JPH09500132A - Hydrogel microencapsulated vaccine - Google Patents

Hydrogel microencapsulated vaccine

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JPH09500132A
JPH09500132A JP7504650A JP50465095A JPH09500132A JP H09500132 A JPH09500132 A JP H09500132A JP 7504650 A JP7504650 A JP 7504650A JP 50465095 A JP50465095 A JP 50465095A JP H09500132 A JPH09500132 A JP H09500132A
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アンドリアノフ，アレキサンダー，ケイ．
ジェンキンズ，シャロン，エイ．
ペイン，レンドン，ジー．
ロバーツ，ブライアン，イー．
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ヴァイラス リサーチ インスティチュート
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Abstract

(57)【要約】 水溶性ポリマーあるいはポリマーヒドロゲルがワクチン形成のための抗原のカプセル化に使用される。抗原はポリマー溶液と混合され、極微粒子がポリマーおよび抗原から形成され、また、場合によってはポリマーは安定した極微粒子を形成するために任意に架橋される。望ましいポリマーはアルジネートおよびポリホスファゼン、更にその混合物である。経口デリバリのために、極微粒子は望ましくは１５ミクロンもしくはそれ以下の直径のものであり、また胃腸管の粘膜内層に付着して細網内皮細胞による吸収を増加させる。   (57) [Summary] Water soluble polymers or polymer hydrogels are used to encapsulate the antigen for vaccine formation. The antigen is mixed with the polymer solution, the microparticles are formed from the polymer and the antigen, and optionally the polymer is optionally crosslinked to form stable microparticles. The preferred polymers are alginates and polyphosphazenes, as well as mixtures thereof. For oral delivery, the ultrafine particles are preferably 15 microns or less in diameter and adhere to the mucosal lining of the gastrointestinal tract to increase absorption by reticuloendothelial cells.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒドロゲルマイクロカプセル化ワクチン この発明は、水溶性ポリマーすなわちヒドロゲルに基づくマイクロスフェア（ 微小球体）の形をしたワクチン賦形剤である。 これは１９９３年７月１２日受理された「免疫アジュバントとしてのホスファ ゼン高分子電解質」という名称の米国特許出願番号０８／０９０，８４１号を部 分継承するものである。 粘膜面を経由する免疫応答の誘導 多くのウイルスは粘膜面を一次感染部位として利用する。ウイルスにもよるが 、感染は粘膜面に局在化して留まるか、もしくは全身感染を定着させるように転 移するかのいずれかになる。局部感染を誘発するウイルスの例は呼吸粘膜で繁殖 するインフルエンザ、パラインフルエンザおよび普通の風邪ウイルスであり、腸 粘膜で複製するロタウイルスおよびノーウォーク因子である。粘膜から拡がり全 身性ウイルス感染を誘導するウイルスは、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ポリオ （小児麻痺）、Ａ型およびＢ型肝炎、およびヘルペス等のウイルスである。 最近数年間に粘膜免疫の誘導に関する非常に多くの情報が蓄積された。例えば 消化管において、免疫応答は消化管粘膜に包埋されたパイエル板に局在化される 。これらの位置におけるリンパ系組織は消化管（消化管付随リンパ系組織、ＧＡ ＬＴ）の 管腔に露出され、管腔内容物をたえず標本抽出することが可能となる。類似のリ ンパ系組織で細気管支付随リンパ系組織（ＢＡＬＴ）は呼吸粘膜に位置する。 一般に多数のウイルスワクチンは、生弱毒化あるいは不活性化ウイルス製剤の 注射の後、全身性防御免疫状態を定着させる。このようなワクチンの成功はワク チン受容者に細胞媒介およびもしくは体液性免疫応答を導入することによるもの である。この全身性免疫は粘膜でのウイルス複製を減少させ、重要な標的器官へ のウイルス拡散を除去することにより疾病の発病を予防する。 注射可能ワクチンの使用は多くのウイルス疾病発生率を劇的に減少させた。そ れにも拘らずこれらの使用は何らかの望ましくない作用と関連する。生弱毒化ウ イルスワクチンは全身性合併症を起こすことがあり、一方不活性化ワクチンは局 所反応を引き起こし、アレルギー状態を誘発することさえある。前者は免疫を減 少させ自然感染の割合を増加させ、一方後者は現在のワクチンの改良および新し いワクチンの開発を妨げる。 注射可能ワクチン使用の代替的方法は抗原とりわけ生弱毒化ウイルスの経口投 与である。このようなワクチンは野生型ウイルスの自然感染により誘発される免 疫応答によく似た強力な粘膜および全身性免疫の双方を誘導する。この免疫応答 の布置はウイルスの全身性拡散だけでなく粘膜でのウイルス複製をも除去する。 かくして複製経口ワクチンにより引き出される免疫応答は注射可能生ワクチンあ るいは不活性化ワクチンにより誘導されるものよりも優れている。この種のワク チンの最良の例 は、生弱毒化経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）である。不幸にも生ワクチ ンの経口投与は胃を通過しても生存し、またたやすく病原力に戻らない生ウイル スに限定される。 これまでに開発されたもっとも効果的な非複製抗ウイルスワクチンは不活性化 ウイルス粒子であった。動物モデルにおいてペプチドおよびサブユニットワクチ ンの効力は限られた成功しかおさめられず、現在このような種類の製剤を使用す るヒトワクチンは存在しない。組換えＤＮＡ操作の初期の年代では、多くのグル ープの人が防御免疫の開発のみでなく非感染性ウイルス抗原による安全性の問題 の解決をも十分に期待した。不幸なことに、実験室での発現ベクターで生産され 、高度に精製されワクチンを受ける人に注射されたウイルスタンパク質が、自然 感染で見出される抗原状態に僅かではあるが近似する生体内立体配座をとると仮 定する理由のないことが次第に明らかになってきた。今日では、唯一の成功した 組換え誘導ワクチンは真核（酵母）発現システムで合成されたＢ型肝炎表面（Ｈ ＢＳ）抗原であった。 微粒子状態にある非複製抗原の経口提示が自然感染により誘導される免疫に非 常によく似る粘膜および全身性免疫の双方を誘導することを立証する証拠が多く なろうとしている。これは全身免疫を誘導することを果せないだけでなくしばし ば全身寛容性の状態を誘導する非複製可溶性抗原による経口免疫と著しい対照を なす。更にこの免疫を引き出すのに必要な抗原用量は同じ抗原を用いる非経口免 疫化に必要とされる容量よりもはるかに低い。このようなワクチン製剤に固有の 主な利点は投与が 簡単で完全に安全であることである。 アジュバント 近代分子生物学の到来は前例のないような簡単さと精度でもって免疫原を生産 する手段を提供した。これらの新しい方法が有効なアジュバントの不在下では一 般に強力な免疫応答を誘導しない精製免疫原を生成するということは皮肉なこと である。ヒトに使用される改良されたワクチンアジュバントの開発は従って最優 先の研究領域となった。にも拘らずアジュバントの研究は免疫原について行われ た作業からひどく遅れた。数十年にわたりヒトに広く使用されたアジュバントは ミョウバンであった。サポニンおよびその精製成分であるクイルＡ（Quil Ａ） 、フロイト完全アジュバントおよび研究や獣医学的適用で使用される他のアジュ バントは毒性を持ち、それがヒトワクチンへの潜在的使用を制限する。ムラミル ジペプチドおよび脂質Ａモノホスホリルなどのような新しく化学的に定着される 製剤が研究されている。 アジュバントがその作用をどのように働かせるかについてのこれまでの見解は 、鉱油乳濁液あるいは水酸化アルミニウムのようなアジュバントが抗原をゆるや かに放出する注射の部位で抗原のデポ（貯蔵所）を形成するというものである。 しかし３日後注射部位の切除が免疫応答には殆ど作用していないことを示した。 最近の研究は、Ａ．Ｃ．アリソンおよびＮ．Ｅ．バイヤーズ「ワクチン：免疫学 上の諸問題への新しいアプローチ」Ｒ．Ｗ．エリス編、４３１ページ（バターワ ース−ハイネマン 社、オクスフォード、１９９２年）で検討されたようにサイトカインの放出によ りアジュバントが免疫応答の特異的でしかも時には非常にせまいアームを剌激す ることによって免疫応答を高めることを示している。長い期間にわたり抗原の放 出のための簡単な貯蔵所として機能するアジュバントを持つことが望ましい。 最近数年間にわたり開発されたアジュバント研究領域は、ワクチン製剤におけ るポリマーの利用である。ハンター，Ｒ．Ｌ．の「非イオン性ブロックコポリマ ー界面活性剤」ワクチンアジュバント研究における問題、Ｄ．Ｒ．スプリッグス およびＷ．Ｃ．コッフ編、８９−９８ページ（ＣＲＣプレス社、１９９１年）は 分子量が約１０，０００以下で単一ブロックの疎水性ポリオキシプロピレン（Ｐ ＯＰ）に隣接する２個のブロックの親水性ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）で構成 される単純な構造を持っている。これらは界面活性剤としては毒性がもっとも少 ないものと考えられ、食品、医薬品および化粧品に広く使用されている。大型の 疎水性コポリマーのいくつかは有効なアジュバントであり、一方、密接に関連し た製剤はそうではない。ＰＯＥおよびＰＯＰの連鎖に差異を持つこれらのコポリ マーのアジュバント活性の間には相関が存在する。現在ではこれらのアジュバン トは油性および水性乳濁液で使用されている。 各種の分子量を持つ広い範囲の高分子電解質がアジュバント活性を持つものと してペトロフ、他、ソビエト医学評論、セクションＤ、免疫学、４巻、１−１１ ３ページ（１９９２年）で 示されている。ここでは正もしくは負の電荷のいずれかを持つ高分子が類似の免 疫刺激活性を示した。高分子電解質は静電気および疎水結合を通じて抗原ととも に複合体を形成する。一方中性および非負荷ポリマーは免疫応答に何らの影響も 与えなかった。 薬剤および抗原の調節放出 調節放出ワクチンの開発に現在かなりの関心が寄せられている。その理由は現 在利用出来るいくつかのワクチンの不利な点の主なものは、それを繰返して投与 するということである。ワクチンの調節放出が可能であればブースター（追加抗 原）免疫の必要性はなくすことが出来る。これは特に開発途上国では有利であり 、そこでは健康管理担当者とワクチン受容者との間の接触を頻繁に繰返すことは しばしば困難であるからである。濾胞樹状細胞およびリンパ節器官の外膜に持続 する抗原が抗体分泌細胞を形成するためにＢ記憶細胞の補給に含まれる証拠が多 くなろうとしている。循環抗体の連続放出は、この補給が連続的に行われている ことを示唆している。抗原の水準が減少するにつれて、これは発生する抗体の親 和性成熟という十分に確立された現象の存在を可能にする。抗原持続概念の受容 は、ワクチン開発において重要な意味を持つ。理想的には抗原が免疫系に提供さ れ、特に濾胞樹状細胞にこれまでよりも拡大された期間にわたり抗原が提供され るようにワクチンを製剤出来るということで有利となるであろう。 多くのポリマーが抗原およびその他タンパク質や化合物をと りこむために用いられてきた。これの初期の例はインフルエンザ抗原を口径１ミ クロン（１，０００ナノメートル）以下のメチルメタクリレート内で重合して所 謂ナノ粒子を形成したもので、クロイター，Ｊ．，医学および薬理学におけるマ イクロカプセルおよびナノ粒子、Ｍ．ドンブロー（編）、１２５−１４８ページ （ＣＲＣプレス）により報告された。抗体応答ならびにインフルエンザウイルス の感染に対する防御は抗原が水酸化アルミニウムと併用して投与される時に著し く改善された。他の粒子を用いた実験はこれらのポリマーのアジュバント効果が 粒子のサイズおよび疎水性に依存することを示した。 いくつかの要因がマイクロカプセル化のための特定のポリマーの選択に寄与す る。ポリマー合成の再生産可能性およびマイクロカプセル化工程、マイクロカプ セル化材料および工程のコスト、毒物学プロフィール、ポリマーおよび抗原の放 出速度および物理化学的親和性、などが考慮されねばならないすべての要因であ る。 生物分解性ポリマーは多くのタイプの不安定結合の一つの周囲に設計される。 その例はポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルソエステル およびポリアミドである。自然発生ポリマーに比べてマイクロカプセル化のため 合成ポリマーを使用する利点の一つは、中立条件の下でこれらの結合の加水分解 の相対的割合がポリマーバックボーンに対する置換基により影響され得るという ことである。置換基修飾もまたポリマーの溶解性および親水性／疎水性を変化さ せるのに使用出来る。 薬剤の、つい最近では抗原の担体としてしばしば選択されるものはポリ（Ｄ， Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。調節当局による受容性は いずれの抗原デリバリシステムに対しても著しい障害として残っている。ＰＬＧ Ａポリマーは長年にわたり分解吸収可能な縫合系として使用されてきた生物分解 性および生物適合性ポリエステルであり、エルドリッジ，Ｊ．Ｈ．他、微生物学 および免疫学における今日の諸問題、１９８９年、１４６巻、５９−６６ページ で論評されている。直径１乃至１０ミクロンのＰＬＧＡマイクロスフェアへの抗 原のとり込みはアジュバント効果を持つものとして示される。 ＰＬＧＡシステムの主に不利な点は有機溶媒の使用と抗原のマイクロカプセル 化に長い調製時間がかかることである。この工程は油中水型乳剤の位相分離を利 用する。対象となる化合物は水溶液として準備され、ＰＬＧＡは塩化チメレンお よび酢酸エチルなどの適切な有機溶媒に溶解される。これら２種の不混和性溶液 は高速攪拌により共同乳濁化される。ポリマーの非溶剤が次いで加えられ、水状 液滴のまわりにポリマーの沈殿を生じ胚マイクロカプセルを形成する。 マイクロカプセルは集められ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ゼラチン、 アルジネート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、あるいはメチルセルロースな どの高分子電解質で安定化され、溶媒は真空内で乾燥もしくは溶媒抽出で除去さ れた。これらの調製条件は、Ｊ．Ｈ．エルドリッジ、他、感染と免疫、９巻、２ ９７８ページ（１９９１年）で示されたよう に、多種多様なペプチド薬剤およびブドウ球菌腸毒素Ｂやキーホールリンペット シアニンなどの抵抗力の強い免疫原のマイクロカプセル化にはうまく成功したが 、ＰＬＧＡを使用するマイクロカプセル化に必要な高い剪断力、有機溶媒の使用 および長い調製時間は、エンベロープウイルスなどのような複合不安定免疫原の 重要なエピトープに対して障害となり得る。 従ってこの発明の一つの目的には、有機溶媒あるいは長い調製時間必要としな いワクチンのカプセル化および非経口あるいは粘膜投与によるデリバリ材料を提 供することである。 この発明のも一つの目的は粘膜面とりわけ経口デリバリを通じて抗原のデリバ リを行うためのシステムを提供することである。 更にこの発明の目的は、免疫原性応答の広いスペクトルを引き出す抗原のため のデリバリシステムを提供することである。 また更にこの発明の目的は、ワクチンの免疫原性を高めるワクチンのデリバリ のためのデリバリシステムを提供することである。 また更にこの発明のも一つの目的は、抗原の調節放出を提供する生物分解性デ リバリシステムを提供することである。 発明の要約 水溶性ポリマーおよびポリマーヒドロゲルは粘膜面へのデリバリ、粘膜面での 抗原の調節放出、あるいは注射（非経口投与）のための抗原のマイクロカプセル 化のために使用される。 もっとも望ましい実施例において、カプセル化抗原は経口あるいは鼻腔内で投与 される。ポリマーは生物適合性、架橋可能水溶性ポリマーあるいはポリマーヒド ロゲルのいずれかであることが出来、それはそこにくみ込まれる抗原に緩やかで それを変性しない条件の下で２００ミクロンもしくはそれ以下の直径を持つ極微 粒子を形成するために使用出来る。望ましい天然の水溶性ポリマーは、アルジネ ート、ゼラチン、ペクチン、およびコラーゲンである。望ましい合成水溶性ポリ マーは、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（酢酸ビニ ル）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリビニルアミン、ポリ（ビニルピリジン） 、ホスファゼン高分子電解質、およびポリ（ビニルアルコール）である。イオン 架橋によりヒドロゲルを形成する望ましいポリマーはポリ（アクリル酸）あるい はポリ（メタクリル酸）の塩、スルホン化ポリスチレン、ポリアミンあるいはポ リ（ビニルピリジン）の第４級塩、およびそれらのポリマーあるいはモノマーの 混合物もしくはコポリマーである。もっとも望ましいポリマーはアルジネート、 ポリホスファゼン、およびその混合物である。 カプセル化抗原を調製するために、抗原はポリマー溶液と混合され、極微粒子 は有機溶媒の有効量を使用することなしにポリマーと抗原から急速に形成され、 またポリマーは安定した生物分解性極微粒子を形成するためにイオンもしくは共 有結合で架橋される。極微粒子は胃腸管の粘膜内層のような粘膜面に粘着し、時 間の経過で放出されるように抗原の細網内皮細胞によ りとり入れを増加させる。ポリマーは望ましくはアルジネートあるいはポリホス ファゼンであり、もっと望ましくは塩化カルシウムのような多価イオンもしくは 二価の陽イオンでイオン架橋されたものである。 実施例は、単独でもしくはコレラ毒素のような粘膜作用薬と併用してポリマー カプセル化抗原の免疫原性の向上を示し、また非経口、経口、あるいは鼻腔内に 投与する時に放出割合および体液性応答を変えるためにどのようにポリマーを操 作するかを示す。 図面の簡単な説明 図１はポリホスファゼンマイクロスフェアの浸透性のグラフであり、カプセル 化タンパク質分子量およびポリマー濃度と同じく放出パーセントで測定されたも のである。レインボータンパク質マーカーが３種の濃度：３．３％（斑点棒）、 ２．５％（平行線棒）および１．５％（黒色棒）のポリ［ジ（カルボキシルアト フェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（グリシナート）ホスファゼン］（ＰＰ）に マイクロカプセル化され、上澄みの一定量のタンパク質が分光光度で分析される 前に、２４時間室温でｐＨ７．４ＨＥＰＥＳ緩衝液で保温された。 図２はポリホスファゼンマイクロスフェアの侵食プロフィールに関する分子量 の作用を示すグラフであり、１３０キロダルトンＰＣ−ＧＩＰ（四角）、３，９ ００キロダルトンＰＣＰＰ（ダイアモンド）、１７０キロダルトンＰＣ−ＧＩＰ （円）、および４００キロダルトンＰＣＰＰ（三角）の日数で表される 期間での質量損失パーセントで測定される。 図３ａおよび３ｂはポリホスファゼンの異なる出発分子量によるＰＣＰＰヒド ロゲルの日数で表される期間での分子量分解プロフィールであり、Ｍｗは分子量 、Ｍｎは数量平均分子量、当初分子量は３，９００キロダルトン（図３ａ）およ び４００キロダルトン（図３ｂ）である。 図４はマトリックスにあるポリマー分子量と溶液にあるポリマー分子量とを比 較する分子量１７０キロダルトンのＰＣ−ＧＩＰＰヒドロゲルの日数で表される 期間での分子量分解プロフィールである。 図５は異なる分子量：１２，０００ｍｗ（四角）、６２，５００ｍｗ（ダイア モンド）、１４０，８００ｍｗ（円）、および２９５，０００ｍｗ（三角）のポ リＬ−リシンで被覆されたポリホスファゼンからのポリスチレンビードの放出パ ーセントのグラフである。直径２０ｎｍの長さである蛍光ポリスチレン（ＰＳ） ビードがポリマー１でカプセル化され、次いで異なる分子量のポリＬ−リシンで 被覆された。被覆ビードはｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液を使って室温で保温さ れた。上澄み内に放出されるポリスチレンビードは定量蛍光光度法で測定され、 最初にカプセル化されたビードのパーセントで表された。 図６ａ、６ｂおよび６ｃは、懸濁液のｆｌｕウイルスで免疫化された動物の血 清（図６ａ）、アルジネートマイクロスフェアのコレラ毒素（ＣＴ）と併用した カプセル化ｆｌｕウイルス（図６ｂ）、およびアルジネートマイクロスフェア内 でカプセ ル化されたｆｌｕウイルス（図６ｃ）のｆｌｕ特異的応答のグラフであり、それ は７、１４、２１、および２８日で（左側から右側に向けてＩｇＭ、黒色棒、Ｉ ｇＧ、平行線棒、ＩｇＡ、斑点棒の順で）抗体力価として測定される。 図７はＣＴと併用してアルジネート内にカプセル化されたインフルエンザの経 口投与に続く血清のｆｌｕ特異的抗体応答であり、ＩｇＭ、黒色棒、ＩｇＧ、平 行線棒、ＩｇＡ、斑点棒で免疫後７、１４、２１、２８および３５日に測定され た。 図８はＣＴと併用するアルジネートのマイクロカプセルでインフルエンザの経 口投与後、経口ブーストの後に糞サンプルでのｆｌｕ特異的抗体のグラフであり 、ＩｇＭ、黒色棒、ＩｇＧ、平行線棒、ＩｇＡ、斑点棒で示したブースト後７、 １４、２１、２８および３５日後に測定された。 発明の詳細な説明 一般に抗原のデリバリのためのマイクロスフェアは水溶性ポリマーもしくはヒ ドロゲルを形成するポリマーの共有結合あるいはイオン架橋により形成される。 望ましい実施例において、ポリマーは水溶性ヒドロゲルカプセル化抗原を形成す るカルシウムイオンのような二価陽イオンでイオン架橋されるアルジネートもし くはポリホスファゼンなどの水溶性ポリマーで形成される。抗原は抗原の分散が マイクロスフェアに確実に行き渡るように架橋に先立ちポリマー溶液と混合され る。より安定したポリマーはマイクロスフェアをポリアミノ酸のような高分子電 解質と更に架橋させることで形成することが出来る。 マイクロスフェアを作るのに有用なポリマー ポリマーは大体生物分解性、架橋可能水溶性ポリマーあるいは重合性ヒドロゲ ルであり、そこにとり込まれる抗原におだやかで変性させない条件の下で１０ミ クロンもしくはそれ以下の直径を持つマイクロスフェアを形成することが出来る 。ここで使用されるようにヒドロゲルはいずれかの水膨張性ポリマーと定義され る。水溶性ポリマーは水、水緩衝生理食塩水あるいは水性アルコール溶液に（典 型的には少なくとも重量で０．００１％の範囲まで）少なくとも部分的に溶解す るポリマーである。望ましい天然水溶性ポリマーは、アルジネート、ゼラチン、 ペクチン、およびコラーゲンを含む。望ましい合成水溶性ポリマーは、ポリ（ア クリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（Ｎビ ニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレン グリコール）、ポリビニルアミン、ポリ（ビニルピリジン）、ホスファゼン高分 子電解質、およびポリ（ビニルアルコール）を含む。イオン架橋によりヒドロゲ ルを形成する望ましいポリマーは、ポリ（アクリル酸）あるいはポリ（メタクリ ル酸）、スルホン酸ポリスチレン、ポリアミンあるいはポリ（ビニルピリジン） のいずれかの第４塩、およびポリマーあるいはそのモノマーの混合物およびコポ リマーを含む。もっとも望ましいポリマーはアルジネート、ポリホスファゼンお よびその混合物を含む。 ポリマーは水溶性ポリマーを非水溶性にするイオン架橋、共 有結合架橋あるいは物理的架橋により架橋することが出来る。室温での水ベース のポリマー溶液のイオン架橋によるゲル化が、有機溶媒に対する長期間の被曝、 温度の上昇および有機溶媒に溶解するポリマーに必要な乾燥を除去する。ポリマ ーは、もしポリマーが酸性側基を持つ場合には多価陽イオン、あるいはポリマー が塩基性側基を持つ場合には多価陰イオンというように、電荷された側基とは逆 の電荷を持つ多価イオンを含む水溶液内で架橋され得る。望ましくは、２価ある いは３価の金属イオン、例えばカルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、 ストロンチウム、バリウム、錫、亜鉛、および鉄、もしくは多価陽イオン、例え ばポリ（アミノ酸）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ ビニルピリジン）、多糖類、および高分子電解質複合体と形成出来る他のものに より架橋される。 アルジネート もっともよく研究されたイオン架橋可能ポリマーは天然に生じるアルジネート であり、これは食料に供される褐藻類、例えばプロンタナルＬＦ２０／６０（米 国、ニューハンプシャー、ポーツマス、プロノヴァ，インコーポレイテッド）か ら調製される。 ポリマーは望ましくは塩化カルシスムあるいは他の２価もしくは多価陽イオン を使用する多価イオンで架橋結合される。 ポリホスファゼン 一組のイオン架橋水溶性ポリホスファゼンの説明で、Ｈ．Ｒ．オールコックお よびＳ．クォン、高分子、２２巻、７５−７９ページ（１９８９年）、に記述さ れているが、それは調製にわたって水性環境のみに被曝される抗原を含むマイク ロスフェアの生成を可能にした。 ここで使用されるアミノ酸という用語は天然および合成アミノ酸の両方を指示 し、必ずしもそれに限定されないが、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロ イシニル、プロリニル、フェニルアラニニル、トリプトファニル、メチオニニル 、グリシニル、セリニル、トレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラ ギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタオイル、リシニル、アルギニニ ル、およびヒスチジニルを含む。 アミノ酸エステルの用語は、天然もしくは合成アミノ酸の脂肪族、アリルある いはヘテロ芳香族カルボン酸エステルを指示する。 ここで使用されるアルキルは、飽和直鎖、分岐あるいは環状炭化水素、もしく はその組合せで、典型的にＣ1からＣ20までのものであり、特にメチル、エチル 、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シク ロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘ キシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチ ル、ヘプチル、オクチル、ノニル、およびデシルを含む。 （アルキルあるいはジアルキル）アミノの用語はそれぞれ １個もしくは２個のアルキル置換基を持つアミノ基を指示する。 ここで使用するアルケニルおよびアルキニルという用語は、それぞれ二重ある いは三重結合を少なくとも１個持つＣ2からＣ20までの直鎖あるいは分岐炭化水 素を指示する。 ここで使用されるアリルという用語は、フェニルあるいは置換フェニルを指示 し、ここで置換基はハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロアルキル 、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メチレンジオキシ、シアノ、Ｃ（ Ｏ）（下級アルキル）、−ＣＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−ＰＯ3Ｈ、−ＣＯ2アルキル、 アミド、アミノ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノ、およびここでアリル 基は３個までの置換基を持つことができる。 脂肪族という用語は、典型的にはＣ1からＣ20の炭化水素を指示し、それはア ルキル、アルケニル、アルキニル成分の一つもしくはその組合せを含むことが出 来、直鎖、分岐、あるいは環状もしくはその組合せでもあり得る。 ここで使用されるハロという用語はフッ素、塩素、臭素、およびヨー素を含む 。 アラルキルという用語は、アルキル置換基を持つアリル基を指示する。 アルカリルという用語は、ベンジル、置換ベンジル、フェネチル、あるいは置 換フェネチルを含むアリル置換基を持つアルキル基を指示し、ここで置換基はア リル基として前記定義の通りである。 ここで使用されるヘテロアリルあるいはヘテロ脂肪族という用語は、少なくと も１個の硫黄、酸素、あるいは窒素を芳香族環に含み、アリル基として前記記載 の通り場合によっては置換される。限定されない例として、フリル、ピリジル、 ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジ ニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ チエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベン ジミダゾリル、プリニル、カルボゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチア ゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、ピラゾリ ル、キナゾリニル、ピリダジニル、ピラジニル、シノリニル、フタラジニル、キ ノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、プテリジニル、５−アザシチ ジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、 ピロロピリミジニル、およびピラゾロピリミジニルがある。 「調剤許容イオン」の用語は、電荷を運び、ホスファゼン高分子電解質におけ る対抗イオンとして投与することの出来る有機あるいは無機成分を指示する。 ここで使用されるヘテロアルキルという用語は炭素鎖にありあるいは炭素鎖を 終結させる（水素あるいは酸素で完成される原子価を持つ）酸素、硫黄、あるい は窒素のようなヘテロアトム（異種原子）を含むアルキル基を支持する。 ここで使用されるポリ［（カルボキシルアトフェノキシ）（グリシナート）ホ スファゼン］、ポリ［ジ（カルボキシルア トフェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（グリシナート）ホスファゼン−コ−（カ ルボキシルアトフェノキシ）（グリシナート）ホスファゼン］およびポリ［ジ（ カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（グリシナート）ホスファ ゼン］は同ポリマーを指示する。 ポリホスファゼンは望ましくはその対抗イオンと釣合う酸あるいは塩基の形態 、もしくはそのイオン塩の形態のいずれかで、電荷側基を含む。 ポリマーは望ましくは生物分解性であり、ヒトを含む動物に投与される時に最 小の毒性を示す。 ホスファゼン高分子電解質の選択 ポリホスファゼンは交互する単一および二重結合により分離される交互するリ ンおよび窒素よりなるバックボーンを持つポリマーである。各リン原子は２個の ペンダント基（“Ｒ”）に共有結合される。ポリホスファゼンの反復単位は下記 の一般式 を持ち、ここでｎは整数である。 置換基（“Ｒ”）はポリマー内で変化出来る種々様々な成分であることが出来 、必ずしもそれに限定されないが、脂肪族；アリル；アラルキル；アルカリル； カルボン酸；ヘテロ芳香族；グルコースを含む炭水化物；ヘテロアルキル；ハロ ゲン； アルキルアミノ−を含む（脂肪族）アミノ−；ヘテロアラルキル；ジアルキルア ミノ−、アリルアミノ、ジアリルアミノ−、アルキルアリルアミノ−を含むジ（ 脂肪族）アミノ−；必ずしもそれに限定されないが−オキシフェニルＣＯ2Ｈ、 −オキシフェニルＳＯ3Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシルおよび−オキシフェ ニルＰＯ3Ｈを含む−オキシアリル；−オキシアルキル、−オキシ（脂肪族）Ｃ Ｏ2Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＳＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ3Ｈを含む−オキ シ脂肪族；および−オキシ（アルキル）ヒドロキシル、−オキシアルカリル、− オキシアラルキル、を含む−オキシ（脂肪族）ヒドロキシル；チオアリル；−チ オアルキル、−チオアルカリル、−チオアラルキルを含むチオ脂肪族；−ＮＨＣ （Ｏ）Ｏ−（アリルあるいは脂肪族）、-Ｏ-[(ＣＨ2)ｘＯ]ｙ-(ＣＨ2)ｘＮＨ2、 -Ｏ-[(ＣＨ2)ｘＯ]ｙ(ＣＨ2)ｘＮＨ(ＣＨ2)ｘＳＯ3Ｈ、および-Ｏ-[(ＣＨ2)ｘＯ ]ｙ-（アリルあるいは脂肪族）であり、ここではｘは１から８でｙは１から２０ までの整数である。この基は例えば酸素、硫黄、窒素、あるいは炭素原子を経て リン原子と結合することが出来る。 一般にポリホスファゼンが一種以上のペンダント基を持つ場合には、この基は ポリマー内をランダムに変化し、従ってポリホスファゼンはランダムコポリマー である。リンは２個の類似の基あるいは２個の異なった基に結合することが出来 る。ポリホスファゼンで２個もしくはそれ以上の種類のペンダント基を持つもの は、ポリ（ジクロロホスファゼン）を１個もしくは複数の救核基を望ましい割合 で反応させて生産することが出来 る。ポリホスファゼンでペンダント基の生成する割合は、ポリマーを生産するの に使用される出発材料の割合、救核基置換反応が実施される温度、および使用さ れる溶媒系などを含む多くの要因で決定される。生成ポリマー内の基の正確な置 換パターンを決定するのは非常に難しいが、一方、ポリマー内の基の割合は当業 者の１人により容易に決められることが出来る。 一つの実施例において、生物分解性ポリホスファゼンは次ぎの式； を持ち、ここでＡおよびＢは独立してポリマー内で変化することが出来、以下の 基であることが出来る。 （ｉ）使用条件の下で加水分解を受け易い基で必ずしもそれに限定されないが、 塩素、アミノ酸、（アミノ基を通じて結合する）アミノ酸エステル、イミダゾー ル、グリセロール、あるいはグルコシルなどを含む基、あるいは （ii）使用条件下で加水分解を受け難い基で、必ずしもそれに限定されないが、 脂肪族；アリル；アラルキル；アルカリル；カルボン酸；ヘテロ芳香族；ヘテロ アルキル；アルキルアミノ−を含む（脂肪族）アミノ−；ヘテロアラルキル；ジ アルキルアミノ−、アリルアミノ−、ジアリルアミノ−、アルキルアリルアミノ −を含むジ（脂肪族）アミノ−；それに限定されないが−オキシフェニルＣＯ2 Ｈ、−オキシフェニルＳＯ3Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシル、および−オキ シフェニル ＰＯ3Ｈを含む−オキシアリル；−オキシアルキル、−オキシ（脂肪族）ＣＯ2Ｈ 、−オキシ（脂肪族）ＳＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ3Ｈを含む−オキシ脂肪 族；−オキシ（アルキル）ヒドロキシルを含む−オキシ（脂肪族）ヒドロキシル ；−オキシアルカリル；−オキシアラルキル；チオアリル；−チオアルキル、− チオアルカリル、あるいはチオアラルキルを含む−チオ脂肪族、などの基。 ここでポリマーは、使用条件の下で加水分解を受け難い反復単位を少なくとも １％もしくはそれ以上、望ましくは１０％もしくはそれ以上、またより望ましく は８０乃至９０％もしくはそれ以上で１００％以下で含み、また、 ｎは４もしくはそれ以上、また望ましくは１０から２０，０００までの整数で ある。 イミダゾール以外のヘテロ芳香族基のようなある種の基は、血液内で見出され るような中性水性条件の下では極端にゆっくりした割合で加水分解し、従ってこ こでの目的のためには典型的に非加水分解基と見做されることは理解されねばな らない。しかし例えば胃内で見出される例えば低ｐＨのような条件下では、（イ ミダゾール以外のヘテロ芳香族のような）通常は非加水分解基の加水分解の割合 は、ポリマーの生物分解性が影響される点まで増加することがあり得る。十分に 周知の技術を使用する当業者の１人は、ペンダント基が使用条件の下で有意の割 合で加水分解するかどうかをたやすく決定することが出来る。当業者の１人はま たここに記載された異なった構造を持つポリホスファゼンの加水分解率を決定す ることが出来るし、標的用 途での望ましい生物分解プロフィールを提供するポリホスファゼンを選択するこ とも出来るであろう。 ポリマーの加水分解性の度合は、加水分解を受けやすいペンダント基の割合お よび加水分解可能基の加水分解率の関数となるであろう。加水分解可能基は、ポ リマーに加水分解不安定性を与えるＰ−ＯＨ結合を提供するために、水状環境下 でヒドロキシル基により代替される。 他の実施例においては、ポリホスファゼンは、（ｉ）ポリマーのペンダント基 のいずれもあるいは事実上いずれも使用条件の下で加水分解を受けない非生物分 解性ポリホスファゼン、あるいは、（ii）使用条件の下で（例えばポリ［ジ（エ チルグリシナート）−ホスファゼン］のように）すべての基が加水分解を受けや すい完全に生物分解性ポリホスファゼン、である。 ホスファゼン高分子電解質はここでポリホスファゼンに陰イオン、陽イオン、 あるいは両染性を付与するイオン化もしくはイオン化可能ペンダント基を含有す るポリホスファゼンと定義される。イオン基は塩、あるいは少なくとも部分的に 解離することの出来る酸もしくは塩基の形をとることが出来る。いずれかの薬理 的に許容出来る単価陽イオンは、必ずしもそれに限定されないが、ナトリウム、 カリウムおよびアンモニウムを含む塩の対抗イオンとして使用することが出来る 。更にホスファゼン高分子電解質は、非イオン側基を含むことが出来る。ホスフ ァゼン高分子電解質は使用条件の下で生物分解性もしくは非生物分解性であるこ とも出来る。イオン化もしくはイオン化可 能ペンダント基は使用条件の下では望ましくは加水分解を受け難いものである。 望ましいホスファゼン高分子電解質はカルボン酸、スルホン酸、あるいはヒド ロキシル成分を含むペンダント基を含有する。酸性基は通常非加水分解ペンダン ト基にあるが、それは代替的にあるいは組合せとして加水分解可能基に位置する こともある。カルボン酸基を側鎖として持つホスファゼン高分子電解質の例は下 記の式： で示され、ここでｎは整数であり、望ましくは１０から１０，０００までの間の 整数である。このポリマーはポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファ ゼン］あるいは代替的にポリ［ビス（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼ ン］（ＰＣＰＰ）という化学名を持つ。 ホスファゼン電解質は望ましくは生物分解性である。ここで使用される生物分 解性という用語は、約２５℃−３７℃の温度で一度ｐＨ６−８の生理溶液に曝さ れると、典型的には約５年以内でもっとも望ましくは１年以内に望ましい用途で 使用される期間内で分解するポリマーである。 もっとも望ましくは、ポリマーは使用条件の下で加水分解し ないカルボン酸成分を含むペンダント基および使用条件の下で加水分解を受けや すいペンダント基を含むポリ（オルガノホスファゼン）である。加水分解感受性 基を持つ望ましいホスファゼン高分子電解質の例は、特にポリ［ジ（カルボキシ ルアトフェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（グリシナート）ホスファゼン−コ− （カルボキシルアトフェノキシ）（グリシナート）ホスファゼン、およびポリ［ ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（クロロ）ホスファゼ ン−コ−（カルボキシルアトフェノキシ）（クロロ）ホスファゼン］を含むポリ ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン−コ−ジ（アミノ酸）ホスフ ァゼン−コ−（カルボキシルアトフェノキシ）（アミノ酸）ホスファゼンである 。 ポリホスファゼンの毒性は、当業者に周知の細胞培養実験を用いて測定される 。例えばポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］の毒性は、細 胞培養皿をポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］で被覆する 細胞培養で測定された。ニワトリ胚芽繊維芽細胞は次いで被覆ペトリ皿に接種さ れた。ニワトリ胚芽繊維芽細胞を接種３日後に細胞は平坦になり紡錘形を形成し た。位相差顕微鏡の下で、有糸核分裂像が観察された。これらの観察は細胞を複 製するためにポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］の無毒性 の証拠を提供する。 架橋ポリホスファゼンは、ホスファゼン高分子電解質を、亜鉛、カルシウム、 ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、 あるいはカドミウム などの金属多価陽イオンと結合させることにより調製することが出来る。 ホスファゼン高分子電解質の合成 ホスファゼン高分子電解質を含むポリホスファゼンは、当業者にとって既知の 方法に従って、ポリ（ジクロロホスファゼン）を広範囲の化学試薬もしくは試薬 の混合物と反応させる高分子求核置換反応により調製することが出来る。望まし くは、ホスファゼン高分子電解質はポリ（ジクロロホスファゼン）を塩素を置換 する適切な求核試薬と反応させることにより作られる。ポリマーの非加水分解側 鎖に対する加水分解可能側鎖の望ましい割合は、ポリ（ジクロロホスファゼン） と反応する対応する求核試薬の量および必要とされる反応を調節することにより 得ることが出来る。 例えば、ポリ［（カルボキシルアトフェノキシ）−（グリシナート）ホスファ ゼン］（ＰＣ−Ｇ１ＰＰ）は、ポリ（ジクロロホスファゼン）の塩素原子をプロ ピル−Ｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびエチルグリシナートヒドロクロライド と求核置換反応させることにより調製される（ＰＣ−Ｇ１ＰＰ合成）。このよう にして得られたポリ［（アリルオキシ）（グリシナート）ホスファゼン］エステ ルは、次いで対応するポリ（カルボン酸）に加水分解される。他のポリホスファ ゼンは、オールコック、Ｈ．Ｒ.、他、無機化学、１１巻、２５８４ページ（１９ ７２年）；オールコック、Ｈ．Ｒ.、他、高分子、１６巻、７１５ページ（１９８ ３年）；オールコック、Ｈ． Ｒ.、他、高分子、１９巻、１５０８ページ（１９８６年）；オールコック、Ｈ． Ｒ.、他、バイオマテリアル（生体組織接触部位補綴用物質）、１９巻、５００ペ ージ（１９８８年）；オールコック、Ｈ．Ｒ.、他、高分子、２１巻、１９８０ペ ージ（１９８８年）；オールコック、Ｈ．Ｒ.、他、無機化学、２１巻（２）、５ １５−５２１ページ（１９８２年）；オールコック、Ｈ．Ｒ.、他、高分子、２２ 巻、７５−７９ページ（１９８９年）；米国特許番号４，４４０，９２１号、４ ，４９５，１７４号、４，８８０，６２２号、オールコック、Ｈ．Ｒ.、他；米国 特許番号４，９４６，９３８号、マッギール、他；米国特許番号５，１４９，５ ４３号、コーエン、他；およびグロールマン、他、調節放出ジャーナル、３，１ ４３号（１９８６年）の公開情報で記載されており、そこでの教訓および開示さ れたポリマーは、引用文献としてここに組込まれている。 抗原の選択 抗原は細胞、細菌、あるいはウイルス粒子、もしくはその部分から誘導される 。ここで定義されたように、抗原はタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク 質、糖脂質、核酸、あるいはその組合せから誘導することが出来、それは動物、 例えば哺乳類、鳥類、あるいは魚類における免疫原性応答を誘発する。ここで定 義されたように、免疫原性応答は体液性あるいは細胞媒介的である。免疫原性応 答が指向する材料が抗原性に乏しい場合には、それは例えばいくつか商業的に利 用出来る試薬キッ トの一つで標準共有結合手法を使ってアルブミンなどの担体もしくはハプテンに 接合することが出来る。 一つの実施例において、核酸が発現される細胞に抗原をコード化する核酸をデ リバリするためにポリマーが使用される。 望ましい抗原の例はインフルエンザタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ Ｖ）タンパク質、インフルエンザ菌、およびＢ型肝炎タンパク質、およびグラム 陰性細胞壁および淋菌タンパク質などのようなリポ多糖類を含む。 培養時の細胞のウイルス感染は、２種類のウイルス粒子、成熟感染ウイルスお よび核酸を欠くある感染ウイルス状粒子を生成する。ウイルスが細胞培養で高力 価で複製する場合には不活性化ウイルス粒子を経口ワクチンに使用することが望 ましい。細胞培養で成長することが出来ないか、もしくは腫瘍化するウイルスに 対しては、非複製ウイルス状粒子（ＶＬＰｓ）を生産する組換えＤＮＡ技術を使 用することが出来る。組換え技術を使って、固有の複雑性のため前記２種のアプ ローチのいずれにも適していないウイルスから、その表面に防護抗原（プソイド タイピング）を展示するウイルス状粒子を構築することが出来る。前記のすべて の抗原はウイルス粒子構成成分であるが、防護免疫を引き出す抗原は必ずしもす べてが構成抗原ではない。防護抗原が非構成成分であるような場合には、そのよ うな抗原を自己組立てウイルス状粒子の表面に遺伝子的に融合させることが出来 る。 アジュバント ある実施例では、粘膜あるいは非経口デリバリのためカプセル化された抗原に アジュバントを含めることが望ましい。 経口投与のためのアジュバント 微量のコレラ毒素（ＣＴ）（コレラ毒性サブユニットＡ、コレラ毒性サブユニ ットＢ、あるいはその両方のいずれか）および第２抗原の混合物の経口投与が共 同投与抗原に対する粘膜免疫を刺激する。更に抗原のみの経口デリバリにより引 き出される免疫寛容性に代る第２抗原に対しての劇的な液性免疫応答が存在する 。かくして粘液デリバリＣＴは粘膜および液性免疫両方の強力な免疫刺激剤ある いはアジュバントとして機能する。このアジュバント作用のメカニズムは、パイ エル板の上に乗るドーム細胞（あるいはＭ細胞）に特異的に結合し、次いでドー ム細胞に通常結合しあるいは結合しない抗原に対する免疫応答性を賦与するよう にリンパ球系細胞を変化させるＣＴの能力によるものである。最近ではこの結合 機能はコレラ毒素の非毒性Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）分子に局在化してきた。 かくして抗原へのＣＴ−Ｂの追加が同一抗原に対するＣＴにより引き出される免 疫応答を模倣することが示された。従ってしばしば望まれることは、ＣＴをマイ クロカプセル化ワクチンに含ませることで経口投与抗原の免疫原性を高めること である。 非経口投与のためのアジュバント アジュバントの例はムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、サイトカイ ン、ジフテリア毒素およびエキソトキシンＡ である。商業的に利用出来るアジュバントは、マサチューセッツ、ウォーセスタ ー、ケンブリッジ バイオサイエンシズのＱＳ−２１およびリビ イミューノケ ムのモノホスフォリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）を含む。 更にまたここで示されるのは、ポリホスファゼンが経口あるいは非経口投与さ れる際にアジュバント作用を持ち得るということである。特にマイクロスフェア がアルジネート９５％およびポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）で形成される場合に その免疫原性を高めることを実施例が示している。 免疫原性組成物の調製 ポリマーは例えば米国特許番号５，１４９，５４３号、コーエン、他、あるい は米国特許番号４，３５２，８８３号、リム、他の方法を用い、その教訓はここ に組み込まれており、あるいはポリマーおよび抗原の溶液をスプレー乾燥するこ とにより、抗原をカプセル化するのに使用される。代替的には抗原およびアジュ バントを含むマイクロスフェアが水溶液成分を単純に混和し、次いで極微粒子を 形成するための機械的力でポリマーをある物質と一緒に凝固させることにより調 製することが出来る。 ここで使用される「マイクロカプセル」という用語は別途説明のない限り極微 粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルを包含する。一般に有用なこ れらのマイクロカプセルは１乃至２００ミクロンの間、望ましくは経口投与のた め１乃至１５ミクロンの間、また注射用の限定要素は針のサイズである が注射用として望ましくは１乃至１００ミクロンの間の微粒子直径を持つもので ある。 望ましい実施例でポリホスファゼン／抗原溶液はまず抗原をＮａ2ＣＯ3，３％ の１部に攪拌しながら溶解させ、次いでＰＣＰＰを溶解するまで攪拌しながら追 加し、またｐＨ７．４のリン酸緩衝液３部をゆっくり加えることで調製された。 洗剤Ｂｒｉｊ５８はポリマー溶液を攪拌しながら最終濃度が０．２％になるよう に加えられた。ＰＣＰＰの最終濃度は２．５％である。ナトリウムアルジネート ／抗原溶液は適切な量の抗原をイオン除去水に溶解して調製される。アルジネー トは次いでアルジネートの最終濃度が１．２５％になるように抗原溶液にゆっく り加えられる。絶えず攪拌しポリマーを抗原にゆっくりと加えることは、等質の 溶液を得るために必要である。 経口デリバリ用のマイクロスフェアを製造するためのもっとも望ましい例で、 マイクロスフェアは、１５０μｌ／ｍｉｎの速度でくみ出しポンプを使ってポリ マーおよび抗原溶液を噴霧ノズル（カナダ、オッタワ、ターボタック）に送り込 むか、もしくは１８ゲージ平滑末端針を備えた超音波スプレーノズル（ニューヨ ーク、ファーミングデール、メドソニック、インコーポレイテッド）に送り込ま れて生成される。分散抗原を含むポリマー溶液は次いで空気圧力が平方インチ当 り約３５ポンドの下でノズルの１．０ｍｍの穴を通して押し込まれる。ポリホス ファゼンとしては、微小液滴はそれがＣａＣｌ2，７．５％、Ｂｒｉｊ５８，０ ．５％浴にノズルか ら３５ｃｍの所でぶつかる際に架橋する。Ｂｒｉｊ５８はマイクロスフェアの塊 状化を防止するために加えられる。ＣａＣｌ2，１．５％浴（Ｂｒｉｊ５８のな いもの）がアルジネートマイクロスフェアのゲル化のために使用される。マイク ロスフェアは次いですばやく遠心分離管に移され、架橋工程を完成し、かつＣａ Ｃｌ2浴で沈殿して起こるマイクロスフェア凝集塊を避けるために約３０分間ゆ っくり振動させられる。凝集はマイクロスフェア表面にある露出したカルボキシ ル基の間のＣａ++架橋およびもしくはマイクロスフェア間の疎水相互作用による ものである。３０分後、マイクロスフェアは４℃、２８００ｒｐｍ、１５分の遠 心分離で収集された。上澄みは棄てられ、ペレットは一度に洗浄され無菌イオン 除去水で再懸濁された。マイクロスフェアは４℃で分析まで貯蔵された。これら の条件で生成したポリホスファゼンマイクロスフェアの約９０％は直径が１から １０ミクロンの範囲にあった。 より大きなマイクロスフェアはより大きい吐出口および低い空気圧を用いて作 られた。 ポリマー−抗原接合体 ポリマーはまた当業者にとって周知の方法に従って水溶性接合体を創り出すた めに抗原と共有接合され、通常は抗原側のアミノあるいはカルボキシル基および ポリマー側のイオン化可能側基の一つとの間の共有結合により行われる。 免疫原性組成物の投与 抗原を含むヒドロゲルマイクロスフェアは粘膜あるいは非経口投与することが 出来る。粘膜面へのデリバリの必ずしも限定されないルートの例は、鼻腔内（あ るいは一般に鼻関連リンパ系組織）、呼吸器系、腟、および直腸である。非経口 デリバリの必ずしも限定されない例は、皮内、皮下、および筋肉内を含む。 抗原は天然に発生するアルジネートおよび合成ポリホスファゼンの両方でカプ セル化することが出来る。抗原装荷の水準、放出速度およびマイクロスフェアの サイズ分布は生成する免疫応答を変化させるのに使用される。この用量は後述す る実施例で示されるようにポリマー−抗原投与により引き出される抗体の力価に もとづいて、抗原装荷および用量を投与する標準技法さらに各抗原の投与スケジ ュールにより決定される。 免疫原性ワクチン組成物が、他の薬理許容成分、例えば水、生理食塩水、ある いはＤｒａｋｅｏｌTM、ＭａｒｋｏｌTMのような鉱油およびスクアレンを含み、 乳濁液を形成し、あるいは水状緩衝液と併用され、もしくは胃内を通過する際に 分解からマイクロカプセルを防護するためにカプセルあるいは腸溶剤皮でカプセ ル化することが出来ることは当業者により理解されるであろう。 抗原原性組成物の貯蔵 イオン架橋マイクロスフェアはその完全性を保持するために緩衝液に貯蔵され る必要がある。ポリマーマトリックス内にとじ込めたマイクロスフェアおよび抗 原の完全性を維持するよう に条件は定められてきた。抗原を含有するマイクロスフェアは無菌イオン除去水 で４℃で貯蔵され、７日間安定している。食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの 標準緩衝液が使用出来ないのは、カルシウムイオンのナトリウムによる置換でマ トリックスの液化に導かれるためである。マイクロスフェアをポリＬリシンある いはその他の架橋剤のようなアミノ酸ポリマーで被覆するとＰＢＳで貯蔵するこ とが出来る。 この発明は更に以下の限定されない実施例を引用することでより理解されるで あろう。 実施例１：毒性の研究 アルジネートはヒトの消費出来るものとして認められている。ポリホスファゼ ンは標準の方法を用いて非毒性を示すために検定することができる。ポリフォス ファゼンは生細胞に対し非毒性であることがこれまで示されてきた。Ｍ．Ｃ．バ ーノ、他バイオ／テクノロジー，９巻、４６８ページ（１９９１年）で報告され たように、ハイブリドーマ細胞が１５０から２００ミクロンの間の直径を持つポ リホスファゼンマイクロスフェアにカプセル化された。カプセル化ハイブリドー マ細胞は細胞分裂を受け、カプセル化の１０日後までに、マイクロスフェアは基 本的に生細胞で充填された。追加の研究がここで記述される。 第１の研究で細胞培養皿はポリホスファゼンで被覆され、次いでニワトリ胚芽 繊維芽細胞が被覆ペトリ皿に接種された。ニワトリ胚芽繊維芽細胞接種３日後細 胞は平たくなり紡錘形とな り、位相差顕微鏡の下で誰でも有糸分裂像を観ることが出来る。これは細胞培養 でポリホスファゼンの無害性を示すものであった。 第２の生体内毒性研究ではアルジネートおよびポリホスファゼンの急性毒性が 生後６−８週のＳＤラットで評価された。この研究はグループ当り５匹のオスラ ットの４グループよりなる。１晩絶食の後各グループの各動物は胃管栄養を経由 してポリマー５０００ｍｇ／ｋｇ（水）の単一経口用量を受けた。用量は２０ｍ ｌ／ｋｇであった。１グループの動物は水を受け入れ、対照グループとして役立 たせた。２グループの動物はアルジネートマイクロスフェアを受けた。３グルー プのラットはポリＬリシンＭ．Ｗ．６８，０００で被覆されたアルジネートマク イロスフェアを受けた。４グループの動物はポリ［ジ（カルボキシルアトフェノ キシ）ホスファゼン］マイクロスフェアを受けた。動物は７日間臨床観察された 。体重が免疫前第１日、および安楽死の時に記録された。血液サンプルが安楽死 の際ＣＯ2による麻酔後眼窩後血流洞の穿刺により得られた。動物は血液収集の 前に一晩絶食された。組織は剖検で検討され保存された。 マイクロスフェアを受けたラットと対照グループのラットの間には体重の増加 に著しい差異は見られなかった。血液学および臨床化学の結果は各グループのす べてのラットについて正常であった。剖検のいずれかの器官でも観察された異常 性に関連する処置は存在しなかった。この研究は５０００ｍｇ／ｋｇの経口用量 でポリホスファゼンおよびアルジネートマイクロス フェアが急性毒性ではないことを示した。 実施例２：タンパク質のとり込みおよびマイクロスフェアの放出特性 免疫応答を引き出すマイクロカプセル化抗原のために、抗原はマイクロスフェ アから放出されねばならない。抗原は２種の異なったしかし相互に排他的でない 拡散と侵食という過程を通じてマイクロスフェアから放出される。もしヒドロゲ ルが分散抗原を透過出来るなら、マイクロスフェアとマトリックスを充填する水 相に続いて、抗原はマイクロスフェアから単純に拡散出来る。従って、抗原の放 出は抗原に対するマイクロスフェアマトリックスの透過性の指標である。逆にポ リマーマトリックスに対する抗原の吸着は、マイクロスフェアからの抗原の拡散 を減少するかもしくは除去するのに役立つであろう。 放出速度の特性付け タンパク質分子量マーカー（エイマーシャム）およびＦＩＴＣ標識ウシ血清ア ルブミン（シグマ）が溶解性タンパク質の放出速度を研究するためにマイクロカ プセル化された。２０ｎｍポリスチレンビード（デューク サイエンティフィッ ク）の放出速度が比較の目的で使用することが出来る。 マイクロスフェア内のタンパク質の定量 免疫原性研究のために、マイクロスフェア内のタンパク質量 がとり込みパーセントを評価するためのマイクロフェア創出直後に、また既知の 抗原量のデリバリを確かめるための動物への注射直前にいずれも直接測定される 。 マイクロスフェアのタンパク質量はバイオ−ラッドタンパク質検定等の標準検 定では評価出来ない。タンパク質はヒドロゲルを検出する原因となるＣａ++をキ レート化してマイクロスフェアから放出することが出来るが、２価の陽イオンを 含むバイオ−ラッド試薬の追加はポリマーを再架橋させ抗原を染料試薬に対し利 用出来なくさせる原因となり得る。 イオン架橋マイクロスフェアにカプセル化されたタンパク質抗原の定量は、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ内の無傷マイクロフェアの既知の量を電気泳動させて測定される 。電気泳動の間に、タンパク質はマイクロスフェアマトリックスから移動しポリ アクリルアミドゲルに入る。タンパク質濃度はマイクロスフェア標本に対し平行 して電気泳動するカプセル化タンパク質の既知の量と比較することにより測定さ れる。 マイクロスフェアのサイズの測定 １乃至１５ミクロンのマイクロスフェアがアジュバント作用を持つものと考え られ、従って望ましいものである。アルジネートおよびポリホスファゼンマイク ロスフェアのサイズはコールターＬＳ１００微粒子寸法測定器で測定される。こ のサイズは１乃至１０ミクロンのサイズの％数字として報告されている。 ポリホスファゼンマイクロスフェアからの抗原放出の修飾 − ポリマー濃度および抗原分子量の作用 ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］の透過性がポリアク リルアミドゲル電気泳動に普通使用される１４，０００乃至２００，０００ダル トンの分子量にわたるタンパク質分子量マーカー（レインボーTMタンパク質分子 量マーカー（エイマーシャム コーポレーション））のカプセル化により調査さ れた。タンパク質の放出は上澄みの分光光度測定により検定された。 この結果は図１で示される。１４．３キロダルトン分子量のリゾチームのよう な特定のタンパク質の透過性はゲルの中にあるポリマーの濃度により影響を受け る。ポリマー濃度が１．５％から３．３％に上昇するにつれて、マイクロカプセ ルマトリックスからのタンパク質の拡散は著しく減少する。同様にタンパク質の 分子量が増加するにつれて、マトリックスからのタンパク質の拡散は遅延する。 例えば２００キロダルトン分子量のミオグロビンタンパク質は３．３％のポリホ スファゼンマトリックスから２４時間以内に拡散出来なかった。 ポリマー分子量および組成物の作用 抗原がマイクロフェアから放出される第２のメカニズムはマイクロスフェアを 構成するポリマーマトリックスの侵食を通じてである。侵食はゲル化反応の逆転 を通じて発生し、ポリマー 分子の可溶化および周囲の水状環境へのその回帰に帰着する。ポリホスファゼン マイクロスフェアの分解は生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で質量損失、ポリマー マトリックスの分子量および溶解物の形成をモニターすることにより研究された 。各種分子量のＰＣＰＰマイクロスフェアにとっての侵食プロフィールは図２で 示される。溶液内で高分子量のＰＣＰＰマイクロスフェアを２０日保温し、また 更に１８０日間に延長したが検出出来る質量損失は観察されなかった。しかし同 じ期間でＧＰＣデータはポリマー分子量の著しい減少を示している（図３ａ）。 分解のメカニズムは明らかに分子内カルボキシル基触媒作用を含むことが出来る 。マイクロスフェア調製のために低分子量のＰＣＰＰを使用すると、最初の１０ 日間でヒドロゲルの著しい侵食およびポリマー分子量の減少に導かれる（図３ｂ ）。マトリックスにあるのと事実上同じ分子量の水溶性ポリマー産物が検出され た。 このシステムでマトリックスから溶液へのポリホスファゼンの放出で約２００ キロダルトンの分子量閾値が存在することをこれらのデータは示している。しか しポリマーの溶解度はマトリックスで支持されるカルシウムイオン（あるいは他 の多価陽イオンもしくはポリマー）の量および高分子の電離度に依存する。ＰＣ ＰＰの侵食で観察される差異は抗原デリバリシステムにとってはもっとも重要な ものである。 ポリホスファゼンは加水分解度を含め調節可能な諸物性を提供出来る適切な側 基をとり込むことにより効果的にあつらえることが出来る。グリシナート基など の加水分解感受性ペンダン ト基の導入は水状架橋の下で分解速度を増加させる。ヒドロキシ誘導体を産出す るためにこれらのアミノホスファゼンの中性培地に現れる外部Ｐ−Ｎ結合の切断 が、ポリマーに加水分解不安定性を付与する。 グリシナート基の１０％を含むポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホス ファゼン−コ−ジ（グリシナート）ホスファゼン］（ＰＣ−Ｇ１ＰＰ）がマイク ロスフェアの調製および分解の研究に使用された。これらのポリマーヒドロゲル の侵食割合はまたポリホスファゼンの分子量に依存する。重量平均分子量１３０ キロダルトンのＰＣ−ＧＩＰＰは、図２で示されるように、３日以内に質量損失 が１００％になる。図４におけるマトリックスおよび溶解物のＧＰＣ分析は、水 状環境で２４０日間保温するとポリマーバッグボーンが分解して１キロダルトン 以下の分子量を持つ断片および無機リン酸塩になることを示している。高分子電 解複合膜を産出するためにヒドロゲルマイクロスフェアをポリＬリシン（分子量 ６２キロダルトン）で被覆すると、侵食率は２．５倍も著しく減少するが、これ は立体障害がポリホスファゼンマイクロスフェアの分解性および安定性を調節す る追加のアプローチを明らかに提供するためである。 架橋剤の作用 マイクロスフェアからの抗原放出を調節出来る第３の手段は、マイクスフェア の外側に半透過性膜を形成するポリＬリシンあるいは類似の多価イオンを用いて ポリホスファゼンマイク ロスフェアを被覆することによる。マイクロスフェアコアは次いでＥＤＴＡなど のようなキレート剤の追加により液化されるが、キレート剤はゲル化工程を逆転 させポリホスファゼンマトリックスの可溶性を生み出す。透過性の度合いは被覆 工程で使用される多価イオンのサイズにより調節出来る。１２乃至２９５キロダ ルトンの分子量にわたるポリＬリシンで架橋したマイクロスフェアからの放出パ ーセントが図５で示される。ポリＬリシンの分子量が増加するにつれて、被覆の 透過性は増加し、その結果マイクロスフェアからのポリスチレンビード２０ｎｍ の放出が増加した。 ポリホスファゼン濃度を変化させ、ポリマーの側基を変更しまたマイクロスフ ェアをポリＬリシンで被覆する能力は、マイクロスフェアが拍動性およびもしく は持続性放出速度で抗原を放出するマイクロスフェアを形成することを可能にす る。ゲル化およびマイクロスフェア形成のための非常に穏やかな条件を組合わせ たこのポリマーシステムの操作可能性により、抗体および免疫応答を誘導する単 一用量ワクチンを開発するためにはこのポリマーシステムが特に望ましいものと なる。 実施例３：試験管内および生体内免疫応答研究で測定されるマウスに経口投与さ れるアルジネートにカプセル化されたインフルエンザワクチンの効力 マイクロカプセル化抗原は経口ルートによるマウスの免疫化に使用された。免 疫応答の速度は、まず液性免疫の試験管検定により測定された。生体内研究の使 用は、抗体クラスの切替え を実施する能力、免疫応答の速さ、大きさおよび持続時間についての免疫化の用 量およびルートの効果、また免疫応答にブースターをかける必要性などの決定を 可能にする。下記に示されるようにＥＬＩＳＡ（エリザ）が全抗原特異的応答、 また同じくＩｇＧ応答のサブクラスを評価するために使用された。ＣＴＬ検定は 細胞媒介応答を評価するために行うことができた。 下記で詳細に述べるように、破傷風トキソイド（コンノートラボラトリーズ） およびインフルエンザウイルスが免疫原性研究用としてカプセル化された。マイ クロカプセル化抗原は前記の通り調製され定量された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより 測定されたアルジネートおよびポリホスファゼン内の抗原濃度は投与の前に無菌 イオン除去水で調節された。 生後７乃至８週間のメスＢＡＬＢ／ｃマウスが無作為に５個のグループに分け られた。ｆｌｕ抗原３０マイクログラムが挿管法により口径投与された。血液サ ンプルはＣＯ2麻酔マウスの眼窩後血脈洞から採取された。マウスは吸入室でＣ Ｏ2を使って安楽死させた。 ノヴァク他、ワクチン，１１巻、５５−６０ページ（１９９２年）により展開 されたインフルエンザマウス疾病モデルシステムは、マイクロカプセル化インフ ルエンザを用いる免疫化によりもたらされる防護を研究するのに用いることが出 来た。マウスは免疫後のいくつかの時間で誘発試験が行われ、各種器官のウイル ス複製水準が測定された。これまでの研究では非経口免疫は鼻および気管を完全 に防護しなかったが、それは肺にお けるウイルス増殖を完全に防護する。かくしてワクチン効力は肺におけるウイル ス複製水準を基礎にして評価することが出来る。 インフルエンザは標準方法に従って卵で成長し、タンパク質、血球凝集および プラークの各検定により定量された。インフルエンザはホルムアルデヒド溶液３ ８％の追加により最終濃度１：４０００でホルマリン不活性化された。ウイルス 感染性もまた60Ｃo源から１．２×１０6ラドのガンマ線照射に被曝させて不活性 化された。 マウス血清の抗インフルエンザ特異的抗体がｐＨ９．６の炭酸ナトリウム緩衝 液の中でインフルエンザ感染ＭＤＣＫ細胞溶菌液１０μｇ／ｍｌで被覆された９ ６ウエルマイクロタイプレートでエリザにより測定された。被覆および洗浄後タ ンパク質の非特異的結合に利用出来る部位は、ＰＢＳ溶液内にＢＳＡ２．５％を 加えることで遮断された。遮断および洗浄の後ＢＳＡ／ＰＢＳ１％内で血清の２ 倍連続希釈液がウエルに加えられた。未結合血清は洗浄除去され、ホースラディ ッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧが加えられた。未結合接合体は 洗浄除去され、血清抗体は基質０−フェニレンジアミンジヒドロクロライドを加 えて検出された。反応はＨ2ＳＯ4２Ｍの追加で停止し、吸光度は４９０ｎｍで読 み取られた。終点力価は同じ希釈の抗体負のサンプルのそれよりも著しく大きい シグナルを生産する最大のサンプルの逆数である。エリザ反応性インフルエンザ 特異的抗体のＴｇＧイソタイプは抗原に結合するマウス抗体の検出で測定された 。マウスＩｇＧサブクラ ス１，２ａ，２ｂおよび３に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ標識 ヒッジ抗マウス抗体がエリザプレートにある抗原と結合するマウス抗体で反応さ れた。 インフルエンザ血球凝集阻止抗体検定が、非特異的阻害剤を除去するためにニ ワトリ赤血球１０％で３０分保温された熱不活性マウス血清を使って行われた。 血清の２倍希釈液が９６ウエルマイクロタイタプレートに加えられ、同量のウイ ルス懸濁液８ＨＡ単位が各ウエルに追加され、室温で３０分保温された。ニワト リ赤血球０．５％懸濁液が各ウエルに加えられ、室温で４５−６０分保温された 。ＨＩ力価は赤血球の血球凝集を完全に阻害する最大希釈の逆数である。 研究の第１グループでは、グループ当り２匹のマウスよりなるＢＡＬＢ／ｃマ ウスの５個のグループが、無菌イオン除去水（グループＩ）、空のアルジネート マイクロスフェア（グループＩＩ）、インフルエンザ３０μｇを含むアルジネー トマイクロスフェア（グループＩＩＩ）、インフルエンザ３０μｇプラス コレ ラ毒素（ＣＴ）１０μｇを混合して含むアルジネートマイクロスフェア（グルー プＩＶ）、あるいは溶解性インフルエンザ３０μｇ（グループＶ）で経口挿管に より免疫された。血液および糞のサンプルが免疫後７日、１４日、２１日および ２８日に収集され、インフルエンザ抗体反応性のクラス特異性が測定された。 動物はアルジネートにマイクロカプセル化されたインフルエンザ単独もしくは コレラ毒素と併用して前記の通り免疫化された。 アルジネートマイクロカプセル化インフルエンザ抗原の結果は図６ａ，６ｂお よび６ｃで示される。インフルエンザ抗原を受けなかった対照マウス（グループ ＩおよびＩＩ）はｆｌｕ特異的血清ＩｇＭあるいはＩｇＧ応答を示さなかった。 溶解性インフルエンザ（グループＶ）は７日に低いＩｇＭ力価を誘導し、それは 少なくとも１４日まで維持されたが、図６で示されるようにＩｇＧ応答は検出さ れなかった。カプセル化ｆｌｕおよびＣＴは図６ｂで示されるように免疫後１４ 日に高水準のｆｌｕ特異的ＩｇＧを誘導した。これらの水準は２８日まで維持さ れた。アルジネートマイクロカプセルｆｌｕの単独のものは、図６ｃで示される ように、マイクロスフェアインフルエンザ−ＣＴ混合物を受けた動物で見られた ものと同じｆｌｕ特異的ＩｇＧ力価を誘導した。良好な抗体力価は１４日より早 い時期に観察され、高力価のＩｇＧは少なくとも７７日間存続した。 アルジネートカプセル化インフルエンザおよびコレラ毒素で免疫化された動物 は最初の免疫化から３５日後にブースター投与された。その結果は図７に示され る。コレラ毒素と併用されるインフルエンザのブースター投与は糞サンプルで測 定されるようにＩｇＡの生産を誘導する。 要約すると、アルジネートカプセル化ｆｌｕは血清内のＩｇＭおよびＩｇＧに 特異的な抗原の導入に粘膜アジュバンドＣＴを必要としなかった。アルジネート カプセル化インフルエンザで得られたデータは、ＣＴのない単一経口用量が高い ｆｌｕ特異的血清ＩｇＧ応答を誘導することを示す。図７にお ける結果は、ＩｇＡ抗体がＣＴのあるアルジネートカプセル化されたインフルエ ンザによる単一経口ブースター投与で誘導されることを示す。 実施例４：試験管内および生休内免疫応答研究で測定されるマウスへのポリホス ファゼンカプセル化インフルエンザワクチンの経口投与による抗体の 生産 前記の通りポリホスファゼンマイクロスフェアでカプセル化されたインフルエ ンザ単独もしくはコレラ毒素と併用した動物免疫化と同じ実験記録が続けられた 。 この結果は図８で示される。コレラ毒素がない場合、血清あるいは糞のいずれ かにも抗インフルエンザ抗体の測定可能な生産は少し遅れたもののアルジネート カプセル化抗原（図６ｂ）で示されたものと同じ様式でＩｇＭの生産が存在する 。 実施例５：マイクロカプセル化破傷風トキソイドを用いるマウスの鼻腔内免疫化 マウスは４グループにわけられ、（１）水中の破傷風トキソイド（９動物）， （２）アルジネートマイクロスフェアの破傷風トキソイド，（９動物），（３） ＰＣＰＰマイクロスフェアの破傷風トキソイド（１０動物），および（４）アル ジネート９５％／ＰＣＰＰ５％よりなるマイクロスフェアの破傷風トキソイド（ ９動物）が鼻腔内に接種された。それぞれの場合において抗原５０μｇが投与さ れた。マウスはエリザで２週後（血清）および３週後（気管支および鼻洗浄）抗 体生産を検定され た。結果は表１で示される。 ボリホスファゼンあるいはアルジネート／ポリホスファゼンマイクロスフェア の抗原鼻腔内投与が血清ＩｇＧ応答を誘導することを明確に示している。更に抗 原がアルジネートおよびＰＣＰＰの組合せでカプセル化される場合に、この投与 方法がＩｇＡ分子の生産を誘導するのに使用出来ることをこの結果が示している 。 実施例６：マイクロスフェアカプセル化破傷風トキソイドによ るマウスの非経口免疫化および従来型アジュバンドによる免疫化との 比較 伝統的に大抵の注射用非複製ワクチンは防護するのに十分な血清抗体力価を達 成するために多重用量を必要とした。明らかな理由でもって単一接種で防護を達 成することがより望まれる。従って抗原の免疫原性に対するポリホスファゼンの 作用は単一用量で皮下免疫されたマウスで検証された。水、ミョウバンおよび完 全フロイントアジュバンド処方の抗原がコンパラトールとして多くの実験に含ま れた。 アルジネートあるいはポリホスファゼンよりなるポリマーマイクロスフェアで 処方された破傷風トキソイド抗原の免疫原性が、溶解性破傷風トキソイドおよび 標準アジュバンドであるミョウバンおよび完全フロイトアジュバンド（ＣＦＡ） の破傷風トキソイドと比較された。５匹のマウスのグループが破傷風トキソイド ２０μｇで皮下ルートを用いて免疫化された。 この結果は表２で示される。抗破傷風トキソイド血清免疫応答はエリザで検定 された。溶解性破傷風トキソイド抗原およびアルジネートマイクロカプセル化破 傷風トキソイドは１３週で５１２の最大力価を誘導した。破傷風トキソイドを含 むポリホスファゼンマイクロスフェアはミョウバンあるいは完全フロイントアジ ュバント破傷風トキソイドよりも免疫後より早い時期により高い抗体力価を誘導 した。更に破傷風トキソイドを含むポリホスファゼンマイクロスフェアは免疫後 １３週でもまだ上昇を続ける抗体力価を誘導した。このおそい時点において、ポ リホスファゼンマイクロスフェア破傷風トキソイドは ６５，５３６の力価を誘導し、これは溶解性破傷風トキソイドでみられる応答よ りも約１００倍強力であり、ミョウバンおよび完全フロイントアジュバントでみ られるものと同じ位あるいは少し上まわる（２乃至４倍）ものであった。ボリホ スファゼンマイクロスフェアは破傷風トキソイドに対する抗体の誘導でアルジネ ートマイクロスフェアよりも明らかに優れていた。 破傷風トキソイドによる免疫化の用量依存効果がポリホスファゼンマイクロス フェアあるいは完全フロイントアジュバントで処方された破傷風トキソイドの量 を変更してマウスを免疫化することにより検証された。 この結果は表３で示される。ポリホスファゼンマイクロスフェア破傷風トキソ イドの免疫原性は完全フロイントアジュバント処方破傷風トキソイドに比べて非 常に有利であった。すべての時点およびすべての破傷風トキソイド用量において 、２種の処方のエリザ力価はお互いの２倍の希釈度内にあった。 実施例７：ポリマーマイクロスフェアにあるいはアジュバンドで処方されたイン フルエンザ微粒子による非経口 免疫化 マウスは更にポリマーマイクロスフェア、ミョウバンおよび完全フロイントア ジュバントに処方されたホルマリン不活性化インフルエンザウイルス５μｇで免 疫化されたが、これはその処方の相対効率が破傷風トキソイドに対するものと比 べて外膜ウイルスに対するものと同じであるかどうかを測定するためであった。 この結果は表４で示される。再度ポリホスファゼンマイクロスフェアは非常に 高い力価抗ｆｌｕ免疫応答を誘導することでは完全フロイントアジュバントと同 じ位効率的であり、水、ミョウバンあるいはアルジネートマイクロスフェアより もずっと効率的であった。破傷風トキソイドの結果とは対照的に、ミョウバンア ジュバントのインフルエンザはかなり低い力価抗ｆｌｕ応答を誘導する水溶性イ ンフルエンザおよびアルジネートマイクロカブセル化インフルエンザと同様に低 かった。これをまとめると、抗原を含むポリホスファゼンマイクロスフェアは完 全フロイントアジュバント処方抗原と同じ大きさの抗体応答を誘発することをこ の結果が示している。 マワス血清は血球凝集阻止および中和検定により機能抗体の存在を検証された 。血球凝集阻止検定は表５で示される。ＨＡＩ検定で測定されたように、ｆｌｕ を含むポリホスファゼンマイクロスフェアは７週で１２８０の抗体力価を誘発し 、一方ミョウバンおよびアルジネートマイクロスフェアのｆｌｕと同じく完全フ ロイントアジュバントのｆｌｕはＨＡＩ力価を検出出来ずあるいは誘発しても非 常に低い力価であった。 インフルエンザ感染性を中和する抗体は５０％プラーク減数検定で検定された 。ポリホスファゼンマイクロスフェアのｆｌｕは１３週までに８００の検知力価 を誘導したが、水溶解および完全フロイントアジュバントのｆｌｕは検出可能中 和抗体力価を誘導しなかった。ＨＡＩおよび中和検定はインフルエンザにとって は感受性機能抗体検定である。かくしてポリホスファゼンマイクロスフェアによ り産み出される免疫応答は完全フロイントアジュバントより優れている。 これらの処方により誘導されるＩｇＧイソタイプはエリザ検定で測定された。 結果は表７で示される。ミョウバンアジュバントのインフルエンザは予期した通 り単にＩｇＧ１応答を誘導した。完全フロイントアジュバントで処方されたｆｌ ｕは主としてＩｇＧ１応答を誘導し、それは７週でビークを迎え１３週までに衰 退していった。アルジネートおよびポリホスファゼンマイクロスフェア処方のｆ ｌｕは同じく主としてＩｇＧ１応答を誘導し、それは７週までにミョウバン処方 のｆｌｕよりも高い値であった。更にポリホスファゼンマイクロスフェア処方抗 原は、完全アジュバント処方抗原により誘導される力価に比べて非常に有利な力 価を誘導した。完全フロイントアジュバントと同じように、ボリホスファゼンマ イクロスフェアはかなりの水準のＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体を誘発した。 ＩｇＧ３イソタイプで検出される活性水準で免疫応答での著しい差異が見出され た。ポリホスファゼンマイクロスフェアは有意のＩｇＧ３抗体力価を誘導するこ との出来る唯一の処方であった。 ポリマーアジュバントおよび合成法更にワクチン組成物への使用に関するこの 発明の修飾および変更は、前記の詳細な説明から当業者にとっては明らかであろ う。このような修飾および変更は付記する特許請求の範囲内にあるように意図さ れている。Detailed Description of the Invention                 Hydrogel microencapsulated vaccine   This invention describes microspheres based on water-soluble polymers or hydrogels ( Vaccine excipient in the form of microspheres.   It was accepted on 12 July 1993 as "Phosphorus as an immune adjuvant. US Patent Application No. 08 / 090,841 entitled "Zen Polymer Electrolyte" It is what you inherit.                     Induction of immune response via mucosal surface   Many viruses use the mucosal surface as the primary site of infection. Depending on the virus , The infection remains localized on the mucosal surface or is transferred to establish a systemic infection. It will either be transferred. An example of a virus that induces local infections propagates on respiratory mucosa Flu, parainfluenza and common cold viruses Rotavirus and Norwalk factor that replicate in the mucosa. Spread from mucous membrane The viruses that induce somatic virus infection are measles, mumps, rubella, and polio. (Pediatric paralysis), hepatitis A and B, and viruses such as herpes.   Much information has been accumulated on the induction of mucosal immunity in the last few years. For example In the digestive tract, the immune response is localized to Peyer's patches embedded in the digestive tract mucosa . The lymphoid tissue at these locations is the digestive tract (gastrointestinal associated lymphoid tissue, GA LT) It is exposed to the lumen and it is possible to continuously sample the contents of the lumen. Similar Bronchiolar-associated lymphoid tissue (BALT) is a tissue located in the respiratory mucosa.   In general, many viral vaccines include live attenuated or inactivated virus preparations. After injection, the systemic protective immune status is established. The success of such a vaccine is exciting By introducing a cell-mediated and / or humoral immune response into the tin recipient It is. This systemic immunity reduces viral replication in the mucosa and leads to important target organs. Prevent the onset of disease by eliminating the viral spread of.   The use of injectable vaccines has dramatically reduced the incidence of many viral diseases. So Nonetheless, their use is associated with some undesirable effect. Live attenuated Irs vaccine may cause systemic complications, whereas inactivated vaccines are locally It may cause a reaction and even induce an allergic condition. The former reduces immunity To increase the rate of natural infections, while the latter improves on and improves on current vaccines. Hinder the development of new vaccines.   An alternative method of using an injectable vaccine is to administer the antigen, especially live attenuated virus by oral administration. It is given. Such vaccines are immune to natural wild-type infections. Induces both strong mucosal and systemic immunity that mimics the epidemiological response. This immune response Placement eliminates not only systemic spread of the virus, but also virus replication in the mucosa. Thus, the immune response elicited by the replicative oral vaccine is the injectable live vaccine. Or better than that induced by inactivated vaccines. This kind of waku The best example of Chin Is a live attenuated oral poliovirus vaccine (OPV). Unfortunately raw Oral administration of live virus survives through the stomach and does not easily return to pathogenicity. Limited to   The most effective non-replicating antiviral vaccine ever developed is inactivated It was a virus particle. Peptide and subunit vaccines in animal models The efficacy of the drug has only met with limited success and currently these types of formulations are used. There is no human vaccine available. In the early years of recombinant DNA manipulation, many groups Problem of not only developing protective immunity but also non-infectious viral antigen I fully expected the solution. Unfortunately, it was produced with an expression vector in the laboratory. , Highly purified, viral proteins injected into vaccine recipients If we assume an in vivo conformation that is slightly but close to the antigenic state found in infection, It has gradually become clear that there is no reason to decide. Today, only successful The recombinant inducing vaccine is a hepatitis B surface (H BS) antigen.   Oral presentation of non-replicating antigens in particulate form is not associated with immunity induced by natural infection. There is plenty of evidence demonstrating that it induces both mucosal and systemic immunity that always resemble Is about to become. Not only does this fail to induce systemic immunity, but it is often In contrast to oral immunization with a non-replicating soluble antigen that induces a state of general tolerance Eggplant Furthermore, the dose of antigen required to elicit this immunity is the parenteral immunization using the same antigen. Much lower than the capacity required for epidemics. Unique to such vaccine formulations The main advantage is the administration It is simple and completely safe.                             Adjuvant   The advent of modern molecular biology produces immunogens with unprecedented simplicity and precision Provided the means to do. These new methods are effective in the absence of effective adjuvants. It is ironic to produce a purified immunogen that generally does not induce a strong immune response It is. Development of improved vaccine adjuvants for use in humans is therefore of the highest priority It became the previous research area. Nevertheless, adjuvant studies have been conducted on immunogens. I was terribly late from the work. The adjuvants that have been widely used in humans for decades are It was alum. Saponin and its purified component Quil A Freund's Complete Adjuvant and other adjuvants used in research and veterinary applications Bunts are toxic, which limits their potential use in human vaccines. Muramil Newly chemically established such as dipeptides and lipid A monophosphoryl The formulation is being studied.   So far, the view on how adjuvants work , Adjuvants such as mineral oil emulsions or aluminum hydroxide will loosen the antigen. It forms an antigen depot (reservoir) at the site of injection that is released to the skin. However, 3 days later it was shown that excision of the injection site had little effect on the immune response. A recent study is A. C. Allison and N.N. E. FIG. Buyers' Vaccine: Immunology A new approach to the above problems. " W. Ellis Edition, page 431 (Butterwa Source-Heinemann , Oxford, 1992). Adjuvants stimulate specific and sometimes very small arms of the immune response Have been shown to enhance the immune response. Release of antigen over a long period It is desirable to have an adjuvant that functions as a simple reservoir for delivery.   The adjuvant research area developed over the last few years is Is the use of a polymer. Hunter, R.A. L. "Nonionic Block Copolymer -Detergents "Issues in Vaccine Adjuvant Research, D. R. Spriggs And W.A. C. Koff, pages 89-98 (CRC Press, 1991) Single block hydrophobic polyoxypropylene (P having a molecular weight of about 10,000 or less) OP) composed of two blocks of hydrophilic polyoxyethylene (POE) It has a simple structure. These are the least toxic surfactants It is considered to be non-existent and is widely used in foods, pharmaceuticals and cosmetics. Large-scale Some of the hydrophobic copolymers are effective adjuvants, while closely related Formulations are not. These copolypeptides with differences in POE and POP linkages There is a correlation between the adjuvant activity of the mers. Now these Ajubans Are used in oily and aqueous emulsions.   A wide range of polyelectrolytes with various molecular weights have adjuvant activity. Petrov, et al., Soviet Medical Review, Section D, Immunology, Volume 4, 1-11 On page 3 (1992) It is shown. Here, polymers with either positive or negative charges have similar immunity. It showed epidemic-stimulating activity. Polyelectrolytes interact with antigens through electrostatic and hydrophobic bonds. To form a complex. On the other hand, neutral and unloaded polymers have no effect on the immune response. Did not give.                       Controlled release of drugs and antigens   There is currently considerable interest in developing controlled release vaccines. The reason is now The main disadvantage of some currently available vaccines is the repeated administration That is to do. If controlled release of vaccine is possible, booster (additional Hara) The need for immunity can be eliminated. This is especially advantageous in developing countries , Where frequent contact between health care personnel and vaccine recipients is It is often difficult. Persistent in the outer membrane of follicular dendritic cells and lymph node organs There is a lot of evidence involved in the recruitment of B memory cells in order to form antibody-secreting cells. I'm about to lose. Continuous replenishment of circulating antibody is performed continuously. Suggests that. As the level of antigen decreases, this occurs as the parent of the antibody. Enables the existence of a well-established phenomenon of harmonious maturation. Acceptance of the concept of antigen persistence Have important implications in vaccine development. Ideally, the antigen is provided to the immune system And, in particular, follicular dendritic cells are presented with antigen for an extended period of time. It would be advantageous to be able to formulate a vaccine like this.   Many polymers contain antigens and other proteins and compounds It has been used to infiltrate. An early example of this was an influenza antigen with a caliber of 1 Polymerized in methylmethacrylate of less than 1,000 nanometers So-called nanoparticles are formed, and are described in Kreuter, J. et al. , Medicine and Pharmacology Microcapsules and nanoparticles, M.I. Dombroh (ed.), Pp. 125-148 (CRC Press). Antibody response and influenza virus The protection against infection of Escherichia coli is significant when the antigen is administered in combination with aluminum hydroxide. Improved. Experiments with other particles show that the adjuvant effect of these polymers It was shown to depend on the size and hydrophobicity of the particles.   Several factors contribute to the selection of a particular polymer for microencapsulation. You. Polymer synthesis reproducibility and microencapsulation process, microcaps Cellular material and process costs, toxicology profile, polymer and antigen release Emission rate and physicochemical affinity, etc. are all factors that must be considered. You.   Biodegradable polymers are designed around one of many types of labile bonds. Examples are polycarbonate, polyester, polyurethane, polyorthoester. And polyamide. Due to microencapsulation compared to naturally occurring polymers One of the advantages of using synthetic polymers is the hydrolysis of these bonds under neutral conditions. That the relative proportion of the can be influenced by the substituents on the polymer backbone That is. Substituent modification also changes the solubility and hydrophilic / hydrophobic properties of the polymer. Can be used to make.   Often the drug of choice, most recently as a carrier for an antigen, is poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA). Acceptance by regulatory authorities It remains a significant obstacle to any antigen delivery system. PLG A-Polymer has been used as a suture system that can be resorbed for many years. And biocompatible polyesters from Eldridge, J .; H. Others, microbiology And Today's Issues in Immunology, 1989, 146, 59-66. Have been commented on. Resistance to PLGA microspheres with a diameter of 1 to 10 microns Raw uptake is indicated as having an adjuvant effect.   The main disadvantage of PLGA system is the use of organic solvents and antigen microcapsules It takes a long time to prepare. This process utilizes the phase separation of water-in-oil emulsions. To use. The target compound was prepared as an aqueous solution, and PLGA was treated with thimerene chloride. And dissolved in a suitable organic solvent such as ethyl acetate. Immiscible solutions of these two Is co-emulsified by high speed stirring. Polymer non-solvent is then added, water The polymer precipitates around the droplets, forming embryonic microcapsules.   Microcapsules are collected, polyvinyl alcohol (PVA), gelatin, Alginate, polyvinylpyrrolidone (PVP), or methylcellulose Any polyelectrolyte stabilized and solvent removed by vacuum drying or solvent extraction. Was. These preparation conditions are described in J. H. Eldridge, et al., Infection and Immunity, Volume 9, 2 As shown on page 978 (1991) , A wide variety of peptide drugs and Staphylococcal enterotoxin B and keyhole limpet Although successful in microencapsulating highly resistant immunogens such as cyanine, , High shear force required for microencapsulation using PLGA, use of organic solvent And long preparation times are associated with complex labile immunogens such as enveloped viruses. It can be an obstacle to important epitopes.   Therefore, one object of the present invention is that no organic solvent or long preparation time is required. Providing delivery material by encapsulation of parenteral vaccine and parenteral or mucosal administration Is to provide.   Another object of this invention is to deliver the antigen through mucosal surface, especially oral delivery. Is to provide a system for performing   A further object of this invention is for the antigen to elicit a broad spectrum of immunogenic responses. Is to provide a delivery system for.   Still another object of this invention is the delivery of vaccines that enhance the immunogenicity of the vaccines. Is to provide a delivery system for.   Yet another object of this invention is to provide a biodegradable device that provides a controlled release of the antigen. It is to provide a recovery system.                               SUMMARY OF THE INVENTION   Water soluble polymers and polymer hydrogels deliver to mucosal surfaces, Microcapsules of antigen for controlled release of antigen or injection (parenteral administration) Used for conversion. In the most preferred embodiment, the encapsulated antigen is administered orally or intranasally. Is done. The polymer is a biocompatible, crosslinkable water-soluble polymer or polymer hydrate. It can be any of the Rogels, which are loose to the antigens that are loaded into it. Ultrafine with a diameter of 200 microns or less under conditions that do not denature it It can be used to form particles. The preferred natural water-soluble polymer is arginine And gelatin, pectin, and collagen. Desirable synthetic water-soluble poly Mer is poly (acrylamide), poly (methacrylamide), poly (vinyl acetate) ), Poly (N-vinylpyrrolidone), poly (hydroxyethyl methacrylate) ), Poly (ethylene glycol), polyvinylamine, poly (vinyl pyridine) , Phosphazene polyelectrolytes, and poly (vinyl alcohol). ion The preferred polymer that forms a hydrogel upon crosslinking is poly (acrylic acid) or Is a salt of poly (methacrylic acid), sulfonated polystyrene, polyamine or polyamine. Of quaternary salts of poly (vinyl pyridine), and their polymers or monomers It is a mixture or copolymer. The most desirable polymer is alginate, Polyphosphazene, and mixtures thereof.   To prepare the encapsulated antigen, the antigen is mixed with a polymer solution, Is rapidly formed from the polymer and antigen without using an effective amount of organic solvent, The polymer is also ionic or covalent to form stable biodegradable ultrafine particles. It is crosslinked with a bond. Ultrafine particles adhere to mucosal surfaces such as the mucosal lining of the gastrointestinal tract, The antigen is reticulated by the reticuloendothelial cells to be released in the course of Increase the stock pick-up. The polymer is preferably alginate or polyphos Fazen, more preferably polyvalent ions such as calcium chloride or It is ionically crosslinked with a divalent cation.   Examples include polymer alone or in combination with mucosal agents such as cholera toxin. Shows enhanced immunogenicity of encapsulated antigens and can be administered parenterally, orally, or intranasally How to manipulate the polymer to alter the release rate and humoral response when administered. Indicates whether to make.                           Brief description of the drawings   Figure 1 is a graph of the permeability of polyphosphazene microspheres, It was measured by percent release as well as molecular weight of protein and polymer concentration Of. 3 kinds of rainbow protein markers: 3.3% (dotted bar), 2.5% (parallel bars) and 1.5% (black bars) of poly [di (carboxylate) Phenoxy) phosphazene-co-di (glycinate) phosphazene] (PP) Microencapsulated, a fixed amount of protein in the supernatant is analyzed spectrophotometrically It was previously incubated with pH 7.4 HEPES buffer for 24 hours at room temperature.   Figure 2 shows the molecular weight of the erosion profile of polyphosphazene microspheres. Is a graph showing the action of 130 kilodalton PC-GIP (square), 3, 9 00 kilodalton PCPP (diamond), 170 kilodalton PC-GIP (Yen) and 400 kilodalton PCPP (triangle) expressed in days Measured as percent mass loss over time.   Figures 3a and 3b show PCPP hydrates with different starting molecular weights of polyphosphazenes. It is a molecular weight decomposition profile in the period represented by the number of days of Rogel, Mw is molecular weight , Mn are number average molecular weights, and the initial molecular weight is 3,900 kilodaltons (Fig. 3a). And 400 kilodaltons (Fig. 3b).   Figure 4 compares the polymer molecular weight in the matrix with that in solution. Comparing molecular weight of 170 kilodalton PC-GIPP hydrogel expressed in days It is the molecular weight degradation profile over time.   Fig. 5 shows different molecular weights: 12,000 mw (square), 62,500 mw (diameter). Mondo), 140,800 mw (yen), and 295,000 mw (triangle) Release of polystyrene beads from poly-phosphazene coated with L-lysine It is a graph of cents. Fluorescent polystyrene (PS) with a diameter of 20 nm The beads were encapsulated with polymer 1, then poly L-lysine of different molecular weight Coated. The coated beads are kept warm at room temperature using HEPES buffer pH 7.4. Was. The polystyrene beads released in the supernatant are measured by quantitative fluorometry, Expressed as the percent of beads initially encapsulated.   Figures 6a, 6b and 6c show the blood of animals immunized with flu virus in suspension. Qing (Fig. 6a), combined with alginate microsphere cholera toxin (CT) Encapsulated flu virus (Fig. 6b), and in alginate microspheres At Capse FIG. 6 is a graph of the flu-specific response of the flu-ized virus (Figure 6c) On days 7, 14, 21, and 28 (from left to right IgM, black bars, I Antibody titer is determined in the order gG, parallel bars, IgA, spotted bars.   Figure 7 shows the history of influenza encapsulated in alginate in combination with CT. Flu-specific antibody response of serum following oral administration, IgM, black bars, IgG, flat. Measured 7, 14, 21, 28 and 35 days after immunization with line bar, IgA, speckled bar. Was.   Figure 8 shows an alginate microcapsule used in combination with CT for influenza. FIG. 6 is a graph of flu-specific antibody in fecal samples after oral administration and after oral boosting. , IgM, black bars, IgG, parallel bars, IgA, spotted bars after boost 7, It was measured after 14, 21, 28 and 35 days.                           Detailed Description of the Invention   Generally, microspheres for the delivery of antigens are water-soluble polymers or polymers. It is formed by covalent bonding or ionic cross-linking of polymers forming a dorogel. In a preferred embodiment, the polymer forms a water soluble hydrogel encapsulated antigen. Alginate that is ionically cross-linked with divalent cations such as calcium ions It is formed of a water-soluble polymer such as polyphosphazene. Antigen is the dispersion of antigen It was mixed with the polymer solution prior to cross-linking to ensure it spreads through the microspheres. You. More stable polymers allow microspheres to be charged with polyelectrolytes such as polyamino acids. It can be formed by degrading and further crosslinking.               Polymers useful for making microspheres   Polymers are generally biodegradable, crosslinkable water-soluble polymers or polymerizable hydrogens. 10 min under conditions that are gentle and do not denature the antigen incorporated therein. Can form microspheres with diameters of clon or smaller . Hydrogel as used herein is defined as any water-swellable polymer. You. Water-soluble polymers can be used in water, water-buffered saline or hydroalcoholic solutions. At least partially dissolved (typically to a range of at least 0.001% by weight) It is a polymer. Preferred natural water-soluble polymers are alginate, gelatin, Includes pectin and collagen. The preferred synthetic water-soluble polymer is Crylamide), poly (methacrylamide), poly (vinyl acetate), poly (N-bi) Nylpyrrolidone), poly (hydroxyethyl methacrylate), poly (ethylene Glycol), polyvinylamine, poly (vinylpyridine), phosphazene Includes a child electrolyte and poly (vinyl alcohol). Hydrogenation by ionic crosslinking The preferred polymer forming the polymer is poly (acrylic acid) or poly (methacrylic acid). Acid), polystyrene sulfonate, polyamine or poly (vinyl pyridine) A fourth salt of any of the above, and a mixture of a polymer or its monomer and copo Including rimers. The most desirable polymers are alginate and polyphosphazene. And mixtures thereof.   The polymer is an ionic crosslinker that renders the water-soluble polymer insoluble. It can be crosslinked by a bound crosslink or a physical crosslink. Water based at room temperature Gelation of the polymer solution due to ionic crosslinking causes long-term exposure to organic solvents, Eliminating the elevated temperatures and drying required for polymers that dissolve in organic solvents. Polymer -Is a polyvalent cation or polymer if the polymer has acidic side groups. , Which has a basic side group, is opposite to the charged side group, such as a polyanion. Can be crosslinked in an aqueous solution containing multiply charged ions of Desirably has two valences Or trivalent metal ions such as calcium, copper, aluminum, magnesium, Strontium, barium, tin, zinc, and iron, or polyvalent cations, for example For example, poly (amino acid), poly (ethyleneimine), poly (vinylamine), poly ( Vinylpyridine), polysaccharides, and others that can form with polyelectrolyte complexes More cross-linked.                             Alginate   The most studied ionically crosslinkable polymers are naturally occurring alginates This is a brown algae used for food, for example Protantanal LF20 / 60 (rice Country, New Hampshire, Portsmouth, Pronova, Inc.) It is prepared from   The polymer is preferably calcium chloride or another divalent or polyvalent cation. Is crosslinked with multiply charged ions.                           Polyphosphazene   A description of a set of ionically cross-linked water-soluble polyphosphazenes is given in H. H. R. All cock And S. Kwon, Kobun, Vol. 22, pp. 75-79 (1989). However, it is a microphone containing an antigen that is exposed only to the aqueous environment during preparation. It enabled the generation of spheres.   The term amino acid as used herein refers to both natural and synthetic amino acids. But is not necessarily limited to alanyl, valinyl, leucinyl, isolo Isynyl, prolinyl, phenylalaninyl, tryptophanyl, methioninyl , Glycinyl, serinyl, threoninyl, cysteinyl, tyrosinyl, asparagus Guinyl, glutaminyl, aspartoyl, gluta oil, ricinyl, arginini And histidinyl.   The term amino acid ester is aliphatic or allyl of natural or synthetic amino acids. Or heteroaromatic carboxylic acid ester.   Alkyl as used herein may be a saturated straight chain, branched or cyclic hydrocarbon, or Is a combination, typically C1To C20Up to, especially methyl, ethyl , Propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, sikh Lopentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl, cyclohexyl Xyl, 3-methylpentyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl Includes le, heptyl, octyl, nonyl, and decyl.   The terms (alkyl or dialkyl) amino are respectively An amino group with one or two alkyl substituents is indicated.   The terms alkenyl and alkynyl as used herein are each double Or C having at least one triple bond2To C20Straight or branched hydrocarbon water up to Indicate the element.   The term allyl as used herein refers to phenyl or substituted phenyl. Where the substituents are halo, alkyl, alkoxy, alkylthio, haloalkyl. , Hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, methylenedioxy, cyano, C ( O) (lower alkyl), -CO2H, -SOThreeH, -POThreeH, -CO2Alkyl, Amido, amino, alkylamino and dialkylamino, and allyl here The group can have up to 3 substituents.   The term aliphatic is typically C1To C20The hydrocarbon of the It may contain one or a combination of alkyl, alkenyl and alkynyl components. Conventionally, it may be linear, branched, or cyclic or a combination thereof.   The term halo as used herein includes fluorine, chlorine, bromine, and iodine. .   The term aralkyl refers to an allyl group that has an alkyl substituent.   The term alkaryl refers to benzyl, substituted benzyl, phenethyl, or Indicate an alkyl group with an allyl substituent, including a substituted phenethyl, where the substituent is an The rilyl group is as defined above.   The term heteroaryl or heteroaliphatic as used herein is at least Also contains one sulfur, oxygen, or nitrogen in the aromatic ring and is described above as an allyl group. As the case may be, it is replaced. Non-limiting examples include furyl, pyridyl, Pyrimidyl, thienyl, isothiazolyl, imidazolyl, tetrazolyl, pyradi Nyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, quinolyl, isoquinolyl, benzo Thienyl, isobenzofuryl, pyrazolyl, indolyl, isoindolyl, benzene Dimidazolyl, purinyl, carbozolyl, oxazolyl, thiazolyl, isothia Zolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, isoxazolyl, pyrrolyl, pyrazoli , Quinazolinyl, pyridazinyl, pyrazinyl, cinolinyl, phthalazinyl, chi Noxalinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, pteridinyl, 5-azacyt Dinyl, 5-azaurasilyl, triazolopyridinyl, imidazolopyridinyl, There are pyrrolopyrimidinyl and pyrazolopyrimidinyl.   The term "pharmaceutical acceptable ion" carries the charge and allows the phosphazene polyelectrolyte to The organic or inorganic component that can be administered as a counterion.   The term heteroalkyl, as used herein, refers to a carbon chain or Oxygen, sulfur, or to terminate (has a valence completed by hydrogen or oxygen) Supports alkyl groups containing heteroatoms such as nitrogen.   Poly [(carboxylatophenoxy) (glycinate) phos used here Sphazen], poly [di (carboxyl Tophenoxy) phosphazene-co-di (glycinate) phosphazene-co- Ruboxylatophenoxy) (glycinate) phosphazene] and poly [di ( Carboxylatophenoxy) phosphazene-codi (glycinate) phospha Zen] refers to the same polymer.   Polyphosphazenes are preferably in the acid or base form that balances their counterions. , Or in the form of its ionic salts, containing charged side groups.   The polymer is desirably biodegradable, making it most suitable when administered to animals, including humans. It shows a small toxicity.                   Selection of phosphazene polyelectrolytes   Polyphosphazenes are alternating ribs separated by alternating single and double bonds. It is a polymer with a backbone consisting of nitrogen and nitrogen. Each phosphorus atom has two Covalently attached to a pendant group (“R”). The repeating unit of polyphosphazene is General formula , Where n is an integer.   The substituent (“R”) can be a wide variety of moieties that can vary within the polymer. , But not necessarily limited to: aliphatic; allyl; aralkyl; alkaryl; Carboxylic acids; Heteroaromatics; Glucose-containing carbohydrates; Heteroalkyls; Halo Gen; Alkylamino-containing (aliphatic) amino-; heteroaralkyl; dialkylar Di (including mino-, allylamino, diallylamino-, alkylallylamino- (Aliphatic) amino-; but not necessarily limited to -oxyphenyl CO2H, -Oxyphenyl SOThreeH, -oxyphenylhydroxyl and -oxyphe Nil POThreeH-containing-oxyallyl; -oxyalkyl, -oxy (aliphatic) C O2H, -oxy (aliphatic) SOThreeH, -oxy (aliphatic) POThreeContains H-Oki Si-aliphatic; and -oxy (alkyl) hydroxyl, -oxyalkaryl,- Oxyaralkyl, including -oxy (aliphatic) hydroxyl; thioallyl; Thioaliphatic including oalkyl, -thioalkaryl, -thioaralkyl; -NHC (O) O- (allyl or aliphatic), -O-[(CH2) xO] y- (CH2) x NH2, -O-[(CH2) xO] y (CH2) xNH (CH2) xSOThreeH, and -O-[(CH2) xO ] y- (allyl or aliphatic), where x is 1 to 8 and y is 1 to 20 Is an integer up to. This group may be, for example, via an oxygen, sulfur, nitrogen, or carbon atom Can bind to the phosphorus atom.   Generally, when the polyphosphazene has one or more pendant groups, this group is It changes randomly within the polymer, so polyphosphazenes are random copolymers. It is. Phosphorus can be attached to two similar groups or two different groups You. Polyphosphazenes with two or more pendant groups Is the desired proportion of poly (dichlorophosphazene) with one or more nucleophilic groups Can be produced by reacting with You. The rate of formation of pendant groups in polyphosphazene depends on the polymer production. Of the starting materials used for the reaction, the temperature at which the nucleophilic substitution reaction is carried out, and the It is determined by many factors, including the solvent system used. Precise placement of groups in the resulting polymer The substitution pattern is very difficult to determine, while the proportion of groups in the polymer is Can be easily decided by one of the persons.   In one embodiment, the biodegradable polyphosphazene has the formula: Where A and B can independently vary within the polymer, Can be a group. (I) A group that is susceptible to hydrolysis under the conditions of use and is not necessarily limited thereto, Chlorine, amino acids, amino acid esters (bonded through amino groups), imidazo Groups containing glucuryl, glycerol, or glucosyl, or (Ii) A group that is not easily hydrolyzed under the conditions of use, but is not necessarily limited thereto. Aliphatic; allyl; aralkyl; alkaryl; carboxylic acid; heteroaromatic; hetero Alkyl; alkylamino-containing (aliphatic) amino-; heteroaralkyl; di Alkylamino-, allylamino-, diallylamino-, alkylallylamino Di (aliphatic) amino-, including; but not limited to, -oxyphenyl CO2 H, -oxyphenyl SOThreeH, -oxyphenylhydroxyl, and -oxy Ciphenyl POThreeH-containing -oxyallyl; -oxyalkyl, -oxy (aliphatic) CO2H , -Oxy (aliphatic) SOThreeH, -oxy (aliphatic) POThreeContains H-oxy fat Group; -oxy (aliphatic) hydroxyl including -oxy (alkyl) hydroxyl -Oxyalkaryl; -oxyaralkyl; thioallyl; -thioalkyl,- Groups such as thioalkaryl or thioaralkyl-including thioaliphatic.   Here, the polymer contains at least repeating units that are not susceptible to hydrolysis under the conditions of use. 1% or more, preferably 10% or more, and more preferably Includes 80 to 90% or more and 100% or less, and   n is 4 or more, and preferably an integer from 10 to 20,000 is there.   Certain groups such as heteroaromatic groups other than imidazole are found in blood. It will hydrolyze at an extremely slow rate under neutral aqueous conditions such as It should be understood that it is typically considered a non-hydrolyzable group for this purpose. No. However, under conditions such as, for example, low pH found in the stomach, Rate of hydrolysis of normally non-hydrolyzable groups (such as heteroaromatics other than midazole) Can increase to the point where the biodegradability of the polymer is affected. Enough One of ordinary skill in the art using well-known techniques has found that the pendant group is not significant under the conditions of use. It is possible to easily decide whether or not to hydrolyze. One of those skilled in the art Determine the hydrolysis rate of polyphosphazenes with different structures described here Can be used for target To select a polyphosphazene that provides the desired biodegradation profile along the way. You can do it.   The degree of hydrolyzability of the polymer depends on the proportion of pendant groups susceptible to hydrolysis. And will be a function of the rate of hydrolysis of the hydrolyzable group. Hydrolyzable groups are In order to provide a P-OH bond that imparts hydrolytic instability to the limer, it may be used in an aqueous environment. With a hydroxyl group.   In another embodiment, the polyphosphazene is (i) a pendant group of a polymer. Non-living matter that does not undergo hydrolysis under the conditions of use. Degradable polyphosphazene, or (ii) under conditions of use (eg poly [di (e) Tilglycinate) -phosphazene]) It is a completely biodegradable polyphosphazene.   The phosphazene polyelectrolyte here is polyphosphazene with anions, cations, Or contains an ionic or ionizable pendant group that imparts amphiphilicity It is defined as polyphosphazene. Ionic groups are salts, or at least partially It can take the form of an acid or base that can be dissociated. Any pharmacology Acceptable monovalent cations include, but are not limited to, sodium, Can be used as a counterion for salts containing potassium and ammonium . In addition, the phosphazene polyelectrolyte can include nonionic side groups. Hosph Azen polyelectrolytes should be biodegradable or non-biodegradable under the conditions of use. You can do it. Ionizable or ionizable Noh pendant groups are desirably resistant to hydrolysis under the conditions of use.   The preferred phosphazene polyelectrolytes are carboxylic acids, sulfonic acids, or hydrates. It contains a pendant group containing a Roxyl component. Acidic groups are usually non-hydrolyzed pendants To the hydrolyzable group, but alternatively or in combination Sometimes. Examples of phosphazene polyelectrolytes with carboxylic acid groups as side chains are below. Expression: Where n is an integer, preferably between 10 and 10,000 It is an integer. This polymer is a poly [di (carboxylatophenoxy) phospha Zen] or, alternatively, poly [bis (carboxylatophenoxy) phosphase ]] (PCPP).   The phosphazene electrolyte is desirably biodegradable. Living matter used here The term degradability means that once exposed to a physiological solution of pH 6-8 at a temperature of about 25 ° C-37 ° C. , Typically within about 5 years and most preferably within 1 year It is a polymer that decomposes within the period of use.   Most desirably, the polymer will hydrolyze under the conditions of use. Pendant group containing no carboxylic acid component and subject to hydrolysis under conditions of use It is a poly (organophosphazene) containing a pendent group. Hydrolytic sensitivity Examples of desirable phosphazene polyelectrolytes having groups are especially poly [di (carboxy) Luatophenoxy) phosphazene-co-di (glycinate) phosphazene-co- (Carboxylatophenoxy) (glycinate) phosphazene, and poly [ Di (carboxylatophenoxy) phosphazene-co-di (chloro) phosphase -Co- (carboxylatophenoxy) (chloro) phosphazene] [Di (carboxylatophenoxy) phosphazene-co-di (amino acid) phosphine It is phosphazene, which is azene-co- (carboxylatophenoxy) (amino acid). .   Toxicity of polyphosphazene is measured using cell culture experiments well known to those skilled in the art. . For example, the toxicity of poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene] is Cell culture dish coated with poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene] Measured in cell culture. Chicken embryo fibroblasts were then seeded on coated Petri dishes. Was. Three days after inoculation with chicken embryo fibroblasts, the cells became flat and formed spindle-shaped. Was. A mitotic image was observed under a phase-contrast microscope. These observations can Non-toxic of poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene] for manufacturing Provide evidence of.   Cross-linked polyphosphazene is a phosphazene polyelectrolyte containing zinc, calcium, Bismuth, barium, magnesium, aluminum, copper, cobalt, nickel, Or cadmium It can be prepared by binding with a metal polyvalent cation such as.                   Synthesis of phosphazene polyelectrolytes   Polyphosphazenes containing phosphazene polyelectrolytes are known to those skilled in the art. Depending on the method, poly (dichlorophosphazene) can be used for a wide range of chemical reagents or reagents. It can be prepared by a nucleophilic substitution reaction of a polymer which is reacted with a mixture of Hope Or, phosphazene polyelectrolytes replace poly (dichlorophosphazene) with chlorine. Prepared by reacting with a suitable nucleophile. Non-hydrolyzed side of polymer The desired ratio of hydrolyzable side chains to chains is poly (dichlorophosphazene). By adjusting the amount of the corresponding nucleophile that reacts with and the reaction required You can get it.   For example, poly [(carboxylatophenoxy)-(glycinate) phospha Zen] (PC-G1PP) is a poly (dichlorophosphazene) chlorine atom. Pill-P-hydroxybenzoate and ethylglycinate hydrochloride And a nucleophilic substitution reaction (PC-G1PP synthesis). like this Poly [(allyloxy) (glycinate) phosphazene] ester obtained by The leu is then hydrolyzed to the corresponding poly (carboxylic acid). Other polyphospha Zen is from Allcock, H.M. R., et al., Inorganic Chemistry, Vol. 11, p. 2584 (19 1972); Allcock, H.C. R., et al., Polymer, 16: 715 (198) 3 years); Allcock, H.C. R., et al., Polymer, Vol. 19, p. 1508 (1986); Allcock, H .; R., et al., Biomaterials (prosthetic substances for contacting living tissue), 19 volumes, 500 pages Page (1988); Allcock, H.C. R., et al., Polymer, Volume 21, 1980 pages Page (1988); Allcock, H.C. R., et al., Inorganic Chemistry, 21 (2), 5 15-521 (1982); Allcock, H .; R., et al., Polymer, 22 Vol. 75-79 (1989); U.S. Patent No. 4,440,921, 4 , 495, 174, 4,880, 622, Allcock, H .; R., et al .; USA Patent No. 4,946,938, McGill et al .; US Pat. No. 5,149,5 43, Cohen, et al .; and Grollman, et al., Modified Release Journal, 3,1. No. 43 (1986) published information, where lessons learned and disclosure These polymers are incorporated herein by reference.                               Selection of antigen   Antigen is derived from cells, bacteria, or viral particles, or parts thereof . As defined here, antigens are proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins Quality, glycolipids, nucleic acids, or combinations thereof, which can be derived from animals, For example, elicit an immunogenic response in mammals, birds, or fish. Fixed here As implied, immunogenic responses are humoral or cell mediated. Immunogenicity If the material to which the answer is directed is poorly antigenic, it may be of some commercial interest, for example. Reagent kit that can be used To a carrier such as albumin or a hapten using a standard covalent bond method. Can be joined.   In one embodiment, the nucleic acid encoding the antigen is labeled in the cells in which it is expressed. A polymer is used to recover.   Examples of desirable antigens are influenza protein, human immunodeficiency virus (HI V) Protein, Haemophilus influenzae, and Hepatitis B protein, and grams Includes negative cell walls and lipopolysaccharides such as N. gonorrhoeae proteins.   Viral infection of cells during culture is caused by two types of virus particles, mature infectious virus and And some infectious viral particles lacking nucleic acids. Virus has high strength in cell culture Inactivated virus particles should be used in oral vaccines for replication at high titers Good. For viruses that are unable to grow in cell culture or become tumorigenic In contrast, recombinant DNA technology that produces non-replicating viral particles (VLPs) is used. Can be used. Using recombination techniques, the two types of From a virus that is not suitable for any of the roaches, a protective antigen (pseudo Viral particles can be constructed to display (typing). All of the above Antigens are components of viral particles, but not all antigens elicit protective immunity. Not all are constitutive antigens. If the protective antigen is a non-component, Such antigens can self-assemble and genetically fuse to the surface of viral particles. You.                             Adjuvant   In one embodiment, encapsulated antigen for mucosal or parenteral delivery It is desirable to include an adjuvant.                     Adjuvant for oral administration   Trace amount of cholera toxin (CT) (cholera toxic subunit A, cholera toxic subunit B, or both) and a second antigen. It stimulates mucosal immunity to the same administered antigen. In addition, oral delivery of antigen only There is a dramatic humoral immune response to a second antigen that replaces the immunotolerance elicited . Mucus delivery CT is thus a potent immunostimulatory agent for both mucosal and humoral immunity Or functions as an adjuvant. The mechanism of this adjuvant action is It specifically binds to the dome cells (or M cells) that ride on the L-plate, and then To confer immune responsiveness to antigens that normally or not bind to murine cells This is due to the ability of CT to change lymphoid cells. Recently this bond Function has been localized to the non-toxic B subunit (CT-B) molecule of cholera toxin. Thus, the addition of CT-B to the antigen is elicited by CT for the same antigen. It has been shown to mimic an epidemiological response. Therefore, what is often desired is a CT Increasing the immunogenicity of orally administered antigens by inclusion in black-encapsulated vaccines It is.                     Adjuvant for parenteral administration   Examples of adjuvants are muramyl dipeptide, muramyl tripeptide, cytokai , Diphtheria toxin and exotoxin A It is. Commercially available adjuvants are Massachusetts, Worcester ー, Cambridge Biosciences QS-21 and Lib Immune Ingredients include monophosphoryl lipid A (MPLA).   Also shown here is that polyphosphazene was administered orally or parenterally. That is, it may have an adjuvant effect when being treated. Especially microspheres Is formed with 95% alginate and polyphosphazene (PCPP) The examples show that it enhances its immunogenicity.                         Preparation of immunogenic composition   Polymers include, for example, US Pat. No. 5,149,543, Cohen, et al. Uses US Pat. No. 4,352,883, rims, and other methods, the lesson here Or spray dried solution of polymer and antigen. And are used to encapsulate the antigen. Alternatively antigens and adjuvants Microspheres containing bunts simply mix the aqueous solution components and then the ultrafine particles. It is controlled by the coagulation of a polymer with a substance by mechanical forces to form it. Can be manufactured.   The term "microcapsule" as used herein is microscopic unless otherwise stated. Includes particles, microspheres, and microcapsules. Generally useful These microcapsules should be administered between 1 and 200 microns, preferably orally. Between 1 and 15 microns, and the limiting factor for injection is the size of the needle For injection, preferably with a fine particle diameter between 1 and 100 microns is there.   In the preferred embodiment, the polyphosphazene / antigen solution is prepared by first loading the antigen with Na.2COThree, 3% Dissolve in one part of the mixture with stirring, then add PCPP with stirring until dissolved. It was prepared by slowly adding 3 parts of phosphate buffer of pH 7.4. Detergent Brij58 so that the final concentration is 0.2% while stirring the polymer solution Was added to The final concentration of PCPP is 2.5%. Sodium alginate / An antigen solution is prepared by dissolving an appropriate amount of antigen in deionized water. Arginine Then, gently dilute the antigen solution so that the final concentration of alginate is 1.25%. Added. The constant agitation and slow addition of polymer to the antigen is of equal quality. Needed to get a solution.   The most desirable example for producing microspheres for oral delivery, Microspheres are used to pump poly pumps at a rate of 150 μl / min. Mar and antigen solution into the spray nozzle (Turbo Tuck, Ottawa, Canada) Ultrasonic spray nozzle with or without 18 gauge blunt end needle , Farmingdale, MedSonic, Inc.) Generated. The polymer solution containing the dispersed antigen is then subjected to air pressure Under about 35 pounds through a 1.0 mm hole in the nozzle. Polyphos As a phazene, the microdroplets are CaCl2, 7.5%, Brij 58,0 . Nozzle for 5% bath Crosslinks when hit at a distance of 35 cm. Brij58 is a mass of microspheres Added to prevent icing. CaCl2, 1.5% bath (don't use Brij 58 Is used for gelling alginate microspheres. Microphone The rospheres are then quickly transferred to a centrifuge tube to complete the cross-linking process, and Ca Cl2Allow for approximately 30 minutes to avoid microsphere clumps that settle in the bath. It can be vibrated completely. Aggregates are exposed carboxy on the surface of microspheres Ca between ru radicals++Due to cross-linking and / or hydrophobic interactions between microspheres Things. After 30 minutes, the microspheres were placed at 4 ° C, 2800 rpm for 15 minutes. Collected with heart separation. The supernatant is discarded and the pellet is washed once and sterile ion Resuspended in clear water. Microspheres were stored at 4 ° C until analysis. these About 90% of the polyphosphazene microspheres produced under the conditions of It was in the 10 micron range.   Larger microspheres are created with larger outlets and lower air pressure. Was done.                         Polymer-antigen conjugate   The polymer also created a water soluble conjugate according to methods well known to those skilled in the art. Is covalently conjugated to the antigen, usually the amino or carboxyl group on the antigen side and This is done by a covalent bond with one of the ionizable side groups on the polymer side.                         Administration of immunogenic composition   Hydrogel microspheres containing antigen can be administered mucosally or parenterally I can do it. An example of a non-limiting route of mucosal delivery is intranasal ( Rui is generally the nasal-related lymphoid tissue), respiratory system, vagina, and rectum. Parenteral Non-limiting examples of delivery include intradermal, subcutaneous, and intramuscular.   Antigens are capped with both naturally occurring alginates and synthetic polyphosphazenes. Can be made into cells. Antigen loading level, release rate and microsphere The size distribution is used to alter the immune response generated. This dose will be described later As shown in the examples below, the titer of antibody elicited by polymer-challenge Based on the standard technique of administering antigen loading and dose, in addition, administration schedule of each antigen Determined by the tool.   The immunogenic vaccine composition has other pharmacologically acceptable ingredients, such as water, saline, Iha DrakeolTM, MarkolTMIncluding mineral oils and squalene, When forming an emulsion, or in combination with an aqueous buffer, or when passing through the stomach Capsule with capsule or enteric coating to protect microcapsules from degradation It will be understood by a person skilled in the art that it can be customized.                         Storage of antigenic composition   Ion-crosslinked microspheres are stored in buffer to preserve their integrity Need to be Microspheres and anti-resistants entrapped within the polymer matrix To maintain the integrity of the original The conditions have been set. Microspheres containing antigen are sterile deionized water Stored at 4 ° C at 7 ° C and stable for 7 days. Such as phosphate buffered saline (PBS) The standard buffer solution cannot be used because the calcium ion is replaced by sodium. This is because it leads to the liquefaction of the tricks. Microspheres are poly-L-lysine Or coated with an amino acid polymer such as other cross-linking agents and stored in PBS. You can   The invention will be better understood by reference to the following non-limiting examples. There will be. Example 1: Toxicity studies   Alginate is recognized as human consumable. Polyphosphase Can be assayed for non-toxicity using standard methods. Polyphos Fazen has previously been shown to be non-toxic to living cells. M. C. Ba Reported in Vol. 9, Bio / Technology, 9: 468 (1991). As described above, hybridoma cells have a porosity of between 150 and 200 microns. Encapsulated in Liphosphazene microspheres. Encapsulated hybrid Ma cells undergo cell division and by 10 days after encapsulation, microspheres are Essentially filled with live cells. Additional studies are described here.   In the first study, cell culture dishes were coated with polyphosphazene, then chicken embryo Fibroblasts were seeded in coated Petri dishes. 3 days after inoculation of chicken embryo fibroblasts The cells become flat and spindle-shaped. Anyone can see the mitotic figure under the phase contrast microscope. This is a cell culture It showed the harmlessness of polyphosphazene.   The second in vivo toxicity study showed that the acute toxicity of alginate and polyphosphazene It was evaluated in 6-8 week old SD rats. This study included 5 Osla per group It consists of four groups. After an overnight fast, each animal in each group was gavaged And received a single oral dose of 5000 mg / kg of water. The dose is 20m It was 1 / kg. One group of animals received water and served as a control group I let it go. Two groups of animals underwent alginate microspheres. 3 glue Rats of poly L lysine M. W. 68,000 coated alginate mac I received the irosphere. The four groups of animals were poly [di (carboxylatopheno Xy) Phosphazene] received microspheres. The animal was clinically observed for 7 days . Body weight was recorded on day 1 before immunization and at euthanasia. Blood sample euthanized In the case of CO2Was obtained by puncture of the retro-orbital sinus after anesthesia. Animals of blood collection I was fasted overnight before. Tissues were examined at necropsy and stored.   Weight gain between rats undergoing microspheres and control group of rats There was no significant difference between the two. The results of hematology and clinical chemistry were collected for each group. Normal for all rats. Abnormalities observed in any organ at autopsy There was no sex-related treatment. This study used an oral dose of 5000 mg / kg With polyphosphazene and alginate micros It showed that the fair was not acutely toxic. Example 2: Protein uptake and microsphere release characteristics   For microencapsulated antigens that elicit an immune response, the antigens are microspheres. It must be released from Oh. Antigens are two different but not mutually exclusive It is released from microspheres through the processes of diffusion and erosion. If hydrogen Water to fill the microspheres and matrix, if Following the phase, the antigen can simply diffuse from the microspheres. Therefore, the release of the antigen Emission is a measure of the permeability of the microsphere matrix to the antigen. On the contrary Adsorption of antigen to the limer matrix results in diffusion of the antigen from the microspheres. Will help to reduce or eliminate.                         Release rate characterization   Protein molecular weight marker (Amersham) and FITC-labeled bovine serum Lubumin (Sigma) is a microcapillary to study the release rate of soluble proteins. It was made into a psel. 20nm polystyrene beads (Duke Scientific The release rate of (h) can be used for comparison purposes.               Quantification of proteins in microspheres   Protein content in microspheres for immunogenicity studies Immediately after the creation of microspheres to assess the uptake percentage, and Directly measured immediately prior to injection into animals to confirm delivery of antigen dose .   The amount of protein in the microspheres is determined by standard tests such as the bio-Rad protein assay. It is not possible to evaluate by the fixed rate. Proteins cause Ca to detect hydrogels++The It can be converted into a rate and released from the microspheres, but divalent cations The addition of a Bio-Rad reagent, which contains, re-crosslinks the polymer and utilizes the antigen to dye reagent. It can be a cause to make it unusable.   Quantitation of protein antigens encapsulated in ion-crosslinked microspheres was performed using S Measured by electrophoresing a known amount of intact microspheres in DS-PAGE . During electrophoresis, proteins migrate from the microsphere matrix and Enter the acrylamide gel. Protein concentration parallel to microsphere preparation Measured by comparison with a known amount of encapsulated protein to be electrophoresed. It is.                   Measuring microsphere size   Considered that microspheres of 1 to 15 microns have an adjuvant effect And is therefore desirable. Alginate and polyphosphazene microphones The size of the rospheres is measured with a Coulter LS100 particle sizer. This Size is reported as a% number for sizes from 1 to 10 microns.         Modification of antigen release from polyphosphazene microspheres                                 −                 Effect of polymer concentration and antigen molecular weight   The permeability of poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene] is 14,000 to 200,000 daltons commonly used for lylamide gel electrophoresis Tons of protein molecular weight markers (rainbowTMProtein molecule Investigated by encapsulation of a quantity marker (Amersham Corporation) Was. Protein release was assayed by spectrophotometric determination of the supernatant.   The results are shown in Figure 1. Like lysozyme with a molecular weight of 14.3 kilodaltons The permeability of certain proteins is affected by the concentration of polymer in the gel. You. As the polymer concentration increased from 1.5% to 3.3%, microcapsules The diffusion of proteins from the matrix is significantly reduced. Similarly for protein As the molecular weight increases, the diffusion of proteins out of the matrix slows down. For example, a 200 kilodalton molecular weight myoglobin protein is 3.3% polypho It could not diffuse from the Sphazen matrix within 24 hours.                   Effect of polymer molecular weight and composition   The second mechanism by which antigens are released from microspheres This is through the erosion of the constituent polymer matrix. Erosion reverses gelation reaction Occurs through the polymer It results in the solubilization of the molecule and its return to the surrounding aqueous environment. Polyphosphazene Degradation of microspheres causes mass loss with saline solution (pH 7.4), polymer Studied by monitoring matrix molecular weight and lysate formation . The erosion profile for PCPP microspheres of various molecular weights is shown in Figure 2. Is shown. Incubate high molecular weight PCPP microspheres in solution for 20 days, and Although it was extended to 180 days, no detectable mass loss was observed. But the same GPC data show a significant decrease in polymer molecular weight over the same period (Fig. 3a). The mechanism of degradation can obviously involve intramolecular carboxyl group catalysis . Using low molecular weight PCPP for the preparation of microspheres, the first 10 Leading to significant erosion of the hydrogel and loss of polymer molecular weight over days (Fig. 3b). ). A water-soluble polymer product of virtually the same molecular weight as found in the matrix was detected. Was.   With this system, the release of polyphosphazene from the matrix to the solution is about 200 These data indicate that there is a molecular weight threshold of kilodaltons. Only Polymer solubility depends on matrix-supported calcium ions (or other The amount of polyvalent cation or polymer) and the degree of ionization of the polymer. PC Differences observed in PP erosion are most important for the antigen delivery system Things.   Polyphosphazene is a suitable material that can provide various physical properties including the degree of hydrolysis. By incorporating the group, it can be customized effectively. Glycinate group, etc. Hydrolysis-sensitive pendant The introduction of toto groups increases the rate of decomposition under water bridges. Yields hydroxy derivatives Cleavage of the external PN bond appearing in the neutral medium of these aminophosphazenes in order to However, it imparts hydrolysis instability to the polymer.   Poly [di (carboxylatophenoxy) phos containing 10% of glycinate groups Fazen-Cody (Glycinate) phosphazene] (PC-G1PP) is Mike It was used to study the preparation and degradation of rospheres. These polymer hydrogels The rate of erosion depends on the molecular weight of polyphosphazene. Weight average molecular weight 130 The kilodalton PC-GIPP loses mass within 3 days as shown in FIG. Becomes 100%. GPC analysis of the matrix and lysate in FIG. When kept warm for 240 days in a striped environment, the polymer bag bone decomposes to 1 kilodalton. It is shown to be fragments and inorganic phosphates with the following molecular weights. Polymer Electron The hydrogel microspheres were treated with poly-L-lysine (molecular weight 62 kdalton), the erosion rate is significantly reduced by 2.5 times. Steric hindrance regulates degradability and stability of polyphosphazene microspheres To provide an additional approach to                             Action of cross-linking agent   The third means by which antigen release from microspheres can be regulated is microphonespheres. With poly-L-lysine or similar multiply charged ions that form a semi-permeable membrane on the outside of the Polyphosphazene microphone By coating the rospheres. Microsphere core is next, EDTA, etc. It is liquefied by the addition of a chelating agent such as, but the chelating agent reverses the gelation process. To produce the solubility of the polyphosphazene matrix. Permeability is covered It can be adjusted according to the size of the multiply charged ions used in the process. 12 to 295 kiloda Release patterns from microspheres cross-linked with poly-L-lysine over the molecular weight of Luton Cents are shown in FIG. As the molecular weight of poly-L-lysine increased, the coating Increased transparency, resulting in 20 nm polystyrene beads from microspheres The emission of   By changing the polyphosphazene concentration, the side groups of the polymer can be The ability of microspheres to be coated with poly-L-lysine is Enables the formation of microspheres that release antigen with a sustained release rate You. Combines very mild conditions for gelation and microsphere formation The manipulability of the polymer system of the octopus has led to a simple induction of antibodies and immune responses. This polymer system is especially desirable for developing single dose vaccines. Become. Example 3: Orally administered to mice as measured in in vitro and in vivo immune response studies           Efficacy of influenza vaccine encapsulated in alginate   The microencapsulated antigen was used to immunize mice by the oral route. Exemption The rate of epidemiological response was first measured by the test tube assay of humoral immunity. Use of in-vivo research For switching the antibody class Immunity for the ability to carry out, the speed, magnitude and duration of the immune response. To determine the effect of dose and route, and the need to boost the immune response. to enable. As shown below, the ELISA (Elisa) is a total antigen-specific response, It was also used to assess subclasses of IgG response. CTL test It could be done to assess cell-mediated responses.   Tetanus Toxoid (Connaught Laboratories), as detailed below. And influenza virus were encapsulated for immunogenicity studies. My The black encapsulated antigen was prepared and quantified as described above. By SDS-PAGE Antigen concentration in measured alginate and polyphosphazene is sterile before administration Adjusted with deionized water.   Seven to eight week old female BALB / c mice were randomly divided into five groups. Was done. Thirty micrograms of flu antigen were calibrated by intubation. Blood service The sample is CO2Collected from the retro-orbital sinus of anesthetized mice. Mouse C in the inhalation chamber O2Was euthanized using.   Developed by Novak et al., Vaccine, Vol. 11, pp. 55-60 (1992). Influenza mouse disease model system It can be used to study the protection afforded by immunization with Ruenza. Came. Mice were challenged at several times post-immunization, and viruses from various organs were tested. The replication level was measured. In previous studies, parenteral immunization completely completed the nose and trachea Not protected it in the lungs, Completely protects against virus growth. Vaccine efficacy is thus viral in the lungs It can be evaluated based on the replication level.   Influenza grows in eggs according to standard methods, and proteins, hemagglutination and It was quantified by each plaque assay. Influenza is formaldehyde solution 3 Formalin was inactivated at a final concentration of 1: 4000 with the addition of 8%. Virus Also infectious60Co1.2 × 10 from the source6Inactive by exposure to gamma irradiation of Rad Was   Anti-influenza specific antibody of mouse serum is sodium carbonate buffer at pH 9.6 Coated with 10 μg / ml of influenza-infected MDCK cell lysate in solution Measured by ELISA on a 6-well microtype plate. After coating and cleaning The site that can be used for non-specific binding of proteins is BSA 2.5% in PBS solution. Blocked by adding. 2 of serum in BSA / PBS 1% after blocking and washing Double serial dilutions were added to the wells. Unbound serum was washed off and washed with horseradish. Goat anti-mouse IgG labeled with Shuperoxidase was added. Unbonded zygotes Washed off and serum antibody added with substrate 0-phenylenediamine dihydrochloride. Detected. The reaction is H2SOFourStop with the addition of 2M and read the absorbance at 490 nm. Was taken off. Endpoint titer is significantly greater than that of antibody negative samples at the same dilution It is the reciprocal of the largest sample that produces a signal. Eliza Reactive Flu TgG isotype of specific antibody was measured by detection of mouse antibody binding to antigen . Mouse IgG subclass Horseradish peroxidase label specific for strains 1, 2a, 2b and 3 Hedge anti-mouse antibody reacted with mouse antibody that binds to the antigen on the ELISA plate. Was.   Influenza hemagglutination-inhibiting antibody assay is used to remove non-specific inhibitors. This was done using heat-inactivated mouse serum incubated with 10% of chicken red blood cells for 30 minutes. A 2-fold dilution of serum was added to a 96-well microtiter plate and the same volume of virus was added. 8 HA units of loose suspension was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes. Niwato 0.5% suspension of red blood cells was added to each well and incubated at room temperature for 45-60 minutes. . The HI titer is the reciprocal of the maximum dilution that completely inhibits hemagglutination of red blood cells.   In the first group of studies, BALB / c mice consisted of 2 mice per group. 5 groups of us, sterile deionized water (Group I), empty alginate Microspheres (Group II), Alginay containing 30 μg influenza Tomicrosphere (Group III), Influenza 30 μg Plus Alginate microspheres (glue) containing 10 μg of latoxin (CT) mixed IV) or 30 μg of soluble influenza (Group V) for oral intubation More immunized. Blood and fecal samples were taken at 7, 14, 21 and Collected on day 28, the class specificity of influenza antibody reactivity was measured.   The animals can be influenza microencapsulated in alginate alone or It was immunized as described above in combination with cholera toxin.   Results for alginate microencapsulated influenza antigen are shown in Figures 6a and 6b. And 6c. Control mice that did not receive the influenza antigen (group I and II) showed no flu-specific serum IgM or IgG response. Soluble influenza (Group V) induces low IgM titers on day 7, which Although maintained for at least 14 days, no IgG response was detected as shown in Figure 6. Was not. Encapsulated flu and CT were post-immunized 14 as shown in Figure 6b. High levels of flu-specific IgG were induced daily. These levels are maintained up to 28 days Was. The alginate microcapsules flu alone are shown in Figure 6c. As seen in animals receiving the microsphere influenza-CT mixture The same flu-specific IgG titers were induced. Good antibody titers are earlier than 14 days High titers of IgG persisted for at least 77 days.   Animals immunized with alginate-encapsulated influenza and cholera toxin Was boosted 35 days after the first immunization. The result is shown in Figure 7. You. Influenza booster administration used in combination with cholera toxin was measured in fecal samples. Induces IgA production as determined.   In summary, alginate-encapsulated flu was bound to IgM and IgG in serum. Mucosal adjuvant CT was not required for specific antigen transfer. Alginate Data obtained with encapsulated influenza are high for single oral doses without CT It is shown to induce a flu-specific serum IgG response. In FIG. The results showed that the IgA antibody was alginate-encapsulated influenza with CT. It is shown to be induced by a single oral booster administration by N.Z. Example 4: Polyphos to mice as measured by in vitro and in-vivo immune response studies           Oral administration of Fazen encapsulated influenza vaccine           production   Influenza encapsulated with polyphosphazene microspheres as described above. The same experimental record as animal immunization with Nanzaza alone or in combination with cholera toxin continued .   The result is shown in FIG. In the absence of cholera toxin, either serum or feces Alginate, albeit with a slight delay in measurable production of anti-influenza antibodies There is IgM production in the same manner as shown for the encapsulated antigen (Fig. 6b). . Example 5: Intranasal immunization of mice with microencapsulated tetanus toxoid   The mice were divided into 4 groups, (1) tetanus toxoid in water (9 animals), (2) Tetanus toxoid of alginate microspheres, (9 animals), (3) PCPP Microsphere Tetanus Toxoid (10 animals), and (4) Al Microsphere tetanus toxoid (95% dinate / 5% PCPP) 9 animals) were inoculated intranasally. In each case 50 μg of antigen was administered Was. Mice were challenged with Eliza after 2 weeks (serum) and 3 weeks (bronchial and nasal lavage). Is certified for body production Was. The results are shown in Table 1.   Boliphosphazene or alginate / polyphosphazene microspheres It is clearly shown that intranasal administration of the antigen induces a serum IgG response. Further resistance This administration when the raw material is encapsulated with a combination of alginate and PCPP The results show that the method can be used to induce the production of IgA molecules . Example 6: By Microsphere Encapsulated Tetanus Toxoid           With parenteral immunization and conventional adjuvant immunization of mice           Comparison   Traditionally most injectable non-replicating vaccines reach sufficient serum antibody titers to protect Multiple doses were required to complete. Protected with a single inoculation for obvious reasons More desirable to achieve. Therefore, the polyphosphazene on the immunogenicity of the antigen The effect was verified in mice immunized subcutaneously with a single dose. Water, alum and finished Antigens from whole Freund's adjuvant are included in many experiments as comparators Was.   Polymer microspheres made of alginate or polyphosphazene The immunogenicity of the prescribed tetanus toxoid antigen depends on the solubility of soluble tetanus toxoid and Standard adjuvants Alum and Complete Freud Adjuvant (CFA) Was compared to the tetanus toxoid. Group of 5 mice with tetanus toxoid Immunized with 20 μg using the subcutaneous route.   The results are shown in Table 2. Anti-tetanus toxoid serum immune response tested by Eliza Was done. Soluble tetanus toxoid antigen and alginate microencapsulation Gout toxoid induced a maximum titer of 512 at 13 weeks. Including tetanus toxoid The polyphosphazene microspheres are either alum or complete Freund's horse mackerel. Induction of higher antibody titers earlier than post-immunization than Tubant tetanus toxoid did. In addition, polyphosphazene microspheres containing tetanus toxoid Even at 13 weeks, it induced antibody titers that were still rising. At this point in time, Liphosphazene Microsphere Tetanus Toxoid It induced a titer of 65,536, which is the response seen with soluble tetanus toxoid. It is about 100 times stronger than that of alum and complete Freund's adjuvant. It was about the same as or slightly higher (2-4 times). Boliho Sphazene microspheres induce arginine in the induction of antibodies against tetanus toxoid. Clearly better than the Auto Microsphere.   Dose-dependent effect of immunization with tetanus toxoid is polyphosphazene micros Amount of tetanus toxoid prescribed with fair or complete Freund's adjuvant Was validated by immunizing mice with changes.   The results are shown in Table 3. Polyphosphazene Microsphere Tetanus Toxo Id is less immunogenic than complete Freund's adjuvant tetanus toxoid It was always an advantage. At all time points and at all tetanus toxoid doses The Eliza titers of the two formulations were within twice the dilution of each other. Example 7: Ins formulated in polymer microspheres or as an adjuvant           Parenteral with fluenza microparticles           Immunization   Mice were further fed with Polymer Microspheres, Alum and Complete Freund. Exempt with 5 μg of formalin inactivated influenza virus prescribed by Juvant It was quarantined that the relative efficiency of the formulation was comparable to that for tetanus toxoid. All were to determine if they were the same as for the outer membrane virus.   The results are shown in Table 4. Once again the polyphosphazene microspheres are very Induction of high titer anti-flu immune response was similar to complete Freund's adjuvant Efficient at the same level as water, alum or alginate microspheres Was much more efficient. In contrast to the tetanus toxoid results, alum Juvant's influenza induces a much lower titer anti-flu response As low as influenza and alginate microcapsulated influenza won. In summary, polyphosphazene microspheres containing antigen are complete. Inducing an antibody response that is as large as the Freund's adjuvant-prescribed antigen Shows the result.   Mawas serum was tested for the presence of functional antibodies by hemagglutination inhibition and neutralization assays . The hemagglutination inhibition assay is shown in Table 5. Flu as determined by HAI assay Containing polyphosphazene microspheres elicited an antibody titer of 1280 at 7 weeks On the other hand, it is the same as the alu and alginate microsphere flu. Reutn's adjuvant flu could not detect HAI titer or was It was always a low titer.   Antibodies neutralizing influenza infectivity were tested by 50% plaque reduction test . Fluor of polyphosphazene microspheres has a detection titer of 800 by 13 weeks , But water soluble and complete Freund's adjuvant flu were still detectable No sum antibody titer was induced. HAI and neutralization test for influenza Is a sensitive functional antibody assay. Thus the Polyphosphazene Microsphere The immune response produced is superior to Freund's complete adjuvant.   The IgG isotypes induced by these formulations were measured by the Eliza test. The results are shown in Table 7. Alum Adjuvant Influenza Simply induced an IgG1 response. Fl formulated with complete Freund's adjuvant u mainly induces an IgG1 response, which beaks at 7 weeks and declines by 13 weeks. I retired. F of alginate and polyphosphazene microsphere formulations lu also primarily induces an IgG1 response, which is alum prescribed by 7 weeks Was higher than that of flu. Furthermore, polyphosphazene microsphere prescription anti Hara has very favorable potency compared to the titers induced by fully adjuvanted antigens. Induced value. As with Complete Freund's Adjuvant, Microspheres elicited significant levels of IgG2a and IgG2b antibodies. Significant differences in the immune response were found at the activity levels detected with the IgG3 isotype Was. Polyphosphazene microspheres can induce significant IgG3 antibody titers It was the only prescription that could.   This relates to polymer adjuvants and synthetic methods and their use in vaccine compositions. Modifications and variations of the invention will be apparent to those skilled in the art from the foregoing detailed description. U. Such modifications and variations are intended to fall within the scope of the appended claims. Have been.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＺ (72)発明者 ジェンキンズ，シャロン，エイ. アメリカ合衆国，01960 マサチューセッ ツ，ピーボディ，ベケット ストリート 10 (72)発明者 ペイン，レンドン，ジー. アメリカ合衆国，02174 マサチューセッ ツ，アーリントン，ヒルサイド アヴェニ ュー 103 (72)発明者 ロバーツ，ブライアン，イー. アメリカ合衆国，02139 マサチューセッ ツ，ケンブリッジ，ローレンス ストリー ト 35────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AU, BR, CA, CN, J P, KR, NZ (72) Inventor Jenkins, Sharon, A.             United States, 01960 Massachusetts             Tsu, Peabody, Beckett Street             Ten (72) Inventor Payne, Rendon, Gee.             United States, 02174 Massachusetts             Tu, Arlington, Hillside Aveni             View 103 (72) Inventor Roberts, Bryan, Yi.             United States, 02139 Massachusetts             Tsu, Cambridge, Lawrence Strey             Th 35

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．一つのワクチン組成物であって、免疫原性作用を誘発する抗原の有効量をカ プセル化した生物適合性ポリマーよりなるヒドロゲル極微粒子を含み、この極微 粒子は２００ミクロンあるいはそれ以下の直径を持つワクチン組成物。 ２．請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで極微粒子が１ミクロンから １５ミクロンまでの直径を持つことを特徴とする組成物。 ３．請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここでポリマーがヒドロゲルを形 成するために物理的架橋、共有結合架橋あるはイオン架橋により架橋することが 出来るポリマーおよびポリマーの塩よりなるグループから選択される生物適合性 ポリマーであることを特徴とする組成物。 ４．請求の範囲第３項記載の組成物であって、ここでポリマーがアルジネート、 ゼラチン、ペクチン、コラーゲン、ホスファゼン高分子電解質、ポリ（アクリル アミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（Ｎ−ビニル ピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリ コール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル 酸）、スルホン酸ポリスチレン、ポリアミン、ポリ（ビニルピリジン）、および そのポリマーおよびモノマーの混合物およびコポリマーよりなるグループから選 択されることを特徴とする組成物。 ５．請求の範囲第３項記載の組成物であって、ここでポリマーが式： のホスファゼン高分子電解質であり、ここでＡおよびＢはポリマー内で独立して 変化することが出来、それは、 (i)使用条件の下で加水分解を受けやすい基、もしくは (ii)使用条件の下で加水分解を受け難い基であり、脂肪族、アリル、アラルキル 、アルカリル、カルボン酸、ヘテロ芳香族、ヘテロアルキル、（脂肪族）アミノ −、ヘテロアラルキル、ジ（脂肪族）アミノ−、アリルアミノ−、ジアリルアミ ノ−、アルキルアリルアミノ−、−オキシアリル、−オキシフェニルＣＯ2Ｈ、 −オキシフェニルＳＯ3Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシル、−オキシフェニル ＰＯ3Ｈ、−オキシ脂肪族、−オキシアルキル、−オキシ（脂肪族）ＣＯ2Ｈ、− オキシ（脂肪族）ＳＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ヒ ドロキシル、−オキシアルカリル、−オキシアラルキル、−チオアリル、−チオ 脂肪族、−チオアルカリル、−チオアラルキル、あるいは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（ アリルあるいは脂肪族）、−Ｏ−〔（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（ＣＨ2）ｘＮＨ2、− Ｏ−［（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ（ＣＨ2）ｘＮＨ（ＣＨ2）ｘＳＯ3Ｈ、および−Ｏ−［ （ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（アリルあるいは脂肪族）、であり、ここでｘは１乃至８ 、またｙは１乃至２０の整数であり、またｎは１０および２０，０００の間にあ る基よりなるグループから選択される基、 であり得ることを特徴とする組成物。 ６．ポリマーが多価陽イオンあるいは高分子電解質で架橋されることを特徴とす る請求の範囲第１項記載の組成物。 ７．ポリマーがアルジネートおよびホスファゼン高分子電解質の混合物であるこ とを特徴とする請求の範囲第４項記載の組成物。 ８．請求の範囲第１項記載の組成物であって、ここで抗原が細胞、細菌、ウイル ス粒子、およびそれらの一部から誘導される化合物よりなるグループから選択さ れ、ここで化合物がタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核 酸、あるいはその組合せよりなるグループから選択されることを特徴とする組成 物。 ９．請求の範囲第８項記載の組成物であって、ここで抗原がロタウイルス、麻疹 、流行性耳下腺炎、風疹、小児麻痺、Ａ型およびＢ型肝炎およびヘルペスウイル ス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザ菌、破傷風菌、インフルエンザ、ジ フテリア菌、および淋菌よりなるグループから選択される生体から誘導されるこ とを特徴とする組成物。 １０．ポリマーが抗原と共有接合されることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の組成物。 １１．組成物が更にムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、サイトカイン 、ジフテリア毒素、エキソトキシンＡ、コレラ毒素Ａ、コレラ毒素Ｂ、および溶 解性ホスファゼンよりなるグループからのアジュバントを含むことを特徴とする 請求の範囲第１項記載の組成物。 １２．極微粒子が胃の酸ｐＨから極微粒子を防護するコーティングの内部にある ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。 １３．動物に免疫応答を生じさせる一つの方法であって、免疫原性作用を誘発す る抗原の有効量をカプセル化する生物適合性ポリマーで形成されるヒドロゲル極 微粒子を含むワクチン組成物をその動物に投与する段階を含み、ここで極微粒子 は直径が２００ミクロンもしくはそれ以下である一つの方法。 １４．マイクロスフェアが粘膜面に投与されることを特徴とする請求の範囲第１ ３項記載の方法。 １５．粘膜面へのルートが気管内であることを特徴とする請求の範囲第１４項記 載の方法。 １６．粘膜面へのルートが鼻腔内であることを特徴とする請求の範囲第１４項記 載の方法。 １７．粘膜面が直腸および膣よりなるグループから選択されることを特徴とする 請求の範囲第１４項記載の方法。 １８．粘膜面へのルートが経目であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載 の方法。 １９．粘膜面へのルートが非経口であることを特徴とする請求の範囲第１４項記 載の方法。 ２０．極微粒子が１ミクロンから１５ミクロンまでの直径を持つことを特徴とす る請求の範囲第１３項記載の方法。 ２１．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここでポリマーがアルジネート 、ゼラチン、ペクチン、コラーゲン、ホスファゼン高分子電解質、ポリ（アクリ ルアミド）、ポリ （メタクリルアミド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、 ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ （ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、スルホン 酸ポリスチレン、ポリアミン、ポリ（ビニルピリジン）、およびそれらのポリマ ーおよびモノマーの混合物およびコポリマーよりなるグループから選択されるこ とを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。 ２２．請求の範囲第２１項記載の方法であって、ここでホスファゼン高分子電解 質が式： のものであり、ここでＡおよびＢはポリマー内で独立して変化することが出来、 それは (i)使用条件の下で加水分解を受けやすい基、もしくは (ii)使用条件の下で加水分解を受け難い基であり、脂肪族、アリル、アラルキル 、アルカリル、カルボン酸、ヘテロ芳香族、ヘテロアルキル、（脂肪族）アミノ −、ヘテロアラルキル、ジ（脂肪族）アミノ−、アリルアミノ−、ジアリルアミ ノ−、アルキルアリルアミノ−、−オキシアリル、−オキシフェニルＣＯ2Ｈ、 −オキシフェニルＳＯ3Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシル、−オキシフェニル ＰＯ3Ｈ、−オキシ脂肪族、−オキシアルキル、−オキシ（脂肪族）ＣＯ2Ｈ、− オキシ（脂肪族）ＳＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ3Ｈ、−オキシ （脂肪族）ヒドロキシル、−オキシアルカリル、−オキシアラルキル、−チオア リル、−チオ脂肪族、−チオアルカリル、−チオアラルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ −（アリルあるいは脂肪族）、−Ｏ−〔（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（ＣＨ2）ｘＮＨ2 、−Ｏ−〔（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ（ＣＨ2）ｘＮＨ（ＣＨ2）ｘＳＯ3Ｈ、あるいは− Ｏ−〔（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（アリルあるいは脂肪族）、であり、ここでｘは１ 乃至８、またｙは１乃至２０の整数であり、またｎは１０および２０，０００の 間にある基よりなるグループから選択される基、 であり得ることを特徴とする方法。 ２３．ポリマーがアルジネートおよびホスファゼンの混合物であることを特徴と する請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで抗原が細胞、細菌、ウイ ルス粒子、およびその一部より誘導される化合物よりなるグルーブから選択され 、ここで化合物はタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸 、あるいはその組合せよりなるグループから選択されることを特徴とする方法。 ２５．請求の範囲第２４項記載の方法であって、ここで抗原がロタウイルス、麻 疹、流行性耳下腺炎、風疹、小児麻痺、Ａ型およびＢ型肝炎およびヘルベスウイ ルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザ菌、破傷風菌、インフルエンザ、 ジフテリア菌、および淋菌よりなるグルーブから選択される生体から誘導される ことを特徴とする方法。 ２６．ポリマーが抗原と共有接合されることを特徴とする請求 の範囲第１３項記載の方法。 ２７．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ムラミルジペプチド、ムラミル トリペプチド、サイトカイン、ジフテリア毒素、エキソトキシンＡ、コレラ毒素 Ａ、コレラ毒素Ｂ、および溶解性ホスファゼンよりなるグループからのアジュバ ントを更に含むことを特徴とする方法。 ２８．極微粒子が胃の酸ｐＨから極微粒子を防護する材料と併用して投与される ことを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。 ２９．極微粒子が異なる放出速度を持つことを特徴とする請求の範囲第１３項記 載の方法。 ３０．ワクチン組成物を製造する一つの方法であって、抗原の存在の下で生物適 合性ポリマーのヒドロゲルを形成することにより２００ミクロンあるいはそれ以 下の直径を持つ極微粒子を形成することを含む方法。 ３１．物理的架橋、共有結合架橋あるはイオン架橋によりポリマーがヒドロゲル に形成されることを特徴とする請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２．請求の範囲第３１項記載の方法であって、ここでポリマーがアルジネート 、ゼラチン、ペクチン、コラーゲン、ホスファゼン高分子電解質、ポリ（アクリ ルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（Ｎ−ビニ ルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレング リコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリ ル酸）、スルホン酸ポリスチ レン、ポリアミン、ポリ（ビニルビリジン）、およびそのポリマーおよびモノマ ーの混合物およびコポリマーよりなるグループから選択されることを特徴とする 方法。 ３３．請求の範囲第３２項記載の方法であって、ここでポリマーは式： のホスファゼン高分子電解質であり、ここでＡおよびＢはポリマー内で独立して 変化することが出来、それは、 (i)使用条件の下で加水分解を受けやすい基、もしくは (ii)使用条件の下で加水分解を受け難い基であり、脂肪族、アリル、アラルキル 、アルカリル、カルボン酸、ヘテロ芳香族、ヘテロアルキル、（脂肪族）アミノ −、ヘテロアラルキル、ジ（脂肪族）アミノ−、アリルアミノ−、ジアリルアミ ノ−、アルキルアリルアミノ−、−オキシアリル、−オキシフェニルＣＯ2Ｈ、 −オキシフェニルＳＯ3Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシル、−オキシフェニル ＰＯ3Ｈ、−オキシ脂肪族、−オキシアルキル、−オキシ（脂肪族）ＣＯ2Ｈ、− オキシ（脂肪族）ＳＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ3Ｈ、−オキシ（脂肪族）ヒ ドロキシル、−オキシアルカリル、−オキシアラルキル、−チオアリル、−チオ 脂肪族、−チオアルカリル、−チオアラルキル、あるいは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（ アリルもしくは脂肪族）、−Ｏ−〔（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（ＣＨ2）ｘＮＨ2、− Ｏ−［（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ（ＣＨ2）ｘＮＨ （ＣＨ2）ｘＳＯ3Ｈ、および−Ｏ−［（ＣＨ2）ｘＯ］ｙ−（アリルもしくは脂 肪族）、であり、ここでｘは１乃至８、またｙは１乃至２０の整数であり、また ｎは１０および２０，０００の間にある基よりなるグループから選択される基、 であり得ることを特徴とする方法。 ３４．抗原の放出で調節された速度を達成するための特異的な分子量を持つボリ マーを選択することを更に含むことを特徴とする請求の範囲第３０項記載の方法 。 ３５．抗原の放出で調節された速度を達成するための特定の分子量を持つ架橋陽 イオンもしくはポリマー分子を選択することを更に含むことを特徴とする請求の 範囲第３０項記載の方法。 ３６．水状環境で分解速度を増加するために加水分解感受性ペンダント基を持つ ポリマーを選択することを更に含むことを特徴とする請求の範囲第３０項記載の 方法。 ３７．拍動放出を持つ免疫原性組成物を形成するために異なった放出速度を持つ 抗原を一緒に含む極微粒子を混合することを更に含むことを特徴とする請求の範 囲第３０項記載の方法。 ３８．ある極微粒子からの抗原放出が他の極微粒子よりもより長い時間後に行わ れるため延長した時間の放出が出来る免疫原性組成物を形成するために異なった 放出速度を持つ抗原を一緒に含む極微粒子を混合することを更に含むことを特徴 とする請求の範囲第３０項記載の方法。[Claims] 1. In one vaccine composition, an effective amount of an antigen that induces an immunogenic effect is administered. It contains microparticles of hydrogel consisting of biocompatible polymer that is encapsulated. Vaccine composition in which the particles have a diameter of 200 microns or less. 2. The composition of claim 1 wherein the ultrafine particles are from 1 micron A composition having a diameter of up to 15 microns. 3. The composition of claim 1 wherein the polymer forms a hydrogel. Physical cross-linking, covalent cross-linking or ionic cross-linking Biocompatibility selected from the group consisting of possible polymers and salts of polymers A composition which is a polymer. 4. The composition of claim 3 wherein the polymer is an alginate, Gelatin, pectin, collagen, phosphazene polyelectrolyte, poly (acrylic Amide), poly (methacrylamide), poly (vinyl acetate), poly (N-vinyl) Pyrrolidone), poly (hydroxyethylmethacrylate), poly (ethylene glycol) Call), poly (vinyl alcohol), poly (acrylic acid), poly (methacrylic) Acid), polystyrene sulfonate, polyamine, poly (vinyl pyridine), and Selected from the group consisting of mixtures and copolymers of the polymers and monomers A composition characterized by being selected. 5. The composition of claim 3 wherein the polymer has the formula: Of phosphazene polyelectrolytes, where A and B are independently within the polymer Can change, which is (i) a group that is susceptible to hydrolysis under the conditions of use, or (ii) A group that is not easily hydrolyzed under the conditions of use, such as aliphatic, allyl, and aralkyl. , Alkaryl, carboxylic acid, heteroaromatic, heteroalkyl, (aliphatic) amino -, Heteroaralkyl, di (aliphatic) amino-, allylamino-, diallylamy No-, alkylallylamino-, -oxyallyl, -oxyphenyl CO2H, -Oxyphenyl SOThreeH, -oxyphenyl hydroxyl, -oxyphenyl POThreeH, -oxyaliphatic, -oxyalkyl, -oxy (aliphatic) CO2H,- Oxy (aliphatic) SOThreeH, -oxy (aliphatic) POThreeH, -oxy (aliphatic) Droxyl, -oxyalkaryl, -oxyaralkyl, -thioallyl, -thio Aliphatic, -thioalkaryl, -thioaralkyl, or -NHC (O) O- ( Allyl or aliphatic), -O-[(CH2) XO] y- (CH2) XNH2, − O-[(CH2) XO] y (CH2) X NH (CH2) XSOThreeH, and -O- [ (CH2) XO] y- (allyl or aliphatic), where x is 1-8. , And y is an integer of 1 to 20, and n is between 10 and 20,000. A group selected from the group consisting of A composition which can be 6. Characterized in that the polymer is cross-linked with polyvalent cations or polyelectrolytes The composition of claim 1. 7. The polymer is a mixture of alginate and phosphazene polyelectrolytes. The composition according to claim 4, wherein: 8. The composition according to claim 1, wherein the antigen is a cell, a bacterium, or a virus. Particles, and compounds derived from some of them Where the compounds are proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, nuclei Compositions characterized by being selected from the group consisting of acids or combinations thereof Stuff. 9. The composition according to claim 8, wherein the antigen is rotavirus or measles. , Mumps, rubella, palsy, hepatitis A and B and herpesvirus , Human immunodeficiency virus, Haemophilus influenzae, tetanus, influenza, di It is derived from a living organism selected from the group consisting of Phtheria and Neisseria gonorrhoeae. A composition comprising: 10. The polymer of claim 1, wherein the polymer is covalently conjugated to the antigen. Composition. 11. The composition further comprises muramyl dipeptide, muramyl tripeptide, cytokine , Diphtheria toxin, exotoxin A, cholera toxin A, cholera toxin B, and lysis. Characterized in that it comprises an adjuvant from the group consisting of degrading phosphazene A composition according to claim 1. 12. The microparticles are inside the coating that protects them from the acid pH of the stomach The composition according to claim 1, characterized in that: 13. A method of raising an immune response in an animal that induces an immunogenic effect Hydrogel electrode formed of biocompatible polymer encapsulating an effective amount of antigen Administering to the animal a vaccine composition comprising microparticles, wherein the microparticles are Is a method with a diameter of 200 microns or less. 14． The first aspect of the invention is characterized in that the microsphere is administered to the mucosal surface. The method according to item 3. 15. 15. The method according to claim 14, wherein the route to the mucosal surface is in the trachea. How to list. 16. 15. The method according to claim 14, characterized in that the route to the mucosal surface is in the nasal cavity. How to list. 17． Characterized in that the mucosal surface is selected from the group consisting of rectum and vagina The method according to claim 14. 18. 15. The method according to claim 14, wherein the route to the mucosal surface is the eyelid. the method of. 19. 15. The method according to claim 14, wherein the route to the mucosal surface is parenteral. How to list. 20. Characterized by ultrafine particles having a diameter of 1 to 15 microns 14. The method according to claim 13, wherein: 21. 14. The method of claim 13 wherein the polymer is alginate. , Gelatin, pectin, collagen, phosphazene polyelectrolyte, poly (acrylic Luamide), poly (Methacrylamide), poly (vinyl acetate), poly (N-vinylpyrrolidone), Poly (hydroxyethyl methacrylate), poly (ethylene glycol), poly (Vinyl alcohol), poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid), sulfone Acid polystyrene, polyamine, poly (vinyl pyridine), and their polymers And a mixture of monomers and copolymers. 14. The method according to claim 13, wherein: 22. 22. The method of claim 21, wherein the phosphazene polyelectrolyte is Quality is the expression: Where A and B are independently variable within the polymer, that is (i) a group that is susceptible to hydrolysis under the conditions of use, or (ii) A group that is not easily hydrolyzed under the conditions of use, such as aliphatic, allyl, and aralkyl. , Alkaryl, carboxylic acid, heteroaromatic, heteroalkyl, (aliphatic) amino -, Heteroaralkyl, di (aliphatic) amino-, allylamino-, diallylamy No-, alkylallylamino-, -oxyallyl, -oxyphenyl CO2H, -Oxyphenyl SOThreeH, -oxyphenyl hydroxyl, -oxyphenyl POThreeH, -oxyaliphatic, -oxyalkyl, -oxy (aliphatic) CO2H,- Oxy (aliphatic) SOThreeH, -oxy (aliphatic) POThreeH, -oxy (Aliphatic) hydroxyl, -oxyalkaryl, -oxyaralkyl, -thioa Ryl, -thioaliphatic, -thioalkaryl, -thioaralkyl, -NHC (O) O -(Allyl or aliphatic), -O-[(CH2) XO] y- (CH2) XNH2 , -O-[(CH2) XO] y (CH2) X NH (CH2) XSOThreeH, or- O-[(CH2) XO] y- (allyl or aliphatic), where x is 1 To 8 and y is an integer of 1 to 20, and n is 10 or 20,000. A group selected from the group consisting of groups in between, A method characterized by being capable of being. 23. Characterized in that the polymer is a mixture of alginate and phosphazene 22. The method according to claim 21. 24. 14. The method according to claim 13, wherein the antigen is a cell, a bacterium or a virus. Selected from a groove consisting of loose particles, and compounds derived from parts thereof. , Where compounds are proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, nucleic acids , Or a combination thereof. 25. 25. The method of claim 24, wherein the antigen is rotavirus, hemp. Rash, mumps, rubella, pediatric paralysis, hepatitis A and B and Helveswi Rus, human immunodeficiency virus, Haemophilus influenzae, tetanus, influenza, Derived from a living organism selected from the group consisting of Diphtheria and Neisseria gonorrhoeae A method characterized by the following. 26. Claims characterized in that the polymer is covalently conjugated to the antigen 14. The method according to claim 13 in the range. 27. The method according to claim 13, wherein muramyl dipeptide, muramyl Tripeptide, cytokine, diphtheria toxin, exotoxin A, cholera toxin Ajuva from the group consisting of A, cholera toxin B, and soluble phosphazene Method. 28. Ultrafine particles are administered in combination with materials that protect them from the acid pH of the stomach 14. The method according to claim 13, characterized in that 29. 14. The ultrafine particles have different release rates, as set forth in claim 13. How to list. 30. One method of making a vaccine composition, which is biocompatible in the presence of an antigen. 200 microns or more by forming a hydrogel of a compatible polymer A method comprising forming ultrafine particles having a lower diameter. 31. The polymer is a hydrogel due to physical crosslinking, covalent crosslinking or ionic crosslinking. 31. A method according to claim 30, characterized in that 32. The method of claim 31, wherein the polymer is an alginate. , Gelatin, pectin, collagen, phosphazene polyelectrolyte, poly (acrylic Lamide), poly (methacrylamide), poly (vinyl acetate), poly (N-vinyl chloride) Lupyrrolidone), poly (hydroxyethylmethacrylate), poly (ethylene glycol) Recall), poly (vinyl alcohol), poly (acrylic acid), poly (meth) Acid), sulfonic acid polystyrate Lene, polyamines, poly (vinyl pyridine), and their polymers and monomers Selected from the group consisting of mixtures and copolymers of Method. 33. The method of claim 32, wherein the polymer has the formula: Of phosphazene polyelectrolytes, where A and B are independently within the polymer Can change, which is (i) a group that is susceptible to hydrolysis under the conditions of use, or (ii) A group that is not easily hydrolyzed under the conditions of use, such as aliphatic, allyl, and aralkyl. , Alkaryl, carboxylic acid, heteroaromatic, heteroalkyl, (aliphatic) amino -, Heteroaralkyl, di (aliphatic) amino-, allylamino-, diallylamy No-, alkylallylamino-, -oxyallyl, -oxyphenyl CO2H, -Oxyphenyl SOThreeH, -oxyphenyl hydroxyl, -oxyphenyl POThreeH, -oxyaliphatic, -oxyalkyl, -oxy (aliphatic) CO2H,- Oxy (aliphatic) SOThreeH, -oxy (aliphatic) POThreeH, -oxy (aliphatic) Droxyl, -oxyalkaryl, -oxyaralkyl, -thioallyl, -thio Aliphatic, -thioalkaryl, -thioaralkyl, or -NHC (O) O- ( Allyl or aliphatic), -O-[(CH2) XO] y- (CH2) XNH2, − O-[(CH2) XO] y (CH2) XNH (CH2) XSOThreeH, and -O-[(CH2) XO] y- (allyl or fat Aliphatic), where x is an integer from 1 to 8 and y is an integer from 1 to 20, and n is a group selected from the group consisting of groups between 10 and 20,000, A method characterized by being capable of being. 34. A volume with a specific molecular weight to achieve a regulated rate of antigen release. 31. The method of claim 30, further comprising selecting a mer. . 35. Cross-linking positive with specific molecular weight to achieve a controlled rate of antigen release The method of claim 1, further comprising selecting an ionic or polymeric molecule. Method according to claim 30. 36. Having hydrolysis sensitive pendant groups to increase degradation rate in aqueous environment 31. The method of claim 30, further comprising selecting a polymer. Method. 37. Have different release rates to form immunogenic compositions with pulsatile release Claims characterized in that it further comprises admixing microparticles which together contain the antigen. The method according to item 30. 38. Antigen release from one microparticle occurs after a longer time than another microparticle Different to form an immunogenic composition that can be released for an extended period of time Characterized in that it further comprises admixing ultrafine particles together with an antigen having a release rate 31. The method according to claim 30, wherein
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001524509A (en) * 1997-12-02 2001-12-04 ウエスト・ファーマシューティカル・サービセズ・ドラッグ・デリバリー・アンド・クリニカル・リサーチ・センター・リミテッド Composition for nasal administration
US9526699B2 (en) 2006-01-18 2016-12-27 Kist Biodegradable and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel, preparation method thereof and use thereof

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPM572294A0 (en) * 1994-05-18 1994-06-09 Vaccine Technologies Pty. Ltd. Delivery vehicle for bioactive molecule
US5674495A (en) * 1995-02-27 1997-10-07 Purdue Research Foundation Alginate-based vaccine compositions
US5879712A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sri International Method for producing drug-loaded microparticles and an ICAM-1 dosage form so produced
US5807757A (en) * 1996-07-02 1998-09-15 Virus Research Institute, Inc. Preparation of ionically cross-linked polyphosphazene microspheresy by coacervation
US5980948A (en) * 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
WO1998048626A1 (en) * 1997-04-30 1998-11-05 Emory University Methods and compositions for administering dna to mucosal surfaces
US7087236B1 (en) 1998-09-01 2006-08-08 Merrion Research I Limited Method for inducing a cell-mediated immune response and improved parenteral vaccine formulations thereof
AU2001261433A1 (en) 2000-05-12 2001-11-26 Pharmacia And Upjohn Company Vaccine composition, method of preparing the same, and method of vaccinating vertebrates
US20040131631A1 (en) * 2002-11-22 2004-07-08 Alexander Andrianov Polyphosphazene immunostimulants
GB0300531D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 West Pharm Serv Drug Res Ltd Pharmaceutical compositions
WO2004066704A2 (en) 2003-01-17 2004-08-12 Cornell Research Foundation, Inc. Injectable hydrogel microspheres from aqueous two-phase system
CN101090710B (en) * 2004-10-25 2012-03-14 宝利策尼克斯有限公司 Loadable polymeric particles for therapeutic and/or diagnostic applications and methods of preparing and using the same
EP1985284A1 (en) * 2007-04-25 2008-10-29 OctoPlus Sciences B.V. Vaccine formulation
WO2008100142A2 (en) * 2007-02-12 2008-08-21 Octoplus Sciences B.V. Vaccine formulation
EP2196196A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-16 Medipol S.A. Compound, medicament, vaccine composition and nanocapsules
US8883717B2 (en) * 2012-03-30 2014-11-11 Artificial Cell Technologies, Inc. Antigenic compositions and methods
GB201212010D0 (en) * 2012-07-05 2012-08-22 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
JP6712222B2 (en) 2013-12-06 2020-06-17 インターベット インターナショナル ベー． フェー． Compositions for oral delivery of bioactive agents
EP3368609A4 (en) * 2015-10-28 2019-07-24 University of Maryland, College Park Multifunctional biodegradable carriers for drug delivery
CN105214100A (en) * 2015-11-16 2016-01-06 中国医学科学院生物医学工程研究所 A kind of pH response microcapsule-type protein vaccine carrier and preparation method
CN112618709B (en) * 2019-09-24 2023-11-03 华南理工大学 Pig oral vaccination slow-release adjuvant and preparation method and application thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4880622A (en) * 1986-05-20 1989-11-14 Research Corporation Technologies, Inc. Water-soluble phosphazene polymers having pharmacological applications
GB8826116D0 (en) * 1988-11-08 1988-12-14 Danbiosyst Ltd Adhesive drug delivery composition
US5032405A (en) * 1989-09-27 1991-07-16 Warner-Lambert Company Oral pharmaceutical composition for acid sensitive proteinaceous agents
US5149543A (en) * 1990-10-05 1992-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Ionically cross-linked polymeric microcapsules

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001524509A (en) * 1997-12-02 2001-12-04 ウエスト・ファーマシューティカル・サービセズ・ドラッグ・デリバリー・アンド・クリニカル・リサーチ・センター・リミテッド Composition for nasal administration
US9526699B2 (en) 2006-01-18 2016-12-27 Kist Biodegradable and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel, preparation method thereof and use thereof

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