JPH09500783A - Bifunctional selection fusion gene based on the cytosine deaminase (cd) gene - Google Patents

Bifunctional selection fusion gene based on the cytosine deaminase (cd) gene

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JPH09500783A JP50078795A JP50078795A JPH09500783A JP H09500783 A JPH09500783 A JP H09500783A JP 50078795 A JP50078795 A JP 50078795A JP 50078795 A JP50078795 A JP 50078795A JP H09500783 A JPH09500783 A JP H09500783A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ネガティブ選択遺伝子と共にリーディングフレームにあり、かつネガティブ選択遺伝子に融合した優性のポジティブ選択遺伝子を含む選択融合遺伝子を提供する。 (57) Abstract: The present invention is in the reading frame with a negative selectable gene, and provides a selection fusion gene comprising a positive selection gene dominant fused to negative selection gene. 本選択融合遺伝子は、宿主細胞に優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与え得る単一の二機能性融合タンパク質をコードする。 This selection fusion gene encodes a single bifunctional fusion protein in the host cell may provide a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant. 優性のネガティブ選択表現型は、5-フルオロシトシン感受性(5-FC s )に関するシトシンデアミナーゼ(CD)遺伝子によって与えられる。 Negative selection phenotype dominant is given by the cytosine deaminase (CD) gene for 5-fluorocytosine sensitivity (5-FC s). 優性のポジティブ選択表現型は、例えば、G-418 アミノグリコシド抗生物質耐性(G-418 r )に関するneo遺伝子またはハイグロマイシンB耐性(Hm r )に関するhph遺伝子によって与えられる。 Positive selection dominant phenotype, for example, given by hph gene for G-418 aminoglycoside antibiotic resistance (G-418 r) about the neo gene or hygromycin B resistance (Hm r). 本発明はさらに、選択融合遺伝子を含む、レトロウイルスベクターのような組換え発現ベクター、および、該組換え発現ベクターを導入された細胞を提供する。 The present invention further includes a selection fusion gene, a recombinant expression vector such as a retroviral vector, and provides cells transfected with recombinant expression vectors. 本発明の選択融合遺伝子は、単一の遺伝子物質として発現され調節されるので、高効率の共調節および共発現を可能とする。 Selection fusion gene of the present invention, since it is regulated expressed as a single genetic material to allow for co-regulation and co-expression of high efficiency.

Description

【発明の詳細な説明】 シトシンデアミナーゼ(CD)遺伝子に基づく 二機能性選択融合遺伝子背景 本発明は、広く、選択表現型を発現する遺伝子に関する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Bifunctional selected fusion gene BACKGROUND present invention based on the cytosine deaminase (CD) gene broadly relates to a gene expressing the selectable phenotype. より特定すれば、本発明は、優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを共に発現し得る遺伝子に関する。 More particularly, the present invention relates to a gene capable of expressing both a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant. 選択表現型を発現する遺伝子は、遺伝子を導入された宿主細胞を同定および単離するための手段として組換えDNA技術において広く用いられている。 Gene expressing the selectable phenotype are widely used in recombinant DNA technology as a means to identify and isolate host cells transfected with the gene. 典型的には、選択表現型を発現する遺伝子は、組換え発現ベクターの一部として宿主細胞に導入される。 Typically, genes expressing selectable phenotype is introduced into the host cell as part of a recombinant expression vector. ポジティブ選択遺伝子は、導入された遺伝子を安定した形態で保持している細胞を同定および/または単離するための手段を提供する。 Positive selection gene provides a means to identify and / or isolate cells held in the stable form of the introduced gene. そして、 この能力によって、これら遺伝子は、遺伝子導入および遺伝子機能の解析を助長する。 Then, this capability, these genes will facilitate the analysis of gene transfer and gene function. その一方で、ネガティブ選択遺伝子は、導入された遺伝子を保持する細胞を排除するための手段を提供する。 On the other hand, negative selection gene provides a means for eliminating cells that retain the introduced gene. 動物細胞において選択表現型を与える数多くの遺伝子が入手可能である。 Numerous genes that confer selectable phenotype in animal cells are available. 細菌のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)(Colbere-Garapinら、J .Mol.Biol.150:1,1981)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)(Santerreら、Gene 30:147,1984)、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)遺伝子(MulliganおよびBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072,1981)は、広く、 優性のポジティブ選択遺伝子として使用される。 Bacterial neomycin phosphotransferase gene (neo) (Colbere-Garapin et al., J .Mol.Biol.150: 1,1981), hygromycin phosphotransferase gene (hph) (Santerre et al, Gene 30: 147,1984), and xanthine - guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene (Mulligan and Berg, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 2072,1981) are widely used as a positive selection gene dominant. Herpes simplexウイルスI型のチミジンキナーゼ(HSV-I TK)遺伝子(Wiglerら、Cell 11:223,1977);細胞由来のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子(Wiglerら、Proc .Natl.Acad.Sci.USA 76:1373,1979);およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子(Jollyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80 :477,1983)は、一般に、劣性のポジティブ選択遺伝子として使用される。 Herpes simplex virus type I thymidine kinase (HSV-I TK) gene (Wigler et al., Cell 11: 223,1977); cells derived from adenine phosphoribosyltransferase (APRT) gene (Wigler et al., Proc .Natl.Acad.Sci. USA 76: 1373,1979); and hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene (Jolly et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80: 477,1983) is generally used as a positive selection gene recessive . 概して、優性の選択遺伝子は、劣性遺伝子よりも、より用途が広い。 Generally, selection gene dominant than recessive genes, and more versatile. なぜなら、劣性遺伝子の使用は、選択可能な機能において不完全な変異細胞に限定される一方で、優性遺伝子は野生型細胞で使用され得るからである。 This is because the use of recessive genes, while being limited to the incomplete mutant cells in a selectable function, dominant gene is because may be used in wild-type cells. いくつかの遺伝子は、ネガティブ選択表現型およびポジティブ選択表現型を与える。 Some genes, gives a negative selection phenotype and positive selectable phenotype. これらには、HSV-I TK、HPRT、APRT、およびgpt遺伝子が包含される。 These include, HSV-I TK, HPRT, APRT, and gpt gene are encompassed. これら遺伝子は、ヌクレオシドまたはプリンアナログの細胞毒性中間体への変換を触媒する酵素をコードしている。 These genes encode enzymes which catalyze the conversion of nucleoside or purine analogs cytotoxic intermediates. ヌクレオシドアナログのガンシクロビル(ganci clovir; GCV)は、HSV-I TKの効果的な基質であるが、細胞由来のTKに関しては不十分な基質である。 Nucleoside analog ganciclovir (ganci clovir; GCV) is an effective substrate for HSV-I TK, a poor substrates with respect to TK-derived cells. 従って、これは、野生型細胞におけるHSV-I TK遺伝子に対してのネガティブ選択に使用され得る(St.Clairら、Antimicrob.Agents Chemot her.31:844,1987)。 Therefore, it can be used negative selection against HSV-I TK gene in wild-type cells (St.Clair et al, Antimicrob.Agents Chemot her.31: 844,1987). しかしながら、HSV-I TK遺伝子は、細胞由来のTK活性を欠いている変異細胞においては、ポジティブ選択にのみ効果的に使用され得る。 However, HSV-I TK gene in the mutant cells lacking TK activity from cells may be used only effectively to positive selection. 同様に、上記HPRTおよびAPRT遺伝子のポジティブ選択またはネガティブ選択のいずれかへの使用は、それぞれHPRT -細胞またはAPRT -細胞に限定される(Fenwick、「HGPRTシステム」、33 3-373頁、M.Gottesman(編)、Molecular Cell Genetics、John Wiley and Son s、New York、1985;Taylorら、「APRTシステム」、311-332頁、M.Gottesman( 編)、Molecular Cell Genetics、John Wiley and Sons、New York、1985)。 Similarly, the use of the either positive selection or negative selection of the HPRT and APRT genes, respectively HPRT - cell or APRT - is restricted to cells (Fenwick, "HGPRT System", 33 3-373 pages, M. Gottesman (ed.), Molecular Cell Genetics, John Wiley and Son s, New York, 1985; Taylor et al., "APRT system", pp. 311-332, M.Gottesman (eds), Molecular Cell Genetics, John Wiley and Sons, New York, 1985). 一方、gpt遺伝子は、野生型細胞において、ポジティブ選択およびネガティブ選択のいずれにも使用され得る。 On the other hand, gpt gene, in wild-type cells, it may be used in any of the positive and negative selection. 野生型細胞におけるgpt遺伝子に対するネガティブ選択は、6-チオキサンチンを用いて可能である。 Negative selection for gpt gene in wild-type cells is possible using 6-thioxanthine. これは、細菌gpt酵素によって、細胞毒性ヌクレオチドアナログに効果的に変換されるが、細胞由来のHPRT酵素によっては変換されない(Besnardら、Mol.Cell.Biol.7:4139,1987)。 This is because the bacterial gpt enzyme, but is effectively converted to a cytotoxic nucleotide analog, not converted by the HPRT enzyme from cells (Besnard et al., Mol.Cell.Biol.7: 4139,1987). 別のネガティブ選択遺伝子が、最近、Mullenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:33,1992)によって報告された。 Another negative selection gene, recently, Mullen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 33,1992) was reported by. 細菌のシトシンデアミナーゼ(CD)遺伝子は、5-フルオロシトシン(5-FC)を5-フルオロウラシル(5-FU)に変換する。 Cytosine deaminase (CD) gene of the bacterium converts 5-fluorocytosine (5-FC) 5-fluorouracil (5-FU). 5-FUは、 さらに細胞内で、5-フルオロ-ウリジン-5'-トリホスフェートおよび5-フルオロ- 2'-デオキシ-ウリジン-5'-モノホスフェートに代謝される。 5-FU is further within the cell, 5-fluoro - is metabolized to uridine-5'-monophosphate - uridine-5'-triphosphate and 5-fluoro - 2'-deoxy. これらは、RNAおよびDNA合成を阻害し、細胞死を引き起こす。 It inhibits RNA and DNA synthesis, cause cell death. 従って、5-FCは、CD遺伝子を保有し発現する細胞を効果的に除去し得る。 Thus, 5-FC may effectively remove cells expressing holds CD gene. CD遺伝子は、正常細胞においてポジティブに選択可能ではない。 CD gene is not possible positively selected in normal cells. さらに最近、ヒトの遺伝子療法(gene therapy)に用いるために設計された遺伝子導入ベクター中に組み込まれ得る選択遺伝子に関心が向けられている。 Have recently directed attention to the selection gene can be incorporated into a gene transfer vector in which is designed for use in human gene therapy (gene therapy). 遺伝子療法は、例えば、細胞活性または細胞表現型を改変し、あるいは代わりに病気の治療に必要な薬剤を発現させ得る異種遺伝子を導入することによって、正常な細胞機能を増強する手段として使用され得る。 Gene therapy, for example, by introducing a heterologous gene capable of expressing a drug needed to treat the modified cellular activity or cell phenotype, or alternatively the disease, can be used as a means of enhancing normal cell function . 遺伝子療法はまた、1つもしくは複数の遺伝子の欠陥もしくは欠損に起因する先天性遺伝病の治療に用いられ得る。 Gene therapy can also be used to treat congenital genetic diseases caused by defective or deficient in one or more genes. これらの疾患は、集合的に重大な病状および死を招く。 These diseases lead to collectively serious pathology and death. このような遺伝病の事例には、血友病AおよびB(それぞれ、血液凝固第VIII因子および第IX因子の欠乏によって引き起こされる)、α 1アンチトリプシン欠損症、およびアデノシンデアミナーゼ欠損症が包含される。 The examples of such genetic disease, hemophilia A and B (respectively, caused by a deficiency of blood coagulation Factor VIII and Factor IX), alpha 1 antitrypsin deficiency, and adenosine deaminase deficiency is included that. これら特定のケースの各々においては、欠けている遺伝子は同定されており、その相補DNA(cDNA)は、分子としてクローンされている(Woodら、Nature 312:330,1984;Ansonら、Nature 315:683,1984;およびLongら、Biochemistry 23:4828,1984;Daddonaら、J.Biol.Chem.259:12 101,1984)。 In each of these particular cases, the missing gene has been identified, its Complementary DNA (cDNA) have been cloned as a molecule (Wood et al., Nature 312: 330,1984; Anson et al., Nature 315: 683,1984; and Long et al., Biochemistry 23: 4828,1984; Daddona et al, J.Biol.Chem.259: 12 101,1984). 待期療法が、これら遺伝病のいくつかについて適用される(通常、血液製剤の投与または輸血の形態で)一方で、このような遺伝病治療の1つの方法は、欠損または失われている遺伝子の代替を患者の体細胞へ導入することである。 Gene palliative treatment is applied for some of these genetic diseases (typically, administration or transfusion in the form of blood product), while one method for such a genetic disease treatment that is deficient or lost the alternative is to introduce into the patient's somatic cells. このプロセスは、「遺伝子療法」と呼ばれる(Anderson,Science 226:40 1,1984)。 This process is referred to as "gene therapy" (Anderson, Science 226: 40 1,1984). 遺伝子療法のプロセスは、典型的には、(1)患者から体(非生殖)細胞を取り出す工程、(2)エクスビボ(ex vivo)において、治療または代替(replacement)遺伝子を、治療または代替遺伝子を発現し得る適切なベクターを介して細胞に導入する工程、および(3)これら細胞をもとの患者に移植または注入(transfuse)する工程(ここで、該治療または代替遺伝子は発現し、ある種の治療上の恩恵をもたらす)を含む。 Gene therapy processes typically (1) a step of taking out the body (non-germ) cells from the patient, (2) ex vivo (ex vivo), the treatment or alternative (replacement) gene therapy or alternative gene step is introduced into the cell via an appropriate vector capable of expressing, and (3) implantation or injection of these cells to the original patient (transfuse) to step (here, the therapeutic or alternative gene is expressed, certain including the benefit) of the therapeutic. ヒトの遺伝子療法に関する体細胞への遺伝子導入は、現在、エクスビボにおいて達成され(Kasidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:473,1990 ;Rosenbergら、N.Engl.J.Med.323:570,1990)、そしてこの比較的効率の悪いプロセスは、代替遺伝子が導入された細胞を(それらを患者へ戻す前に)同定および単離するための、優性のポジティブ選択遺伝子の使用によって、促進されるであろう。 Gene transfer into somatic cells for human gene therapy is currently achieved ex vivo (Kasid et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 473,1990; Rosenberg et al., N.Engl.J.Med.323 : 570,1990), and this relatively inefficient process, alternative gene is introduced cells (prior to) to identify and isolate returning them to the patient, by the use of positive selection gene dominant, It will be promoted. 例えば、上記neo遺伝子は、ヒト遺伝子療法において用いられる遺伝的に改変された細胞の同定に用いられている。 For example, the neo gene has been used to identify genetically modified cells used in human gene therapy. しかしながら、いくつかの事例では、遺伝的に改変された細胞の導入が実際に患者の健康を危険にさらす可能性がある。 However, in some cases, there are genetically modified could compromise actually patient health introduction of cells. 遺伝的に改変された細胞をインビボ(i n vivo)において選択的に除去する能力は、その手法を逆に戻すことを許容することにより、遺伝子療法を受ける患者に安全という付加マージンを与える。 The ability to selectively remove the genetically modified cells in vivo (i n vivo), by allowing the return the approach reversed, providing additional margin of safety for patients undergoing gene therapy. このことは、(野生型細胞において機能し得る)ネガティブ選択(すなわち、「自殺」)遺伝子をベクターに組み込むことによって達成され得る。 This may (can function in wild-type cells) negative selection (i.e., "suicide") may be achieved by incorporating the gene into a vector. 優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与え得る遺伝子の組み込みは、ポジティブ選択表現型およびネガティブ選択表現型の共発現(co-expression)および共調節(co -regulation)を確実にし、そしてベクターのサイズを最小化し得る。 Integration of genes that may confer a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant, and the positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype coexpressing (co-expression) and co-regulation (co -regulation) to ensure, and It may minimize the size of the vector. しかしながら、いくつかの事例におけるgpt遺伝子に関するポジティブ選択には、測定することが困難となり得る精密な選択条件が要求される。 However, the positive selection for gpt gene in some instances, precise selection conditions which may be measured can be a difficult is required. その理由は、gpt遺伝子を用いているというよりはむしろ、優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型との共発現が、2つの異なる遺伝子(これらは、他の優性のポジティブにおよびネガティブに選択可能な機能を別々にコードしている)の共発現によって一般的に達成されることにある。 This is because, rather than rather uses the gpt gene, co-expression of a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominance, the two different genes (these positively selected other dominant and negatively possible functions in generally achieved by that by separately encoding to have) the co-expression. 異なる遺伝子によってコードされる、優性のポジティブ選択表現型およびネガティブ選択表現型を共発現させるための現存するストラテジーには、通常、複雑な難題を与える。 Encoded by different genes, the existing strategies for co-expressing the positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant, usually gives a complex challenge. もっとも広く使用される技法は、2つの表現型を別々にコードする2つのプラスミドを共にトランスフェクト(co-transfect)することである( Wiglerら、Cell 16:777,1979)。 The technique most widely used is to both transfecting two plasmids encoding two phenotypes separately (co-transfect) (Wigler et al, Cell 16: 777,1979). しかしながら、共導入(co-transfer)の効率は、めったに100%とならず、そして2つの遺伝子は、独立して遺伝学的または発生機構学的調節を受け得る。 However, the efficiency of the co-introduced (co-transfer) is rarely not 100%, and the two genes may undergo genetic or developmental mechanics regulation independently. 第2のストラテジーは、2つの遺伝子を、単一プラスミド上で連結させるかまたはウイルスベクター中に2つの独立した転写ユニットとして配置することである。 The second strategy, the two genes, is to place as two separate transcriptional units into or viral vector linking on a single plasmid. この方法もまた、これら遺伝子が独立して調節され得るという不都合を欠点としてもつ。 This method also has the disadvantage that these genes may be independently regulated as drawbacks. レトロウイルスベクターの場合、一方または他方の独立した転写ユニットのサプレッションが、起こり得る(EmermanおよびTemin、Mol.Cell.Biol.6:792,1986)。 For retroviral vectors, suppression of one or the other independent transcription unit may occur (Emerman and Temin, Mol.Cell.Biol.6: 792,1986). さらに、機能的な多くのプロモーターを有するレトロウイルスベクターが首尾よく作成されているにもかかわらず、ある状況下では、ウイルスベクター中に2つの機能的な転写ユニットを収容し得る十分なスペースがないことがあり得る(Overellら、Mol.Cell.Biol.8:18 03,1988)。 Additionally, retroviral vectors with functional number of promoters despite being created successfully, in some situations, there is not sufficient space that can accommodate two functional transcription units into a viral vector it is possible (Overell et al., Mol.Cell.Biol.8: 18 03,1988). 第3のストラテジーは、2つの遺伝子を1つの2シストロンmRNAとして、単一のプロモーターを用いて発現させることである。 A third strategy, the two genes as a single bicistronic the mRNA, leading to express using a single promoter. しかしながら、この方法によれば、遠位のオープンリーディングフレームは、しばしば、一定しない効率で(そして通常は減縮されて)翻訳され(Kaufmanら、EMBOJ.6:187,1987 )、そしてこのような発現ストラテジーが1次細胞においていかに有効なのか定かではない。 However, according to this method, the distal open reading frame is often in inconsistent efficiency (and usually is Genchijimi) is translated (Kaufman et al., EMBOJ.6: 187,1987), and such expression strategy is not sure how valid in the primary cell. 本発明は、異なる遺伝子によってコードされる、優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とをさらに効果的にかつ確実に共発現するための方法を提供する。 The present invention provides methods for different genes by the code more efficiently and reliably co-expressing positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant. 発明の要旨本発明は、ネガティブ選択遺伝子と共にリーディングフレームにあり、かつネガティブ選択遺伝子に融合した優性のポジティブ選択遺伝子を含む選択融合遺伝子(selectable fusion gene)を提供する。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention resides in a reading frame with a negative selectable gene, and provides a selection fusion gene comprising a positive selection gene dominant fused to negative selection gene (selectable fusion gene). 本選択融合遺伝子は、単一の二機能性融合タンパク質をコードする。 This selection fusion gene encodes a single bifunctional fusion protein. このタンパク質は、宿主細胞に、優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与え得る。 This protein, the host cell, may provide a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant. 本発明の選択融合遺伝子は、ネガティブ選択のための細菌シトシンデアミナーゼ(CD)遺伝子由来のヌクレオチド配列を含有する。 Selection fusion gene of the present invention contains a bacterial cytosine deaminase (CD) nucleotide sequence from the gene for negative selection. 好ましい実施態様において、本選択融合遺伝子は、neo遺伝子由来のヌクレオチド配列に融合した細菌CD遺伝子由来のヌクレオチド配列を含有する。 In a preferred embodiment, the selected fusion gene contains a nucleotide sequence from the bacterial CD gene fused to nucleotide sequences derived from the neo gene. この遺伝子は、本明細書においてCD-neo選択融合遺伝子(配列番号1)と呼ばれる。 This gene, referred to as CD-neo selection fusion gene herein (SEQ ID NO: 1). このCD-neo選択融合遺伝子は、優性のポジティブ選択に関するG-418耐性(G-418 r )とネガティブ選択に関する5-フルオロシトシン感受性(5-FC s )とを与える。 The CD-neo selection fusion gene confers a G-418 resistant regarding positive selection of dominant (G-418 r) and 5-fluorocytosine sensitivity regarding negative selection (5-FC s). 本発明はまた、本選択融合遺伝子を含有する組換え発現ベクター(例えばレトロウイルス)、および該組換え発現ベクターを導入された細胞を提供する。 The present invention also provides recombinant expression vectors containing the present selected fusion gene (e.g. retroviruses), and introduced the recombinant expression vector cells. 本発明の選択融合遺伝子は、単一の遺伝子体として発現および調節されるので、高効率の共調節および共発現を可能とする。 Selection fusion gene of the present invention, since it is expressed and regulated as a single genetic element, to enable co-regulation and co-expression of high efficiency. 図面の簡単な説明図1は、プラスミドtgCMV/hygro/LTR、tgCMV/neo、tgCMV/hygro-CD、tgCMV/CD -hygro、tgCMV/neo-CDおよびtgCMV/CD-neoに含まれる発現カセットの図解を示す。 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1, Plasmid tgCMV / hygro / LTR, tgCMV / neo, tgCMV / hygro-CD, tgCMV / CD -hygro, illustration of the expression cassettes contained in tgCMV / neo-CD and tgCMV / CD-neo It is shown. 水平方向の矢印は、転写開始部位および転写方向を示す。 Horizontal arrows indicate the transcription initiation site and a transcription direction. LTRとラベル表示された白抜き枠は、レトロウイルスの長末端反復である。 LTR labeled displayed white frame is a long terminal repeat of retrovirus. CMVとラベル表示された白抜き枠は、サイトメガロウイルスのプロモーターである。 CMV and labeling have been white frame is a promoter of cytomegalovirus. 図2は、NIH/3T3細胞のトランスフェクトされたもののプールから調製された抽出物に関するシトシンデアミナーゼアッセイの結果を示す。 Figure 2 shows the results of cytosine deaminase assay for extracts prepared from pooled those transfected in NIH / 3T3 cells. この抽出物は、シトシンからウラシルへの変換を測定することによりアッセイされた。 The extract was assayed by measuring the conversion of cytosine to uracil. 図3は、本発明において使用されるレトロウイルスベクターtgLS(+)neoおよびtgLS(+)CD-neoのプロウイルスの構造の図解を示す。 Figure 3 shows a graphical representation of the retroviral vector tgLS (+) neo and tgLS (+) the structure of the provirus of CD-neo for use in the present invention. 図4は、非感染NIH/3T3(レーン1)、tgLS(+)neo感染NIH/3T3(レーン2)、およびtgLS(+)CD-neo感染NIH/3T3(レーン3)細胞プールに関するシトシンデアミナーゼアッセイの結果を示す。 4, uninfected NIH / 3T3 (lane 1), tgLS (+) neo-infected NIH / 3T3 (lane 2), and tgLS (+) CD-neo infected NIH / 3T3 (lane 3) cytosine deaminase assay for cell pool It shows the results. この結果は、tgLS(+)CD-neoに感染した細胞が、 高レベルのシトシンデアミナーゼ活性を発現することを示す。 The results show that cells infected with tgLS (+) CD-neo expresses high levels of cytosine deaminase activity. 図5は、非感染NIH/3T3細胞(プレートa、bおよびc)ならびにtgLS(+)neo( プレートdおよびe)またはtgLS(+)CD-neo(プレートfおよびg)レトロウイルスに感染したNIH/3T3細胞の染色されたコロニーの写真を示す。 5, uninfected NIH / 3T3 cells (plates a, b and c) and tgLS (+) neo (plates d and e) or tgLS (+) CD-neo (plates f and g) infected NIH retrovirus / show the 3T3 cell photo of the stained colonies. 細胞は、長期増殖アッセイにおいて、培地単独(プレートa)あるいはG-418(プレートb、dおよびf)またはG-418+5-FC(プレートc、eおよびg)を補充された培地中で増殖させられた。 Cells in long-term proliferation assay, are grown in medium alone (plate a) or G-418 (plate b, d and f) or G-418 + 5-FC (plate c, e and g) medium supplemented with It was. データは、非感染NIH/3T3細胞がG-418に感受性であり、そして5-FCに耐性であり、tgLS(+)neoに感染したNIH/3T3細胞がG-418および5-FCの両方に耐性であり、そしてtgLS(+)CD-neoに感染したNIH/3T3細胞がG-418に耐性であり、そして5-FCに感受性であったことを示す。 Data uninfected NIH / 3T3 cells are sensitive to G-418, and are resistant to 5-FC, both NIH / 3T3 cells infected with tgLS (+) neo is G-418 and 5-FC It is resistant, and show that tgLS (+) NIH / 3T3 cells infected with CD-neo is resistant to G-418, and was sensitive to 5-FC. 発明の詳細な説明配列番号1および配列番号2(請求の範囲の直前に示している)は、本発明のCD -neo選択融合遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の特定の実施態様を示す。 DETAILED DESCRIPTION invention sequence ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (as shown in the immediately preceding the claims) show specific embodiments of the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of CD neo selection fusion gene of the present invention. 配列表に示されたCD-neo選択融合遺伝子は、neo遺伝子(ヌクレオチド1282位〜2073位)由来の配列に連結したCD遺伝子(ヌクレオチド4位〜1281位)由来の配列を含む。 CD-neo selection fusion gene shown in the sequence listing, the neo gene (nucleotide 1282 of ~2073 position) CD gene (nucleotide position 4 ~1281 position) linked to sequences from sequences from. 定義本明細書中で使用されるように、用語「選択融合遺伝子」とは、ネガティブ選択遺伝子に融合され、かつネガティブ選択遺伝子と共にリーディングフレーム中にある優性ポジティブ選択遺伝子を含むヌクレオチド配列のことを言い、そしてそれは、細胞宿主に優性ポジティブ選択表現型およびネガティブ選択表現型を与え得る単一の二機能性融合タンパク質をコードする。 As used in the definition herein, the term "selective fusion gene" is fused to the negative selection gene, and refers to a nucleotide sequence comprising a dominant positive selectable gene which is in reading frame with a negative selectable gene and it encodes a single bifunctional fusion protein that can have cell host to dominant positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype. 「優性ポジティブ選択遺伝子」とは、細胞宿主に優性ポジティブ選択表現型を与えるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のことを言い、そして以下にさらに詳細に議論および例示される。 By "dominant positive selection gene" refers to a nucleotide sequence encoding a protein conferring a dominant positive selectable phenotype on a cellular host, and is discussed in further detail and exemplified below. 「ネガティブ選択遺伝子」とは、細胞宿主にネガティブ選択表現型を与えるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のことを言い、そしてまた以下にさらに詳細に議論および例示する。 By "negative selection gene" refers to a nucleotide sequence encoding a protein that confers a negative selectable phenotype on a cellular host, and also further discussed and illustrated in detail below. 「選択遺伝子」とは、一般に、優性ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子のことを言う。 A "selection gene", in general, refers to a dominant positive selection gene and the negative selection gene. 選択遺伝子の発現産物(すなわち、選択遺伝子によりコードされるタンパク質) がペプチド結合により融合され、そして2種のタンパク質の各々の生物学的活性の少なくとも一部分が保持されている場合には、選択遺伝子は、別の選択遺伝子「に融合され、そして別の選択遺伝子と共にリーディングフレーム中にある」。 Expression product of the selected gene (i.e., the protein encoded by the selection gene) when is fused by a peptide bond, and at least a portion of the two respective proteins biological activity is retained, the selection gene another selection gene "fused to and in reading frame with another selection gene". 本明細書中に開示されるCD-neo選択融合遺伝子に関して、CDタンパク質およびne oタンパク質がペプチド結合により融合され、そして単一の二機能性融合タンパク質として発現される場合には、CD遺伝子(シトシンデアミナーゼをコードし、5 -フルオロシトシン感受性、すなわち5-FC sのネガティブ選択表現型を与える)は、neo遺伝子(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、G-418耐性、 すなわちG-418 rの優性ポジティブ選択表現型を与える)に融合され、そしてneo遺伝子と共にリーディングフレーム中にある。 If respect CD-neo selection fusion genes disclosed herein, CD protein and ne o proteins are fused by a peptide bond and expressed as a single bifunctional fusion protein, CD gene (cytosine encoding the deaminase, 5 - fluorocytosine sensitivity, i.e. provide negative selection phenotype of 5-FC s) encodes a neo gene (neomycin phosphotransferase, dominant positive selection of G-418 resistant, i.e. G-418 r fused to give a phenotype), and in reading frame with the neo gene. 本発明の構成成分の選択遺伝子配列は、好ましくは、隣接している;しかし、 構成成分の選択遺伝子配列が、イントロンのような内部非翻訳ヌクレオチド配列で分けられている選択融合遺伝子を構築することは可能である。 Components of the selection gene sequences of the invention, preferably adjacent; however, the components of the selected gene sequence, to construct a selected fusion gene are separated by internal nontranslated nucleotide sequences, such as introns it is possible. 本発明の目的のために、選択融合遺伝子の発現は、構成成分の選択遺伝子配列の発現産物がペプチド結合により融合されている単一の二機能性融合タンパク質を生じる場合には、このような非隣接選択遺伝子配列は融合されると考えられる。 For the purposes of the present invention, the expression of a selectable fusion gene if the expression product of the selected gene sequence component results in a single bifunctional fusion protein which is fused by a peptide bond, such non adjacent selection gene sequences are considered to be fused. 「ヌクレオチド配列」とは、DNAまたはRNA配列のようなデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのヘテロポリマーのことを言う。 "Nucleotide sequence" refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides heteropolymers, such as DNA or RNA sequences. ヌクレオチド配列は、別個のフラグメントの形態であるか、またはより大きな構築物の成分として存在する。 Nucleotide sequence, either in the form of a separate fragment or as component of a larger construct. 好ましくは、ヌクレオチド配列は、標準的な生化学的方法により、例えば、クローニングベクターを使用して、配列の同定、操作、および回収を可能にする量または濃度である。 Preferably, the nucleotide sequences by standard biochemical methods, for example, using a cloning vector, the identification of sequences, operations, and is an amount or concentration to allow recovery. 組換えヌクレオチド配列は、クローニング、制限酵素分解、および連結反応の工程の種々の組み合わせの産物である。 Recombinant nucleotide sequence, cloning, the product of various combinations of restriction enzymes degradation, and ligation steps. この工程は、 自然系において見出される相同な配列と区別可能な構造コード配列を有する構築物を生じる。 This process results in a construct having sequences homologous with distinct structural coding sequences found in the natural system. 一般に、構造コード配列、例えば、本発明の選択融合遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチドフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられて、組換え転写単位において発現され得る合成遺伝子を提供し得る。 In general, structural coding sequence, for example, a nucleotide sequence encoding a selectable fusion genes of the present invention, nucleotide fragments and short oligonucleotide linkers, or assembled from a series of oligonucleotides, synthetic gene that is capable of being expressed in a recombinant transcriptional unit It can provide. このような配列は、好ましくは、真核生物の遺伝子中に典型的に存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンにより中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供される。 Such sequences are preferably provided in the form of an open reading frame uninterrupted by internal nontranslated sequences, i.e. introns typically present in eukaryotic genes. 関連の選択遺伝子配列を含むゲノムDNAは、好ましくは、選択遺伝子をコードする適切なヌクレオチド配列を得るために使用される;しかし、cDNAフラグメントもまた使用され得る。 Genomic DNA containing the relevant selectable gene sequences is preferably used to obtain appropriate nucleotide sequences encoding selectable genes; however, cDNA fragments may also be used. このような配列がコード領域の操作または発現を妨げない場合には、非翻訳DNAの配列は、 オープンリーディングフレームから5'側または3'側に存在し得るか、あるいはオープンリーディングフレーム内に存在し得る。 If such sequences do not interfere with manipulation or expression of the coding region, the sequence of the untranslated DNA, either may be present in the open reading frame 5 'or 3', or present in the open reading frame obtain. しかし、いくつかの遺伝子は、ある宿主における適切な発現に必要であるイントロンを含み得る。 However, some genes may include introns is necessary for proper expression in certain hosts. 例えば、HPRT選択遺伝子は、胚性幹(ES)細胞における発現に必要であるイントロンを含む。 For example, HPRT selectable gene includes introns are required for expression in embryonic stem (ES) cells. 上記で示唆したように、本発明のヌクレオチド配列はまた、RNA配列を含み得る。 As suggested above, the nucleotide sequences of the present invention may also comprise RNA sequences. 例えば、そこでは、そのヌクレオチド配列は細胞宿主を感染させるためのレトロウイルス中にRNAとしてパッケージされる。 For example, where its nucleotide sequence is packaged as RNA in a retrovirus for infecting a cellular host. レトロウイルス発現ベクターの使用は、下記にさらに詳しく議論される。 The use of retroviral expression vectors are discussed in more detail below. 用語「組換え発現ベクター」とは、トランスフェクションまたはウイルス感染により標的細胞中に形質導入され得、そして選択融合遺伝子の発現をコードする形態のDNAまたはRNAの複製可能な単位のことを言う。 The term "recombinant expression vector" refers to a transduced obtained, and DNA or RNA of replicable unit forms of encoding the expression of a selected fusion gene into the target cells by transfection or viral infection. この選択融合遺伝子は、遺伝子発現において調節の役割を有する1つまたは複数の遺伝的要素、例えば、転写開始配列および転写終止配列ならびに翻訳開始配列および翻訳終止配列の制御下で、mRNAへ転写され、そしてタンパク質に翻訳される。 The selection fusion gene, one or more genetic elements having a regulatory role in gene expression, for example, under the control of transcriptional initiation sequences and transcription termination sequences and translation initiation and termination sequences are transcribed into mRNA, and it is translated into protein. 本発明の組換え発現ベクターは、細菌細胞において複製され、かつ例えば、カルシウムホスフェート沈澱、エレクトロポレーションまたは他の物理的な導入方法により標的細胞中に直接トランスフェクトされるDNA構築物の形態を取り得る。 The recombinant expression vectors of the present invention may take the form of replicated in bacterial cells, and for example, calcium phosphate precipitation, electroporation or other physical DNA constructs directly transfected into target cells by introduction method . RNA構築物の形態を取る組換え発現ベクターは、例えば、プロウイルスDNAベクターを用いて予めトランスフェクトされ、そしてプロウイルスDNAのRNA転写物を含むレトロウイルスを生じる適切な「パッケージング」細胞株によりパッケージされる感染性レトロウイルスの形態であり得る。 The recombinant expression vector in the form of RNA constructs may, for example, packages are pre transfected with proviral DNA vector and the proviral DNA RNA transcript suitable "packaging" produce retroviruses containing cell lines It may be in the form of infectious retroviruses being. 宿主細胞は、レトロウイルスで感染させられ、そしてレトロウイルスRNAは、宿主細胞の染色体DNA中に安定に組み込まれてプロウイルスを形成する2本鎖DNA中間体への逆転写により複製される。 Host cells are infected with a retrovirus, and retroviruses RNA is stably integrated into the host chromosome DNA of a cell is replicated by reverse transcription into a double-stranded DNA intermediate to form a provirus. 次いで、プロウイルスDNAは、宿主細胞中で発現されて、DNAによってコードされるポリペプチドを生成する。 Then, proviral DNA is expressed in a host cell to produce the polypeptide encoded by the DNA. 従って、本発明の組換え発現ベクターは、感染性レトロウイルス内に存在するRNA構築物だけでなく、適切な宿主細胞内の染色体DNA中に安定に組み込まれたレトロウイルスRNAゲノムのDNA逆転写物、またはそのクローン化コピーを包含するプロウイルスDNAのコピー、もしくはレトロウイルスDNAの組み込まれていない中間体形態のクローン化コピーも含む。 Accordingly, recombinant expression vectors of the present invention, an infectious retrovirus as well RNA construct present in the viral, DNA reverse transcripts of a retrovirus RNA genome stably integrated into chromosomal DNA in a suitable host cell, or including its cloned copies of proviral DNA comprising the copy or clone a copy of the intermediate form which is not built-in retroviral DNA,. プロウイルスDNAは、プロウイルス配列が感染された宿主細胞において発現される場合、mRNAに転写されそしてタンパク質に翻訳される選択された構造DNA配列に独立して作動可能に関連する転写因子を含む。 Proviral DNA, when proviral sequences are expressed in host cells infected, including transcription factors associated operably independently of being transcribed into mRNA and protein translated is selected structure DNA sequence. 直接的トランスフェクションに使用される組換え発現ベクターは、 細菌宿主細胞においてベクターの複製を可能にするDNA配列を含む。 The recombinant expression vectors used for direct transfection comprises a DNA sequence enabling the vector to replicate in a bacterial host cell. 本発明における使用に適する種々の組換え発現ベクターを、以下に記載する。 Various recombinant expression vectors suitable for use in the present invention are described below. 「(形質)導入する」とは、選択融合遺伝子を含む組換え発現ベクターの細胞中への導入を意味する。 The term "(trait) introducing" means the introduction into cells of a recombinant expression vector containing a selection fusion gene. 形質導入法は、本質的に物理的であり得(すなわち、トランスフェクション)、すなわちそれらの方法は、RNAに転写され、感染性ウイルス粒子中にパッケージされ、そして標的細胞を感染させるために使用され、それによって所望の遺伝材料を送達し(すなわち、感染)得るDNA をコードする組換えウイルスベクター(レトロウイルスなど)の使用に頼り得る。 Transduction method is essentially physically and is obtained (i.e., transfection), namely those methods, is transferred to RNA, packaged into infectious viral particles and used to infect target cells thereby it may rely on the use of to deliver the desired genetic material (i.e., infection) obtained recombinant viral vector encoding the DNA (such as a retrovirus). 多くに異なるタイプの哺乳動物の遺伝子導入および組換え発現ベクターが開発されてきた(例えば、MillerおよびCalos編「Gene Transfer Vectors for Mammal lan Cells」Current Comm.Mol.Biol.、(Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1987)を参照のこと)。 Gene transfer and recombinant expression vectors of many different types of mammalian have been developed (e.g., Miller and Calos eds "Gene Transfer Vectors for Mammal lan Cells" Current Comm.Mol.Biol., (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987) see). 裸のDNAは、カルシウムホスフェートトランスフェクション(Bermanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 81:7176、1984)、DEAE-デキストラントランスフェクション(McCutchanら、J.Natl.Cancer Inst.41:351 、1986;Luthmanら、Nucl.Acids Res.11:1295、1983)、プロトプラスト融合(D eansら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 81:1292、1984)、エレクトロポレーション(Potterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 81:7161、1984)、リポフェクション(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413、1987)、ポリブレンヘキサジメスリンブロミドトランスフェクション(Polybrene hexadimethrine br omide transfection)(KawaiおよびNishizawa、Mol.Cell.Biol.4:1172、1984) および細胞膜のレーザーマイクロ穿刺による直接遺伝子導入(Taoら、Proc.Natl .Acad.Sci.U SA 84:4180、1987)を包含する(しかし、限定されない)多くの技法のうちいずれか1つ Naked DNA include calcium phosphate transfection (Berman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 81: 7176,1984), DEAE- dextran transfection (McCutchan et al., J.Natl.Cancer Inst.41: 351, 1986; Luthman et al., Nucl.Acids Res.11: 1295,1983), protoplast fusion (D eans et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 81: 1292,1984), electroporation (Potter et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84 81: 7161,1984), lipofection (Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413,1987), polybrene hexa dimethyl Surin bromide transfection (Polybrene hexadimethrine br omide transfection) (Kawai and Nishizawa, Mol.Cell.Biol.4: 1172,1984): encompasses and direct gene transfer by laser micro puncture of the cell membrane (4180,1987 Tao et al, Proc.Natl .Acad.Sci.U SA 84) (but not limited) any one of a number of techniques を用いてトランスフェクションにより哺乳動物の細胞中に物理的に導入され得る。 It may be physically introduced into a cell of a mammal by transfection with. 組換え感染性ウイルス粒子を遺伝子送達に利用する種々の感染技法が開発されてきた。 Various infectious techniques that utilize recombinant infectious virus particles for gene delivery have been developed. これは、本発明への好ましいアプローチを表す。 This represents a preferred approach to the present invention. この方法において使用されてきたウイルスベクターは、シミアンウイルス40(SV40;Karlssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 82:158、1985)、アデノウイルス(Karlssonら、EMBOJ.5:2377、1986)、アデノ関連ウイルス(LaFaceら、Virology 162:483、1 988)およびレトロウイルス(Coffin、1985、17〜71頁、Weissら編、RNA Tumor Vi ruses、第2版 Vol.2、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)由来のウイルスベクターを包含する。 Viral vectors that have been used in this way, simian virus 40 (SV40; Karlsson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 82: 158,1985), adenovirus (Karlsson et al., EMBOJ.5: 2377,1986 ), adeno-associated virus (LaFace et al., Virology 162: 483,1 988) and retroviruses (Coffin, pp 1985,17~71, Weiss et al., eds., RNA Tumor Vi Ruses, second Edition Vol.2, Cold Spring Harbor Laboratory , including the virus vector of New York) derived. 従って、遺伝子導入および発現の方法は、数多く存在するが、哺乳動物細胞において遺伝子材料を導入および発現するように本質的に機能する。 Accordingly, methods of gene transfer and expression are present numerous, essentially functions to introduce and express genetic material in mammalian cells. 上記の技法のいくつかは、造血細胞またはリンパ細胞を形質導入するために使用されてきたが、これらは、カルシウムホスフェートトランスフェクション(Bermanら、上記、1984)、プロトプラスト融合(Deansら、上記、1984)、エレクトロポレーション(Cannら、Oncogene 3:123、1988)、ならびに組換えアデノウイルス(Karlssonら、上記;Reutherら、Mol.Cell.Biol.6:123、1986)、アデノ関連ウイルス(LaFaceら、上記)およびレトロウイルスベクター(Overellら、 Oncogene 4:1425、1989)による感染を包含する。 Some of the above techniques, but hematopoietic cells or lymphoid cells have been used to transduce, these are calcium phosphate transfection (Berman et al., Supra, 1984), protoplast fusion (Deans et al., Supra, 1984 ), electroporation (Cann et al., Oncogene 3: 123,1988), as well as recombinant adenovirus (Karlsson et al., supra; Reuther et al., Mol.Cell.Biol.6: 123,1986), adeno-associated virus (LaFace et al. including 1425,1989) the infection by:, supra) and retrovirus vectors (Overell et al., Oncogene 4. 1次性Tリンパ球は、エレクトロポレーション(Cannら、上記、1988)およびレトロウイルス感染(Nishiharaら、Cancer Res.48 :4730、1988;Kasidら、上記、1990)により首尾良く形質導入されてきた。 The primary T-lymphocytes, electroporation (Cann et al., Supra, 1988) and retroviral infection (Nishihara et al., Cancer Res.48: 4730,1988; Kasid et al., Supra, 1990) successfully been transduced by It was. 選択融合遺伝子の構築本発明の選択融合遺伝子は、ネガティブ選択遺伝子と融合された優性ポジティブ選択遺伝子を包含する。 Selection fusion gene of the present invention constructed of a selected fusion gene comprises a dominant positive selectable gene fused to a negative selection gene. 選択遺伝子は、一般的に、例えば、抗生物質耐性表現型を与え得、または(優性ポジティブ選択に対して)独立栄養要求を供給し得、もしくは(ネガティブ選択に対して)毒性代謝物を活性化し得るタンパク質をコードする遺伝子を包含する。 Selection gene will generally contain, for example, to obtain given antibiotic resistance phenotype, or obtain supplies (dominant to positive selection) independently auxotrophic or (against the negative selection) the toxic metabolites activated including the gene encoding the obtained protein. 二機能性融合タンパク質をコードするDNA配列は、組換えDNA技法を使用して構築され、優性ポジティブ選択性遺伝子およびネガティブ選択遺伝子をコードする個々のDNAフラグメントを適切な発現ベクターに組み立てる。 DNA sequences encoding the bifunctional fusion protein is constructed using recombinant DNA techniques, assembled individual DNA fragments encoding a dominant positive selection gene and negative selection gene into an appropriate expression vector. ある選択遺伝子の3'末端は、他の選択遺伝子の5'末端に連結され、フレーム内の配列のリーディングフレームにより、mRNA配列を単一の生物学的に活性な二機能性融合タンパク質に翻訳することが可能になる。 3 of a selected gene 'end, 5 Other selection genes' are ligated to the ends, the reading frame of the sequence in the frame, to translate the mRNA sequences into a single biologically active bifunctional fusion protein it becomes possible. 選択融合遺伝子は、単一のプロモーターの制御の下で発現される。 Selection fusion gene is expressed under the control of a single promoter. 優性ポジティブ選択遺伝子は、宿主細胞中に形質導入される際に、安定な形質導入体のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子である。 Dominant positive selection gene, when transduced into a host cell a gene expressing a dominant phenotype that allows positive selection of stable transductants. 本発明の優性ポジティブ選択遺伝子は、好ましくは、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neoまたはaph)(Colbere-Garapinら、J.Mol.Biol.150:1、1981;Sou thernおよびBerg、J.Mol.Appl.Genet.1:327、1982);および、ハイグロマイシン耐性(Hm r )の選択表現型を与えるハイグロマイシン-Bホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hphまたは「hygro」)(Santerreら、Gene 30:147、1984;Sugdenら、 Mol.Cell.Biol.5:410、1985;ATCC受託番号39820として、プラスミドpHEBol から入手可能)から成る群より選択される。 Dominant positive selection gene of the present invention, preferably, aminoglycoside phosphotransferase gene (neo or aph) from Tn5 encoding resistance to the antibiotic G418 (Colbere-Garapin et al., J.Mol.Biol.150: 1,1981; sou Thern and Berg, J.Mol.Appl.Genet.1: 327,1982); and hygromycin resistance (Hm r) hygromycin -B phosphotransferase gene conferring selective phenotype (hph or "hygro") ( Santerre Ra, Gene 30: 147,1984; Sugden Ra, Mol.Cell.Biol.5: 410,1985; as ATCC Deposit No. 39820, is selected from the group consisting of available) from plasmid PHEBol. ハイグロマイシンBは、転位を妨害して誤翻訳を促進することによりタンパク質合成を阻害するアミノグリコシド抗生物質である。 Hygromycin B is an aminoglycoside antibiotic that inhibits protein synthesis by facilitating the erroneous translation interfere with dislocation. hph遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンBをリン酸化して無毒化することにより、hph遺伝子で形質導入された細胞にHm rを与える。他の受容可能な優性ポジティブ選択遺伝子は、以下を包含する:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする細菌neo遺伝子(Beckら、Gene 19:327、1982);ミコフェノール酸に対する耐性をコードする大腸菌由来のキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt)(MulliganおよびBerg、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 78:2072、1981);プリンの生合成に必要であり、かつ増加したレベルのDHFRを構成的に発現する細胞を選択するために薬物メトトレキセート(MTX )により競合的に阻害され得るネズミ細胞または大腸菌由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(SimonsenおよびLevinson、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495、1983;Simonsenら、Nucl.Acids Res.16:2235、1988);S. typhimuri umヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)遺伝子(Hartmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:80 47、1988);大腸菌トリプトファンシンターゼβサブユニット(trpB)遺伝子(Hart manら、上記);ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(pac)遺伝子( Varaら、Nucl.Acids Res.14:4117、1986);アデノシンデアミナーゼ(ADA)遺伝子(Daddonaら、J.Biol.Chem.259:12101、1984);多重薬剤耐性(MDR)遺伝子(K aneら、Gene 84:439、1989);マウスオルニチンデカルボキシラーゼ(OCD)遺伝子(GupbaおよびCoffino、J.Biol.Chem.160:2941、1985);大腸菌アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ触媒サブユニット(pyrB)遺伝子(RuizおよびWahl、Mol .Cell.Biol.6:3050、1986);およびアスパラギンシンテターゼをコードする大腸菌asnA遺伝子(Cartierら、Mol.Cell.Biol.7:1623、1987)。ネガティブ選択遺伝子は、宿主細胞中に形質導入される際に、安定な形質導入体のネガティブ選択(すなわち、脱離)を可能にする表現型を発現する遺伝子である。本発明の好ましいネガティブ選択遺伝子は、5-フルオロシトシン感受性を与えるシトシンデアミナーゼをコードする細菌CD遺伝子(Genbank受託番号X63656) である。ネガティブ選択に適切な他の酵素は、ホスフェート含有プロドラッグ(エトポシド-ホスフェート、ドキソルビシン-ホスフェート、ミトマイシンホスフェートなど)を毒性脱リン酸化代謝物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ; スルフェート含有プロドラッグをフリードラッグに変換するのに有用なアリールスルファターゼ;ペプチド含有プロドラッグをフリードラッグに変換するのに有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン(カテプシンBおよびLなど);D-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なD-アラニルカルボキシペプチダーゼ;グリコシル化プロドラッグをフリードラッグに変換するのに有用な炭水化物開裂酵素(β-ガ クトシダーゼおよびノイラミニダーゼなど);β-ラクタムを用いて誘導される薬物をフリードラッグに変換するのに有用なβ-ラクタマーゼ;およびフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基をそれぞれ用いて、窒素原子のところで誘導された薬物をフリードラッグに変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ(ペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼなど)を包含するが、これらに限定されない。他の酵素プロドラッグの組み合わせは、パラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタミン酸を伴う細菌(例えば、シュードモナス由来)酵素カルボキシペプチダーゼG2を包含する。この化合物由来のグルタミン酸部分の開裂は、毒性安息香酸マスタードを放出する。ペニシリン-Vアミダーゼは、ドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセトアミド誘導体を毒性代謝物に変換する。遺伝子コードの縮重のために、同一アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変異があり得る;例示的なDNAの実施態様は、配列表の配列番号1においてヌクレオチド配列に対応する実施態様である。このような変異体は、1種またはそれ以上の置換、欠失、 または付加を有する改変DNAまたは改変アミノ酸配列を有し、その正味の効果は、生物学的活性を保持し、そしてこのような変異体は、本明細書中で開示される特定の配列に代わって置換され得る。 CDおよびneoを含む選択融合遺伝子の配列が、CDおよびneoの配列の全てまたは一部分を含み、そして適度な厳しい条件(50 ℃、2×SSC)下で配列表の配列番号1のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能であり、そして生物学的に活性な融合タンパク質を発現する場合、それらは等価である。 「生物学的に活性な」融合タンパク質は、構成成分の選択遺伝子の選択表現型を与え得るに十分なアミノ酸配列の類似性を、本明細書中に開示される本発明の特定の実施態様と共有する。好ましい実施態様において、細菌シトシンデアミナーゼ(CD)遺伝子由来の配列は、細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子由来の配列と融合される。得られた選択融合遺伝子(CD-neo選択融合遺伝子と呼ばれる)は、G-418 r および5-GC sを与え、かつ優性ポジティブおよびネガティブ選択表現型が単一の遺伝的実体として発現および調節され得る二機能性融合タンパク質をコードする。CD-neo選択融合遺伝子は、ガンシクロビルを投与されているらしい患者集団において特に有利であり得る。 組換え発現ベクター本発明の選択融合遺伝子は、この選択融合遺伝子が導入される宿主細胞を同定、単離、または除去するために用いられる。この選択融合遺伝子は、宿主細胞内に、この選択融合遺伝子を含む組換え発現ベクターを形質導入することにより宿主細胞に導入される。このような宿主細胞には、哺乳動物細胞または昆虫細胞のような高等真核生物起源に由来する細胞タイプ、または下等原核生物起源に由来する細胞タイプが包含される。 上記のように、このような選択融合遺伝子は、好ましくは、この選択融合遺伝子を細胞内で発現し、そして選択表現型を与え得る組換え発現ベクターの成分として特定の細胞内に導入される。このような組換え発現ベクターには、一般に、 適切な転写または翻訳制御配列に作動可能に連結された選択融合遺伝子を含む合成または天然ヌクレオチド配列、例えば、複製開始点、制御転写に対する任意のオペレーター配列、発現されるべき遺伝子に連結した適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の5'または3'フランキング非転写配列、および5'または3'非翻訳配列(例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナーおよびアクセプター部位)、ならびに転写停止配列が包含される。このような調節配列は、哺乳動物、ウイルス、微生物、または昆虫の遺伝子から誘導され得る。ヌクレオチド配列は、それらが機能的に互いに関連している場合、作動可能に連結している。例えば、プロモーターは、それが選択融合遺伝子の転写を制御する場合には、選択融合遺伝子に作動可能に連結している;または、リボソーム結合部位は、選択融合遺伝子を単一の二機能性融合タンパク質に翻訳させるようにそれが配置される場合には、選択融合遺伝子に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したとは、隣接していることを意味する。 哺乳動物、細菌、および酵母細胞宿主に用いられる特異的な組換え発現ベクターは、Pouwelsら、(Cloning Vectors: A Laboratory Manual,Elsevier,New Yo rk,1985)に記載されており、当該分野で周知である。動物細胞に用いられる組換え発現ベクターの詳細な説明は、Rigby,J.Gen.Virol.64:255,1983);Eld erら、Ann.Rev.Genet.15:295,1981;およびSubramaniら、Anal.Biochem.1 35:1.1983に見出され得る。適切な組換え発現ベクターはまた、ウイルスベクター、特にレトロウイルスを包含し得る(以下に詳細に述べる)。 本発明の選択融合遺伝子は、好ましくは強力なエンハンサーおよびプロモーター発現カセットの転写制御下に置かれる。このような発現カセットの例には、ヒトサイトメガロウイルス即時型(HCMV-IE)プロモーター(Boshartら、Cell 41:521 ,1985)、β−アクチンプロモーター(Gunningら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5831、1987)、ヒストンH4プロモーター(Guildら、J.Virol.62:3795,1988) 、マウスメタロチオネインプロモーター(Mclvorら、Mol.Cell.Biol.7:838,1987)、ラット成長ホルモンプロモーター(Millerら、Mol.Cell Biol.5:431,1985)、ヒトアデノシンデアミナーゼプロモーター(Hantzapoulosら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:351 9,1989)、HSV TKプロモーター(Tabinら、Mol.Cell.Biol.2:426,1982)、α- 1アンチトリプシンエンハンサー(Pengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8146 ,1988)、および免疫グロブリンエンハンサー/プロモーター(Blankensteinら、 Nucleic Acid Res.16:10939,1988)、SV40初期または後期プロモーター、アデノウイルスの2つの主要な後期プロモーター、もしくはポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルス、あるいは他のレトロウイルスまたはアデノウイルスから誘導された他のウイルスのプロモーターが包含される。免疫グロブリン(Ig)遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー要素は、Bリンパ球に対する顕著な特異性を与える(Banerjiら、Cell 33:729,1983;Gilliesら、Cell 33:717,1983;Mas onら、Cell 41:479,1985)が、これらの要素は、赤血球細胞でのみ、β-グロブリン遺伝子機能の転写を制御する(van Assendelftら、Cell 56:969,1989)。周知の制限技術および連結(ligation)技術を用いて、適切な転写制御配列は、種々のDNA供給源から切り出され、そして本発明に従って発現されるべき、非損傷の選択融合遺伝子と作動可能な関係で統合(integrate)され得る。従って、多くの転写制御配列は、レトロウイルスベクターにうまく用いられ、感染細胞において挿入された遺伝子を発現させ得る。 レトロウイルスレトロウイルスは、真核生物細胞内に本発明の選択融合遺伝子を非常に効率的に形質導入するために用いられ得、そして一次(primary)細胞内に選択融合遺伝子を送達するのに好ましい。さらに、レトロウイルスによる組み込みは、制御された様式で起こり、その結果、細胞毎に新たな遺伝情報の1個または数個のコピーを安定に組み込む。 レトロウイルスは、ゲノムがRNA形態である1つのクラスのウイルスである。 レトロウイルスのゲノムRNAは、以下を包含するウイルス性タンパク質をコードするトランスに作用する遺伝子配列を含む:ウイルス粒子の核においてRNAと関連する(gag領域によりコードされる)構造タンパク質;DNA相補物を作製する(po l領域によりコードされる)逆転写酵素;および粒子のリポタンパク質エンベロープに存在し、そして感染の際、ウイルスを宿主細胞表面に結合させる(env領域によりコードされる)エンベロープ糖タンパク質。レトロウイルスの複製は、 シスに作用する要素、例えば、プロウイルスDNAおよびウイルスの複製に必要な他のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターにより調節される。シスに作用する要素は、レトロウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する約600塩基対の、2個の同一の未翻訳の長い末端繰り返し(LTR)内にあるか、またはそれに隣接している。レトロウイルスは、ウイルスにコードされた、RNA指向性(RNA-directed)DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いて、逆転写により二本鎖DNA中間体にそれらのRNAゲノムをコピーすることにより複製する。DNA中間体は、鳥類または哺乳動物の宿主細胞の染色体DNA内に組み込まれる。組み込まれたレトロウイルスDNAはプロウイルスと呼ばれる。 プロウイルスは、感染性ウイルス粒子の形成のためのRNA鎖合成用テンプレートとして機能する。プロウイルスの前進転写および感染性ウイルス粒子への組立(a ssembly)は、ウイルスの複製に必要な内因性のトランスに作用する遺伝子を有する適切なヘルパーウイルスの存在下で起こる。 レトロウイルスは、レトロウイルスのプロウイルス形態の内因性のトランスに作用する遺伝子の1つまたはそれ以上を、組換え治療遺伝子、または本発明の場合には、選択融合遺伝子と置き換え、次いで組換えプロウイルスを細胞内に形質導入することにより、ベクターとして用いられる。トランスに作用する遺伝子には、gag、pol、およびenv遺伝子が包含され、これらは、それぞれ、ウイルスコアのタンパク質、酵素である逆転写酵素、およびエンベロープタンパク質の成分(constituents)をコードする。これらは全て、非損傷ビリオンの産生に必要である。トランスに作用する、gag、pol、およびenv遺伝子の欠失した組換えレトロウイルスは、複製に必須であるタンパク質を合成し得ず、従って、複製欠損(rep lication-defective)である。このような複製欠損組換えレトロウイルスは、パッケージング細胞株を用いて増殖される。これらのパッケージング細胞株は、非損傷ビリオンの産生に必要な全てのトランスに作用する遺伝子配列を与える、組み込まれたレトロウイルスゲノムを含む。このようなパッケージング細胞株内に形質導入されたプロウイルスDNA配列は、RNA内に転写され、そして選択融合遺伝子(および/または治療遺伝子)を含む感染性ビリオン内にキャプシド化されるが、トランスに作用する遺伝子産生物であるgag、p ol、およびenvを欠き、他の細胞に感染するためにRNAを粒子内にキャプシド化するために必要なgag、pol、およびenvタンパク質を合成し得ない。従って、得られる感染性レトロウイルスベクターは、他の細胞を感染し得、そして選択融合遺伝子を宿主細胞の細胞性DNA内に組み込み得る。Mannら(Cell 33:153,1983)は、 例えば、ヘルパーウイルスを含まない組換えレトロウイルスのストックを産生するために用いられ得る種々のパッケージング細胞株(例えば、Ψ2)の開発について記載している。エコトロピック(ecotropic)ウイルスエンベロープ(例えば、Ψ2)をコードするトランスに作用する要素を有する細胞株におけるキャプシド化により、エコトロピック(限定された宿主範囲)子孫ウイルスが提供される。あるいは、両種性パッケージング遺伝子を含む細胞株(例えば、PA317、ATCC CRL 9078;MillerおよびButtimore,Mol.Cell.Biol.6:2895,1986)における組立により、両種性(広範な宿主範囲)子孫ウイルスが提供される。 多数のプロウイルス構築物が、外来遺伝子を発現するのにうまく用いられている(例えば、Coffin,Weissら(編)、RNA腫瘍ウイルス、第2版、第2巻、(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1985,pp.17-71 を参照)。大抵のプロウイルス要素は、ネズミレトロウイルスから誘導される。 しかし、本発明に従う使用に適用可能なレトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳動物細胞供給源から誘導される。適切なレトロウイルスは、レトロウイルスベクターを用いて形質導入されるべき新たな遺伝物質の受容体であるべき細胞を感染し得なければならない。適切なレトロウイルスの例には、鳥類レトロウイルス(例えば、鳥類赤芽球症ウイルス(AEV)、鳥類白血病ウイルス(ALV)、鳥類骨髄芽球症ウイルス(AMV)、鳥類肉腫ウイルス(ASV)、フジナミ肉腫ウイルス(FuSV)、脾臓壊死ウイルス(SNV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV);ウシ白血病ウイルス(B LV);ネコ白血病ウイルス(FeLV)またはネコ肉腫ウイルス(FeSV)のようなネコレトロウイルス;ネズミ白血病ウイルス(MuLV)のようなネズミレトロウイルス;マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)、およびネズミ肉腫ウイルス(MSV);ならびにヒトT細胞リンパ球ウイルス1および2(HTLV-1および-2)、および類人猿肉腫ウイルス(SSV)のような霊長類レトロウイルスが包含される。多くの他の適切なレトロウイルスが当業者に公知である。レトロウイルスの分類については、Weissら( 編)、RNA腫瘍ウイルス、第2版、第2巻、(Cold Spring Harbor Laboratory,N ew York,1985,pp.1-160)のTeichにより提供されている。本発明と組み合わせた使用に好ましいレトロウイルスは、モロネイネズミ白血病ウイルス(MoMLV)、モロネイネズミ肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイネズミ肉腫ウイルス(HaMSV)、およびキルステンネズミ肉腫ウイルス(KiSV)として知られているネズミレトロウイルスである。Mo MSVゲノム由来のレトロウイルスベクターを構築するために必要な配列は、pMV(A TCC37190)のようなpBR322プラスミド配列との組み合わせで得られ得るが、K-BAL B細胞におけるKiSVの細胞株産生体は、ATCC CCL 163.3として寄託された。RSV L TRおよび非損傷ネオマイシン薬物耐性マーカーを含むpBR322から誘導されたpRSV neoの寄託物は、受託No.37198でATCCから入手可能である。SNVゲノムを含むプラスミドpPB101は、ATCC 45012として入手可能である。上記レトロウイルスのウイルスゲノムは、感染宿主細胞の染色体DNA内にそれらのウイルスゲノムを組み込み得るが、一旦組み込まれると、感染性ウイルスが導入される細胞が、機能的に活性なトランスに作用するウイルスタンパク質をコードする他のプロウイルス要素を含まなければ、感染性ウイルスを産生する複製を起こし得ない、複製欠損のレトロウイルスベクターを構築するのに用いられる。 レトロウイルスにより形質導入される本発明の選択融合遺伝子は、レトロウイルスのLTR内に組み込まれたエンハンサーおよびプロモーターの転写制御下に選択融合遺伝子を置くか、または、それらをLTR間に挿入された異種転写制御配列の制御下に置くかによって発現される。異種転写制御配列およびLTR転写制御配列の両方の使用により、ベクターにおいて治療遺伝子および選択融合遺伝子の同時発現が可能となり、従って、所望の治療遺伝子産生物をコードする特異的ベクター配列を発現する細胞の選択が可能となる。高レベルの発現を得るには、治療遺伝子および/または選択融合遺伝子を、レトロウイルス内で、強力な異種エンハンサーおよびプロモーター発現カセットの転写制御下におく必要があり得る。多くの異なる異種エンハンサーおよびプロモーターが、レトロウイルスベクターにおいて遺伝子を発現させるために用いられている。このようなエンハンサーまたはプロモーターは、哺乳動物ゲノムを含む、ウイルス供給源または細胞供給源から誘導され得、そして好ましくは、本来、構成性(constitutive)である。このような異種転写制御配列は、組換え発現ベクターに関して上記されている。形質導入細胞で発現されるように、上記遺伝子移入法のいずれかにより導入されるDNA配列は、通常、RNAポリメラーゼ11プロモーターの制御下で発現される。 特に好ましい組換え発現ベクターには、pLXSN、pLNCX、およびpLNL6、ならびにそれらの誘導体が包含される。これらは、MillerおよびRosman、Biotechnique s 7:980,1989に記載されている。これらのベクターは、異種DNAをレトロウイルスLTRまたはCMVプロモーターの転写制御下で発現し得、そしてneo遺伝子をSV40 初期領域プロモーターまたはレトロウイルスLTRの制御下で発現し得る。本発明で使用するために、neo遺伝子は、本明細書中に開示されている二機能性で選択融合遺伝子、例えば、CD-neo選択融合遺伝子と置き換えられる。有用な複製欠損レトロウイルスの構築は、日常技術の問題である。得られる組換えレトロウイルスは、感染宿主細胞の染色体DNA内に組み込まれ得るが、一旦組み込まれると、感染性ウイルスが導入される細胞が、機能的に活性なトランスに作用するウイルスタンパク質をコードする他のプロウイルス挿入物を含まなければ、 感染性ウイルスを産生する複製を起こし得ない。 二機能性選択融合遺伝子の使用本発明の選択融合遺伝子は、この選択融合遺伝子が導入される体細胞(somatic cell)のような細胞を同定、単離、または除去する手段として遺伝子治療において使用するのに特に好ましい。遺伝子治療においては、体細胞は患者から取り出され、治療遺伝子および本発明の選択融合遺伝子を含む組換え発現ベクターで形質導入され、次いで患者に再導入される。遺伝子治療のビヒクルとして用いられ得る体細胞には、造血(骨髄由来)細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、および線維芽細胞が包含される(Friedman,Science 244:1275,1989)。あるいは、 遺伝子治療は、インビボで体細胞を形質導入する注入可能なベクターを使用することにより達成され得る。ヒトにおける遺伝子移入の可能性は例証されている(K asidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:473,1990);Rosenbergら、N.Engl. J.Med.323:570,1990)。 本発明の選択融合遺伝子は、インビボで遺伝的に改変された細胞を除去するのに特に有用である。ネガティブ選択表現型を発現する細胞のインビボでの除去は、細胞グラフトを切除(ablate)する手段として遺伝子治療において特に有用であり、従って、遺伝子治療手順を逆転させる手段を提供する。 例えば、抗ヘルペスウイルス薬剤ガンシクロビルを、免疫グロブリンプロモーターからHSV-I TK遺伝子を発現するトランスジェニック動物に投与すると、HSV-I TK遺伝子を発現する細胞の選択的な切除が起こることが示されている(Heymanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2698,1989)。同じトランスジェニックマウスを用いて、GCVもアーベルソン白血病ウイルス誘導リンパ腫の完全な退行(regr ession)を誘導することが示された(Mooltenら、Human Gene Therapy 1:125,199 0)。第三の研究では、ネズミ肉腫(K3T3)をHSV-I TKを発現するレトロウイルスに感染させ、そして同系のマウスに移植した。肉腫細胞により誘導された腫瘍は、 GCVで治療した後、完全に根絶された(MooltenおよびWells、J.Natl.Cancer In st.82:297,1990)。 本発明の選択融合遺伝子はまた、Oldfieldら、Human Gene Therapy 4:39,199 3により実施されたように、腫瘍切除治療において有用である。tgLS(+)CD-neo レトロウイルスベクターを産生するパッケージング細胞(約10 6 〜10 9 )は、腫瘍内で(intra-tumorally)接種される。数日後(その間に、新たに産生されたレトロウイルスが、近接する急速に増殖する腫瘍細胞を感染する)、(tgLS(+)CD-neoレトロウイルスベクターが用いられるときには)患者に体重1kg当たり約50〜200mgの5-FCを毎日(経口または静脈経由で)与え、感染した腫瘍細胞を選択的に切除する。 本発明の二機能性選択融合遺伝子はまた、相同的組換えによる遺伝子改変を促進するために用いられ得る。Reidらは、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4299, 1990は、最近、HPRT遺伝子を用いる、ES細胞における相同的組換え(「イン−アウト」相同的組換え)による遺伝子改変の2工程手順を記載した。簡潔に述べると、この手順には以下の2工程が含まれる:「イン」工程、ここでは、HPRT遺伝子が標的遺伝子配列に埋め込まれ、HPRT宿主細胞内にトランスフェクトされ、そして標的位置にHPRT遺伝子が取り込まれた相同的組換え体が、HAT培地におけるそれらの増殖およびPCRを用いるゲノム分析により同定される。第2の「アウト」工程では、標的遺伝子配列内に埋め込まれた所望の置換配列を含む(しかしHP RT遺伝子を有さない)構築物を細胞内にトランスフェクトし、そして置換配列を含む(しかしHPRT遺伝子を有さない)相同的組換え体をHPRT +細胞に対するネガティブ選択により単離する。この手順は、標的遺伝子内に選択遺伝子配列を導入することなく、わずかな変異を標的遺伝子内に導入させるが、HPRT -細胞株における形質転換体のポジティブ選択を必要とする。なぜなら、HPRT遺伝子は、ポジティブ選択に対して劣性(recessive)であるからである。さらに、ES細胞におけるHPRT遺伝子の非効率的な発現のために、大きな9-kbp HPRTミニ遺伝子を用いる必要がある。この遺伝子は、相同的組換えベクターの構築および増殖を入り組ませる。本発明の選択融合遺伝子は、改良された手段を提供し、そのことにより「イン−アウト」相同的組換えが行われ得る。本発明の選択融合遺伝子は、 ポジティブ選択に対して優勢であるので、任意の野生型細胞が用いられ得る(すなわち、選択発現型に欠陥のある細胞の使用に限定されない)。さらに、選択融合遺伝子を含むベクターのサイズは、大きなHPRTミニ遺伝子に比べて顕著に縮小される。 例示として、CD-neoの選択融合遺伝子は、以下のように用いられる:第1の「 イン」工程において、CD-neo選択融合遺伝子を標的遺伝子配列に埋め込み、宿主細胞内にトランスフェクトし、そしてCD-neoの選択融合遺伝子を標的位置に取り込ませた相同的組換え体を、G-418を含有する培地で増殖させた後、PCRを用いてゲノム分析を行うことにより同定する。次いで、CD-neo +細胞を第2の「アウト」工程に用いる。ここで、標的遺伝子配列に埋め込まれた所望の置換配列を含む(がCD-neoの選択融合遺伝子を有さない)構築物を細胞内にトランスフェクトする。5-FCを用いてCD-neo +細胞を選択的に除去した後、PCRを用いてゲノム分析することにより、相同的組換え体を単離する。 実施例実施例1 CD-neo選択融合遺伝子含有プラスミドベクターの 構築および特徴付け A. 二機能性CD-neo選択融合遺伝子の構築プラスミドtgCMV/hygro/LTR(図1)は、次の因子:HCMV IE94プロモーター(Bos hartら、Cell 41:521,1985)を含有するBalI-SstIIフラグメント;哺乳動物細胞に対するコンセンサス翻訳開始配列(GCCGCCACC ATG )(Kozakら、Nucl.Acids Res .15:8125,1987)に順応する配列を含有するオリゴヌクレオチド;ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするhph遺伝子(Kasterら、Nucl.Acids Res.11:6895,1983)由来のヌクレオチド234-1256;ポリアデニル化配列を含有するMoMLV(Shinnickら、Nature 293:543,1981)のヌクレオチド7764から3'LTRまでの配列;細菌の複製開始点を含有するpML2d(LuskyおよびBotchan、Nature 293 :79,1981)由来のNruI-AlwNIフラグメント;β-ラクタマーゼ遺伝子を含有するp GEM1(Promega Corp.)由来のAlwNI-AatIIフラグメントから成る。 プラスミドtgCMV/neo、tgCMV/CD、tgCMV/CD-hygro、tgCMV/neo-CD、およびtgC MV/CD-neoは、全て構造上tgCMV/hygro/LTRに類似しており、コンセンサス翻訳開始配列を含有するが、それぞれは、hph配列の代わりに異なる配列を含有する。 プラスミドtgCMV/neoは、3つのアミノ酸(GGA TCG GCC)をコードするオリゴヌクレオチドおよびhph配列の代わりにネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(Beckら、 Gene 19:327,1982)をコードする細菌neo遺伝子由来のヌクレオチド154-945を含有する。プラスミドtgCMV/CDは、hph配列の代わりに、シトシンデアミナーゼをコードする細菌CD遺伝子(Genbank 承認番号X63656)由来のヌクレオチド1645-292 5を含有する。CD配列は、PCRによりプラスミドpCD2(Mullenら、Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 89:33,1992)より増幅した。プラスミドtgCMV/hygro-CDは、hph配列の代わりにCD遺伝子由来のヌクレオチド1645-2925に融合した、hph遺伝子由来のヌクレオチド234-1205を含有する。プラスミドtgCMV/CD-hygroは、hph配列の代わりにhph遺伝子由来のヌクレオチド234-1256に融合した、CD遺伝子由来のヌクレオチド1645-2922を含有する。プラスミドtgCMV/neo-CDは、hph配列の代わりに、さらに3つのアミノ酸(GGA TCG GCC)をコードするオリゴヌクレオチド、およびCD遺伝子由来のヌクレオチド1645-2925に融合した細菌neo遺伝子由来のヌクレオチド154-942を含有する。プラスミドtgCMV/CD-neoは、hph配列の代わりに、 neo遺伝子由来のヌクレオチド154-945に融合したCD遺伝子由来のヌクレオチド16 45-2922を含有する。 次のような標準的手法(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Wiley,New York),1987)を用いて、プラスミドtgCMV/hygro/LTRを構築した: 初めにtgLS(+)HyTK (Luptonら、Mol.Cell.Biol.11:3374,1991)由来の長鎖HindIII-StuIフラグメントを、tgLS(-)CMV/HyTK(Luptonら、上記、1991)由来のHCMV IE94プロモーターに及ぶHindIII-StuIフラグメント、およびヒトIL-2cDNA配列を含有するフラグメントと連結することによって、プラスミドHyTK-CMV-IL2を構築した。このヒトIL -2cDNA配列を含有するフラグメントを、オリゴヌクレオチド5'-CCCGCTAGCCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCC-3'および5'-CCCGTCGACTTAATTATCAAGTCAGTGTT-3'を用いたPCRによって、ヒトIL-2cDNAを含有するプラスミドから増幅した。増幅後、PCR産物を初めT4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑にし、tgLS(+)HyTKおよびtgLS(-)CMV/HyTK由来のフラグメントへの連結前に、次にNheIで切断した。プラスミドtgCMV/hygro/LTRを作製するため、tgCMV/hygro(Luptonら、上記、1991)のSV40ポリアデニル化シグナルに及ぶSalI-PvuIフラグメントを、HyTK-CMV-IL2由来のモロネイ白血病ウイルスLTR (レトロウイルスのポリアデニル化シグナルを含有する)を含有するSalI-PvuIフラグメントと置き換えた。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/n eoを構築した:tgCMV/hygro由来のHCMV IE94プロモーターに及ぶPvuI-NheIフラグメントを、tgLS(+)neo由来のneo遺伝子に及ぶNheI-HindIIIフラグメント(Hin dIII部位をT4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑にした)に連結し、そしてH yTK-CMV-IL2由来のモロネイ白血病ウイルスLTR(レトロウイルスのポリアデニル化シグナルを含有する)を含有するSalI-PvuI フラグメントに連結した。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/C Dを構築した:tgCMV/hygro由来のHCMV IE94プロモーターに及ぶPvuI-NheIフラグメントを、合成DNAフラグメント(オリゴヌクレオチドである5'-CTAGCCGCCACCATGTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCG-3'および5'-GTAACCGGGCGTTAATAATTGTTTGTAAAGCGTTATTCGACATGGTGGCGG-3'をアニーリングすることによって調製した)、pCD2(Mullenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 33,1992)由来のCDコーディング領域の残余を含有するBstE2-AluIフラグメント、およびHyTK-CMV-IL2由来のモロネイ白血病ウイルスLTR(レトロウイルスのポリアデニル化シグナルを含有する)を含有するSalI-PvuIフラグメントに連結した。 連結前に、後者フラグメント中のSalI部位をT4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑にした。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/C D-hygroを構築した:tgCMV/CD由来の長鎖ClaI-SalIフラグメントを、オリゴヌクレオチドである5'-CCCATCGATTACAAACGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC-3'および5'-GCCATGTAGTGTATTGACCGATTCC-3'を用いたPCRによってtgCMV/hygroから増幅したClaI-NcoIフラグメント(連結前にPCR産物をClaIおよびNcoIで切断した)、およびtgCMV/hygro/LTR由来のhphコーディング領域の残余を含有するNcoI-SalIフラグメントに連結した。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/h ygro-CDを構築した:tgCMV/CD由来の長鎖SpeI-BstE2フラグメントを、tgCMV/hyg ro/LTR由来のhphコーディング領域を含有するSpeI-ScaIフラグメント、および合成DNAフラグメント(オリゴヌクレオチドである5'-ACTCTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCG-3'および5'-GTAACCGGGCGTTAATAATTGTTTGTAAAGCGTTATTCGAGAGT-3'をアニーリングすることによって調製した)に連結した。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/C D-neoを構築した:tgCMV/CD由来の長鎖ClaI-Asp718フラグメントを合成DNAフラグメント(オリゴヌクレオチドである5'-CGATTACAAACGTATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC-3'および5'-GGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATACGTTTGTAAT-3'をアニーリングすることによって調製した)、およびtgCMV/neo由来のneo遺伝子コーディング領域の残余を含有するEagI-Asp718フラグメントに連結した。 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgCMV/n eo-CDを構築した:tgCMV/neo由来の長鎖SphI-SalIフラグメントを、オリゴヌクレオチドである5'-CGAACTGTTCGCCAGGCTC-3'および5'-CCCGGTAACCGGGCGTTAATAATTGTTTGTAAAGCGTTATTCGAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3'を用いたPCRによってtgCMV/neoから増幅したClaI-NcoIフラグメント(連結前にPCR 産物をSphIおよびBstE2で切断した)、およびtgCMV/CD由来のCD遺伝子コーディング領域の残余を含有するBstE2-SalIフラグメントに連結した。 B. CD融合遺伝子を含有する細胞の優性ポジティプ選択 CD融合遺伝子がneoおよびhph両活性をコードすることを実証するために、NIH/ 3T3細胞内で、種々のプラスミドが薬剤耐性を与える頻度を調べた。 初めにNIH/3T3細胞を、10%仔ウシ血清(Hyclone)、2mM L-グルタミン、50U/ml ペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Gibco Laboratoriesより入手)中、37℃、10% CO 2を補充した加湿大気内で生育させた。トランスフェクションのため、指数増殖期の細胞をトリプシン処理により回収、洗浄して血清を除き、そして濃度10 7細胞/mlでDMEM中に再懸濁した。プラスミドDNA(5μg)を800μlの細胞懸濁液(8×10 6細胞)に添加し、そしてこの混合物を、Biorad Gene PulserおよびCapacitance Extender(200-3 00V、960μF、0.4cm電極間隙、周辺温度下)を用いてエレクトロポレーションにかけた。 エレクトロポレーション後、細胞を10cmシャーレに戻し、そして非選択培地で生育させた。24時間後、細胞をトリプシン処理し、6×10 5細胞/10cmシャーレに接種し、一夜接触させた。非選択培地を選択培地(500U/mlのHmまたは800μg/mlのG-418を含む)に取り替え、そして10-14日間選択を継続した。プレートを次にメタノールで固定し、メチレンブルーで染色し、そしてコロニーを計数した。表1に報告したコロニーの数は、10cmシャーレあたりのコロニーの平均の数である。 非トランスフェクション細胞は、ハイグロマイシン耐性(Hm r )でもG-418耐性(G -418 r )でもなかった。この結果より、hygro-CD融合遺伝子およびCD-hygro融合遺伝子はHm rをコードするが、CD-hygro融合遺伝子の活性は、hygro-CD融合遺伝子の活性よりも低いことを示唆する。CD-neo融合遺伝子はG-418 rを与えるが、neo- CD遺伝子は与えない。 C. C. トランスフェクトした細胞プール上でのシトシンデアミナーゼアッセイ融合遺伝子がシトシンデアミナーゼ(CD)活性を保持しているかどうかを調べるために、表1に示したHm rおよびG-418 r NIH/3T3コロニーをプールし、そして樹立細胞株とした。 To investigate whether the cytosine deaminase assay fusion gene on the transfected cell pools holds the cytosine deaminase (CD) activity, the Hm r and G-418 r NIH / 3T3 colonies shown in Table 1 were pooled , and it was established cell lines. 抽出物を調製し、そして[ 3 H]-シトシンの替わりに[ 14 C]-シトシンを使用した以外はおもに既に記載されている(Mullenら、Proc.Natl.Acad.S ci.USA 89:33,1992)とおりに、シトシンのウラシルへの変換を測定することによりCD活性をアッセイした。 The extracts were prepared, and [3 H] - instead of cytosine [14 C] - except using cytosine are mainly described previously (Mullen et al., Proc.Natl.Acad.S ci.USA 89:33 , 1992) as was assayed CD activity by measuring the conversion of cytosine uracil. 10cmシャーレに1×10 6細胞を接種し、そして細胞を2 日間インキュベートした。 Inoculated with 1 × 10 6 cells in 10cm Petri dish, and the cells were incubated for 2 days. 次に細胞をTris緩衝液(100mM Tris、pH7.8、1mM EDTA 、1mMジチオスレイトール)中で洗浄し、そして1mlのTris緩衝液で、シャーレからかき取った。 The cells Tris buffer (100mM Tris, pH7.8,1mM EDTA, 1mM dithiothreitol) were washed in, and in Tris buffer 1 ml, were scraped from the dish. 次に細胞をEppendorf microfuge内で10秒間、24,000rpmで遠心分離して100μlのTris緩衝液に再懸濁し、そして5サイクルの急速冷凍および解凍を行った。 Then 10 seconds cells in Eppendorf microfuge, resuspended in Tris buffer 100μl was centrifuged at 24,000 rpm, and subjected to rapid freezing and thawing of 5 cycles. Eppendorf microfuge内で5分間、6,000rpmで遠心分離後、上清をきれいなチューブに移した。 Eppendorf microfuge within 5 min, centrifuged at 6,000 rpm, and the supernatant was transferred to a clean tube. Bioradプロテインアッセイキットを用いて、抽出物内のタンパク質濃度を調べた。 Using Biorad protein assay kit, it was examined and the protein concentration in the extract. 次に細胞抽出物のうち25μl(即ち体積25μl中のタンパク質等価量)を1μl の[ 14 C]-シトシン(0.6mCi/ml、53.4mCi/mmol;Sigma Chemical Co.)と混合し、 そして反応を37℃で1-4時間進行させた。 Then 25 [mu] l (i.e. protein equivalent amount in volume 25μl) [14 C] of 1μl of of cell extract - cytosine (0.6mCi / ml, 53.4mCi / mmol ; Sigma Chemical Co.) were mixed, and the reaction It was allowed to proceed for 1-4 hours at 37 ℃. 反応物の2分の1を次に薄層クロマトグラムに添加し、そして86% 1-ブタノールおよび14%水の混合物中でクロマトグラフを行った。 Then added to a thin layer chromatogram of one-half of the reaction and was chromatographed in a mixture of 86% 1-butanol and 14% water. 展開後、薄層クロマトグラムをKodak X-OMAT AR X-線フィルムに8-14時間曝した。 After deployment, it was exposed 8-14 hours a thin layer chromatogram on Kodak X-OMAT AR X- ray film. 結果を図2に示す。 The results are shown in Figure 2. 結果より、CD-neo融合遺伝子、CD-hygro融合遺伝子、およびhygro-CD融合遺伝子はCD活性をコードしたが、CD-hygro融合遺伝子およびhygro-CD融合遺伝子の活性はCD-neo融合遺伝子の活性よりも低かったことが示される。 Result from, CD-neo fusion gene, CD-hygro fusion gene, and hygro-CD fusion gene is encoding a CD activity, CD-hygro fusion gene and hygro-CD activity of the fusion gene activity of CD-neo fusion gene it is shown was lower than. 実施例2 neoまたはCD-neo選択融合遺伝子含有レトロウイルスベクター の構築および特徴付け A. レトロウイルスベクターの構築レトロウイルスプラスミドtgLS(+)neoおよびtgLS(+)CD-neoは、次の因子:5 'LTRおよびMoMSVのヌクレオチド984のPstI部位までの配列(Van Beverenら、Cell 27:97,1981);MoMLVのヌクレオチド563のPstI部位からヌクレオチド1040までの配列(Shinnickら、Nature 293:543,1981);neoまたはCD-neoコーディング領域をそれぞれ含有する、tgCMV/neoまたはtgCMV/CD-neo由来のフラグメント;MoM LV(Shinnickら、上記、293:543,1981)のヌクレオチド7764から3'LTRまでの配列;細菌の複製開始点を含有するpML2d(LuskyおよびBotchan、上記、1981)由来のN ruI-AlwNIフラグメント;β-ラクタマーゼ遺伝子を含有するpGEM1(Promega Corp .)由来のAlwNI-AatIIフラグメントから成る。 Example 2 neo or CD-neo selection fusion gene construct and characterization of containing retroviral vector A. Construction retroviral plasmid TgLS retroviral vector (+) neo and tgLS (+) CD-neo, the following factors: 5 'sequences up PstI site at nucleotide 984 of LTR and MoMSV (Van Beveren et al., Cell 27: 97,1981); sequences from PstI site at nucleotide 563 to nucleotide 1040 of MoMLV (Shinnick et al., Nature 293: 543,1981) ; containing neo or CD-neo coding region, respectively, fragment from TgCMV / neo or tgCMV / CD-neo; MoM LV (Shinnick et al., supra, 293: 543,1981) sequence from nucleotide 7764 to 3'LTR of ; pML2d containing a bacterial origin of replication (Lusky and Botchan, above, 1981) from the N RUI-AlwNI fragment; (. Promega Corp) beta-lactamase gene containing pGEM1 consisting AlwNI-AatII fragment from. 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgLS(+ )neoを構築した:初めに、tgLS(+)HyTK由来のEcoRI-ClaIフラグメントを、tgCM V/hygro由来のEcoRI-Asp718フラグメント、および合成DNAフラグメント(オリゴヌクレオチドである5'-GTACAAGCTTGGATCCCTCGAGAT-3'および5'-CGATCTCGAGGGATCCAAGCTT-3'をアニーリングすることによって調製した)に連結することによってプラスミドtgLS(+)hygroを構築した。 Standard techniques such as: (Ausubel et al., Supra, 1987) using a plasmid tgLS (+) was constructed neo: initially, the EcoRI-ClaI fragment from tgLS (+) HyTK, derived tgCM V / hygro the EcoRI-Asp718 fragment, and plasmid tgLS by ligating a synthetic DNA fragment (prepared by annealing 5'-GTACAAGCTTGGATCCCTCGAGAT-3 'and 5'-CGATCTCGAGGGATCCAAGCTT-3' oligonucleotide) and (+) hygro It was constructed. 次にhygro遺伝子に及ぶNheI-HindIIIフラグメントを、オリゴヌクレオチドである5'-CCCGCTAGCCGCCGCCACCATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCAC-3'および5'-CCCAAGCTTCCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3'(連結前にPCR産物をNheIおよびHindIIIで切断した)を用いるPCRによって、pSV2neo(SouthernおよびBerg、J.Mol.Appl. Gen.1:327,1982)から増幅したNheI-HindIIIフラグメントと取り替えることによって、プラスミドtgLS(+)neoを構築した。 Then the NheI-HindIII fragment spanning the hygro gene, by PCR using 5'-CCCGCTAGCCGCCGCCACCATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCAC-3 'and 5'-CCCAAGCTTCCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3' oligonucleotides (PCR product before connecting cut with NheI and HindIII), pSV2neo (Southern and Berg, J.Mol.Appl Gen.1:. 327,1982) by replacing the amplified NheI-HindIII fragment from a plasmid was constructed tgLS (+) neo. 次のような標準的手法(Ausubelら、上記、1987)を用いて、プラスミドtgLS(+ )CD-neoを構築した:HyTK-CMV-IL2由来のHCMV IE94プロモーターおよびヒトIL-2 cDNAに及ぶNheI-SalIフラグメントをtgCMV/CD-neo由来のNheI-SalIフラグメントと取り替えた。 Standard techniques such as: (Ausubel et al., Supra, 1987) using a plasmid tgLS (+) to construct CD-neo: HyTK-CMV-IL2-derived HCMV IE94 promoter and NheI ranging human IL2 cDNA the -SalI fragment was replaced with NheI-SalI fragment from tgCMV / CD-neo. 図3にレトロウイルスベクターであるtgLS(+)neoおよびtgLS(+)CD-neoのプロウイルス構造を示す。 A retroviral vector in FIG. 3 tgLS (+) neo and tgLS (+) shows the proviral structure of CD-neo. 図中の「LTR」は、レトロウイルスベクターの長末端反復配列セグメントを表し、「neo」は細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を表し、そして「CD-neo」はCD/ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子を示す。 "LTR" in the figure represents a long terminal repeat sequence segments of the retroviral vector, "neo" represents the bacterial neomycin phosphotransferase gene, and "CD-neo" indicates CD / neomycin phosphotransferase fusion gene. neo遺伝子およびCD-neo遺伝子は、LTR転写制御領域に作動可能に連結されている。 neo gene and the CD-neo gene is operably linked to LTR transcriptional control region. 矢印は、転写制御領域からの転写の方向を示す。 The arrows indicate the direction of transcription from the transcriptional control region. 「A + 」はポリアデニル化配列を示す。 "A +" indicates a polyadenylation sequence. B. レトロウイルスベクターに感染した安定な細胞株の継代 tgLS(+)neoおよびtgLS(+)CD-neoに感染した安定なNIH/3T3細胞株を得るために、本レトロウイルスプラスミドDNAをΨ2エコトロピックパッケージング細胞内にトランスフェクトした。 Passaging TgLS infected stable cell line B. retroviral vector (+) neo and tgLS (+) to obtain the infected stable NIH / 3T3 cell line in CD-neo, the present retroviral plasmid DNA .psi.2 It was transfected into ecotropic packaging cells. 次に、トランスフェクトしたΨ2細胞を、10mM酪酸ナトリウム(Sigma Chemical Co.)を補充した完全増殖培地を含有する10cm組織培養用シャーレに移し、そして一夜接触させた。 Next, the Ψ2 cells transfected, transferred to a 10cm tissue culture dish containing complete growth medium supplemented with 10mM sodium butyrate (Sigma Chemical Co.), and allowed to contact overnight. 15時間後、培地を除去し、そして新鮮培地と取り替えた。 After 15 hours, the medium was removed and replaced with fresh medium. さらに24時間後、一時的に生産されたエコトロピックウイルス粒子を含有する培地を回収、2000rpmで10分間遠心分離し、そしてNIH/3T3 細胞への感染に使用した。 After an additional 24 hours, temporarily-produced recovered media containing ecotropic virus particles were centrifuged 10 minutes at 2000 rpm, and used to infect NIH / 3T3 cells. 指数分裂期のNIH/3T3細胞をトリプシン処理により回収し、そして2.5×10 4細胞/35mmウエルの密度で2枚の6-ウエル組織培養トレイに接種した。 The NIH / 3T3 cells in exponential mitotic were harvested by trypsinization and inoculated into two 6-well tissue culture trays at a density of 2.5 × 10 4 cells / 35 mm well. 翌日、培地を、4μg/mlポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)(Sigma Chemical Co.)で補充した培地内のウイルス含有、無細胞上清(1ml/ウエル)の系列希釈液と取り替えた。 The following day, the medium was replaced with serial dilutions of 4 [mu] g / ml polybrene (hexadimethrine bromide) (Sigma Chemical Co.) virus containing in supplemented medium, the cell-free supernatant (1 ml / well). 感染は一夜進行させた。 Infection was allowed to proceed overnight. 次に、上清を完全増殖培地と取り替えた。 Then, it replaced the supernatant was used as a complete growth medium. さらに8-2 4時間の生育後、感染NIH/3T3細胞を、G-418(Gibco)に対する薬剤耐性を対象に、 最終濃度800μg/ml(Hm r細胞)で選択した。 Furthermore 8-2 after 4 hours growth, the infection NIH / 3T3 cells, targeting drug resistance to G-418 (Gibco), were selected at a final concentration of 800μg / ml (Hm r cells). 全体で12-14日間の生育後、1トレイの培養G-418 r耐性細胞を100%メタノールで固定し、そしてメチレンブルーで染色した。 After a total of 12-14 days growth, the first tray of culture G-418 r resistant cells were fixed with 100% methanol and stained with methylene blue. コロニーを計数し、そして各ウエルのコロニー数を使用して、一時感染上清中に存在するレトロウイルスの力価を確立した(表2)。 Colonies were counted, and using the number of colonies in each well were established titer retrovirus present in the one o'clock infection supernatants (Table 2). 他のトレイのG-418 r細胞より、G-418 r細胞のコロニーをプールし、そして分析のためバルク培養を樹立した。 From G-418 r cells other trays, the colonies of G-418 r cells were pooled and were established bulk culture for analysis. このバルク培養より抽出物を調製し、そして[ 3 H] -シトシンの代わりに[ 14 C]-シトシンを使用した以外は一般に既に記載されている(Mullenら、1992)とおりに、シトシンのウラシルへの変換を測定することによりCD活性をアッセイした。 This was prepared from bulk culture extracts, and [3 H] - instead of a cytosine [14 C] - except using cytosine is generally described previously (Mullen et al., 1992) as, cytosine into uracil It was assayed CD activity by measuring the conversion. 10cmシャーレに1×10 6細胞を接種し、そして細胞を2日間インキュベートした。 Inoculated with 1 × 10 6 cells in 10cm Petri dish, and the cells were incubated for 2 days. 次に細胞をTris緩衝液(100mM Tris、pH7.8、1mM ED TA、1mMジチオスレイトール)中で洗浄し、そして1mlのTris緩衝液で、シャーレからかき取った。 The cells Tris buffer (100mM Tris, pH7.8,1mM ED TA, 1mM dithiothreitol) were washed in, and in Tris buffer 1 ml, were scraped from the dish. 次に細胞をEppendorf microfuge内で10秒間、14,000rpm遠心分離して100μlのTris緩衝液に再懸濁し、そして5サイクルの急速冷凍および解凍を行った。 Then 10 seconds cells in Eppendorf microfuge, resuspended in Tris buffer 100μl to 14,000rpm centrifugation, and subjected to rapid freezing and thawing of 5 cycles. Eppe ndorf microfuge内で5分間、6,000rpmで遠心分離後、上清をきれいなチューブに移した。 Eppe ndorf microfuge within 5 min, centrifuged at 6,000 rpm, and the supernatant was transferred to a clean tube. Bioradプロテインアッセイキットを用いて、抽出物内のタンパク質濃度を調べた。 Using Biorad protein assay kit, it was examined and the protein concentration in the extract. 次に細胞抽出物のうち25μl(即ち体積25μl中のタンパク質等価量)を1mlの[ 14 C]-シトシン(0.6mCi/ml、53.4mCi/mmol;Sigma Ch emical Co.)と混合し、そして反応を37℃で1-4時間進行させた。 Then [14 C] 25 [mu] l (i.e. protein equivalent amount in volume 25 [mu] l) of 1ml of cell extract - cytosine (0.6mCi / ml, 53.4mCi / mmol ; Sigma Ch emical Co.) was mixed with, and the reaction It was allowed to proceed for 1-4 hours at 37 ℃. 反応物の2分の1を次に薄層クロマトグラムに添加し、そして86% 1-ブタノールおよび14%水の混合物中でクロマトグラフを行った。 Then added to a thin layer chromatogram of one-half of the reaction and was chromatographed in a mixture of 86% 1-butanol and 14% water. 展開後、薄層クロマトグラムをKodak X- OMAT AR X-線フィルムに8-14時間曝した。 After deployment, it was exposed 8-14 hours a thin layer chromatogram on Kodak X- OMAT AR X- ray film. 図4に示す結果より、tgLS(+)CD-n eoレトロウイルスベクターに感染した細胞は、高レベルのシトシンデアミナーゼ活性を発現することが示される。 From the results shown in FIG. 4, tgLS (+) cells infected with CD-n eo retroviral vectors that express high levels of cytosine deaminase activity is shown. C. CD-neo選択融合遺伝子を含有する細胞のネガティブ選択ネガティブ選択に対するneoおよびCD-neo選択融合遺伝子の有用性を検討するために、各トランスフェクションから得られたコロニーをプールし、そして以後の分析のための細胞株を樹立した。 To investigate the utility of the neo and CD-neo selection fusion gene for negative selection negative selection of cells containing C. CD-neo selection fusion gene, the colonies obtained from each transfection were pooled and subsequent It was established cell lines for analysis. NIH/3T3細胞またはtgLS(+)neoレトロウイルスもしくはtgLS(+)CD-neoレトロウイルスが感染したNIH/3T3細胞を、長期増殖アッセイ法を用いて5-FC sについてアッセイした。 The NIH / 3T3 cells or tgLS (+) neo retroviral or tgLS (+) NIH / 3T3 cells CD-neo retroviral infected were assayed for 5-FC s with long proliferation assay. 初めに、1×10 4細胞を完全増殖培地中、10cm組織培養シャーレに接種し、そして4時間接触させた。 First, in complete growth medium 1 × 10 4 cells were seeded into 10cm tissue culture dish and allowed to contact for 4 hours. 次に培地を種々の濃度のG-418および/または5-FC(Sigma )で補充し、その後さらに10-14日間、細胞をインキュベートした。 Then supplementing the media with various concentrations of G-418 and / or 5-FC (Sigma), among then further 10-14 days, the cells were incubated. 培地は2-4 日ごとに取り替えた。 The medium was replaced every 2-4 days. 次に細胞を100%メタノールにてインサイチュで固定し、そしてメチレンブルーで染色した。 Cells were then fixed in situ with 100% methanol and stained with methylene blue. 代表的な染色プレートの写真を図5に示す。 A photo of a typical staining plate shown in Figure 5. プレートaは、薬剤無添加培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate a has NIH / 3T3 cells grown in drug free medium. プレートbは、800μg/ml G-418を含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate b has NIH / 3T3 cells grown in media containing 800μg / ml G-418. プレートcは、100μg/ml 5-FCを含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate c has NIH / 3T3 cells grown in media containing 100μg / ml 5-FC. プレートdは、tgLS(+)neoで感染させて800μg/ml G-418を含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate d has NIH / 3T3 cells grown in media containing 800μg / ml G-418 were infected with tgLS (+) neo. プレートeは、tgLS(+)neoで感染させて800μg/ml G-418および100μg/ml 5- FCを含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate e has NIH / 3T3 cells grown in medium containing tgLS (+) were infected with neo 800μg / ml G-418 and 100μg / ml 5- FC. プレートfは、tgLS(+ )CD-neoで感染させて800μg/ml G-418を含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate f has NIH / 3T3 cells grown in media containing 800μg / ml G-418 were infected with tgLS (+) CD-neo. プレートgは、tgLS(+)CD-neoで感染させて800μ/ml G-418および100μg/ml 5-FCを含有する培地中で生育させたNIH/3T3細胞を有する。 Plate g has NIH / 3T3 cells grown in medium containing tgLS (+) were infected with CD-neo 800μ / ml G-418 and 100μg / ml 5-FC. これらの結果より、1)非インフェクトNIH/3T3細胞はG-418に感受性および5-FC に耐性であること、2)tgLS(+)neo感染NIH/3T3細胞はG-418および5-FC両者に耐性であること、3)tgLS(+)CD-neo感染NIH/3T3細胞はG-418に耐性であるが5-FCに感受性であることが示される。 From these results, 1) the non Infekuto NIH / 3T3 cells are resistant to sensitive and 5-FC in G-418, 2) tgLS (+) neo-infected NIH / 3T3 cells G-418 and 5-FC be resistant to both, 3) tgLS (+) CD-neo infected NIH / 3T3 cells is shown that it is resistant to G-418 is susceptible to 5-FC.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI C12R 1:91) (C12N 9/78 C12R 1:91) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 6 identification symbol Agency in the docket number FI C12R 1:91) (C12N 9/78 C12R 1:91)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. [Claims] 1. ネガティブ選択遺伝子と共にリーディングフレームにあり、かつ該ネガティブ融合遺伝子に融合した優性のポジティブ選択遺伝子を含む選択融合遺伝子であって、発現された際に宿主細胞に優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与える単一の二機能性融合タンパク質をコードする選択融合遺伝子;ここで、該ネガティブ選択遺伝子は、シトシンデアミナーゼ(CD)である。 Located reading frame with a negative selectable gene, and the a selected fusion gene containing a positive selection gene negative fusion gene fused to the dominant, positive selection dominant phenotype in the host cell upon expression and negative selection phenotype DOO single selected fusion gene encodes a bifunctional fusion protein conferring; wherein said negative selection gene is a cytosine deaminase (CD). 2. 2. 前記優性のポジティブ選択遺伝子が、hph遺伝子およびneo遺伝子からなる群から選択される、請求項1に記載の選択融合遺伝子。 Positive selection gene of the dominant is selected from the group consisting of hph gene and the neo gene, selection and fusion gene according to claim 1. 3. 3. 前記優性のポジティブ選択遺伝子がneoである、請求項2に記載の選択融合遺伝子。 Positive selection gene of the dominant is neo, selection and fusion gene according to claim 2. 4. 4. 配列番号2に記載の第2位から第690位までのアミノ酸の配列をコードする、請求項3に記載の選択融合遺伝子。 Encoding the sequence of amino acids from the second position according to # 690 in SEQ ID NO: 2, selected fusion gene according to claim 3. 5. 5. 配列番号1に記載の第4位から第2073位までのヌクレオチドの配列をコードする、請求項3に記載の選択融合遺伝子。 Coding sequence of the nucleotides in position first 2073 from # 4 set forth in SEQ ID NO: 1, selection and fusion gene according to claim 3. 6. 6. 請求項2に記載の選択融合遺伝子を含有する組換え発現ベクター。 The recombinant expression vector containing the selection gene fusion of claim 2. 7. 7. 請求項3に記載の選択融合遺伝子を含有する組換え発現ベクター。 The recombinant expression vector containing the selection gene fusion of claim 3. 8. 8. 請求項4に記載の選択融合遺伝子を含有する組換え発現ベクター。 The recombinant expression vector containing the selection gene fusion of claim 4. 9. 9. 前記ベクターがレトロウイルスである、請求項6に記載の組換え発現ベクター。 Wherein the vector is a retrovirus, a recombinant expression vector of claim 6. 10. 10. 前記ベクターがレトロウイルスである、請求項7に記載の組換え発現ベクター。 Wherein the vector is a retrovirus, a recombinant expression vector of claim 7. 11. 11. 前記ベクターがレトロウイルスである、請求項8に記載の組換え発現ベクター。 Wherein the vector is a retrovirus, a recombinant expression vector of claim 8. 12. 12. 請求項6に記載の組換え発現ベクターを導入された細胞。 Transduced cells a recombinant expression vector of claim 6. 13. 13. 請求項9に記載の組換え発現ベクターを導入された細胞。 Cells transfected with the recombinant expression vector of claim 9. 14. 14. 細胞に優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与える方法であって、該細胞に請求項6に記載の組換え発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。 Cells A method of providing a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant, comprising introducing the recombinant expression vector of claim 6 into the cells. 15. 15. 細胞に優性のポジティブ選択表現型とネガティブ選択表現型とを与える方法であって、該細胞に請求項9に記載の組換え発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。 Cells A method of providing a positive selectable phenotype and a negative selectable phenotype dominant, comprising introducing the recombinant expression vector of claim 9 into said cell.
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