JPH08201383A - Method for determining sugar chain structure - Google Patents
Method for determining sugar chain structureInfo
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- JPH08201383A JPH08201383A JP2589395A JP2589395A JPH08201383A JP H08201383 A JPH08201383 A JP H08201383A JP 2589395 A JP2589395 A JP 2589395A JP 2589395 A JP2589395 A JP 2589395A JP H08201383 A JPH08201383 A JP H08201383A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、糖鎖構造を決定する方
法に関し、さらに詳しくは、糖タンパク質、糖脂質、プ
ロテオグリカンなどの複合糖質の糖鎖構造を簡便に効率
よく決定する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for determining a sugar chain structure, and more particularly to a method for simply and efficiently determining a sugar chain structure of a glycoconjugate such as glycoprotein, glycolipid and proteoglycan.
【0002】[0002]
【従来の技術】自然界に広く分布している複合糖質の糖
鎖は生体内の重要な構成成分であり、細胞間の相互作用
に深く関わっていることが明らかにされつつある。それ
にともない様々な糖鎖構造の微量解析の技術が開発され
ており、これらの技術は、糖鎖の切り出し、糖鎖の分離
精製、糖鎖の標識などの工程を適宜組み合わせたもので
あるが、最終的には、得られた糖に関する確実な情報を
得るためにはNMRやMSによる同定が必要であり、非
常に煩雑な手間を要する。これらの手間を省いて簡便に
糖鎖構造を決定できる方法も提案されている。BACKGROUND ART It is becoming clear that sugar chains of glycoconjugates widely distributed in nature are important constituents in the living body and are deeply involved in interactions between cells. Along with this, various techniques for microanalysis of sugar chain structures have been developed.These technologies are a combination of steps such as excision of sugar chains, separation and purification of sugar chains, and labeling of sugar chains. Ultimately, identification by NMR or MS is necessary to obtain reliable information on the obtained sugar, which is extremely troublesome. A method has also been proposed in which the sugar chain structure can be easily determined by omitting these steps.
【0003】これまで提案されている簡便な糖鎖構造解
析方法は、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HP
LC)の手法を応用したものとしては、糖識別能を有す
るレクチンを固定化したカラムを利用する分析方法(An
al. Biochem., 164, 374(1987)ハラダら)、2種類のモ
ードのHPLCを組み合わせた二次元HPLC(Anal.
Biochem., 171, 73(1988)トミヤら)による方法、およ
び、試料を予めエキソグリコシダーゼなどの混合酵素系
列で処理し、処理した試料をHPLCで分析することに
より糖鎖構造を決定する方法(化学と生物 32(10)661
(1994) コニシら)などを挙げることができる。これら
は、いずれも、HPLCのクロマトグラムの保持時間を
指標に糖鎖構造を決定する方法である。The simple sugar chain structure analysis methods proposed so far include, for example, high performance liquid chromatography (HP).
As an application of the method of LC), an analytical method using a column on which a lectin having a sugar discrimination ability is immobilized (An
al. Biochem., 164, 374 (1987) Harada et al.) Two-dimensional HPLC combining two modes of HPLC (Anal.
Biochem., 171, 73 (1988) Tomiya et al.) And a method of pretreating a sample with a mixed enzyme series such as exoglycosidase and analyzing the treated sample by HPLC to determine the sugar chain structure (chemistry And creature 32 (10) 661
(1994) Konishi et al.). Each of these methods is a method for determining a sugar chain structure using the retention time of an HPLC chromatogram as an index.
【0004】しかしながら、HPLCの手法を利用した
分析方法は、(1)一回に一試料の解析しかできず、多
数の試料を同時に解析することはできない、(2)HP
LCの条件設定が微妙で保持時間がずれ、不正確になる
可能性が高い、(3)HPLCをポストカラムリアクタ
ーまたはプレカラムリアクターと組み合わせたものは試
薬を大量に消費する、(4)レクチン固定化カラムを用
いると、レクチンの糖に対する親和性の変化のため吸着
する糖ペプチドにも影響が生じる可能性がある、などの
問題点を抱えている。However, the analysis method using the HPLC method is (1) only one sample can be analyzed at a time, and a large number of samples cannot be analyzed simultaneously. (2) HP
LC condition setting is delicate and retention time shifts, which is likely to be inaccurate. (3) Combination of HPLC with post-column reactor or pre-column reactor consumes large amount of reagent, (4) Lectin immobilization The use of a column has a problem that a glycopeptide adsorbed may change due to a change in the affinity of lectin for sugar.
【0005】また、固相に糖鎖を固定化して解析する方
法も試みられているが、親水性の高い糖鎖を固定化する
のは技術的に困難を伴う。そのため、糖鎖を固定化する
ための技法が提案されている。例えば、アミノプレート
に糖鎖の還元末端を利用して酸アミド結合により固定化
する方法(Anal. Biochem., 182, 200(1989)オオバヤシ
ら)、糖鎖自体に疎水性を付与する目的で高分子化して
プレートに吸着せしめる方法(特開昭62−21256
8)、糖鎖をビオチニル化し、アビジンを結合させた固
相に、アビジンとビオチンの強力な親和性を利用して糖
鎖を固定化する方法などが挙げられる。しかしながら、
プレートなどの固相に固定化する方法においては、糖鎖
の前処理および縮合剤を用いた固相化に伴う固定化収率
の低下、操作の煩雑さ、長時間を要する、また生体成分
を共存させることによる非特異的吸着などが生じ易い、
などの問題点があった。また、最近、表面プラズモン共
鳴を利用した分析手法によって糖鎖を分析することも提
案されているが、高価な特殊な機器を用いるため汎用性
に富む方法ではない。[0005] Further, a method of immobilizing a sugar chain on a solid phase for analysis has been attempted, but immobilizing a highly hydrophilic sugar chain is technically difficult. Therefore, techniques for immobilizing sugar chains have been proposed. For example, a method of immobilizing an acid amide bond on an amino plate by using a reducing end of a sugar chain (Anal. Biochem., 182, 200 (1989) Oobayashi et al.), A method of imparting a high hydrophobicity to the sugar chain itself is used. A method of molecularizing and adsorbing onto a plate (Japanese Patent Laid-Open No. 62-21256).
8), a method in which a sugar chain is biotinylated, and the sugar chain is immobilized on a solid phase to which avidin is bound by utilizing the strong affinity of avidin and biotin. However,
In the method of immobilizing on a solid phase such as a plate, a reduction in immobilization yield due to pretreatment of sugar chains and immobilization using a condensing agent, complicated operation, and long time are required. Non-specific adsorption is likely to occur due to coexistence,
There were problems such as. Recently, it has been proposed to analyze sugar chains by an analysis method using surface plasmon resonance, but it is not a versatile method because an expensive special device is used.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、複合
糖質に由来する糖鎖または糖ペプチドを一段階で効率的
に固相に固定化し、さらにその上に標識物質を固定化し
て、得られる標識化された固相を検出することによっ
て、簡便に効率よく糖鎖構造を決定することができる方
法を提供することにある。本発明の方法によれば、分析
に所要な一連の反応を従来の検出機器を用いて効率よく
行うことができ、また、多数の微量試料を一度に分析す
ることができる。An object of the present invention is to efficiently immobilize a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate on a solid phase in a single step, and further immobilize a labeling substance thereon, An object of the present invention is to provide a method capable of simply and efficiently determining a sugar chain structure by detecting the resulting labeled solid phase. According to the method of the present invention, a series of reactions required for analysis can be efficiently performed using a conventional detection device, and a large number of trace samples can be analyzed at one time.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明によれば、(1)
複合糖質由来の糖鎖または糖ペプチドと、該糖鎖または
該糖ペプチドの分子末端基と反応して共有結合を形成し
得る反応基を有するポリマーでコーティングした固相と
を反応させて固定化糖鎖または固定化糖ペプチドを生成
し、(2)該固定化糖鎖または固定化糖ペプチドと、こ
れらと特異的に結合する標識化された物質とを反応さ
せ、(3)生成する標識化された固相を検出することを
特徴とする糖鎖構造を決定する方法が提供される。According to the present invention, (1)
Immobilization by reacting a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate with a solid phase coated with a polymer having a reactive group capable of reacting with a molecular end group of the sugar chain or the glycopeptide to form a covalent bond Producing a sugar chain or an immobilized glycopeptide, (2) reacting the immobilized sugar chain or the immobilized glycopeptide with a labeled substance that specifically binds to these, and (3) producing a labeling A method for determining a sugar chain structure is provided, which comprises detecting the solid phase.
【0008】さらに本発明によれば、(1)複合糖質由
来の糖鎖または糖ペプチドと、該糖鎖または該糖ペプチ
ドの分子末端基と反応して共有結合を形成し得る反応基
を有するポリマーでコーティングした固相とを反応させ
て固定化糖鎖または固定化糖ペプチドを生成し、
(2)該固定化糖鎖または固定化糖ペプチドと、これら
と特異的に結合する結合用物質とを反応させ、(3)得
られる生成物と、該結合用物質と特異的に結合する標識
物質とを反応させ、(4)生成する標識化された固相を
検出することを特徴とする糖鎖構造を決定する方法が提
供される。Further, according to the present invention, (1) it has a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate and a reactive group capable of reacting with the molecular end group of the sugar chain or the glycopeptide to form a covalent bond. Reacting with a solid phase coated with a polymer to produce immobilized sugar chains or immobilized glycopeptides,
(2) The immobilized sugar chain or the immobilized glycopeptide is reacted with a binding substance that specifically binds to them, and (3) the resulting product and a label that specifically binds to the binding substance. There is provided a method for determining a sugar chain structure, which comprises reacting with a substance and (4) detecting the resulting labeled solid phase.
【0009】以下、本発明の糖鎖構造を決定する方法を
詳細に説明する。本発明の測定対象は、複合糖質、すな
わち、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどの
非糖質成分を含む糖質の糖鎖構造であって、糖質自体は
単糖、オリゴ糖および多糖のいずれでもよく格別限定さ
れるものではない。The method for determining the sugar chain structure of the present invention will be described in detail below. The measurement target of the present invention is a glycoconjugate, that is, a sugar chain structure of a sugar containing non-sugar components such as glycoprotein, glycolipid, and proteoglycan, and the sugar itself is composed of monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. Both are not particularly limited.
【0010】用いる検体は格別限定されるものではな
く、検体に含まれる糖鎖としては、各種のもの、例え
ば、N−グリコシド型、O−グリコシド型、コラーゲン
型糖タンパク質およびガングリオ系、グロボ系、ラクト
系糖脂質などの糖鎖が挙げられる。糖タンパク質、糖脂
質、プロテオグリカンなどの複合糖質から糖鎖を分離す
る方法としては、常用される方法、例えば、ヒドラジン
分解法、プロナーゼによる徹底消化、N−グリカナーゼ
処理、O−グリカナーゼ処理、トリフルオロ酢酸による
分解法などを挙げることができ、それらによる処理操作
などは、通常のこの種の方法で採られているものと同様
に行ない得る。(Methods Enzymol., Vol 83, 263(198
2))The sample to be used is not particularly limited, and various sugar chains contained in the sample, for example, N-glycoside type, O-glycoside type, collagen type glycoprotein and ganglio type, globo type, Examples thereof include sugar chains such as lacto-based glycolipids. As a method for separating a sugar chain from a glycoconjugate such as glycoprotein, glycolipid, and proteoglycan, a commonly used method, for example, hydrazinolysis method, thorough digestion with pronase, N-glycanase treatment, O-glycanase treatment, trifluoro A decomposition method with acetic acid and the like can be mentioned, and a treatment operation and the like with them can be performed in the same manner as that usually adopted in this kind of method. (Methods Enzymol., Vol 83, 263 (198
2))
【0011】本発明の方法においては、先ず、複合糖質
由来の糖鎖または糖ぺプチドを固定化した固相を調製す
る。そのためには、先ず、細胞またはそれに由来する生
物標品より単離した糖タンパク質、糖脂質、プロテオグ
リカンなどの複合糖質を酵素などによる消化を行って糖
鎖または糖ぺプチドのフラグメントを得る。各フラグメ
ントはHPLCなどによって分離精製し、各ピークフラ
クションを適量取り、固定化用の糖鎖または糖ぺプチド
のフラグメントを得る。糖鎖の分画には様々なクロマト
グラフィーを用いることが出来るが、特に糖ぺプチドの
ような低分子物質の分離にはC18等による逆相HPL
Cが適している。溶出画分モニターには210−230
nmの吸収を検出するのが簡便でよい。得られたフラク
ションはピーク毎に分取乾燥し、固定化用固相との反応
に用いる。In the method of the present invention, first, a solid phase on which a sugar chain or sugar peptide derived from a glycoconjugate is immobilized is prepared. For that purpose, first, glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids and proteoglycans isolated from cells or biological preparations derived therefrom are digested with an enzyme or the like to obtain sugar chains or fragments of sugar peptides. Each fragment is separated and purified by HPLC and the like, and each peak fraction is collected in an appropriate amount to obtain a sugar chain or sugar peptide fragment for immobilization. Various chromatographies can be used for the fractionation of sugar chains, but especially for the separation of low molecular weight substances such as sugar peptides, reverse-phase HPL using C18 etc.
C is suitable. 210-230 for the elution fraction monitor
It is convenient to detect the absorption at nm. The obtained fraction is fractionally dried for each peak and used for the reaction with the solid phase for immobilization.
【0012】糖鎖または糖ぺプチドのフラグメントを固
定すべき固相は格別限定されるものではなく、その材質
としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、置換ポリス
チレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニ
リデンなどのフッ素化ポリマー、ポリスルホン、ポリエ
ステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ナ
イロン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポ
リビニルアルコール、ポリウレタンおよびこれらの共重
合体などの水に難溶性または不溶性の合成重合体、セル
ロース類、ガラスなどが挙げられる。固相の形態も格別
限定されるものではなく、代表的形態としてはマイクロ
プレート、膜、繊維、紙などが挙げられ、特にマイクロ
タイタープレートが最も好ましい。また、その大きさお
よび厚さも格別限定されない。The solid phase on which the sugar chain or the sugar peptide fragment is to be immobilized is not particularly limited, and its material is fluorinated such as polyolefin, polystyrene, substituted polystyrene, polytetrafluoroethylene, and polyvinylidene fluoride. Polymers, polysulfones, polyesters, polycarbonates, polyacrylonitriles, nylons, polyacrylamides, polymethacrylates, polyvinyl alcohols, polyurethanes and copolymers thereof such as water-insoluble or insoluble synthetic polymers, celluloses, glass and the like. . The form of the solid phase is not particularly limited, and typical forms include microplates, membranes, fibers, papers, etc., with microtiter plates being most preferred. Further, its size and thickness are not particularly limited.
【0013】糖鎖または糖ぺプチドの固相上に固定化す
るに際しては、結合力を高めるために、予め、固相表面
を、糖鎖または糖ぺプチドの分子末端基、すなわち、糖
鎖の還元末端のホルミル基または糖ぺプチドの分子末端
のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有結合
(例えば酸アミド結合)を形成し得る反応基を有するポ
リマーでコーティングする。そのような共有結合を形成
し得る反応基としては、例えば、エポキシ基、ハロゲン
原子、アミノ基、ヒドラジノ基、カルボキシル基、酸無
水物基、ホルミル基などが挙げられる。When the sugar chain or sugar peptide is immobilized on the solid phase, the surface of the solid phase is previously fixed to the molecular end group of the sugar chain or sugar peptide, ie, the sugar chain, in order to enhance the binding force. It is coated with a polymer having a reducing group or a reactive group capable of reacting with an amino group or a carboxyl group at the molecular end of a sugar peptide to form a covalent bond (for example, an acid amide bond). Examples of the reactive group capable of forming such a covalent bond include an epoxy group, a halogen atom, an amino group, a hydrazino group, a carboxyl group, an acid anhydride group and a formyl group.
【0014】上記のような反応基を有するポリマーは、
上記のような反応基を有する単量体の重合および他の反
応基を有するポリマーの化学的変性などによって調製さ
れる。好ましいポリマーとしては、無水マレイン酸のよ
うな酸無水物モノマーの重合体、またはそれと共重合し
得るビニルモノマー、例えば、メチルビニルエーテル、
エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、イソブ
チルビニルエーテル、スチレンなどとの無水マレイン酸
共重合体を例示することができる。さらに、エポキシ基
を有するモノマーであるグリシジルメタクリレート、グ
リシジルアクリレート、またはカルボキシル基を有する
モノマーであるアクリル酸、メタクリル酸などの重合体
および共重合体を挙げることができる。得られた重合体
の官能基をさらに化学変性して異なる官能基を有する重
合体を得ることも可能であり、例えばエポキシ基または
酸無水物を有する重合体は、アンモニア、ヒドラジンま
たはプロパンジアミンのようなジアミノアルカン類、塩
基性アミノ酸、ポリアミン類などと反応させることによ
りアミノ基を有する重合体を得ることができる。また、
アミノ基を有する重合体は無水コハク酸のような酸無水
物などと反応させることによりカルボキシル基を有する
重合体とすることができる。水酸基を有する重合体の場
合には、例えばアルカリ条件下で、1,4−ブタンジオ
ールジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテ
ル類、1,7−オクタジエンジエポキシドのようなジエ
ポキシド類などと反応させ、エポキシ基を有する重合体
とすることができる。The polymer having a reactive group as described above is
It is prepared by polymerizing a monomer having a reactive group as described above and chemically modifying a polymer having another reactive group. Preferred polymers include polymers of acid anhydride monomers such as maleic anhydride, or vinyl monomers copolymerizable therewith, such as methyl vinyl ether,
Examples thereof include maleic anhydride copolymers with ethyl vinyl ether, butyl vinyl ether, isobutyl vinyl ether, styrene and the like. Further, polymers and copolymers such as glycidyl methacrylate or glycidyl acrylate, which is a monomer having an epoxy group, or acrylic acid or methacrylic acid, which is a monomer having a carboxyl group, can be mentioned. It is also possible to chemically modify the functional group of the obtained polymer to obtain a polymer having a different functional group, for example, a polymer having an epoxy group or an acid anhydride may be a compound such as ammonia, hydrazine or propanediamine. A polymer having an amino group can be obtained by reacting with various diaminoalkanes, basic amino acids, polyamines and the like. Also,
A polymer having an amino group can be converted to a polymer having a carboxyl group by reacting with an acid anhydride such as succinic anhydride. In the case of a polymer having a hydroxyl group, for example, it is reacted with diglycidyl ethers such as 1,4-butanediol diglycidyl ether and diepoxides such as 1,7-octadiene diepoxide under alkaline conditions. It may be a polymer having an epoxy group.
【0015】これら被覆用のポリマーの分子量は、特に
制限されることはないが、固相表面にコートするに適し
た疎水性、および粘性を有するためには、分子量は40
0以上であれば良く、特に2万以上100万以下が望ま
しい。上記反応基を有するポリマーを固相にコートする
方法は格別限定されるものではなく、ポリマーの有機溶
剤溶解液を浸漬法、塗布法その他のコーティング法を採
ることができる。The molecular weight of these coating polymers is not particularly limited, but in order to have hydrophobicity and viscosity suitable for coating on a solid surface, the molecular weight is 40.
It may be 0 or more, and particularly preferably 20,000 or more and 1 million or less. The method of coating the polymer having the above-mentioned reactive group on the solid phase is not particularly limited, and a dipping method, a coating method or other coating method of an organic solvent solution of the polymer can be adopted.
【0016】糖鎖または糖ぺプチドのフラクションと固
定化固相との反応条件は特に制限されることはなく、通
常この種の検出法の場合と同様でよい。すなわち、一般
に45℃以下、好ましくは約4〜40℃の温度条件下、
1〜40時間程度を要して反応を行なう。その際、反応
媒体としては、反応に悪影響を与えない通常の溶媒、例
えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩
衝液、酢酸緩衝液などのpH4〜8程度の緩衝液を好ま
しいものとして使用できる。The reaction conditions between the sugar chain or sugar peptide fraction and the immobilized solid phase are not particularly limited, and may be generally the same as in the case of this type of detection method. That is, generally under a temperature condition of 45 ° C or lower, preferably about 4 to 40 ° C,
The reaction is performed for about 1 to 40 hours. At that time, as the reaction medium, an ordinary solvent that does not adversely influence the reaction, for example, a buffer solution having a pH of about 4 to 8 such as a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a Tris-hydrochloric acid buffer solution, and an acetate buffer solution is preferable. Can be used as a thing.
【0017】本発明の方法においては、上記のように糖
鎖または糖ぺプチドの固相上に固定化した後、(1)該
糖鎖または糖ぺプチドと、これらと特異的に結合する標
識化された物質とを反応させて結合したうえ、生成する
標識化された固相を検出するか、または(2)該糖鎖ま
たは糖ぺプチドと、これらと特異的に結合する結合用物
質を反応させ、さらに、該結合用物質と特異的に結合す
る標識物質とを反応させて結合したうえ、生成する標識
化された固相を検出する。In the method of the present invention, after immobilizing on the solid phase of the sugar chain or sugar peptide as described above, (1) the sugar chain or sugar peptide and a label that specifically binds to these Or a bound substance that specifically binds to the sugar chain or sugar peptide is detected. After the reaction, the binding substance and the labeling substance that specifically binds are reacted and bound, and the resulting labeled solid phase is detected.
【0018】上記(1)の方法において、固定化された
糖鎖または糖ぺプチドと特異的に結合する標識化された
物質としては、標識レクチンおよび標識抗体が好ましく
用いられる。ここで標識レクチンおよび標識抗体として
は、それぞれ、各種のレクチンおよび抗体を、通常の放
射性物質、酵素標識物質、蛍光物質などの各種標識剤で
標識化したものが用いられる。標識剤としての放射性物
質としては、125Iその他の放射性ヨード剤などを、
蛍光物質としては、フルオレセイン・イソチオシアナー
ト(FITC)、テトラメチルローダミン・イソチオシ
アナート(TRITC)、置換ローダミン・イソチオシ
アナート(XRITC)、ローダミンB・イソチオシア
ナート、ジクロロトリアジンフルオレセイン(DTA
F)などを、また、酵素標識物質としては、パーオキシ
ダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、キモトリプシノー
ゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリセロアルデヒ
ド−3−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラー
ゼ、DNA−ナーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをそれ
ぞれ挙げることができる。In the above method (1), a labeled lectin and a labeled antibody are preferably used as the labeled substance that specifically binds to the immobilized sugar chain or sugar peptide. Here, as the labeled lectin and the labeled antibody, various lectins and antibodies labeled with various labeling agents such as ordinary radioactive substances, enzyme labeling substances and fluorescent substances are used. Examples of radioactive substances as labeling agents include 125I and other radioactive iodine agents,
Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), substituted rhodamine isothiocyanate (XRITC), rhodamine B isothiocyanate, dichlorotriazine fluorescein (DTA).
F) and the like, and as enzyme labeling substances, peroxidase, microperoxidase, chymotrypsinogen, procarboxypeptidase, glyceroaldehyde-3-phosphate dehydrogenase, amylase, phosphorylase, DNA-nase, β-galactosidase, etc. Can be mentioned respectively.
【0019】標識化すべきレクチンとしては公知の各種
のもの、例えば、ConA、RCA60、RCA12
0、LCA、PSA、VFA、L−PHA、E−PH
A、WGA、PNAなどを例示できる。上記各種レクチ
ンは市販品として入手することもでき、また常法に従っ
て製造することもできる(J. Biol. Chem., 254, 9349-
9351(1979): Nature, 194, 495(1962));蛍光抗体法、
医化学実験講座4,263-270;Acta. Endocrinol. Suppl.,
168, 206(1972)など参照)。また、標識化すべき抗体に
ついても特に制限はなく、糖鎖または糖ぺプチドを特異
的に認識する抗体であれば良い。抗体を適切に選ぶこと
によって、固定化された糖質または糖ぺプチドに対する
特異性および親和力の高い標識化抗体が得られる。Various known lectin to be labeled, for example, ConA, RCA60, RCA12.
0, LCA, PSA, VFA, L-PHA, E-PH
A, WGA, PNA, etc. can be illustrated. The above various lectins can be obtained as commercial products, or can be produced according to a conventional method (J. Biol. Chem., 254, 9349-.
9351 (1979): Nature, 194, 495 (1962)); fluorescent antibody method,
Laboratory of Medical Chemistry 4,263-270; Acta. Endocrinol. Suppl.,
168, 206 (1972) etc.). The antibody to be labeled is also not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes a sugar chain or a sugar peptide. By proper selection of the antibody, a labeled antibody having high specificity and affinity for the immobilized carbohydrate or glycopeptide can be obtained.
【0020】上記(2)の方法において、固定化された
糖鎖または糖ぺプチドと特異的に結合する結合用物質と
しては、標識化されていないレクチンおよび抗体が好ま
しく用いられる。レクチンおよび抗体としては、上記
(1)の方法において用いられる標識化すべきレクチン
および抗体と同様に、糖鎖または糖ぺプチドを特異的に
認識するものであれば格別限定されることはなく、各種
レクチンおよび抗体の中から選ぶことができる。In the above method (2), unlabeled lectin and antibody are preferably used as the binding substance that specifically binds to the immobilized sugar chain or sugar peptide. The lectin and antibody are not particularly limited as long as they can specifically recognize a sugar chain or a sugar peptide, like the lectin and antibody to be labeled used in the method (1) above. You can choose between lectins and antibodies.
【0021】上記(2)の方法においては、標識化され
ていない結合用物質を結合せしめた後、該結合用物質と
特異的に結合する標識物質を反応させて結合する。ここ
で標識物質としては、レクチンまたは抗体に対して親和
性をもつ標識化抗体、あるいはレクチンに対して親和性
をもつ糖を有する赤血球およびポリマーラテックスなど
の物質が挙げられる。In the above-mentioned method (2), after binding an unlabeled binding substance, a labeling substance which specifically binds to the binding substance is reacted to bind. Examples of the labeling substance include labeled antibodies having an affinity for lectins or antibodies, or substances such as red blood cells and polymer latex having a sugar having an affinity for lectins.
【0022】上記(1)および(2)の方法は、両者を
比較すると一長一短があるが、次の点では上記(2)の
方法が優れている。すなわち、上記(1)の方法では、
一般に、使用できる標識化レクチンまたは標識化抗体が
限定され、入手困難であり、また標識化レクチンまたは
標識化抗体の調製を試みた場合には、得られた標品の精
製などに手間がかかることに加えて、レクチンや抗体の
特異性および親和力が変わるという変性を惹き起こす可
能性がある。これとは対照的に、上記(2)の方法で
は、結合用物質を介在させることによって広範囲に亘る
標識化抗体が利用でき、それらの難点がない。The above methods (1) and (2) have merits and demerits when comparing the two, but the method (2) is superior in the following points. That is, in the above method (1),
In general, the labeled lectins or labeled antibodies that can be used are limited and are difficult to obtain, and when attempting to prepare the labeled lectins or labeled antibodies, it takes time to purify the obtained preparations. In addition, it may cause denaturation in which the specificity and affinity of lectins and antibodies are changed. In contrast to this, in the method of (2) above, a wide range of labeled antibodies can be utilized by interposing a binding substance, and there is no difficulty thereof.
【0023】上記(1)の方法における標識レクチンま
たは標識抗体の結合反応、ならびに、上記(2)の方法
における標識化されていない結合用物質の結合反応およ
び標識物質の結合反応は、いずれも、前記糖鎖または糖
ぺプチドの固定化の場合と同様に、通常のこの種の反応
と同様にして実施できる。その際、反応に悪影響を与え
ない前記した各種溶媒を使用することができ、また、所
望により反応系にカルシウムやマンガンなどの金属イオ
ンを加えることもできる。上記反応は一般に45℃以
下、好ましくは約4〜40℃の温度条件下、1〜40時
間程度を要して行なわれる。The binding reaction of the labeled lectin or labeled antibody in the above method (1) and the binding reaction of the unlabeled binding substance and the binding reaction of the labeling substance in the above method (2) are both As in the case of immobilizing the sugar chain or sugar peptide, it can be carried out in the same manner as a usual reaction of this type. At this time, the above-mentioned various solvents that do not adversely affect the reaction can be used, and if desired, metal ions such as calcium and manganese can be added to the reaction system. The above reaction is generally carried out under a temperature condition of 45 ° C. or lower, preferably about 4 to 40 ° C., for about 1 to 40 hours.
【0024】上記(1)および(2)両方法において、
最終的に得られた固定化標識物質を検出するには、固相
の形状、光学的性質に応じて、吸光スペクトル変化の測
定、あるいは放射活性の測定などによって適宜行われ
る。例えば、固相がマイクロプレートである場合には、
一般的な酵素免疫法(ELISA)に用いられるプレー
トリーダーなどで簡便に検出することができる。In both the above methods (1) and (2),
The finally obtained immobilized labeled substance is appropriately detected by measuring the change in the absorption spectrum or measuring the radioactivity depending on the shape and optical properties of the solid phase. For example, if the solid phase is a microplate,
It can be easily detected with a plate reader or the like used in a general enzyme immunoassay (ELISA).
【0025】[0025]
【実施例】以下に本発明の実施例を示し本発明を具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。実施例1 MMAC(メチル・ビニル・エーテル/無水マレイン酸
共重合体、/n-263,分子量41000) を5mg/mlの濃
度でヘキサンに溶かし、この溶液を96穴のマイクロタ
イタープレート(Immulon 200, C.A. Greiner and Sohn
e, GmbH & CoKG, Germany) の各ウェルに100μlず
つ加えて、室温で30分間静置した。上清を捨てた後、
50mMトリス−マレイン酸緩衝液(pH7.0) に溶かし
たp−アミノフェニルガラクトピラノシド(糖ペプチド
の単純モデルとして用いた)の2倍希釈列水溶液(1.56
-400μg/ml)を50μlずつウェルに加えて固定化を行
った。上清を捨ててTBSで3回洗浄した後、5%BS
A(ウシ血清アルブミン)/TBS(0.15M NaClを含む
トリス−塩酸緩衝液)で1時間ブロックした。上清を捨
てた後、ガラクトースを特異的に認識し得る標識化レク
チンであるHRP(ホース・ラディッシュ・パーオキシ
ダーゼ)−標識化RCA(ヒマ種子レクチン)を100
μlずつ加えて静置した。さらに、上清を捨ててTBS
で洗浄し、HRPに対する基質であるO−フェニレンジ
アミンを用いて発色させ490nmの吸光度を測定し
た。EXAMPLES The present invention will be specifically described below by showing Examples of the present invention, but the present invention is not limited to these Examples. Example 1 MMAC (methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer, / n-263, molecular weight 41000) was dissolved in hexane at a concentration of 5 mg / ml, and this solution was added to a 96-well microtiter plate (Immulon 200, CA Greiner and Sohn
e, GmbH & CoKG, Germany), 100 μl was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After discarding the supernatant,
A 2-fold diluted aqueous solution of p-aminophenylgalactopyranoside (used as a simple model of glycopeptide) dissolved in 50 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) (1.56
-400 μg / ml) was added to each well in an amount of 50 μl to perform immobilization. After discarding the supernatant and washing 3 times with TBS, 5% BS
The cells were blocked with A (bovine serum albumin) / TBS (Tris-hydrochloric acid buffer containing 0.15M NaCl) for 1 hour. After discarding the supernatant, 100 labeled HRP (horse radish peroxidase) -labeled RCA (castor seed lectin), which is a labeled lectin capable of specifically recognizing galactose, was added.
Each μl was added and left to stand. Furthermore, discard the supernatant and discard TBS.
The plate was washed with, and color was developed using O-phenylenediamine, which is a substrate for HRP, and the absorbance at 490 nm was measured.
【0026】上記と同様の実験をMMACの代わりにB
S3(ビス・スルホサクレンイミジル・スベレート)を
0.1mg/mlの濃度になるように5mMリン酸緩衝
液(pH5.0) に溶かして100μlずつウェルに加え、
室温で2時間静置した後に上清を捨ててプレートをコー
トしたものを用い、比較した。その結果を図1に示し
た。図1にみられるようにリガンドの濃度が5μg/m
l以下の濃度ではBS3とMMACでは殆ど差が見られ
ないが、5μg/ml以上ではMMACのほうがはるか
に効率よく、濃度依存的に固定化されていることが分か
った。An experiment similar to the above was performed using B instead of MMAC.
Dissolve S3 (bis-sulfosacrene imidyl suberate) in 5 mM phosphate buffer (pH 5.0) to a concentration of 0.1 mg / ml and add 100 μl to each well,
After standing at room temperature for 2 hours, the supernatant was discarded and the plate was used for comparison. The results are shown in Fig. 1. As shown in Fig. 1, the concentration of the ligand is 5 μg / m.
It was found that at a concentration of 1 or less, almost no difference was observed between BS3 and MMAC, but at 5 μg / ml or more, MMAC was much more efficiently immobilized in a concentration-dependent manner.
【0027】実施例2 糖を固定化する際の時間を1,3,6,18時間と変化
させて、MMACを用いて実施例1と同様の実験を行
い、固定化時間の影響を調べた。その結果を図2に示し
た。図2に示すとおり、全ての固定化時間において濃度
依存的な結果が得られたが、6時間程度でほぼ平衡に達
した。 Example 2 The same experiment as in Example 1 was conducted using MMAC while changing the time for immobilizing sugar to 1, 3, 6, 18 hours, and the influence of the immobilization time was investigated. . The result is shown in FIG. As shown in FIG. 2, concentration-dependent results were obtained at all immobilization times, but almost equilibrium was reached in about 6 hours.
【0028】実施例3 HRP−標識化レクチンの反応時間を15分、30分、
1時間、2時間と変化させてMMACを用いて実施例1
と同様の実験を行った。その結果を図3に示した。反応
収率は1時間で平衡に達した。 Example 3 The reaction time of HRP-labeled lectin was 15 minutes, 30 minutes,
Example 1 using MMAC by changing the time from 1 hour to 2 hours
The same experiment was performed. The results are shown in Fig. 3. The reaction yield reached equilibrium in 1 hour.
【0029】実施例4 実施例1と同様にしてMMACをコートしたマイクロタ
イタープレートにp−アミノフェニルガラクトピラノシ
ドの2倍希釈列溶液(1.56-400μl/ml)を加えて固定化
した。5%BSA/TBSでブロックした後に、RCA
を50μlずつ加えて室温で1時間静置した。さらに洗
浄とブロッキングを行い、4%ヒトA型赤血球を100
μl加え、1時間静置して赤血球を溶血させた。検出は
マイクロリーダで415nmの吸光度を測定した。比較
としてMMACコートを行わないプレートに対して同様
の実験を行った。その結果を図4に示した。MMACを
介してアミノ化糖を固定化したものがMMACを介さず
に固定化したものと比較し、その後のレクチン、赤血球
による検出が容易に行えることが明らかになった。 Example 4 In the same manner as in Example 1, a 2-fold dilution series solution (1.56-400 μl / ml) of p-aminophenylgalactopyranoside was added to a microtiter plate coated with MMAC for immobilization. RCA after blocking with 5% BSA / TBS
50 μl each was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After further washing and blocking, 100% of 4% human type A red blood cells
μl was added and left still for 1 hour to lyse the red blood cells. For detection, the absorbance at 415 nm was measured with a micro reader. As a comparison, the same experiment was performed on a plate not coated with MMAC. The results are shown in Fig. 4. It was clarified that the one immobilized with aminated sugar via MMAC was easily detected subsequently with lectin and erythrocyte, as compared with the one immobilized without MMAC.
【0030】実施例5 実施例1と同様にしてMMACをコートしたマイクロタ
イタープレートにp−アミノフェニルガラクトヒドラシ
ドを固定化した。その際、固定化する糖の濃度を6.2
5−400μg/mlに変え、5%BSA/TBSでブ
ロックした後にRCA0.5mg/mlを100μlず
つ加えて室温で1時間静置した。さらに、洗浄とブロッ
キングを行い、植物型N−結合糖鎖に対する抗体(抗B
−SJA−II抗体、1000倍希釈)を100μlずつ
加えて室温で1時間反応させた。洗浄とブロッキングを
行い、2次抗体としてHRP−標識化抗ウサギIgG抗
体(ヤギ)を100μl加えて室温で30分間静置し
た。発色はO−フェニレンジアミンを用いた方法で行
い、490nmの吸光度を測定した。その結果を図5に
示した。その結果、アミノ化糖が、糖に対する抗体およ
びその二次抗体により感度良く検出できることが明らか
になった。 Example 5 In the same manner as in Example 1, p-aminophenylgalactohydraside was immobilized on a microtiter plate coated with MMAC. At that time, the concentration of the immobilized sugar was 6.2.
After changing to 5-400 μg / ml and blocking with 5% BSA / TBS, RCA 0.5 mg / ml was added by 100 μl and left at room temperature for 1 hour. Furthermore, washing and blocking are performed, and an antibody against the plant-type N-linked sugar chain (anti-B
-SJA-II antibody, diluted 1000 times) was added in 100 μl portions and reacted at room temperature for 1 hour. After washing and blocking, 100 μl of HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (goat) was added as a secondary antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Color development was performed by a method using O-phenylenediamine, and the absorbance at 490 nm was measured. The results are shown in FIG. As a result, it was revealed that aminated sugars can be detected with high sensitivity by an antibody against sugar and its secondary antibody.
【0031】実施例6 ヒマ種子レクチン(RCA)1mgを0.1mM Ca
Cl2−30mM NaCl−50mM Tris−H
Cl(pH7.8)500μlに溶かして100℃、10分
間加熱し、同じ緩衝液に溶かしたトリプシン(20μg/2
μl) を加えて37℃で24時間静置して、タンパク質
を消化した。さらに、0.2M PMSFと0.2M
EDTAを5μl加えて100℃で10分間加熱し、反
応を停止させた。タンパク質を加えないで同様の操作を
したものをブランクとした。この消化物の一部をC18
逆相HPLCカラムに加え、ぺプチドを分離した。分離
はC18逆相系のカラム(4×150mm)を用い、流速1.
0ml/min、温度40℃、検出は220nmで行
い、0.05%トリフルオロ酢酸から60% 2−プロ
パノール:アセトニトリル(7:3) への60分間直線グ
ラジエントにて行った。得られたクロマトグラムを図6
に示した。 Example 6 1 mg of castor seed lectin (RCA) was added to 0.1 mM Ca.
Cl 2 -30mM NaCl-50mM Tris- H
Trypsin (20 μg / 2) dissolved in 500 μl of Cl (pH 7.8), heated at 100 ° C. for 10 minutes, and dissolved in the same buffer solution.
μl) was added and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours to digest the protein. In addition, 0.2M PMSF and 0.2M
The reaction was stopped by adding 5 μl of EDTA and heating at 100 ° C. for 10 minutes. A blank obtained by performing the same operation without adding protein was used. A part of this digest is C18
The peptide was separated by addition to a reverse phase HPLC column. For separation, a C18 reverse-phase column (4 × 150 mm) was used, and the flow rate was 1.
The detection was performed at 0 ml / min, a temperature of 40 ° C., and 220 nm, and a linear gradient from 0.05% trifluoroacetic acid to 60% 2-propanol: acetonitrile (7: 3) was used for 60 minutes. The obtained chromatogram is shown in FIG.
It was shown to.
【0032】ヘキサンに溶かしたMMAC(1mg/ml)を
タイタープレートのウェルに100μlずつ加えて室温
で30分間静置した。分取したぺプチドフラクションは
Speed Vac で乾燥させ、純水を加えてその一部を50m
M トリス−マレイン酸緩衝液に溶かして50μlと
し、上清を捨てたウェルに加えた。18時間、4℃で静
置してぺプチドを固定化した。またMMACの変わりに
BS3を用いて同様な固定化をおこなった。BS3を
0.1mg/mlの濃度になるように5mMリン酸緩衝
液(pH5.0) に溶かし、タイタープレートのウェルに5
0μlずつ加えて、37℃で2時間コートした。さら
に、分取したぺプチドフラクションの一部をPBSに溶
かして50μlとし、ウェルに加えてBS3とともにイ
ンキュベートした。18時間、4℃で静置してぺプチド
の固定化を行った。100 μl of MMAC (1 mg / ml) dissolved in hexane was added to each well of the titer plate and left standing at room temperature for 30 minutes. The peptide fraction collected is
Dry with Speed Vac, add pure water and part of it to 50m
It was dissolved in M Tris-maleic acid buffer solution to make 50 μl, and the supernatant was added to the discarded well. The peptide was fixed by allowing to stand for 18 hours at 4 ° C. The same immobilization was performed using BS3 instead of MMAC. Dissolve BS3 in 5 mM phosphate buffer (pH 5.0) to a concentration of 0.1 mg / ml, and add 5 to the wells of a titer plate.
0 μl of each was added and coating was performed at 37 ° C. for 2 hours. Further, a part of the collected peptide fraction was dissolved in PBS to make 50 μl, added to the well and incubated with BS3. The peptide was immobilized by allowing it to stand at 4 ° C. for 18 hours.
【0033】ぺプチドを固定化したプレートのウェルを
TBSで3回洗浄し、5%BSA/TBSで1時間、室
温でブロッキングを行った。上清を捨てて、HRP−標
識化(コンカナバリンA)ConAの1000培希釈溶
液を100μl加え、室温で1時間反応させた。洗浄
後、ウェル中の糖を含むぺプチドと結合したHRP−標
識化ConAをO−フェニレンジアミンを用いた方法で
発色を行い、490nmの吸光度を測定して検出した。
その結果を図6に示した。陽性と検出されたものが図6
にて番号を記したピーク(29, 31, 44, 47, 47, 48, 5
1, 54, 58, 59, 60, 65, 67)である。The wells of the plate on which the peptide was immobilized were washed 3 times with TBS and blocked with 5% BSA / TBS for 1 hour at room temperature. The supernatant was discarded, 100 μl of a 1000-fold diluted solution of HRP-labeled (concanavalin A) Con A was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing, HRP-labeled ConA bound to the sugar-containing peptide in the well was subjected to color development by a method using O-phenylenediamine, and the absorbance at 490 nm was measured and detected.
The results are shown in Fig. 6. What is detected as positive is Fig. 6
Peak numbered at (29, 31, 44, 47, 47, 48, 5
1, 54, 58, 59, 60, 65, 67).
【0034】また、これらのフラクションについてMM
ACコート法とBS3法とを比較した結果を図7に示し
た。その結果、全体的にMMACで固定化したほうが吸
光度が高く、BS3では、ほとんど検出されていないフ
ラクション(ピーク29, 44,48, 51, 67)もMMACで
は検出することができた。特に、フラクション中に糖鎖
のついていないぺプチドが混在していて糖ぺプチドの量
が少ない場合(ピーク44, 54)MMACとBS3の固定
化量の差がみられた。また、タイタープレートの表面を
コートしない場合はぺプチドは全く検出されなかった。MM for these fractions
The result of comparison between the AC coating method and the BS3 method is shown in FIG. 7. As a result, the absorbance was higher when immobilized with MMAC as a whole, and the fractions (peaks 29, 44, 48, 51, 67) that were hardly detected by BS3 could be detected by MMAC. In particular, when the peptide without sugar chain was mixed in the fraction and the amount of sugar peptide was small (peaks 44 and 54), a difference in the immobilized amount of MMAC and BS3 was observed. Moreover, when the surface of the titer plate was not coated, no peptide was detected.
【0035】実施例7 実施例1と同様にしてMMACをコートしたマイクロタ
イタープレートにヒト乳オリゴ糖を一定量加え、5%B
SA/TBSでブロックした。25μg/mlのモノク
ローナル抗体(NS10C17)液(0.15M Na
Cl、10%BSA、0.1% NaN3 を含むTB
S)を加え、室温で30分間反応させた。反応後、TB
Sで3回洗浄し、2次抗体としてHRP−標識化抗マウ
スIgM抗体溶液を加え、室温で30分間静置した。発
色は0−フェニレンジアミンを用いた方法で行い、49
0nmの吸光度を測定した。その結果、LNDI(Le
b構造〔Fucαl→2Galβl→3(Fucαl→4)GlcNAc〕を含む
ラクト−N−ジフコペンタオースI〔Fucαl→2Galβl
→3(Fucαl→4)GlcNAcβl→3Galβl→4Glc〕)が感度良
く検出できた。 Example 7 As in Example 1, a certain amount of human milk oligosaccharide was added to a microtiter plate coated with MMAC, and 5% B was added.
Blocked with SA / TBS. 25 μg / ml monoclonal antibody (NS10C17) solution (0.15M Na
TB containing Cl, 10% BSA, 0.1% NaN 3
S) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After reaction, TB
After washing 3 times with S, HRP-labeled anti-mouse IgM antibody solution was added as a secondary antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Color was developed by a method using 0-phenylenediamine,
The absorbance at 0 nm was measured. As a result, LNDI (Le
Lacto-N-difucopentaose I [Fucαl → 2Galβl containing structure b [Fucαl → 2Galβl → 3 (Fucαl → 4) GlcNAc]]
→ 3 (Fucαl → 4) GlcNAcβl → 3Galβl → 4Glc]) was detected with high sensitivity.
【0036】参考例1 実施例6におけるRCAのトリプシン消化物の一部を
0.1M Ac0Na−1mM CaCl2−1mMM
gCl2−150mM NaCl緩衝液で平衡化したC
onAアガロースカラム(3ml) にかけ、緩衝液20m
lで洗浄後、0.1M メチルα−マンノシド溶液10
mlで溶出した。この糖ぺプチド画分を濃縮した後、C
18逆相HPLCカラムにかけたクロマトグラムを図8
に示した。実施例6におけるぺプチドと同様にMMAC
法にて検出した結果、陽性だった7つのピークに番号を
付与した。 Reference Example 1 A part of the tryptic digest of RCA in Example 6 was replaced with 0.1 M Ac0Na-1 mM CaCl 2 -1 mMM.
C equilibrated with gCl 2 -150 mM NaCl buffer
on Agarose column (3ml), buffer 20m
After washing with l, 0.1M methyl α-mannoside solution 10
Elute with ml. After concentrating this sugar peptide fraction, C
Figure 18 shows the chromatogram applied to an 18 reverse-phase HPLC column.
It was shown to. Similar to the peptide in Example 6, MMAC
As a result of detection by the method, 7 peaks that were positive were assigned numbers.
【0037】参考例2 参考例1における7つのピークフラクション、および実
施例6で得られた12のピークフラクションについてア
ミノ酸配列分析を行ったところ、表1のような結果とな
った。(グリコシレーションサイトを下線部で、分析さ
れた配列を実線で、既知の報告から分かる配列を袋文字
で示した。) 表1において、左縦軸のピーク番号は、RCA消化物の
逆相クロマトグラフィーによって得られた陽性ピークフ
ラクション番号を示し、右縦軸は、RCA消化物のCo
nAアガロースカラムによるアフィニティクロマトグラ
フィーによって得られた陽性ピークフラクション番号を
示している。 Reference Example 2 The amino acid sequence analysis of the seven peak fractions in Reference Example 1 and the 12 peak fractions obtained in Example 6 gave the results shown in Table 1. (The glycosylation site is underlined, the analyzed sequence is shown by a solid line, and the sequence known from a known report is shown by blank letters.) In Table 1, the peak number on the left vertical axis is the reverse phase of the RCA digest. The positive peak fraction number obtained by chromatography is shown, and the right vertical axis shows the Co of the RCA digest.
The positive peak fraction number obtained by affinity chromatography on a nA agarose column is shown.
【0038】表1において、ピーク1,2,4はRCA
のB−85のハイマンノース型糖鎖がついているぺプチ
ド、ピーク3,5,6,7はRCAのB−135のハイ
マンノース型糖鎖がついているぺプチドであった。A−
10とB−73に結合しているコンプレックス型糖鎖
は、ConAアガロースカラムでは得られなかった。一
方、MMACコート法によればピーク31,44,5
1,66,67は、それぞれ、B−85、A−10、B
−135、A−10、A−10に相当し、ConAアガ
ロース法では検出できない糖ぺプチドを検出することが
できた。従って、MMAC固定化方法による糖鎖の検出
により、ConAアガロースカラムでは得られなかった
糖ぺプチドが検出できることが明らかとなった。なお、
アミノ酸配列分析はApplied Bionsystems のProtein se
quencer Model 476Aにて分析した。In Table 1, peaks 1, 2, and 4 are RCA.
Of B-85 with a high mannose type sugar chain, and peaks 3, 5, 6 and 7 were peptides with a high mannose type sugar chain of B-135 of RCA. A-
The complex type sugar chain bound to 10 and B-73 could not be obtained on the ConA agarose column. On the other hand, according to the MMAC coating method, peaks 31,44,5
1, 66 and 67 are B-85, A-10 and B, respectively.
Glycopeptides corresponding to -135, A-10 and A-10, which could not be detected by the ConA agarose method, could be detected. Therefore, it was revealed that by detecting the sugar chain by the MMAC immobilization method, a sugar peptide which could not be obtained by the ConA agarose column can be detected. In addition,
Amino acid sequence analysis is performed by Applied Bionsystems in Protein se.
Quencher Model 476A was used for analysis.
【0039】[0039]
【発明の効果】本発明の方法によれば、糖鎖を固相に共
有的に結合することによって、レクチン、抗体、糖分解
酵素などの糖認識能を有する物質との相互作用の解析を
行うことにより、簡便に且つ効率よく糖鎖構造を決定す
ることができる。さらに、従来法である固定化レクチン
を用いたクロマトグラフィーによって分析する方法では
検出されなかった糖鎖も、本発明方法によれば検出する
ことが可能である。また、微量多種の試料について一度
にそれらの糖鎖構造を決定することができる。本発明の
方法は、癌診断薬などの開発など糖鎖の関与が予想され
る方面での応用が期待される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the method of the present invention, by covalently binding a sugar chain to a solid phase, the interaction with a substance having a sugar recognizing ability such as a lectin, an antibody and a glycolytic enzyme is analyzed. Thus, the sugar chain structure can be determined easily and efficiently. Further, according to the method of the present invention, it is possible to detect a sugar chain which was not detected by the conventional method of analyzing by chromatography using immobilized lectin. In addition, it is possible to determine the sugar chain structures of various kinds of samples at one time. The method of the present invention is expected to be applied in fields where sugar chains are expected to be involved, such as the development of cancer diagnostic agents.
【0040】本発明の糖鎖構造を決定する方法、すなわ
ち、(1)複合糖質由来の糖鎖または糖ペプチドと、該
糖鎖または該糖ペプチドの分子末端基と反応して共有結
合を形成し得る反応基を有するポリマーでコーティング
した固相とを反応させて固定化糖鎖または固定化糖ペプ
チドを生成し、(2−1)該固定化糖鎖または固定化糖
ペプチドと、これらと特異的に結合する標識化された物
質とを反応させ、または(2−2)該固定化糖鎖または
固定化糖ペプチドと、これらと特異的に結合する結合用
物質とを反応させ、さらに、得られる生成物と、該結合
用物質と特異的に結合する標識物質とを反応させ、次い
で、(3)生成する標識化された固相を検出することを
特徴とする糖鎖構造を決定する方法 の好ましい態様をまとめると以下のとおりである。The method for determining the sugar chain structure of the present invention, that is, (1) a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate is reacted with the sugar chain or a molecular end group of the glycopeptide to form a covalent bond. Reacting with a solid phase coated with a polymer having a reactive group capable of producing an immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide, and (2-1) the immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide and a specific thereof. Reacting with a labeled substance that specifically binds, or (2-2) reacting the immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide with a binding substance that specifically binds to these, and further obtaining And a labeled substance that specifically binds to the binding substance, and then (3) detecting the labeled solid phase to be produced, for determining a sugar chain structure. The preferred embodiments of It is a cage.
【0041】(i) 上記(1)において、固相に固定化
すべき糖鎖および糖ぺプチドは複合糖質を酵素により消
化して調製する。 (ii)上記(1)において、共有結合を形成し得る反応
基がエポキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、ヒドラジノ
基、カルボキシル基、酸無水物基またはホルミル基であ
る。 (iii) 上記(1)において、反応基を有するポリマー
の分子量が400〜100万である。(I) In the above (1), the sugar chain and sugar peptide to be immobilized on the solid phase are prepared by digesting a complex sugar with an enzyme. (Ii) In the above (1), the reactive group capable of forming a covalent bond is an epoxy group, a halogen atom, an amino group, a hydrazino group, a carboxyl group, an acid anhydride group or a formyl group. (Iii) In the above (1), the polymer having a reactive group has a molecular weight of 400 to 1,000,000.
【0042】(iv)上記(2−1)において、標識化さ
れた物質が標識レクチンである。 (v) 上記(2−1)において、標識化された物質が標
識抗体である。 (vi)上記(2−2)において、結合用物質が標識化さ
れていないレクチンまたは抗体であり、また、該結合用
物質と特異的に結合する標識物質が標識化抗体、赤血球
またはポリマーラテックスである。(Iv) In (2-1) above, the labeled substance is a labeled lectin. (V) In (2-1) above, the labeled substance is a labeled antibody. (Vi) In the above (2-2), the binding substance is an unlabeled lectin or antibody, and the labeling substance that specifically binds to the binding substance is a labeled antibody, erythrocyte or polymer latex. is there.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図1】p−アミノフェニルグリコシドのプレートへの
固定化におけるコーティング用ポリマーおよび同グリコ
シド濃度のRCA固定化量(吸光度としても表示)に及
ぼす影響を示す。FIG. 1 shows the influence of a coating polymer and the concentration of the glycoside on immobilization of p-aminophenylglycoside on a plate, on the amount of RCA immobilization (expressed as absorbance).
【図2】p−アミノフェニルグリコシドの固定化におけ
る固定化時間および同グリコシド濃度のRCA固定化量
(吸光度としても表示)に及ぼす影響を示す。FIG. 2 shows the immobilization time in immobilization of p-aminophenylglycoside and the effect of the glycoside concentration on the amount of RCA immobilization (expressed as absorbance).
【図3】固定化p−アミノフェニルグリコシドに対する
HRP−レクチン(RCA)の反応時間および同グリコ
シド濃度のRCA固定化量(吸光度としても表示)に及
ぼす影響を示す。FIG. 3 shows the reaction time of HRP-lectin (RCA) to immobilized p-aminophenylglycoside and the effect of the glycoside concentration on the amount of RCA immobilized (expressed as absorbance).
【図4】p−アミノフェニルグリコシドに結合したレク
チン(RCA)の赤血球による検出において、MMAC
コートの有無および同グリコシド濃度のRCA固定化量
(吸光度としても表示)に及ぼす影響を示す。FIG. 4: MMAC in detection of lectin (RCA) bound to p-aminophenylglycoside by erythrocytes.
The effect of the presence or absence of a coat and the glycoside concentration on the amount of RCA immobilized (also expressed as absorbance) is shown.
【図5】抗体を用いたp−アミノフェニルグリコシドの
検出において、同グリコシド濃度のRCA固定化量(吸
光度としても表示)に及ぼす影響を示す。FIG. 5 shows the influence of the same glycoside concentration on the amount of RCA immobilized (also expressed as absorbance) in the detection of p-aminophenyl glycoside using an antibody.
【図6】RCAのトリプシン消化物の逆相高速液体クロ
マトグラフィーによる分析結果を示す。FIG. 6 shows the results of analysis of a tryptic digest of RCA by reverse phase high performance liquid chromatography.
【図7】RCA由来のペプチドフラクションを、MMA
CコートとBS3コートに固定化した結果を比較して示
す。FIG. 7: RCA-derived peptide fraction was analyzed using MMA
The results of immobilization on C coat and BS3 coat are shown for comparison.
【図8】RCAの消化物の、ConAアガロースカラム
によるアフィニティクロマトグラフィーによる分析結果
を示す。FIG. 8 shows the results of analysis of RCA digests by affinity chromatography on a ConA agarose column.
【表1】 [Table 1]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小川 温子 東京都目黒区中目黒二丁目2番30号111 (72)発明者 松本 勲武 千葉県浦安市美浜四丁目3番13号 (72)発明者 中山 珠美 神奈川県川崎市川崎区扇町5−1 昭和電 工株式会社化学品研究所内 (72)発明者 森口 征矢夫 東京都港区芝大門一丁目13番9号 昭和電 工株式会社内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Atsuko Ogawa 2-30, Nakameguro, Meguro-ku, Tokyo 111 (72) Inventor Isamu Matsumoto 4-3-13 Mihama, Urayasu, Chiba (72) Invention Person Tamami Nakayama 5-1 Ogimachi, Kawasaki-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa Prefecture Chemical Research Laboratory, Showa Denko KK (72) Inventor Seiya Moriguchi 1-13-9 Shibadaimon, Minato-ku, Tokyo Inside Showa Denko KK
Claims (2)
チドと、該糖鎖または該糖ペプチドの分子末端基と反応
して共有結合を形成し得る反応基を有するポリマーでコ
ーティングした固相とを反応させて固定化糖鎖または固
定化糖ペプチドを生成し、 (2)該固定化糖鎖または固定化糖ペプチドと、これら
と特異的に結合する標識化された物質とを反応させ、 (3)生成する標識化された固相を検出することを特徴
とする糖鎖構造を決定する方法。(1) A solid coated with a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate and a polymer having a reactive group capable of reacting with a molecular end group of the sugar chain or the glycopeptide to form a covalent bond. To produce an immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide, and (2) react the immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide with a labeled substance that specifically binds to these. (3) A method for determining a sugar chain structure, which comprises detecting the produced labeled solid phase.
チドと、該糖鎖または該糖ペプチドの分子末端基と反応
して共有結合を形成し得る反応基を有するポリマーでコ
ーティングした固相とを反応させて固定化糖鎖または固
定化糖ペプチドを生成し、 (2)該固定化糖鎖または固定化糖ペプチドと、これら
と特異的に結合する結合用物質とを反応させ、 (3)得られる生成物と、該結合用物質と特異的に結合
する標識物質とを反応させ、 (4)生成する標識化された固相を検出することを特徴
とする糖鎖構造を決定する方法。2. A solid coated with a sugar chain or glycopeptide derived from a glycoconjugate and a polymer having a reactive group capable of reacting with a molecular end group of the sugar chain or the glycopeptide to form a covalent bond. (2) reacting the immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide with a binding substance that specifically binds to the immobilized sugar chain or immobilized glycopeptide, 3) Determine the sugar chain structure characterized by reacting the obtained product with a labeling substance that specifically binds to the binding substance, and (4) detecting the labeled solid phase produced. Method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2589395A JPH08201383A (en) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Method for determining sugar chain structure |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08201383A true JPH08201383A (en) | 1996-08-09 |
Family
ID=12178479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2589395A Pending JPH08201383A (en) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Method for determining sugar chain structure |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH08201383A (en) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006258608A (en) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimadzu Corp | Sugar chain analyzing apparatus |
JPWO2005064327A1 (en) * | 2003-12-25 | 2007-07-19 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Glycan structure profiling technology |
JP2010096769A (en) * | 2002-06-03 | 2010-04-30 | Inst For Systems Biology | Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins |
US8008094B2 (en) | 2003-12-25 | 2011-08-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Methods for analyzing interactions between proteins and sugar chains |
US8597576B2 (en) | 2005-06-23 | 2013-12-03 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Analyzer for glycan or complex carbohydrate |
JP2014066532A (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-17 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Sugar chain fixing carrier, manufacturing method thereof and compound carrier in which sugar chain fixing carrier is fixed with sugar chain or sugar chain containing material |
-
1995
- 1995-01-20 JP JP2589395A patent/JPH08201383A/en active Pending
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