JPH0716094A - Production of single-stranded oligonucleotide having promoter sequence of rna polymerase - Google Patents

Production of single-stranded oligonucleotide having promoter sequence of rna polymerase

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JPH0716094A
JPH0716094A JP14360893A JP14360893A JPH0716094A JP H0716094 A JPH0716094 A JP H0716094A JP 14360893 A JP14360893 A JP 14360893A JP 14360893 A JP14360893 A JP 14360893A JP H0716094 A JPH0716094 A JP H0716094A
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JP
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primer
rna
single
sequence
polymerase
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JP14360893A
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Japanese (ja)
Inventor
Toshiya Aono
Motohiro Kondo
Yutaka Takarada
裕 宝田
元宏 近藤
利哉 青野
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
東洋紡績株式会社
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Abstract

PURPOSE:To obviate the necessity of troublesome heating treatment by hybridizing a peeling primer and a primer having the promoter sequence of RNA polymerase in a specific mode to the nucleic acid sequence followed by extension reaction using a DNA polymerase with helicase-like activity. CONSTITUTION:(A) A peeling primer and (B) a primer having the promoter sequence of RNA polymerase are hybridized to the nucleic acid sequence so as to situate the primer A toward 3'-side off the primer B. An extension reaction from the primer B is conducted by the action of DNA polymerase having helicase-like activity, and, furthermore, by the extension reaction from the primer A, the objective single-stranded oligonucleotide is separated.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明はRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドの製造法に関し、また該RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する特定核酸配列の増幅法に関する。 The present invention relates to an process for the preparation of single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase, also method for amplifying specific nucleic acid sequences using single stranded oligonucleotides with promoter sequences of the RNA polymerase on.

【0002】 [0002]

【従来の技術】ハイブリダイゼーションによる核酸の検出は、遺伝病、癌、感染症などの診断における有効な手段として汎用されるようになってきた。 Detection of nucleic acids by the Prior Art Hybridization genetic diseases, cancer, has come to be widely used as an effective means in the diagnosis of infectious diseases. しかしながら、 However,
特定核酸配列が非常に僅少な場合には、感度上の問題等によりその検出が困難である。 If the specific nucleic acid sequence is very slight, it is difficult that detecting the sensitivity problems such. そのため、特定核酸配列の増幅法の開発が試みられてきた。 Therefore, the development of method for amplifying specific nucleic acid sequences have been attempted. その最初の試みとして、目的とする核酸をDNAポリメラーゼにより増幅させる方法(特開昭61-274697号公報、以下PCR 法と略す)が開発された。 As a first attempt, a method of the nucleic acid of interest is amplified by DNA polymerase (JP 61-274697 and JP hereinafter abbreviated as PCR method) has been developed. しかしながら、PCR 法は、その原理上、特殊な温度制御装置を必要とし、増幅効率も2倍づつしか増幅できないという欠点を有している。 However, PCR method has the disadvantage that its principle, require special temperature controller, amplification efficiency even twice at a time can only amplify. またDN The DN
Aリガーゼを用いる増幅法(WO89/12696、特開平2-2934 Amplification methods using A ligase (WO89 / 12696, JP-A-2-2934
号公報など、以下LCR 法と略す)も考案されたがPCR 法と同様、特殊な温度制御装置と必要とする。 Such as JP, hereinafter referred to as LCR method) were also devised as with the PCR method requires a special temperature controller.

【0003】そこで、特殊な温度制御装置を必要とせず、効率よく遺伝子を増幅する方法が必要とされ、RN [0003] Therefore, without requiring a special temperature controller is required efficiently method of amplifying a gene, RN
Aポリメラーゼを用いた遺伝子増幅方法(特開平2-5864 Gene amplification method using A polymerase (JP-A 2-5864
号公報、特開平4-501057号公報など、以下NASBA法と略す)が開発された。 JP, etc. Hei 4-501057 discloses, hereinafter referred to as NASBA method) has been developed. NASBA法は、転写開始配列を有するプライマーと特定核酸配列をアニールさせ、DNAポリメラーゼで伸長反応後、熱をかけてRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。 NASBA method is a primer having a transcription initiation sequence is annealed to the specific nucleic acid sequence, after the extension reaction by DNA polymerase, to obtain a single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence by applying heat. その後、RNAポリメラーゼのプロモーター配列(転写開始配列)の性質を利用し、一定温度で遺伝子増幅反応を行うものである。 Then, by utilizing the property of the RNA polymerase promoter sequence (transcription initiation sequence), and performs a gene amplification reaction at a constant temperature. また、NASBA法はメッセンジャーRNAからの遺伝子増幅が可能である。 Also, NASBA method is capable of gene amplification from messenger RNA. この方法は、転写開始配列を有するプライマーを特定伝達RNA This method is particular transfer RNA primers having transcription initiation sequence
に結合し、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)で相補的DNAを合成後、リボヌクレアーゼ(RNase Bind to, after synthesizing a complementary DNA by RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase), a ribonuclease (RNase
H)処理で伝達RNAを分解し、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。 Decomposing the transfer RNA in H) process, obtaining a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase. その後、転写開始配列の性質を利用し一定温度で遺伝子増幅反応を行うものである。 Then, it performs a gene amplification reaction at a constant temperature by utilizing the properties of the transcription initiation sequence.

【0004】 [0004]

【発明が解決しようとする課題】上記のように、PCR法は特殊な温度制御装置と高価な耐熱性DNAポリメラーゼを必要とし、増幅効率も2倍づつしか増幅できないという欠点を有している。 As described above [0005], PCR method requires a special temperature controller and expensive thermostable DNA polymerase, has the disadvantage that the amplification efficiency can only amplify be doubled at a time. この欠点を解決すべくNASBA法が開発された。 NASBA method in order to solve this drawback has been developed. しかしながら、このNASBA法も反応の中間工程であるRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において、加熱処理(95℃で5分間処理後、冷却)を行わざるを得ず操作が煩雑となる。 However, in this NASBA method also obtaining a single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence which is an intermediate step of the reaction (after 5 minutes treatment at 95 ° C., cooling) heat treatment compelled not operation performed It becomes complicated. また、NASBA法は伝達RNAからの遺伝子増幅が可能であり、RNAリボヌクレアーゼの使用により煩雑な加熱処理を省略できるが、伝達RNAからの増幅法にのみ適用し、DNAからの増幅には適さない。 Also, NASBA method is capable of gene amplification from transfer RNA, can be omitted complicated heat treatment by the use of RNA ribonuclease, it applied only to the amplification method from transmission RNA, not suitable for amplification from DNA.

【0005】本発明の目的は、上記のような従来からの問題点を解決するものであり、その目的とするところは、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを得る工程において煩雑な加熱処理を必要としない簡便な製造法を提供することにある。 An object of the present invention is to solve the problems of the conventional as described above, it is an object of complicated in the step of obtaining a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase and to provide a simple manufacturing method that does not require heat treatment.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課題を解決すべく鋭意研究をすすめた結果、本発明に到達した。 Means for Solving the Problems The present inventors have results which recommend intensive studies to solve these problems, have reached the present invention. すなわち本発明は次の工程を含むことを特徴とするRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法である。 That is, the present invention is a process for producing a single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence, which comprises the following steps. (a)特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびRNA (A) the specific nucleic acid sequence, peeling primer and RNA
ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーをハイブリダイズさせる。 The first primer having a promoter sequence of the polymerase is hybridized. (ここで剥離用プライマーおよびRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1 (First with a promoter sequence peeling primer and RNA polymerase here
プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、 Primers can be attached to each complementary sequence of the specific nucleic acid sequence,
その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補的配列がRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーの特定核酸配列の相補的配列の3'側に存在する。 Its positional relationship complementary sequence of the specific nucleic acid sequence of peeling primer at the 3 'end of the complementary sequence of the specific nucleic acid sequence of the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase. ) (b)次いでヘリカーゼ様活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーからの伸長反応を行う。 ) (B) then using a DNA polymerase having a helicase-like activity, performing an elongation reaction from the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase. (c)さらに剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、 (C) further with the extension reaction from the release primers,
特定核酸配列からRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーと該第1プライマーからの伸長物で形成されるRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。 Separating the single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence which is formed by the extension product from the first primer and the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase from the specific nucleic acid sequence.

【0007】本発明では工程(b)および工程(c)が同時に行われることが好ましい。 [0007] It is preferable that step (b) and step (c) is carried out simultaneously in the present invention. また本発明のRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法では、工程(c)において形成されるRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1 In a method of producing a single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence of the present invention may also contain one having a promoter sequence of RNA polymerase formed in step (c)
本鎖オリゴヌクレオチドと特定核酸配列との二重鎖領域が、ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼの作用により、剥離用プライマーからの伸長反応にともない巻戻され、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドが特定核酸配列から分離されることが好ましい。 Duplex region of the specific nucleic acid sequence and the strand oligonucleotide, by the action of DNA polymerases with helicase-like activity, unwound with the extension reaction from the release primers, single strand having the RNA polymerase promoter sequence it is preferred that the oligonucleotide is separated from the specific nucleic acid sequence.

【0008】また本発明は次の工程を含むことを特徴とするRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを用いた特定核酸配列の増幅法である。 [0008] The present invention is a method for amplifying specific nucleic acid sequences using single stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase, characterized in that it comprises the following steps. (A)上記工程(a)〜工程(c)を経て得られたRN (A) said step (a) RN obtained through - step (c) is
Aポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドに第2プライマーをハイブリダイズさせる。 The second primer is hybridized to single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence A polymerase. (B)次いでDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、二重鎖DNAを合成した後、 (C)二重鎖DNAにRNAポリメラーゼを反応させて一重鎖RNAを複数合成する。 (B) then perform an extension reaction using a DNA polymerase, after synthesizing a double-stranded DNA, a plurality synthesizing single-stranded RNA is reacted with RNA polymerase (C) double-stranded DNA. (D)一重鎖RNAを鋳型として、第2プライマーをハイブリダイズさせる。 (D) a single-stranded RNA as a template, hybridizing a second primer. (E)次いでRNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、RNA−DNAハイブリッドを形成させる。 (E) then using RNA-dependent DNA polymerase to form a RNA-DNA hybrids. (F)RNA−DNAハイブリッドのRNA部分を分解し、一本鎖DNAを得る。 (F) to decompose the RNA portion of the RNA-DNA hybrid to obtain a single-stranded DNA. (G)得られた一本鎖DNAにRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーをハイブリダイズさせ、伸長反応を行い、二重鎖DNAを合成する。 (G) the single-stranded DNA obtained by hybridizing the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase performs an extension reaction, synthesizing a double-stranded DNA. (H)さらに工程(C)から(G)を繰り返して特定核酸配列を増幅する。 (H) further from step (C) repeating the (G) for amplifying a specific nucleic acid sequence.

【0009】以下に本発明に使用される用語を説明する。 [0009] To explain the terms used in the present invention are shown below. 「伸長反応」とは核酸配列に十分に相補的な配列をもつプライマーを核酸配列にハイブリダイズした後、D After the primer having a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence hybridizes to a nucleic acid sequence A "extension reaction", D
NAポリメラーゼとデオキシアデノシン5'−三リン酸(dATP)、デオキシシチジン5'−三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン5'−三リン酸(dGTP)、及びデオキシチミジン5'−三リン酸(dTTP)の存在下、プライマーにデオキシヌクレオチドを共有結合し、核酸配列に相補的なDNA配列を順次合成する反応である。 NA polymerase deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP), deoxycytidine 5'-triphosphate (dCTP), deoxyguanosine 5'-triphosphate (dGTP), and deoxythymidine 5'-triphosphate (dTTP the presence of) the deoxynucleotide covalently attached to the primer, is sequentially combined to react DNA sequences complementary to the nucleic acid sequence. 「剥離用プライマー」とはRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドを特定核酸配列から分離させるためのプライマーである。 "Exfoliation primer" is a primer for separating a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase from the specific nucleic acid sequence. 剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、伸長反応方向の上流に存在するRN As the extension reaction from the release primer, RN located upstream of the extension reaction direction
Aポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドがヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼの作用により特定核酸配列から分離される。 Single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence A polymerase is separated from the specific nucleic acid sequence by the action of DNA polymerases with helicase-like activity.

【0010】「RNAポリメラーゼのプロモーター配列」とはRNAポリメラーゼが特異的に結合する配列である。 [0010] A "promoter sequence of RNA polymerase" is an array of RNA polymerase specifically binds to. RNAポリメラーゼはこのプロモーター配列に特異的に結合し、該プロモーター配列よりも下流のDNA RNA polymerase binds specifically to the promoter sequence, downstream of the DNA than the promoter sequence
配列と相同なRNAを合成する。 To synthesize the sequence and homologous RNA. 「RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマー」とは5'末端にT3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼなどのプロモーター配列を有し、3'末端側に特定核酸配列に相補的な核酸配列を有するプライマーである。 5 The "first primer having a promoter sequence of RNA polymerase" 'T3 RNA polymerase at the end, T7 RNA polymerase, have a promoter sequence, such as SP6RNA polymerase, 3' having a nucleic acid sequence complementary to the specific nucleic acid sequence distally it is a primer. 「RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチド」とはRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーとDNAポリメラーゼによる該第1プライマーからの伸長物の結合物である。 The "single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence" is a conjugate of extension product from the first primer of the first primer and DNA polymerase with the promoter sequence of RNA polymerase.

【0011】「ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼ」とはプライマーからの伸長反応を行いDNAを合成しつつ、伸長方向に存在する二本鎖DNA部位を巻き戻して一本鎖DNAに変換するポリメラーゼのことである。 [0011] While combining the DNA subjected to elongation reaction from the primer "DNA polymerases with helicase-like activity", rewind the double-stranded DNA sites present in the extending direction of the polymerase to convert the single-stranded DNA it is. 例えば、PHI29DNAポリメラーゼ、クレノウフラグメント(Klenow fragment)、M2DNAポリメラーゼなどがヘリカーゼ様活性を有しており、本発明に使用可能である。 For example, Phi29 DNA polymerase, Klenow fragment (Klenow fragment), etc. M2DNA polymerase has helicase-like activity, it can be used in the present invention. また耐熱性DNAポリメラーゼであるTt The Tt is a thermostable DNA polymerase
h(Thermus thermophilus)DNAポリメラーゼ、Ta h (Thermus thermophilus) DNA polymerase, Ta
q(Thermus aquaticus)DNAポリメラーゼ、Ven q (Thermus aquaticus) DNA polymerase, Ven
t(Thermococcuslitoralis)DNAポリメラーゼ、B t (Thermococcuslitoralis) DNA polymerase, B
st(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼなどもヘリカーゼ様活性を有しており本発明に使用できる。 Such as st (Bacillus stearothermophilus) DNA polymerase can be used in the present invention has a helicase-like activity.

【0012】本発明に使用する特定核酸配列は一重鎖D [0012] The particular nucleic acid sequence for use in the present invention are single-stranded D
NAであっても二重鎖DNAであってもよい。 Even NA may be a double-stranded DNA. それらが人為的に作成されたものであっても、天然に存在するものであっても支障はない。 Even those in which they were created artificially, there is no problem, even those which occur in nature. 天然のDNAを使用する場合には常法に従い検体から抽出後、本発明に利用できる。 When using natural DNA after extraction from the sample by a conventional method, it can be used in the present invention.
検体の具体的な調製法としては、例えば腸炎ビブリオの菌株をブレインハートインフュージョン培地に接種して、一晩培養する。 Specific preparation of the specimen, for example, a strain of Vibrio parahaemolyticus was inoculated into brain heart infusion medium and incubated overnight. 成育したコロニーをエッペンドルフチューブにかきとり、希釈用緩衝液に懸濁し、さらにここへ、プロテイナーゼ、溶菌液を加えて撹拌し、約60℃ Scraped grown colonies in an Eppendorf tube, suspended in dilution buffer further here, and stirred proteinase, the lysate was added, about 60 ° C.
で30分間インキュベートし、次いで得られた溶解液を、 The in and incubated for 30 minutes, then the resulting solution,
フェノール、クロロホルムなどで抽出後、エタノール沈澱して核酸を得る。 Phenol, extracted, etc. with chloroform, to obtain a nucleic acid by ethanol precipitation.

【0013】本発明においてRNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つ第1プライマーのプロモーター配列は、T3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼ、SP [0013] The present invention first primer promoter sequences with RNA polymerase promoter sequence in, T3 RNA polymerase, T7 RNA polymerase, SP
6 RNAポリメラーゼ用のプロモーター配列などを用いればよい。 6 may be used, such as a promoter sequence for RNA polymerase. 該第1プライマーと特定核酸配列とのアニール部位の配列長に特に制限はなく、好ましくは10〜100b There is no particular restriction on the sequence length of the annealing site of the first primer and the specific nucleic acid sequence, preferably 10~100b
p 、特に好ましくは10〜50bp、更に好ましくは15〜30bp p, particularly preferably 10~50Bp, more preferably 15~30bp
がよいが、これに限定されるものではない。 Although good, but it is not limited thereto. プライマーの調製法は従来公知の方法に従う。 The preparation of primers according to a conventional method. 具体的な手法としては、例えばABI社マニュアルに従ってホスホアミダイド法により製造する。 As a specific method, produced by phosphoamidite method, for example, in accordance with ABI company documentation. 各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で実施する。 Deprotection of various oligonucleotides is carried out with aqueous ammonia. 精製はFPLCで逆相カラムにて実施してもよい。 Purification may be carried out by reverse phase column with FPLC.

【0014】本発明では、剥離用プライマーおよびRN [0014] In the present invention, peeling primer and RN
Aポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補的配列がRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーの特定核酸配列の相補的配列の3'側に存在する。 The first primer having a promoter sequence A polymerase can bind to each complementary sequence of the specific nucleic acid sequence, the positional relationship of the first primer complementary sequence of the specific nucleic acid sequence of peeling primer has a promoter sequence of RNA polymerase at the 3 'end of the complementary sequence of the specific nucleic acid sequence. 剥離用プライマーを設計する場合、剥離用プライマーと特定核酸配列とのアニール部位の配列長に特に制限はなく、好ましくは10〜100bp 、特に好ましくは10〜50 When designing the peeling primer is not particularly limited to the sequence length of the annealing sites of the specific nucleic acid sequence and the peeling primer, preferably 10~100Bp, particularly preferably 10 to 50
bp、更に好ましくは15〜30bpがよいが、これに限定されるものではない。 bp, more preferably it is 15~30bp, but not limited thereto.

【0015】以下に本発明を図面(図1および図2)を用いて説明する。 [0015] will be described with reference to the present invention with reference to the accompanying drawings (FIGS. 1 and 2) below. 剥離用プライマーaとRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーbは特定核酸配列の相補的結合配列に結合でき、その位置関係は該剥離用プライマーaの特定核酸配列の相補的結合配列a'が該第1プライマーbの特定核酸配列の相補的結合配列b'の3'側に存在しなければならない。 First primer b having a promoter sequence for peeling primers a and RNA polymerase can bind to a complementary binding sequence of the specific nucleic acid sequence, complementary binding sequence a specific nucleic acid sequence of the positional relation the release primer a 'is It must be present at the 3 'side of the' complementary binding sequence b of the specific nucleic acid sequence of the first primer b. 該第1プライマーbと剥離用プライマーaの特定核酸配列の相補的結合配列間の距離(b'とa'間の距離)に特に制限はなく、ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼにより該剥離用プライマーaからの伸長反応にともない、 There is no particular restriction on the distance between the complementary binding sequence of the specific nucleic acid sequence of the first primer b and the peeling primer a (b 'and a' distance between), primer the release by DNA polymerases with helicase-like activity With the extension reaction from a,
該第1プライマーbと該第1プライマーbからの伸長物cが特定核酸配列から分離する距離に設定すればよい。 Elongation product c from the first primer b and the first primer b may be set to the distance separating from the specific nucleic acid sequence.
好ましくは0〜2000bp、特に好ましくは20〜1000bpがよいが、これに限定されるものではない。 Preferably 0~2000Bp, particularly preferably but good 20~1000Bp, but is not limited thereto.

【0016】剥離用プライマーaとRNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つ第1プライマーbは以下の方法に基づき特定核酸配列とアニールさせる(工程a)。 The first primer b having a promoter sequence for peeling primers a and RNA polymerase to specific nucleic acid sequences anneal according to the following methods (step a).
特定核酸配列が二本鎖DNAの場合には、該特定核酸配列と該第1プライマーbと剥離用プライマーaを混合し、80〜105 ℃で2〜5分間加熱後、室温になるまで放置する。 In the case of the specific nucleic acid sequence is double-stranded DNA is mixed with the specific nucleic acid sequence and the first primer b and the peeling primer a, after heating 2-5 minutes at 80 to 105 ° C., allowed to come to room temperature . 特定核酸配列が一本鎖DNAの場合には、該特定核酸配列と該第1プライマーbと剥離用プライマーa If the specific nucleic acid sequence is single-stranded DNA, said specific nucleic acid sequence and the first primer b and the peeling primer a
を混合し、しばらく放置してもよいし、50〜105 ℃で2 They were mixed, and the mixture may be left for a while, 2 at 50~105 ℃
〜5分間加熱後、室温になるまで放置してもよい。 After heating 5 minutes, it may be allowed to come to room temperature. アニール反応終了後、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの4種のデオキシリボヌクレオチド)存在下、ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼを用いて、剥離用プライマーaとRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーbからの伸長反応を生じせしめる(工程b)。 After the annealing reaction was completed, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, 4 kinds of deoxyribonucleotides dTTP) presence, using a DNA polymerase having a helicase-like activity, the first primer having a promoter sequence of peeling primer a and RNA polymerase allowed to rise to elongation reaction from b (step b). 該第1プライマーbと第1プライマーbからの伸長物cは、剥離用プライマーaからの伸長反応に従って、特定核酸配列と形成される二重鎖領域が、ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼの作用により巻戻され、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドdが特定核酸配列から分離される(工程c)。 First primer b and the extension product c from the first primer b in accordance with the extension reaction from the release primer a, duplex region formed between the specific nucleic acid sequence, by the action of DNA polymerases with helicase-like activity wound back, single-stranded oligonucleotide d having a promoter sequence for RNA polymerase is separated from the specific nucleic acid sequence (step c). 剥離用プライマーaからの伸長反応とRN Elongation reaction and RN from the release primer a
Aポリメラーゼのプロモーター配列を持つ第1プライマーbからの伸長反応(工程b)と、RNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドd Elongation reaction from the first primer b having a promoter sequence A polymerase and (step b), a single-stranded oligonucleotide d having a promoter sequence for RNA polymerase
が特定核酸配列から分離される反応(工程c)を同時に生じせしめても何等問題はない。 But nothing like there is no problem even if allowed to occur simultaneously and the reaction (step c) is separated from the specific nucleic acid sequence.

【0017】RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドの具体的な製法の一例としては、腸炎ビブリオのゲノムを緩衝液に懸濁し、デオキシリボヌクレオチドおよびT7転写開始配列と耐熱性溶血毒遺伝子に相同な配列を有するプライマー1および耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を有する剥離プライマー2を混合し、約95℃に加熱後、室温になるまで放置する。 [0017] As an example of a specific method of a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase were suspended genomes Vibrio parahaemolyticus in a buffer, the deoxyribonucleotides and T7 transcription initiation sequence and heat resistance hemolysin gene peeling primer 2 having a sequence homologous to sequences of the primers 1 and heat hemolysin genes with homologous sequences were mixed, heated to about 95 ° C., allowed to come to room temperature. DNAポリメラーゼを添加し、約30℃で保温し反応を行う。 Adding a DNA polymerase, performs insulation react at about 30 ° C..

【0018】本発明の製造法により製造されたRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌレオチドdを使用して核酸の増幅を行うには、まず該一本鎖ヌクレオチドdに相補的な第2プライマーeをアニールさせ(図2、工程A)、DNAポリメラーゼ反応により二重鎖DNAを形成させる(工程B)。 [0018] Using the single-stranded Origonureochido d having a promoter sequence of the prepared RNA polymerase by the production method of the present invention to amplify nucleic acids, first second primer complementary to the single stranded nucleotides d were annealed to e (FIG. 2, step a), to form a double-stranded DNA by a DNA polymerase reaction (step B). 該二本鎖DN The double-stranded DN
AにRNAポリメラーゼを反応させ、一重鎖RNAfを合成させる(工程C)。 The RNA polymerase is reacted to A, to synthesize a single-stranded RNAf (Step C). 該一重鎖RNAには上記一本鎖ヌクレオチドに相補的な第2プライマーeがアニール可能であり(工程D)、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)により該一重鎖RNAfに相補的なDN The said single-stranded RNA is a second primer e complementary to the single-stranded nucleotide said can anneal (step D), complementary to the single-stranded RNAf by RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) DN
A配列gを合成する(工程E)。 Synthesizing the A sequence g (step E). 一重鎖RNAに相補的なDNA配列gと一重鎖RNAfを例えばリボヌクレアーゼを用いて分離し(工程F)、該一重鎖RNAに相補的なDNA配列gとRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第一プライマーbをアニールさせ、DNAポリメラーゼにより二重鎖にする(工程G)。 Were separated using a DNA sequence complementary g and single-stranded RNAf the single-stranded RNA for example ribonuclease (step F), the first primer b having a promoter sequence complementary DNA sequences g and RNA polymerase to the single-stranded RNA It was annealed to a double-stranded by DNA polymerase (step G). 以上の反応を少なくとも1回繰り返し、増幅反応を行う。 Repeating at least once or more reaction, the amplification reaction.

【0019】本発明に使用する第2プライマーとはRN [0019] The second primer to be used in the present invention RN
Aポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖ヌクレオチドに相補的なプライマーをいう。 Single stranded nucleotides having a promoter sequence A polymerase refers to a primer complementary.

【0020】本発明において特定核酸配列の検出を行うには、上記増幅法により増幅した試料を電気泳動、サザンブロット、ドットブロットなどを行う必要があり、具体的な検出法の一例としては、上記工程aから工程cにより得られた反応液にRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖ヌクレオチドに相補的な第2プライマー、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)、RNAポリメラーゼおよび必要によりリボヌクレアーゼを添加して約42℃で反応させ、反応液を例えばナイロン膜に数μl滴下後、放射線標識プローブまたは酵素標識プローブをハイブリダイズさせて検出できる。 [0020] To perform the detection of specific nucleic acid sequences in the present invention, electrophoresis samples amplified by the amplification method, Southern blot, it is necessary to perform, dot blot, as an example of a specific detection method, the complementary second primer to a single-stranded nucleotide to the reaction solution obtained in the step c from step a with a promoter sequence for RNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase), added ribonuclease by RNA polymerase and optionally It reacted at about 42 ° C. and, after a few μl added dropwise to the reaction solution to a nylon membrane for example, can detect the radiolabeled probe or enzyme-labeled probe is hybridized. また別な検出例としては、上記第2プライマー、DTT、 As another detection example, the second primer, DTT,
RNA依存性DNAポリメラーゼ(例、AMV逆転写酵素)、RNAポリメラーゼ(例、T7RNAポリメラーゼ)および必要によりリボヌクレアーゼ(例、RNaseH) RNA-dependent DNA polymerase (e.g., AMV reverse transcriptase), RNA polymerase (e.g., T7 RNA polymerase) and required by ribonuclease (e.g., RNase H)
を添加して約42℃で反応させ、反応液をアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。 It was reacted at about 42 ° C. and added and the reaction mixture was subjected to agarose gel electrophoresis, after ethidium bromide staining to detect the fluorescence with ultraviolet light. 反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたヌクレオチド断片の長さを算出することができる。 In addition to molecular weight markers of the reaction liquid also electrophoresed at the same time, by comparing the relative mobility, it is possible to calculate the length of the detected nucleotide fragments.

【0021】 [0021]

【発明の効果】従来方法では、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌレオチドを得るために加熱処理(95℃で5分間処理後、冷却)を必要とし、この加熱操作は反応を自動化する際の障壁となり、 EFFECTS OF THE INVENTION Conventionally methods, when (after 5 minutes treatment at 95 ° C., cooling) heat processed to obtain a single-stranded Origonureochido having a promoter sequence for RNA polymerase requires, the heating operation is to automate the reaction It becomes a barrier,
装置自体に加熱装置を設けなければならない。 The device itself must be provided with a heating device. ところが、本発明ではヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼを使用して、その操作を簡便化できることにより、 However, the present invention uses a DNA polymerase with a helicase-like activity, by being able to simplify the operation,
このような煩雑な操作および装置を必要とせずに、RN Such complicated operations and apparatus without requiring, RN
Aポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌレオチドを得ることができる。 It is possible to obtain single-stranded Origonureochido having a promoter sequence A polymerase. 本発明の1本鎖オリゴヌレオチドの製造法は、塩基配列が既知の核酸をその初期に存在する量に比較してより大量に生成させる増幅方法に適用できる。 1 strand Origonureochido production method of the present invention is applicable to the amplification method of nucleotide sequences to produce larger quantities compared to the amount present a known nucleic acid to the initial. また特定核酸配列の検出法にも適用できる。 Also applicable to detection of specific nucleic acid sequences.

【0022】 [0022]

【実施例】次に実施例を用いて本発明を具体的に説明する。 Detailed description of the present invention with reference to the following Examples. 実施例1 (各種オリゴヌクレオチドの合成)ABI社DNAシンセサイザー391型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列表に示される配列、すなわち、T7RNAポリメラーゼのプロモーター配列(T7転写開始配列)および耐熱性溶血毒遺伝子に相同な配列を有する第1プライマー(配列番号1)、耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同な配列を有する剥離用プライマー(配列番号2)、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドに相補的な第2プライマー(耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相補的な配列を有する)(配列番号3)を合成した。 Example 1 (Synthesis of various oligonucleotides) using an ABI Inc. DNA synthesizer model 391, the sequence shown in the sequence listing by the phosphoamidite method, i.e., a promoter sequence of T7RNA polymerase (T7 transcription initiation sequence) and heat resistance hemolysin first primer having a sequence homologous to the gene (SEQ ID NO: 1), stripping primer having a sequence homologous to the sequence of the thermostable hemolysin gene (SEQ ID NO: 2), single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase was synthesized complementary second primer (having the sequence complementary to that of the thermostable hemolysin gene) (SEQ ID NO: 3). 具体的な手法はABI社マニュアルに従い、0.2Mスケールで実施した。 Specific procedures are in accordance with ABI, Inc. manual, it was carried out in 0.2M scale. 各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃一夜実施した。 Deprotection of various oligonucleotides was performed 55 ° C. overnight with aqueous ammonia. 精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。 Purification was performed by reverse phase column with Pharmacia Co. FPLC.

【0023】(腸炎ビブリオからのゲノムの調製)腸炎ビブリオの菌株を 3% NaClを含むブレインハートインフュージョン培地(Brain Heart Infusion Agar)に接種して、37℃で一晩培養した。 [0023] was inoculated into brain heart infusion medium containing 3% NaCl and strains (genomic Preparation from Vibrio parahaemolyticus) Vibrio parahaemolyticus (Brain Heart Infusion Agar), and incubated overnight at 37 ° C.. 成育したコロニーをそれぞれ Each an adult colonies
1.5mlのエッペンドルフチューブにかきとり、希釈用緩衝液(0.1MNaH 2 PO 4 , pH 7.0) 300μlに懸濁した。 It scraped into 1.5ml Eppendorf tube, suspended in dilution buffer (0.1MNaH 2 PO 4, pH 7.0 ) 300μl. さらにここへプロテイナーゼK(ナカライテスク社) 0.6 In addition proteinase K here (Nacalai Tesque) 0.6
mg、溶菌液(8M尿素、0.25%ドデシル硫酸ナトリウム、 mg, lysates (8M urea, 0.25% sodium dodecyl sulfate,
0.25%ラウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA, pH 0.25% sodium lauryl sarcosine, 50 mM EDTA, pH
7.6) 600μlを加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベートした。 7.6) 600 [mu] l added and stirred and incubated at 60 ° C. 30 min. 得られた溶解液をフェノールで2回、クロロホルムで1回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。 The resulting solution twice with phenol, extracted once with chloroform, ethanol precipitated to obtain a nucleic acid.

【0024】(検出用プローブの調製) (1)リンカーアームを有する腸炎ビブリオ用オリゴヌクレオチドの合成 ABI社DNAシンセサイザー392 型を用いて、ホスホアミダイド法にて、配列表に示される配列、すなわち検出用プローブ(配列番号4)を合成した。 [0024] (Preparation of detection probe) (1) using synthetic ABI Inc. DNA synthesizer 392 type Vibrio parahaemolyticus oligonucleotide having a linker arm, sequence by phosphoamidite method, set forth in the Sequence Listing, i.e. a detector probe (SEQ ID NO: 4) were synthesized. この際、特表昭60-500717 号公報に記載された合成法により、デオキシウリジンから化学合成した 5位にリンカーアームを有するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。 At this time, by the synthetic method described in Kohyo Sho 60-500717 discloses a uridine having a linker arm was introduced into the oligonucleotide chemically synthesized 5-position from deoxyuridine. このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のTと置換しうるが、この実施例においては5'末端のTを置換した。 The uridine can be substituted with any T within the oligonucleotide, but replacing T at the 5 'end in this embodiment.
合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で50℃、一夜脱保護処理した後、ファルマシア社製FPLC Synthesized linker oligonucleotides 50 ° C. with aqueous ammonia, after deprotection treatment overnight, manufactured by Pharmacia FPLC
で陰イオン交換カラムを用いて精製した。 In purified using an anion exchange column.

【0025】(2)リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドにそのリンカーアームを介して、アルカリホシファターゼを文献(Ncleic Acid [0025] (2) via its linker arm for labeling the linker oligonucleotide with alkaline phosphatase linker oligonucleotides, literature alkali Hoshi file synthetase (Nucleic Acid
s Research, vol.14, p.6114, 1986) に従って結合した。 s Research, vol.14, p.6114, was coupled according to 1986). リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A 260を0.2M NaHCO 0.2 M NaHCO linker oligonucleotides 1.5 A 260
3 12.5μl に溶解し、ここへ10mg/ml スベリン酸スクシニミジル(DSS)25 μlを加えて、室温で2分間反応させた。 3 was dissolved in 12.5 [mu] l, wherein the addition of 10mg / ml suberic acid succinimidyl (DSS) 25 μl, and reacted at room temperature for 2 minutes. 反応液を1mM CH 3 COONa (pH5.0) で平衡化したSeph Seph The reaction solution was equilibrated with 1mM CH 3 COONa (pH5.0)
adex G-25 カラム(1cmφ×30cm) でゲル濾過して過剰の Adex G-25 column (1cmφ × 30cm) by gel filtration and excess of
DSS を除去した。 The removal of the DSS. 末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、さらにモル比で2倍量のアルカリホスファターゼ (100mM NaHCO 3 , 3M HClに溶解したもの)と室温で16時間反応させることによりアルカリホスファターゼ標識プローブを得た。 The terminal amino groups of the activated linker oligonucleotide, alkaline phosphatase-labeled probe by further 2-fold amount of alkaline phosphatase (dissolved in 100mM NaHCO 3, 3M HCl) in a molar ratio to react for 16 hours at room temperature Obtained. 得られた標識プローブはファルマシア製FPLCで陰イオン交換カラムを用いて精製した。 The resulting labeled probe was purified using an anion exchange column with Pharmacia FPLC. 標識プローブを含む画分を集め、セントリコン30K(アミコン社) を用いて限外濾過法により濃縮した。 The fractions containing the labeled probe was collected and concentrated by ultrafiltration using a Centricon 30K (Amicon).

【0026】(RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ一本鎖オリゴヌクレオチドの合成)腸炎ビブリオのゲノム1ngを緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH8.3, 6mM MgC [0026] Genomic 1ng buffer (RNA synthesis of single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence of the polymerase) Vibrio parahaemolyticus (50 mM Tris-HCl, pH8.3, 6mM MgC
l 2 , 40 mM KCl )に懸濁し、1mMデオキシリボヌクレオチド(Pharmacia)およびプライマー1、2と混合し、3分間95℃で加熱後、室温になるまで放置した。 was suspended in l 2, 40 mM KCl), it was mixed with 1mM deoxyribonucleotides (Pharmacia) and primer 2, after heating for 3 minutes 95 ° C., and allowed to come to room temperature. PHI91 RN PHI91 RN
Aポリメラーゼを4単位添加し、30℃で1時間保温し反応を行った。 The A polymerase was added 4 units, was carried out for 1 hour kept to react at 30 ° C..

【0027】(検出)上記反応液にプライマー3(配列番号3)、10 mM DTT 、40ユニットのRNA依存性DN [0027] (Detection) primer 3 (SEQ ID NO: 3) to the reaction solution, 10 mM DTT, 40 units of RNA-dependent DN
Aポリメラーゼ (AMV 逆転写酵素)(東洋紡)0.4 ユニットのリボヌクレアーゼ(RNaseH)(Pharmacia) 、20ユニットのT7RNAポリメラーゼ(Stratagene)を添加し42℃ A polymerase (AMV reverse transcriptase) (Toyobo) 0.4 units of ribonuclease (RNase H) (Pharmacia), added 42 ° C. to 20 units T7RNA polymerase (Stratagene)
で3時間反応させた。 In was allowed to react for 3 hours. 反応液1μlをナイロン膜に滴下後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。 After the addition the reaction mixture 1μl to a nylon membrane and fixed to a nucleic acid under alkaline conditions. この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカリフォスファターゼ標識核酸プローブ(配列番号4)を含むハイブリダイゼーション・バッファー(5×SSC, 0.5 After neutralization the membrane was transferred to a hybridization bag, hybridization buffer (5 × SSC containing the alkaline phosphatase-labeled nucleic acid probe (SEQ ID NO: 4), 0.5
% ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニールピロリドン、 % Bovine serum albumin, 0.5% polyvinylpyrrolidone,
1%ドデシル硫酸ナトリウム) を加えて、50℃で15分間ハイブリダイゼーションを行った。 Adding 1% sodium dodecyl sulfate) was carried out for 15 min hybridization at 50 ° C.. ナイロン膜をポリバックから取り出し、洗浄液1(1×SSC, 1% ドデシル硫酸ナトリウム) で50℃、10分間振盪洗浄した。 The nylon membrane was taken out from the poly-back, 50 ° C. with washing solution 1 (1 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate), and shaken 10 min wash. さらに洗浄液 Furthermore, cleaning solution
2 (1×SSC)で室温下10分間振盪洗浄した。 It was shaken washed at room temperature for 10 minutes in 2 (1 × SSC). 膜を新しいハイブリダイゼーションバックに移し、基質液(0.1M Tris Transfer the film to a new hybridization back, a substrate solution (0.1M Tris
-HCl, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl 2 , 0.3mg/ml ニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロフェリールホスフェート pH7.5) を入れ、シール後、37℃で30分間インキュベートした。 -HCl, placed 0.1M NaCl, 0.1M MgCl 2, 0.3mg / ml nitroblue tetrazolium, 0.3 mg / ml of bromine chloro ferry Le phosphate pH 7.5), after sealing, was incubated at 37 ° C. 30 min.

【0028】(結果)生成物はプライマー1、2 (配列番号 1、2)を同時に用いたときのアルカリホスファターゼにより生じる紫色色素のスポットが検出できた。 [0028] (Results) The product could be detected purple dye spots caused by alkaline phosphatase in the case of using the simultaneous primer 1 (SEQ ID NO: 1, 2).

【0029】図1は本発明のRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖ヌクレオチドを製造する全体図を示す。 [0029] Figure 1 shows an overall view of manufacturing a single-stranded nucleotides having a RNA polymerase promoter sequence of the present invention. 図2は本発明により得られたRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖ヌクレオチドを使用する特定核酸配列の増幅方法を示す。 Figure 2 illustrates a method for amplifying specific nucleic acid sequences using single stranded nucleotides having a promoter sequence of the resulting RNA polymerase by the present invention. 図3は実施例1 3 Example 1
のハイブリダイゼーションの結果を示す。 The results of the hybridization. 図中、スポット1〜4はプライマー(配列番号1,2)存在下および非存在下における実施結果を示す。 In the figure, the spot 1-4 shows an embodiment results in the presence and absence primer (SEQ ID NO: 1, 2). スポット5はプライマー(配列番号1、2)存在下で特定核酸配列非存在化におけるコントロールを示す。 Spot 5 shows a control in a specific nucleic acid sequence absence of the presence primer (SEQ ID NO: 1, 2).

【0030】 [0030]

【配列表】 [Sequence Listing]

配列番号:1 配列の長さ:40 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..20 特徴を決定した方法:S 他の特徴:T7転写開始配列と、耐熱性溶血毒遺伝子に相同的な配列を有する。 SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 40 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms Topology: linear sequence type: wherein the location of the other nucleic acid synthetic DNA sequence: 1..20 method determined characteristics : S other features: having a T7 transcription initiation sequence, the homologous sequence in heat resistance hemolysin gene. 配列:AATACGACTC ACTATAGCCCC GGTTCTGATG AGATATTGTT 40 Array: AATACGACTC ACTATAGCCCC GGTTCTGATG AGATATTGTT 40

【0031】配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..20 特徴を決定した方法:S 他の特徴:耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相同的な配列を有する。 [0031] SEQ ID NO: length of the two sequences: 20 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms Topology: linear sequence type: wherein the location of the other nucleic acid synthetic DNA sequence: 1..20 features determined method: S other features: having a sequence homologous to the sequence of thermostable hemolysin gene. 配列:GCTGCATTC AAAACATCTGC 20 Array: GCTGCATTC AAAACATCTGC 20

【0032】配列番号:3 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..20 特徴を決定した方法:S 他の特徴:耐熱性溶血毒遺伝子の配列に相補的な配列を有する。 [0032] SEQ ID NO: 3 Length of sequence: 26 SEQ types: the number of nucleic acid strands: both forms Topology: linear sequence type: wherein the location of the other nucleic acid synthetic DNA sequence: 1..20 features determined method: S other features: having a sequence complementary to that of the thermostable hemolysin gene. 配列:ATTTTACGAA CACAGCAGAA TGACCG 26 Array: ATTTTACGAA CACAGCAGAA TGACCG 26

【0033】配列番号:4 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..20 特徴を決定した方法:S 他の特徴:耐熱性溶血毒遺伝子の配列を有する。 [0033] SEQ ID NO: 4 sequence Length: 25 SEQ types: the number of the nucleic acid strand: both forms Topology: linear sequence type: wherein the location of the other nucleic acid synthetic DNA sequence: 1..20 features determined method: S other features: having a sequence of thermostable hemolysin gene. 配列:TCAGGTACTA AATGGTTGAC ATCCT 25 Array: TCAGGTACTA AATGGTTGAC ATCCT 25

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明のRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖ヌクレオチドを製造する工程aから工程cを示す。 1 shows a step c from step a of producing a single-stranded nucleotides having a RNA polymerase promoter sequence of the present invention.

【図2】本発明のRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖ヌクレオチドを使用する特定核酸配列の増幅法を示す。 Figure 2 shows a method for amplifying specific nucleic acid sequences using single stranded nucleotides having the RNA polymerase promoter sequence of the present invention.

【図3】実施例1のハイブリダイゼーションの結果を示す。 Figure 3 shows the results of hybridization of Example 1.

Claims (4)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 次の工程を含むことを特徴とするRNA 1. A RNA, characterized in that it comprises the following steps
    ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法。 Method for producing a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence of the polymerase. (a)特定核酸配列に、剥離用プライマーおよびRNA (A) the specific nucleic acid sequence, peeling primer and RNA
    ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーをハイブリダイズさせる。 The first primer having a promoter sequence of the polymerase is hybridized. (ここで剥離用プライマーおよびRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1 (First with a promoter sequence peeling primer and RNA polymerase here
    プライマーは特定核酸配列の各相補的配列に結合でき、 Primers can be attached to each complementary sequence of the specific nucleic acid sequence,
    その位置関係は剥離用プライマーの特定核酸配列の相補的配列がRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーの特定核酸配列の相補的配列の3'側に存在する。 Its positional relationship complementary sequence of the specific nucleic acid sequence of peeling primer at the 3 'end of the complementary sequence of the specific nucleic acid sequence of the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase. ) (b)次いでヘリカーゼ様活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーからの伸長反応を行う。 ) (B) then using a DNA polymerase having a helicase-like activity, performing an elongation reaction from the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase. (c)さらに剥離用プライマーからの伸長反応に伴い、 (C) further with the extension reaction from the release primers,
    特定核酸配列からRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーと該第1プライマーからの伸長物で形成されるRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを分離する。 Separating the single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence which is formed by the extension product from the first primer and the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase from the specific nucleic acid sequence.
  2. 【請求項2】 請求項1における工程(b)および工程(c)が同時に行われることを特徴とするRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法。 2. A method for producing a single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence, wherein the step of claim 1 (b) and step (c) are carried out simultaneously.
  3. 【請求項3】 請求項1の工程(c)において形成されるRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドと特定核酸配列との二重鎖領域が、 Wherein the duplex region of the single-stranded oligonucleotide having the RNA polymerase promoter sequence formed in step of claim 1 (c) and the specific nucleic acid sequence,
    ヘリカーゼ様活性をもつDNAポリメラーゼの作用により、剥離用プライマーからの伸長反応にともない巻戻され、RNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドが特定核酸配列から分離されることを特徴とするRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法。 By the action of DNA polymerases with helicase-like activity, unwound with the extension reaction from the release primers, characterized in that the single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase is isolated from the specific nucleic acid sequence RNA method for producing a single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence of the polymerase.
  4. 【請求項4】 次の工程を含むことを特徴とするRNA 4. RNA, characterized in that it comprises the following steps
    ポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを用いた特定核酸配列の増幅法。 Amplification of specific nucleic acid sequences using single stranded oligonucleotides with promoter sequences of the polymerase. (A)請求項1において製造したRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドに第2プライマーをハイブリダイズさせる。 (A) the second primer is hybridized to single-stranded oligonucleotide having a promoter sequence for RNA polymerase produced in claim 1. (B)次いでDNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、二重鎖DNAを合成した後、 (C)二重鎖DNAにRNAポリメラーゼを反応させて一重鎖RNAを複数合成する。 (B) then perform an extension reaction using a DNA polymerase, after synthesizing a double-stranded DNA, a plurality synthesizing single-stranded RNA is reacted with RNA polymerase (C) double-stranded DNA. (D)一重鎖RNAを鋳型として、第2プライマーをハイブリダイズさせる。 (D) a single-stranded RNA as a template, hybridizing a second primer. (E)次いでRNA依存性DNAポリメラーゼを用いて、RNA−DNAハイブリッドを形成させる。 (E) then using RNA-dependent DNA polymerase to form a RNA-DNA hybrids. (F)RNA−DNAハイブリッドのRNA部分を分解し、一本鎖DNAを得る。 (F) to decompose the RNA portion of the RNA-DNA hybrid to obtain a single-stranded DNA. (G)得られた一本鎖DNAにRNAポリメラーゼのプロモーター配列をもつ第1プライマーをハイブリダイズさせ、伸長反応を行い、二重鎖DNAを合成する。 (G) the single-stranded DNA obtained by hybridizing the first primer having a promoter sequence of RNA polymerase performs an extension reaction, synthesizing a double-stranded DNA. (H)さらに工程(C)から(G)を繰り返して特定核酸配列を増幅する。 (H) further from step (C) repeating the (G) for amplifying a specific nucleic acid sequence.
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