類似の方法により分析することができる。ヌクレオチド配列はロス・アラモスＨＩＶ遺伝子バンクから得られた。ＨＩＶゲノムの選択された領域を標的とするリボザイムを、ＲＮＡの翻訳を阻害する様式で標的ＲＮＡを開裂するように選ぶ。翻訳の阻害がたとえば蛋白質合成を阻害することによりウイルス複製を阻害するように遺伝子を選択する。ＨＩＶ−１ＲＮＡのこれらの重要な領域内の有効な標的部位の選択は、その標的ＲＮＡの種々のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに対するアクセス可能性を試験することにより行われる。これらの試験は、ＲＮＡプローブを使用し、ハイブリッド分子をＲＮａｓｅＨで開裂させることによりアクセス可能性をアッセイすることによって実施しうる（下記を参照されたい）。あるいはこの試験には、ＲＮＡの二次構造の予想から設計されたリボザイムプローブを使用し、開裂生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりアッセイし、開裂分子および非開裂分子の存在を検出することができる。以下は適切な標的部位を同定しうる方法の例であり、本発明を限定するものではない。一般にこれらの方法は、ハンマーヘッドリボザイムに対する潜在的な開裂部位を同定し、次いで二次構造の形成が最小となることを確実にすることにより、これらの部位それぞれにつき標的としてのそれらの適性を判定する試験を行うことを含む。ロス・アラモス・データバンクのＨＩＶ−１ゲノム配列を、ｖｉｆおよびｎｅｆ遺伝子をコードする領域において比較した。１５カ所の推定リボザイム開裂部位が、１１株のウイルス配列間で高度に保存されていることが見出された。これらの部位は、これら２標的ＲＮＡ内のハンマーヘッドリボザイム開裂にとって好ましい部位である。ｎｅｆ遺伝子部位のうち２カ所はＨＩＶ−１ゲノムの３′− ＬＴＲ内の領域と重複しており、これは療法上潜在的な価値のある他の標的である。ｎｅｆ標的はすべてあらゆる既知のＨＩＶ−１ｍＲＮＡ内に存在し、ＲＮＡの効果的な翻訳または輸出に必要であると思われるｍＲＮＡの３′末端制御領域を破壊する開裂の標的となる可能性がある。同様に、多数のｖｉｆ標的部位がｐｏｌ、ｔａｔおよびｖｐｒｍＲＮＡ内に存在する（図２参照）。ｖｉｆおよびｎｅｆ遺伝子の各部位に対応する短いＲＮＡ基質を設計した。各基質は、対応するリボザイム認識領域と塩基対合しない、５′および３′末端における２−３ヌクレオチドからなるものであった。これらの非対合領域は１２− １４ヌクレオチドの中央領域をフランキングし、リボザイム中の相補的アームをこれに対して設計した。各基質配列の構造は、標準的な市販のＰＣｆｏｌｄコンピュータープログラムを用いて推定した。結合の正の自由エネルギーを生じる配列を受容した。負の自由エネルギーを生じる配列は、各末端から１または２個の塩基をトリミングすることにより修飾した。修飾された配列がなお強固な二次構造をもつと予想された場合は、それらを排除した。基質を選択したのち、ＲＮＡ基質それぞれに対するリボザイムを設計した。リボザイムの折りたたみもＰＣｆｏｌｄにより分析した。ハンマーヘッドモチーフのステムII（図１参照）領域を形成し、かつ分子内塩基対合が避けられるフランキングアームを含むリボザイム分子を探索した。リボザイムはしばしば、リボザイム末端から塩基をトリミングすることにより、またはステムIIに追加の塩基対を導入して目的とする折りたたみを達成することにより修飾した。不適性な折りたたみを伴うリボザイムは排除した。基質／リボザイム対が適性な分子内構造を含むことを見いだしたのち、それらの分子を共に折りたたんで分子間相互作用を予想した。リボザイムとその同族標的配列への配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）塩基対合の模式図を図１に示す。このような分析を用いて、コンピューターの作成した配列比較に基づいて、ＨＩＶゲノムのｖｉｆおよびｎｅｆ遺伝子中の有効な標的部位の以下のような推定が得られた（表１を参照のこと）。標的配列は、参考のため、最初に最も５’側のヌクレオチド番号が示されている。括弧内の塩基は、保存パターンにおける代替塩基である。リボザイム標的として有用であると考えられる標的を、リボヌクレアーゼＨアッセイ法（下記を参照されたい）により核酸プローブへのアクセス可能性につき試験することができる。このアッセイは、リボザイムを合成する必要なしに、標的部位の使用を迅速に試験することができる。それを利用して、リボザイム攻撃に最適な部位をスクリーニングすることができる。リボザイムの合成本発明に有用なリボザイムは、セク（Cech）（前掲）が述べた遺伝子転写法により、または化学的合成法により調製することができる。ＲＮＡの化学合成はＤＮＡ合成の場合と類似する。しかしＲＮＡ中の追加の２′−ＯＨ基は、３′−５ ′ヌクレオチド間結合の形成に、かつ塩基の存在下でのＲＮＡの分解されやすさに対処するために、異なる保護基対策を必要とする。最近開発された、２′−ヒドロキシル基の保護のためにｔ−ブチルジメチルシリル基を用いるＲＮＡ合成法が、リボザイムの合成のための最も信頼性のある方法である。この方法によれば、適正な３′−５′ヌクレオチド間結合を有するＲＮＡが平均カップリング収率９９％以上で再現性をもって得られ、ポリマーの２工程脱保護を必要とするにすぎない。Ｈ−ホスホネート化学に基づく方法は、ホスホルアミダイト化学に基づく方法より相対的に低いカップリング効率を示す。これはＤＮＡ合成についても問題である。自動オリゴヌクレオチド合成のスケールアップのための有望な方法が、Ｈ −ホスホネートにつき最近報告された。適切なカップリング時間と“欠陥（ｆａｉｌｕｒｅ）”配列の追加キャッピングとの併用により、カップリング工程で２当量程度の少量のモノマーを用いて１４μｍｏｌｅの範囲のスケールでのオリゴヌクレオチドの合成において、高い収率が得られた。他の別法は、通常の固体支持体の代わりに可溶性高分子支持体（たとえばポリエチレングリコール）を用いるものである。この方法によれば、カップリング工程で約３当量のモノマーを用いて、バッチ当たり１００ｍｇ規模の量の短いオリゴヌクレオチドが得られる。リボザイムの有用性を高めるために、リボザイム構造に対する種々の修飾を行うことができる。このような修飾は保存寿命、ｉｎｖｉｔｒｏでの半減期、安定性、および標的部位へのこれらのリボザイムの導入の容易さを高め（たとえば細胞膜貫通を高めるために）、また標的細胞を認識し、かつ結合する能力を付与する。リボザイムの外的送達は主鎖の化学的修飾によって、たとえばリボザイム分子の全体的な負の電荷が減少して細胞膜を通る拡散が促進されることによって、有利になる。オリゴヌクレオチドの電荷を減少させるための本発明の対策には下記のものが含まれる：メチルホスホネートによるヌクレオチド間結合の修飾、ホスホルアミダイトの使用、正に帯電した分子へのオリゴヌクレオチドの結合、ならびにオリゴヌクレオチド、脂質および標的細胞に対する特異的レセプターまたはエフェクターから構成されるコンプレックスパッケージの形成。これらの修飾の例には、ＲＮＡ内のヌクレオチド間結合としてホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートを含むイオウ含有リボザイムが含まれる。このようなイオウ修飾リボザイムの合成は、イオウ伝達試薬、³Ｈ−１，２−ベンゼンジチオール−３ −オン１，１−ジオキシドを用いて達成される。リボザイムはリボース修飾されたリボヌクレオチドをも含有しうる。ピリミジン類似体はウリジンから、出発物質としてジエチルアミノイオウトリフルオリド（ＤＡＳＴ）を用いる方法で調製される。リボザイムは電荷を減少させるためにポリマーカチオンに静電的に、または共有結合により付着してもよい。このポリマーは、３′末端をリボヌクレオシドジアルデヒドに変換するだけで、リボザイムに結合させることができる。ジアルデヒドは末端２′，３′−シスジオール系を過ヨウ素酸開裂することにより得られる。送達系に対する個々の要件に応じた他の可能な修飾には、カルボキシ、アミノまたはチオール官能基を含む異なるリンカーアームが含まれる。さらに他の例には、メチルホスホネートおよび２′−Ｏ−メチルリボース、ならびにｍ₇ ＧｐｐｐＧまたはｍ₃ ^2.2.7ＧｐｐｐＧによる５′または３′キャッピングまたはブロッキングが含まれる。たとえばキナーゼ処理したリボザイムをグアノシントリホスフェートおよびグアニルトランスフェラーゼと接触させてｍ₃Ｇキャップをリボザイムに付加する。この合成ののち、リボザイムを標準法によりゲル精製することができる。リボザイムが所望の活性を有することを確認するために、５′キャップを含むものおよび含まないものにつき標準法により試験して、その酵素的活性およびその安定性の双方につきアッセイすることができる。種々の修飾を有するものを含めた合成リボザイムは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製しうる。シリカおよびポリマー系支持体上での逆相カラムおよびアニオン交換体を用いる他の液体クロマトグラフィー技術も採用しうる。以下は、１つのリボザイムの合成の例である。固相ホスホルアミダイト化学を用いた。用いたモノマーは、ウリジン、Ｎ−ベンゾイル−シトシン、Ｎ−フェノキシアセチルアデノシン、およびグアノシンの、２’−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリルシアノエチルホスホルアミダイト（Glen Research，Sterling，V A）であった。固相合成は、ＡＢＩ３９４または３８０ＢＤＮＡ／ＲＮＡ合成器で、それぞれの器械に提供される標準的なプロトコールを用いて実施した。唯一の例外は、カップリング工程を１０分から１２分に増加させたことである。ホスホルアミダイトの濃度は０．１Ｍであった。合成は、１μｍｏｌＲＮＡ反応カラム（Glen R esearch）を用いて１μｍｏｌのスケールで行った。平均カップリング効率は、放出されたトリチルカチオンの熱量測定により判定して、モデル３９４については９７％と９８％との間であり、モデル３８０Ｂについては９７％と９９％との間であった。合成後、保護されたリボザイムを固体支持体（たとえばＣＰＧ）から切断し、無菌バイアル中で、乾燥エタノール性アンモニア（２ｍＬ）中で５５℃において１６時間インキュベートすることにより、塩基およびジホスホエステル部分を脱保護した。反応混合物をドライアイス上で冷却した。その後、冷液体を無菌スクリューキャップつきバイアル中に移し、凍結乾燥した。リボザイムから２’−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基を除去するため、得られた残渣を乾燥ＴＨＦ（ＴＢＡＦ）中の１Ｍフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムに、各シリル基について２０倍過剰の試薬を用いて、室温（約１５− ２５℃）において１６時間懸濁した。等容量の無菌１Ｍ酢酸トリエチルアミン、ｐＨ６．５を加えることにより反応を停止させた。試料を冷却し、ＳｐｅｅｄＶａｃで最初の容量の半分に濃縮した。リボザイムは、Ｃ４３００Å ５μｍＤｅｌｔａＰａｋカラム上でアセトニトリル勾配を用いるＨＰＬＣにより、２工程で精製した。第１工程、すなわち”トリチルオン”工程では、５’−ＤＭＴ−保護リボザイムを５’−ＤＭＴ基を欠失している不合格配列から分離した。この工程で用いた溶媒は、Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（アセトニトリル）であった。溶出プロフィールは、２０％Ｂ−１０分間、次に、２０％Ｂから５０％Ｂの直線勾配−５０分間、５０％Ｂ−１０分間、５０％Ｂから１００％Ｂの直線勾配−１０分間、および１００％Ｂから０％Ｂの直線勾配−１０分間、であった。第２工程では、２％トリフルオロ酢酸で処理することにより完全に脱保護されたリボザイムを、Ｃ４３００Å ５μｍＤｅｌｔａＰａｋカラム上でアセトニトリル勾配を用いて精製する。この第２工程で用いた溶媒は、Ａ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）およびＢ（８０％アセトニトリル、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．８）であった。溶出プロフィールは、５％Ｂ−５分間、５％Ｂから１５％Ｂの直線勾配−６０分間、１５％Ｂ−１０分間、および１５％Ｂから０％Ｂの直線勾配−１０分間であった。トリエチルアンモニウム塩の形のリボザイムを含む分画を冷却し、ＳｐｅｅｄＶａｃで凍結乾燥した。固体残渣を最少量のエタノールに溶解し、アセトン中の過塩素酸ナトリウムを加えることにより、ナトリウム塩の形のリボザイムを沈殿させた。（同様の方法によりＫ⁺またはＭｇ²⁺塩を生成することができる）。遠心分離によりリボザイムを回収し、アセトンで３回洗浄し、凍結乾燥した。発現ベクター本発明においては合成リボザイムが好ましいが、発現ベクターにより産生されたものも使用しうる。適切なリボザイム発現ベクターを設計する際には、下記の因子を考慮することが重要である。最終リボザイムはリボザイム内の望ましくない二次構造を最小限に抑えるためにできるだけ小さく維持しなければならない。比較的強力なプロモーターであり、かつｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの双方で発現可能であるプロモーター（たとえばヒトサイトメガロウイルス即時型領域（ＨＣＭＶｉｅ１）プロモーターを選ぶべきである。このようなプロモーターは、標的ＲＮＡを破壊するのに十分なリボザイムの産生を行うのに適したレベルであるが、他の細胞活性の阻害が起こるほど高すぎないレベルで（細胞の死滅自体を目的としない限り）、リボザイムを発現すべきである。リボザイムの５′末端のヘアピンは、必要とされる転写開始配列（ＧＧまたはＧＧＧまたはＧＧＧＡＧ）がリボザイムの他の部分に結合せず、したがって転写過程の制御に影響しないことを確実にするために有用である。５′ヘアピンはまた、リボザイムを５′−３′エキソヌクレアーゼから保護するために有用である。リボザイム遺伝子の３′末端の選ばれたヘアピンは、転写終止シグナルとして作用するため、また３′−５′エキソヌクレアーゼ活性から保護のために、有用である。既知の終止シグナルの一例は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系に存在するものである。このシグナルは、長さ約３０ヌクレオチドである。より短い長さの他の３′側ヘアピンも良好な終止およびＲＮＡ安定性を付与するために用いることができる。これらのヘアピンは、標準リボザイムを適切な配向で配置し、かつこれらの配列が結合した状態で発現することができるベクター配列内に挿入することができる。ポリ（Ａ）テイルもリボザイムの３′末端を保護するために有用である。これらはポリ（Ａ）シグナル部位を発現ベクターに含有させる（ｉｎｖｉｖｏでポリ（Ａ）テイルを付加するように細胞に信号を発する）か、またはポリ（Ａ）配列を直接に発現ベクターに導入することにより得られる。第１の方法においては、シグナルはリボザイムの他の部分との望ましくない二次構造を形成するのを阻止する位置になければならない。第２の方法においては、ポリ（Ａ）ストレッチの大きさはｉｎｖｉｖｏで発現された場合に経時的にサイズが縮小する可能性があり、従ってベクターを経時的に検査する必要があろう。リボザイムがそれらの標的配列に作用するのを阻止するポリ（Ａ）結合性蛋白質を結合させるポリ（Ａ）テイルの付加については注意を払うべきである。リボザイムの試験目的リボザイムを選択し、合成し、精製すると、それらを速度論的その他の実験において試験して、それらの有用性を判定する。この方法の例を以下に提示する。リボザイムの調製粗製の合成リボザイム（一般に一度に３５０μｇ）を１５％変性ポリアクリルアミドゲル（厚さ０．７５ｍｍ、長さ４０ｃｍ）上で分離し、ＵＶシャドウイングにより視覚化する。全長リボザイムを含有するゲルを切り取り、ゲル切片を５ｍｌのゲル溶離緩衝液（０．５ＭＮＨ₄ＯＡｃ，１ｍＭＥＤＴＡ）中に一夜、４℃で撹拌しながら浸漬する。溶出液をＣ−１８マトリックス（Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ、ミリポア、マサチュセッツ州ミルフォード）上で脱塩し、真空乾燥させる。乾燥したＲＮＡを５０−１００μｌのＴＥ（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．２）に再懸濁する。この溶液のアリコートを１ｍｌのＴＥ中に１００倍に希釈し、その半量を用いてリボザイム溶液を分光測光法により定量する。この希釈原液の濃度は一般に１５０−８００ｎＭである。変性ポリアクリルアミドゲル上に単一バンドが存在することによりリボザイムの純度が確認される。リボザイムを２以上の部分に分けて合成することが有利であろう。リボザイムの各部分はごく限られた酵素的活性を示すか、または示さず、すべての部分が互いにリゲーション（または他の形で並置）すると、活性は実質的に（少なくとも５−１０倍）高まる。ハンマーヘッドリボザイム合成の具体例を以下に示す。本方法は、２つ（またはそれ以上）の比較的短い“半”リボザイムを合成し、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによりそれらを互いにリゲーションすることを含む。たとえば３４ｍｅｒリボザイムを作成するためには、２つの１７ｍｅｒを合成し、１つをリン酸化し、そして両者をゲル精製する。次いでこれらの精製された１７ｍｅｒを、２つの１７ｍｅｒに対して相補的なＤＮＡスプリント鎖にアニーリングする。このＤＮＡスプリントは、２つの１７ｍｅｒをそれぞれの１端が互いに隣接する状態で配置するように設計された配列を有する。次いで並置されたＲＮＡ分子をＡＴＰの存在下でＴ４ＲＮＡリガーゼにより処理する。あるいは相補的結合が２つのＲＮＡ分子の好ましいリゲーションに影響する場合は、ＤＮＡスプリント鎖をリゲーション反応から省くことができる。次いでこうして形成された３４ｍｅｒＲＮＡをＨＰＬＣ精製する。基質の調製約１０−３０ｐｍｏｌｅの未精製基質を、２５ｐｍｏｌｅの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端−放射性標識する。標識混合物全体を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化する。全長バンドを切り取り、１００μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に一夜４℃で浸漬する。速度論的反応短い基質（８−１６塩基）を用いる反応のために、アッセイ用緩衝液（７５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂ ）中に、基質濃度が１ｎＭ未満になるように基質溶液を１×で調製する。リボザイム溶液（典型的には２０ｎＭ）をアッセイ用緩衝液中に１×で調製し、１×アッセイ用緩衝液を用いて４種類の希釈液を調製する。各リボザイム希釈液（すなわち２０、１６、１２、８および４ｎＭ）１５μｌを別個の試験管に装入する。これらの試験管および基質試験管を、３７℃で少なくとも５分間プレインキュベートする。１５μｌの基質をリボザイム試験管中へ迅速ピペッティングにより混入することにより反応を開始する（最終リボザイム濃度が１０、８、６、４、２ｎＭであることに留意する）。５μｌアリコートを１５秒または３０秒間隔で取り出し、５μｌの停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、キシレンシアノールおよびブロムフェノールブルー染料）で停止する。最終リボザイムの時点で残りの基質のうちアリコートをゼロリボザイム対照として取り出す。これらの試料を１５％または２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。各ゲルを視覚化し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナー（アンビス・システムズ、カリフォルニア州サイディエゴ）で定量する。大部分の活性リボザイムにつき、Ｋ_mおよびＫ_cat値を測定するために速度論的分析を基質過剰で実施する。長鎖ＲＮＡ基質（長さ１５塩基を越えるもの）を用いる速度論的反応のために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７プロモーター、およびＨＩＶ−１ＲＮＡの適宜なヌクレオチドをコードするＤＮＡを含む特定のテンプレートを用いる転写により、基質を調製する。基質溶液はアッセイ用緩衝液（７５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂）中に１×で調製され、５８ｎＭ濃度の長鎖ＲＮＡ分子を含有する。ゲル精製リボザイムを１μＭ濃度となるように添加することにより、反応を開始する。アリコートを２０、４０、６０、８０および１００分の時点で取り出し、次いで５μｌの停止液の添加により停止する。変性ＰＡＧＥにより開裂生成物を分離する。バンドを視覚化し、アンビスベータスキャナーで定量する。速度論的分析リボザイム仲介による開裂に関する簡単な反応メカニズムは：［式中、Ｒ＝リボザイム、Ｓ＝基質、およびＰ＝生成物である］である。四角で囲んだ工程は基質過剰の場合にのみ重要である。リボザイム濃度は基質濃度より過剰であるので、リボザイム−基質コンプレックス（［Ｒ：Ｓ］）の濃度はコンプレックスが最初に形成されるごく短期間を除いて、経時的に一定である。すなわち：（ここでｔ＝時間）であり、従って：（Ｒ）（Ｓ）ｋ₁ ＝（ＲＳ）（ｋ₂＋ｋ₁）である。反応速度は基質が経時的に消失する速度である：これらの式を置換すると：または：となる。この式を時間収率につき積分すると：となり、ここでＳ₀＝初期基質である。従って非切断基質画分の負の対数を時間（分）に対してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる：ここでｋ_obs＝実測された速度定数である。勾配（ｋ_obs）をリボザイム濃度に対してプロットすると、下記の勾配をもつ直線が得られる：これらの方程式を用いると、速度論的実験より得られたデータからいずれの被験リボザイムが最も有用であるか、すなわち活性であるかを判定するために必要な情報が得られる。これらのリボザイムを選択し、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏ系で試験することができる。リポソームの調製脂質分子を揮発性有機溶剤（ＣＨＣｌ₃、メタノール、ジエチルエーテル、エタノールなど）に溶解した。有機溶剤を蒸発により除去した。この脂質を０．１ ×リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で水和懸濁し、次いで液体窒素を用いて３回凍結−融解し、室温でインキュベートした。懸濁液を順次０．４μｍ、０．２ μｍおよび０．１μｍのポリカーボネートフィルターから最大圧力８００ｐｓｉ（約５６．２ｋｇ／ｃｍ²）で押出した。押出されたリポソーム懸濁液とリボザイムを混合し、凍結乾燥した。この脂質／リボザイム粉末を水で元の容量の１／１０に再水和した。懸濁液を押出しに必要な最小容量（１．５ｍｌのバレルに対しては０．４ｍｌ、１０ｍｌのバレルに対しては１．５ｍｌ）に１×ＰＢＳで希釈し、０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍのポリカーボネートフィルターから再度押出した。このリポソームに捕獲されたリボザイムを捕獲されていないリボザイムからゲル濾過クロマトグラフィー（セファロースＣＬ−４Ｂ，バイオゲルＡ５Ｍ）により分離した。リポソーム抽出物をプールし、０．２μｍフィルターで濾過することにより滅菌した。遊離リボザイムをプールし、エタノール沈殿により回収した。リポソーム濃度は放射性脂質の取り込みにより測定された。リボザイム濃度は³²Ｐで標識することにより測定された。ロッシ（Rossi）ら，1 992（前掲）（およびそこに引用される参考文献）にリポソームを調製するための他の方法が記載されている。合成脂質誘導体、ジステアロイルホスファチジルエチルアミドチオアセチルスクシンイミド（ＤＳＰＥ−ＡＴＳ）をジパルミトイルホスファチジルコリンおよびコレステロールと配合したものからなるリポソーム配合物を用いる実験において、本発明者らは直径１００−２００ｎｍのリポソームの取り込みを同様な速度論的状態で観察した。大きい粒子ほどより多数の捕獲分子、またはより大きな分子量の分子、たとえば発現プラスミドを収容した。これらの粒子は、供給された脂質用量と蛍光の平均対数（リポソームの取り込みを追跡するためにカルセインを用いた）との間で直線関係を示した。２００μＭ用量についてすら細胞毒性は観察されなかった。これらのリポソームはＣＤ４細胞集団への送達に特に有用である。ｉｎｖｉｖｏアッセイ選ばれたリボザイムの作用の有効性をｉｎｖｉｖｏで、ＨＩＶ−１または関連するウイルスに対して感受性である細胞培養物を用いて、標準法により試験しうる。たとえばＨＩＶ感受性細胞の単層培養物を、確立された方法で増殖させる。細胞を６もしくは９６ウェル組織培養プレート中で増殖させる。ＨＩＶに感染させる前に、培養物を３−２４時間、リボザイム含有リポソームで処理する。次いで細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、ウイルスを１−１００ｐｆｕ／細胞の多重度で添加する。１時間吸着させたのち、遊離ウイルスをＰＢＳですすぎ去り、細胞を３−５日間、適宜なリポソーム調製物で処理する。次いで細胞に新鮮な培地を再供給し、再度インキュベートする。ウイルスは細胞から上層の培地中へ採集される。細胞を−７０℃および３７℃で各温度につき３０分間の３サイクルのインキュベーションにより破壊し、確立された方法を用いるプラークアッセイ法によりウイルス力価を測定する。リボヌクレアーゼ保護アッセイ細胞内における標的ｍＲＮＡの蓄積またはリボザイムもしくはＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの開裂（ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ）は、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて定量化することができる。この方法においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（U.S.Biochemical）を用いて、１×転写緩衝液（製造元より供給される）、０．２ｍＭＡＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、ＩＵ／μｌ膵臓ＲＮａｓｅ阻害剤（Boehringer Mannheim Biochemi cals）および２００μＣｉの³²Ｐ標識ＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，New Engl and Nuclear）を含む２０μｌの反応液中で、３７℃において１時間反応させて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスリボプローブを転写させる。標的ＤＮＡを１ＵＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅｌ(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)で３７℃において１５分間消化し、取り込まれなかったヌクレオチドをＧ−５０セファデックス・スピンクロマトグラフィーで除去する。アンチセンスプローブの転写と同様の方法で、適当なＤＮＡ鋳型を用いて標的ＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写することができる。標準的な方法により転写体を精製し、以下に記載する方法にしたがって、３７℃においてリボザイムで消化する。あるいは、ウイルス感染細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ）チューブに移し、マイクロ遠心分離機において低速で３０秒間遠心分離してペレット化し、７０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．１％サルコジル、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中で溶解させる。次に、細胞溶解物（４５ μｌ）または規定量のｉｎｖｉｔｒｏ転写体（これもまたハイブリダイゼーション緩衝液中）を、０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で、５×１０⁵ｃｐｍのそれぞれのアンチセンスリポプローブを含む５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、２５μｌの鉱油を上層し、５５℃で一夜加熱することによりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション反応を０．５ｍｌのＲＮａｓｅ溶液（０．４ＭＮａＣｌ中、２０Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＡ）２Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅＴ１、１０Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ）中に希釈し、３７℃で３０分間加熱し、１０μｌの２０％ＳＤＳおよび１０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、その後３７℃においてさらに３０分間インキュベートする。ハイブリッドは、０．５ｍｌのフェノール／クロロホルム１：１混合物で抽出することにより部分精製し、水相を０．５ｍｌのイソプロパノールと合わせ、ミクロ遠心分離機で室温（約２０℃）において１０分間遠心分離して、ＲＮａｓｅ耐性ハイブリッドをペレット化する。ペレットを１０μｌのローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、１×ＴＢＥ、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール）に溶解し、９５℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで変性条件下で分析する。リボザイムの安定性選ばれたリボザイムをその安定性、従ってその潜在的有用性を調べるために試験することができる。このような試験は種々の化学的修飾（たとえばポリ（Ａ）テイルの付加）がリボザイムの安定性に及ぼす影響を調べるためにも利用することができ、従ってより安定なリボザイムの選択の補助となる。たとえば反応混合物は、１−５ｐｍｏｌｅの５′（キナーゼ処理）および／または３′標識リボザイム、１５μｇの細胞質ゾル抽出物、および２．５ｍＭＭｇＣｌ₂を全容量１００μｌ中に含有する。反応物を３７℃でインキュベートする。８μｌアリコートを一定時間毎に取り出し、８μｌの停止混合物（２０ｍＭＥＤＴＡ，９５％ホルムアミド）と混合する。試料を１５％アクリルアミドシークエンスゲル上で分離し、フィルムに露光し、アンビス（Ａｍｂｉｓ）で走査する。３′標識リボザイムは、³²Ｐ標識コルジセピンをポリ（Ａ）ポリメラーゼにより３′ＯＨに取り込ませることにより形成しうる。たとえば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応物は、４０ｍＭトリス、ｐＨ８，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，２５０ｍＭＮａＣｌ，２．５ｍＭＭｎＣｌ₂；３μｌ ³²Ｐコルジセピン，５００Ｃｉ／ｍＭ；および６単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼを全容量５０μｌ中に含有する。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。リンパ球およびマクロファージ取り込みに及ぼすリポソーム表面修飾の影響ジステアロイルホスファチジルエタノールアミドメチルチオアセテートを含むリポソームを調製することができる。ヒドロキシルアミンを用いてチオール基を脱保護し、次に反応性チオールをチオール反応性基で修飾して、リポソームの表面特性を変化させることができる。Ｎ−エチルマレイミドとの反応は、リンパ球およびマクロファージ取り込みを引き起こす。この修飾により、ＣＤ４^-およびＣＤ４⁺リンパ球によりリポソームが取り込まれる。ヨードアセトアミドおよびヨード酢酸を用いる修飾を、取り込みについて試験した。ヨードアセトアミド修飾は、リンパ球細胞数が時間とともに減少しリポソームが毒性であることを示した。しかし、アセテート取り込みはスクシンイミドについて観察されるものより５倍多かった。取り込みは、³Ｈ−ヘキサデシルコレステロールエーテルおよび捕獲された水溶性フルオロフォアであるカルセインの両方の取り込みによりモニターした。いずれも、リポソームが７２時間の間に細胞に取り込まれたことを確証した。取り込みは、フィトヘマグルチニンで７２時間刺激されたリンパ芽球中でアッセイした。取り込み曲線は２相であり、最初の８時間の間には細胞表面結合のみが観察されたのに対し、２４時間後には取り込みは７２時間まで直線的であった。これは２００μＭ用量で観察された。１００μＭ脂質用量は、細胞表面結合のみを示した。塩基置換がリボザイム活性に及ぼす影響いずれの一次構造特性がリボザイムによる基質の開裂を変化させるかを判定するために、特異的リボザイムにより認識される基質開裂領域において塩基をわずかに変化させることができる。たとえば、基質配列を中心の“Ｃ”ヌクレオチドにおいて変化させて、開裂部位をＧＵＣからＧＵＡモチーフに変化させることができる。次いで各基質を用いた開裂についてのＫ_cat／Ｋ_m値を分析して、その変化がリボザイム開裂速度を高めるか否かを判定する。リボザイム結合アームに対して相補的な塩基を変化させる影響を扱うために、同様な実験を行うことができる。相補的基質に対する強固な結合を維持することが予想される変化が好ましい。ヌクレオチド含量のわずかな変化が、結合強度のみに基づいて予想し得ない様式でリボザイム／基質の相互作用を変化させる可能性がある。リボザイムの触媒コア領域の構造は、基質の構造、またはリボザイム／基質コンプレックスの三次元構造のわずかな変化を認識する。最適なリボザイム設計を始めるために、種々のアーム長さを有するが、同じ長さの短いＲＮＡ基質を標的とするリボザイムの開裂速度を調べることができる。最小のアーム長さが必要であり、有効な開裂はリボザイム／基質の組み合わせに応じて異なる。選ばれたリボザイムの開裂活性は、ＨＩＶ−１相同性基質を用いて評価することができる。アッセイはリボザイム過剰で実施され、おおまかなＫ_cat／Ｋ_min値が得られる。短い基質または長い基質を用いて得られる数値を比較すると、ｉｎｖｉｖｏでのリボザイムの有用性が示される。リポソーム送達されたリボザイムの細胞内安定性選ばれたリボザイムのｉｎｖｉｖｏ安定性を試験するためには、下記の試験が有用である。リボザイムを³²Ｐ末端標識し、リポソーム内に捕獲し、ＨＩＶ− １感受性細胞に３時間送達する。細胞を分画し、リボザイムをフェノール／クロロホルム抽出により精製する。あるいは、細胞（１×１０⁷、Ｔ−１７５フラスコ）をフラスコの表面から掻き取り、低温のＰＢＳで２回洗浄する。細胞を４ｍｌのＴＥＳ（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，０．２５Ｍ蔗糖，ｍＭＥＤＴＡ）で３５回ダウンシング（ｄｏｕｎｃｉｎｇ）することによりホモジナイズする。核を１００×ｇで１０分間ペレット化する。細胞下小器官（膜画分）をＳＷ６０ローターにより２００，０００×ｇで２時間ペレット化する。ペレットを１ｍｌのＨ緩衝液（０．２５Ｍ蔗糖，５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。上清液は細胞質画分を含有する（約３．７ｍｌ中に）。核ペレットをＴＭ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂）中の６５％蔗糖１ｍｌに再懸濁し、蔗糖の段階濃度勾配（１ｍｌの６５％蔗糖ＴＭ中の核、１ｍｌの６０％蔗糖ＴＭ、１ｍｌの５５％蔗糖ＴＭ、５０％蔗糖ＴＭ、３００μｌの２５％蔗糖ＴＭ）上でＳＷ６０ローターにより３７，０００×ｇで１時間バンド形成させる。核のバンドを採集し、ＴＭ緩衝液で１０％蔗糖となるように希釈する。核をＳＷ６０ローターにより３７，０００×ｇで１５分間ペレット化し、ペレットを１ｍｌのＴＭ緩衝液に再懸濁する。アリコートを変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、細胞内局在を測定する。新規に合成されたリボザイムの移動度を比較することにより、無傷のリボザイムを含有する種々の画分を測定することができる。細胞内でのリボザイム分子の半減期を延長する修飾を調べるために、細胞を上記により分画し、それぞれの画分の純度をその画分に存在することが知られている酵素活性をアッセイすることにより評価することができる。種々の細胞画分を−７０℃で凍結し、修飾されたリボザイム分子の相対的なヌクレアーゼ耐性の判定に利用する。リボザイム分子は５ホスホロチオエート（ｐｓ）により、または分子の各末端における２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）修飾により合成することができる。これらの分子およびホスホジエステル型のリボザイムを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより³²ＰおよびＡＴＰで末端標識する。等濃度を細胞質抽出物に添加し、それぞれのアリコートを１０分間隔で採取する。試料を変性ＰＡＧＥによりサイズ分画し、相対的なヌクレアーゼ耐性度をアンビス（Ａｍｂｉｓ）ベータスキャナーでゲルを走査することにより分析する。それらの結果は、リボザイムが細胞質抽出物で消化されたか否か、またいずれの型が相対的にヌクレアーゼ耐性が高いかを示す。短いＲＮＡ基質を用いた場合、修飾されたリボザイムは一般に天然リボザイムの触媒活性の８０−９０％を保持する。非標識、５′末端標識、または３′末端標識リボザイムをアッセイに使用しうる。これらの実験は、所見を証明するためにヒト細胞抽出物を用いて実施することもできる。ＨｅＬａ（ＣＤ４⁺）およびＶｅｒｏ細胞は、前臨床試験において抗ウイルス化学物質をスクリーニングするために多くの研究者によって用いられている。リボザイムおよびアンチセンスＤＮＡは、感染細胞中で治療的レベルを維持するためには、それらのヌクレアーゼ耐性に依存する。リボザイムのヌクレアーゼ安定性を増加させる化学修飾を設計するために、種々のタイプの細胞から核、細胞質および膜の溶解物を調製し、これらの画分中のヌクレアーゼ集団の相対的比活性（ヌクレアーゼ単位／ｍｇ蛋白質）および最適カチオン（Ｍｇ⁺²−、Ｍｎ⁺²−、Ｃａ⁺²−またはＺｎ⁺²−活性化）を比較した。ヌクレアーゼ活性は調べた細胞画分の間で著しく相違した（表２および３および図６ａ−ｆ；標準的な方法論により試験して、＋＋＋は高いヌクレアーゼ活性を示し、＋＋および＋はより低いレベルを示し、−はヌクレアーゼ活性がないことを示す）が、ＨｅＬａ細胞中に存在するヌクレアーゼ集団は、単球およびリンパ球調製物の両方において観察されたものとは同様ではなかった（表４、表中において標準単位は比較のためにのみ示されており、ヌクレアーゼ活性の特定のレベルを反映するものではない）。ＨｅＬａヌクレアーゼは、添加したＺｎ⁺²の存在下において最大活性を有したが、単球およびリンパ球溶解物においては添加したカチオンはヌクレアーゼ活性を増強しなかった。単球およびリンパ球溶解物におけるヌクレアーゼの相対的レベルは、活性化ＨｅＬａ溶解物中のものよりも、それぞれ２．２倍および４倍高かった。リボザイムに対する種々の化学修飾を、ヌクレアーゼ活性を増加させるがリボザイムの触媒活性を保持する能力について試験した。図７は、選ばれたリボザイムの触媒活性に及ぼす種々の修飾の影響を示す。活性を減少させた修飾（１３１５、１３７１および１２８５）についてはそれ以上の分析を行わなかった。リボザイムの化学修飾により、リボザイム安定性の細胞特異的パターンが得られ、２ ’−Ｏ−メチル糖置換が、いずれの溶解物についても総合的に最良のリボザイム安定性の増強を与えた。リンパ球および単球細胞質溶解物による消化に対するリボザイムの相対的耐性が図８に示される。リボザイムを分子の５’−末端または３’−末端のいずれかで標識したときのリボザイムの消化速度は同様であり、このことは、分解は溶解物中の内因性ホスファターゼ活性によるものではないことを示す。種々の報告は、ハンマーヘッドモチーフの結合アーム（ステムＩおよびIII）中でのリボザイムの修飾が、ヌクレアーゼ消化に対するはるかに増強された保護を与えるであろうことを示唆している。図９に示されるように、本発明者らは異なる結果を観察した。２．４、２．５、７、８、９、１０．４および１３位にヌクレアーゼ耐性部位があるようである。２．４、２．５および１０．４位の耐性は、試験されたリボザイムに特異的であるかもしれず、これらの部位のヌクレアーゼ感受性に関する結論に達するまでにはさらに多くの配列を試験する必要がある。しかし、７、８、９および１３位はこのモチーフにおいて保存されているヌクレオチドであり、溶解物消化実験において生成した適切な安定性フラグメントにより示されるように、ヌクレアーゼ消化が停止する部位のようである。興味深いことに、リンパ球および単球溶解物中にははるかに多くのヌクレアーゼが存在するように見えるが、活性化ＨｅＬａ細胞質溶解物を用いて同様の実験を行った場合には、安定なフラグメントは観察されなかった。ＨｅＬａＣＤ４⁺細胞におけるリボザイムの効力の観察は、治療の適性を判定する前にリンパ球において再実験すべきである。実施例１：ＨＩＶｔａｔリボザイムｔａｔの５′エキソンは以下の潜在的開裂部位を含む：すなわち２ＧＣＵ部位、３ＧＵＡ部位、５ＡＵＣ部位、３ＵＣＣ部位、および５ＣＵＣ部位。これらの１８部位のすべてをコンピューター折りたたみおよびＲＮａｓｅＨアッセイにより試験した。１３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの結合に対する各部位のアクセス可能性の測定を以下のようにして実施した：（ａ）クローンＶ配列（このクローンはロッシ（Rossi）博士により提供され、ヌクレオチド１５１−３６６の５′ｔａｔエキソンを含む）の最初の４２５ヌクレオチドを、ルナフォールド（ＲＮＡＦＯＬＤ）４．０（一般に入手されるプログラム）により折りたたんで、折りたたみドメイン、すなわちステムにより閉じられた自己充足構造（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の存在につき調べた。（ｂ）潜在的開裂部位それぞれにつき、その部位を含むドメインを折りたたんで、それが（ａ）部の場合と同様に折りたたまれることを確認し；次いでそのドメインを、開裂部位およびその周囲のヌクレオチド（全体で１１−１６ヌクレオチド）に非対合状態を維持させながら再度折りたたんだ。これら２つの折りたたみにおける自由エネルギーの差を、リボザイムまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが塩基対合するためにこの領域をメルトアウトするコストと解釈した。（ｃ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、−１７ないし−１８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの予想デルタ−Ｇ（結合）を与えるように調整された。従って全結合エネルギーの差は（ｂ）部で計算した自由エネルギー差に反映されると予想された。計算値を表５に示す。表５に挙げる１８の標的部位を標的とする１８のＤＮＡオリゴヌクレオチドを作成した。約１００ｎＭのボディー標識ＲＮＡ転写体（クローンＶ）、０．０８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ（過剰のＲＮａｓｅＨ）、ならびに１ｍＭ、１０μＭまたは１μＭＤＮＡオリゴヌクレオチドの２×希釈液を用いて、ＲＮａｓｅＨ実験を行った。結果を表６に示す。１８部位のうち８部位は、１０分間のインキュベーション後に５μＭで４０％以上の開裂を示した。最も活性の高い配列（Ｈ３３２，Ｈ３３７ｂ，Ｈ３５２，表６参照）に対する３種類のリボザイムを設計した。これら３種類のリボザイムを図３Ａ、ＢおよびＣに示し、それぞれＨＤＨ、ＨＥＨおよびＨＦＨと表示する。実施例２：チオホスフェートを含むリボザイムこの実施例の目的は、主鎖のある位置にホスフェートの代わりにチオホスフェート置換体を含むリボザイムの活性を評価することであった。ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子に対するリボザイムを、標準的なホスホルアミダイト化学を用いてＡＢＩ合成装置により合成した。ただし、チオホスフェートが主鎖に取り込まれる工程で、標準的な酸化工程（ヨウ素を用いる）に代わりにビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）イオウ伝達試薬を用いる酸化工程を用いた。脱保護および脱塩されたＲＮＡをゲル精製し、溶離し、キナーゼ処理し、配列決定して、その配列が適正であることを確認した。末端標識ＲＮＡを同様にＨ₂Ｏ₂で処理した。これはチオホスフェートを含有する位置における開裂を優先的に促進する。リボザイム活性を、短い（１２ヌクレオチド）末端標識基質ＲＮＡの開裂について試験した。基質濃度は約１ｎＭであり；リボザイム濃度は５−１００ｎＭであり；インキュベーションは３７℃で、７５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂中において、２−４０分間であった。開裂程度をゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定し、次いでＡＭＢＩＳにより定量した。これらのリボザイムを図４Ａ−４Ｇに示す。下記のリボザイムは本質的に１００％の活性を示した：ｒ３７（非修飾）、ｒ３７ｓ２（５′アーム上の１チオ、３′アーム上の２チオ）、ｒ３７ｓ４（各アーム上の３チオ修飾）、ｓ３７Ａ（３′アーム上の３修飾）、ｓ３７Ｂ（３′アーム上の交互の３修飾）。完全修飾されたリボザイムは若干の活性低下を示した。たとえばｓ３７Ｃ（基質結合アーム上においてほとんど完全に修飾されている）は非修飾に対して３倍の活性低下を示し、ｓ３７Ｄ（ステムＩ、IIおよびIIIにおいてチオ修飾）は非修飾に対して９倍の活性低下を示した。実施例３：２′−Ｏ−メチル含有リボザイムＡＢＩ合成装置により標準的なホスホルアミダイト化学を用いて、標準的なヌクレオチドの代わりに２′−Ｏ−メチルホスホルアミダイトヌクレオチドを使用して、リボザイムを作成した。リボザイム活性を上記の方法でＰＡＧＥ分析により測定した。図５を参照すると、基質と塩基対合するすべての位置（ステムIIIの５′側のＡを除く）に２′−Ｏ−メチルを含むリボザイムを合成した。２′−Ｏ−メチルリボザイムに関するＫ_cat／Ｋ_mは４４×１０⁶Ｍ^-1ｍｉｎ^-1であり、これに対して非修飾に関するものは４１×１０⁶ｍ^-1ｍｉｎ^-1であり、チオホスフェート修飾リボザイムに関するものは３２×１０⁶であった。従って２′−Ｏ−メチルリボザイムは１００％の活性を保持する。実施例４：ＨＩＶ−１のＬＴＲおよびＴＡＴ領域の標的化以下の実施例は、ＨＩＶ−１のＬＴＲおよびＴＡＴ領域を標的とする有用なリボザイムを示すために、上述の実施例を拡張したものである。ここで用いられる方法論の詳細は、１９９４年５月１８日に出願されたスティンクコーム（Stinch comb）ら、米国特許出願第０８／２４５，４６６号”Methods and Compositions for Treatment of Restenosis and Cancer Using Ribozymes”に記載されており、この記載を本明細書の一部としてここに引用する。本発明の実施にはこのような詳細は必要ではない。塩基の番号は、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｋ０３４５５（ＨＩＶＨＸＢ２）に従い、転写開始部位からの番号である。ＨＨリボザイム部位のためのＬＴＲ領域のスクリーニングＬＴＲは、ＨＩＶ−１ゲノムの中で最も保存されている領域の１つである。また、ＬＴＲ領域は、ＨＩＶ−１のライフサイクル中で生成されるすべての転写体に存在する。したがって、ＬＴＲ標的を開裂するリボザイムは、ＨＩＶ複製を遮断する可能性がある。ＨＩＶ−１ＬＴＲ中には、４３個の潜在的ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム部位がある。ａ）リボザイムがその標的と正しく折りたたまれること、およびｂ）標的配列がすべてのＨＩＶ−１株において保存されていること、に基づいて、１０個のハンマーヘッドリボザイムを合成した。ＲＮＡ合成ＲＮＡホスホルアミダイト化学を用いて、７／７の結合アームを有するリボザイムを合成した。上述のように、リボザイムを脱保護し、精製した。この実験において用いられた標的ＲＮＡは、６１３ｎｔ長さであり、ＬＴＲを標的とする１０個のＨＨリボザイムのすべてに対する開裂部位を含有していた。ＬＴＲ標的配列の上流にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む鋳型を、ＨＩＶ−１プロＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。他のこのようなクローンは容易に構築することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、このＰＣＲ増幅鋳型から標的ＲＮＡを転写させた。４つのリボヌクレオチド３リン酸の１つとして［α−³²Ｐ］ＣＴＰを含有させることにより、転写体を転写の間に内部標識した。３７℃で２時間転写させた後に、転写混合物をＤＮａｓｅ−１で処理して、転写に用いられたＤＮＡ鋳型を消化して除去した。イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させ、ペレットを７０％エタノールで２回洗浄して、塩および転写反応に用いられたヌクレオチドを除去した。ＲＮＡをＤＥＰＣ−処理水に再懸濁し、４℃において保存した。リボザイム開裂反応反応はリボザイム過剰条件（ｋ_cat／Ｋ_m）下で実施した（ハーシュラグ（Hers chlag）およびセク（Cech）、（1990）Biochemistry 29，10159-10171）。簡単には、１，０００ｎＭのリボザイムおよび１０ｎＭの内部標識標的ＲＮＡを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１０ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下で９０℃で２分間加熱することにより、別々に変性した。３７℃に１０−２０分間冷却することによりＲＮＡを復元した。リボザイムと標的ＲＮＡとを３７℃において混合することにより開裂反応を開始させた。一定の時間間隔で５μｌのアリコートを採取し、等容量の停止緩衝液を加えることにより反応を停止させ、ドライアイス上で凍結した。試料はシークエンスゲルで分離した。結果図１０に示されるように、個別に試験した１０個のリボザイムのうち、４つのＨＨリボザイム（５６８、５８１、６３１、６９６）のみがＬＴＲＲＮＡを開裂した。他の標的部位はリボザイム結合および開裂にはアクセス可能ではないようである。部位５６８はまた部位１１５とも称され、ドロープリック（Drouplic ）ら（66 J．Virol. 1432-1441，1992）ならびにハイデンライヒおよびエクスタイン（Heidenreich,Eckstein）（267 J．Biol．Chem. 1904-1909，1992）によりハンマーヘッドリボザイム開裂の標的とされている。５６８ＨＨリボザイムは他のものよりも高度にその標的を開裂したため、このＨＨリボザイムの結合アームの長さを最適化することに興味がもたれた。図１１に示されるように、結合アームの長さを１２から１４塩基対（合計）に増加させると、リボザイム開裂の速度は著しく増加した。１４塩基対より長い結合アームを有するリボザイムの活性には、著しい改良はなかった。特定の部位を標的とするＨＨリボザイムの化学的修飾は、ヒト血清中におけるリボザイムの安定性を著しく改良しうる。さらに、これらの修飾は、リボザイムの触媒活性には有意の影響を与えないようである。リボザイム中の、Ｕ４、Ｇ５、Ａ６、Ｕ７、Ｇ８、Ｇ１２およびＡ１５．１位（標準的な命名法を用いる、図１４を参照のこと）を除くすべての２’ヒドロキシル基を２’−Ｏ−メチル基で修飾した。Ｕ４およびＵ７位の２’ヒドロキシル基は、２’アミノ、２’−Ｃ− アリル、２’−Ｏ−メチルまたは２’−アラ−フルオロのいずれかで修飾した。１９９４年３月２９日に出願されたユースマン（Usman）らの米国特許出願０８／２１８，９３４号、"2'-Deoxy2'-alkylnucleotide containing Nucleic Acid" を参照のこと、この記載を本明細書の一部としてここに引用する。図１２を参照すると、５６８ＨＨリボザイムは、種々の塩基（上掲のものと同様）の糖部分の化学的修飾により安定化されることができた。以下の化合物の１つにより、５６８ＨＨリボザイムをさらに修飾した：２’フルオロ、Ｕ７位における２’アミノ、Ｕ４位におけるアラフルオロ、Ｕ４位およびＵ７位における２ ’アミノ、Ｕ４位におけるｃ−アリル。上述の修飾のいずれも、リボザイム活性に有害な影響を与えなかった。細胞を５６８ＨＨリボザイム（Ｕ４位およびＵ７位に２’アミノ修飾を有する）でトランスフェクトすると、ＨＩＶ−１の複製が遮断される。ＨＨリボザイム部位のためのＴＡＴ領域のスクリーニングＴＡＴｍＲＮＡの領域は、ＨＩＶ−１ライフサイクルの間に生成される転写体の大部分に存在する。したがって、ＴＡＴ標的を開裂するリボザイムは、ＨＩＶ複製を遮断する可能性がある。ＨＩＶ−１ＴＡＴ領域（５７７６ｎｔと６０４４ｎｔとの間）中には、５４個の潜在的ＨＨリボザイム部位がある。ａ）リボザイムがその標的と正しく折りたたまれること、およびｂ）標的配列がすべてのＨＩＶ−１株において保存されていること、に基づいて、９個のハンマーヘッドリボザイムを合成した。ＲＮＡ合成およびリボザイム開裂反応は、上述にしたがって実施した。この実験において用いた標的ＲＮＡは４２２ｎｔ長さであった。図１３に示されるように、５つの部位（５８４１、５８６９、５９７８、５９６６、５９６９）が、他のものより容易に開裂した。これらのハンマーヘッド部位のいずれも、これまでに標的とされたことはなかった。ヘアピンリボザイム部位のためのＨＩＶ−１ゲノムのスクリーニング表VIIIおよび図１５を参照すると、ＨＩＶ−１ゲノム中には２７個の潜在的ヘアピン（ＨＰ）リボザイム部位がある。表に示されるリボザイムを合成し、試験した。有害な影響を与えずにヘアピン構造の種々の領域を修飾することができる：たとえば、ヌクレオチド５６５位および４３９８位を標的とするものにおいて、２つの塩基を挿入して、それぞれＧＧＣＡ（第３カラム）のかわりにＧＧＣＡＣＡ、およびＧＣＡＧのかわりにＧＣＡＧＵＣ、とすることができる。ＬＴＲ領域中の部位５６５（オジュワン（Ojwang）ら、（1992）PNAS，USA. 8 9，10802-10806；ユー（Yu）ら、（1993）PNAS，USA. 90，6340-6344）、およびＨＩＶ−１ゲノムのＰＯＬ領域中の４３９８位（ヨゼフおよびバーク（Joseph,B urke）、（1993）J．Biol Chem. 268，24515-24518）は、ＨＰリボザイムの結合および開裂にアクセス可能であることが示されている。本発明者らはまた、５６５および４３９８位を標的とするＨＰリボザイムが活性を有することを見いだした。最良のＨＨおよびＨＰリボザイムは、その付随する開裂および標的部位とともに表VIIに示されている。リボザイムの投与選ばれたリボザイムを予防的に、またはＨＩＶ−１感染患者に、適宜な送達ベヒクル、たとえばリポソーム、制御放出ベヒクルにより、イオントホレシス、エレクトロポレーションもしくはイオン対合分子、または共有結合付加物、あるいは他の薬理学的に許容される送達法を用いて、感染組織にリボザイムを外的に送達することにより投与しうる。投与経路には、筋肉内、エアゾール、経口（錠剤または丸薬の形）、局所的、全身的、眼内、腹腔内、および／または鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）が含まれる。リボザイムによる免疫感作および／またはリボザイムの送達のための発現ベクターも適切である。選ばれたリボザイムの特定の送達経路はリボザイムの用途に依存するであろう。一般に各リボザイムについての特定の送達プログラムは、細胞内局在に関する非修飾リボザイムの取り込み、次いで効力の証明に注目するであろう。あるいは動物の器官または組織におけるこれらと同じ細胞への送達を追及することができる。取り込み試験には、送達ベヒクルまたは方策にかかわらず、細胞のリボザイム取り込みを評価するための取り込みアッセイが含まれる。これらのアッセイは、取り込み後のリボザイムの細胞内局在をも測定し、最終的には標的配列を含む細胞コンパートメント（核および／または細胞質）内で定常状態濃度を維持するための要件を確立する。次いで効力および細胞毒性を調べる。毒性には細胞の生存性のみでなく、細胞の機能も含まれる。採用しうる送達法には下記のものが含まれる：ａ．リポソーム内に封入ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入ｃ．コレステロールとのコンジュゲーションｄ．大部分のｓｎＲＮＡまたは核蛋白質に見られる抗原結合部位または核標的部位を利用した、核コンパートメントへの局在化ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いた、リボザイムの電荷の中和ｆ．リボザイムを全身に分布させるための血液幹細胞の利用。本発明には、下記を含めた少なくとも３種類の送達方策が有用である：リボザイムの修飾、粒子キャリヤー型薬物送達ベヒクル、およびレトロウイルス発現ベクター。大部分の小分子同様に非修飾リボザイムは徐々にではあるが細胞に取り込まれる。細胞の取り込みを高めるために、リボザイムは本質的にはランダムに、その電荷を減少させるが特異的な官能基を保持する様式で修飾されていてもよい。これにより、分子は細胞膜を越えて拡散することができ、従って透過バリヤーが除かれる。電荷を減少させるためのリボザイムの修飾は、細胞によるこれらの大型分子の取り込みを高める１つの方法である。しかし、ランダムな方法は推奨できない。リボザイムは小型の薬物より構造的および機能的に複雑だからである。リボザイムの触媒活性を維持するために必要な構造上の要件は当業者に周知である。細胞への送達を高める修飾を設計する際には、これらの要件を考慮する。修飾はヌクレアーゼ分解に対する感受性を低下させるためにも設計される。これらの特性は双方ともリボザイムの効力を大幅に改良するであろう。リボザイム開裂活性に必要なホスホジエステル結合を変化させることなしに、細胞による取り込みを数オーダー増大させることができる。ホスフェート主鎖の化学的修飾は負の電荷を減少させ、これにより膜を越えた自由拡散が可能になるであろう。この原理はアンチセンスＤＮＡ技術につき有効であることが立証された。ＤＮＡとＲＮＡの化学組成の類似性が、これを実現可能な方法にする。体内においては、組織細胞内への修飾リボザイムの拡散を駆動させるために外部濃度の維持が必要であろう。罹患組織を一時的に高い濃度の薬物に暴露し、これが徐々に全身吸着により消費されうる投与経路が好ましい。リボザイムの循環半減期を高めるように設計された薬物キャリヤーを用いる静脈内投与を採用しうる。薬物キャリヤーのサイズおよび組成が、血流からの急速な消失を制限する。感染部位に蓄積するように調製されたキャリヤーは、リボザイムを分解プロセスから保護しうる。薬物送達ベヒクルは全身投与および局所投与の双方に有効であろう。それらは徐放性レザバーとして作用するように、またはそれらの内容物を標的細胞に直接送達するように設計することができる。直接送達薬物ベヒクルを用いることの利点は、１回の取り込み当たり多数の分子が送達されることである。これらのベヒクルは、さもなれば血流から急速に消失するであろう薬物の循環半減期を高めることが示された。このカテゴリーに属する特殊な薬物送達ベヒクルの若干の例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および生物吸着性マイクロスフェアである。このカテゴリーに属する送達システムのうちではリポソームが好ましい。リポソームは細胞内安定性を高め、取り込み効率を高め、かつ生物学的活性を改良する。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式で配列した脂質からなる中空の球状小胞である。それらは水溶性化合物を閉じ込めるための内部水性空間を備え、直径０．０５ミクロンから数ミクロンに及ぶサイズである。幾つかの研究から、リポソームはＲＮＡを細胞へ送達することができ、かつそのＲＮＡは生物学的に活性な状態に維持されることが示された。たとえば、最初は研究道具として設計されたリポソーム送達ベヒクルであるリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）が無傷のｍＲＮＡ分子を細胞へ送達し、これにより対応する蛋白質が産生することが示された。他の研究においては、長さ３，５００ヌクレオチドであり、ＨＩＶの構造蛋白質に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子を内包する、抗体を標的とするリポソーム送達システムが、ウイルスの増殖を配列特異的様式で阻害した。その抗体は感染細胞をリポソームの標的にするだけでなく、感染細胞によるリポソームの内在化のきっかけをも与えた。エンドサイトーシスのきっかけを与えることは、ウイルスの阻害にとって有用である。最後に、リポソームにより送達された合成リボザイムはＨ９細胞（ＨＩＶ感受性細胞の一例）の核内に濃縮され、かつそれらの細胞内での配列開裂により証明されるように機能性であることが示された。比較的小さなリボザイム（長さ１４２ヌクレオチド未満）を用いる他の細胞タイプへのリポソーム送達は、異なる細胞内局在を示した。リポソームは幾つかの利点をもたらす：それらは無毒性であり、生物分解性の組成である；それらは長い循環半減期を示す；および、組織を標的とするためにそれらの表面に認識分子を容易に結合させることができる。最後に、懸濁液または凍結乾燥製品のいずれにおいてもリポソーム系薬剤が経費的に有効に製造されることは、許容しうる薬物送達システムとしてのこの技術の実施可能性を証明した。他の制御放出薬物送達システム、たとえばナノ粒子およびヒドロゲルは、リボザイムの有効な送達ベヒクルであろう。これらのキヤリヤーは化学療法薬および蛋白質系薬剤のために開発されたものであり、従ってリボザイムの送達に適している。リボザイムの局所投与は、最小の全身吸収において投与部位に局在濃縮を可能にするので有利である。これによって罹患部位へのリボザイムの送達方策が簡単になり、毒性の程度が少なくなる。さらに、適用される材料の量が他の投与経路に必要なものよりはるかに少ない。効果的な送達のためには、リボザイムが感染細胞内へ拡散することが必要である。負の電荷を中和するためにリボザイムを修飾することが、透過に必要なすべてであろう。しかし電荷の中和が不十分である場合、修飾されたリボザイムをリポソーム内に透過促進剤、たとえばアゾン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸と共に配合することができる。リポソームは修飾リボザイムおよび透過促進剤がリポソームから感染細胞内へ移行する徐放性ベヒクルであってもよく、またはリポソームのリン脂質が修飾リボザイムおよび透過促進剤と共に細胞への送達の促進に直接に関与することもできる。場合により、リボザイムおよび透過促進剤の双方を徐放のための坐剤配合物中に配合することができる。リボザイムは全身的に投与することもできる。全身吸収は、薬物が血流中に蓄積し、次いで全身に分布することを意味する。全身吸収を生じる投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内、鞘内、および眼内投与が含まれる。これらの投与経路はそれぞれリボザイムをアクセス可能な罹患組織に暴露する。皮下投与は局所リンパ節中へ排液し、リンパネットワーク内を通って進み、循環中へ進入する。循環中へ進入する速度は、分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームその他の薬物キャリヤーを用いると、リボザイムはリンパ節に局在する。リボザイムを細胞内へ拡散するように修飾するか、またはリポソームが細胞への非修飾もしくは修飾リボザイムの送達に直接関与することもできる。この方法は特に、本発明の抗ＨＩＶリボザイムを用いるエイズの処置に有用である。同様にエイズ療法において好ましいのは、オリゴヌクレオチドをリンパ球およびマクロファージへ送達しうるリポソーム配合物の使用である。このオリゴヌクレオチド送達システムは、感染した一次免疫細胞におけるＨＩＶ増殖を阻害する。全血の研究により、この配合物は３７℃で８時間後に９０％までがリンパ球に取り込まれることが示される。生物内分布および薬物動力学の予備研究によれば、静脈内投与の１時間後に組織１ｇ当たりの注射量の７０％が脾臓において得られた。この配合物は２つの理由から、抗エイズリボザイムのための卓越した送達ベヒクルを提供する。第１に、Ｔヘルパーリンパ球およびマクロファージはウイルスに感染する一次細胞であり、第２に、皮下投与はリボザイムをリンパ節内の常在性ＨＩＶ感染リンパ球およびマクロファージへ送達する。次いでリポソームはリンパ系から排出され、循環系に進入し、脾臓に蓄積し、ここでリボザイムが常在性リンパ球およびマクロファージへ送達される。腹腔内投与も循環系への進入をもたらし、この場合もリボザイム送達ベヒクル複合体の分子量およびサイズが進入速度を制御する。静脈内注射されたリポソームは肝臓、肺臓および脾臓内への蓄積を示す。この蓄積が注射量の３０−４０％となるように組成およびサイズを調整することができる。残りの用量は最高２４時間、血流中で循環する。選ばれた送達法により罹患細胞における細胞質蓄積が起こり、最適投与のためには分子はある程度のヌクレアーゼ耐性をもつべきである。核への送達も採用しうるが、好ましさの程度は比較的低い。極めて好ましい送達法には、リポソーム（１０−４００ｎｍ）、ヒドロゲル、制御放出ポリマー、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーション（ｅｘｖｉｖｏ処置用）、および他の薬剤学的に適用しうるベヒクルが含まれる。用量は適応症および投与経路に依存するが、１００−２００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内であるべきである。処置期間は病的症状の経過期間全体に及び、通常は少なくとも１４−１６日間、恐らく連続的であろう。局所適用、眼内適用および膣内適用のためには、１日多数回の投与が考慮される。投与回数は疾病への送達ベヒクルおよび臨床試験による有効性データに依存するであろう。細胞内における療法レベルのリボザイムの確立は、取り込みおよび分解の速度に依存する。分解度を低下させると、リボザイムの細胞内半減期が延長される。従って化学的に修飾されたリボザイム、たとえばホスフェート主鎖の修飾、またはヌクレオチド類似体によるリボザイムの５′および３′末端のキャッピングを有するものは、異なる投与形態を必要とするであろう。有用な系についての記載は前記に引用した先行技術により提供され、それらすべてを本明細書に参考として引用する。本発明のリボザイムは、試料中の標的ＲＮＡの存在を特異的または非特異的に検出するための診断道具としても有用である。すなわち試料中に標的ＲＮＡが存在する場合、それはリボザイムによって特異的に開裂し、従ってより小型のＲＮＡ種として容易にかつ特異的に検出することができる。このような小型のＲＮＡ種の存在は、試料中に標的ＲＮＡが存在することを指示する。他の態様は下記の特許請求の範囲の範囲内である。 Detailed Description of the Invention Methods and reagents for inhibiting human immunodeficiency virus replication This application is for Draper, “Method and Reagent for Inh ibiting Human Immunodeficiency Virus Replication ”, May 1992. US patent application Ser. No. 07 / 882,886 filed March 14, 1993 US Patent Application No. 08 / 103,423 filed on August 6 (assigned to the applicant It is a partial continuation application). These applications have been abandoned and this content All of which (including the figures) are incorporated herein by reference. The present invention relates to inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV) replication, particularly HIV-1. To the use of ribozymes as inhibitors of the replication of Escherichia coli. For example, Draper (Dr aper) et al., PCT / WO93 / 23569, which is hereby incorporated by reference. Quoted here as part. Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by infection with the virus HIV-1 It is thought to be done. Currently it is treated by administration of azidothymidine (AZT) , Which delays the progression of the disease but does not cure it. available. AZT resistant strain of HIV-1 was found to develop after 1 year of treatment Was. AZT has limited efficacy in some patients and may be intolerant May be accepted. Relatively recently, dideoxyinosine (DDI) and dide Drugs such as oxycytidine (DDC) have been tested for the treatment of AIDS. this None of these compounds reduce the viral load in patients, but they do. Treat the symptoms of the disease. The following is a discussion of related technologies. None of these are conventional to the present invention. It is not an admission that it is technology. Rossi et al., 8Aids Research and H uman Retroviruses 183,1992 used ribozymes as anti-HIV-1 therapeutic agents. It gives an overview of usage. They state: A new tactic in the treatment of viral infections is to pair it with viral transcripts and The use of antisense DNA or RNA to block expression. RNA is information Besides being a child, it may also possess enzymatic activity. Therefore antisense function And enzymatic function into a single transcript, Ribozymes can be designed that can be used in virtually any viral RNA. Specific pairing to cleave the phosphodiester backbone at specific positions, which results in Functionally inactivates viral RNA. When performing this cleavage, the ribozyme itself The body is unchanged and can therefore be recycled to cleave other molecules, which Ri it becomes a true enzyme. Several different catalytic motifs possessing enzymatic activity Yes, each of these was converted to an enzymatic antisense with site-specific cleavage ability. Can be included. Rossi et al., This study targets the gag gene RNA near the translation initiation codon Hammerhead ribozyme specific for its target in the complex environment of total cellular RNA It also proved that it could be cleaved. Of ribozyme targets in HIV-1 For identification, they were clearly superior in the two regulatory proteins tat and rev Targets, they are in the tat mRNA and are shared by tat and rev. He said that he was investigating potential ribozyme cleavage sites in Son. Furthermore they States: A rational approach to the problem of target selection is according to the criteria below. First, Functionally important targets, such astat,rev,int,psi(Packagen Site) or tRNA^lsyPriming site should be chosen. Gene Once the target region has been determined, its nucleotide sequence is Sequence conservation should be assessed. Within these conserved regions, potential cleavage sites, Preferably GUC or GUA (others are sufficient but seem to have a lower cleavage effect) Should be selected). Examine this region for potential secondary structure, then You should choose the most promising part of. Finally, try ribozymes in cell culture. Prior to testing, a series of long (at least 100 nucleotides long) substrates were used. Performed an in vitro cleavage reaction (preferably kinetic analysis) and selected It is recommended to prove that the site is truly preferred for cleavage. [References Is omitted. ] Rossi et al. Further consider and test as potential ribozyme cleavage sites. Said that the worthy target is a viral packaging signal or a psi sequence. I'm eating. Sudo and Drlica, 88Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7303,1 991 is a ribozyme designed to cleave the HIV integrase gene. I have written about each. They said that the ribozyme was a plasmid of E. coli. When transcribed from a rasmid, it disrupts and integrates integrase RNA. It states that it results in a complete block of the proteinase synthesis. They are HIV-1 Integrase gene may be a useful target for therapeutic ribozymes You. Heidenreich, Eckstein, 267,J. Biol .Chem .1904,1992 is HIV-1 long terminal repeat (LTR) RNA. Three ribozymes targeting different sites above are described. They are, It also describes the effect of chemical modification in the ribozyme on the cleavage of LTR RNA. doing. This includes 2'-fluorocytidine substitution and internucleotide phosphorous. Includes thioate linkages. Weerasinghe et al., 65J. Virology 5531,1991 is HIV- A ribozyme designed for a conserved region within the 5'leader sequence of 1 RNA I have listed. Chang et al., 2Clinical Biotechnology 23,1990 is HIV-1 g Targets two different sites in the ag gene and one site in the viral 5'-LTR region The ribozyme designed to do so is described. Lorentzen et al., 5Virus Genes 17,1991 is the HIV-1 Ribozymes targeting the lion infectious agent (vif) are described. Server (Sarver) et al., 247Science 1222,1990 is HIV-1 gag transcription A ribozyme of the hammerhead group that targets the body is described. They are H HIV-1 compared to when the cells attacked with IV-1 are non-ribozyme expressing cells shows a substantial reduction in gag RNA levels, the reduction in gag RNA It is said that it was reflected in the decrease in p24 level. They found that the result was HIV-1 Feasibility of developing ribozymes as therapeutic agents against human pathogens such as Is suggested. Hampel et al., "RNA Catalysts for Cleaving Specific RNA Sequences". --- US patent application Ser. No. 07 / 247,100 filed Sep. 20, 1989 (Continuation application of Sep. 20, 1988) is related to hairpin ribozyme. And a ribozyme that appears to be specific for the HIV-1 gag gene. The following is an example. Hampel and Tritz, 28Biochem istry 4929,1989, and Hampel et al., 18Nucleic Acids Research 299, 1990 also describes a hairpin-type catalytic RNA model, and one target site is HIV -1 tat gene. Goldberg et al., WO 91/04319, Robertson and Goldson, WO 91/04324, hepatitis delta The ribozyme expressed in the vector is described, and the delta virus genome is HI. May carry a ribozyme against V env or gag mRNA It has said. Rossi et al., WO 91/03162, describes HIV-1ga. Chimera D used to cleave g transcript or 5'LTR splice sites The NA-RNA catalytic sequence is described. Ojwang et al., 89Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10, 802, 1992 and Yu et al., 90Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6340,1993 is HIV-1 Hairpin ribozymes that are claimed to be capable of inhibiting expression are described. Joseph and Ba 268 (Joseph, Burke)J. Biol. Chem. 24,515,1993 for anti-HIV hair The optimization of the pin ribozyme is described. 66 Dropropic et al.J. Viro logy 1432,1992 is cleaved at +115 nucleosides of HIV-1 RNA The U5 ribozyme is described. Other related techniques include Rossi et al., US Pat. No. 5,144,019. And 5,149,796: Altman et al., US Pat. No. 5,1. 68,053; Zaia et al., 660.Ann. N. Y. Acad. Sci. 95, 1992; Gu 16E, Guatelli et al.J. Cell Biochem. 79, 1992; Jeang et al., 267J. Biol. Chem. 17891, 1992; Dropulic et al., 66.J. Virol. 1432, 1992; Lisziewicz et al., International Publication WO91 / 1045. 3; International Publication WO91 / 15500; Rossi et al., 14AJ. Cell Biochem . D428, 1990; and "The Papovaviridae", Ed. Salzman et al., Vol. 2,The Viruses , Plenum Press, N.Y. 1987. Ribozymes repeatedly open other distinct RNA molecules in a nucleotide sequence-specific manner. It is a cleavable, enzymatically active RNA molecule. These enzymatic RNA molecules are It can qualitatively target any RNA transcript and is effective in vitro. A fruitful cleavage has been achieved. Kim et al., 84Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878 8,1987; Haseloff, Gerlach, 334Nature 585, 1988; Cech, 260JAMA 3030,1988; and Jefferies Et al., 17Nucleic Acids Research 1371, 1989. Ribozymes act by first binding to the target RNA. This join Retained in close proximity to the enzymatic portion of the RNA that acts to cleave the target RNA, This is done by the target RNA binding part of the ribozyme. Therefore, ribozyme It recognizes the target RNA and then binds to the target RNA by complementary base pairing, Once bound to the site, it acts enzymatically to cleave the target RNA. like this The ability to direct the synthesis of the protein it encodes by cleaving a specific target RNA Destroy. The ribozyme binds to its RNA target and cleaves it, then the RN It is possible to leave A and search for another target, and then repeatedly bind to and cleave a new target. Wear. The enzymatic properties of ribozymes can be determined by other approaches, such as antisense (in this case, nuclear Acid molecules simply bind to the nucleic acid target and block its transcription) is there. The effective concentration of ribozyme required to administer a therapeutic treatment is the antisense oligonucleotide. Because it is lower than that of Cletide. This advantage is that the ribozyme acts enzymatically It reflects what you can do. For example, one ribozyme molecule has many target RNAs It can cleave the molecule. Furthermore, ribozymes are highly specific inhibitors, and their inhibition Specificity is not only the base-pairing mechanism of binding but also the RN to which the molecule binds. It also depends on the mechanism that inhibits A expression. Ie inhibition is cleavage of RNA target Targeting RN to the rate of cleavage of non-target RNA It is defined as the ratio of the cleavage rates of A. This cleavage mechanism is involved in base pairing It depends on factors other than what you do. Therefore, the specificity of action of ribozymes is the same Thought to be larger than that of antisense oligonucleotides that bind to the A site You.Summary of the invention The present invention provides novel enzymatic RNA molecules, ribozymes, and immune systems Quarantine deficiency virus (eg HIV-1, HIV-2, and FIV-1 and S The method used to inhibit replication of related viruses, including IV-1). That Ribozymes from these related viruses in humans and other animals. It can be used in the treatment of diseases caused by The present invention also relates to ribozyme Is used to cleave the RNA of these viruses. Especially books The ribozyme molecules described herein include LTR, nef, vif, tat and r Targets ev viral genes or regions. These genes are known in the art. Is known. For example, Matsukura et al., 86Proc.Natl.Acad.Sci .USA 4244,1989, Cheng-Mayer et al., 246.Science 1629,1989 , Viscidi et al., 246Science 1606,1989, Malim et al., 86Proc .Natl.Acad.Sci.USA 8222,1989, Terwilliger et al., 88.Proc.N atl.Acad.Sci.USA 10971, 1991, and Bartel et al., 67.Cell 529,199 1, and Figures 2A and 2B. Therefore, in a first aspect, the present invention provides HIV-1 RNA, or an equivalent thereof. Etc., regions required for viral replication (eg protein synthesis), eg vif, n control ef, tat or rev gene region, or viral gene expression Known structures (eg tar, rre or 3'-LTR regions) It features an enzymatic RNA molecule (ie, a ribozyme) that specifically cleaves. "Enzymatic RNA molecule" refers to a specific gene target in the substrate binding region. An enzymatic activity that is complementary and acts to specifically cleave RNA within its target. It means an RNA molecule that also has sex. That is, an enzymatic RNA molecule is an RNA molecule Cleavage, which can inactivate the target RNA molecule. This complementarity Hive an enzymatic RNA molecule into the target RNA enough to cause cleavage. It has a function to redistribute. 100% complementarity is preferred, but 50- Complementarity as low as 75% is also useful in the present invention. HIV-1 "equivalent" RNA Is associated with immunodeficiency disease in various animals including humans, cats and monkeys It is intended to include naturally occurring RNA molecules. These viral RNAs are Similar in structure and equivalent genes such as vif, nef, tat and re It has a v gene. A "gene" is the protein coding region of a cognate mRNA, HIV. The protein synthesis or stability of the genome, provirus genome or its mRNA It is intended to represent any regulatory region in RNA that controls. In a preferred embodiment, the enzymatic RNA molecule is shaped with a hammerhead motif. Hairpin, hepatitis delta virus, group I intron, or R Even if formed with a motif of NaseP-like RNA (related to RNA guide sequence) Good. An example of such a hammerhead motif is Rossi et al. See references); examples of hairpin motifs are Hampel et al. (See references); examples of hepatitis delta virus motifs are Ta and Bean, 31Biochemistry 16,1992; RNaseP model Examples of chiefs are Guerrier-Takeda et al., 35Cell 849,1983; Gu Loop I intron is described in Cech et al., US Pat. No. 4,987,071. Have been. These specific motifs do not limit the present invention. All that matters in a mysterious enzymatic RNA molecule is that it has one or more target residues. Having a specific substrate binding site complementary to the gene RNA region, and its substrate binding A nucleotide sequence that confers RNA cleavage activity to the molecule within or around the site. It will be appreciated by those skilled in the art. In a particularly preferred embodiment, the cleaving RNA within the HIV-1 RNA is It is selected from one or two or more of the sequences shown below. The sequences are similar to those in the Los Alamos human retrovirus and the AIDS database. Obtained from the IVPCV12 sequence. The folded sequence is a 2.3 kb subgee. It starts from the first nucleotide of the nom mRNA. This area is vif, vp It contains the coding regions for the r, vpu, tat, rev and nef gene products. In a second related aspect, the invention comprises the enzymatic RNA molecule described above. Characterized by mammalian cells. Preferably, the mammalian cells are human cells, such as cells. It is a T4 lymphocyte having a CD4 receptor molecule on the surface of the cell. In a third related aspect, the present invention relates to the fermentation of the enzyme in mammalian cells, for example. The above enzymatic, located in the vector in a manner that allows expression of the elementary RNA molecule. An expression vector containing a nucleic acid encoding an RNA molecule is featured. In a fourth related aspect, the invention provides vif, nef, tat or re. Enzyme that cleaves HIV-1 RNA or related RNA in the v gene region For treating a human immunodeficiency disease by administering a therapeutic RNA molecule to a patient Features. In another related aspect, the invention relates to a ribozyme of the invention, which cat or monkey. Is treated. Those ribozymes cleave HIV-1 RNA Or within the FIV and SIV viral RNAs It may be modified to target similar locations. The present invention provides high levels of viral RNA in HIV-1 type virus-infected cells. It provides a group of chemical cleaving agents that exhibit a degree of specificity. If desired, those ribozymes Im targeting uniform single-stranded DNA by methods known in the art. Can be designed to. The ribozyme molecule is preferably HIV-1 HIV-1 is highly conserved so that all strains can be treated with a single ribozyme. Targeted sequence regions. These enzymatic RNA molecules are external to the infected cell. Alternatively, it can be delivered internally. In the preferred hammerhead motif , The molecule is small (less than 40 nucleotides, preferably 32-36 nucleotides long. Lowering the cost of treatment compared to other ribozyme motifs Can be. Smallest ribozyme reported today delivered for treatment of HIV infection Im (Rossi et al., 1992, supra) described a 142 nucleotide long in. Vitro transcript. A combination of ribozymes longer than 100 nucleotides Is extremely difficult to achieve by automated methods, and the therapeutic costs of such molecules Is remarkable. Delivery of ribozymes by expression vectors is, in principle, ex vivo. It is possible only by treatment. This limits the usefulness of this method. The present invention In small ribozyme motifs (such as the hammer generally shown in Figure 1). Head structure) and another method using external delivery. Of these molecules The simple structure also reflects the ability of the ribozyme to enter the target region of the mRNA structure. Increase power. Therefore, in situations where the hammerhead structure is contained in a longer transfer, In contrast, proper folding of the ribozyme structure or ribozyme structure into the mRNA target region There are no non-ribozyme-flanking sequences that interfere with the complementary binding of the enzyme. The enzymatic RNA molecule of the present invention is attracted by both HIV-1 and HIV-2. Can be used to treat human immunodeficiency virus infections, including those caused You. Those treatments include the treatment of non-human spirits, including monkey and feline immunodeficiency virus. It can be extended to other related viruses that infect long-tailed animals. Proliferate infected animals Can be treated at the time of infection. The timing of this treatment is in infected cells Reduce the viral load and in any subsequent round of productive infection. Disables virus replication. This is possible due to the opening of viral protein synthesis. These ribozymes disable the structures required for successful initiation. The target selected in the present invention has advantages over conventional targets. This is the And act at the time of virus adsorption or reverse transcription as well as potentially infected cells. And also acts on cells transformed by the virus. Further Virus released in the first round of infection in the presence of those ribozymes Spar particles will still be immunogenic because their capsids are intact. Follow According to one method of the present invention, defective but immunogenic viral particles are identified. Form and thus maintain the potential to mount an immune response in the treated animal. Wear. Furthermore, the enzymatic RNA molecules of the invention are sensitive to HIV-1 or related viruses. Use of dyed cell cultures in vitro to reveal intact capsids and defects Viral particles with genomic RNA can be produced. Then these grains Using the offspring to prophylactically trigger an immune response or to treat infected animals Can be. The present invention also provides a defective HIV-1 virus (or Are associated particles), and these defective particles, For example, a DNA encoding the ribozyme of the present invention under the control of a suitable promoter. Or a method of immunizing or vaccination with a vector containing You.Diagnostic use The ribozyme of the present invention is used to induce genetic drift and viral abruption in diseased cells. It can be used as a diagnostic tool for investigating mutations. Ribozyme activity and target RNA Because of its close relationship with the structure of the target R Mutations that alter the base pairing and three-dimensional structure of NA can be detected . The use of the multiple ribozymes described in this invention allows for the structure and function of RNA. Important nucleotide changes in vitro and in cells and tissues Can be mapped. Using the cleavage of target RNA by ribozyme Inhibits gene expression and plays (essentially) the role of specific gene products in disease progression You can judge. In this way, other gene targets are identified as important mediators of the disease. May be judged. These experiments show that combination therapies (eg, different genes Targeted multiple ribozymes, ribozymes linked to known small molecule inhibitors Or ribozyme and / or other chemical or biological molecules Better treatment of disease progression by presenting the possibility of Will bring. Other in vitro uses of the ribozymes of the invention are It is well known in the art that the presence of mRNA associated with HIV-1 related states Includes detection. These RNAs are cleaved after treatment with ribozymes. The presence of the thing is detected by determining using standard methods. In certain instances, only cleaves wild-type HIV or mutant forms of target RNA Possible ribozymes are used in the assay. Wild in the sample using the first ribozyme Mutated RNA in a sample using a second ribozyme to identify the presence of RNA Identify the presence of. As a reaction control, both wild-type and mutant RNA were combined. Relative potency of ribozymes in the reaction by cleaving the substrate with both ribozymes And can be shown to not cleave "non-target" RNA species. Synthetic substrate The cleavage products were also analyzed for wild-type and mutant RNA in the sample population. Generate a size marker for That is, each analysis involves two ribozymes. Im, 2 substrates and 1 unknown sample, 6 combined And the reaction. The presence of the cleavage product was determined using an RNAse protection assay, The full-length and cleaved fragments of each RNA were analyzed on a polyacrylamide gel. It can be analyzed in one lane. Generation of mutant RNA in target cells To gain knowledge about the estimated risk of current and desired phenotypic changes, It is not always necessary to quantify the results. The protein product is expressed Expression of mRNAs involved in the development of HIV) is not appropriate for establishing risk. is there. Using probes with equivalent specific activity for both transcripts, RNA A qualitative comparison of levels would be appropriate and would reduce the cost of initial diagnosis. RNA Mutant versus wild type, whether comparing levels qualitatively or quantitatively A higher ratio of will correlate with a higher risk. Other features and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments and from the claims. It will be clear from the range.Description of preferred embodiments First, the drawings will be briefly described.Drawing FIG. 1 is a diagram showing a hammerhead motif ribozyme. -1 Stems I, II and III interacting with the target region ((I) and (II) respectively) And labeled with (III)). 5'of both ribozyme and target And 3'end. Dashes indicate base paired nucleotides. 2A and 2B show various genes and genes of HIV-1 and HIV-2. 3 illustrates a child area. 3A-3C are diagrams illustrating three types of ribozymes of the present invention. 4A-4G are schematic representations of chemically modified ribozymes of the invention. (Black circles indicate modified bases). Specifically, FIG. 4A shows unmodified HCH-r37. 4B is a thio-substituted HCH-r37S2, and FIG. 4C is a thio-substituted HCH-r37S2. r37S4 and Figures 4D-G are thio-substituted HCH-s37A-D. FIG. 5 illustrates a chemically modified ribozyme of the present invention (circled). The bases are modified with 2'-O-methyl), specifically ribozyme is 2'- It is O-methyl HCH-037A. 6a-f show cytoplasmic, membrane and nuclei of Vero and HeLa cells. 1 is a diagram showing the stability of ribozymes in extracts. 7, 8 and 9 show various hammerhead ribozymes with their activity and It is shown together with the resistance to lyase. FIG. 10 illustrates the activity of various ribozymes targeting the LTR. . FIG. 11 illustrates the activity of ribozymes with various arm lengths. FIG. 12 illustrates ribozymes with different sugar modifications. FIG. 13 illustrates the activity of various ribozymes targeting TAT. . FIG. 14 shows the hammerhead ribozyme by base number. . Each N and N'may be the same or different. FIG. 15 shows two hairpin ribozymes having activity against HIV RNA. It is the one illustrated.Target site The HIV-1 genome, due to its RNA-containing and reverse transcription error nature, Receive a sudden genetic drift. However, regions of the genome that are essential for viral replication ( Gene) is expected to maintain (ie, preserve) the constant sequence for an extended period of time Is done. These regions are relatively conserved among immunodeficiency viruses of different types or strains. A single ribozyme to destroy all of these viruses. These regions are preferred targets in the present invention, since only the It is a part. Thus, using one type of ribozyme, all HIV-1 Targets Rus and all HIV-2, SIV and FIV viruses be able to. We chose several such genes for HIV-1 and Cleave their nucleotide sequence by ribozymes targeting these regions The existence of a storage area was investigated. Detailed analysis of two genes, vif and nef The tat, rev and other genes mentioned above are also similar to those described below. It can be analyzed by the method of. The nucleotide sequence is Los Alamos HIV Obtained from the gene bank. Ribozymes targeting selected regions of the HIV genome block RNA translation. One chooses to cleave the target RNA in a damaging manner. Inhibition of translation depends on protein Genes are selected to inhibit viral replication by inhibiting growth. HI The selection of effective target sites within these critical regions of V-1 RNA depends on its target R For hybridization of NA with various oligonucleotide probes This is done by testing accessibility. These tests are based on RNA probe Access by cleaving the hybrid molecule with RNase H This can be done by assaying for feasibility (see below). There For this test, a ribozyme probe designed from the prediction of RNA secondary structure was used. The cleaved product is used for analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). However, the presence of cleaved and uncleaved molecules can be detected. The following are examples of methods by which suitable target sites may be identified and are not limiting of the invention. There is no. In general, these methods are potentially open to hammerhead ribozymes. By identifying the cleavage site and then ensuring that the formation of secondary structure is minimized. For each of these sites, tests were conducted to determine their suitability as targets. Including The HIV-1 genomic sequence of the Los Alamos Databank was cloned into vif and ne. A comparison was made in the region encoding the f gene. 15 putative ribozyme cleavage sites Positions were found to be highly conserved among the 11 viral sequences. this These sites are favorable for hammerhead ribozyme cleavage within these two target RNAs. It is a good part. Two of the nef gene sites are 3'-of the HIV-1 genome. It overlaps with a region within the LTR, which is another target of potential therapeutic value. You. The nef target is present in all known HIV-1 mRNAs and A 3'-end regulatory region of mRNA that seems to be required for effective translation or export of A It can be the target of cleavage that destroys the zone. Similarly, a large number of vif target sites It is present in pol, tat and vpr mRNA (see Figure 2). A short RNA substrate was designed corresponding to each site of the vif and nef genes. each The substrate is at the 5'and 3'ends that do not base pair with the corresponding ribozyme recognition region. It was composed of 2-3 nucleotides. These unpaired regions are 12- Flanking the central region of 14 nucleotides to allow complementary arms in the ribozyme Designed for this. The structure of each substrate sequence is a standard commercial PC fold computer program. It was estimated using The sequences that gave rise to the positive free energy of binding were accepted. Negative Sequences that generate free energy are trimmed by 1 or 2 bases from each end. It was modified by It is expected that the modified sequence will still have a strong secondary structure. If you eliminated them. After selecting the substrate, ribozymes were designed for each RNA substrate. Re Folding of the Bozyme was also analyzed by PC fold. It forms the stem II region of the hammerhead motif (see Fig. 1) and has an inner salt. We searched for ribozyme molecules containing flanking arms that avoid grouping. Revolving Zym is often also found by trimming bases from the ribozyme end, By introducing additional base pairs into stem II to achieve the desired fold. Modified. Ribozymes with improper folding were excluded. Substrate / ribozai After finding that the pair of molecules contains the proper intramolecular structure, fold them together. Folded to predict intermolecular interactions. Coordination of ribozyme and its cognate target sequence ( A schematic diagram of base pairing is shown in FIG. Based on computer-generated sequence comparisons using such analysis, H Estimation of the valid target sites in the vif and nef genes of the IV genome as follows: Was obtained (see Table 1). The target sequence is first 5'most for reference. The nucleotide numbers of are shown. Bases in parentheses are alternatives in the conservation pattern. It is an alternative base. The target considered to be useful as a ribozyme target was ribonuclease H Accessibility of nucleic acid probes by assay method (see below) Can be tested. This assay is a standard assay that does not require the synthesis of ribozymes. The use of the target site can be tested quickly. Ribozyme attack using it The optimal site for can be screened.Ribozyme synthesis Ribozymes useful in the present invention are compatible with the gene transcription method described by Cech (supra). Or by chemical synthetic methods. Chemical synthesis of RNA is D Similar to the case of NA synthesis. However, the additional 2'-OH group in RNA is 3'-5 'Ease of RNA degradation in the formation of internucleotide bonds and in the presence of bases To deal with different protective group measures are needed. Recently developed 2'-hi RNA synthesis method using t-butyldimethylsilyl group for protection of droxyl group Is the most reliable method for the synthesis of ribozymes. According to this method , RNA with proper 3'-5 'internucleotide linkages has an average coupling yield Reproducible above 99%, requiring two-step deprotection of the polymer I'm sorry. Methods based on H-phosphonate chemistry are methods based on phosphoramidite chemistry It exhibits a relatively lower coupling efficiency. This is also a problem with DNA synthesis is there. A promising method for scale-up of automated oligonucleotide synthesis is H. -Recently reported on phosphonates. Appropriate coupling time and "defect (fa 2 in the coupling step, in combination with additional capping of Oligomers on a scale in the range of 14 μmole using a small amount of equivalent monomer High yields were obtained in the synthesis of nucleotides. Another alternative is the usual solid support. Use soluble polymeric support (eg polyethylene glycol) instead of carrier Things. According to this method, about 3 equivalents of monomer are used in the coupling step. Thus, short oligonucleotides on the order of 100 mg per batch are obtained. Various modifications to the ribozyme structure have been made to enhance the utility of the ribozyme. I can. Such modifications have shelf life, in vitro half-life, and Qualitatively and enhances the ease of introduction of these ribozymes into target sites (eg (To enhance cell membrane penetration), and also the ability to recognize and bind to target cells I do. External delivery of ribozymes is accomplished by chemical modification of the backbone, for example ribozyme molecules. The overall negative charge of the Be profitable. The measures of the present invention for reducing the charge of an oligonucleotide include: Include: modification of internucleotide linkages with methylphosphonate, phosphine Use of foramidites, coupling of oligonucleotides to positively charged molecules, And oligonucleotides, lipids and specific receptors for target cells or Forming a complex package consisting of effectors. Of these modifiers Examples include phosphorothioates and phosphos as internucleotide linkages in RNA. Included are sulfur-containing ribozymes that include rodithioate. Such sulfur modification Ribozymes are synthesized by sulfur transfer reagents,^ThreeH-1,2-benzenedithiol-3 Achieved with -one 1,1-dioxide. Ribozymes are ribose modified Ribonucleotides may also be included. Pyrimidine analog starting from uridine Prepared by a method that uses diethylaminosulfur trifluoride (DAST) as the quality Is done. Ribozymes electrostatically or to polymer cations to reduce the charge. Alternatively, it may be attached by a covalent bond. This polymer has a ribonucleoside at the 3'end. It can be bound to a ribozyme simply by converting it to sidedialdehyde. The Aldehydes can be prepared by periodic acid cleavage of the terminal 2 ', 3'-cisdiol system. can get. Other possible modifications depending on the individual requirements for the delivery system include carboxy. , Different linker arms containing amino, or thiol functional groups are included. further Other examples include methylphosphonate and 2'-O-methylribose, and m₇ GppppG or m_Three ^2.2.75'or 3'capping with GppppG or Includes blocking. For example, a kinased ribozyme can be treated with guanosine triphosphate and Contact with anyltransferase m_ThreeAdd G cap to ribozyme . After this synthesis, the ribozyme can be gel purified by standard methods. Revolving Including a 5'cap to confirm that the Zym has the desired activity. Yo And its stability are tested by standard methods to determine its enzymatic activity and its stability. Both can be assayed. Synthetic ribozymes, including those with various modifications, are It can be purified by HPLC (HPLC). Reversed phase on silica and polymer supports Other liquid chromatography techniques using columns and anion exchangers were also adopted. sell. The following is an example of the synthesis of one ribozyme. Solid-phase phosphoramidite chemistry Using. The monomers used were uridine, N-benzoyl-cytosine, N-pheno 2'-tert-Butyl-diene of xyacetyl adenosine and guanosine Methylsilyl cyanoethyl phosphoramidite (Glen Research, Sterling, V It was A). Solid phase synthesis is performed on an ABI394 or 380B DNA / RNA synthesizer, respectively. It was carried out using the standard protocol provided for these instruments. The only exception is The coupling step was increased from 10 minutes to 12 minutes. Phosphoramida The concentration of ito was 0.1M. For synthesis, use 1 μmol RNA reaction column (Glen R esearch) on a 1 μmol scale. The average coupling efficiency is For Model 394, as determined by calorimetry of the released trityl cation Between 97% and 98% and for the Model 380B between 97% and 99% It was between. After synthesis, the protected ribozyme is cleaved from the solid support (eg CPG), In a sterile vial in dry ethanolic ammonia (2 mL) at 55 ° C. The base and diphosphoester moieties are removed by incubating for 16 hours. Protected. The reaction mixture was cooled on dry ice. The cold liquid is then sterile filtered. Transferred into a vial with a Lew cap and lyophilized. To remove the 2'-tert-butyl-dimethylsilyl group from the ribozyme, The residue obtained is treated with 1M tetra-n-butyl fluoride in dry THF (TBAF). For the ammonium, using a 20-fold excess of reagent for each silyl group, room temperature (about 15- Suspended at 25 ° C for 16 hours. Equal volume of sterile 1M triethylamine acetate, The reaction was stopped by adding pH 6.5. Cool sample, SpeedV Concentrated to half the original volume with ac. The ribozyme was loaded onto the C4 300Å 5 μm DeltaPak column. Purified in two steps by HPLC with nitrile gradient. In the first step, the "trityl-on" step, the 5'-DMT-protected ribozyme Was separated from the rejected sequences lacking the 5'-DMT group. Used in this process The solvents were A (0.1 M triethylammonium acetate, pH 6.8) and B (acetic acid). (Cetonitrile). The elution profile is 20% B-10 min, then 2 Linear gradient from 0% B to 50% B-50 minutes, 50% B-10 minutes, 50% B to 100% B linear gradient-10 minutes, and 100% B to 0% B linear gradient-1. It was 0 minutes. In the second step, it was completely deprotected by treatment with 2% trifluoroacetic acid. Ribozyme on the C4 300Å 5 μm DeltaPak column. Purify using a nitrile gradient. The solvent used in this second step was A (0.1M vinegar). Triethylammonium acid, pH 6.8) and B (80% acetonitrile, 0 . 1M triethylammonium acetate, pH 6.8). Elution profile Is 5% B-5 min, 5% B to 15% B linear gradient-60 min, 15% B-1 There was 0 minutes and a linear gradient from 15% B to 0% B-10 minutes. Fractions containing ribozyme in the form of triethylammonium salt are cooled and Lyophilized in Vac. Dissolve the solid residue in the minimum amount of ethanol and dissolve in acetone. Precipitation of ribozyme in the form of its sodium salt by adding sodium perchlorate I let it. (K by the same method⁺Or Mg²⁺Can generate salt). Distant Ribozymes were collected by cardiac separation, washed 3 times with acetone and lyophilized.Expression vector Synthetic ribozymes are preferred in the present invention, but are produced by an expression vector. It can also be used. When designing an appropriate ribozyme expression vector, It is important to consider the factors. The final ribozyme is the It should be kept as small as possible to minimize secondary structure. A relatively strong promoter and in vitro and in vivo A promoter that is expressible by both (eg, human cytomegalovirus immediate The type region (HCMV ie1) promoter should be chosen. Such promo Suitable for producing sufficient ribozyme to destroy the target RNA Level, but not too high (inhibition of cell The ribozyme should be expressed (unless it is intended to kill itself). The hairpin at the 5'end of the ribozyme contains the required transcription initiation sequence (GG or GGG or GGGAG) does not bind to other parts of the ribozyme and thus transcription It is useful to ensure that it does not affect the control of the process. 5'hairpin hama Useful for protecting ribozymes from 5'-3 'exonucleases . The selected hairpin at the 3'end of the ribozyme gene serves as a transcription termination signal. Useful for acting and protecting from 3'-5 'exonuclease activity It is. An example of a known termination signal is present in the T7 RNA polymerase system Things. This signal is approximately 30 nucleotides in length. Shorter length Other 3'hairpins should also be used to confer good termination and RNA stability. Can be. These hairpins place standard ribozymes in the proper orientation, and Insert into a vector sequence that can express these sequences in a linked state be able to. Poly (A) tails are also useful for protecting the 3'end of ribozymes. this Have included a poly (A) signal site in an expression vector (in vivo Signal to the cell to add a poly (A) tail) or poly (A) tail. Obtained by introducing the array directly into the expression vector. In the first method , Signals prevent the formation of undesired secondary structures with other parts of the ribozyme. You must be in a stopping position. In the second method, poly (A) stretch Size may decrease over time when expressed in vivo Therefore, it may be necessary to inspect the vector over time. Ribozymes are them To bind a poly (A) -binding protein that blocks its action on the target sequence of A) Care should be taken regarding the addition of tails.Ribozyme testing Once the ribozymes of interest have been selected, synthesized, and purified, they are kinetic and Test in trials to determine their usefulness. An example of this method is presented below You. Preparation of ribozyme Crude synthetic ribozyme (typically 350 μg at a time) modified with 15% polyacrylic Separation on amide gel (thickness 0.75mm, length 40cm), UV shadow in Visualize with a group. Cut the gel containing the full-length ribozyme and cut the gel slice into 5 pieces. ml of gel elution buffer (0.5M NH_FourOAc, 1 mM EDTA) overnight Immerse at 4 ° C. with stirring. Elute the C-18 matrix (Sep-Pa Desalination and vacuum on a K cartridge, Millipore, Milford, Mass. dry. 50-100 μl of dried RNA was added to TE (Tris 10 mM, ED Resuspend in 1 mM TA, pH 7.2). Aliquot this solution into 1 ml of T Dilute 100 times in E and use half of it to spectrophotometrically analyze the ribozyme solution. Quantify. The concentration of this diluted stock solution is generally 150-800 nM. Modified Poria Confirmation of ribozyme purity by the presence of a single band on the crylamide gel Is done. It may be advantageous to synthesize the ribozyme in two or more parts. Ribozyme Each part of the enzyme has very limited enzymatic activity or no When ligated (or otherwise juxtaposed), the activity is substantially (at least 5-10 times higher). Specific examples of hammerhead ribozyme synthesis are shown below. The method synthesizes two (or more) relatively short “half” ribozymes, Ligating them together with T4 RNA ligase. Tato For example, to make a 34-mer ribozyme, two 17-mers are synthesized and One is phosphorylated and both are gel purified. Then these purified 17m er to the DNA splint strand complementary to the two 17mers I do. This DNA splint consists of two 17mers with one end next to each other. It has an array designed to be placed in contact. RNA then juxtaposed Molecules are treated with T4 RNA ligase in the presence of ATP. Or complementary If the binding affects the preferred ligation of two RNA molecules, a DNA splice The lint strand can be omitted from the ligation reaction. Then formed in this way The 34mer RNA is HPLC purified. Preparation of substrate Approximately 10-30 pmole of crude substrate was added to 25 pmole of [γ-³²P] AT 5'end-radiolabeled with T4 polynucleotide kinase using P. Mark The entire mixture was separated on a 20% denaturing polyacrylamide gel and autoradiographed. Visualize with Raffy. Cut out the full length band and remove 100 μl TE (10 m Soak overnight in M Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 mM EDTA) at 4 ° C. You. Kinetic reaction For reactions with short substrates (8-16 bases) assay buffer (75 m M Tris-HCl, pH 7.6; 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂ In 1), the substrate solution is prepared at 1 × so that the substrate concentration is less than 1 nM. Riboza Immunization solution (typically 20 nM) was prepared 1 × in assay buffer and 1 × Four dilutions are prepared using assay buffer. Each ribozyme dilution (SUN 15 μl (20, 16, 12, 8 and 4 nM) are placed in separate tubes. Pre-incubate these tubes and substrate tubes at 37 ° C for at least 5 minutes. To Mix 15 μl of substrate into ribozyme tube by rapid pipetting. The reaction is started by and (the final ribozyme concentration is 10, 8, 6, 4, 2 nM Please note that). Remove 5 μl aliquots at 15 or 30 second intervals, 5 μl of stop solution (95% formamide, 20 mM EDTA, xylene cyano And bromphenol blue dye). Remaining at the time of final ribozyme Aliquots of each substrate are removed as a zero ribozyme control. These samples are separated on a 15% or 20% polyacrylamide gel. each Visualize the gel and use the Ambis Beta Scanner (Ambis System Muzu, Sai Diego, CA). K for most active ribozymes_mAnd K_catKinetic to measure value The analysis is performed in substrate excess. For kinetic reactions using long RNA substrates (more than 15 bases in length) , T7 RNA polymerase, and T7 promoter, and HIV-1 Uses a specific template containing DNA encoding the appropriate nucleotides for RNA A substrate is prepared by transcription. The substrate solution is the assay buffer (75 mM Tri Su-HCl, pH 7.6; 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂)inside Prepared 1 × and contains a 58 nM concentration of long RNA molecules. Gel purified ribozyme The reaction is started by adding the glucose to a concentration of 1 μM. Aliquot Were removed at 20, 40, 60, 80 and 100 minutes and then 5 μl of stop was added. Stop by adding stop solution. Cleavage products are separated by denaturing PAGE. band Is visualized and quantified with an Ambis beta scanner. Kinetic analysis The simple reaction mechanism for ribozyme-mediated cleavage is: [Wherein R = ribozyme, S = substrate, and P = product]. In a square The boxed steps are important only in the case of substrate excess. Ribozyme concentration is higher than substrate concentration Since it is in excess, the concentration of ribozyme-substrate complex ([R: S]) is It is constant over time, except for the very short period when the plexes first form. sand Wachi: (Where t = time), and thus: (R) (S) k₁ = (RS) (k₂+ K₁) It is. The reaction rate is the rate at which the substrate disappears over time: Substituting these expressions: Or: Becomes Integrating this equation for time yields: And here, S₀= Initial substrate. Therefore, the negative logarithm of the uncleaved substrate fraction is Plotting against (minutes) gives a straight line with the following slope: Where k_obs= Measured rate constant. Gradient (k_obs) To the ribozyme concentration And plot it to get a straight line with the following slope: Using these equations, we can calculate which data from the data obtained from the kinetic experiments. Required to determine if the test ribozyme is most useful, ie active Information can be obtained. Select these ribozymes and select in vivo or ex It can be tested in a vivo system.Preparation of liposomes Volatile organic solvent (CHCl)_Three, Methanol, diethyl ether, Tanol). The organic solvent was removed by evaporation. 0.1% of this lipid X Hydrate suspended in phosphate buffered saline (PBS) and then 3 using liquid nitrogen Freeze-thaw once and incubate at room temperature. Sequentially 0.4 μm, 0.2 800 psi maximum pressure from μm and 0.1 μm polycarbonate filters (Approximately 56.2 kg / cm²). Extruded liposome suspension and riboza Im was mixed and lyophilized. Add this lipid / ribozyme powder to 1 / of the original volume with water. Rehydrated to 10. The minimum volume required to extrude the suspension (for a 1.5 ml barrel 0.4 ml, 1.5 ml for a 10 ml barrel) with 1 × PBS. From 0.4μm, 0.2μm, 0.1μm polycarbonate filter Extruded again. The ribozyme trapped in the liposomes is not captured by the ribozyme. Gel filtration chromatography (Sepharose CL-4B, Bioge (A5M). Pool the liposome extracts and fill with 0.2 μm It was sterilized by filtration through a filter. Free ribozyme is pooled and ethanol precipitated. Collected by Tono. Liposome concentration was measured by radioactive lipid uptake. The ribozyme concentration is³²It was measured by labeling with P. Rossi et al., 1 To prepare liposomes in 992 (supra) (and references cited therein). Other methods are described. Synthetic lipid derivative, distearoylphosphatidylethylamide thioacetyls Cusinimide (DSPE-ATS) was added to dipalmitoylphosphatidylcholine and In an experiment using a liposomal formulation consisting of a mixture of cholesterol and cholesterol Therefore, the present inventors have found that the uptake of liposomes with a diameter of 100-200 nm is similar to Observation was made in a theoretical state. Larger particles have more capture molecules, or A small amount of the molecule, for example an expression plasmid, was housed. These particles were supplied Mean logarithm of lipid dose and fluorescence (calcein to track liposome uptake Was used). Even with a 200 μM dose, there is no cytotoxicity Not observed. These liposomes are particularly useful for delivery to CD4 cell populations is there. in vivo assay The efficacy of action of selected ribozymes was tested in vivo by HIV-1 or Tested by standard methods using cell cultures that are sensitive to the sell. For example, monolayer cultures of HIV sensitive cells are grown in established ways . Cells are grown in 6 or 96 well tissue culture plates. Infected with HIV Cultures are treated with ribozyme-containing liposomes for 3-24 hours prior to being allowed to proceed. Next Rinse cells with phosphate-buffered saline (PBS) and wash with virus 1-100. Add at a multiplicity of pfu / cell. After adsorbing for 1 hour, release the free virus into PB Rinse with S and treat cells for 3-5 days with appropriate liposome preparation. Next Re-feed cells with fresh medium and incubate again. Virus from cells Collected in the upper medium. Cells at -70 ° C and 37 ° C for 30 minutes at each temperature Disrupted by 3 cycles of incubation between Viral titers are measured by the Lark assay.Ribonuclease protection assay Intracellular accumulation of target mRNA or ribozyme or RNaseH Cleavage of RNA (in vitro or in vivo) by It can be quantified using a protective assay. In this method, T7 RNA polymerase (U.S. Biochemical) was used. , 1x transfer buffer (supplied by manufacturer), 0.2 mM ATP, GTP And UTP, IU / μl pancreatic RNase inhibitor (Boehringer Mannheim Biochemi cals) and 200 μCi³²P-labeled CTP (800 Ci / mmol, New Engl and nuclear) in 20 μl of reaction solution at 37 ° C. for 1 hour , Transcribe an antisense riboprobe from the template DNA. 1 U of target DNA RNase-free DNasel (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) at 37 ℃ Digestion for 15 minutes and remove unincorporated nucleotides from G-50 Sephadde. Cousin spin chromatography. Target using the appropriate DNA template in a similar manner to the transcription of antisense probes. RNA can be transcribed in vitro. Transfer the transcript by standard methods Purify and digest with ribozyme at 37 ° C according to the method described below. You. Alternatively, collect virus-infected cells in 1 ml of PBS and Transfer to a Pendorf (EPPENDORF) tube and place in a microcentrifuge. Centrifuge at low speed for 30 seconds to pellet, 70 μl hybridization. Buffer (4M guanidine isothiocyanate, 0.1% sarcodyl, 25m Dissolve in M sodium citrate, pH 7.5). Next, cell lysate (45 μl) or a defined amount of in vitro transcript (also hybridisation Buffer solution) in a 0.5 ml Eppendorf tube.^Fivecp m of each antisense lipoprobe containing 5 μl of hybridization By adding 25 μl of mineral oil and heating at 55 ° C. overnight. Hybridize. Hybridization reaction with 0.5 ml R Nase solution (20 U / ml RNase A in 0.4 M NaCl) 2 U / m l RNase T1, 10 U / ml RNase-free DNase I) diluted in And heat at 37 ° C. for 30 minutes, 10 μl 20% SDS and 10 μl protein. Inase K (10 mg / ml) was added, followed by a further 30 minutes at 37 ° C. Incubate. The hybrid is 0.5 ml phenol / chloroform 1 Partially purified by extraction with a mixture of 1: 1 and the aqueous phase with 0.5 ml of isopropanol. And centrifuge for 10 minutes at room temperature (about 20 ℃) in a microcentrifuge. And pellet the RNase resistant hybrid. Add 10 μl pellet to Buffering solution (95% formamide, 1 × TBE, 0.1% bromophenol) Red blue, 0.1% xylene cyanol), heat at 95 ° C for 5 minutes, and ice Cool on top and analyze on a 4% polyacrylamide / 7M urea gel under denaturing conditions. Ribozyme stability The selected ribozymes were tested for their stability and therefore their potential utility. You can test. Such tests are performed with various chemical modifications (eg poly (A)). Can also be used to investigate the effect of tail addition) on ribozyme stability. And thus aid in the selection of more stable ribozymes. For example reaction mix The product is 1-5 pmole of 5 '(kinase treated) and / or 3'-labeled ribozyme. Im, 15 μg cytosolic extract, and 2.5 mM MgCl₂The total capacity 1 Contained in 00 μl. The reaction is incubated at 37 ° C. 8 μl Alicho Was removed periodically and 8 μl of stop mixture (20 mM EDTA, 95% Formamide). Sample on a 15% acrylamide sequence gel Separated, exposed to film and scanned with Ambis. The 3'labeled ribozyme is³²P-labeled cordycepin was labeled with poly (A) polymerase. It can be formed by incorporating it into 3'OH. For example, poly (A) polymer The enzyme reaction was 40 mM Tris, pH 8, 10 mM MgCl 2.₂, 250 mM NaCl, 2.5 mM MnCl₂3 μl³²P Cordycepin, 500 Ci / MM; and 6 units of poly (A) polymerase in a total volume of 50 μl . The reaction mixture is incubated at 37 ° C for 30 minutes.Effect of liposome surface modification on lymphocyte and macrophage uptake Contains distearoylphosphatidylethanolamide methylthioacetate Liposomes can be prepared. The thiol group can be converted using hydroxylamine. Deprotection, and then modifying the reactive thiol with a thiol-reactive group, the liposome surface The surface characteristics can be changed. Reaction with N-ethylmaleimide And cause macrophage uptake. With this modification, CD4^-and CD4⁺Liposomes are taken up by lymphocytes. Modifications with iodoacetamide and iodoacetic acid tested for uptake did. Iodoacetamide modification reduces the number of lymphocytes over time It has been shown that the membrane is toxic. However, acetate uptake is succinimide 5 times more than that observed for. Ingest is^ThreeH-hexadecylco Lesterol ether and calcein, a trapped water-soluble fluorophore Was monitored by both uptakes of In both cases, liposomes were It was confirmed that it was taken up by the cells. Uptake is 72 with phytohemagglutinin Assayed in time-stimulated lymphoblasts. The uptake curve has two phases, first Only cell surface binding was observed during the 8 hour period of Inclusion was linear up to 72 hours. This was observed at the 200 μM dose. 10 The 0 μM lipid dose showed only cell surface binding. Effect of base substitution on ribozyme activity Determine which primary structural features alter ribozyme-induced substrate cleavage In order to maintain the base in the substrate cleavage region recognized by the specific ribozyme. Can be changed. For example, a "C" nucleotide centered on the substrate sequence To change the cleavage site from GUC to GUA motif. it can. Then K for cleavage with each substrate_cat/ K_mAnalyze the value and change It is determined whether oxidization enhances the rate of ribozyme cleavage. Pair with the ribozyme binding arm Similar experiments can be performed to address the effects of changing complementary bases by You. Changes expected to maintain tight binding to complementary substrates are preferred . It seems that slight changes in nucleotide content cannot be predicted based on binding strength alone. The formula may alter the ribozyme / substrate interaction. Ribozyme catalyst The structure of the core region is the structure of the substrate or the tertiary of the ribozyme / substrate complex. Recognize slight changes in the original structure. To start the optimal ribozyme design, we have different arm lengths but the same length Ribozyme cleavage rates targeting short RNA substrates can be investigated. Minimal arm length is required and effective cleavage depends on the ribozyme / substrate combination Depending on. The cleavage activity of selected ribozymes can be assessed using an HIV-1 homologous substrate. Can be. The assay was performed in excess of ribozyme, giving a rough K_cat/ K_minvalue Is obtained. Comparing the numbers obtained with short or long substrates, The utility of ribozymes in vivo is shown. Intracellular stability of liposome-delivered ribozyme To test the in vivo stability of selected ribozymes, the following tests Is useful. Ribozyme³²P-terminal labeled, captured in liposomes, HIV- Deliver to 1 sensitive cells for 3 hours. The cells are fractionated and the ribozyme is phenol / black Purify by Loform extraction. Alternatively, cells (1 x 10⁷, T-175 Frass Co) is scraped from the surface of the flask and washed twice with cold PBS. 4m cells 1 TES (10 mM Tris, pH 7.4, 0.25 M sucrose, mM EDTA ) Homogenize by douncing 35 times . Pellet the nuclei at 100 xg for 10 minutes. Subcellular organelle (membrane fraction) SW6 Pellet with a 0 rotor at 200,000 xg for 2 hours. 1m pellet Resuspend in 1 H buffer (0.25 M sucrose, 50 mM HEPES, pH 7.4). It becomes cloudy. The supernatant contains the cytoplasmic fraction (in approx. 3.7 ml). Nuclear pellet to T M (50 mM Tris, pH 7.4, 2.5 mM MgCl₂) In 65% sucrose 1 resuspend in ml, step gradient of sucrose (1 ml of nuclei in 65% sucrose TM, 1 ml 60% sucrose TM, 1 ml 55% sucrose TM, 50% sucrose TM, 300 μl of 2 5% sucrose TM) on SW60 rotor at 37,000 xg for 1 hour in band form Complete Collect nuclear band and dilute with TM buffer to 10% sucrose . Pellet the nuclei in a SW60 rotor at 37,000 xg for 15 minutes and pellet. Resuspend the pellet in 1 ml of TM buffer. Aliquot denatured polyacrylamide Size-fractionate on gel and measure intracellular localization. Of the newly synthesized ribozyme Different fractions containing intact ribozymes were measured by comparing mobilities. Can be To study modifications that increase the half-life of ribozyme molecules within cells, we will move up the cells. It is known that the purity of each fraction exists in that fraction. It can be evaluated by assaying the enzyme activity. Various cell fractions were frozen at -70 ° C and the relative number of modified ribozyme molecules increased. It is used to judge the resistance to creatase. The ribozyme molecule is 5 phosphorothioate (p 2'-O-methyl (2'-OMe) modification by s) or at each end of the molecule. It can be synthesized by decoration. These molecules and phosphodiester type ribo Zym by T4 polynucleotide kinase³²End labeled with P and ATP You. Add equal concentration to cytosolic extract and take aliquots of each at 10 minute intervals I do. Samples were size-fractionated by denaturing PAGE to determine relative nuclease resistance. Analyze by scanning the gel on an Ambis beta scanner . The results indicate whether the ribozyme was digested with the cytoplasmic extract, and eventually Indicates that the type is relatively nuclease resistant. When using a short RNA substrate , Modified ribozymes generally retain 80-90% of the catalytic activity of natural ribozymes I do. Use unlabeled, 5'end labeled, or 3'end labeled ribozymes in the assay You. These experiments can be performed using human cell extracts to verify the findings. Can also be. HeLa (CD4⁺) And Vero cells are antiviral in preclinical studies. Used by many researchers to screen chemicals. Re Bozyme and antisense DNA maintain therapeutic levels in infected cells. In turn, it depends on their nuclease resistance. Ribozyme nuclease stability From various types of cells to the nucleus, cytoplasm to design chemical modifications that increase And membrane lysates were prepared and the relative specific activities of the nuclease populations in these fractions (Nuclease unit / mg protein) and optimal cation (Mg⁺²-, Mn⁺²−, Ca⁺²-Or Zn⁺²-Activation) was compared. Nuclease activity examined cell fraction Significantly different between the minutes (Tables 2 and 3 and Figures 6a-f; by standard methodology). , ++ shows high nuclease activity, and ++ and + are lower levels. Bell, and-indicates no nuclease activity) in HeLa cells. Resident nuclease populations were observed in both monocyte and lymphocyte preparations Was not the same as the one shown in Table 4, where the standard units are for comparison only. It is shown and does not reflect a particular level of nuclease activity). HeLa nuclease was added Zn⁺²Had maximum activity in the presence of However, in monocytes and lymphocyte lysates, the added cations had nuclease activity. Did not increase. Relative levels of nucleases in monocyte and lymphocyte lysates Bells are 2.2-fold and 4-fold higher, respectively, than in activated HeLa lysates won. Various chemical modifications to ribozymes are used to increase nuclease activity, but The ability of Zyme to retain catalytic activity was tested. Figure 7 shows the selected rebosai The effect of various modifications on the catalytic activity of the membrane is shown. Modifications that reduced activity (131 5, 1371 and 1285) were not analyzed further. Revolving Chemical modification of the enzyme results in a cell-specific pattern of ribozyme stability. '-O-Methyl sugar substitution is the best overall ribozyme for any lysate It gave an increase in stability. Reactivity to digestion by lymphocytes and monocytes cytosolic The relative resistance of Bozyme is shown in FIG. The ribozyme is either the 5'-end of the molecule or The rate of ribozyme digestion when labeled at either the 3'-end is similar. That the degradation is not due to the endogenous phosphatase activity in the lysate. Is shown. Various reports have shown that the binding arms of the hammerhead motif (stems I and III) Modification of ribozymes in DNA greatly enhances protection against nuclease digestion Suggest that you will give. As shown in FIG. 9, the present inventors differ. The following results were observed. Numbers 2.4, 2.5, 7, 8, 9, 10.4 and 13 There seems to be a clease resistant site. Resistance at 2.4, 2.5 and 10.4 May be specific for the ribozyme tested, More sequences need to be tested before reaching conclusions on case sensitivity. You. However, positions 7, 8, 9 and 13 are conserved in this motif. Cleotide, a suitable stable fragment generated in lysate digestion experiments Seems to be the site at which nuclease digestion stops. Interesting Unfortunately, there are far more nucleases in lymphocytes and monocyte lysates. Similar experiments were performed using activated HeLa cytosolic lysate In some cases no stable fragment was observed. HeLa CD4⁺On cells The observation of the efficacy of ribozymes in lymphocytes has You should re-test.Example 1: HIV tat ribozyme The 5'exon of tat contains the following potential cleavage sites: 2GCU site 3GUA sites, 5AUC sites, 3UCC sites, and 5CUC sites. these Computer folding and RNase H assay of all 18 sites Tested. Measurement of accessibility of each site for binding of 13mer oligonucleotide Was performed as follows: (A) Clone V sequence (this clone was provided by Dr. Rossi , Including the 5'tat exon of nucleotides 151-366). Ku Reotide was labeled with Lunafold (RNAFOLD) 4.0 (a commercially available Gram) and then closed by the folding domain, ie stem Of self-contained structure I checked for existence. (B) For each potential cleavage site, fold the domain containing that site And make sure it folds as in part (a); The main is the nucleotide at the cleavage site and its surroundings (11-16 nucleos in total). Folded again while keeping the unmatched state. These two folds Difference in free energy between ribozyme or DNA oligonucleotide Interprets this as the cost of melting out this region due to base pairing. (C) The length of the DNA oligonucleotide is -17 to -18 kcal / m. It was adjusted to give the expected delta-G (binding) of ole. Therefore, total combined energy It was expected that the difference in rugies would be reflected in the difference in free energy calculated in part (b). The calculated values are shown in Table 5. 18 DNA oligonucleotides targeting the 18 target sites listed in Table 5 were Created. About 100 nM body labeled RNA transcript (clone V), 0.08 U / μl RNaseH (excess RNaseH), as well as 1 mM, 10 μM Alternatively, use 2 × dilution of 1 μM DNA oligonucleotide to remove RNase H. Test was carried out. Table 6 shows the results. Eight out of 18 sites are 10 minutes After basation it showed> 40% cleavage at 5 μM. Most active sequence (H3 32, H337b, H352, see Table 6). Was. These three types of ribozymes are shown in FIGS. 3A, 3B and 3C, which show HDH and HE, respectively. Labeled as H and HFH.Example 2: Ribozyme containing thiophosphate The purpose of this example was to substitute thiophosphates for phosphates at positions on the backbone. Was to evaluate the activity of ribozymes containing the gut substitute. A ribozyme against the HIV-1 tat gene was added to the standard phosphoramidite It was synthesized on an ABI synthesizer using Togaku chemistry. However, mainly thiophosphate A process that is incorporated into the chain, instead of the standard oxidation process (using iodine) An oxidative step with a Beagecage sulfur transfer reagent was used. Withdrawal The protected and desalted RNA was gel purified, eluted, kinased and sequenced. And confirmed that the sequence was correct. Similarly, end labeled RNA₂O₂At I understood. It preferentially promotes cleavage at positions containing thiophosphates You. Ribozyme activity is related to the cleavage of short (12 nucleotide) end-labeled substrate RNA. And tested. Substrate concentration is about 1 nM; ribozyme concentration is 5-100 nM Yes; incubation at 37 ° C., 75 mM Tris, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂It was 2-40 minutes. Open The degree of cleavage is measured by gel electrophoresis (PAGE) and then quantified by AMBIS. did. These ribozymes are shown in Figures 4A-4G. The ribozyme below is essentially 10 It showed 0% activity: r37 (unmodified), r37s2 (1 thio on the 5'arm, 2thio on 3'arm), r37s4 (3thio modification on each arm), s37A ( 3 modifications on the 3'arm), s37B (alternate 3 modifications on the 3'arm). The fully modified ribozyme showed a slight decrease in activity. For example, s37C (group (Almost completely modified on the protein binding arm) is 3 times that of unmodified S37D (thio-modified at stems I, II and III) It showed a 9-fold decrease in activity with respect to the modification.Example 3: Ribozyme containing 2'-O-methyl A standard synthesizer using standard phosphoramidite chemistry on an ABI synthesizer Use 2'-O-methyl phosphoramidite nucleotides instead of cleotide Then, the ribozyme was created. Ribozyme activity was determined by PAGE analysis as described above. Measured. Referring to FIG. 5, all positions (base 5 ′ of stem III) that base pair with the substrate. Ribozymes containing 2'-O-methyl (excluding A) were synthesized. 2'-O-methyl K for ribozyme_cat/ K_mIs 44 × 10⁶M^-1min^-1And against this 41 × 10 for unmodified⁶m^-1min^-1And the thiophosphate modification 32 × 10 for decoration ribozyme⁶Met. Therefore, 2'-O-methyl Bozyme retains 100% activity.Example 4: Targeting the LTR and TAT regions of HIV-1 The following examples demonstrate useful probes targeting the LTR and TAT regions of HIV-1. It is an extension of the above embodiment to show the Bozyme. Used here Details of the methodology can be found in Stinkcomb (Stinch Comb filed on May 18, 1994). comb) et al., US Patent Application No. 08 / 245,466, "Methods and Compositions. for Treatment of Restenosis and Cancer Using Ribozymes ” This description is incorporated herein by reference. This is the practice of the invention. No such details are needed. The base number is GenBank number K03455 (H It is the number from the transcription start site according to IVHXB2).Screening the LTR region for the HH ribozyme site The LTR is one of the most conserved regions of the HIV-1 genome. Ma In addition, the LTR region is the entire transcript produced during the life cycle of HIV-1. Exists in. Therefore, ribozymes that cleave LTR targets block HIV replication. It may be refused. Forty-three potential hammerhead (HH) ribozymes in the HIV-1 LTR There is a body part. a) the ribozyme is properly folded with its target, and b) On the basis that the target sequence is conserved in all HIV-1 strains Ten hammerhead ribozymes were synthesized.RNA synthesis Riboza with a 7/7 binding arm using RNA phosphoramidite chemistry Im synthesized. Ribozymes were deprotected and purified as described above. The target RNA used in this experiment was 613 nt long and It contained cleavage sites for all 10 targeted HH ribozymes. A template containing a T7 RNA polymerase promoter upstream of the LTR target sequence, PCR amplified from the HIV-1 pro DNA clone. Other such clones Easy to build. This PCR using T7 RNA polymerase The target RNA was transcribed from the amplification template. One of the four ribonucleotide triphosphates As [α-³²The inclusion of P] CTP allows the transcript to be labeled with an internal label during transcription. I knew it. After transferring at 37 ° C. for 2 hours, the transfer mixture was treated with DNase-1. The DNA template used for transcription was digested and removed. RN with isopropanol Precipitate A and wash the pellet twice with 70% ethanol to remove salt and transcription reactions. The nucleotide used for was removed. RNA was resuspended in DEPC-treated water, Stored at 4 ° C.Ribozyme cleavage reaction The reaction is carried out under ribozyme excess conditions (k_cat/ K_m) Under (Herslag (Hers chlag) and Cech, (1990) Biochemistry 29, 10159-10171). Easy Contains 1,000 nM ribozyme and 10 nM internally labeled target RNA. 0 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 10 mM MgCl₂In the presence of Denatured separately by heating at 90 ° C. for 2 minutes. 37 ° C for 10-20 minutes RNA was restored by cooling. Ribozyme and target RNA at 37 ° C The cleavage reaction was initiated by mixing. 5 μl ants at regular time intervals The reaction is stopped by taking a coat and adding an equal volume of stop buffer. Frozen on ice. Samples were separated on a sequence gel.result As shown in FIG. 10, four out of ten ribozymes tested individually Only HH ribozymes (568, 581, 631, 696) open LTR RNA. Cracked. Other target sites are not accessible for ribozyme binding and cleavage It is. Site 568, also referred to as site 115, is a Drouplic. ) Et al (66J. Virol. 1432-1441, 1992) and Heidenreich and Echter Inn (Heidenreich, Eckstein) (267J. Biol. Chem. 1904-1909, 1992) It is a target for hammerhead ribozyme cleavage. Because the 568HH ribozyme cleaved its target to a higher degree than the others, this There was interest in optimizing the length of the binding arm of the HH ribozyme. Figure 11 As shown in, increasing the length of the binding arm from 12 to 14 base pairs (total) Then, the rate of ribozyme cleavage was significantly increased. Binding arm longer than 14 base pairs There was no significant improvement in the activity of the ribozyme with the. Chemical modification of HH ribozymes targeting specific sites has been demonstrated in human serum. The stability of ribozymes can be significantly improved. In addition, these modifications include ribozyme It does not appear to have a significant effect on the catalytic activity of. U4 and G5 in ribozyme , A6, U7, G8, G12 and A15.1 positions (using standard nomenclature, Figure 2'-O-methyl group for all 2'hydroxyl groups (see 14). Qualified. The 2'hydroxyl groups at the U4 and U7 positions are 2'amino, 2'-C- Modified with either allyl, 2'-O-methyl or 2'-ara-fluoro. US patent application 08 of Usman et al. Filed March 29, 1994 / 218,934, "2'-Deoxy2'-alkylnucleotide containing Nucleic Acid" , The description of which is incorporated herein by reference. Referring to FIG. 12, the 568HH ribozyme has various bases (identical to those listed above). Could be stabilized by chemical modification of the sugar moiety. One of the following compounds Further modified the 568HH ribozyme: 2'fluoro, at the U7 position. 2'amino, arafluoro at U4, 2 at U4 and U7 'Amino, c-allyl at U4 position. All of the above modifications have ribozyme activity Did not have a harmful effect on. Cells are 568HH ribozymes (with 2'amino modifications at U4 and U7 positions). ) Block HIV-1 replication.Screening the TAT region for the HH ribozyme site A region of TAT mRNA is a transcription produced during the HIV-1 life cycle. It exists in most of the body. Therefore, the ribozyme that cleaves the TAT target is HI May block V replication. 54 in the HIV-1 TAT region (between 5776nt and 6044nt) There are potential HH ribozyme sites. a) Ribozyme correctly folds into its target Folding, and b) the target sequence is conserved in all HIV-1 strains. 9 hammerhead ribozymes were synthesized based on the following. RNA synthesis and ribozyme cleavage reactions were performed as described above. This fruit The target RNA used in the test was 422 nt long. As shown in FIG. 13, there are five sites (5841, 5869, 5978, 59). 66, 5969) was more easily cleaved than the others. These hammerhead parts None of the positions has ever been targeted.Screening the HIV-1 genome for hairpin ribozyme sites Referring to Table VIII and Figure 15, there are 27 potential clones in the HIV-1 genome. There is an Appin (HP) ribozyme site. The ribozyme shown in the table was synthesized and tested. did. Can modify different regions of the hairpin structure without deleterious effects : For example, in those targeting nucleotide positions 565 and 4398 Inserting two bases, GGCA instead of GGCA (3rd column) respectively It can be GCAGUC instead of CA and GCAG. Site 565 in the LTR region (Ojwang et al., (1992)PNAS, USA. 8 9, 10802-10806; Yu et al., (1993)PNAS, USA. 90, 6340-6344), and Position 4398 in the POL region of the HIV-1 genome (Joseph and B urke), (1993)J. Biol Chem. 268, 24515-24518) is a binding of HP ribozyme. And the cleavage is shown to be accessible. We also found that 56 We found that HP ribozymes targeting positions 5 and 4398 were active. Was. The best HH and HP ribozymes with their associated cleavage and target sites Are shown in Table VII.Administration of ribozyme Appropriate delivery of selected ribozymes prophylactically or to HIV-1 infected patients. Vehicles such as liposomes, controlled release vehicles allow for iontophoresis, Lectroporation or ion-pairing molecule, or covalent adduct, or Externally deliver the ribozyme to infected tissues using other pharmacologically acceptable delivery methods. It can be administered by reaching. The routes of administration include intramuscular, aerosol and oral (tablets Or in the form of pills), topically, systemically, intraocularly, intraperitoneally, and / or intrathecally (in (trathecal) are included. Immunization with ribozyme and / or Expression vectors for delivery of bozymes are also suitable. The particular route of delivery of the ribozyme chosen will depend on the use of the ribozyme . In general, the specific delivery program for each ribozyme is related to subcellular localization. We will focus on the incorporation of unmodified ribozyme, followed by proof of efficacy. Or Can pursue delivery to these same cells in the organs or tissues of the animal You. Uptake studies include cell ribozymes, regardless of delivery vehicle or strategy. Incorporation assays to assess membrane uptake are included. These assays are Also measures subcellular localization of ribozyme after uptake, and finally contains the target sequence Maintain steady-state concentration in the cell compartment (nucleus and / or cytoplasm) Establish requirements for. The potency and cytotoxicity is then investigated. Toxicity means cell life Not only survival but also cell function is included. The delivery methods that may be adopted include: a. Enclosed in liposome b. Transduction with retrovirus vector c. Conjugation with cholesterol d. Antigen binding sites or nuclear targets found on most snRNAs or nucleoproteins Localization to nuclear compartments using sites e. Neutralization of ribozyme charge using nucleotide derivatives f. Use of blood stem cells to distribute ribozymes throughout the body. At least three delivery strategies are useful in the present invention, including the following: riboza Immunization, particle carrier drug delivery vehicles, and retroviral expression vehicles. Kuta. Unmodified ribozymes, like most small molecules, are gradually taken up by cells. Be included. Ribozymes are essentially random in order to enhance cellular uptake. , May be modified in a manner that reduces its charge but retains a specific functional group Yes. This allows the molecule to diffuse across the cell membrane and thus the permeation barrier. Is excluded. Modification of the ribozyme to reduce the charge of the large molecules of these large molecules by the cell. This is one way to increase uptake. However, random methods are not recommended. Ribozymes are structurally and functionally more complex than small drugs. Ribozai The structural requirements necessary to maintain the catalytic activity of the membrane are well known to those skilled in the art. cell Consider these requirements when designing a modification that enhances delivery to. Modification is Nuku It is also designed to reduce susceptibility to degradation of the lyase. These characteristics are Both would greatly improve the efficacy of ribozymes. Required for ribozyme cleavage activity Uptake by cells can be increased by several degrees without altering essential phosphodiester bonds. Can be increased. Chemical modification of the phosphate backbone reduced the negative charge, thereby crossing the membrane Free diffusion will be possible. This principle is effective for antisense DNA technology Was proved. This can be achieved because of the similar chemical composition of DNA and RNA. Make it an effective method. In the body, drives the diffusion of modified ribozymes into tissue cells It may be necessary to maintain an external concentration to allow this. Temporarily high concentration of drug in affected tissue A route of administration is preferred in which the substance is exposed and can be gradually consumed by systemic adsorption. Re Intravenous with a drug carrier designed to increase the circulating half-life of bozyme Administration may be adopted. The size and composition of the drug carrier is such that it rapidly clears the bloodstream. Limit loss. Carriers prepared to accumulate at the site of infection are ribozymes Can be protected from the decomposition process. The drug delivery vehicle will be effective for both systemic and local administration. They are To act as a sustained release reservoir or to direct their contents directly to target cells It can be designed for delivery. Benefits of using a direct delivery drug vehicle The point is that multiple molecules are delivered per uptake. These behi Kuru enhances the circulating half-life of drugs that would otherwise clear rapidly from the bloodstream It was shown that. Some examples of specialized drug delivery vehicles in this category are: , Liposome, hydrogel, cyclodextrin, biodegradable nanocapsule, And bioabsorbable microspheres. Of the delivery systems in this category, liposomes are preferred. Lipo Somes enhance intracellular stability, increase uptake efficiency, and improve biological activity You. Liposomes consist of lipids arranged in a manner similar to the lipids that make up the cell membrane. It is an empty spherical vesicle. They have an internal aqueous space for enclosing water-soluble compounds It has a diameter ranging from 0.05 micron to several microns. Some research , Liposomes can deliver RNA to cells, and the RNA is It was shown to be maintained in a biologically active state. For example, a liposome delivery vehicle originally designed as a research tool Lipofectin delivers intact mRNA molecules to cells, This was shown to produce the corresponding protein. In other studies, 3,500 nucleotides, antisense to HIV structural proteins An antibody-targeted liposome delivery system that encapsulates an RNA molecule Ruth growth was inhibited in a sequence-specific manner. The antibody targets infected cells to liposomes. As well as triggering internalization of liposomes by infected cells . Triggering endocytosis is useful for virus inhibition It is. Finally, synthetic ribozymes delivered by liposome V-sensitive cells), which are enriched in the nucleus of V-sensitive cells and by sequence cleavage within those cells. It has been shown to be functional as demonstrated. Relatively small ribozyme (long Delivery of liposomes to other cell types using less than What Intracellular localization was shown. Liposomes offer several advantages: they are non-toxic and biodegradable. Composition; they exhibit a long circulating half-life; and to target tissues Recognition molecules can be easily attached to their surface. Finally, the suspension Is a cost-effective way to produce liposome drugs in any of the lyophilized products. Demonstrating the feasibility of this technology as an acceptable drug delivery system. Was. Other controlled release drug delivery systems such as nanoparticles and hydrogels have It would be an effective delivery vehicle for Zym. These carriers are chemotherapy drugs and It was developed for protein drugs and is therefore suitable for delivery of ribozymes. I have. Topical administration of ribozymes allows localized concentration at the site of administration with minimal systemic absorption Is advantageous. This makes it easy to deliver the ribozyme to the affected area And the degree of toxicity is reduced. In addition, the amount of material applied will depend on other routes of administration. Much less than what you need. Ribozymes can infect for effective delivery It needs to diffuse into cells. Modify ribozyme to neutralize negative charge Decorating will be all that is needed for transparency. But insufficient charge neutralization In some cases, the modified ribozyme may be incorporated into a liposome to enhance its permeation enhancer, such as Azone (A zone) or oleic acid. The liposomes are modified Sustained-release vehicle in which bozyme and permeation enhancer migrate from liposome into infected cells Or the phospholipids of the liposome are modified ribozymes and permeation enhancers. It may also be directly involved with the facilitator in facilitating delivery to the cell. In some cases, Both bozymes and permeation enhancers can be incorporated into suppository formulations for sustained release. it can. Ribozymes can also be administered systemically. Systemic absorption means that the drug accumulates in the bloodstream. Meaning to be distributed and then distributed throughout the body. Routes of administration that result in systemic absorption include Intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intrathecal, and intraocular administration are included. These investments Each route of exposure exposes the ribozyme to accessible diseased tissues. Subcutaneous administration Drains into local lymph nodes, travels through the lymph network, and enters the circulation You. The rate of entry into the circulation has been shown to be a function of molecular weight or size. I have. With liposomes and other drug carriers, ribozymes enter lymph nodes. Localize. Ribozyme modified to diffuse into cells or liposome Can also be directly involved in the delivery of unmodified or modified ribozymes to cells. This method is particularly useful for treating AIDS with the anti-HIV ribozymes of the invention. You. Also preferred in AIDS therapy is the use of oligonucleotides for lymphocytes and lymphocytes. And the use of liposomal formulations that can be delivered to macrophages. This oligonuc Reotide delivery system inhibits HIV proliferation in infected primary immune cells . A study of whole blood showed that this formulation resulted in up to 90% lymphocytes after 8 hours at 37 ° C It is shown to be incorporated. According to preliminary studies of biodistribution and pharmacokinetics , 70% of the injected dose per gram of tissue was obtained in the spleen 1 hour after intravenous administration Was. This formulation provides excellent delivery for anti-AIDS ribozymes for two reasons. Provide the vehicle. First, T helper lymphocytes and macrophages Rus is the primary cell that infects the second, and secondly, subcutaneous administration of ribozyme Deliver to persistent HIV infected lymphocytes and macrophages. Then liposomes Are excreted from the lymphatic system, enter the circulatory system, and accumulate in the spleen, where ribozymes Delivered to resident lymphocytes and macrophages. Intraperitoneal administration also results in entry into the circulatory system, again with ribozyme delivery vehicles. The molecular weight and size of the complex control the rate of entry. Injected liposomes show accumulation in the liver, lungs and spleen. this The composition and size can be adjusted so that the accumulation is 30-40% of the injected dose. Wear. The remaining dose circulates in the bloodstream for up to 24 hours. Chosen delivery method results in cytoplasmic accumulation in diseased cells for optimal dosing The molecule should have some nuclease resistance. We also adopted delivery to the nucleus Yes, but less preferred. Highly preferred delivery methods include liposomes (10-400 nm), hydrogel, controlled release polymer, microinjection Or electroporation (for ex vivo treatment) and other drugs Includes pharmaceutically applicable vehicles. Dose depends on indication and route of administration However, it should be within the range of 100-200 mg / kg body weight / day. Treatment period May extend over the course of the morbidity, usually for at least 14-16 days and probably It will be continuous. For topical, intraocular and vaginal application, multiple doses per day Giving is considered. Frequency of administration depends on delivery vehicle for disease and clinical trial Will depend on the data. The establishment of therapeutic levels of ribozymes within cells is dependent on the rate of uptake and degradation. Depends on. Reducing the degree of degradation extends the intracellular half-life of ribozymes. Therefore, chemically modified ribozymes, such as modifications of the phosphate backbone, Caps the ribozyme at the 5'and 3'ends with nucleotide analogues. Those with will require different dosage forms. Description of useful system Are provided by the prior art cited above, all of which are incorporated herein by reference. Quote. The ribozyme of the present invention specifically or non-specifically determines the presence of target RNA in a sample. It is also useful as a diagnostic tool for detection. That is, the target RNA is present in the sample When present, it is specifically cleaved by the ribozyme and thus the smaller RN It can be easily and specifically detected as type A. Such a small RNA The presence of species indicates the presence of target RNA in the sample. Other aspects are within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｎ 5/10 8931−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 7/00 9359−4Ｂ 9/00 9/00 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者マクスウィゲン，ジェームズアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者スティンクコーム，ダニエル・ティーアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，オールド・ポスト・ロード 7203 (72)発明者トンプソン，ジェームズ・ディーアメリカ合衆国コロラド州80301，ボウルダー，グレンウッド・ドライブ 2925，ナンバー 301─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07H 21/04 8615-4C C07H 21/04 B C12N 5/10 8931-4B C12N 7/00 7/00 9359- 4B 9/00 9/00 9281-4B 5/00 B (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, (PT, SE), AU, CA, JP, KR (72) Inventor Maxwigen, James 80301, Colorado, United States, Boulder, Franklin Drive 4866 (72) Inventor Stinkcomb, Daniel Tee 80301, Bowl, Colorado, United States Dar, Old Post Road 7203 (72) Inventor Thompson, James Dee United States of America 80301, Boulder, Glenwood Drive 2925, Number 301, Colorado

Claims

[Claims] 1. An enzymatic nucleic acid molecule that cleaves RNA of immunodeficiency virus in nef. 2. The immunodeficiency virus RNA consists of the tar, rre and 3'LTR regions. An enzymatic nucleic acid molecule that cleaves in a region selected from the group: 3. The fermentation according to claim 1, wherein the RNA molecule has a hammerhead motif. Elementary nucleic acid molecule. 4. The RNA molecule may be a hairpin, a hepatitis delta virus, a group 1 intron. Or the RNaseP RNA motif, the enzymatic nucleic acid component according to claim 1. Child. 5. An enzymatic nucleic acid molecule that cleaves the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1-68. 6. The ribozyme is a 5 to 23 salt complementary to the RNA of the gene or region. Enzymatic nucleic acid molecule according to any of claims 1-5, comprising a group. 7. The ribozyme is 10 to 18 complementary to the RNA of the gene or region. The enzymatic nucleic acid molecule according to claim 6, comprising a base. 8. A mammalian cell comprising the enzymatic nucleic acid molecule of any of claims 1-5. 9. 9. The cell according to claim 8, wherein said cell is a human cell. 10. The cell is a T4 lymphocyte having a CD4 receptor on its cell surface The cell according to claim 9. 11. A nucleic acid encoding the enzymatic nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 5, An expression vector comprising in a manner that the enzymatic RNA molecule is expressed in a mammalian cell. 12. Administering to a patient an enzymatic nucleic acid molecule according to any of claims 1-5 A method of treating a more acquired immunodeficiency disease. 13. 13. The method of claim 12, wherein the patient is a human, cat or monkey. 14． A method of providing defective viral particles, which is infected with an immunodeficiency virus The cells are treated with enzymatic nucleic acid components active in the cleavage of genes required for viral replication or infectivity. A method comprising contacting with a child. 15. The molecule is active in cleaving a gene required for viral protein synthesis. The method according to claim 14. 16. 15. The method of claim 14, wherein the gene is the nef or tat gene. 17． A defect produced by the method according to any one of claims 14, 15 or 16. Virus particles. 18. A defect formed by the method according to claim 14, 15, or 16. An immunogenic preparation comprising defective viral particles. 19. A method of immunizing against infection by HIV-1, wherein the patient is immunized. Or a step of contacting with a vector encoding the enzymatic nucleic acid molecule according to any one of 1. Way. 20. Enzymatic nucleic acid molecules that cleave the substrate sequences shown in Tables VII or VIII. 21. An enzymatic nucleic acid molecule having the sequence shown in Table VII or VIII.