JPH07304799A - Human influenza virus-resistant antibody - Google Patents

Human influenza virus-resistant antibody

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JPH07304799A
JPH07304799A JP6117466A JP11746694A JPH07304799A JP H07304799 A JPH07304799 A JP H07304799A JP 6117466 A JP6117466 A JP 6117466A JP 11746694 A JP11746694 A JP 11746694A JP H07304799 A JPH07304799 A JP H07304799A
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Abstract

PURPOSE: To obtain the antibody specifically recognizing the specific sites of human influenza A type virus H3H subtype, capable of being used for diagnosing, preventing, etc., the crisis of influenza due to the infection of human influenza virus, and enabling the examination of a large amount of specimens in a short time.
CONSTITUTION: This novel antiviral antibody recognizes a TGMRN polypeptide sequence represented by formula I and a QINGKLNR(L/V)IEK polypeptide sequence represented by formula II (Xaa is Val, Leu) in the trunk region in the hemagglutinin molecule of a human influenza A type virus H3N2 subtype, does not recognize a TGLRN polypeptide sequence represented by formula III and a GITNKVNSVIEK polypeptide sequence represented by formula IV in the trunk region in the hemagglutinin molecule of the H1N1 subtype and H2N2 subtype of the human influenza A type virus, and a GITNKVNSVIEK polypeptide sequence represented by formula IV, is useful for diagnosing, preventing, etc., the infection of human influenza virus, enables to type a large amount of specimens in a short time, and enables to rapidly predict the prevalence of the influenza.
COPYRIGHT: (C)1995,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインフルエンザウイルスの感染による発症の診断、予防に利用される抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関する。 The present invention relates to the diagnosis of the onset due to infection of human influenza virus, it relates to an anti-human influenza virus antibodies to be used for prevention.

【0002】 [0002]

【従来の技術】インフルエンザウイルスには3つの型(A、B及びC)があり、インフルエンザの世界的な流行を起こし、多くの死者がでるのはA型のヒトインフルエンザウイルスによるものである。 Of the Related Art Influenza virus There are three types (A, B and C), cause pandemic influenza, is the out many deaths are due to type A human influenza virus. インフルエンザA型ウイルスは更にウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン( haemagglutinin:以下、HAと略す)及びノイラミニダーゼ(以下、NAと略す)の抗原性により多くのサブタイプに分類され、ヒトインフルエンザA型ウイルスとしてはH1N1サブクラス、H2N2サブクラス、H3N2サブクラスの3種が現在知られている。 Influenza A viruses are further viral surface proteins haemagglutinin (haemagglutinin: hereinafter, abbreviated as HA) and neuraminidase (hereinafter referred to as NA) are classified into a number of subtypes by antigenicity, as the human influenza A virus H1N1 subclass, H2N2 subclass, three of H3N2 subclasses are now known. これらのサブクラス中、H1N1サブクラス、H3N2サブクラスのウイルスが現在流行しているヒトインフルエンザA型ウイルスであり、H2N2サブクラスのウイルスは消滅し、1968年以降、日本においての分離例は無い。 During these subclasses, H1N1 subclass, is a human influenza type A virus H3N2 subclass of virus is currently circulating, H2N2 subclass of the virus disappears, since 1968, the separation example of in Japan is not. このインフルエンザA型ウイルスのHAは、球状部領域( head region ) と幹領域( stem region ) という二つの構造の異なった領域で構成され、球状部領域は、ウイルスが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含みHAの血球凝集活性に関与し、一方、幹領域は、ウイルスのエンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している〔ウイリー( Wiley ) ら、アニュアル レビュー オブ バイオケミストリー( Ann. Rev.Biochem. HA of the influenza A virus is composed of globular region (head region) and the stem region (stem region) that was in two different structural regions, globular region is receptive for the virus to bind to the target cell involved in hemagglutination activity of HA includes body binding site, while the stem region comprises a fusion peptide necessary for membrane fusion between the endosomal membrane envelope and the cell of the virus and is involved in fusion activity [Willy ( Wiley), et al., Annual review of Biochemistry (Ann. Rev.Biochem.
)、第56巻、第365〜394頁(1987)〕。 ), Vol. 56, pp. 365-394 (1987)].

【0003】 [0003]

【発明が解決しようとする課題】ヒトインフルエンザA The present invention is to provide a human influenza A
型ウイルスは周期的にHAとNAの型を変えて大流行を引起こし、インフルエンザの流行期である冬期前にワクチン接種を受けても、別の型のウイルスによるインフルエンザが流行するためワクチンの効果が期待できないことが多い。 Type virus periodically strained causing outbreaks by changing the type of HA and NA, even vaccinated before winter is epidemic season of influenza vaccine efficacy for influenza caused by another type of virus epidemics but often it can not be expected. しかし、HA分子やNA分子中の、ウイルスのサブタイプに共通で、抗原変異の生じ難い抗原部位、 However, in the HA molecules and NA molecules, a common subtype of the virus, hard antigenic sites occur antigenic variation,
特に立体構造を認識する抗体を得ることができれば、この抗体はA型ウイルスの感染による発症の診断、予防に利用できる。 Especially if it is possible to obtain an antibody that recognizes a conformation, the antibody diagnostic of onset by infection with type A virus, can be used for prevention. 本発明の目的は、ヒトインフルエンザA型ウイルスのサブタイプを特異的に認識する抗体、該抗体を用いるヒトインフルエンザウイルスの検出方法、及び該方法に使用するキットを提供することにある。 An object of the present invention is to provide human influenza A type virus antibody specifically recognizing the subtypes, the detection method of a human influenza virus using the antibodies, and kits for use in the method.

【0004】 [0004]

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関し、下記特性(a)及び(b)を有することを特徴とする。 If outlined present invention According to an aspect of the first invention of the present invention relates to anti-human influenza virus antibody, and having the following characteristics (a) and (b). (a)ヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N2サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号1で表されるTGMRNポリペプチド配列と配列表の配列番号2で表されるQINGKLNR(L/V)I (A) QINGKLNR represented by SEQ ID NO: 2 of TGMRN polypeptide sequence to the sequence table shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the stem region in hemagglutinin molecules of H3N2 subtype of human influenza A virus (L / V ) I
EKポリペプチド配列とを認識する。 Recognize and EK polypeptide sequence. (b)ヒトインフルエンザA型ウイルスのH1N1サブタイプとH2N2サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号3で表されるTGLRNポリペプチド配列と、配列表の配列番号4で表されるGIT (B) a TGLRN polypeptide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing of the stem region in hemagglutinin molecules of H1N1 subtype and H2N2 subtype of human influenza A virus, represented by SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing GIT
NKVNSVIEKポリペプチド配列とを認識しない。 NKVNSVIEK do not recognize the polypeptide sequence. また本発明の第2の発明はヒトインフルエンザウイルスの検出方法に関し、本発明の第1の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をH3N2サブタイプのヒトインフルエンザウイルスに結合させる工程を包含することを特徴とする。 The second aspect of the present invention relates to a method for the detection of human influenza virus, characterized in that it comprises a first step of the anti-human influenza virus antibody coupled to H3N2 subtype of human influenza virus of the invention of the present invention . 更に本発明の第3の発明は、本発明の第2 A third aspect of the present invention, the second invention
の発明の方法を用いて検出を行うためのヒトインフルエンザウイルス検出キットに関し、本発明の第1の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有していることを特徴とする。 Relates human influenza virus detection kit for the detection using the method of the invention is characterized by containing the anti-human influenza virus antibody of the first aspect of the present invention.

【0005】本発明者らは鋭意研究の結果、ヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N2サブタイプの幹領域に、共通に保存された抗原部位に対する抗体を得ることに成功し、次に、該抗体がヒトインフルエンザA型ウイルスのH1N1サブタイプ、H2N2サブタイプに全く交さ認識性を示さないことより、H3N2サブタイプの確定診断に有用であることを見出し、本発明を完成した。 [0005] The present inventors have conducted intensive studies, to the stem region of the H3N2 subtype of human influenza A virus, succeeded in obtaining an antibody against antigenic site that is stored in common, then, the antibody is human H1N1 subtype of influenza a virus, than to show no interlinked recognizability in H2N2 subtype, found to be useful for the definitive diagnosis of H3N2 subtype, and completed the present invention.

【0006】ヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N [0006] of human influenza A virus H3N
2サブタイプのHA分子幹領域中の共通部位を特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体として、次の様に調製することができる。 2 subtype of antibody that specifically recognizes a common site of HA molecules in the stem region, as monoclonal antibodies can be prepared as follows. 例えばマウス、モルモット、ウサギのような、ほ乳動物を下記抗原で免疫する。 Such as mice, guinea pigs, such as rabbits, immunizing mammals with the following antigens. 抗原としては次のような物質を使用することができる。 Antigens may be used materials such as the following. H3N H3N
2サブタイプ、例えばA/Fukuoka /C29/85、A 2 subtypes, for example A / Fukuoka / C29 / 85, A
/Sichuan /2/87、A/Ibaraki /1/90、A/ / Sichuan / 2/87, A / Ibaraki / 1/90, A /
Suita /1/90(以上、大阪大学微生物病研究所保存株)、A/Port Chalmers /1/73〔インフルエンザA(H3N2)、ATCC VR−810〕、A2/Ai Suita / 1/90 (or more, Osaka University Research Institute for Microbial Diseases, stocks), A / Port Chalmers / 1/73 [influenza A (H3N2), ATCC VR-810], A2 / Ai
chi /2/68〔インフルエンザA、ATCC VR− chi / 2/68 [influenza A, ATCC VR-
547〕より選択されるウイルス粒子を使用することができる。 The viral particles selected from the 547] can be used. あるいはこれらのウイルスから得られるHA分子、若しくは遺伝子組換え技術を用いて調製されるHA HA prepared or with HA molecules, or genetic recombination technology resulting from these viruses
ポリペプチド、若しくは本発明の抗体の認識部位、すなわちHA分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する組換えポリペプチド、又はHA分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する合成ポリペプチドで免疫することができる。 Polypeptide, or recognition site of an antibody of the invention, namely synthetic containing recombinant polypeptide containing antigenic sites of the stem region in HA molecule in the molecule, or an antigen site of the stem region in HA molecule in the molecule it can be immunized with a polypeptide.

【0007】次に免疫動物より得られた脾臓細胞を、例えばマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られるハイブリドーマから、下記(A)〜(C)の性質を有する抗体を産生する細胞を選択し、該細胞を培養することによって調製することができる。 [0007] The next Spleen cells obtained from immunized animals, for example, fused with mouse myeloma cells from the resulting hybridomas to select the cells which produce antibodies having the following properties (A) ~ (C), it can be prepared by culturing the cells. (A)H3N2のサブタイプウイルスに結合性を有する。 (A) capable of binding to subtype virus H3N2. (B)H1N1サブタイプ及びH2N2サブタイプのウイルス、H1N1サブタイプとしては例えばA/Bangko (B) H1N1 and H2N2 subtypes of the virus, the H1N1 subtype for example A / Bangko
k /10/83、A/Yamagata/120/86、A/Os k / 10/83, A / Yamagata / 120/86, A / Os
aka /930/88、A/Suita /1/89(以上、大阪大学微生物病研究所保存株)、A/PR/8/34 aka / 930/88, A / Suita / 1/89 (or more, Osaka University Research Institute for Microbial Diseases, stocks), A / PR / 8/34
〔インフルエンザ(H1N1)、ATCCVR−9 [Flu (H1N1), ATCCVR-9
5〕、A1/FM/1/47〔インフルエンザA(H1 5], A1 / FM / 1/47 [influenza A (H1
N1)、ATCC VR−97〕、A/New Jersey/8 N1), ATCC VR-97], A / New Jersey / 8
/76〔インフルエンザA(H1N1)、ATCC V / 76 [influenza A (H1N1), ATCC V
R−897〕、A/NWS/33〔インフルエンザA R-897], A / NWS / 33 [influenza A
(H1N1)、ATCC VR−219〕、A/Weiss (H1N1), ATCC VR-219], A / Weiss
/43〔インフルエンザA(H1N1)、ATCC V / 43 [influenza A (H1N1), ATCC V
R−96〕、A/WS/33〔インフルエンザA(H1 R-96], A / WS / 33 [influenza A (H1
N1)、ATCC VR−825〕、H2N2サブタイプとしては例えばA/Okuda/57、A/Adachi/2/ N1), ATCC VR-825], as the H2N2 subtype for example A / Okuda / 57, A / Adachi / 2 /
57、A/Kumamoto/1 /65、A/Kaizuka /2/6 57, A / Kumamoto / 1/65, A / Kaizuka / 2/6
5、A/Izumi /5/65(以上、大阪大学微生物病研究所保存株)、A2/Japan /305/57〔インフルエンザA(H2N2)、ATCC VR−100〕、及びB型のウイルス、例えばB/Nagasaki/1/87(大阪大学微生物病研究所保存株)、B/Allen /45〔インフルエンザB、ATCC VR−102〕には結合性を有さない。 5, A / Izumi / 5/65 (or, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University stocks), A2 / Japan / 305/57 [influenza A (H2N2), ATCC VR-100], and B-type virus, e.g., B / Nagasaki / 1/87 (Research Institute for microbial diseases, Osaka University stocks), B / Allen / 45 [influenza B, ATCC VR-102] to no binding.

【0008】HA分子幹領域中に配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号5又は6 [0008] amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing in the HA molecule stem region, and SEQ ID NO: 5 or 6
で表されるアミノ酸配列を有するヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばA/duck/Czechoslovakia/1/ In non-human having an amino acid sequence represented by the influenza virus, for example A / duck / Czechoslovakia / 1 /
56(H4N6)、A/chiken/Germany “N”/49 56 (H4N6), A / chiken / Germany "N" / 49
(H10N7)(以上、大阪大学微生物病研究所保存株)には結合性を有し、これらのアミノ酸配列を有さないヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばA/whis (H10N7) (or, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University stocks) to have a binding, non-human does not have these amino acid sequences of influenza virus, for example A / whis
tling swan/Shimane /476/83(H5N3)、A tling swan / Shimane / 476/83 (H5N3), A
/whistling swan/Shimane /37/80(H6N / Whistling swan / Shimane / 37/80 (H6N
6)、A/tufted duck /Shimane /124R/80 6), A / tufted duck / Shimane / 124R / 80
(H7N7)、A/turkey/Ontario /6118/68 (H7N7), A / turkey / Ontario / 6118/68
(H8N4)、A/turkey/Wisconsin /66(H9N (H8N4), A / turkey / Wisconsin / 66 (H9N
2)、A/duck/England /56(H11N6)(以上、大阪大学微生物病研究所保存株)には結合性を有さない。 2), A / duck / England / 56 (H11N6) (or, no binding to the Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University stocks).

【0009】(C)H3N2サブタイプのHA分子は認識するが、HA分子中の球状部領域が関与する血球凝集活性は阻害しない。 [0009] (C) H3N2 subtype HA molecule recognized by, hemagglutination activity globular region in HA molecule is involved does not inhibit.

【0010】このハイブリドーマの調製に関しては、ネーチャー( Nature )、第256巻、第495〜497頁(1975)を基に行う。 [0010] For the preparation of this hybridoma, Nature (Nature), 256 vol performs pp 495-497 and (1975) to the group. 免疫用マウスとしては、Balb The immunity for the mouse, Balb
/c系マウス、Balb/c系マウスと他系マウスとのF1 F1 and / c mice, Balb / c mice and other mice
マウスなどが用いられる。 Mouse, etc. is used. 免疫はマウス1匹に対して、 Immunity against one mouse,
例えばウイルス粒子(100〜1000HA単位)を抗原として用い、2〜5月間に例えば3回行う。 For example using viral particles (100~1000HA unit) as an antigen, carried out 2-5 months for example 3 times. なおマウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。 Note sampling of breeding and spleen cells of mice in the conventional manner.

【0011】ミエローマ細胞としてはSP2/0−Ag [0011] Examples of the myeloma cells SP2 / 0-Ag
14(ATCC CRL1581)、p3×63Ag8 14 (ATCC CRL1581), p3 × 63Ag8
U. U. 1(ATCC CRL1597)、p3×63Ag 1 (ATCC CRL1597), p3 × 63Ag
8(ATCC TIB9)、p3×63−Ag8.65 8 (ATCC TIB9), p3 × 63-Ag8.65
3(ATCC CRL1580)等が好適に用いられる。 3 (ATCC CRL 1580) or the like is preferably used. 脾臓細胞とミエローマ細胞は1:1〜10:1の割合で混合し、融合はNaCl(約0.85%)、ジメチルスルホキシド〔10〜20%(v/v)〕及び分子量1 Spleen cells and myeloma cells is 1: 1 to 10 were mixed at a ratio of 1, fusion NaCl (about 0.85%), dimethyl sulfoxide [10~20% (v / v)] and molecular weight 1
000〜6000のポリエチレングリコールを含有するリン酸緩衝液(pH7.2〜7.4)中で、両細胞の混合物を35〜37℃で1〜5分間保温することによって行う。 Phosphate buffer containing polyethylene glycol 000-6000 (pH 7.2-7.4) in a mixture of both cells performed by incubating 5 minutes at 35 to 37 ° C.. 融合細胞の選択は、HAT培地を用い、生育してくる細胞として選択する。 Selection of fused cells, using HAT medium, which selects as a cell coming grown. 融合細胞のクローン化は限界希釈法にて少なくとも3回繰返して行う。 Cloning of fused cells is performed repeatedly at least three times by the limiting dilution method.

【0012】ハイブリドーマを通常の動物細胞と同様にして培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得ることができる。 [0012] When the hybridoma in the same manner as the conventional animal cell culture, it is possible to obtain an antibody of the present invention in the results medium. また該ハイブリドーマをプリスタン処理のヌードマウス、又はBalb/cマウスの腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができる。 Also it is possible to accumulate the antibody of the present invention in the ascites by growing and transplanting the hybridoma into the peritoneal cavity of nude mice, or Balb / c mice pristane-treated. すなわち、これらのマウス腹腔内にプリスタン0.5〜1mgを接種し、その後2〜3週目に腹腔に5×10 6 〜1×10 7個のハイブリドーマを移植する。 That is, pristane 0.5~1mg inoculated into the mice intraperitoneally, the abdominal cavity transplanting 5 × 10 6 ~1 × 10 7 hybridomas subsequent 2-3 weeks. 通常7〜10日後に腹水が蓄積し、これを採取する。 Ascites accumulated in the usually after 7 to 10 days, collecting the. 培養物及び腹水中のモノクローナル抗体は通常の手段で精製される。 Monoclonal antibodies of the culture and the ascites are purified by conventional means.

【0013】得られたモノクローナル抗体はH3N2サブタイプのHA分子の幹領域を認識し、詳細には以下の性状を有している。 [0013] The resulting monoclonal antibody recognizes the stem region of the H3N2 subtype HA molecule, in particular has the following properties.

【0014】(a)染色試験により、H3N2サブタイプで感染したMDCK細胞(ATCCCCL34)を認識し、H1N1サブタイプ及びH2N2サブタイプで感染したMDCK細胞は認識しない。 [0014] The (a) staining tests, recognizes MDCK cells (ATCCCCL34) infected with H3N2 subtype, MDCK cells infected with H1N1 and H2N2 subtypes do not recognize. 染色試験は4種類の抗体(本発明のモノクローナル抗体、ウサギ抗マウスイムノグロブリンG血清、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンG血清、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体)を用い、ジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジー(J.Clin. Microbiol ) 、第28巻、 Staining test 4 types of antibodies (monoclonal antibodies of the present invention, a rabbit anti-mouse immunoglobulin G serum, goat anti-rabbit immunoglobulin G serum, peroxidase - rabbit anti-peroxidase complex) used, Journal of Clinical Microbiology (J. Clin. Microbiol), Vol. 28,
第1308〜1313頁(1990)に記載の方法に準じ行う。 Performed according to the method described in pp. 1308-1313 (1990).

【0015】(b)免疫沈降法により、H3N2サブタイプのHA分子を認識し、H1N1サブタイプ及びH2 [0015] The (b) immunoprecipitation, recognizes the HA molecule of H3N2 subtype, H1N1 subtypes and H2
N2サブタイプのHA分子は認識しない。 N2 subtype of the HA molecule does not recognize.

【0016】(c)血球凝集試験において、H1N1サブタイプ、H2N2サブタイプ、H3N2サブタイプのそれぞれの血球凝集活性を阻害しない。 [0016] (c) In the haemagglutination test, H1N1 subtypes, H2N2 subtype, does not inhibit the respective hemagglutination activity of H3N2 subtype.

【0017】(d)HA分子をコードする遺伝子解析により特定される、H3N2サブタイプのHA分子中の幹領域に特有の共通保存領域を認識し、H1N1サブタイプ及びH2N2サブタイプのHA分子中の幹領域に特有の共通保存領域は認識しない。 The (d) The specified by genetic analysis encoding HA molecule recognizes a common conserved region characteristic to the stem regions in HA molecules of H3N2 subtype in HA molecules of H1N1 and H2N2 subtypes common storage area specific to the stem region does not recognize.

【0018】H3N2サブタイプのHA分子中の共通保存領域としては、ジャーナル オブビロロジー(J.Vi [0018] as a common storage area in the HA molecule of the H3N2 subtype, journal Obubiroroji (J.Vi
rology )、第67巻、第2552〜2558頁(199 rology), Vol. 67, pp. 2552-2558 (199
3)に記載のH3N2サブタイプのHA分子中の幹領域の配列表の配列番号1で表されるTGMRNポリペプチド配列と配列表の配列番号2で表されるQINGKLN QINGKLN represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing with TGMRN polypeptide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the stem region in HA molecule of H3N2 subtype according to 3)
R(L/V)IEKポリペプチド配列がある。 R (L / V) IEK polypeptide sequence is. 図1にH Figure 1 H
A分子中の三次構造の模式図〔前出ウイリーら〕、及びH3N2サブタイプのHA分子中の共通保存領域の位置を示す。 Schematic view of the tertiary structure in A molecule [supra Wiley et al.], And it shows the position of the common conserved regions in the H3N2 subtype HA molecule. 図中A領域、B領域で示す両ポリペプチド配列は、図1に示す様にHA分子中の幹領域の中央で互に近接して位置しており、抗体の一例のHybridoma AI3C A in the figure region, both the polypeptide sequence shown in B region, located close to one another at the center of the stem region in HA molecule as shown in Figure 1, an example of an antibody Hybridoma AI3C
(FERM BP−4516)の生産するモノクローナル抗体AI3Cは、該HA分子中の幹領域の配列表の配列番号1で表されるTGMRNポリペプチド配列と配列表の配列番号2で表されるQINGKLNR(L/V) Monoclonal antibodies AI3C for production (FERM BP-4516) is, QINGKLNR (L shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing with TGMRN polypeptide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the stem region in the HA molecule / V)
IEKポリペプチド配列とを認識する。 Recognize and IEK polypeptide sequence.

【0019】H1N1サブタイプ、及びH2N2サブタイプのHA分子中の共通保存領域としては、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載の、H1N1サブタイプ及びH2N2サブタイプのHA分子中の幹領域の配列表の配列番号3で表されるTGLRNポリペプチド配列と配列表の配列番号4で表されるGITNKVNSVIE The H1N1 subtype, and as the common conserved regions in HA molecules of H2N2 subtype, according to preceding Journal of Biroroji, H1N1 subtype and H2N2 sequences in the sequence listing of the stem region in subtypes of HA molecules GITNKVNSVIE represented by SEQ ID NO: 4 in sequence Listing and TGLRN polypeptide sequence represented by numbers 3
Kポリペプチド配列があるが、本発明の抗体はこれらの部位は認識しない。 There are K polypeptide sequences, these sites of antibody present invention does not recognize.

【0020】本発明により得られる抗体、又は抗体由来のFab、抗体をコードする遺伝子より調製した抗体、 [0020] Antibodies obtained according to the present invention, or an antibody-derived Fab, antibody prepared from a gene encoding an antibody,
Fab、Fv、scFv等はヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N2サブクラスのHA分子中の幹領域に特有の共通保存領域を特異的に認識する。 Fab, Fv, scFv and the like specifically recognizes a common conserved region characteristic to the stem regions in HA molecules of H3N2 subclass of human influenza A virus. したがって、球状部領域の抗原変異に全く影響されることなく、ヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N2サブクラスを特異的に検出することができ、ヒトインフルエンザウイルスによる発症の診断や予防のための、ヒトインフルエンザウイルスの検出、特に、流行中のウイルスをH1N1サブクラス、H3N2サブクラス、B型ウイルスにタイピングする際に有用である。 Accordingly, without being affected at all antigenic variation of the spherical region, it is possible to specifically detect the H3N2 subclass of human influenza A virus, for the diagnosis and prevention of onset by human influenza virus, human influenza virus detection, in particular, virus H1N1 subclasses epidemic, is useful in typing H3N2 subclass, the B-type virus.

【0021】ヒトインフルエンザウイルスの検出に際しては、ヒトインフルエンザA型ウイルスのH1N1サブクラス、H2N2サブクラスは認識し、H3N2サブクラスは認識しない抗体、例えばHybridoma C179(F [0021] In detection of human influenza virus, H1N1 subclass of human influenza A virus, H2N2 subclass aware, H3N2 subclass does not recognize the antibody, for example, Hybridoma C179 (F
ERM BP−4517)より産生され(特願平4−2 ERM BP-4517) are produced from the (Japanese Patent Application No. 4-2
72538号)、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載のモノクローナル抗体、C179と組合せ使用することにより、検体中のH1N1サブクラス、H2N2サブクラスとH3N2サブクラスの分別検出を簡便に行うことができる。 No. 72538), a monoclonal antibody according to preceding Journal of Biroroji, by using combination and C179, H1N1 subclasses in the sample, it is possible to easily perform the H2N2 subclasses and H3N2 subclasses fractionation detection. 更に抗B型ウイルス抗体を組合せることにより、流行中のヒトインフルエンザウイルス(H1N Further, by combining the anti-B virus antibody, human influenza viruses in epidemics (h1n
1サブタイプ、H3N2サブタイプ、B型ウイルス)のタイピングを正確、迅速、簡便に行うことができる。 1 subtype H3N2 subtype, the typing of B virus) accurately, quickly, can be easily performed.

【0022】本発明の抗体を用いるH3N2サブクラスの検出方法としては、従来この分野でよく知られた免疫測定法、すなわち酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ免疫比濁法、ラテックス凝集法等が使用でき、中でも酵素免疫測定法が、感度、簡便さにおいて最も実用的である。 [0022] Detection methods for H3N2 subclasses using antibodies present invention, conventionally well-known immunoassay in the art, i.e. an enzyme immunoassay, radioimmunoassay turbidimetric immunoassay, latex agglutination method and the like can be used, of these enzyme immunoassay methods, the sensitivity is the most practical in simplicity.

【0023】検体としては、うがい液より調製したウイルス液、鼻汁より調製したウイルス液、咽頭ぬぐい液より調製したウイルス液等を使用するのが最も簡便である。 [0023] As the sample, the virus solution prepared from mouthwash, virus solution prepared from nasal secretions, it is most convenient to use a virus solution like prepared from throat swab. 例えばウイルス液中のウイルスをヒトインフルエンザウイルス高感受性のMDCK細胞に感染させ、モノクローナル抗体AI3Cを用い、前出の染色試験を行うことにより、高感度、簡便にH3N2サブタイプを検出することができる。 For example the virus of viral solution was infected to MDCK cells of the human influenza virus hypersensitivity, using monoclonal antibodies AI3C, by performing the dyeing test, supra, high sensitivity, it is possible to easily detect the H3N2 subtype. この時、C179、抗B型ウイルス抗体と併用すれば、検体中のヒトインフルエンザウイルスの検出を効率よく行うことができる。 At this time, C179, when combined with the anti-B virus antibody, it is possible to efficiently detect the human influenza virus in a specimen. また各ウイルスが混合感染した場合の検体中からも、各型のウイルスを効率よく分別、検出することができる。 Also from a specimen when the virus was mixed infection, each type of virus efficiently fractionation, can be detected.

【0024】また本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有するキットを用いることにより、ヒトインフルエンザA型ウイルス、H3N2サブクラスの検出を簡便に行うことができる。 [0024] By using a kit containing an anti-human influenza virus antibodies of the present invention, the human influenza A virus, it is possible to easily perform detection of H3N2 subclass. なおキット中には、H1N1 It should be noted is in the kit, H1N1
サブクラス検出用のC179、B型ウイルス検出用の抗B血清を含有させることにより更に簡便に、ヒトインフルエンザウイルスを検出することができる。 Further simply by containing the anti-B serum for C179, B-type virus detection for subclasses detection, it is possible to detect the human influenza virus. なおキットに用いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。 Reagent used in the kit should be noted is may be in solution, it may be a freeze-dried product.

【0025】 [0025]

【実施例】以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 BRIEF DESCRIPTION by examples present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.

【0026】実施例1 1.ウイルスの調製 H1N1サブタイプとしてA/PR/8/34、A/Ba [0026] Example 1 1. A Preparation H1N1 subtype virus / PR / 8/34, A / Ba
ngkok /10/83、A/Yamagata/120/86、A ngkok / 10/83, A / Yamagata / 120/86, A
/Osaka /930/88、A/Suita /1/89、H2 / Osaka / 930/88, A / Suita / 1/89, H2
N2サブタイプとしてA/Okuda /57、A/Adachi/ N2 subtype as A / Okuda / 57, A / Adachi /
2/57、A/Kumamoto/1/65、A/Kaizuka /2 2/57, A / Kumamoto / 1/65, A / Kaizuka / 2
/65、A/Izumi /5/65、H3N2サブタイプとしてA2/Aichi /2/68、A/Fukuoka /C29/ / 65, A / Izumi / 5/65, H3N2 subtype as A2 / Aichi / 2/68, A / Fukuoka / C29 /
85、A/Sichuan /2/87、A/Ibaraki /1/9 85, A / Sichuan / 2/87, A / Ibaraki / 1/9
0、A/Suita /1/90、B型ウイルスとしてB/Na 0, A / Suita / 1/90, as B viruses B / Na
gasaki/1/87を用い、ヒト以外のインフルエンザウイルスとして、H4N6サブタイプとしてはA/duck/ Using gasaki / 1/87, as influenza viruses other than human, the H4N6 subtype A / duck /
Czechoslovakia/1/56、H5N3サブタイプとしてはA/whistling swan/Shimane /476/83、H6 Czechoslovakia / 1/56, H5N3 sub The types A / whistling swan / Shimane / 476/83, H6
N6サブタイプとしてはA/whistling swan/Shimane N6 sub as the type A / whistling swan / Shimane
/37/80、H7N7サブタイプとしてはA/turfte / 37/80, H7N7 sub The types A / turfte
d duck/Shimane /124R/80、H8N4サブタイプとしてはA/turkey/Ontario /6118/68、H d duck / Shimane / 124R / 80, H8N4 sub The types A / turkey / Ontario / 6118/68, H
9N2サブタイプとしてはA/turkey/Wisconsin /6 9N2 sub as the type A / turkey / Wisconsin / 6
6、H10N7サブタイプとしてはA/chicken /Germ 6, H10N7 sub as the type A / chicken / Germ
any “N”/49、H11N6サブタイプとしてはA/ any "N" / 49, H11N6 sub as the type A /
duck/England /56を用い、それぞれのウイルスを1 With duck / England / 56, the respective virus 1
1日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、34℃で4日間培養後、各ウイルス液を採取した。 It was inoculated into the allantoic cavity of embryonated chicken eggs at one day of age, after 4 days of culture at 34 ° C., were collected each virus solution.

【0027】2.モノクローナル抗体の調製 (1)実施例1−1で調製したA2/Aichi 2/68のウイルス(320HA単位)をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、1ヵ月間隔で、Balb/cマウス腹腔内注射により、2度免疫し、その1ヵ月後に、同抗原(320HA単位)のPBS懸濁液を用い腹腔内注射しブーストした。 [0027] 2. Preparation of monoclonal antibody (1) Virus (320HA units) of A2 / Aichi 2/68 prepared in Example 1-1 was suspended before use in Freund's complete adjuvant, at one month intervals, Balb / the c in mouse peritoneal injection, twice immunization, after the 1 month, were injected boosted intraperitoneally with PBS suspension of the same antigen (320HA units). その3日後に、マウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。 Three days later, the spleen was removed from the mice, and splenocytes were prepared. マウスミエローマとしてはp3 The mouse myeloma p3
×63Ag8を10%牛胎児血清添加DME培地で継代後2日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で洗浄し、調製した。 The × 63Ag8 those two days after subculture with 10% fetal calf serum-containing DME medium, washed with physiological saline before cell fusion, were prepared. 次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞数1:5の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、1ml Then spleen cells and myeloma cells the number cells were mixed at a ratio of 1: 5, the supernatant was removed by centrifugation, after sufficiently loosened precipitated cell mass, with stirring, 1 ml
の混合液〔ポリエチレングリコール−4000(2 Mixture of [polyethylene glycol -4000 (2
g)、MEM(2ml)、ジメチルスルホキシド〕に加え、5分間37℃に保温した後、液の全量が10mlになるようにゆっくりMEMを加えた。 g), MEM (2 ml), was added to dimethyl sulfoxide] After incubation for 5 minutes 37 ° C., the total amount of the solution was added slowly MEM to be 10 ml. 次に、遠心分離後、 Then, after centrifugation,
上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。 The supernatant was removed, the cells are gently loosen. これに正常培地〔PRMI−1640に牛胎児血清10%を加えたもの〕30mlを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細胞を懸濁した。 This normal medium [PRMI-1640 as supplemented with 10% fetal calf serum] 30ml was added and suspended gently cells using a measuring pipette.

【0028】懸濁液を96穴の培養プレートに分注し、 The suspension is dispensed into culture plates 96,
5%のCO 2を含む培養器中で、37℃で24時間培養した。 In incubator containing 5% CO 2, for 24 hours at 37 ° C.. 次にHAT培地を加え、10〜14日間培養した。 Then HAT medium was added, and cultured for 10 to 14 days. 続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。 Then take a part of the culture supernatants were screened hybridomas.

【0029】(2)インフルエンザA型ウイルスのH3 [0029] (2) of the influenza A virus H3
N2サブタイプに保存されているA領域、B領域に反応するモノクローナル抗体を得るために、希釈していない、上記培養上清を1次抗体として用い、3種のサブタイプ(H3N2、H10N7、H1N1)のそれぞれに感染したMDCK細胞の染色試験を行った。 N2 A region conserved subtype, in order to obtain a monoclonal antibody reactive to the B region, undiluted, using the culture supernatant as a primary antibody, three subtypes (H3N2, H10N7, H1N1 ) of staining was performed test of the infected MDCK cells, respectively. 染色試験は前出のジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジーに記載の方法に準じて行った。 Staining test was performed according to the method described in Journal of Clinical Microbiology, supra. すなわち96穴マイクロタイタープレート(ファルコン3072:ベクトン ディキンソン社製)上で、ヒトインフルエンザA型ウイルスの各サブタイプ株(H3N2:A2/Aichi /2 That 96-well microtiter plates (Falcon 3072: Becton Dickinson Co.) on, the human influenza A each subtype strain of virus (H3N2: A2 / Aichi / 2
/68、H10N7:A/chicken /Germany “N”/ / 68, H10N7: A / chicken / Germany "N" /
49、H1N1:A/PR/8/34)に感染させたM 49, H1N1: A / PR / 8/34) M infected with
DCK細胞を、PBS(pH7.4)で洗浄後、無水エタノールで室温下、10分間固定した。 The DCK cells were washed with PBS (pH 7.4), at room temperature with anhydrous ethanol, and fixed 10 minutes. 次にこれらの細胞を4種類の抗体〔モノクローナル抗体を含有する前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグロブリンG血清(オルガノテクニカ社製)の1000倍希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンG血清(オルガノテクニカ社製)の5 Then the culture supernatant, 1000-fold dilution of rabbit anti-mouse immunoglobulin G serum (manufactured by Organo Teknika), Goat anti-rabbit immunoglobulin G serum (organo Technica containing these cells four antibody [Monoclonal antibody 5 of the company, Ltd.)
00倍希釈液、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体(オルガノテクニカ社製)の1000倍希釈液〕で連続的に、37℃、30分間ずつ反応させ、処理細胞をPBSで洗浄した。 00-fold dilutions, peroxidase - rabbit anti-peroxidase complex successively with (Organo Teknika Co.) 1000-fold dilution of], 37 ° C., and reacted by 30 minutes, the treated cells were washed with PBS. 最後にペルオキシダーゼ反応を、0.01%のH 22と0.3mg/mlの3,3′−ジアミノベンジジン四塩酸のPBS溶液を用い、グラハム、カルノフスキー( Graham、Karnovsky ) の方法で行った。 Finally the peroxidase reaction, using 0.01% H 2 O 2 and 0.3 mg / ml of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in PBS, subjected Graham, in the method of the Karnofsky (Graham, Karnovsky) It was. 染色された細胞は通常の光学顕微鏡で観察し、H The stained cells were observed under normal optical microscope, H
3N2サブタイプ感染のMDCK細胞及びH10N7サブタイプ感染のMDCK細胞をそれぞれ認識する抗体を選抜した。 3N2 subtype infected MDCK cells and H10N7 subtypes infected MDCK cells were selected antibodies recognizing respectively. 次に該抗体産生の確認された細胞が増殖している穴の細胞を取り出し、限界希釈法を3回行い、目的の細胞をクローニングし、クローニングされたハイブリドーマ株をHybridoma AI3C、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をモノクローナル抗体AI3 Then removed cells of the hole has been identified that cell antibody production are growing three times the limiting dilution method, and cloning the target cell, the cloned hybridoma strains Hybridoma AI3C, the hybridoma is produced monoclonal antibody monoclonal antibody AI3
Cと命名した。 It was named C. なお、該モノクローナル抗体AI3Cの開発名はモノクロナール抗体F49である。 Incidentally, the development name of the monoclonal antibody AI3C is monoclonal antibody F 49.

【0030】このHybridoma AI3Cは、Hybridoma A [0030] This Hybridoma AI3C is, Hybridoma A
I3Cと表示して、工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM BP−4516として寄託されている。 Is displayed with I3C, the Agency life Institute of Advanced Industrial Science and Technology, it has been deposited as FERM BP-4516.

【0031】(3)プリスタン処理したBalb/cマウスに上記ハイブリドーマ株を5×10 6個/匹マウスの腹腔内に投与した。 [0031] (3) in Balb / c mice treated with pristane were administered the hybridoma strains 5 × 10 6 cells / animal in the peritoneal cavity of mice. 10〜21日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、3000rpm /5分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。 After 10 to 21 days, take ascites from mice ascites cancer was induced, the solid components were removed by centrifugation of 3000 rpm / 5 min, to prepare ascites fluid. 腹水液1ml中には約5mgのモノクローナル抗体AI3C(以下、単にAI3Cと略す)が含有されていた。 The ascites fluid 1ml about 5mg monoclonal antibody AI3C (hereinafter, simply referred to as AI3C) it was contained. AI3C AI3C
はプロテインA−セファロース4B(ファルマシア社製)で精製された。 It was purified on a protein A- Sepharose 4B (Pharmacia).

【0032】3.モノクローナル抗体の性状 (1)実施例1−2−(3)記載の腹水液の100倍希釈液を段階希釈し、実施例2−(2)記載の染色試験を行い、AI3Cの抗原認識性を検討した。 [0032] 3. Monoclonal antibodies of the properties (1) Example 1-2- (3) were serially diluted 100-fold dilution of the ascites fluid as described, subjected to dyeing test in Example 2 (2) wherein, AI3C It was investigated of antigen recognition properties. H1N1サブタイプとしてはA/PR/8/34、A/Bangkok /1 H1N1 The subtype A / PR / 8/34, A / Bangkok / 1
0/83、A/Yamagata/120/86、A/Osaka / 0/83, A / Yamagata / 120/86, A / Osaka /
930/88、A/Suita /1/89、A1/FM/1 930/88, A / Suita / 1/89, A1 / FM / 1
/47、H2N2サブタイプとしてはA/Okuda /5 / 47, as the H2N2 subtype A / Okuda / 5
7、A/Adachi/2/57、A/Kumamoto/1/65、 7, A / Adachi / 2/57, A / Kumamoto / 1/65,
A/Kaizuka /2/65、A/Izumi/5/65、H3 A / Kaizuka / 2/65, A / Izumi / 5/65, H3
N2サブタイプとしてA/Aichi /2/68、A/Fuku N2 subtypes as A / Aichi / 2/68, A / Fuku
oka /C29/85、A/Sichuan /2/87、A/Ib oka / C29 / 85, A / Sichuan / 2/87, A / Ib
araki /1/90、A/Suita/1/90、A/Kitakyu araki / 1/90, A / Suita / 1/90, A / Kitakyu
shu/159/93、更にインフルエンザB型ウイルスとしてB/Nagasaki/1/87を用い、ヒトインフルエンザウイルス以外の実施例1−1記載のウイルスも用いた。 shu / 159/93, further using B / Nagasaki / 1/87 as an influenza B virus was also used viruses in Example 1-1 described non-human influenza viruses. その結果を表1、表2に示す。 The results in Tables 1 and 2.

【0033】 [0033]

【表1】 表 1 ─────────────────────────────── ウ イ ル ス 染 色 力 価 ─────────────────────────────── H1N1サブタイプ A/PR/8/34 <400 A/Bangkok /10/83 <400 A/Yamagata/120/86 <400 A/Osaka /930/88 <400 A/Suita /1/89 <400 H2N2サブタイプ A/Okuda /57 <400 A/Adachi/2/57 <400 A/Kumamoto/1/65 <400 A/Kaizuka 2/65 <400 A/Izumi 5/65 <400 H3N2サブタイプ A2/Aichi /2/68 409600 A/Fukuoka /C29/85 102400 A/Sichuan /2/87 102400 A/Ibaraki /1/90 102400 A/Suita /1/90 102400 B [Table 1] Table 1 ─────────────────────────────── cormorant Lee ls e dyed color titers ───── ────────────────────────── H1N1 subtype A / PR / 8/34 <400 A / Bangkok / 10/83 <400 A / Yamagata / 120/86 <400 A / Osaka / 930/88 <400 A / Suita / 1/89 <400 H2N2 subtype A / Okuda / 57 <400 A / Adachi / 2/57 <400 A / Kumamoto / 1/65 <400 A / Kaizuka 2/65 <400 A / Izumi 5/65 <400 H3N2 subtype A2 / Aichi / 2/68 409600 A / Fukuoka / C29 / 85 102400 A / Sichuan / 2/87 102400 A / Ibaraki / 1 / 90 102400 A / Suita / 1/90 102400 B B/Nagasaki/1/87 <400 ─────────────────────────────── B / Nagasaki / 1/87 <400 ───────────────────────────────

【0034】 [0034]

【表2】 [Table 2]

【0035】表1、表2中の数字は実施例1−2− [0035] Table 1, the numbers in Table 2. Example 1-2-
(3)の腹水液の希釈倍数であり、染色力価は染色試験で細胞を染色可能な該腹水液の最大希釈倍数を示す。 (3) a dilution ratio of the ascites fluid, staining titer indicates the maximum dilution of the cells stainable of ascites water solution in the dyeing test. また表2中のA領域アミノ酸配列、B領域アミノ酸配列とは各サブタイプにおいてH3N2サブタイプのA領域、 The A region amino acid sequences in Table 2, H3N2 subtype A region in each subtype and B region amino acid sequence,
B領域にそれぞれ対応する領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号で示したものであり、配列表の配列番号1、 Each region B are those in which the amino acid sequence of the corresponding region in SEQ ID NO: of the Sequence Listing, of the sequence listing SEQ ID NO: 1,
及び配列番号5又は6で示すアミノ酸配列を有するサブタイプのウイルスをAI3Cは認識する。 And AI3C subtypes of the virus having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 recognizes.

【0036】以上、AI3CはすべてのH3N2サブタイプ及びA/duck/Czechoslovakia/1/56、A/ch The above, AI3C all H3N2 subtype and A / duck / Czechoslovakia / 1/56, A / ch
icken /Gevmany “N”/49を認識し、他のサブタイプ、B型ウイルスは認識しなかった。 Recognizes icken / Gevmany "N" / 49, the other subtypes, B-type virus did not recognize.

【0037】(2)抗体の血球凝集阻害活性(HI)は次の様に行った。 [0037] (2) hemagglutination inhibition activity of the antibody (HI) was carried out in the following manner. 抗体としては実施例1−(3)の腹水液を用い、該抗体は使用前に3倍容のレセプター分解酵素(RDE:武田薬品工業社製)溶液を加え、37℃、 Antibodies with ascites fluid of Example 1- (3), the antibody prior to use in three volumes of receptor enzyme (RDE: manufactured by Takeda Chemical Industries, Ltd.) was added, 37 ° C.,
18時間反応後、56℃、45分間の加熱処理でRDE After 18 hours the reaction, 56 ° C., RDE heat treatment of 45 minutes
を失活させ、最終的に腹水液の16倍希釈液として調製し、被検液とし、その段階希釈液を調製し、次に実施例1−1記載の各ウイルス(16HA単位)と混合し、室温で30分間反応させた。 The quenched finally prepared as a 16-fold dilution of the ascites fluid, the test solution was prepared the serial dilutions, then mixed as in Example 1-1 each virus according (16ha units) It was reacted at room temperature for 30 minutes. その後、ニワトリ赤血球を加えよく混和し、各ウイルスで赤血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を検討した。 Then, mixed well added chicken erythrocytes was investigated the effects of antibodies on the hemagglutination activity in the virus. AI3Cはすべてのサブタイプのウイルスの血球凝集活性に影響を与えなかった。 AI3C had no effect on blood cell aggregation activity of all of the sub-types of the virus.

【0038】4.エピトープの決定 AI3Cの認識タンパク質がHA分子であることを免疫沈降反応によって決定した。 [0038] 4. Recognizing protein epitopes determined AI3C was determined by immunoprecipitation that the HA molecule. すなわち、H3N2サブタイプのA2/Aichi /2/68を30分間MDCK細胞に吸着、感染させた後、培地中のメチオニンを10μCi That, H3N2 subtype A2 / Aichi / 2/68 adsorption for 30 minutes MDCK cells, after infection, methionine in the medium 10μCi
の「 35 S〕メチオニンで置換したMEMで24時間培養し、感染細胞を標識した。次に該細胞を集め、次にRI Cultured for 24 hours in MEM was replaced by "35 S] methionine, were labeled infected cell. Then collect the cells, then RI
PA緩衝液〔50mMトリス(pH7.4)、150mM N PA buffer [50mM Tris (pH7.4), 150mM N
aCl、1mM EDTA、1%ノニデットP−40、1 aCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40,1
%デオキシコール酸、0.1%SDS〕に再懸濁した。 % Deoxycholate, and resuspended in 0.1% SDS]. 続いて不溶物を遠心除去した後、上清を得た。 After centrifugation to remove insoluble matter followed to obtain a supernatant. 次に該上清をAI3Cと混合し、1時間、4℃で保温した後、プロテインA−セファロースCL4Bビーズを添加し、室温で2時間保持し、免疫沈降物をビーズに吸着させた。 Then the supernatant was mixed with AI3C, 1 hour, mixture was kept at 4 ° C., was added Protein A- Sepharose CL4B beads were held 2 hours at room temperature, the immunoprecipitate was adsorbed to the beads. 次に該ビーズを集め、RIPA緩衝液で5回洗浄した後、 Then collect the beads, washed 5 times with RIPA buffer,
沸騰し、AI3Cの結合タンパク質を遊離させた。 Boiling, to release the bound proteins AI3C. 次に該タンパク質のSDS−12.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを固定し、1Mサリチル酸ナトリウムに浸してから乾かし、オートラジオグラフィーを行った。 Then perform SDS-12.5% ​​polyacrylamide gel electrophoresis of the protein, the gel was fixed, dried from soaked in 1M sodium salicylate, autoradiography was performed. AI3Cの結合する標識タンパク質は、その電気泳動パターンより、A2/Aichi /2/68のHA分子と同定された。 Binding to labeled proteins AI3C, from the electrophoresis pattern was identified as HA molecule of A2 / Aichi / 2/68. 同様の試験をH1N1サブタイプ、H Similar tests H1N1 subtype, H
2N2サブタイプ、他のH3N2サブタイプ及び実施例1−1記載のB型ウイルス、ヒト以外のウイルスをそれぞれ用い行った。 2N2 subtypes, other H3N2 subtype and Example 1-1, wherein B virus, non-human viruses was performed using respectively. AI3CはすべてのH3N2サブタイプ、A/duck/Czechoslovakia/1/56、及びA/ch AI3C all H3N2 subtypes, A / duck / Czechoslovakia / 1/56, and A / ch
icken /Germany " N "/49のHA分子と特異的に免疫沈降した。 icken / Germany "N" / 49 were specifically immunoprecipitated with HA molecules. これらのウイルスのHA分子の幹領域に共通に保存されているアミノ酸配列は前出の配列番号1で表されるアミノ酸配列、及び配列番号2、5、6で表されるアミノ酸配列であり、AI3Cのエピトープはこの両アミノ酸配列と決定した。 Amino acid sequence conserved in common to the stem regions of HA molecules of these viruses is an amino acid sequence represented by amino acid sequence, and SEQ ID NO: 2, 5, 6 of SEQ ID NO: 1, supra, AI3C epitope of was determined that both of these amino acid sequences.

【0039】実施例2 1.C179の調製 プリスタン処理したBalb/cマウスにHybridoma C17 [0039] Hybridoma Preparation pristane-treated Balb / c mice of Example 2 1.C179 C17
9(FERM BP−4517)を5×10 6個/匹マウスの腹腔内に投与した。 9 was administered (FERM BP-4517) into the peritoneal cavity of 5 × 10 6 cells / mouse. 10〜21日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、3000rpm /5 After 10 to 21 days, take the ascites fluid from mouse ascites cancer was induced, 3000rpm / 5
分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。 The solid components were removed by minute centrifugation was prepared ascites fluid. 腹水液1ml中には約5mgのモノクローナル抗体C1 Monoclonal antibody C1 of about 5mg is in the ascites fluid 1ml
79(以下、単にC179と略す)が含有されていた。 79 (hereinafter, simply referred to as C179) was contained.
C179はプロテインA−セファロース4B(ファルマシア社製)で精製した。 C179 was purified on a protein A- Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia).

【0040】2.抗B型ウイルス抗体の調製 実施例1−1に記載のヒトインフルエンザB型ウイルス、B/Nagasaki/1/87の5000HA単位をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、1ヵ月間隔で、ウサギ筋肉内に注射し、二度免疫した。 [0040] 2. Human influenza B virus according to Preparation Example 1-1 of anti-B virus antibody, the 5000HA units of B / Nagasaki / 1/87 was suspended before use in Freund's complete adjuvant, one month interval in, was injected into the rabbit muscle, was twice immunity. 二度目の免疫の10日後に、心臓より全採血し、抗B型ウイルス血清を調製した。 After 10 days of the second time immunization, exsanguination from the heart, to prepare anti-B virus serum.

【0041】3.ヒトインフルエンザウイルス検出キットの作製 実施例1−2−(3)記載のAI3CのPBS溶液(1 [0041] 3. Preparation Example of human influenza virus detection kit 1-2- (3) of AI3C according PBS solution (1
mg/ml)1ml、実施例2−1記載のC179のPBS溶液(1mg/ml)1ml、及び実施例2−2記載の抗B型ウイルス血清1mlをそれぞれ5ml容のバイアルに分注し、 mg / ml) 1ml, PBS solution (1 mg / ml of C179 in Example 2-1 described) 1ml, and Example 2-2 Anti B virus serum 1ml according dispensed into vials 5ml volumes respectively,
凍結乾燥を行い、それぞれの凍結乾燥標品を得た。 And then freeze-dried to give each of the freeze-dried preparation. 次にこれらの標品と、抗体溶解、希釈用の1%ブロックエース(雪印社製)含有PBS100ml入バイアルを組合せ、ヒトインフルエンザウイルス検出キットを作製した。 Then with these preparations, the antibody dissolved, combined with 1% Block Ace (Snow Brand Milk Co., Ltd.) containing PBS100ml inlet vial for dilution, to produce a human influenza virus detection kit.

【0042】実施例3 1.臨床分離株のタイピング 1968年以降に患者より分離された分離株80株(大阪府立公衆衛生研究所保存株)のタイピングを行った。 [0042] was carried out in Example 3 1. typing of clinical isolates typing since 1968 to be separated from the patient the isolates 80 shares of (Osaka Prefectural Institute of Public Health stocks).
すなわち、96穴マイクロプレート(コーニング268 That is, 96-well microtiter plates (Corning 268
60)の各穴にMDCK細胞を1×10 4個ずつ分注し、翌日、各分離株のウイルス液25μlを1株につき3穴分注し、35℃、45分間保温し、ウイルスを感染させた。 60) dispensed in 1 × 10 4 cells MDCK cells to each well of the minute, the next day, the virus solution 25μl of each isolate dispensed 3 holes minute per share, 35 ° C., and kept for 45 minutes, infected with virus It was. 各穴をPBSで洗浄後、0.5%トラガカントゴム(和光純薬社製)、及び5μg/mlのトリプシンを含有するイーグルMEM100μlを添加した。 After washing each well with PBS, 0.5% tragacanth gum (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and was added to Eagle MEM100μl containing 5 [mu] g / ml trypsin. これを3 This 3
5℃で16時間保温した後、添加液を除去し、各穴をP 5 After incubation for 16 hours at ° C., to remove the additive solution, each hole P
BSで洗浄した。 And washed with BS. 次に各穴の細胞を、室温下、無水エタノールで10分間固定した。 Then for each well cells were fixed for 10 minutes at room temperature with anhydrous ethanol. 次に実施例2で作製したキットを用い、AI3C溶液(1mg/ml)の1000倍希釈液、C179溶液(1mg/ml)の1000倍希釈液、 Then using the kit prepared in Example 2, 1000-fold dilution of AI3C solution (1mg / ml), C179 1000-fold dilution of the solution (1 mg / ml),
抗B型血清(原血清濃度)の1000倍希釈液を調製し、これらの抗体希釈液を用い、各細胞の染色試験を行った。 1000-fold dilution of anti-B serum (original serum concentration) were prepared using these antibodies dilutions were stained test of each cell. すなわち、各分離株が感染した3穴のうち、1穴にはAI3C希釈液、他の1穴にはC179希釈液、残りの1穴には抗B型ウイルス血清希釈液の各100μl That is, of the 3 holes each isolate is infected, AI3C dilution in 1 hole, C179 dilutions other one well, each in the remaining one well of anti-B virus serum dilutions 100μl
をそれぞれの穴で反応させた後、ウサギ抗マウスイムノグロブリンG血清の1000倍希釈液100μl、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン血清の500倍希釈液100 After the mixture was reacted at each hole, a rabbit anti-mouse immunoglobulin 1000-fold dilution 100μl of G serum, 500-fold dilution of goat anti-rabbit immunoglobulin serum 100
μl、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体の1000倍希釈液100μlで連続的に、37 [mu] l, peroxidase - continuously at 1000-fold dilution 100μl of rabbit anti-peroxidase complex, 37
℃、30分間ずつ反応させ、処理細胞をPBSで洗浄した。 ° C., and reacted by 30 minutes, the treated cells were washed with PBS. 最後にペルオキシダーゼ反応を、0.01%のH 2 Last peroxidase reaction, the 0.01% H 2 O
2と0.3mg/mlの3,3′−ジアミノベンジジン四塩酸のPBS溶液100μlを用い、各細胞を染色し、各穴を水道水で洗浄し、乾燥させた。 Using 2 and 0.3 mg / ml of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride in PBS 100 [mu] l, were stained each cells were washed each well with tap water and dried. 染色させた細胞はフォーカスとして3穴のうち、いずれか1穴分に形成され、 Cells were stained among three holes as the focus is formed on any one hole component,
可視化できた。 I was able to visualize. 可視化が困難な場合は通常の光学顕微鏡で観察し、H1N1サブタイプ、H3N2サブタイプ及びB型のいずれかであるかのタイピングを行った。 If visualization is difficult to observe with an ordinary light microscope, H1N1 subtype, it was of typing is either H3N2 subtype and B-type. 該方法に従って行われたタイピングの結果を、従来法の血清学的に赤血球凝集抑制反応でタイピングされた結果と比較した。 The results of the typing performed according to the process, and compared with the results typed serologically hemagglutination inhibition reaction in the conventional method. その結果を下記表3に示す。 The results are shown in Table 3.

【0043】 [0043]

【表3】 表 3 ──────────────────────────────────── H1N1 H3N2 H1N1、H3N2混合 B型 ──────────────────────────────────── 従来法 24 35 − 21 本発明方法 22 35 2 21 ──────────────────────────────────── [Table 3] Table 3 ──────────────────────────────────── H1N1 H3N2 H1N1, H3N2 mixed type B ──────────────────────────────────── conventional method 24 35 - 21 present invention a method 22 35 2 21 ─ ───────────────────────────────────

【0044】表3に示す様に従来法ではH1N1サブタイプと判定されていた2分離株が、H1N1サブタイプとH3N2サブタイプのウイルスの混合物であることも判明し、本発明により各分離株のタイピングを正確に行うことができた。 [0044] 2 isolates have been determined to H1N1 subtype in the conventional method as shown in Table 3, also it has been found that a mixture of H1N1 subtype and H3N2 subtype virus, the present invention each isolate I was able to do the typing accurately.

【0045】なおフェレット免疫血清としては、A/Ku [0045] It should be noted that as ferret immune serum, A / Ku
mamoto/37/79(H1N1)、A/Bangkok /10 mamoto / 37/79 (H1N1), A / Bangkok / 10
/83(H1N1)、A/Yamagata/120/86(H / 83 (H1N1), A / Yamagata / 120/86 (H
1N1)でそれぞれフェレットを免疫して得たH1N1 In 1N1) was obtained by immunizing a ferret each H1N1
サブタイプ判定用血清、A/Ishikawa/7/32(H3 Subtype determination serum, A / Ishikawa / 7/32 (H3
N2)、A/Phillippin/2/82(H3N2)、A/ N2), A / Phillippin / 2/82 (H3N2), A /
Fukuoka /C29/85(H3N2)、A/Sichuan / Fukuoka / C29 / 85 (H3N2), A / Sichuan /
2/87(H3N2)でそれぞれフェレットを免疫して得たH3N2サブタイプ判定用血清、B/Singapore / H3N2 subtype determination sera obtained by immunizing ferrets respectively 2/87 (H3N2), B / Singapore /
222/79、B/Ibaraki /2/85、B/Yamagata 222/79, B / Ibaraki / 2/85, B / Yamagata
/16/88、B/Aichi /5/88でそれぞれフェレットを免疫して得たB型ウイルス判定用血清(以上、大阪府立公衆衛生研究所保有)を用いた。 / 16/88, B / Aichi / 5/88 in ferrets immunized obtained was B virus determination serum (or, Osaka Prefectural Institute of Public Health held) respectively were used.

【0046】2.臨床検体中のウイルスのタイピング 1993〜1994年発症の患者のうがい液10mlを4 [0046] 2. Of the patient's typing 1993 to the onset in 1994 of the virus in clinical specimens a mouthwash 10ml 4
℃、3000回転、30分間の遠心分離を行い、上澄液を調製した。 ° C., followed by centrifugation of 3000 rpm, 30 minutes to prepare a supernatant. 次にこの上澄液をウイルス液検体とし、実施例3−1に従い、ウイルス感染細胞の染色試験を行った。 Then the supernatant this was a virus liquid sample, according to Example 3-1, was subjected to dyeing test of virus-infected cells. すなわち、24穴マイクロプレート(コーニング2 That is, 24-well microtiter plates (Corning 2
58201)の各穴にMDCK細胞を1×10 4個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体0.8mlを1検体につき3 58201) dispensed in 1 × 10 4 cells MDCK cells to each well of the minute, the next day, the virus suspension sample 0.8ml per sample 3
穴分注し、35℃、45分間保温し、ウイルスを感染させた。 Dispensed hole min, 35 ° C., and kept for 45 minutes, were infected with the virus. 次に各穴をPBSで洗浄後、5μg/mlのトリプシンを含有するイーグルMEM1mlを添加した。 Then after washing each well with PBS, and added Eagle MEM1ml containing 5 [mu] g / ml trypsin. これを35℃で40時間保温後、添加液を除去し、各穴をPB After this 40 hour incubation at 35 ° C., to remove the additive solution, each hole PB
Sで洗浄し、以下、AI3C、C179、抗B型ウイルス血清を用い、各細胞の染色試験を行った。 Washed with S, below, AI3C, C179, using anti-B virus serum, were stained test of each cell. また、ウイルス感染後、35℃で4日間保温した各細胞についても、同様に染色試験を行った。 Further, after virus infection, for the respective cells were incubated for 4 days at 35 ° C., it was subjected to the same dyeing test. なお、従来法として、2 It should be noted that, as a conventional method, 2
4穴マイクロプレートの各穴にMDCK細胞を1×10 4-well microplate 1 × 10 MDCK cells in each well of
4個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体0.8mlを1検体につき4穴分注し、35℃、45分間保温し、ウイルスを感染させた。 Four by four dispensed, the next day, dispensed 4 holes min per sample liquid virus sample 0.8 ml, 35 ° C., and kept for 45 minutes, were infected with the virus.

【0047】各穴をPBSで洗浄後、5μg/mlのトリプシンを含有するイーグルMEM1mlを添加し、35 [0047] After washing each well with PBS, added Eagle MEM1ml containing 5 [mu] g / ml trypsin, 35
℃、4日間培養した。 ℃, were cultured for 4 days. 培養4日目に細胞変性を観察し、 Cytopathic observed on day 4 of culture,
変性のみられた検体につき当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。 It modified the observed specimen per measured hemagglutination activity of the cell culture fluid of the hole. また変性のみられなかった検体については再度、ウイルス液によるMDCK細胞感染を行い、4日後に再度細胞変性の有無を確認し、細胞変性のみられた検体は当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。 With respect to the samples were observed with denatured again performs MDCK cells infected by the virus liquid, to check for re-cytopathic after 4 days, the sample was observed with cytopathic hemagglutination activity of the cell culture fluid of the hole It was measured. すなわち、0.5%ヒヨコ赤血球50μlに細胞培養液50μlを混合し、30分後の凝集の有無より、 That is, by mixing cell culture fluid 50 [mu] l 0.5% chick red blood cells 50 [mu] l, than the presence or absence of aggregation after 30 minutes,
ヒトインフルエンザウイルスの有無を判定した。 To determine the presence or absence of the human influenza virus. ヒトインフルエンザウイルスの存在が確認された細胞培養液については、H1N1サブタイプ、H3N2サブタイプ、 For cell culture presence of human influenza virus was confirmed, H1N1 subtypes, H3N2 subtype,
B型ウイルス判定用のフェレット免疫血清、すなわち、 Ferret immune serum for determination B virus, i.e.,
A/Yamagata/32/89(H1N1)でフェレットを免疫して得たH1N1サブタイプ判定用血清、A/Osak A / Yamagata / 32/89 (H1N1) H1N1 subtype determination serum ferrets obtained by immunization with, A / Osak
a /1089/93(H3N2)、及びA/Kitakyushu a / 1089/93 (H3N2), and A / Kitakyushu
/159/93(H3N2)でそれぞれフェレットを免疫して得たH3N2サブタイプ判定用血清、B/Bangko / 159/93 (H3N2) in H3N2 subtype determination sera obtained by immunizing ferrets respectively, B / Bangko
k /63/90及びB/Mie /1/93でそれぞれフェレットを免疫し得たB型ウイルス判定用血清(以上、大阪府立公衆衛生研究所保有)を用い、該各血清の赤血球凝集抑制反応でタイピングを行った。 k / 63/90 and B / Mie / 1/93 in obtained immunized ferrets each B virus determination serum (or, Osaka Prefectural Institute of Public Health held) with, in hemagglutination inhibition reaction of the respective serum typing was performed. すなわち各血清2 That is, each serum 2
5μlごとに、細胞培養液25μlを添加し、37℃、 Each 5 [mu] l, were added the cell culture medium 25 [mu] l, 37 ° C.,
1時間保温した後、0.5%ヒヨコ赤血球50μlを混合し、30分後の凝集の有無より、ヒトインフルエンザウイルスのタイピングを行った。 After incubation for 1 hour, mixed with 0.5% chick red blood cells 50 [mu] l, than the presence or absence of aggregation after 30 minutes, was typing of human influenza virus. 本発明の方法と、従来法の結果を表4に示す。 And methods of the present invention, the results of the conventional method shown in Table 4.

【0048】 [0048]

【表4】 表 4 ──────────────────────────────────── H1N1 H3N2 B型 インフルエンザ ウイルス非検出 ──────────────────────────────────── 従来法 0 33 0 39 本発明方法 保温40時間 0 25 0 47 保温4日間 0 33 0 39 ──────────────────────────────────── [Table 4] Table 4 ──────────────────────────────────── H1N1 H3N2 B ​​type influenza virus non-detection ──────────────────────────────────── conventional method 0 33 0 39 present invention a method incubated 40 hours 0 25 0 47 insulation 4 days 0 33 0 39 ────────────────────────────────────

【0049】本発明方法ではうがい液より調製したウイルス液検体を細胞に感染後、2日後には、25/33 [0049] After infection the virus solution specimens prepared from mouthwash to cells in the present invention method, after 2 days, 25/33
(76%)をタイピングすることができ、更に保温を続けた場合、従来法のタイピングと結果が完全に一致し、 (76%) to be able to typing, further if continued incubation, typing the results of the conventional method is completely matched,
1993〜1994年に流行のウイルスはH3N2サブタイプと決定した。 Epidemic of the virus from 1993 to 1994, was determined to H3N2 subtype.

【0050】従来法において使用するフェレット血清は、流行中のヒトインフルエンザウイルス株を分離し、 The ferret serum to be used in the conventional method is to separate the human influenza virus strains in the outbreak,
フェレットを免疫し、調製して得ているため、ヒトインフルエンザウイルスの抗原性の変化により、その結合活性消失が生じること、よって常に、最新、複数の抗血清を準備する必要がある。 Were immunized ferrets, since obtained by preparing, by a change in the antigenicity of the human influenza virus, that its binding activity loss occurs, thus always needs to prepare Recently, several antisera. また、最近、フェレットが入手困難であり、自家繁殖の結果、高力価血清の調製が困難となっている。 In addition, recently, ferret is difficult to obtain, as a result of the self-breeding, the preparation of high-titer serum is difficult.

【0051】一方、本発明方法は、検体調製後、ウイルスの増殖力が強い場合は2日後に、タイピングが可能なこと、H1N1サブタイプ検出用抗体、H3N2サブタイプ検出用抗体が、それぞれのサブタイプの抗原変化の影響を受けないこと、高力価の抗体がモノクローナル抗体として常に安定して供給されること等で特に優れている。 Meanwhile, the present method, after the sample preparation, when the growth of the virus is strong after 2 days, it capable of typing, H1N1 subtype detection antibody, H3N2 subtype detection antibody, each sub not be affected by the type of antigen variation, high titers of antibodies are particularly excellent in such be always stably supplied as a monoclonal antibody.

【0052】 [0052]

【発明の効果】本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体、その検出方法及び本発明のキットを用いることにより、インフルエンザウイルス分離株だけでなく、患者のうがい液からも迅速に高感度でかつ正確にインフルエンザウイルスを検出でき、しかも、同時にタイピングを行うことができる。 Anti-human influenza virus antibodies of the present invention, by using the detection method and kit of the present invention, not only the influenza virus isolates, and accurately influenza rapid sensitive from gargle fluid of patients can detect the virus, moreover, it is possible to perform the typing at the same time. その結果、短時間に大量の検体のタイピングが可能となり、その年におけるインフルエンザの流行予測が迅速に行えることになる。 As a result, a short time it is possible to typing of a large amount of the specimen, the epidemic prediction of influenza in the year will be carried out quickly.

【0053】 [0053]

【配列表】 [Sequence Listing]

【0054】配列番号:1 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0054] SEQ ID NO: 1 Length of the sequence: 5 SEQ types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0055】配列番号:2 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント 配列の特徴:9番目のXaa はVal 又はLeu である。 [0055] SEQ ID NO: 2 sequence Length: 12 sequence types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide Fragment type: intermediate portion fragment sequence features: 9th Xaa is it is Val or Leu.

【0056】配列番号:3 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0056] SEQ ID NO: 3 Length of the sequence: 5 SEQ types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0057】配列番号:4 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0057] SEQ ID NO: 4 sequence Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0058】配列番号:5 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0058] SEQ ID NO: 5 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0059】配列番号:6 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0059] SEQ ID NO: 6 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0060】配列番号:7 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0060] SEQ ID NO: 7 Length of the sequence: 5 SEQ types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0061】配列番号:8 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0061] SEQ ID NO: 8 Length of sequence: 5 SEQ types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0062】配列番号:9 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0062] SEQ ID NO: 9 Length of sequence: 5 SEQ types: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0063】配列番号:10 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0063] SEQ ID NO: 10 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0064】配列番号:11 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0064] SEQ ID NO: 11 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0065】配列番号:12 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0065] SEQ ID NO: 12 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【0066】配列番号:13 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント [0066] SEQ ID NO: 13 SEQ Length: 12 Type of sequence: the number of amino acid chains: a single-stranded Topology: linear sequence type: peptide fragment type: intermediate portion fragment

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】ヘマグルチニン分子の三次構造の模式図である。 1 is a schematic view of the tertiary structure of hemagglutinin molecule.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12Q 1/70 9453−4B G01N 33/53 D 33/569 L //(C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 吉岡 広文 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 大島 淳 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内 ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 identification symbol Agency Docket No. FI art display portion C12Q 1/70 9453-4B G01N 33/53 D 33/569 L // (C12P 21/08 C12R 1 : 91) (72) inventor Hirofumi Yoshioka Otsu, Shiga Prefecture Seta 3-chome fourth No. 1 Takara Shuzo Co., Ltd. center within the Institute (72) inventor Atsushi Oshima Otsu, Shiga Prefecture Seta 3-chome fourth No. 1 Takara Shuzo Co., Ltd. central within the Institute (72) inventor Kato YunoSusumu Otsu, Shiga Prefecture Seta 3-chome fourth No. 1 Takara Shuzo Co., Ltd. center within the Institute

Claims (3)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 下記特性(a)及び(b)を有する抗ヒトインフルエンザウイルス抗体。 1. A anti human influenza virus antibody having the following characteristics (a) and (b). (a)ヒトインフルエンザA型ウイルスのH3N2サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号1で表されるTGMRNポリペプチド配列と配列表の配列番号2で表されるQINGKLNR(L/V)I (A) QINGKLNR represented by SEQ ID NO: 2 of TGMRN polypeptide sequence to the sequence table shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the stem region in hemagglutinin molecules of H3N2 subtype of human influenza A virus (L / V ) I
    EKポリペプチド配列とを認識する。 Recognize and EK polypeptide sequence. (b)ヒトインフルエンザA型ウイルスのH1N1サブタイプとH2N2サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号3で表されるTGLRNポリペプチド配列と、配列表の配列番号4で表されるGIT (B) a TGLRN polypeptide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing of the stem region in hemagglutinin molecules of H1N1 subtype and H2N2 subtype of human influenza A virus, represented by SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing GIT
    NKVNSVIEKポリペプチド配列とを認識しない。 NKVNSVIEK do not recognize the polypeptide sequence.
  2. 【請求項2】 請求項1記載の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をH3N2サブタイプのヒトインフルエンザA型ウイルスに結合させる工程を包含することを特徴とするヒトインフルエンザウイルスの検出方法。 2. A method of detecting human influenza viruses characterized in that it comprises the step of binding the anti-human influenza virus antibody according to claim 1, wherein the H3N2 subtype of human influenza A virus.
  3. 【請求項3】 請求項2記載の方法を用いて検出を行うための検出キットであって、請求項1記載の抗体を含有していることを特徴とするヒトインフルエンザウイルス検出キット。 3. A detection kit for the detection using the method of claim 2, wherein the human influenza virus detection kit, characterized by containing the antibody of claim 1, wherein.
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