JPH0912474A - ホエータンパク質濃縮物由来の免疫賦活物質 - Google Patents
ホエータンパク質濃縮物由来の免疫賦活物質Info
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- JPH0912474A JPH0912474A JP7163771A JP16377195A JPH0912474A JP H0912474 A JPH0912474 A JP H0912474A JP 7163771 A JP7163771 A JP 7163771A JP 16377195 A JP16377195 A JP 16377195A JP H0912474 A JPH0912474 A JP H0912474A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマトグ
ラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分を
得、該画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマ
トグラフィーにかけることによって得られ、以下の理化
学的性質を有する免疫賦活物質。 (1) 分子量25,000以下。 (2) マイトジェン活性を有する。 (3) レクチンに対して反応性を有する。 (4) リンを含有する。 【効果】 本発明により、ホエータンパク質濃縮物から
免疫賦活物質が提供される。
ラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分を
得、該画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロマ
トグラフィーにかけることによって得られ、以下の理化
学的性質を有する免疫賦活物質。 (1) 分子量25,000以下。 (2) マイトジェン活性を有する。 (3) レクチンに対して反応性を有する。 (4) リンを含有する。 【効果】 本発明により、ホエータンパク質濃縮物から
免疫賦活物質が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ホエータンパク質濃縮
物に含まれる免疫賦活物質に関する。本発明の免疫賦活
物質は、これまでに知られているラクトフェリン、免疫
グロブリン、リゾチーム等と同様、乳由来の生理活性物
質であり、調製粉乳をはじめ各種栄養食品および医薬品
に使用できる。
物に含まれる免疫賦活物質に関する。本発明の免疫賦活
物質は、これまでに知られているラクトフェリン、免疫
グロブリン、リゾチーム等と同様、乳由来の生理活性物
質であり、調製粉乳をはじめ各種栄養食品および医薬品
に使用できる。
【０００２】
【従来の技術】ホエータンパク質濃縮物中には、ラクト
フェリンや免疫グロブリンなどのいわゆる生理活性物質
を豊富に含むことが知られている。かかる生理活性物質
の免疫細胞に対する活性に関し、ラクトフェリンは前単
球に結合し、細胞の増殖を高めることが報告されている
（R. Oria et al., J. Dairy Res., 60, 363, 1993）。
また、免疫グロブリンについては、牛乳より単離された
IgG1が脾臓リンパ細胞に対してマイトジェン活性を有す
ることが明らかにされている（T. Saito et al.,Anim.
Sci. Technol. (Jpn.), 65, 105, 1994）。しかし、ホ
エータンパク質濃縮物中には、前記生理活性物質以外の
まだ未同定の微量成分の存在が示唆されており、その免
疫賦活活性については何の情報も得られていないのが現
状である。
フェリンや免疫グロブリンなどのいわゆる生理活性物質
を豊富に含むことが知られている。かかる生理活性物質
の免疫細胞に対する活性に関し、ラクトフェリンは前単
球に結合し、細胞の増殖を高めることが報告されている
（R. Oria et al., J. Dairy Res., 60, 363, 1993）。
また、免疫グロブリンについては、牛乳より単離された
IgG1が脾臓リンパ細胞に対してマイトジェン活性を有す
ることが明らかにされている（T. Saito et al.,Anim.
Sci. Technol. (Jpn.), 65, 105, 1994）。しかし、ホ
エータンパク質濃縮物中には、前記生理活性物質以外の
まだ未同定の微量成分の存在が示唆されており、その免
疫賦活活性については何の情報も得られていないのが現
状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホエータン
パク質濃縮物中に含まれる免疫賦活作用を有する生理活
性物質を提供することを目的とする。
パク質濃縮物中に含まれる免疫賦活作用を有する生理活
性物質を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記の現状
を踏まえ、上記課題に基づいて乳由来のホエータンパク
質濃縮物中の微量成分の中からさらに有用成分を分離精
製することを課題として取り上げ、鋭意研究に取り組ん
だ。その結果、ホエータンパク質濃縮物を多段式カラム
処理し、得られるグリコマクロペプチドに富む画分をさ
らにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーに
かけることにより、分子量が25,000以下の強いマイトジ
ェン活性を有する物質を分離することに成功し、本発明
を完成するに至った。
を踏まえ、上記課題に基づいて乳由来のホエータンパク
質濃縮物中の微量成分の中からさらに有用成分を分離精
製することを課題として取り上げ、鋭意研究に取り組ん
だ。その結果、ホエータンパク質濃縮物を多段式カラム
処理し、得られるグリコマクロペプチドに富む画分をさ
らにゲルろ過、次いでイオン交換クロマトグラフィーに
かけることにより、分子量が25,000以下の強いマイトジ
ェン活性を有する物質を分離することに成功し、本発明
を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ホエータンパク質濃
縮物をカラムクロマトグラフィーにかけてグリコマクロ
ペプチドに富む画分を得、該画分をさらにゲルろ過、次
いでイオン交換クロマトグラフィーにかけることによっ
て得られ、以下の理化学的性質を有する免疫賦活物質で
ある。 (1) 分子量25,000以下。
縮物をカラムクロマトグラフィーにかけてグリコマクロ
ペプチドに富む画分を得、該画分をさらにゲルろ過、次
いでイオン交換クロマトグラフィーにかけることによっ
て得られ、以下の理化学的性質を有する免疫賦活物質で
ある。 (1) 分子量25,000以下。
【０００６】(2) マイトジェン活性を有する。 (3) レクチンに対して反応性を有する。 (4) リンを含有する。 上記イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば１
ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものが挙げられ、カ
ラムクロマトグラフィーとしては、例えば多段式カラム
クロマトグラフィーが挙げられ、ホエータンパク質とし
ては、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズホエ
ータンパク質が挙げられる。ここで、「レクチンに対し
て反応性を有する」とは、本発明の免疫賦活物質がレク
チンと結合して凝集反応を起こすことをいい、レクチン
としては、例えばヒママメレクチン、小麦胚芽レクチ
ン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレクチン、ピ
ーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選ばれる少
なくとも一つのものが挙げられる。また、免疫賦活物質
のリンの含有量は、免疫賦活物質１ｍｇ当たり0.1 〜10
0 μgである。
ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものが挙げられ、カ
ラムクロマトグラフィーとしては、例えば多段式カラム
クロマトグラフィーが挙げられ、ホエータンパク質とし
ては、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズホエ
ータンパク質が挙げられる。ここで、「レクチンに対し
て反応性を有する」とは、本発明の免疫賦活物質がレク
チンと結合して凝集反応を起こすことをいい、レクチン
としては、例えばヒママメレクチン、小麦胚芽レクチ
ン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレクチン、ピ
ーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選ばれる少
なくとも一つのものが挙げられる。また、免疫賦活物質
のリンの含有量は、免疫賦活物質１ｍｇ当たり0.1 〜10
0 μgである。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
は、ホエータンパク質濃縮物を原料とする。ここで、ホ
エータンパク質濃縮物（以下「ＷＰＣ」という）とは、
乳を酸処理又はキモシン処理することにより得られるホ
エー画分、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズ
ホエータンパク質等をいい、ラクトフェリン、免疫グロ
ブリン又はEGFなどの各種成長因子が含まれるものであ
る。
は、ホエータンパク質濃縮物を原料とする。ここで、ホ
エータンパク質濃縮物（以下「ＷＰＣ」という）とは、
乳を酸処理又はキモシン処理することにより得られるホ
エー画分、例えばカゼインホエータンパク質又はチーズ
ホエータンパク質等をいい、ラクトフェリン、免疫グロ
ブリン又はEGFなどの各種成長因子が含まれるものであ
る。
【０００８】乳は通常牛乳を用いるが、その他の獣乳
（たとえば、ヤギ乳、羊乳など）および人乳を用いるこ
とができ、また、これらの乳は初乳および常乳のいずれ
でもよい。さらに、実用的には市販のＷＰＣを直接用い
ることもできる。そして、上記ＷＰＣを公知の方法、例
えば多段式カラムを用いたクロマトグラフィーにかける
ことによりβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミ
ンなどを大部分除去したグリコマクロペプチドに富む画
分を得る（食品産業ハイセパレーション・システム技術
研究組合・平成４年10月27日発行「機能性食品素材の高
度分離・精製と開発」P196参照）。この場合、カラム１
段当たり例えばDEAE-Sephadex A25若しくは DEAE-Sepha
cel（ファルマシア社製）、Chitopearl EP-03若しくは
Chitopearl EP-05 （富士紡績社製）又はDEAE-Toyopear
l 650s （東ソー社製）等を充填した複数段（例えば５
段式）カラムに試料を通液することにより行うことがで
きる。
（たとえば、ヤギ乳、羊乳など）および人乳を用いるこ
とができ、また、これらの乳は初乳および常乳のいずれ
でもよい。さらに、実用的には市販のＷＰＣを直接用い
ることもできる。そして、上記ＷＰＣを公知の方法、例
えば多段式カラムを用いたクロマトグラフィーにかける
ことによりβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミ
ンなどを大部分除去したグリコマクロペプチドに富む画
分を得る（食品産業ハイセパレーション・システム技術
研究組合・平成４年10月27日発行「機能性食品素材の高
度分離・精製と開発」P196参照）。この場合、カラム１
段当たり例えばDEAE-Sephadex A25若しくは DEAE-Sepha
cel（ファルマシア社製）、Chitopearl EP-03若しくは
Chitopearl EP-05 （富士紡績社製）又はDEAE-Toyopear
l 650s （東ソー社製）等を充填した複数段（例えば５
段式）カラムに試料を通液することにより行うことがで
きる。
【０００９】このようにして、ホエー画分中の主要蛋白
質であるβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミン
の予備的な分画が可能である。次に、ゲルろ過モードの
カラム、例えば、Sephadex G-200若しくはSephacrylS-2
00（ファルマシア社製）、Bio-Gel P-200(バイオラッド
社製）、Toyopearl HW-55(東ソー社製）又はCellulofin
e GC-700（生化学工業社製）等により、分子量３万以上
の物質の除去を行う。この方法は、ラクトフェリン又は
免疫グロブリン等の分子量が数万以上の既知生理活性物
質を除くために必要、かつ重要である。
質であるβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミン
の予備的な分画が可能である。次に、ゲルろ過モードの
カラム、例えば、Sephadex G-200若しくはSephacrylS-2
00（ファルマシア社製）、Bio-Gel P-200(バイオラッド
社製）、Toyopearl HW-55(東ソー社製）又はCellulofin
e GC-700（生化学工業社製）等により、分子量３万以上
の物質の除去を行う。この方法は、ラクトフェリン又は
免疫グロブリン等の分子量が数万以上の既知生理活性物
質を除くために必要、かつ重要である。
【００１０】そして最後に、イオン交換モードのカラ
ム、例えば、DEAE-Sephacel、DEAE-Sephadex 、DEAE-Se
pharose若しくはMono Q（ファルマシア社製）、DEAE-Ce
llulofine（生化学工業社製）、DEAE-Bio-GelA(バイオ
ラッド社製) 又はDEAE-Toyopearl（東ソー社製) 等を用
いて目的物質の精製を行う。この場合、上記カラムに通
常使用されるいずれの溶出溶液をも用いることができる
が、１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するのが好まし
い。この過程により、得られる画分の単位重量当たりの
マイトジェン活性は数十倍以上に高まり、最終目的物の
回収が可能となる。
ム、例えば、DEAE-Sephacel、DEAE-Sephadex 、DEAE-Se
pharose若しくはMono Q（ファルマシア社製）、DEAE-Ce
llulofine（生化学工業社製）、DEAE-Bio-GelA(バイオ
ラッド社製) 又はDEAE-Toyopearl（東ソー社製) 等を用
いて目的物質の精製を行う。この場合、上記カラムに通
常使用されるいずれの溶出溶液をも用いることができる
が、１ＭのＮａＣｌ溶液を用いて溶出するのが好まし
い。この過程により、得られる画分の単位重量当たりの
マイトジェン活性は数十倍以上に高まり、最終目的物の
回収が可能となる。
【００１１】最終的に得られた目的物質の分子量につい
ては、例えばAsahipak GS-320 HQ上で低分子量の検量線
キットを用いることにより測定することができる。ま
た、最終的に得られた目的物質の生理活性（マイトジェ
ン活性）については、マウス等から採取した脾細胞の分
裂の有無を、 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込みを指
標として測定すればよい。かかる生理活性の指標には刺
激係数を用いる。刺激係数とは、各種試料存在下での 3
Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量を試料無添加時の
3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量で割った値（St
imulation Index；以下「ＳＩ」という）をいう。
ては、例えばAsahipak GS-320 HQ上で低分子量の検量線
キットを用いることにより測定することができる。ま
た、最終的に得られた目的物質の生理活性（マイトジェ
ン活性）については、マウス等から採取した脾細胞の分
裂の有無を、 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込みを指
標として測定すればよい。かかる生理活性の指標には刺
激係数を用いる。刺激係数とは、各種試料存在下での 3
Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量を試料無添加時の
3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込み量で割った値（St
imulation Index；以下「ＳＩ」という）をいう。
【００１２】さらに、上記目的物質のレクチンとの反応
性については、公知方法、例えば標識レクチンキット
（例えばペルオキシダーゼレクチンキットＢ；ホーネン
コーポレーション社）を用いて測定することができる。
また、上記目的物質のリン含量については、例えば発光
分光分析装置等を用いて測定することができ、タンパク
質１mg当たり0.1〜100μg 含有する。
性については、公知方法、例えば標識レクチンキット
（例えばペルオキシダーゼレクチンキットＢ；ホーネン
コーポレーション社）を用いて測定することができる。
また、上記目的物質のリン含量については、例えば発光
分光分析装置等を用いて測定することができ、タンパク
質１mg当たり0.1〜100μg 含有する。
【００１３】本発明の免疫賦活物質は、ＷＰＣ原料1,00
0 ｇ当たり１〜100 mg（収率10-4〜10-2％）得られる。
0 ｇ当たり１〜100 mg（収率10-4〜10-2％）得られる。
【００１４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕原料物質を市販のＷＰＣであるチーズホエ
ー（商品名：Calpro 75, Calpro Ingredients, USA 社
製）とした。このＷＰＣを脱イオン水に溶解し、５％
（W/V)濃度の溶液を調製した。この溶液のpHを4.4に調
整し、60℃で60分間加熱後、3000×Ｇで15分間遠心分離
して得られた上清を回収した。
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕原料物質を市販のＷＰＣであるチーズホエ
ー（商品名：Calpro 75, Calpro Ingredients, USA 社
製）とした。このＷＰＣを脱イオン水に溶解し、５％
（W/V)濃度の溶液を調製した。この溶液のpHを4.4に調
整し、60℃で60分間加熱後、3000×Ｇで15分間遠心分離
して得られた上清を回収した。
【００１５】次に、この上清を内径50mm，高さ200mmの
アクリル製カラム１段当たり150mlのDEAE-Sephadex A25
(ファルマシア社製）を充填した５段式カラムに下向流
のみで通液した。初期流速：SVを３h-1、カラム頂部圧
力上限を約0.5kgf/cm2とし、それを越えた場合は流速調
節を行った。通液終了後、ベッド容量（bed volume) の
２倍量の脱イオン水でカラム内を水洗し、0.1N NaOH水
溶液を延べベッド容量の６倍量循環させてグリコマクロ
ペプチド（以下「ＧＭＰ」という）に富む画分を溶離さ
せた。さらに、カラム内に残存した溶離液をベッド容量
の２倍量の水で押し出し、得られた溶離液を限外ろ過法
で濃縮および電気透析法で脱塩後、凍結乾燥した。ここ
で得られたものをＧＭＰに富む画分と呼び、以下の実験
に用いた。
アクリル製カラム１段当たり150mlのDEAE-Sephadex A25
(ファルマシア社製）を充填した５段式カラムに下向流
のみで通液した。初期流速：SVを３h-1、カラム頂部圧
力上限を約0.5kgf/cm2とし、それを越えた場合は流速調
節を行った。通液終了後、ベッド容量（bed volume) の
２倍量の脱イオン水でカラム内を水洗し、0.1N NaOH水
溶液を延べベッド容量の６倍量循環させてグリコマクロ
ペプチド（以下「ＧＭＰ」という）に富む画分を溶離さ
せた。さらに、カラム内に残存した溶離液をベッド容量
の２倍量の水で押し出し、得られた溶離液を限外ろ過法
で濃縮および電気透析法で脱塩後、凍結乾燥した。ここ
で得られたものをＧＭＰに富む画分と呼び、以下の実験
に用いた。
【００１６】すなわち、まずＧＭＰに富む画分（４ｇ）
をゲルろ過法で分離させた。分離にはSephacryl S-200
(ファルマシア社製）を充填したカラム（XK50/100）を
用いた。緩衝液としてPBS(pH7.2)を使用し、流速は16ml
/hとし、８mlずつ流出液を分取した。結果を図１に示
す。この時のクロマトグラフィーのパターンから、低分
子量の画分１〜４を回収した。
をゲルろ過法で分離させた。分離にはSephacryl S-200
(ファルマシア社製）を充填したカラム（XK50/100）を
用いた。緩衝液としてPBS(pH7.2)を使用し、流速は16ml
/hとし、８mlずつ流出液を分取した。結果を図１に示
す。この時のクロマトグラフィーのパターンから、低分
子量の画分１〜４を回収した。
【００１７】次に、画分１〜４のうち、図１に示した画
分２及び４（下線を付して表示）それぞれを、さらに陰
イオン交換法で分離した。分離にはベッド容量６mlのQ
Sepharose樹脂（ファルマシア社製）を充填したカラム
（直径２cm，長さ30cm）を用い、得られた試料（図１に
記載の画分２及び４）を吸着させた後、５種類の緩衝
液、すなわち 0.01Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)（以下
「buffer T」という）、0.12M NaClを含んだbuffer T、
0.25M NaClを含んだbuffer T、1M NaClを含んだbuffer
T及び6Mグアニジン−塩酸を流した。流した量はそれぞ
れ20、30、30、30および20mlであり、流速は0.5ml/min
とし、３mlずつ流出液を分取した。
分２及び４（下線を付して表示）それぞれを、さらに陰
イオン交換法で分離した。分離にはベッド容量６mlのQ
Sepharose樹脂（ファルマシア社製）を充填したカラム
（直径２cm，長さ30cm）を用い、得られた試料（図１に
記載の画分２及び４）を吸着させた後、５種類の緩衝
液、すなわち 0.01Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)（以下
「buffer T」という）、0.12M NaClを含んだbuffer T、
0.25M NaClを含んだbuffer T、1M NaClを含んだbuffer
T及び6Mグアニジン−塩酸を流した。流した量はそれぞ
れ20、30、30、30および20mlであり、流速は0.5ml/min
とし、３mlずつ流出液を分取した。
【００１８】この時のクロマトグラフィーのパターンを
図２に示す。図２において、（ａ）で示すパターンは図
１に示す画分２のものであり、（ｂ）で示すパターンは
図１に示す画分４のものである。最終的に求める物質は
画分２および４を１M NaClで溶出した場合に得られるピ
ーク成分（以下、それぞれ「Ｐ２」、「Ｐ４」という）
であった。そして、Ｐ２及びＰ４から得られた本発明の
免疫賦活物質は、それぞれ８mg及び2.8 mgであった。
図２に示す。図２において、（ａ）で示すパターンは図
１に示す画分２のものであり、（ｂ）で示すパターンは
図１に示す画分４のものである。最終的に求める物質は
画分２および４を１M NaClで溶出した場合に得られるピ
ーク成分（以下、それぞれ「Ｐ２」、「Ｐ４」という）
であった。そして、Ｐ２及びＰ４から得られた本発明の
免疫賦活物質は、それぞれ８mg及び2.8 mgであった。
【００１９】〔実施例２〕実施例１で得られた物質Ｐ２
及びＰ４の分子量をAsahipak GS-320HQ上で低分子量の
ゲルろ過検量線キットを用いて推定した。対照分子量マ
ーカーとして、オボアルブミン（分子量45,000）、キモ
トリプシノーゲンＡ（分子量25,635）及びリボヌクレア
ーゼＡ（分子量13,680）を用いた。
及びＰ４の分子量をAsahipak GS-320HQ上で低分子量の
ゲルろ過検量線キットを用いて推定した。対照分子量マ
ーカーとして、オボアルブミン（分子量45,000）、キモ
トリプシノーゲンＡ（分子量25,635）及びリボヌクレア
ーゼＡ（分子量13,680）を用いた。
【００２０】その結果を図３に示す。Ｐ２は約19,500、
Ｐ４は約16,000の分子量を持つことが示された。 〔実施例３〕実施例１で得られた図１に示す画分である
画分２（Ｆ２）および４（Ｆ４）、並びに図２に示す画
分であるＰ２およびＰ４のマイトジェン活性を測定し
た。
Ｐ４は約16,000の分子量を持つことが示された。 〔実施例３〕実施例１で得られた図１に示す画分である
画分２（Ｆ２）および４（Ｆ４）、並びに図２に示す画
分であるＰ２およびＰ４のマイトジェン活性を測定し
た。
【００２１】マイトジェン活性は８週令のBALB/Cマウス
（日本チャールズリバー社）より回収した脾臓リンパ細
胞を96穴の細胞培養プレート（Falcon社製）に１穴あた
り２×105 個まき、実施例１で得られた各種試料の存在
下で３〜５日間培養した。培地には100U/mlのペニシリ
ン（Gibco社）、100μg/mlストレプトマイシン（Gibco
社）、５×10-5 Mの２−メルカプトエタノール、５％ウ
シ胎児血清を含むRPMI 1640(Gibco社) を用いた。
（日本チャールズリバー社）より回収した脾臓リンパ細
胞を96穴の細胞培養プレート（Falcon社製）に１穴あた
り２×105 個まき、実施例１で得られた各種試料の存在
下で３〜５日間培養した。培地には100U/mlのペニシリ
ン（Gibco社）、100μg/mlストレプトマイシン（Gibco
社）、５×10-5 Mの２−メルカプトエタノール、５％ウ
シ胎児血清を含むRPMI 1640(Gibco社) を用いた。
【００２２】培養の最終20時間における 3Ｈ−ラベルし
たチミジンの取り込み量を測定した。ＳＩについては、
各種試料存在下での 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込
み量を試料無添加時の 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り
込み量で割った値で示した。Ｆ２およびＦ４は図１の分
画で得られたものを１mlの培地に溶かして１穴あたり10
0μl 用い、Ｐ２及びＰ４は図２の分画で得られたもの
を１mlの培地に溶かして１穴あたり100μl 用いた。Ｇ
ＭＰについては実施例１で分画する前の試料１mgを培地
１mlに溶かして１穴あたり100μl 用いた。その他の試
料は、市販品（Sigma社）を、１穴あたりConAおよびLPS
についてはそれぞれ２μg、α−ラクトアルブミン（alp
ha-La）およびβ−ラクトグロブリン（beta-Lg）につい
てはそれぞれ50μg加えて培養した。
たチミジンの取り込み量を測定した。ＳＩについては、
各種試料存在下での 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り込
み量を試料無添加時の 3Ｈ−ラベルしたチミジンの取り
込み量で割った値で示した。Ｆ２およびＦ４は図１の分
画で得られたものを１mlの培地に溶かして１穴あたり10
0μl 用い、Ｐ２及びＰ４は図２の分画で得られたもの
を１mlの培地に溶かして１穴あたり100μl 用いた。Ｇ
ＭＰについては実施例１で分画する前の試料１mgを培地
１mlに溶かして１穴あたり100μl 用いた。その他の試
料は、市販品（Sigma社）を、１穴あたりConAおよびLPS
についてはそれぞれ２μg、α−ラクトアルブミン（alp
ha-La）およびβ−ラクトグロブリン（beta-Lg）につい
てはそれぞれ50μg加えて培養した。
【００２３】結果を図４および図５に示す。Ｆ２および
Ｆ４はもとのＧＭＰより活性が上昇することが図４より
認められた。さらに、その活性はイオン交換法による精
製で極めて顕著になり、Ｆ２及びＦ４それぞれからの画
分であるＰ２及びＰ４は、既知のマイトジェン（ConAお
よびLPS）活性のレベルと同等になった（図５）。
Ｆ４はもとのＧＭＰより活性が上昇することが図４より
認められた。さらに、その活性はイオン交換法による精
製で極めて顕著になり、Ｆ２及びＦ４それぞれからの画
分であるＰ２及びＰ４は、既知のマイトジェン（ConAお
よびLPS）活性のレベルと同等になった（図５）。
【００２４】〔実施例４〕Ｐ２およびＰ４の腸管隣接リ
ンパ組織に対するマイトジェン活性を既知のマイトジェ
ンConAおよびLPSと比較した。ConAは２μg/ml、LPSは20
μg/mlで用いた。腸管隣接リンパ組織としては、８週令
のBALB/Cマウス（日本チャールズリバー社）より回収し
たパイエル板リンパ細胞を用いた。３日間、腸管隣接リ
ンパ組織を各試料とともに培養し、ＳＩ値を測定した。
その他の実験条件は実施例３と同様とした。
ンパ組織に対するマイトジェン活性を既知のマイトジェ
ンConAおよびLPSと比較した。ConAは２μg/ml、LPSは20
μg/mlで用いた。腸管隣接リンパ組織としては、８週令
のBALB/Cマウス（日本チャールズリバー社）より回収し
たパイエル板リンパ細胞を用いた。３日間、腸管隣接リ
ンパ組織を各試料とともに培養し、ＳＩ値を測定した。
その他の実験条件は実施例３と同様とした。
【００２５】その結果、Ｐ２及びＰ４のいずれもConA及
びLPS とほぼ同様のＳＩ値を示した（表１参照）。
びLPS とほぼ同様のＳＩ値を示した（表１参照）。
【００２６】
【表１】 表１ 腸管隣接リンパ組織に対するマイトジェン活性 ──────────────────────── 試 料 SI値 ──────────────────────── −（なし） 1.0±0.3 P2 5.1±0.4 P4 9.5±1.0 ConA 5.0±0.5 LPS 15.0±1.5 ──────────────────────── 表１より、本発明で得られた物質は既知のマイトジェン
物質と同様に腸管免疫系を活性化する効果を有すること
が明らかとなった。
物質と同様に腸管免疫系を活性化する効果を有すること
が明らかとなった。
【００２７】〔実施例５〕実施例１で得られた物質Ｐ２
及びＰ４を１mg/ml になるようにリン酸緩衝液（0.15M,
pH7.2) に溶解した。これらの溶液をPVDF膜にドットブ
ロッティングした後、標識レクチンキット（ペルオキシ
ダーゼ−レクチンキットＢ，ホーネンコーポレーション
社）を用いて反応性を測定した。
及びＰ４を１mg/ml になるようにリン酸緩衝液（0.15M,
pH7.2) に溶解した。これらの溶液をPVDF膜にドットブ
ロッティングした後、標識レクチンキット（ペルオキシ
ダーゼ−レクチンキットＢ，ホーネンコーポレーション
社）を用いて反応性を測定した。
【００２８】結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】 表２ Ｐ２及びＰ４に対するレクチン反応性 ───────────────────────────────── レクチン類* ───────────────────────────── RCA 120 WGA ConA PHA-E4 UEA-I PNA DBA LCA ───────────────────────────────── Ｐ２ ＋ ＋ − − − − − ＋ Ｐ４ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ − ＋ − ＋ ───────────────────────────────── * RCA 120: ヒママメレクチン, PNA: ヒ゜ーナッツレクチン, ConA: タチナタマメレクチン， LCA: レンチルレクチン, PHA-E4: インケ゛ンマメレクチン, WGA:小麦胚芽レクチン, DBA: ト゛リコスマメレクチン(Dolichos biflorus), UEA-I: ハリエニシタ゛レクチン(Ulex europaeus) Ｐ２及びＰ４は、ヒママメレクチン(RCA120: Ricinus c
ommunis agglutinin)、小麦胚芽レクチン(WGA: wheat g
erm agglutinin)、タチナタマメレクチン(ConA: concan
avalin A)、インゲンマメレクチン(PHA-E4: Phaseolus
vulgaris)、ピーナッツレクチン(PNA: penut agglutini
n)及びレンチルレクチン(LCA: Lens culinaris aggluti
nin)から選ばれる少なくとも一つに対して反応性を有す
ることが示された。
ommunis agglutinin)、小麦胚芽レクチン(WGA: wheat g
erm agglutinin)、タチナタマメレクチン(ConA: concan
avalin A)、インゲンマメレクチン(PHA-E4: Phaseolus
vulgaris)、ピーナッツレクチン(PNA: penut agglutini
n)及びレンチルレクチン(LCA: Lens culinaris aggluti
nin)から選ばれる少なくとも一つに対して反応性を有す
ることが示された。
【００３０】〔実施例６〕実施例１で得られた物質Ｐ４
をタンパク質濃度が0.16mg/ml になるように蒸留水に溶
解した。タンパク質濃度はPierce社のタンパク質アッセ
イ試薬にて測定した。この溶液0.1mlを0.1N HNO3 ５ml
に加え、分析試料とした。これをSeiko SPS-1200VR ICP
発光分光分析装置を用い、リン含量を測定した。
をタンパク質濃度が0.16mg/ml になるように蒸留水に溶
解した。タンパク質濃度はPierce社のタンパク質アッセ
イ試薬にて測定した。この溶液0.1mlを0.1N HNO3 ５ml
に加え、分析試料とした。これをSeiko SPS-1200VR ICP
発光分光分析装置を用い、リン含量を測定した。
【００３１】結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】 表３ 試料のリン含量（単位：μg/ml) ─────────────────── 0.1244 測定値 0.1023 0.08164 ─────────────────── 平均値 0.10 ─────────────────── 平均値（0.10μg/ml) に希釈率(50)を乗ずると原液のリ
ン含量は5.0μg/mlとなり、これよりＰ４はタンパク質
１mg当たりリンを約31μg 含むことが明らかにされた。
ン含量は5.0μg/mlとなり、これよりＰ４はタンパク質
１mg当たりリンを約31μg 含むことが明らかにされた。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、ホエータンパク質濃縮物
からの免疫賦活物質が提供された。本発明によれば、こ
れまで微量成分であるためその生理機能が全く不明であ
った乳由来のホエー画分中の新規物質について、食品お
よび医薬品への有効利用を図ることができる。そして、
乳が潜在的に有する免疫賦活などの生体調節機能をより
具体的な形で商品開発に使用できる。
からの免疫賦活物質が提供された。本発明によれば、こ
れまで微量成分であるためその生理機能が全く不明であ
った乳由来のホエー画分中の新規物質について、食品お
よび医薬品への有効利用を図ることができる。そして、
乳が潜在的に有する免疫賦活などの生体調節機能をより
具体的な形で商品開発に使用できる。
【図１】ゲルろ過の結果を示す図である。
【図２】イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図
である。
である。
【図３】分子量の測定結果を示す図である。
【図４】脾臓リンパ細胞に対するマイトジェン活性を示
す図である。
す図である。
【図５】脾臓リンパ細胞に対するマイトジェン活性を示
す図である。
す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 ホエータンパク質濃縮物をカラムクロマ
トグラフィーにかけてグリコマクロペプチドに富む画分
を得、該画分をさらにゲルろ過、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーにかけることによって得られ、以下の理
化学的性質を有する免疫賦活物質。 (1) 分子量25,000以下。 (2) マイトジェン活性を有する。 (3) レクチンに対して反応性を有する。 (4) リンを含有する。 - 【請求項２】 イオン交換クロマトグラフィーが１Ｍの
ＮａＣｌ溶液を用いて溶出するものである請求項１記載
の免疫賦活物質。 - 【請求項３】 カラムクロマトグラフィーが多段式カラ
ムクロマトグラフィーである請求項１記載の免疫賦活物
質。 - 【請求項４】 ホエータンパク質がカゼインホエータン
パク質又はチーズホエータンパク質である請求項１記載
の免疫賦活物質。 - 【請求項５】 レクチンが、ヒママメレクチン、小麦胚
芽レクチン、タチナタマメレクチン、インゲンマメレク
チン、ピーナッツレクチン及びレンチルレクチンから選
ばれる少なくとも一つである請求項１記載の免疫賦活物
質。 - 【請求項６】 リンの含有量が免疫賦活物質１ｍｇ当た
り0.1〜100μgである請求項１記載の免疫賦活物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16377195A JP3859747B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ホエータンパク質濃縮物由来の免疫賦活物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16377195A JP3859747B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ホエータンパク質濃縮物由来の免疫賦活物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912474A true JPH0912474A (ja) | 1997-01-14 |
| JP3859747B2 JP3859747B2 (ja) | 2006-12-20 |
Family
ID=15780411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16377195A Expired - Lifetime JP3859747B2 (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ホエータンパク質濃縮物由来の免疫賦活物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3859747B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20101181A1 (it) * | 2010-06-30 | 2011-12-31 | Inpha Duemila Srl | Composizioni perla riduzione del peso corporeo e della glicemia post prandiale |
| JP2012152138A (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-16 | Biolink Hanbai Co Ltd | 食品組成物 |
| CN103789342A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-05-14 | 华南农业大学 | 菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPX1的应用 |
-
1995
- 1995-06-29 JP JP16377195A patent/JP3859747B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20101181A1 (it) * | 2010-06-30 | 2011-12-31 | Inpha Duemila Srl | Composizioni perla riduzione del peso corporeo e della glicemia post prandiale |
| JP2012152138A (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-16 | Biolink Hanbai Co Ltd | 食品組成物 |
| CN103789342A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-05-14 | 华南农业大学 | 菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPX1的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3859747B2 (ja) | 2006-12-20 |
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