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JPH07147982A - Method for analyzing distribution of kinds of m-rna - Google Patents

Method for analyzing distribution of kinds of m-rna

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Publication number
JPH07147982A
JPH07147982A JP29859493A JP29859493A JPH07147982A JP H07147982 A JPH07147982 A JP H07147982A JP 29859493 A JP29859493 A JP 29859493A JP 29859493 A JP29859493 A JP 29859493A JP H07147982 A JPH07147982 A JP H07147982A
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JP
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Patent type
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oligomer
rna
array
kinds
distribution
Prior art date
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Pending
Application number
JP29859493A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Hideki Kanbara
Kazunobu Okano
和宣 岡野
秀記 神原
Original Assignee
Hitachi Ltd
株式会社日立製作所
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Abstract

PURPOSE: To provide the analysis method capable of simultaneously measuring especially even plural basic sequenceunknown m-RNAs by a means for detecting the distribution of the various m-RNAs contained in cells.
CONSTITUTION: Many kinds of DNA oligomers are divided into every kinds, immobilized in every divisions on the surface of a solid oligomer array, and subsequently hybridized with m-RNA. A fluorescently labeled dNTP and a reverse transcriptase are used to synthesize fluorescently labeled c-DNA complementary to the m-RNA on the oligomer array. The fluorescent light of each division on the oligomer array is measured to know the distribution of the m-RNA. An oligomer having a structure comprising a poly A and an arbitrary sequence on the 3'-terminal side of the poly A is used as the oligomer.
COPYRIGHT: (C)1995,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、DNAあるいはRNA、特に The present invention relates to, DNA or RNA, in particular
m-RNA種類分布あるいは存在比の解析法に関するものである。 It relates m-RNA-type distribution or abundance ratio analysis. 応用として病気診断、生体機能解析などがある。 Disease diagnosis as the application, there is such as a biological function analysis.

【0002】 [0002]

【従来の技術】生体内あるいは細胞内で起こっている現象は、その中で活動しているm-RNAの種類と量を知ることでモニタ−できる。 BACKGROUND ART phenomena occurring in vivo or in a cell, monitoring by knowing the type and amount of m-RNA which are active therein - can. しかし、m-RNAは生体中に含まれるRNA分解酵素により短時間で分解されるため、細胞内においても寿命が約30分と非常に短い。 However, since m-RNA is to be decomposed in a short time by RNA degrading enzymes contained in the living body, a very short and lifetime of about 30 minutes in the cell. このためその計測は非常に難しかったが、現在ではRNAを逆転写酵素によりc-DNAとしてこれを解析する手法が開発されている。 Thus although the measurement was very difficult, approach at present to analyze this as c-DNA by a reverse transcriptase RNA it has been developed. 細胞中に含まれるm-RNA、従ってc-DNAの種類は高々 m-RNA contained in the cells, therefore the type of c-DNA is at most
10万種で活動しているのは1万種前後と言われている。 The has been active with 10 million species is said to be 10,000 species before and after.
このc-DNAの塩基配列を決定しようとするのがc-DNAプロジェクトで日本はじめ世界各国で進められている。 This to try to determine the nucleotide sequence of the c-DNA has been promoted Japan began around the world in a c-DNA project.

【0003】一方、細胞内m-RNAの種類分布(abundanc [0003] On the other hand, of the intracellular m-RNA-type distribution (abundanc
e)を知るには全てのc-DNAを作り、ベクタ−中にクロ− To know e) is made all the c-DNA, vector - black in -
ニングしてライブラリ−を作る。 Training to the library - make. この中から1つづつクロ−ンを取っては配列を調べ、同じ配列が重複して現われる回数から存在比を求める(Nature Genet. 2, 173-1 One by one black from the -. Taking down examined sequence, the same sequence seek abundance from the number appearing in duplicate (Nature Genet 2, 173-1
79(1992))。 79 (1992)). しかし、この方法では存在比を求めるためには非常に多くの配列決定を行う必要がある。 However, in this method for determining the abundance ratio it is required to perform a large number of sequencing. また、m- In addition, m-
RNAからc-DNAを得るとき、固体表面に固定されたプライマ−を用いてc-DNAを合成し、固体表面にc-DNAを固定したライブラリ−を作る技術が開発されている(Nature 3 When you get a c-DNA from RNA, primer immobilized on a solid surface - was synthesized c-DNA using a library of the c-DNA immobilized on a solid surface - art of making have been developed (Nature 3
57, 519-520(1992))。 57, 519-520 (1992)). このライブラリ−を用いて特定の遺伝子が発現し、m-RNAが増えているか否か、あるいは特定c-DNAの塩基配列を決定することなどを行うことができる。 The library - the like can be performed that a particular gene expressed, whether m-RNA is increasing, or to determine the nucleotide sequence of a particular c-DNA using.

【0004】 [0004]

【発明が解決しようとする課題】生体の活動状況を全体的に捕らえるには前述のように、すべてのm-RNAの種類と量、およびその時間変化や外部刺激による変化を調べることが重要であるが、これまでおこなわれているクロ−ニング法では手間がかかりすぎ現実的でない。 [SUMMARY OF THE INVENTION] As described above in capture overall the activities of the biological, type and amount of all the m-RNA, and to investigate the change due to the time change and an external stimulus is important there is, heretofore has been done black - impractical too cumbersome in training method. また、 Also,
DNAプロ−ブを用いる方法では少数のプロ−ブを用いて、それらがハイブリダイズした量の比から種類分布を求めることはできるが既知プロ−ブがある場合に限られプロ−ブ数も数百以上になると現実的でない。 DNA Pro - the method using a blanking few pro - Using parts, but they may be to determine the type distribution from the ratio of the hybridized amount known pro - only if there is a blanking pro - number also Bed Number It becomes more than a hundred and not realistic. そこで、 there,
すべてのm-RNAを検出でき、プロ−ブが得られていないときでも、計測できる手法の開発が望まれている。 It can detect all m-RNA, pro - even when blanking is not obtained, it is desired development of a technique that can measure.

【0005】 [0005]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、 Means for Solving the Problems] The present inventors,
固体表面上に種々DNAオリゴマ−を種別に分画して保持したチップを作成し、これを用いてm-RNAの分布解析を行うことにより上記目的が達成できることを見出し、本発明を完成した。 Various DNA oligomer on a solid surface - a create a fractionated retained chip type, found that the above object can be achieved by performing a distribution analysis of m-RNA which was used to complete the present invention. すなわち、多種DNAオリゴマ−を種類ごとに区分けして固体表面に保持したプローブチップを用いて、m-RNAの分布を計測することを特徴とするm-RNA That is, a large DNA oligomers - a and divided by type using a probe tip held on the solid surface, m-RNA, characterized in that to measure the distribution of m-RNA
の種類分布解析法である。 It is a type distribution analysis method.

【0006】上記DNAオリゴマーとしては、共通配列とその3'末端側に2mer〜8merの任意配列を含むものが挙げられ、そして、前記共通配列としては、ポリTまたはc-DNAの酵素切断部に導入されたオリゴマー配列あるいはそれと相補的な配列が挙げられる。 [0006] As the DNA oligomer, a compound containing any sequence of 2mer~8mer the consensus sequence and its 3 'end, and, as the common arrangement, the enzymatic cleavage of the poly-T, or c-DNA introduced oligomer sequences or it complementary to sequences. さらに、本発明は、DNAオリゴマ−がm-RNAに特異的にハイブリダイズする配列からなるものである、m-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ−アレ−である。 Furthermore, the present invention, DNA oligomers - is composed of the sequence that hybridizes specifically to m-RNA, DNA for type distribution analysis of m-RNA oligomer - array - a.

【0007】上記DNAオリゴマ−アレ−におけるm-RNAに特異的にハイブリダイズする配列としては、共通配列とその3'末端側に2mer〜8mer、好ましくは2mer〜5me [0007] The DNA oligomers - array - specifically hybridize to m-RNA in the array, 2Mer~8mer the consensus sequence and its 3 'end, preferably 2mer~5me
rの任意配列を含むものが挙げられる。 To include any sequence of r and the like. そして、前記共通配列が、20mer以下のポリT、およびc-DNAの酵素切断部に導入されたオリゴマー配列あるいはそれと相補的な配列が挙げられる。 Then, the common sequence, 20mer following poly T, and c-DNA oligomer sequences or complementary thereto sequence introduced into enzymatic cleavage of the like.

【0008】ポリT部の長さは5〜20merでこれだけでは安定なハイブリドマ−を作らない長さとする。 [0008] The length of the poly T unit is the only this 5~20mer stable Haiburidoma - a length not to make. これに続く任意配列の2mer〜8merの部分とあわさり初めて安定になるように設計する。 Mating a 2mer~8mer portion of any sequence following this design for the first time to be stable. ポリT部の長さは、オリゴチップ上でのハイブリダイゼ−ションのために20mer以下であればよい。 The length of the poly-T portion, hybridization on oligo chip - may be any 20mer below for Deployment. また4mer以下ではm-RNAのポリA部に対する特異性が低下する。 The specificity is reduced against the poly A portion of the m-RNA in 4mer below. よってポリT部の長さは5〜20mer Thus the length of the poly T portion 5~20mer
がよく、さらに望ましくは6〜10merがよい。 C., and more preferably it is 6~10Mer. また、任意配列は2〜8mer程度が良く、長くなりすぎると、ここだけで安定なハイブリダイゼ−ションを起し、ポリA Moreover, any sequence may be about 2~8Mer, if too long, stable hybridization only where - cause Deployment, poly A
末端以外とハイブアリダイズする危険性がある。 There is a risk of non-terminal and hives ant soybean.

【0009】さらに、本発明は、(1)上記いずれかのオリゴマ−アレ−にm-RNA抽出液を接触させ、オリゴマ− Furthermore, the present invention is (1) any of the above oligomer - array - to contacting the m-RNA extract, oligomer -
アレ−表面のDNAオリゴマ−に各m-RNAをハイブリダイズさせる工程、(2)逆転写酵素と4種のうち少なくとも1 Array - the surface of the DNA oligomer - step of hybridizing each m-RNA in one at least of (2) reverse transcriptase and four
種の蛍光標識dNTPと他のdNTPを用いてオリゴマ−アレ− Array - oligomers using a fluorescently labeled dNTP and other dNTP species -
にハイブリダイズしたm-RNAに相補的で蛍光標識されたc c fluorescently labeled complementary to the hybridized m-RNA in
-DNAを合成する工程、および(3)オリゴマ−アレ−上の各区分けした部位の蛍光を測定することで各m-RNAの量を定量する工程、を含む、m-RNAの種類分布解析法である。 Step synthesizing-DNA, and (3) oligomers - array - quantifying the amount of each m-RNA by measuring the fluorescence of each divided the site above, including the type distribution analysis of m-RNA it is.

【0010】さらに、本発明は、(1)上記いずれかのオリゴマ−アレ−にm-RNA抽出液を接触させ、オリゴマ− Furthermore, the present invention is (1) any of the above oligomer - array - to contacting the m-RNA extract, oligomer -
アレ−表面のDNAオリゴマ−に各m-RNAをハイブリダイズさせる工程、(2)逆転写酵素と4種のうち少なくとも1 Array - the surface of the DNA oligomer - step of hybridizing each m-RNA in one at least of (2) reverse transcriptase and four
種の蛍光標識dNTPと他のdNTPを用いてオリゴマ−アレ− Array - oligomers using a fluorescently labeled dNTP and other dNTP species -
にハイブリダイズしたm-RNAに相補的で蛍光標識されたc c fluorescently labeled complementary to the hybridized m-RNA in
-DNAを合成する工程、(3)c-DNAに相補的で他の蛍光体で標識したプロ−ブDNAをハイブリダイゼ−ションさせる工程、(4)c-DNAに含まれる蛍光体と上記(3)の行程でハイブリダイズさせたプロ−ブDNA中の他の蛍光体の間のエネルギ−トランスファ−を用いて、一方の蛍光体を励起させることで他方の蛍光体からの蛍光を検出する工程、および(5)オリゴマ−アレ−上の各区分けした部位の蛍光を測定することで各m-RNAの量を定量する工程、を含むことを特徴とするm-RNAの種類分布解析法である。 A step of synthesizing a-DNA, (3) were labeled with complementary and other phosphors to c-DNA pro - Bed DNA and hybridization - Deployment is to process, (4) a phosphor and the (3 contained in the c-DNA energy between the other phosphors of the probe in the DNA - - Pro was hybridized with stroke) transfer - is used to detect the fluorescence from the other of the phosphor by exciting the one phosphor step, and (5) oligomers - array - a type distribution analysis of m-RNA, which comprises the step, the quantitating the amount of each m-RNA by measuring the fluorescence of each divided the site above.

【0011】本発明のDNA オリゴマーアレーは次のようにして調製する。 [0011] DNA oligomers array of the present invention is prepared as follows. オリゴマーの種類が多い時はScience When the type of the oligomer is large Science
251 , 767-773 (1991)に示されたように光化学反応で基板上に順次合成していくのが良いが、あまり多くない時は合成したDNAプローブをアレーの各区画に結合させるのが良い。 251, 767-773 good to sequentially synthesized on a substrate in a photochemical reaction as shown in (1991), but it is preferable to binding the synthesized DNA probes to each partition of the array when not many . 後者の例を次に説明する。 It will now be described an example of the latter. 光反応性ビオチンを混合した重炭酸バッファ中に石英基板を入れ、ホトマスクを通して光を照射して各区画にビオチンを結合させる。 A quartz substrate was placed in a bicarbonate buffer by mixing photoreactive biotin, binding the biotin to each partition by irradiating light through a photomask. 次いでアビジンを結合させ、各区画にアビジンを固定する。 Then allowed to bind to avidin, to secure the avidin into each compartment. あらかじめ合成した種々配列を持つビオチン付加DNAプローブを含む液をマイクロピペットで各区画毎に異なる配列のプローブが付着するように滴下し、ビオチン−アビジン結合を形成させて固体表面に固定してオリゴマーアレーを作製する。 Was added dropwise a solution containing the biotinylated DNA probes with previously synthesized various sequences as probes for each partition for each different sequence micropipette is attached, biotin - oligomer to form a avidin fixed to a solid surface array the to produce.

【0012】オリゴチップの固体基板としては、石英板、シリコンウェハー等が用いられる。 [0012] As the solid substrate oligo chip, quartz plate, silicon wafer or the like is used. 上記オリゴチップの各区画には5'末端がT(チミン)の連続するオリゴマ−あるいは既知配列と持ったオリゴマ−からなり、その3'末端に4種の塩基(A, C,G, T)の種々組合せからなるオリゴマ−(8マ−以下)部分を持つオリゴマ−を一種づつ保持している。 Above each partition oligo chip 5 'end is contiguous T (thymine) oligomer - or known sequence have been oligomer - made, its 3' the four bases at the terminal (A, C, G, T) oligomer comprising various combinations of - (8 Ma - less) oligomer having a partial - is one by one hold.

【0013】m-RNA分布解析は次の通り行う。 [0013] m-RNA distribution analysis is carried out as follows. 各種m-RNA Various m-RNA
をオリゴチップ上に供給してハイブリダイズするプロセス、次に標識物をもつヌクレオチドモノマ−を用いて相補鎖合成するプロセス、及び、合成された標識物を持つポリヌクレオチドを検出するプロセスを順次行うことによりm-RNAを分布解析する。 The process of hybridizing to supply on oligo chip, then the nucleotide monomers having a label - the process of complementary strand synthesis using, and sequentially performing the process for detecting a polynucleotide having a combined label the m-RNA to distribution analysis by. 上記蛍光体は標識物として用いられるものであり、この標識物としては蛍光体の他、化学発光を誘起する物質、放射性物質などを用いることができる。 The phosphor is intended to be used as a label, as the label other phosphors, substances that induce chemiluminescence, or the like can be used radioactive material.

【0014】 [0014]

【作用】m-RNAは3'末端にA(アデニン)がつらなった部位をもつ、このアデニン部位をハイブリダイゼ−ションにより選別すると共に、これに続く任意配列部を種々組合せのオリゴマ−部で識別してチップ上に選別して保持する。 [Action] m-RNA has a site continuous is A (adenine) in the 3 'end, the adenine site hybridization - with sorting by Deployment, various combinations of oligomers any sequence portion subsequent thereto - identified in parts and holding the sorted on the chip in. チップ上オリゴマ−の3'末端配列がm-RNAの配列と相補的に一致する時には相補鎖合成が進行し蛍光体(他の標識物でもよい)が取りこまれる。 Phosphor proceeds complementary strand synthesis (or other label) is incorporated when the 3 'terminal sequence complementary to match the sequence of m-RNA - chip oligomers. 洗浄後、レ− After washing, Les -
ザ−顕微鏡などを用い、蛍光体付オリゴマ−の存在部位とその光量を知ることによりm-RNAの種類と分布を知ることができる。 The - such as a microscope, fluorescent cylindrical body oligomer - can know the type and distribution of m-RNA by knowing site present between the amount of light. m-RNAの中には3'末端のポリA配列に隣接する配列だけは区別できないものもあるが、それらは、識別用のプロ−ブを合成されたc-DNAにハイブリダイズさせ区別する。 Some m-RNA is 3 'only end of the poly A sequence flanking sequences are also indistinguishable, they are professional for identification - distinguishing hybridized to c-DNA of the blanking synthesized.

【0015】 [0015]

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明する。 EXAMPLES The following specifically describes the invention based on examples. ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 However, the present invention is not limited to these examples. 〔実施例1〕オリゴチップは、石英基板1の各区画2の表面にScience(251,767〜773(1991))に報告された手法を用いてDNAオリゴマ−を作成することにより調製する。 EXAMPLE 1 oligo chip, DNA oligomers with each compartment 2 of the surface of the quartz substrate 1 was reported in Science (251,767~773 (1991)) approach - is prepared by creating a. このオリゴチップの模式図は図1のとおりである。 Schematic of this oligo chip is shown in Figure 1.
このオリゴマ−はリンカ−を通して表面に結合させても、直接結合させてもよい。 The oligomer - linker - be bound to the surface through, it may be a direct bond. オリゴチップは縦、横100 Oligo chip is vertical, horizontal 100
の区画からなっており、全部で10 4箇の区画を10mm四方にもつ。 It has become the compartment, with a section of a total of 10 4箇to 10mm square. ただし図1では模式図なため、区画数は実際のものより少なく表示してある。 However, in schematic diagram a for 1, the number of partitions are labeled as less than actual. m-RNAのポリA部とハイブリダイズするポリT部の長さは5〜20merでこれだけでは安定なハイブリドマ−を作らない長さとする。 The length of the poly A portion that hybridizes to the poly T portion of the m-RNA is only this 5~20mer stable Haiburidoma - a length not to make. これに続く任意配列の7マ−の部分とあわさり初めて安定になるように設計する。 Any sequence of 7 during subsequent - designed to be a portion with mating first stable. T部の長さは、オリゴチップ上でのハイブリダイゼ−ションには0.15M〜0.2Mの塩強度で、変性温度が40℃以下が望ましいので20mer以下であればよい。 The length of the T section, hybridization on oligo chip - a salt strength of 0.15M~0.2M the Deployment may be at 20mer less because denaturation temperature is desirable 40 ° C. or less. また4mer以下ではm-RNAのポリA部に対する特異性が低下する。 The specificity is reduced against the poly A portion of the m-RNA in 4mer below. よってポリT部の長さは5〜20merがよい。 Thus the length of the poly T section good 5~20Mer.
さらに望ましくは6〜10merがよい。 More preferably it is 6~10Mer. 任意配列は2〜8m Any array 2~8m
er程度が良く、長くなりすぎると、ここだけで安定なハイブリダイゼ−ションを起し、A末端以外とハイブアリダイズする危険性がある。 Good about er, if too long, only a stable hybridization here - cause Deployment, there is a risk of non-A terminal and hives ant soybean. 任意配列中ポリA, C, G, Tなどあまり意味のない配列は除去し、種々のオリゴマ−を各区画に作る。 Any sequence poly A, C, G, T, etc. so insignificant sequences are removed, a variety of oligomers - making in each compartment.

【0016】次に本方法測定の手順を図2を用いて説明する。 [0016] Next, steps of the method measuring will be explained with reference to FIG. 図2は説明を容易にするために、オリゴチップの区画数やオリゴマ−は実際のものより少なく書かれている。 2 for ease of description, partition number or oligomer oligo chip - is written less than actual. オリゴチップにはオリゴマ−21〜24が各区画11〜14 Each compartment in the oligo chip oligomer -21~24 11 to 14
に結合している。 It is bound to. オリゴチップを反応容器に沈めたり、 Or submerged oligo chip to the reaction vessel,
周辺に枠を当てチップを底面とする反応容器を作り、m- The chip against the frame around to create a reaction vessel to the bottom surface, m-
RNA抽出液を注入して、ハイブリダイズさせる。 By injecting RNA extract, are hybridized. すると図2の、31,34,のようなオリゴチップに特異的に反応するm-RNAがハイブリダイズする。 Then in Figure 2, 31,34, m-RNA hybridizes specifically reactive to such oligo chip as. 次いでモノヌクレオチド(dNTP)と逆転写酵素を用いてm-RNAに対する相補DNA Then the complementary DNA for the m-RNA using reverse transcriptase and mononucleotides (dNTPs)
(c-DNA)鎖41,44を合成する。 Synthesizing (c-DNA) strands 41 and 44. この時、dNTPのいずれか少なくとも1つ(たとえばdCTP)に蛍光標識55を入れておく。 In this case, we put a fluorescent label 55 on at least one one of dNTPs (e.g. dCTP). 反応の結果、5'末端がオリゴチップ上に固定され、蛍光標識55を取り込んだc-DNA鎖ができる。 Result of the reaction, the 5 'end is fixed on the oligo chip, it is c-DNA strand incorporating the fluorescent label 55. 相補鎖の伸長はm-RNA配列とオリゴマ−配列が相補である場合にだけ起る。 Extension of the complementary strand m-RNA sequence and the oligomer - occurs only if the sequence is complementary. 配列が一致していないがハイブリダイズが起っている場合を極力少なくするため、ポリT以外のハイブリダイズ領域の長さは必要最小限とし、8mer以下がよい。 Because the array but does not match to minimize the case that occurred hybridize, the length of the hybridizing region other than poly-T is the minimum required, it is less 8 mer. また、反応温度を上げて相補でない組合せのハイブリダイゼ−ションを除去するのもよい。 Further, hybridization combinations that are not complementary by raising the reaction temperature - Deployment may to remove. 鎖長は16〜 The chain length is 16
21merがよい。 21mer is good. たとえばポリT部が15merで、任意配列部が6merなら変性温度が45℃前後になるので47℃〜50℃ Such as poly T unit is in 15mer, since the denaturation temperature if any sequence portion 6mer is around 45 ° C. 47 ° C. to 50 ° C.
の洗浄液で洗浄することで非特異的に結合したものを除くことができる。 It can be removed as non-specifically bound by washing with the washing solution.

【0017】反応液及び蛍光標識dNTPを除去し、洗浄した後、レ−ザ−顕微鏡(あるいは蛍光検出装置)で蛍光体の付着している区画を識別し、存在するm-RNAの3'末端配列とその量を知る。 [0017] After the reaction solution and the fluorescence-labeled dNTP were removed, washed, les - The - microscope (or fluorescence detection device) deposition of phosphor partitioned identifies that, the 3 'end of the m-RNA present array and know the amount. 生体の種々状態下で得たm-RNA m-RNA obtained under various conditions of a living body
分布パタ−ンの変化から各状況下におけるm-RNAの動きを知ることができる。 Distribution pattern - from the change in emissions can know the movement of the m-RNA under each situation. この方法では、1つの区画に複数のc-DNAが合成されている可能性があり、これらを識別する必要があるときは図3のように識別用の別の蛍光体で標識されたオリゴマ−プロ−ブをc-DNAにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無からこれらを識別できる。 Oligomer In this way, there is a possibility that a plurality of c-DNA in one compartment have been synthesized, when it is necessary to identify these labeled with another fluorescent material for identification as shown in Figure 3 - pro - Bed was hybridized to c-DNA, it can identify these from the presence or absence of hybridized. すなわち、図3に示すようにオリゴチップの同じ区画にオリゴチップのオリゴマ−では分別できない61,62 That is, oligomers oligo chip in the same compartment of oligo chip 3 - In can not be separated 61
のような複数のm-RNAが結合しうる。 It may bind more m-RNA, such as. この場合、逆転写酵素による相補鎖合成は、m-RNAの61,62に対しそれぞれ起り、同じ蛍光体を取り込んだ相補鎖c-DNA 71,72がそれぞれ合成される。 In this case, the complementary strand synthesis by reverse transcriptase, occur respectively to 61 and 62 m-RNA, a complementary strand c-DNA 71 and 72 incorporating the same phosphor is synthesized, respectively. この状態では2種のm-RNAを分別して定量することはできない。 It can not be quantified by fractionating the two m-RNA in this state. そこでまずホルムアミドや Therefore, first formamide Ya
95℃の熱水により洗浄してハイブリダイズしたm-RNAを除去する。 Washed with 95 ° C. hot water to remove the hybridized m-RNA by. すると1本鎖状態のc-DNAだけがオリゴチップ上にのこる。 Then only c-DNA of the single-stranded state remains on the oligo chip. この時2種のc-DNA 71,72は、お互いに異なる配列をもっているわけであるから、それぞれに特異的な第2、第3のオリゴマ−81,82を用意する。 Two c-DNA 71 and 72 at this time, since not have different sequences from one another, the second specific to each, to prepare a third oligomer -81,82. オリゴマ−81,82には、それぞれ異なる蛍光体91,92が結合している。 The oligomer -81,82, phosphor 91 and 92 differ respectively are attached. 91にはテトラメチルロ−ダミン、92にはスルホロ−ダミン101を使用すれば、He-Neレ−ザ−(543nm) The 91 Tetoramechiruro - rhodamine, Suruhoro the 92 - Using rhodamine 101, the He-Ne Les - The - (543 nm)
で励起できるレ−ザ−顕微鏡を用いることでテトラメチルロ−ダミン(TRITC)とスルホロ−ダミン(TR)由来の蛍光を分離して検出することができる。 In excitation can Les - The - Tetoramechiruro by using a microscope - rhodamine and (TRITC) Suruhoro - rhodamine (TR) can be detected separately fluorescence from. あるいは、c- Alternatively, c-
DNAにとりこまれる蛍光体をフルオレセイン(FITC)とすることで、FITC→TRITCあるいはTRへのエネルギ−トランスファ−を用いてTRITCあるいはTRを発光せしめ2 The phosphor incorporated in the DNA by a fluorescein (FITC), FITC → TRITC or energy to the TR - transfer - allowed emit TRITC or TR with 2
種のm-RNAを識別定量することもできる。 It is also possible to identify quantitative seeds m-RNA. 各c-DNAと第2、第3のオリゴマ−は、ハイブリダイゼ−ションしているのだから、c-DNAの中のフルオレセインと第2、第3のオリゴマ−中のテトラメチルロ−ダミンやスルホロ−ダミン101と分子レベルで接触している。 Each c-DNA and the second, third oligomer - may hybridization - because of being Deployment, fluorescein and the second in the c-DNA, the third oligomer - Tetoramechiruro Medium - rhodamine and Suruhoro - rhodamine 101 We are in contact at the molecular level. よってArレ−ザ(488nm)でフルオレセインを励起するとハイブリダイズしているオリゴマ−中のテトラメチルロ−ダミン Thus Ar Les - The oligomers are hybridized and to excite the fluorescein (488nm) - Medium Tetoramechiruro - rhodamine
91やスルホロ−ダミン101である92がエネルギ−トランスファ−により励起され蛍光を発する。 91 and Suruhoro - rhodamine is 101 92 energy - transfer - fluoresces when excited by. この場合は、オリゴチップの各区画に結合したc-DNA(これは、一区画に1種のc-DNAが結合したもの)と同一区画に2種のmR In this case, c-DNA (this is one of the c-DNA is obtained by coupling to one compartment) attached to each section of the oligo chip two mR the same compartment
NAが結合したものを1本のレ−ザで同時に検出できる利点がある。 NA is bound one record what - has the advantage that can be detected simultaneously in THE. 本実施例ではフルオレセイン、テトラメチルロ−ダミンとスルホロ−ダミン101を用いた例を示したが、もちろん他の蛍光体、例えば、ロ−ダミン系やフルオレセイン系、クマリン系、フタロシアニン系などの蛍光体の組合せがいろいろ使用できる。 Fluorescein In this embodiment, Tetoramechiruro - rhodamine and Suruhoro - although an example of using the rhodamine 101, of course other phosphors, for example, Russia - rhodamine system or fluorescein-based, coumarin, combinations of phosphors such as phthalocyanine but many can be used.

【0018】ここではm-RNAのポリAに続く3'末端配列を認識したが、3'末端にポリAのない細菌等のm-RNAの場合には3'末端に酵素を用いてポリAを付加した後同様の操作をすればよい。 [0018] Here, 'but recognize terminal sequence, 3' continues 3 to poly A of the m-RNA poly A with the enzyme at the 3 'end in the case of m-RNA, such as no poly A terminated bacteria it may be the same operation after adding. 配列既知のm-RNAだけをモニターすればよい場合には3'末端配列に代わってモニター配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを固体表面に作成して用いればよい。 The oligomer that hybridizes specifically to a monitor arranged in place of the 3 'terminal sequence may be used to create the solid surface when it is sufficient only monitor sequence known m-RNA.

【0019】〔実施例2〕実施例1ではポリAに続く3'末端配列を認識したが、これに代えて制限酵素の切断部に続く配列を認識してもよい。 [0019] Example 2 was recognized subsequent 3 'terminal sequence in Example 1, poly A, may recognize the sequence that follows the cutting part of the restriction enzyme instead. ポリTプライマーを用いてm-RNAを鋳型としてDNAを合成しc-DNAを得る。 Obtaining a synthesized c-DNA of the DNA as a template m-RNA with poly T primer. cD cD
NAを合成する時ポリTプライマーに蛍光標識やビオチン標識を入れておく。 We put a fluorescent label or a biotin-labeled poly T primer when synthesizing the NA. 次いで制限酵素Mbo Iなどを用いて切断する。 Then cut by using a restriction enzyme the Mbo I. 制限酵素は(種々m-RNA中に)なるべく均等に切断部が現れる4塩基認識酵素が良い。 Restriction enzymes (variously m-RNA in) as possible appears 4 base recognition enzyme may equally cut. 切断部に既知配列を持つ16〜20mer のオリゴマーをライゲーションにより結合させる。 It is bound by ligation oligomers 16~20mer having a known sequence to the cutting unit. ライゲーションでオリゴマーを導入する代わりに末端修飾酵素 Terminal Transferase を用いて3'末端にポリAを導入しこれを既知配列として利用しても良い。 Introducing a poly A at the 3 'end using terminal modification enzyme Terminal Transferase Instead of introducing the oligomer ligation may be utilized as a known sequence.

【0020】既知配列導入後RNA分解酵素RNase Hを用いてRNA鎖を分解し、c-DNA鎖(酵素切断された断片)を残す。 [0020] degrade the RNA strand using the known sequences introduced after RNA degrading enzyme RNase H, leaving a c-DNA strand (enzyme cleaved fragments). 磁気ビーズ等に付いたポリAからなるプローブを用意し、c-DNAのポリT端を持つものを分離する。 Providing a probe comprising a poly-A was attached to magnetic beads, etc., to isolate those with poly-T end of c-DNA. 分離には他の方法を用いても良い。 Other methods may be used for the separation. これらの操作により5'末端にポリT配列を持ち、3'末端が既知の配列(ライゲーションにより導入されたもの)を持つc-DNAだけを得ることができる。 'Has a poly-T sequence at the ends, 3' 5 by these operations end known sequence (introduced by ligation) can be obtained only c-DNA with. これはm-RNAのポリA部とそこに最も近い制限酵素切断部まで配列と相補的なc-DNA断片で、 This is a complementary c-DNA fragment with sequence nearest restriction portion therein and a poly A portion of the m-RNA,
各c-DNAに1個だけ存在するものである。 In which there is only one for each c-DNA. これは蛍光標識等がされており検出する時に有効に働く、以下の手順は実施例1とほぼ同一である。 This works effectively when detecting are fluorescent labels and the like, the following procedure is substantially the same as in Example 1.

【0021】オリゴチップのポリT配列の代わりに共通オリゴマー配列を使用する事、固体表面に固定したプライマーからの相補鎖合成時に標識物を入れる必要がない点などが主な相違点である。 [0021] The use of common oligomer sequence in place of oligo chip of poly T sequences, such that there is no need to include label at the time of complementary strand synthesis from the fixed primer on the solid surface are the main differences. 蛍光標識を用いる以外の検出法には化学発光やエレクトロルミネッセンスなどがあるがいずれの場合も発光反応を触媒する物質たとえばアルカリフォスファターゼなどをアビジンと結合させたものを用意しておき、アビジンをDNA鎖のビオチンと結合させて目的DNAを標識した後、ルミノールなど発光試薬を添加して発光せしめて検出する。 The detection methods other than the use of fluorescent labeled are prepared what is chemiluminescent and electroluminescent but conjugated with avidin such substances such as alkaline phosphatase also catalyzes a luminescent reaction in either case, avidin DNA strand after labeling the target DNA be coupled with biotin and detected allowed emission by adding a luminescence reagent such as luminol.

【0022】 [0022]

【発明の効果】本発明は、すべてのm-RNAをぬけおとすことなく計測し、その複数のm-RNAの存在比を同時に測定することができる利点がある。 According to the present invention, measured without reducing void all m-RNA, there is an advantage that can measure the abundance ratio of the plurality of m-RNA simultaneously. また、一枚のプロ−ブチップにm-RNAをハイブリダイズさせ、蛍光標識したcD Also, a single pro - Buchippu the m-RNA hybridized to, cD fluorescently labeled
NAを合成するだけなので、容易にm-RNA分布を測定することができる。 Because only synthesize NA, it can be measured easily m-RNA distribution. また、蛍光標識したc-DNAはプロ−ブチップの各区画上に保存されるので、これを鋳型として必要に応じて、その部位のc-DNAの相補鎖を合成し、塩基配列を決定することもできる利点がある。 Furthermore, c-DNA fluorescently labeled pro - because they are stored on each compartment of Buchippu, which if necessary as a template, to synthesize the complementary strand of c-DNA at that site, determining the nucleotide sequence there is an advantage that can be. さらに、本発明は塩基配列が未知なm-RNAでもその分布を測定できる利点がある。 Furthermore, the present invention has the advantage of nucleotide sequence can measure the distribution even unknown m-RNA. また、m-RNAの反応は、すべて同一のプロ−ブチップの表面で行われ、検出もプロ−ブチップアレ−表面のきめられた位置の蛍光強度を測定するだけなので、ハンドリングが容易で自動化が可能になる利点がある。 Further, the reaction of the m-RNA, all identical pro - place in Buchippu surface, detect pro - Buchippuare - since only measuring the fluorescence intensity of the determined position of the surface, to be capable of handling easy automation there is an advantage to be.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】オリゴチップの概念図。 FIG. 1 is a conceptual diagram of an oligo chip.

【図2】本発明でのm-RNA測定の概念図。 Conceptual diagram of m-RNA measured in the present invention; FIG.

【図3】本発明でのオリゴチップ上の同一区画に複数の [3] The present invention more in the same partition on oligo chip in
m-RNAが存在する場合のm-RNA測定の概念図。 Conceptual diagram of m-RNA measured in a case where m-RNA is present.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1…基板、2,11,12,13,14…区画、21,22,23,24…DNAオリゴマ−、31,34,61,62…オリゴチップ上に捕捉されたm 1 ... substrate, 2,11,12,13,14 ... compartment, 21, 22, 23, 24 ... DNA oligomers -, 31,34,61,62 ... captured on oligo chip m
-RNA、41,44,71,72…逆転写酵素で合成されたc-DNA、5 -RNA, c-DNA synthesized in 41,44,71,72 ... reverse transcriptase, 5
5,91,92…蛍光色素、81…第2のオリゴマ−、82…第3 5,91,92 ... fluorochrome, 81 ... second oligomer -, 82 ... third
のオリゴマ−。 Of oligomers -.

Claims (11)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 多種DNAオリゴマ−を種類ごとに区分けして固体表面に保持したプローブチップを用いて、m-RN 1. A wide DNA oligomers - with the by dividing each type probe tip held on the solid surface, m-RN
    Aの存在比を計測することを特徴とするm-RNAの解析法。 Analysis of m-RNA, which comprises measuring the abundance ratio of A.
  2. 【請求項2】 DNAオリゴマ−が共通配列とその3'末端側に2mer〜8merの任意配列を含むものであることを特徴とする請求項1記載のm-RNAの種類分布解析法。 2. A DNA oligomers - the type distribution analysis of m-RNA of claim 1, wherein a is intended to include any sequence of 2mer~8mer the consensus sequence and its 3 'end.
  3. 【請求項3】 DNAオリゴマ−の共通配列が、ポリTであることを特徴とする請求項2記載のm-RNAの種類分布解析法。 3. A DNA oligomers - the common sequence, type distribution analysis of m-RNA of claim 2, wherein the poly T.
  4. 【請求項4】 DNAオリゴマーの共通配列が、c-DNA 4. A common sequence of DNA oligomer, c-DNA
    の酵素切断部に導入されたオリゴマー配列あるいはそれと相補的な配列を含むことを特徴とする請求項2記載の According to claim 2, characterized in that it comprises an oligomer sequences or a sequence complementary to that introduced into the enzymatic cleavage of the
    m-RNAの種類分布解析法。 Type distribution analysis of m-RNA.
  5. 【請求項5】 DNAオリゴマ−が、m-RNAあるいはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列からなるものであることを特徴とするm-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ− 5. A DNA oligomer - is, m-RNA or cDNA to hybridize specifically to the m-RNA, characterized in that is made of a sequence-type distribution analysis of DNA oligomers -
    アレ−。 Array -.
  6. 【請求項6】 m-RNAに特異的にハイブリダイズする配列が、共通配列とその3'末端側に2mer〜8merの任意配列を含むものであることを特徴とする請求項5記載の 6. m-RNA that specifically hybridizes to sequences of claim 5, wherein a common sequence and its 3 'end is intended to include any sequence of 2mer~8mer
    m-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ−アレ−。 m-RNA of type distribution analysis of DNA oligomer - array -.
  7. 【請求項7】 m-RNAに特異的にハイブリダイズする配列が、共通配列とその3'末端側に2mer〜5merの任意配列を含むものであることを特徴とする請求項5記載の 7. A m-RNA that specifically hybridizes to sequences of claim 5, wherein a common sequence and its 3 'end is intended to include any sequence of 2mer~5mer
    m-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ−アレ−。 m-RNA of type distribution analysis of DNA oligomer - array -.
  8. 【請求項8】 共通配列が、ポリTであって、該ポリTが5〜20merである請求項6記載のm-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ−アレ−。 8. A consensus sequence is a poly-T, wherein the poly T is for type distribution analysis of m-RNA of claim 6 wherein the 5~20Mer DNA oligomers - array -.
  9. 【請求項9】 共通配列が、c-DNAの酵素切断部に導入されたオリゴマー配列あるいはそれと相補的な配列である請求項6記載のm-RNAの種類分布解析用のDNAオリゴマ−アレ−。 9. common sequence, c-DNA of the enzyme is introduced into the cut portion oligomer sequence or it sequence complementary is claim 6, wherein the m-RNA type distribution analysis of DNA oligomers - array -.
  10. 【請求項10】 (1)請求項5〜8のいずれかに記載のオリゴマ−アレ−にm-RNA抽出液を接触させ、オリゴマ− 10. (1) according to any one of claims 5-8 oligomer - array - to contacting the m-RNA extract, oligomer -
    アレ−表面のDNAオリゴマ−に各m-RNAをハイブリダイズさせる工程、(2)逆転写酵素と4種のうち少なくとも1 Array - the surface of the DNA oligomer - step of hybridizing each m-RNA in one at least of (2) reverse transcriptase and four
    種の蛍光標識dNTPと他のdNTPを用いてオリゴマ−アレ− Array - oligomers using a fluorescently labeled dNTP and other dNTP species -
    にハイブリダイズしたm-RNAに相補的で蛍光標識されたc c fluorescently labeled complementary to the hybridized m-RNA in
    -DNAを合成する工程、および(3)オリゴマ−アレ−上の各区分けした部位の蛍光を測定することで各m-RNAの量を定量する工程、を含むことを特徴とするm-RNAの種類分布解析法。 Step synthesizing-DNA, and (3) oligomers - array - quantifying the amount of each m-RNA by measuring the fluorescence of each divided the site above, the m-RNA, which comprises a type distribution analysis method.
  11. 【請求項11】 (1)請求項5〜8のいずれかに記載のオリゴマ−アレ−にm-RNA抽出液を接触させ、オリゴマ− 11. (1) according to any one of claims 5-8 oligomer - array - to contacting the m-RNA extract, oligomer -
    アレ−表面のDNAオリゴマ−に各m-RNAをハイブリダイズさせる工程、(2)逆転写酵素と4種のうち少なくとも1 Array - the surface of the DNA oligomer - step of hybridizing each m-RNA in one at least of (2) reverse transcriptase and four
    種の蛍光標識dNTPと他のdNTPを用いてオリゴマ−アレ− Array - oligomers using a fluorescently labeled dNTP and other dNTP species -
    にハイブリダイズしたm-RNAに相補的で蛍光標識されたc c fluorescently labeled complementary to the hybridized m-RNA in
    -DNAを合成する工程、(3)c-DNAに相補的で他の蛍光体で標識したプロ−ブDNAをハイブリダイゼ−ションさせる工程、(4)c-DNAに含まれる蛍光体と上記(3)の行程でハイブリダイズさせたプロ−ブDNA中の他の蛍光体の間のエネルギ−トランスファ−を用いて、一方の蛍光体を励起させることで他方の蛍光体からの蛍光を検出する工程、(5)オリゴマ−アレ−上の各区分けした部位の蛍光を測定することで各m-RNAの量を定量する工程、を含むことを特徴とするm-RNAの種類分布解析法。 A step of synthesizing a-DNA, (3) were labeled with complementary and other phosphors to c-DNA pro - Bed DNA and hybridization - Deployment is to process, (4) a phosphor and the (3 contained in the c-DNA energy between the other phosphors of the probe in the DNA - - Pro was hybridized with stroke) transfer - is used to detect the fluorescence from the other of the phosphor by exciting the one phosphor step, (5) oligomers - array - type distribution analysis of m-RNA, which comprises the step, the quantitating the amount of each m-RNA by measuring the fluorescence of each divided the site above.
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