JPH09149795A - クロールの測定方法および測定試薬 - Google Patents
クロールの測定方法および測定試薬Info
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- JPH09149795A JPH09149795A JP33123295A JP33123295A JPH09149795A JP H09149795 A JPH09149795 A JP H09149795A JP 33123295 A JP33123295 A JP 33123295A JP 33123295 A JP33123295 A JP 33123295A JP H09149795 A JPH09149795 A JP H09149795A
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- Japan
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Abstract
(57)【要約】
【構成】２−クロロ−４−ニトロフェニ一ルマルトース
またはパラニトロフェニ一ルマルトース等発色性基を導
入したマルトース誘導体を用いて、クロールを測定す
る。 【効果】試料に由来するアミラーゼの影響を受けること
なく正確にクロールの測定が可能となり、血清や尿等生
体試料中の簡便且つ正確なクロールの定量ができる。
またはパラニトロフェニ一ルマルトース等発色性基を導
入したマルトース誘導体を用いて、クロールを測定す
る。 【効果】試料に由来するアミラーゼの影響を受けること
なく正確にクロールの測定が可能となり、血清や尿等生
体試料中の簡便且つ正確なクロールの定量ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、クロールの測定方法に
関するものであり、更に詳細には、クロールが存在しな
いと活性を発現しないアミラーゼに試料中のクロールを
接触せしめ、試料中のクロール量に依存して変化するア
ミラーゼ活性を測定することによってクロールを測定す
るエンザイムアッセイに関する。
関するものであり、更に詳細には、クロールが存在しな
いと活性を発現しないアミラーゼに試料中のクロールを
接触せしめ、試料中のクロール量に依存して変化するア
ミラーゼ活性を測定することによってクロールを測定す
るエンザイムアッセイに関する。
【０００２】更に詳細には、本発明は、測定試薬として
還元性末端に発色性基を有するマルトース（以下、マル
トース誘導体という）を用い、変化するアミラーゼ活性
を、マルトース誘導体の分解速度あるいは分解程度を遊
離してくる発色性材質に基づいて測定する方法に関す
る。
還元性末端に発色性基を有するマルトース（以下、マル
トース誘導体という）を用い、変化するアミラーゼ活性
を、マルトース誘導体の分解速度あるいは分解程度を遊
離してくる発色性材質に基づいて測定する方法に関す
る。
【０００８】本発明に係る酵素定量法は、ヒト血清や尿
中に存在するアミラーゼの影響を受けることが極めて少
なく、これに対してクロールに対する反応性は極めて高
いので、アミラーゼが存在する各種試料（例えば生体試
料〉であっても、これら混在するアミラーゼに係りな
く、つまり予じめ混在するアミラーゼを失活させたりす
ることなく、直接且つ正確にクロールを測定することが
できる。また、本発明は、このようなすぐれた測定方法
を実施できる測定試薬にも関するものである。
中に存在するアミラーゼの影響を受けることが極めて少
なく、これに対してクロールに対する反応性は極めて高
いので、アミラーゼが存在する各種試料（例えば生体試
料〉であっても、これら混在するアミラーゼに係りな
く、つまり予じめ混在するアミラーゼを失活させたりす
ることなく、直接且つ正確にクロールを測定することが
できる。また、本発明は、このようなすぐれた測定方法
を実施できる測定試薬にも関するものである。
【０００４】
【従来の技術】クロール（Ｃｌということもある）は、
ヒトの体内では主として細胞外液中に存在し、成人で約
２０００ｍＥｑのＣｌが含まれている。Ｃｌの正常値
は、例えば、血清Ｃｌが９７〜１０３ｍＥｑ／Ｌ、髄液
Ｃｌが１２２〜１３２ｍＥｑ／Ｌ、汗Ｃｌが１０〜６０
ｍＥｑ／Ｌ、尿Ｃｌが１７０〜２５０ｍＥｑ／日であっ
て、生体Ｃｌのレベルをこれらの範囲内に維持すること
が必要である。
ヒトの体内では主として細胞外液中に存在し、成人で約
２０００ｍＥｑのＣｌが含まれている。Ｃｌの正常値
は、例えば、血清Ｃｌが９７〜１０３ｍＥｑ／Ｌ、髄液
Ｃｌが１２２〜１３２ｍＥｑ／Ｌ、汗Ｃｌが１０〜６０
ｍＥｑ／Ｌ、尿Ｃｌが１７０〜２５０ｍＥｑ／日であっ
て、生体Ｃｌのレベルをこれらの範囲内に維持すること
が必要である。
【０００５】これが一旦疾病になると変動するようにな
る。脱水症（水分欠乏）、Ｃｌ剤が過剰投与、炭酸脱水
素酵素阻害剤投与、尿細管性アシドーシス、呼吸性アル
カローシス過呼吸、過換気症候群、脳炎、膵のう胞性線
維症、低アルドステロン症などの疾病では、例えば血清
Ｃｌ値が１０８ｍＥｑ／Ｌ以上を示す高Ｃｌ血症へと変
動する。
る。脱水症（水分欠乏）、Ｃｌ剤が過剰投与、炭酸脱水
素酵素阻害剤投与、尿細管性アシドーシス、呼吸性アル
カローシス過呼吸、過換気症候群、脳炎、膵のう胞性線
維症、低アルドステロン症などの疾病では、例えば血清
Ｃｌ値が１０８ｍＥｑ／Ｌ以上を示す高Ｃｌ血症へと変
動する。
【０００６】これとは逆に、希釈性低Ｃｌ血症、水分過
剰投与、消化液喪失、腎性喪失、腎不全、慢性腎（う）
炎、利尿剤、副腎皮質機能不全、大葉性肺炎、肺気腫、
呼吸中枢障害、髄膜炎などの疾病では、例えば血清Ｃｌ
値が１０８ｍＥｑ／Ｌ以下を示す低Ｃｌ血症へと変動す
る。
剰投与、消化液喪失、腎性喪失、腎不全、慢性腎（う）
炎、利尿剤、副腎皮質機能不全、大葉性肺炎、肺気腫、
呼吸中枢障害、髄膜炎などの疾病では、例えば血清Ｃｌ
値が１０８ｍＥｑ／Ｌ以下を示す低Ｃｌ血症へと変動す
る。
【０００７】血清中の塩素イオンの測定方法としては、
Ｓｃｈａｌｅｓ−Ｓｃｈａｌｅｓ法、電量滴定法、イオ
ン電極法、酵素法が知られている。しかしながら、電量
滴定法やイオン電極法は、クロライドメーターやイオン
選択電極を備えた装置等、特殊な装置、操作が複雑な装
置、高価な装置を使用しなければならない。また、Ｓｃ
ｈａｌｅｓ−Ｓｃｈａｌｅｓ法は測定試薬として水銀を
使用するため、廃液の処理等に格別の配慮が必要であ
る。
Ｓｃｈａｌｅｓ−Ｓｃｈａｌｅｓ法、電量滴定法、イオ
ン電極法、酵素法が知られている。しかしながら、電量
滴定法やイオン電極法は、クロライドメーターやイオン
選択電極を備えた装置等、特殊な装置、操作が複雑な装
置、高価な装置を使用しなければならない。また、Ｓｃ
ｈａｌｅｓ−Ｓｃｈａｌｅｓ法は測定試薬として水銀を
使用するため、廃液の処理等に格別の配慮が必要であ
る。
【０００８】また、酵素法、特に酵素としてアミラーゼ
を使用する方法があり、一例として、錯体形成試薬、非
活性型α−アミラーゼ、カルシウムイオン含有錯体及び
α−アミラーゼ活性測定用試薬からなる塩素イオン定量
用試薬（特開昭６３−１２６４９７）がある。ここで、
アミラーゼは、周知の通り、血液中にも存在し、病態、
個々および日・時などによって大きく変動する。そうな
ると、クロール濃度をアミラーゼ活性で定量しようとす
る場合には、この血中アミラーゼ活性の変動がクロール
測定に正負誤差を与えることになる。特に、アミラーゼ
は、膵臓疾患の患者血中に高濃度に存在するし、それ以
外にも、例えば唾液中にも多量に存在しており、ミスト
として空気中に浮遊し、これらが正の誤差を発生させ
る。
を使用する方法があり、一例として、錯体形成試薬、非
活性型α−アミラーゼ、カルシウムイオン含有錯体及び
α−アミラーゼ活性測定用試薬からなる塩素イオン定量
用試薬（特開昭６３−１２６４９７）がある。ここで、
アミラーゼは、周知の通り、血液中にも存在し、病態、
個々および日・時などによって大きく変動する。そうな
ると、クロール濃度をアミラーゼ活性で定量しようとす
る場合には、この血中アミラーゼ活性の変動がクロール
測定に正負誤差を与えることになる。特に、アミラーゼ
は、膵臓疾患の患者血中に高濃度に存在するし、それ以
外にも、例えば唾液中にも多量に存在しており、ミスト
として空気中に浮遊し、これらが正の誤差を発生させ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上記したようにクロー
ルの定量法において、酵素法は、前三者に比して、簡単
な装置で簡便にクロールの定量が可能であり、有害な水
銀を使用することもなく、非常にすぐれた方法である
が、正誤差の発生は避けられない。
ルの定量法において、酵素法は、前三者に比して、簡単
な装置で簡便にクロールの定量が可能であり、有害な水
銀を使用することもなく、非常にすぐれた方法である
が、正誤差の発生は避けられない。
【００１０】本発明は、このような技術の現状におい
て、クロールを正確且つ効率的に測定するシステムを開
発する目的でなされたものであり、更に詳細には、本発
明の目的は、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影響
を受けることなく正確に生体試料等各試料中のクロール
を効率的に測定する新規システムを開発することであ
る。
て、クロールを正確且つ効率的に測定するシステムを開
発する目的でなされたものであり、更に詳細には、本発
明の目的は、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影響
を受けることなく正確に生体試料等各試料中のクロール
を効率的に測定する新規システムを開発することであ
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するためになされたものであって、血清や尿中の
アミラーゼの影響を受けることのないクロールの測定方
法及びそのための試薬を開発するために各方面から検討
した結果、クロールに対する反応性は保持したまま、血
中や尿中のアミラーゼの影響は受けにくい新規システム
を見出し、本発明を完成した。
を達成するためになされたものであって、血清や尿中の
アミラーゼの影響を受けることのないクロールの測定方
法及びそのための試薬を開発するために各方面から検討
した結果、クロールに対する反応性は保持したまま、血
中や尿中のアミラーゼの影響は受けにくい新規システム
を見出し、本発明を完成した。
【００１２】すなわち、本発明者らは、２−クロロ−４
−ニトロフェニールマルトースを用いることにより、ア
ミラーゼに対する感受性を大幅に低下させること（つま
り、アミラーゼに対する反応性はわずかに１／３３にす
ぎないこと）をはじめて見出し、この新知見を基礎とし
て本発明を完成するに至った。
−ニトロフェニールマルトースを用いることにより、ア
ミラーゼに対する感受性を大幅に低下させること（つま
り、アミラーゼに対する反応性はわずかに１／３３にす
ぎないこと）をはじめて見出し、この新知見を基礎とし
て本発明を完成するに至った。
【００１３】本発明は、還元性末端に発色性基が導入さ
れたマルトース誘導体を用いることを特徴とするクロー
ルのエンザイムアッセイを基本的技術思想とするもので
あって、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影響を受
けることなくクロールを測定することができ、各種試
料、特にアミラーゼを持ち込んでくる試料、例えば尿や
血清試料中のクロールをも簡便且つ正確に測定できるシ
ステムを提供するものである。
れたマルトース誘導体を用いることを特徴とするクロー
ルのエンザイムアッセイを基本的技術思想とするもので
あって、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影響を受
けることなくクロールを測定することができ、各種試
料、特にアミラーゼを持ち込んでくる試料、例えば尿や
血清試料中のクロールをも簡便且つ正確に測定できるシ
ステムを提供するものである。
【００１４】本発明においては、還元性末端に発色性基
が導入されたマルトース誘導体を使用するが、発色性基
としては、マルトースと結合した状態では可視光領域で
の吸収は認められないが、一旦マルトースから遊離して
遊離の状態になると、可視光領域に吸収を示す発色団が
すべて包含される。このような発色団としては、具体的
には、置換されていてもよいフェニール基、例えば、２
−クロロ−４−ニトロフェニール基、パラニトロフェニ
ール基、６−ジクロロ−４−ニトロフェニール基等が例
示される。
が導入されたマルトース誘導体を使用するが、発色性基
としては、マルトースと結合した状態では可視光領域で
の吸収は認められないが、一旦マルトースから遊離して
遊離の状態になると、可視光領域に吸収を示す発色団が
すべて包含される。このような発色団としては、具体的
には、置換されていてもよいフェニール基、例えば、２
−クロロ−４−ニトロフェニール基、パラニトロフェニ
ール基、６−ジクロロ−４−ニトロフェニール基等が例
示される。
【００１５】このような発色性基が導入されたマルトー
ス誘導体としては、例えば２−クロロー４ーニトロフェ
ニールマルトース（以下、Ｇ２ＣＮＰということもあ
る）を挙げることができる。その構造式は下記化１で示
される。
ス誘導体としては、例えば２−クロロー４ーニトロフェ
ニールマルトース（以下、Ｇ２ＣＮＰということもあ
る）を挙げることができる。その構造式は下記化１で示
される。
【００１６】
【化１】
【００１７】本発明においては、アミラーゼ活性測定用
試薬として、Ｇ２ＣＮＰ等発色性基を有するマルトース
誘導体を使用することを大きな特徴のひとつとするもの
であるが、このようなマルトース誘導体を新たに使用す
ることにより、クロールイオンに対する反応性は充分保
持しつつ、アミラーゼに対する反応性は、２−クロロ−
４一ニトロフェニール−α−Ｄ−マルトトリオース（Ｇ
３ＣＮＰ）、同マルトテトラオース（Ｇ４ＣＮＰ）、同
マルトペンタオース（Ｇ５ＣＮＰ）、同マルトヘキサオ
ース（Ｇ６ＣＮＰ）、同マルトヘプタオース（Ｇ７ＣＮ
Ｐ）等オリゴマーに比して、大幅に低下し、例えばＧ４
ＣＮＰに比して１／３３にまで低下せしめることに成功
したものである。
試薬として、Ｇ２ＣＮＰ等発色性基を有するマルトース
誘導体を使用することを大きな特徴のひとつとするもの
であるが、このようなマルトース誘導体を新たに使用す
ることにより、クロールイオンに対する反応性は充分保
持しつつ、アミラーゼに対する反応性は、２−クロロ−
４一ニトロフェニール−α−Ｄ−マルトトリオース（Ｇ
３ＣＮＰ）、同マルトテトラオース（Ｇ４ＣＮＰ）、同
マルトペンタオース（Ｇ５ＣＮＰ）、同マルトヘキサオ
ース（Ｇ６ＣＮＰ）、同マルトヘプタオース（Ｇ７ＣＮ
Ｐ）等オリゴマーに比して、大幅に低下し、例えばＧ４
ＣＮＰに比して１／３３にまで低下せしめることに成功
したものである。
【００１８】したがって、本基質を使用することによっ
て、検体から持ち込まれるアミラーゼの影響を避けて、
正確なクロールの定量をすることがはじめて可能となっ
たのである。
て、検体から持ち込まれるアミラーゼの影響を避けて、
正確なクロールの定量をすることがはじめて可能となっ
たのである。
【００１９】本発明において使用するＧ２ＣＮＰ等のマ
ルトース誘導体は、通常臨床検査分野で用いられている
α−アミラーゼ活性測定に用いられている試薬とは異な
り、α一アミラーゼに対する反応性は必らずしもそう高
いものではないが、大量のアミラーゼを共存させると、
添加されたクロールイオンの量ないし検体中に存在する
クロールイオンの量に応じて、アミラーゼによって加水
分解され、Ａ405ｎｍの吸光皮が増大する。これを測定
することによって、クロールの定量ができるのである。
ルトース誘導体は、通常臨床検査分野で用いられている
α−アミラーゼ活性測定に用いられている試薬とは異な
り、α一アミラーゼに対する反応性は必らずしもそう高
いものではないが、大量のアミラーゼを共存させると、
添加されたクロールイオンの量ないし検体中に存在する
クロールイオンの量に応じて、アミラーゼによって加水
分解され、Ａ405ｎｍの吸光皮が増大する。これを測定
することによって、クロールの定量ができるのである。
【００２０】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものでは
ない。
【００２１】
【実施例１】試料液、Ｒ一１液、Ｒ−２液を、それぞ
れ、以下のように調製した。
れ、以下のように調製した。
【００２２】（試料液）：５ｍＭの酢酸カルシウムの共
存下、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍ
Ｍ、６ｍＭ、３ｍＭ、１．５ｍＭ、０ｍＭのＮａＣｌを
それぞれ含む試料液を用意した。
存下、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍ
Ｍ、６ｍＭ、３ｍＭ、１．５ｍＭ、０ｍＭのＮａＣｌを
それぞれ含む試料液を用意した。
【００２３】（Ｒ−１液）：市販のブタ脾臓アミラーゼ
の硫安溶液１ｍｌを遠心分離にかけ（１０，０００ｒｐ
ｍ×５分）、沈澱するブタ脾臓アミラーゼを集め、３ｍ
ｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ６．０）に溶解し、４℃に３０分間放置した。そ
の後、６０ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムにて、
０．１Ｍ ＭＥＳ穣衡液（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、０．１％ＮａＮ3を含む、ｐ
Ｈ６．０）に交換して、クロールとカルシウムフリーの
ブタ脾臓アミラーゼ液を調製した。本溶液をＲ−１液と
した。 （Ｒ−２液）：５ｍＭの２−クロロ−４一ニトロフェニ
一ルマルトース溶液。
の硫安溶液１ｍｌを遠心分離にかけ（１０，０００ｒｐ
ｍ×５分）、沈澱するブタ脾臓アミラーゼを集め、３ｍ
ｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ６．０）に溶解し、４℃に３０分間放置した。そ
の後、６０ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムにて、
０．１Ｍ ＭＥＳ穣衡液（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、０．１％ＮａＮ3を含む、ｐ
Ｈ６．０）に交換して、クロールとカルシウムフリーの
ブタ脾臓アミラーゼ液を調製した。本溶液をＲ−１液と
した。 （Ｒ−２液）：５ｍＭの２−クロロ−４一ニトロフェニ
一ルマルトース溶液。
【００２４】試料液１０μｌにＲ−１液を３００μｌ加
え、３７℃で５分間インキュベ一トし、しかる後、１０
０μｌのＲ−２液を加え、よく混合した後３７℃に加温
し、Ｒ−２液添加後１分目から３分目までの４０５ｎｍ
での吸光度変化量を測定し、１分間当りの吸光度変化量
を算出した。測定は、日立社製７１５０自動分析機を用
いて行った。
え、３７℃で５分間インキュベ一トし、しかる後、１０
０μｌのＲ−２液を加え、よく混合した後３７℃に加温
し、Ｒ−２液添加後１分目から３分目までの４０５ｎｍ
での吸光度変化量を測定し、１分間当りの吸光度変化量
を算出した。測定は、日立社製７１５０自動分析機を用
いて行った。
【００２５】０ｍＭ ＮａＣｌを含む試料液を用いたと
きの吸光度変化量を他の試料液を用いたときの吸光度変
化量を差し引き、測定値を得た。結果を図１に示す。
きの吸光度変化量を他の試料液を用いたときの吸光度変
化量を差し引き、測定値を得た。結果を図１に示す。
【００２６】その結果から明らかなように、本発明の方
法によれば、直線的な定量曲線にて試料中のクロールを
定量できることが確認された。
法によれば、直線的な定量曲線にて試料中のクロールを
定量できることが確認された。
【００２７】
【実施例２】実際にヒト血清中のクロールの定量を、上
記実施例１にて調整したＲ−１、Ｒ−２を用いて行っ
た。結果を図１に示す。
記実施例１にて調整したＲ−１、Ｒ−２を用いて行っ
た。結果を図１に示す。
【００２８】
【発明の効果】本発明の方法によれば、試料に由来する
アミラーゼの影響を受けることなく簡便で迅速なクロー
ルの正確な定量が可館となった。したがって、本発明に
よれば、運常の試料はもちろんのこと、血清や尿素各種
の生体試料中のクロールを熟練を要することなく迅速且
つ正確に測定することが可能となり、本発明は例えば臨
床診断に多大の貢献をなすものである。
アミラーゼの影響を受けることなく簡便で迅速なクロー
ルの正確な定量が可館となった。したがって、本発明に
よれば、運常の試料はもちろんのこと、血清や尿素各種
の生体試料中のクロールを熟練を要することなく迅速且
つ正確に測定することが可能となり、本発明は例えば臨
床診断に多大の貢献をなすものである。
【００２９】また本発明は、Ｇ２ＣＮＰ等のマルトース
誘導体、及び必要あればアミラーゼ、緩衝液、標準曲線
作製用のクロール化合物（溶液）を含有してなる、クロ
ール測定試薬ないし測定キットも提供するものである。
誘導体、及び必要あればアミラーゼ、緩衝液、標準曲線
作製用のクロール化合物（溶液）を含有してなる、クロ
ール測定試薬ないし測定キットも提供するものである。
【図１】本発明方法によるＧ２ＣＮＰを用いるクロール
の定量曲線を示す。
の定量曲線を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】還元性末端に発色性基が導入されたマルト
ース誘導体を用いてなることを特徴とするクロールの測
定試薬。 - 【請求項２】発色性基が置換基を有していてもよいフェ
ニール基であることを特徴とする請求項１に記載の測定
試薬。 - 【請求項３】発色性基が２−クロロ一４−ニトロフェニ
一ル基又はパラニトロフェニ一ル基又は６−ジクロロ−
４−ニトロフェニール基であることを特徴とする請求項
２に記載の測定試薬。 - 【請求項４】請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載
の試薬を使用することを特徴とするクロールの測定方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33123295A JPH09149795A (ja) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | クロールの測定方法および測定試薬 |
| US08/757,845 US5948632A (en) | 1995-11-28 | 1996-11-27 | Method and reagent for measuring chlorine and calcium ions using a maltose derivative |
| EP96119080A EP0776979B1 (en) | 1995-11-28 | 1996-11-28 | Method and reagent for measuring an ion by using maltose derivatives |
| DE69615991T DE69615991T2 (de) | 1995-11-28 | 1996-11-28 | Verfahren und Reagenz zum Nachweis von Ionen unter Verwendung von Maltose Derivaten |
| AT96119080T ATE207128T1 (de) | 1995-11-28 | 1996-11-28 | Verfahren und reagenz zum nachweis von ionen unter verwendung von maltose derivaten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33123295A JPH09149795A (ja) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | クロールの測定方法および測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09149795A true JPH09149795A (ja) | 1997-06-10 |
Family
ID=18241384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33123295A Pending JPH09149795A (ja) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | クロールの測定方法および測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09149795A (ja) |
-
1995
- 1995-11-28 JP JP33123295A patent/JPH09149795A/ja active Pending
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