JPH07301626A

JPH07301626A - クロマトグラフィーカラム、血清の前処理装置及び血清の前処理方法

Info

Publication number: JPH07301626A
Application number: JP6258508A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Sato; 利明佐藤; Norio Okuyama; 典生奥山; Tetsuro Ogawa; 哲朗小川; Tsuneo Hiraide; 恒男平出; Yoshiya Yoshida; 芳哉吉田; Hiroshi Nakayama; 洋中山
Original assignee: KANAGAWA PREF GOV; Kanagawa Prefecture; Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: KANAGAWA PREF GOV; Pentax Corp; Kanagawa Prefecture
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1994-10-24
Publication date: 1995-11-14
Anticipated expiration: 2015-05-29
Also published as: JP3045646B2

Abstract

(57)【要約】【目的】装填及び除去の容易な充填剤を用い、血清検
査に対する妨害物質を容易に除去しうる方法及び装置並
びに分離カラムを提供すること。【構成】カラム本体１の流路内に流体の通過を許す目
皿板４が設けられており、この目皿板４上に、流路の上
流側に位置させて１枚以上の機能性シート５が載置され
ていることを特徴とするクロマトグラフィーカラムであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ミニカラムとして好適
なクロマトグラフィーカラム、血清の前処理装置及び血
清の前処理方法に関する。

【０００２】

【従来技術及びその問題点】アパタイト等のリン酸カル
シウム系化合物が蛋白質に対して吸着作用を有すること
から、クロマトグラフィーカラムの充填剤としてリン酸
カルシウム系化合物粒子を用いることは既に知られてい
る。しかしながら、カラムにリン酸カルシウム系化合物
粒子を均一に充填するのは、煩雑であり、特に、ミニカ
ラムに充填するのは困難であった。また、抗原−抗体反
応を利用した血清検査を行うために、リン酸カルシウム
系化合物粒子を充填したクロマトグラフィーカラムを用
いるには、従来、遠心分離、エタノール沈殿、有機溶剤
抽出などの方法によって、血清からゴミ、細胞破砕物、
細胞内粒子などを除去するとともに、検査の妨げとなる
妨害物質の除去を行わなければならず、多大な時間と手
数を要していた。そのため、妨害物質を簡単な操作で短
時間に除去できる方法の開発が求められている。

【０００３】

【発明の目的】本発明は、前記従来技術の問題点を解決
し、装填及び除去の容易な充填剤を用い、血清検査に対
する妨害物質を容易に除去しうる分離カラム及び血清の
前処理方法を提供することを目的とするものである。

【０００４】

【発明の概要】本発明は、カラム充填剤としてリン酸カ
ルシウム系化合物を含有する機能性シートを用いること
によって上記目的を達成したものである。すなわち、本
発明のクロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィ
ーカラム本体の流路内に流体の通過を許す目皿板が設け
られており、この目皿板上に、流路の上流側に位置させ
て１枚以上の機能性シートが載置されていることを特徴
とする。

【０００５】本発明のクロマトグラフィーカラムにおい
て、目皿板上に置いた機能性シートの周縁からスリーブ
とカラム本体との間を通って試料液体が外部に漏れるの
を防止するため、機能性シートの周縁とスリーブの下端
とカラム本体の流路の内壁の間に横漏れ防止リングを設
置し、クロマトグラフィーカラムを組み立てたときにス
リーブを上から押圧することによってカラム内部を密閉
状態とできるようにするのが好ましい。

【０００６】また、本発明のカラムをミニカラムとして
構成する場合には、スリーブの液体流路の流入側を比較
的大きめの口径とし、その流入側から流出側に向かって
液体流路を先細に構成するのが好ましい。さらに、その
場合に、微量の液体が機能性シート上に迅速に拡散しう
るように、スリーブの底部には流路の先端を通る十文字
の溝を設けるのが好ましい。

【０００７】本発明のクロマトグラフィーカラムにおい
て、目皿板は機能性シートを支持するとともに、液体を
通過させうるものであれば、その材質、孔径などに特に
制限はなく、例えばステンレスやセラミックスから成る
ものなどが挙げられる。

【０００８】本発明に使用しうる機能性シートとは、Ｃ
ａ／Ｐ比＝０．８〜２．０のリン酸カルシウム系化合物
を１０〜８０重量％含有する機能紙又は機能性不織布で
ある。リン酸カルシウム系化合物の具体例としては、ハ
イドロキシアパタイト、フッ素アパタイト等の各種のア
パタイト、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウ
ム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウムなどが挙
げられ、これらは単独で又は混合物として使用すること
ができる。このような機能紙については、特開平２−１
０４６２３号公報に記載されているので、詳細な説明は
省くが、機能紙を製造する際の填料の添加方式として
は、内添方式と塗工方式とがあり、どちらの方法で製造
されたものでもよい。しかし、リン酸カルシウム系化合
物の吸着作用を発揮させるためには、該化合物が完全に
は被覆されていないことが必要である。リン酸カルシウ
ム系化合物を平均粒径０．１〜３０μｍの二次粒子から
成る粉末として用いるのが好ましい。平均粒径が０．１
μｍより小さいと、抄紙の際に抄紙機の網から水と共に
落下してしまい、３０μｍを超えると、重すぎて、均一
に分散することが困難となる。このような二次粒子は、
粒径１００Å〜１００００Åの一次粒子が凝集又は焼結
することによって形成される。さらに、填料として用い
る粒子は表面積が大きいことが望ましい。また、塗工方
式を採用する場合には、三次元網状構造を形成する接着
剤と組み合わせて原紙上に塗布しなければならない。

【０００９】機能性不織布は、原料繊維の少なくとも一
部に熱可塑性高分子繊維を用いて、上記のようなリン酸
カルシウム系化合物のスラリーで不織布を含浸するか、
抄紙技術又は塗工法により機能紙と同様の方法で製造す
ることができる。

【００１０】本発明において、機能性シートとして高温
高圧水蒸気滅菌されたものを使用することができる。こ
の滅菌は、一般に、１００℃（１．１kg／cm²、絶対圧
力）〜２００℃（１５．９kg／cm²、絶対圧力）で１〜
６０分行うのが好ましい。温度が１００℃未満では、滅
菌効果が得られず、２００℃を超えると、機能性シート
の紙又は不織布が変質する恐れがある。高温高圧水蒸気
での滅菌は、通常オートクレーブ中で行われ、オートク
レーブとしては、殊に医療用高圧蒸気滅菌器が好適であ
る。滅菌条件としては、一般に１２１℃、２．２kg／cm
²〜１３２℃、３．０kg／cm²の条件が適用される。

【００１１】上記のような機能性シートを目的に応じて
１枚以上目皿板上に載置して充填剤とすることができ
る。機能性シートの枚数を選択することにより、吸着能
を微弱な段階から多くの蛋白質を吸着できる高度な段階
まで容易に調整することができる。本発明のカラムを用
いれば、機能性シート１枚でもゴミ、細胞破砕物、細胞
内粒子などを除去でき、さらに、条件を適切に設定する
ことにより抗原−抗体反応を利用した血清検査に対する
妨害物質、殊に、高比重リポ蛋白（ＨＤＬコレステロー
ル）を吸着除去することができる。

【００１２】そのため、本発明のクロマトグラフィーカ
ラムは、血清の前処理装置として有用である。また、本
発明において充填剤として用いる機能性シートは蛋白質
に対して高い吸着能を有するが、ｐＨ６．９〜ｐＨ１０
の緩衝液で希釈した血清中の蛋白質を吸着せず、ＨＤＬ
コレステロールや油性物質を吸着することが判明した。

【００１３】したがって、本発明は、さらに、血清をｐ
Ｈ６．９〜１０、好ましくはｐＨ８〜１０の緩衝液で希
釈した後、本発明のクロマトグラフィーカラムの流入口
より注入し、機能性シートを通過させることを特徴とす
る血清の前処理方法を提供する。緩衝液としては、ｐＨ
６．９〜１０のものであれば、各種のものを用いること
ができるが、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸
カリウム緩衝液、トリスリン酸緩衝液などが好適であ
る。

【００１４】さらに、上記のように機能性シートは蛋白
質に対して高い吸着能を有するので、血清を機能性シー
トと接触させれば血清蛋白（免疫グロブリン）を機能性
シートに吸着させることができる。その際ＨＤＬコレス
テロール、油性物質などの抗原−抗体反応妨害物質も機
能性シート上に残るが、これらの妨害物質は水洗及び脱
水操作により機能性シートから除去されることが分かっ
た。したがって、水洗脱水後に機能性シートに吸着され
て残留する血清蛋白を緩衝液を用いて溶離すれば、その
溶離液中には抗原あるいは抗体が含まれるから、この溶
離液を抗原−抗体反応を利用した各種の血清検査に好適
に使用することができる。

【００１５】すなわち、本発明は、さらに、血清を機能
性シートと接触させて血清蛋白を機能性シートに吸着さ
せ、水洗及び脱水操作により機能性シートから抗原−抗
体反応阻害物質を除去した後、ｐＨ６．０〜６．８の緩
衝液により機能性シート内に残留する蛋白成分を溶離す
ることを特徴とする血清の前処理方法及びこの方法で得
た溶離液を抗原−抗体反応の試料として用いることを特
徴とする血清中の抗原又は抗体の検出方法を提供するも
のである。

【００１６】これらの方法に用いる機能性シートは、ク
ロマトグラフィーカラムに関して詳細に記載したのと同
一である。高温高圧水蒸気滅菌された機能性シートを用
いると、殊に、培養系の検査に使用する場合に微生物の
混入の恐れがなく、正確な検査結果を得ることができ
る。また、緩衝液としては、ｐＨ６．０〜６．８のもの
であれば、各種のものを用いることができ、例えば、リ
ン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス
リン酸緩衝液などが好適である。

【００１７】本発明の方法を適用しうる血清検査として
は、抗原−抗体反応を利用したものであれば、特に制限
はなく、例えば、ＲＡテスト（ラテックス凝集反応検
査）、ＡＳＯ検査、ＣＲＰ検査、ＨＢｓ抗原−抗体検
査、梅毒血清検査、エイズ検査など人間ドックでも行な
われる諸検査をはじめとして、赤血球凝集テスト、赤血
球凝集阻止テスト、細菌凝集テストなどが挙げられる。

【００１８】本発明は、さらに、１枚以上の機能性シー
ト、一端が封鎖されているプラスチックチューブ及びこ
のチューブ内に挿入して機能性シートを支持するスペー
サチューブから成ることを特徴とする血清の前処理キッ
トを提供する。ここで用いる機能性シートは、クロマト
グラフィーカラムに関して詳細に記載したのと同一であ
り、高温高圧水蒸気滅菌されたものでもよい。このキッ
トを用いて、プラスチックチューブ内にスペーサチュー
ブを挿入し、スペーサチューブ上に機能性シートを載
せ、この機能性シートに血清を滴下し、遠心分離後、水
洗及び脱水操作を行い、緩衝液での溶離を行なうことに
より、上記の本発明による血清の前処理を行なうことが
できる。

【００１９】

【発明の実施例】次に、図面を参照して本発明をさらに
詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるも
のではない。図１は、本発明の一実施例を示すクロマト
グラフィーカラムの分解説明図であり、図２は図１に示
したカラムを組み立てた状態で示す断面図である。この
クロマトグラフィーカラムは、カラム本体１と、スリー
ブ２と、押えナット３とを備えている。カラム本体１
は、上流側流路１ａと下流側流路１ｂを有し、上流側流
路１ａの底部に、段部１ｃが形成されている。上流側流
路１ａの外周には雄ねじ部１ｄが形成されている。上流
側流路１ａ内には、目皿板４、機能性シート５、及び機
能性シート５の周囲を囲繞する横漏れ防止リング６が挿
入される。押えナット３は、カラム本体１の雄ねじ部１
ｄに螺合される雌ねじ部３ａと軸孔３ｂを有し、カラム
本体１に螺合されると、スリーブ２をカラム本体１の段
部１ｃに向けて押圧する。従って、押えナット３を強く
締めると、横漏れ防止リング６と機能性シート５は、上
流側流路１ａ内に挿入されたスリーブ２の底面２ａによ
って目皿板４（段部１ｃ）に押し付けられて、固定され
る。

【００２０】図示したクロマトグラフィーカラムにおい
て、スリーブ２の液体流路は流入側から流出側に向かっ
て先細に形成されている。さらに、スリーブ２の底部
（流出端）２ａには該流路の先端を通る十文字状の溝２
ｂが設けられており、液体が良好に拡散するように構成
されている。

【００２１】図示したクロマトグラフィーカラムに所望
の枚数の機能性シートを装填し、カラムを組み立てる場
合には、上記の目皿板４上に機能性シート５を載置し、
該機能性シート５の外周に横漏れ防止リング６を嵌め、
押えナット３をカラム本体１にねじ結合することによっ
て組み立て完了となる。

【００２２】本発明のクロマトグラフィーカラムにおい
て、各部分の材質には特に制限はないが、スリーブ及び
横漏れ防止リングの材料としては、例えばテトラフルオ
ロエチレンコポリマーが挙げられ、カラム本体及びナッ
トの材料としては、ステンレススチールが挙げられる。
また、目皿板としては、ステンレス焼結フィルターなど
が挙げられる。

【００２３】参考例１針葉樹パルプと広葉樹パルプを７：３の重量比で混合
し、カナダ標準ろ水度が３６０ccとなるように叩解し
た。このパルプを水に分散させ、濃度０．３重量％のパ
ルプスラリーを調製し、湿式法で合成したＣａ／Ｐ比
１．６７、比表面積４５ｍ²／ｇ、平均粒径２μｍのハ
イドロキシアパタイトを０．７重量％添加し、ＪＩＳ−
Ｐ８２０９に準拠して抄紙した。得られた製品紙のハイ
ドロキシアパタイト含有率は７０重量％、坪量は４０ｇ
／ｍ²であった。この機能紙を以下、ＨＡｐ紙と記載す
る。

【００２４】参考例２平均粒径０．５５μｍ、比表面積５５ｍ²、Ｃａ／Ｐ比
１．６７の多孔質ハイドロキシアパタイト顆粒１０重量
％及びドデシル硫酸ナトリウム０．０５重量％を含む水
性分散液を作製した。この分散液で厚さ０．４ｍｍのポ
リエチレンから成る不織布を含浸した後、１３０℃の熱
風で乾燥させた。得られた不織布のハイドロキシアパタ
イト担持率は２０重量％であった。以下、この不織布を
ＨＡｐ不織布と記載する。

【００２５】実施例１正常人の血液を室温で６０分間放置し、１００００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、試料血清を得た。この血清を
５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で２倍の
容量に希釈し、その０．５ｍｌを図１に示したクロマト
グラフィーカラムに注入した。２本のクロマトグラフィ
ーカラムの一方にはＨＡｐ紙１枚を装填し、他方にはＨ
Ａｐ不織布を２枚重ねとして装填した。血清、ＨＡｐ紙
通過後の血清及びＨＡｐ不織布通過後の血清についてそ
れぞれ二次元電気泳動を行い、得られた電気泳動像をそ
れぞれ図３〜図５に示す。これらの図から、血清蛋白質
はほとんど変化しなかった（ほとんど吸着されなかっ
た）が、ＨＤＬコレステロールを示す図３のスポット
１、２、３及び５が図４及び図５で著しく減少してお
り、ＨＡｐ紙通過後の血清及びＨＡｐ不織布通過後の血
清は、様々な血清の検査に用いるのに好適なものとなっ
たことが判る。

【００２６】実施例２図１及び２に示した構造のクロマトグラフィーカラムに
おいて、孔径２μｍのステンレス焼結フィルターの上に
ＨＡｐ紙を１枚載置し、厚さ及び高さが１ｍｍの横漏れ
防止リングを設置してカラムを組み立て、該カラムをウ
ォータース・クロマトグラフ（Waters chromatograph）
（６００Ｅ、４９０及びPantos U−２２８）に取り付け
た。初期溶離液として１ｍＭリン酸二水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．８、０．３０ｍＭＣａＣｌ₂）から４０
０ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８、
０．１１ｍＭＣａＣｌ₂）への５分間直線濃度勾配法に
より高速液体クロマトグラフィーを行った。なお、流速
は１ｍｌ／分とし、各蛋白質の検出は、２８０ｎｍでの
吸光度の測定によって行なった。

【００２７】ウシ血清アルブミン１２μｇ／３μｌの水
溶液を試料溶液として上記のクロマトグラフィーを行っ
て得られた血清アルブミンの溶離曲線を図６に示す。リ
ゾチーム２０μｇ／５μｌの水溶液を試料溶液として上
記のクロマトグラフィーを行って得られたリゾチームの
溶離曲線を図７に示す。チトクロームｃ２０μｇ／５μ
ｌの水溶液を試料溶液として上記のクロマトグラフィー
を行って得られたチトクロームｃの溶離曲線を図８に示
す。

【００２８】実施例３ＨＡｐ紙１０枚をセットした以外は、実施例２と同じ条
件で高速液体クロマトグラフィーを行った。ウシ血清ア
ルブミン２０μｇ／５μｌの水溶液を試料溶液として上
記のクロマトグラフィーを行って得られた血清アルブミ
ンの溶離曲線を図９に示す。リゾチーム２０μｇ／５μ
ｌの水溶液を試料溶液として上記のクロマトグラフィー
を行って得られたリゾチームの溶離曲線を図１０に示
す。チトクロームｃ２０μｇ／５μｌの水溶液を試料溶
液として上記のクロマトグラフィーを行って得られたチ
トクロームｃの溶離曲線を図１１に示す。

【００２９】上記の高速液体クロマトグラフィーによ
り、ＨＡｐ紙１枚を使用した場合、血清アルブミンは大
部分が吸収されなかったが、１０枚を使用した場合には
負荷量のおよそ半分が吸着された。また、リゾチームは
ＨＡｐ紙１枚でも、負荷した大部分が吸着され、ＨＡｐ
紙１０枚を使用した場合には、負荷量の全量が吸着され
た。チトクロームｃは、ＨＡｐ紙１枚で負荷量の全量が
吸着された。いずれの蛋白質についても、球状ハイドロ
キシアパタイトや球状フッ素アパタイトを充填したカラ
ムを用いた場合とほぼ同等の結果を得ることができた。

【００３０】実施例４図１２は、本発明の血清の前処理キットの一例を示す説
明図である。このキットは、プラスチックチューブ１
０、スペーサチューブ１１及び機能性シート１２から成
り、プラスチックチューブ１０の開口部にはキャップ１
３が備えられている。

【００３１】機能性シートとして参考例１で製造したＨ
Ａｐ紙（一辺が２．５ｃｍの正方形）を１枚用いて、豚
血液中の日本脳炎抗体の血球凝集法による測定のための
前処理を行なった。比較のため、同じ大きさの濾紙（AD
VANTEC S1 B ）を用いた。これらを水洗した後、０．４
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中で洗い、再
び水洗して平衡化した。これらの上にそれぞれ豚血清１
０μｌを滴下した。豚血清としては、従来の測定方法に
より陽性であることが既知のものと、陰性であることが
既知のものとを使用した。それぞれ１分間、５分間ある
いは１０分間水洗後、図１２に示したプラスチックチュ
ーブ１０内に挿入したスペーサチューブ１１の上に置
き、キャップ１３で蓋をし、１０００ｒｐｍで３分間遠
心分離し、この濾液は捨てた。濾液中の免疫グロブリン
（ＩｇＧ、ＩｇＭ）及びコレステロールの濃度を測定
し、水洗後に残留する量を算出し、それらの残留率の経
時変化を図１３に示す。なお、ＩｇＧ及びＩｇＭの水洗
０分の値として、従来法により前処理した陽性血清の値
を使用した。また、コレステロールの測定には、検査キ
ット〔デタミナーＴＣ５５５、協和メデックス（株）〕
を使用した。

【００３２】なお、図１３において◎はＨＡｐ紙に残留
するＩｇＧ及びＩｇＭを示し、○はＨＡｐ紙に残留する
コレステロールを示し、◇は濾紙に残留するＩｇＧ及び
ＩｇＭを示し、△は濾紙に残留するコレステロールを示
す。

【００３３】次いで、ＨＡｐ紙上に０．４０Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．８、０．１２ｍＭＣａＣｌ
₂）２５μｌを滴下し、同様に遠心分離し、この操作を
２回行なって、合計５０μｌの濾液を集めた。この濾液
を血球凝集阻止反応テストの試料とした。このテストの
操作は、厚生省保健医療局の伝染病流行予測調査検査術
式（昭和６１年５月）に従った。

【００３４】比較のため、従来の前処理法、すなわち、
アセトン抽出、ガチョウ血球添加による非特異凝集素の
除去を行なった。この前処理には２４時間以上の時間が
必要であった。この前処理によって得られた血清を試料
として、上記血球凝集阻止反応テストを行なった。

【００３５】ＨＡｐ紙を用いて血清中から分離した溶液
の抗体価は、水洗５分のＨＡｐ紙の場合で既に、従来の
前処理法により得た血清中の抗体価と同じであった。図
１３から明らかなとおり、濾紙の場合、水洗後１０分で
免疫グロブリンの残留はなかったが、ＨＡｐ紙の場合に
は免疫グロブリンは１００％残留し、コレステロールは
５分水洗で５０％、１０分水洗で約４０％程度しか残留
していなかった。また、非特異凝集素については、水洗
１分間のＨＡｐ紙でも検出されなかったので、ＨＡｐ紙
に吸着されないと考えられる。したがって、本発明方法
により前処理された血清は、抗原−抗体反応を利用した
各種の検査に好適であり、微量で検査でき、また、本発
明による血清の前処理は、３０分前後で行なうことがで
き、従来法に比べて著しく短時間で、容易に行なうこと
ができる。

【００３６】実施例５参考例１で製造した１×３ｃｍのＨＡｐ紙を水洗した
後、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中
で洗い、再び水洗して平衡化した。乾燥後、ガラスシャ
ーレに入れてオートクレーブに入れ、１２１℃、１．２
気圧で２０分水蒸気滅菌し、使用直前に水で湿らせ、そ
の上に豚血清１０μｌを滴下した。豚血清としては、日
本脳炎ウイルス抗体に関して従来の測定方法により陽性
のものと陰性のものを使用した。５分間水洗後、遠心分
離用プラスチックチューブ（ポリスチレン製、容量１．
５ｍｌ）に移し、遠心分離した（ｒ＝５．５ｃｍ、１０
００ｒｐｍ、３分）。この濾液（濾液１と称する）を集
めた後、ＨＡｐ紙上に０．４０Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．８）３５μｌを添加し、同様に遠心分離
し、濾液（以下、濾液２と称する）を集めた。さらに、
ＨＡｐ紙上に０．４０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．８）３５μｌを添加し、同様に遠心分離する操作を
繰り返して、濾液（以下、濾液３、４及び５と称する）
を集めた。これらの濾液３５μｌのうちそれぞれ２５μ
ｌは、血球凝集阻止反応の試料とした。対照としては、
従来の前処理法、すなわち、アセトン抽出、ガチョウ血
球添加により非特異凝集素を除去した血清を用いた。血
球凝集阻止反応の操作は、厚生省保健医療局の伝染病流
行予測調査検査術式（昭和６１年５月）に従った。残り
の濾液１０μｌを電気泳動して、吸着した蛋白質を調べ
た。電気泳動法は、真鍋らの方法を用いた。検出は銀染
色法を用いた。

【００３７】滅菌していないＨＡｐ紙を用いて血清中か
ら分離した溶液の抗体価と、滅菌したＨＡｐ紙を用いて
血清中から分離した溶液の抗体価は、同じであった。滅
菌処理した場合も、滅菌しない場合と同様に、抗体は、
濾液２と濾液３とを合わせて９８％回収できた。濾液１
は０％、濾液４及び５は、それぞれ１％の回収率であっ
た。電気泳動した結果を、図１４〜１６に示す。図１４
は日本脳炎ウイルス抗体陽性の豚血清の二次元電気泳動
像を示す電気泳動パターンであり、図１５は未滅菌処理
ＨＡｐ紙を用いた場合の濾液２、図１６は滅菌処理した
ＨＡｐ紙を用いた場合の濾液２の二次元電気泳動像を示
す電気泳動パターンである。これらの電気泳動像を比較
したところ、アルブミンはＨＡｐ紙にほとんど吸着され
ていなかった。吸着した血清蛋白質の泳動像は、オート
クレーブ滅菌処理した場合も、滅菌処理しない場合と同
じであった。これらの結果から、ＨＡｐ紙は高温高圧水
蒸気滅菌しても性能を充分に維持していることが証明さ
れた。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、充填剤の吸着能を機能
性シートの枚数を適切に選択することにより容易に調整
することができ、その都度の用途に適した吸着能を有す
るクロマトグラフィーカラムとすることができる。ま
た、本発明のクロマトグラフィーカラムにｐＨ６．９〜
１０の緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、リン酸
カリウム緩衝液、トリスリン酸緩衝液などで希釈した血
清を注入することにより、抗原−抗体反応を利用した血
清検査の妨害物質である高比重リポ蛋白を選択的に吸着
除去することができるため、本発明のクロマトグラフィ
ーカラムは、血清検査のための血清の前処理に好適であ
り、血清の前処理装置として有用である。また、カラム
の充填剤として機能性シートを用いているので、装填及
び除去が極めて容易である。さらに、機能性シートに付
着したコレステロールなどの血清検査妨害物質を、水洗
により無視しうる程度に除去することができるため、血
清を機能性シートと直接接触させて血清蛋白を吸着させ
た後、水洗により妨害物質を除去し、緩衝液で血清蛋白
を溶離することにより、容易に血清検査に好適な血清を
得ることができる。すなわち、本発明によれば、極めて
短時間に簡単な操作で血清の前処理を行なうことができ
る。また、本発明に用いる機能性シートは、高温高圧水
蒸気滅菌してその吸着特性を維持するため、培養系の抗
体分離あるいは抗体検査に好適に使用することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例を示すクロマトグラフィーカ
ラムの分解説明図である。

【図２】図１に示したクロマトグラフィーカラムを組み
立てたときの断面図である。

【図３】未処理の血清の二次元電気泳動像を示す電気泳
動パターン図である。

【図４】実施例１におけるＨＡｐ紙通過後の血清の二次
元電気泳動像を示す電気泳動パターン図である。

【図５】実施例１におけるＨＡｐ紙通過後の血清の二次
元電気泳動像を示す電気泳動パターン図である。

【図６】実施例２で得られた血清アルブミンの溶離曲線
図である。

【図７】実施例２で得られたリゾチームの溶離曲線図で
ある。

【図８】実施例２で得られたチトクロームｃの溶離曲線
図である。

【図９】実施例３で得られた血清アルブミンの溶離曲線
図である。

【図１０】実施例３で得られたリゾチームの溶離曲線図
である。

【図１１】実施例３で得られたチトクロームｃの溶離曲
線図である。

【図１２】本発明の血清の前処理キットの一例を示す説
明図である。

【図１３】実施例４で行なった水洗後の免疫グロブリン
とコレステロールの残留率の経時変化を示すグラフ図で
ある。

【図１４】日本脳炎ウイルス抗体陽性の豚血清の二次元
電気泳動像を示す電気泳動パターン図である。

【図１５】実施例５において未滅菌処理ＨＡｐ紙を用い
た場合の濾液２の二次元電気泳動像を示す電気泳動パタ
ーン図である。

【図１６】実施例５において滅菌処理したＨＡｐ紙を用
いた場合の濾液２の二次元電気泳動像を示す電気泳動パ
ターン図である。

【符号の説明】

１カラム本体２スリーブ３押えナット４目皿板５機能性シート６横漏れ防止リング１０プラスチックチューブ１１スペーサチューブ１２機能性シート１３キャップ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小川哲朗東京都板橋区前野町２丁目36番９号旭光学工業株式会社内 (72)発明者平出恒男東京都板橋区前野町２丁目36番９号旭光学工業株式会社内 (72)発明者吉田芳哉神奈川県横浜市戸塚区戸塚町4699−１ (72)発明者中山洋東京都新宿区西早稲田２−７−６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】クロマトグラフィーカラム本体の流路内
に流体の通過を許す目皿板が設けられており、この目皿
板上に、流路の上流側に位置させて１枚以上の機能性シ
ートが載置されていることを特徴とするクロマトグラフ
ィーカラム。
【請求項２】機能性シートの周縁と上流側流路内に嵌
合されたスリーブの下端とカラム本体の流路の内壁の間
に横漏れ防止リングを設置した請求項１記載のクロマト
グラフィーカラム。
【請求項３】スリーブが流入側から流出側に向かって
先細となる液体流路を有し、スリーブの流出側端面には
流路の先端を通る十文字の溝が設けられている請求項１
又は２記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４】クロマトグラフィーカラム本体が上流側
流路と下流側流路を有し、上流側流路の底部には目皿板
を載置する段部が形成され、上流側流路の外周には雄ね
じ部が形成されており、この雄ねじ部と押えナットが結
合される請求項１、２又は３に記載のクロマトグラフィ
ーカラム。
【請求項５】機能性シートが、Ｃａ／Ｐ比＝０．８〜
２．０のリン酸カルシウム系化合物を１０〜８０重量％
含有する機能紙あるいは機能性不織布である請求項１記
載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項６】機能性シートが高温高圧水蒸気滅菌され
たものである請求項１記載のクロマトグラフィーカラ
ム。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のク
ロマトグラフィーカラムから成る血清の前処理装置。
【請求項８】血清をｐＨ６．９〜１０の緩衝液で希釈
した後、請求項１〜６のいずれか１項に記載のクロマト
グラフィーカラムに注入し、機能性シートを通過させる
ことを特徴とする血清の前処理方法。
【請求項９】ｐＨ８〜１０の緩衝液で希釈する請求項
８記載の血清の前処理方法。
【請求項１０】血清を機能性シートと接触させて血清
蛋白を機能性シートに吸着させ、水洗及び脱水操作によ
り機能性シートから抗原−抗体反応阻害物質を除去した
後、ｐＨ６．０〜６．８の緩衝液により機能性シート内
に残留する蛋白成分を溶離することを特徴とする血清の
前処理方法。
【請求項１１】緩衝液がトリスリン酸緩衝液、リン酸
ナトリウム緩衝液又はリン酸カリウム緩衝液である請求
項１０記載の血清の前処理方法。
【請求項１２】機能性シートが、Ｃａ／Ｐ比＝０．８
〜２．０のリン酸カルシウム系化合物を１０〜８０重量
％含有する機能紙あるいは機能性不織布である請求項１
０記載の血清の前処理方法。
【請求項１３】機能性シートが高温高圧水蒸気滅菌さ
れたものである請求項１０記載の血清の前処理方法。
【請求項１４】血清を機能性シートと接触させて血清
蛋白を機能性シートに吸着させ、水洗及び脱水操作によ
り機能性シートから抗原−抗体反応阻害物質を除去した
後、ｐＨ６．０〜６．８の緩衝液により機能性シート内
に残留する蛋白成分を溶離し、この溶離液を抗原−抗体
反応の試料として用いることを特徴とする血清中の抗原
又は抗体の検出方法。
【請求項１５】機能性シートが、Ｃａ／Ｐ比＝０．８
〜２．０のリン酸カルシウム系化合物を１０〜８０重量
％含有する機能紙あるいは機能性不織布である請求項１
３記載の血清中の抗原又は抗体の検出方法。
【請求項１６】機能性シートが高温高圧水蒸気滅菌さ
れたものである請求項１３記載の血清中の抗原又は抗体
の検出方法。
【請求項１７】１枚以上の機能性シート、一端が封鎖
されているプラスチックチューブ及びこのチューブ内に
挿入して機能性シートを支持するスペーサチューブから
成ることを特徴とする血清の前処理キット。
【請求項１８】機能性シートが、Ｃａ／Ｐ比＝０．８
〜２．０のリン酸カルシウム系化合物を１０〜８０重量
％含有する機能紙あるいは機能性不織布である請求項１
７記載の血清の前処理キット。
【請求項１９】機能性シートが高温高圧水蒸気滅菌さ
れたものである請求項１７記載の血清の前処理キット。