JPH07123996A - 精製組み換えｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白質およびその製法 - Google Patents
精製組み換えｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白質およびその製法Info
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- JPH07123996A JPH07123996A JP5296065A JP29606593A JPH07123996A JP H07123996 A JPH07123996 A JP H07123996A JP 5296065 A JP5296065 A JP 5296065A JP 29606593 A JP29606593 A JP 29606593A JP H07123996 A JPH07123996 A JP H07123996A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺
伝子を発現可能なように含有する組み換えワクシニアウ
イルスを感染させるか又は、この組み換えウイルスとＲ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現可能なように含有する別
の組み換えワクシニアウイルスとで重感染させた動物細
胞の培養物から生産されるＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白
質、その製造方法、並びにこれら組み換えワクシニアウ
イルスベクター。 【効果】 天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗
体との間で良好な免疫学的反応性を示す組み換え蛋白質
を効率よく産生できる。
伝子を発現可能なように含有する組み換えワクシニアウ
イルスを感染させるか又は、この組み換えウイルスとＲ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現可能なように含有する別
の組み換えワクシニアウイルスとで重感染させた動物細
胞の培養物から生産されるＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白
質、その製造方法、並びにこれら組み換えワクシニアウ
イルスベクター。 【効果】 天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗
体との間で良好な免疫学的反応性を示す組み換え蛋白質
を効率よく産生できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組み換えＨＣＶ Ｅ２
／ＮＳ１蛋白質およびその製法に関する。さらに詳しく
は、本発明は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードす
る遺伝子を発現可能なように含有する組み換えワクシニ
アウイルスを感染させるか又は、この組み換えウイルス
とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現可能なように含有す
る別の組み換えワクシニアウイルスとを重感染させた動
物細胞の培養物から得られる精製組み換えＨＣＶ Ｅ２
／ＮＳ１蛋白質に関する。
／ＮＳ１蛋白質およびその製法に関する。さらに詳しく
は、本発明は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードす
る遺伝子を発現可能なように含有する組み換えワクシニ
アウイルスを感染させるか又は、この組み換えウイルス
とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現可能なように含有す
る別の組み換えワクシニアウイルスとを重感染させた動
物細胞の培養物から得られる精製組み換えＨＣＶ Ｅ２
／ＮＳ１蛋白質に関する。
【０００２】さらに、本発明は、該Ｅ２／ＮＳ１蛋白質
の産生に使用するこれら組み換えワクシニアウイルスベ
クターにも関する。
の産生に使用するこれら組み換えワクシニアウイルスベ
クターにも関する。
【０００３】
【従来の技術】肝炎ウイルスのうち、Ａ型肝炎ウイルス
とＢ型肝炎ウイルスが発見された後もＡでもＢでもない
ウイルス（非Ａ非Ｂ型）が存在することが知られてい
た。非Ａ非Ｂ型肝炎は、発症後慢性化しやすく、高率に
肝硬変から肝癌に移行するといわれており、その病因ウ
イルスの分離同定が急がれていた。１９８９年、遺伝子
工学の技術を使用することで、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血
清と特異的に反応する蛋白質を発現する遺伝子がクロー
ニングされ、その遺伝子をもつウイルスがＣ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）と名付けられた。まず、米国カイロン社
によってＨＣＶの非構造領域（ＮＳ）であるＮＳ3 およ
びＮＳ4 がコードする蛋白質(C100-3)に対する抗体（C1
00-3抗体）を測定する方法が開発された(Kuoら，Scienc
e 244, 362-364 (1989)) 。しかし、カイロン社のＨＣ
Ｖ診断システムに使用されているＮＳ4 前半(C100-3)の
領域は、慢性肝炎患者では70％程度の抗体検出率しか示
さない。したがって、C100-3抗体陰性であるにも拘ら
ず、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性例の存在が知られるようにな
り、C100-3抗体ではＣ型肝炎の診断および輸血後肝炎の
予防は不十分であることがわかった。その後カイロン社
をはじめとする、いくつかの研究グループによってＨＣ
Ｖ遺伝子の全貌が明らかにされてきた（Chooら，Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455 (1991); Inchau
spe ら， Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88, 10292-10296
(1991); Katoら， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87, 95
24-9528 (1990); Takamizawaら，J. Virol. 65, 1105-1
113 (1991);Tanakaら，Virus Research 23, 39-53 (19
92); Okamoto ら， J. gen. Virol.72, 2697-2704 (199
1); および Okamotoら， Virology 188, 331-341 (199
2)）。
とＢ型肝炎ウイルスが発見された後もＡでもＢでもない
ウイルス（非Ａ非Ｂ型）が存在することが知られてい
た。非Ａ非Ｂ型肝炎は、発症後慢性化しやすく、高率に
肝硬変から肝癌に移行するといわれており、その病因ウ
イルスの分離同定が急がれていた。１９８９年、遺伝子
工学の技術を使用することで、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血
清と特異的に反応する蛋白質を発現する遺伝子がクロー
ニングされ、その遺伝子をもつウイルスがＣ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）と名付けられた。まず、米国カイロン社
によってＨＣＶの非構造領域（ＮＳ）であるＮＳ3 およ
びＮＳ4 がコードする蛋白質(C100-3)に対する抗体（C1
00-3抗体）を測定する方法が開発された(Kuoら，Scienc
e 244, 362-364 (1989)) 。しかし、カイロン社のＨＣ
Ｖ診断システムに使用されているＮＳ4 前半(C100-3)の
領域は、慢性肝炎患者では70％程度の抗体検出率しか示
さない。したがって、C100-3抗体陰性であるにも拘ら
ず、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性例の存在が知られるようにな
り、C100-3抗体ではＣ型肝炎の診断および輸血後肝炎の
予防は不十分であることがわかった。その後カイロン社
をはじめとする、いくつかの研究グループによってＨＣ
Ｖ遺伝子の全貌が明らかにされてきた（Chooら，Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455 (1991); Inchau
spe ら， Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88, 10292-10296
(1991); Katoら， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87, 95
24-9528 (1990); Takamizawaら，J. Virol. 65, 1105-1
113 (1991);Tanakaら，Virus Research 23, 39-53 (19
92); Okamoto ら， J. gen. Virol.72, 2697-2704 (199
1); および Okamotoら， Virology 188, 331-341 (199
2)）。
【０００４】前述のC100-3抗体はＨＣＶ遺伝子の非構造
領域であるＮＳ3 後半からＮＳ4 前半をコードする蛋白
質に対する抗体であって、ＨＣＶ構造蛋白質に対する抗
体ではないということ、米国型のＨＣＶよりクローニン
グされたこと等が原因となり検出感度が充分ではないと
考えられる。この問題を改善するため、構造蛋白質をコ
ードするＨＣＶコア蛋白質に対する抗体の検出系や、構
造領域と非構造領域の両者を混合使用した第２世代ＨＣ
Ｖ抗体検出系の開発が進められてきた。
領域であるＮＳ3 後半からＮＳ4 前半をコードする蛋白
質に対する抗体であって、ＨＣＶ構造蛋白質に対する抗
体ではないということ、米国型のＨＣＶよりクローニン
グされたこと等が原因となり検出感度が充分ではないと
考えられる。この問題を改善するため、構造蛋白質をコ
ードするＨＣＶコア蛋白質に対する抗体の検出系や、構
造領域と非構造領域の両者を混合使用した第２世代ＨＣ
Ｖ抗体検出系の開発が進められてきた。
【０００５】構造蛋白質のうちエンベロープ蛋白質を構
成する蛋白質にはＥ1 蛋白質とＥ２／ＮＳ１蛋白質があ
る。Ｅ1 蛋白質に対する抗体は検出頻度が低く、Ｅ1 蛋
白質が抗体産生の標的となりにくいか、あるいはＥ1 蛋
白質が変異に富んでいることに起因してＥ1 蛋白質に対
する抗体の検出率が低い。もう一つのエンベロープ蛋白
質であるＥ２／ＮＳ１蛋白質については、フラビウイル
スの遺伝子構造との比較から非構造蛋白質をコードする
ＮＳ1 遺伝子として提唱されたが、糖鎖付加部位の存在
からエンベロープ蛋白質をコードするＥ2 遺伝子に相当
することが判明し、従ってＥ２／ＮＳ１蛋白質と呼称さ
れている。
成する蛋白質にはＥ1 蛋白質とＥ２／ＮＳ１蛋白質があ
る。Ｅ1 蛋白質に対する抗体は検出頻度が低く、Ｅ1 蛋
白質が抗体産生の標的となりにくいか、あるいはＥ1 蛋
白質が変異に富んでいることに起因してＥ1 蛋白質に対
する抗体の検出率が低い。もう一つのエンベロープ蛋白
質であるＥ２／ＮＳ１蛋白質については、フラビウイル
スの遺伝子構造との比較から非構造蛋白質をコードする
ＮＳ1 遺伝子として提唱されたが、糖鎖付加部位の存在
からエンベロープ蛋白質をコードするＥ2 遺伝子に相当
することが判明し、従ってＥ２／ＮＳ１蛋白質と呼称さ
れている。
【０００６】井上ら（J.gen.Virol.(1992)73, 2151-215
4 ）は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ1領域を含むアミノ酸
番号３８２番目から５５９番目を含む蛋白質をカイコ多
角体病ウイルスを用いてＳｆ９細胞中で発現させてい
る。彼らが発現させたＮ１５２０蛋白は糖鎖付加がな
く、慢性の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清との反応性もイム
ノブロッティングにより13.4％と低い。また、精製方法
については具体的に提示されていない。D.Y. Chienら
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, p.10011-10015）
は、２５７アミノ酸からなるＥ２抗原をバキュロウイル
スを使用しＳｆ細胞にて分泌蛋白質として得ているが、
その反応性は慢性非Ａ非Ｂ肝炎患者に対しても６１％と
低い。これは用いた遺伝子領域によってコードされる蛋
白質の抗原性が低いか、もしくはバキュロウイルスの糖
鎖構造が反応性を阻害していることが考えられる。
4 ）は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ1領域を含むアミノ酸
番号３８２番目から５５９番目を含む蛋白質をカイコ多
角体病ウイルスを用いてＳｆ９細胞中で発現させてい
る。彼らが発現させたＮ１５２０蛋白は糖鎖付加がな
く、慢性の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清との反応性もイム
ノブロッティングにより13.4％と低い。また、精製方法
については具体的に提示されていない。D.Y. Chienら
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, p.10011-10015）
は、２５７アミノ酸からなるＥ２抗原をバキュロウイル
スを使用しＳｆ細胞にて分泌蛋白質として得ているが、
その反応性は慢性非Ａ非Ｂ肝炎患者に対しても６１％と
低い。これは用いた遺伝子領域によってコードされる蛋
白質の抗原性が低いか、もしくはバキュロウイルスの糖
鎖構造が反応性を阻害していることが考えられる。
【０００７】スパッテら（R.Spaete; Virology(1992) 1
88,819-830）は、発現ベクターとしてサイトメガロウイ
ルスプロモーターを有するベクターを使用し、ＣＨＯ細
胞によってＣ型肝炎ウイルスのＮＳ1 領域としてアミノ
酸番号１番目のMet から９１７番目のGly を含む細胞株
＃６２、アミノ酸番号４０６番目のGly から６６１番目
のGlu を含む細胞株＃７０（また７０−１４−８）、ア
ミノ酸番号３８３番目のAla から６６１番目のGlu を含
む細胞株＃２２（または２２−４０−３２）を得てい
る。彼らは細胞株＃７０、＃２２においてtpa シグナル
シークエンスをＮＳ1 遺伝子の５′−末端に結合させた
形で発現を行い７１kDa の蛋白質を分泌させている。し
かしながら、Ｃ型肝炎ウイルスの抗原蛋白質であるＥ２
／ＮＳ１蛋白質の回収方法については述べていない。
88,819-830）は、発現ベクターとしてサイトメガロウイ
ルスプロモーターを有するベクターを使用し、ＣＨＯ細
胞によってＣ型肝炎ウイルスのＮＳ1 領域としてアミノ
酸番号１番目のMet から９１７番目のGly を含む細胞株
＃６２、アミノ酸番号４０６番目のGly から６６１番目
のGlu を含む細胞株＃７０（また７０−１４−８）、ア
ミノ酸番号３８３番目のAla から６６１番目のGlu を含
む細胞株＃２２（または２２−４０−３２）を得てい
る。彼らは細胞株＃７０、＃２２においてtpa シグナル
シークエンスをＮＳ1 遺伝子の５′−末端に結合させた
形で発現を行い７１kDa の蛋白質を分泌させている。し
かしながら、Ｃ型肝炎ウイルスの抗原蛋白質であるＥ２
／ＮＳ１蛋白質の回収方法については述べていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする問題点】Ｅ２／ＮＳ１蛋白質
はＣ型肝炎ウイルスのエンベロープ蛋白質の一つと考え
られ、Ｃ型肝炎ウイルス感染による抗体の有無を確認す
る上で、構造蛋白質であるエンベロープ蛋白質に対する
抗体を検出することには意義がある。しかし、Ｅ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質は糖蛋白質であるため、Ｃ型肝炎ウイルスの
感染によるＥ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗体を検出する
ための抗原蛋白質としてはより天然型に近い糖鎖構造を
有するＥ２／ＮＳ１蛋白質を用いることが望ましい。こ
れまで、Ｅ２／ＮＳ１抗原は、昆虫細胞（Y. Matsuura
ら，J. Virology 66, 1425-1431 (1992)；バキュロウイ
ルス使用）、ＣＨＯ細胞（スパッテら、上掲）、酵母
（Kuo ら，(1991) in “Viral Hepatitis and Liver Di
sease ” pp.347-349, Williamsand Wilkins, Baltimor
e, MD.; Spaete ら，Virology 188, 819-830 (1992)）
による発現が報告されている。しかし、酵母、昆虫細胞
では、大量に安定した抗原が得られる反面、糖鎖構造や
蛋白質の高次構造がヒト体内で発現している抗原とは異
なっていることが考えられる。ＣＨＯ細胞ではヒト体内
で発現している抗原と似た糖鎖構造を有する蛋白質が得
られると期待されるが、発現量が少なく、抗原の大量精
製が困難である。
はＣ型肝炎ウイルスのエンベロープ蛋白質の一つと考え
られ、Ｃ型肝炎ウイルス感染による抗体の有無を確認す
る上で、構造蛋白質であるエンベロープ蛋白質に対する
抗体を検出することには意義がある。しかし、Ｅ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質は糖蛋白質であるため、Ｃ型肝炎ウイルスの
感染によるＥ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗体を検出する
ための抗原蛋白質としてはより天然型に近い糖鎖構造を
有するＥ２／ＮＳ１蛋白質を用いることが望ましい。こ
れまで、Ｅ２／ＮＳ１抗原は、昆虫細胞（Y. Matsuura
ら，J. Virology 66, 1425-1431 (1992)；バキュロウイ
ルス使用）、ＣＨＯ細胞（スパッテら、上掲）、酵母
（Kuo ら，(1991) in “Viral Hepatitis and Liver Di
sease ” pp.347-349, Williamsand Wilkins, Baltimor
e, MD.; Spaete ら，Virology 188, 819-830 (1992)）
による発現が報告されている。しかし、酵母、昆虫細胞
では、大量に安定した抗原が得られる反面、糖鎖構造や
蛋白質の高次構造がヒト体内で発現している抗原とは異
なっていることが考えられる。ＣＨＯ細胞ではヒト体内
で発現している抗原と似た糖鎖構造を有する蛋白質が得
られると期待されるが、発現量が少なく、抗原の大量精
製が困難である。
【０００９】患者血清中のＣ型肝炎ウイルスＥ２／ＮＳ
１蛋白質に対する抗体を正確に検出するためには、Ｃ型
肝炎ウイルス感染者の体内でウイルスが発現しているＥ
２／ＮＳ１蛋白質と同様の折りたたみ様式（folding ）
や糖鎖付加等の修飾を受けている抗原を多量に得ること
が必要である。
１蛋白質に対する抗体を正確に検出するためには、Ｃ型
肝炎ウイルス感染者の体内でウイルスが発現しているＥ
２／ＮＳ１蛋白質と同様の折りたたみ様式（folding ）
や糖鎖付加等の修飾を受けている抗原を多量に得ること
が必要である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者らは、広範囲の動物細胞への感染が可能であるワ
クシニアウイルスをベクターとして用いることによっ
て、天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗体と免
疫学的に良好に反応することができるＨＣＶ Ｅ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質を動物細胞内で効率よく発現分泌させ得るこ
とを見出し、本発明を完成させた。
発明者らは、広範囲の動物細胞への感染が可能であるワ
クシニアウイルスをベクターとして用いることによっ
て、天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗体と免
疫学的に良好に反応することができるＨＣＶ Ｅ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質を動物細胞内で効率よく発現分泌させ得るこ
とを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】したがって、本発明は、ＨＣＶ Ｅ２／Ｎ
Ｓ１蛋白質をコードする遺伝子を発現可能なように含有
する組み換えワクシニアウイルスにより感染させた動物
細胞の培養物から生産される、天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ
１蛋白質に対する抗体と免疫学的に反応する精製組み換
えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を提供する。
Ｓ１蛋白質をコードする遺伝子を発現可能なように含有
する組み換えワクシニアウイルスにより感染させた動物
細胞の培養物から生産される、天然ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ
１蛋白質に対する抗体と免疫学的に反応する精製組み換
えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を提供する。
【００１２】ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードする
遺伝子のヌクレオチド配列及び該蛋白質の推定アミノ酸
配列は、例えば国際特許出願公開第ＷＯ９０／１１０８
９号公報（カイロン社）、Takamizawaら，J. Virol. 6
5: 1105-1113 (1991)、Katoら，Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 87: 9524-9528 (1990)、Inchauspe ら，Proc.N
atl. Acad. Sci. USA, 88: 10292-10296 (19991) 、Tan
akaら，Virus Research, 23: 39-53 (1992)、Okamoto
ら，J. gen. Virol., 72: 2697-2704 (1991)、Okamoto
ら，Virology, 188: 331-341 (1992) 、本出願人による
特願平４−８８１４０号（平成４年３月１２日出願）等
に記載されており、従って、本発明の組み換え蛋白質
は、これらの文献等に記載される、変異体を含む任意の
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１配列及びその部分配列を使用し、
本発明方法を用いて得ることができる。具体的には、後
記配列表中の配列番号：１に示される全アミノ酸配列又
はその部分配列をコードする遺伝子である。ここで、
「部分配列」は、配列番号：１に示されるアミノ酸番号
２１〜２９８の配列又はその部分配列を指す。
遺伝子のヌクレオチド配列及び該蛋白質の推定アミノ酸
配列は、例えば国際特許出願公開第ＷＯ９０／１１０８
９号公報（カイロン社）、Takamizawaら，J. Virol. 6
5: 1105-1113 (1991)、Katoら，Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 87: 9524-9528 (1990)、Inchauspe ら，Proc.N
atl. Acad. Sci. USA, 88: 10292-10296 (19991) 、Tan
akaら，Virus Research, 23: 39-53 (1992)、Okamoto
ら，J. gen. Virol., 72: 2697-2704 (1991)、Okamoto
ら，Virology, 188: 331-341 (1992) 、本出願人による
特願平４−８８１４０号（平成４年３月１２日出願）等
に記載されており、従って、本発明の組み換え蛋白質
は、これらの文献等に記載される、変異体を含む任意の
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１配列及びその部分配列を使用し、
本発明方法を用いて得ることができる。具体的には、後
記配列表中の配列番号：１に示される全アミノ酸配列又
はその部分配列をコードする遺伝子である。ここで、
「部分配列」は、配列番号：１に示されるアミノ酸番号
２１〜２９８の配列又はその部分配列を指す。
【００１３】なお、本明細書中「免疫学的に反応する」
なる用語は、抗原抗体反応することを意味する。
なる用語は、抗原抗体反応することを意味する。
【００１４】本発明の組み換え蛋白質は糖鎖を含んでい
てもよいし又は含まなくてもよいが、良好な免疫学的反
応性を得るためには糖鎖を含むのが好ましい。
てもよいし又は含まなくてもよいが、良好な免疫学的反
応性を得るためには糖鎖を含むのが好ましい。
【００１５】本発明の組み換えＥ２／ＮＳ１蛋白質は、
下記の２つの方法によって製造することができる。
下記の２つの方法によって製造することができる。
【００１６】第１の製法は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白
質をコードする遺伝子を組み換えワクシニアウイルスプ
ロモーターの制御下に配置して含む組み換えワクシニア
ウイルスを作製し、該組み換えワクシニアウイルスで動
物細胞を感染させ、得られた感染細胞を適当な条件下で
培養し、この間に該細胞内のワクシニアウイルス由来の
ＲＮＡポリメラーゼを利用して該遺伝子を発現し、分泌
された組み換えＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白質を回収し、こ
れを精製することを包含する。
質をコードする遺伝子を組み換えワクシニアウイルスプ
ロモーターの制御下に配置して含む組み換えワクシニア
ウイルスを作製し、該組み換えワクシニアウイルスで動
物細胞を感染させ、得られた感染細胞を適当な条件下で
培養し、この間に該細胞内のワクシニアウイルス由来の
ＲＮＡポリメラーゼを利用して該遺伝子を発現し、分泌
された組み換えＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白質を回収し、こ
れを精製することを包含する。
【００１７】第２の製法は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白
質をコードする遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に配
置して、この遺伝子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在時
のみ発現できるようにした第１の組み換えワクシニアウ
イルスを作製し、さらにこれとは別個に、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子をワクシニアウイルスプロモーターの
制御下に配置して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する
ことができるように第２の組み換えワクシニアウイルス
を作製し、これらの組み換えワクシニアウイルスで動物
細胞を重感染させ、得られた感染細胞を適当な条件下で
培養してＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺伝子
を発現し、分泌された組み換えＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白
質を回収し、これを精製することを包含する。
質をコードする遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に配
置して、この遺伝子がＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在時
のみ発現できるようにした第１の組み換えワクシニアウ
イルスを作製し、さらにこれとは別個に、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子をワクシニアウイルスプロモーターの
制御下に配置して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する
ことができるように第２の組み換えワクシニアウイルス
を作製し、これらの組み換えワクシニアウイルスで動物
細胞を重感染させ、得られた感染細胞を適当な条件下で
培養してＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺伝子
を発現し、分泌された組み換えＨＣＶＥ２／ＮＳ１蛋白
質を回収し、これを精製することを包含する。
【００１８】本発明範囲に含まれる上記２つの製法は、
ＲＮＡポリメラーゼを利用して目的蛋白質をコードする
遺伝子を発現する点で共通性を有するが、ＲＮＡポリメ
ラーゼ自体の発現の仕方が異なる。すなわち、前者の方
法では、ワクシニアウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼ
を利用するのに対し、後者の方法では、細胞内に外来Ｒ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入し、その発現産物を利用
する。
ＲＮＡポリメラーゼを利用して目的蛋白質をコードする
遺伝子を発現する点で共通性を有するが、ＲＮＡポリメ
ラーゼ自体の発現の仕方が異なる。すなわち、前者の方
法では、ワクシニアウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼ
を利用するのに対し、後者の方法では、細胞内に外来Ｒ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を導入し、その発現産物を利用
する。
【００１９】上記のいずれの製法によって発現させても
発現産物においてはその性状については変わりがなく、
同様の方法によってＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を培養
産物から精製することができる。
発現産物においてはその性状については変わりがなく、
同様の方法によってＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を培養
産物から精製することができる。
【００２０】ワクシニアウイルスとしては、Ｌｉｓｔｅ
ｒ株、ＷＲ株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（in V
accinia Viruses as Vectors for Vaccinia Antigens,
p.87-99 (Elsevier)）等を使用しうる。また、作製した
組み換えワクシニアウイルスを感染させる動物細胞とし
ては、ワクシニアウイルスが感染し易い全ての細胞、好
ましくは哺乳類由来の細胞、例えば癌細胞（例えば、Ｈ
ｅＬａ−ｓ３（ATCC CCL 2.2））、肝臓由来の細胞（例
えば、ＨｅｐＧ２（ATCC HB 8065））、血液由来の細胞
（例えば、Ｋ−５６２（ATCC CCL 243））等が挙げられ
る。培養条件は、使用する細胞の種類に応じて任意に選
択し得る。
ｒ株、ＷＲ株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（in V
accinia Viruses as Vectors for Vaccinia Antigens,
p.87-99 (Elsevier)）等を使用しうる。また、作製した
組み換えワクシニアウイルスを感染させる動物細胞とし
ては、ワクシニアウイルスが感染し易い全ての細胞、好
ましくは哺乳類由来の細胞、例えば癌細胞（例えば、Ｈ
ｅＬａ−ｓ３（ATCC CCL 2.2））、肝臓由来の細胞（例
えば、ＨｅｐＧ２（ATCC HB 8065））、血液由来の細胞
（例えば、Ｋ−５６２（ATCC CCL 243））等が挙げられ
る。培養条件は、使用する細胞の種類に応じて任意に選
択し得る。
【００２１】組み換えワクシニアウイルスの作製、ウイ
ルスの培養については、Current Protocol in Molecula
r Biology ，第２巻，第１５章“Protein Expression”
（１９８９年）（Willey Interscience ）に記載の方法
を使用して実施し得る。
ルスの培養については、Current Protocol in Molecula
r Biology ，第２巻，第１５章“Protein Expression”
（１９８９年）（Willey Interscience ）に記載の方法
を使用して実施し得る。
【００２２】１種類の組み換えワクシニアウイルスを用
いる方法において使用可能なワクシニアウイルスプロモ
ーターの具体例として、牛痘ウイルス由来のＡＴＩプロ
モーター（特開昭６１−２２２１９４号公報、J. Viro
l., 65:5584-5588 (1991)）、複合ウイルスプロモータ
ー（特開平２−１８６９９２号公報、本出願人による特
願平５−８４２４号（平成５年１月２１日出願）、ワク
シニアウイルスｐ７．５プロモーター（J. Virol., 54:
30-37 (1985)）を挙げることができる。組み換えワクシ
ニアウイルスは、ワクシニアウイルスプロモーターとワ
クシニアウイルス遺伝子（例えば、ＨＡ遺伝子）を保有
するプラスミドにＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子を挿入し
て得られる発現ベクターを制限的に線状化し、得られた
線状ベクターＤＮＡをワクシニアウイルス感染細胞にト
ランスフェクトすることによって得ることができる。そ
の具体例として、後述の実施例４に記載の組み換えワク
シニアウイルスＬＯ−ＳＦ2 Ｂ３８−Ｊ１１を挙げるこ
とができる。
いる方法において使用可能なワクシニアウイルスプロモ
ーターの具体例として、牛痘ウイルス由来のＡＴＩプロ
モーター（特開昭６１−２２２１９４号公報、J. Viro
l., 65:5584-5588 (1991)）、複合ウイルスプロモータ
ー（特開平２−１８６９９２号公報、本出願人による特
願平５−８４２４号（平成５年１月２１日出願）、ワク
シニアウイルスｐ７．５プロモーター（J. Virol., 54:
30-37 (1985)）を挙げることができる。組み換えワクシ
ニアウイルスは、ワクシニアウイルスプロモーターとワ
クシニアウイルス遺伝子（例えば、ＨＡ遺伝子）を保有
するプラスミドにＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子を挿入し
て得られる発現ベクターを制限的に線状化し、得られた
線状ベクターＤＮＡをワクシニアウイルス感染細胞にト
ランスフェクトすることによって得ることができる。そ
の具体例として、後述の実施例４に記載の組み換えワク
シニアウイルスＬＯ−ＳＦ2 Ｂ３８−Ｊ１１を挙げるこ
とができる。
【００２３】一方、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用した
２種類の組み換えワクシニアウイルスを重感染する方法
においては、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の発現を有効
に行わしめるためにはＴ７遺伝子１０のプロモーター
（DunnとStudier, J. Mol. Biol., 166:47-534 (1983)
）が好ましいが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識する
プロモーターであればその種類を問わない。さらに、必
要に応じてターミネーター領域、例えばＴ７遺伝子１０
のターミネーター領域（DunnとStudier ，上掲）等を含
んでもよい。
２種類の組み換えワクシニアウイルスを重感染する方法
においては、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の発現を有効
に行わしめるためにはＴ７遺伝子１０のプロモーター
（DunnとStudier, J. Mol. Biol., 166:47-534 (1983)
）が好ましいが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識する
プロモーターであればその種類を問わない。さらに、必
要に応じてターミネーター領域、例えばＴ７遺伝子１０
のターミネーター領域（DunnとStudier ，上掲）等を含
んでもよい。
【００２４】上記第１の組み換えワクシニアウイルスベ
クターは、Ｔ７プロモーター領域とワクシニアウイルス
遺伝子（例えば、ＨＡ遺伝子）を保有するプラスミドに
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子を挿入して得られる発現ベ
クターを制限的に線状化し、得られた線状ベクターＤＮ
Ａをワクシニアウイルス感染細胞にトランスフェクトす
ることによって得ることができる。このようなプラスミ
ドの具体例は図１に記載のｐＨＡ−Ｔ７であり、これ
は、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーター領域を含む
ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ製）とワクシニアウ
イルスＨＡ遺伝子を含むプラスミドｐＨＡ１３．１（EM
BO J. 6:339-3384 (1987) ）とを用いて図１に示す手順
で作製することができる。次に、ｐＨＡ−Ｔ７のＥcoＲ
Ｉ−ＨinｄIII にＥ２／ＮＳ１遺伝子領域のアミノ酸番
号３６４（ヌクレオチド番号１４１２；ＮcoＩ部位）か
らアミノ酸番号６６１（ヌクレオチド番号２３０５；Ｓ
acＩ部位）からなるＮcoＩ−ＳacＩ断片（図２のＬＯ−
Ｊ１１；配列番号：１に示される全アミノ酸配列）を挿
入することによってＥ２／ＮＳ１遺伝子発現ベクターｐ
Ｊ１１ΔＵＴＲとすることができる。この発現ベクター
を線状化した後、ワクシニアウイルス感染細胞にトラン
スフェクトすることによって組み換えワクシニアウイル
スＬＯ−Ｊ１１ΔＵＴＲを得ることができる。
クターは、Ｔ７プロモーター領域とワクシニアウイルス
遺伝子（例えば、ＨＡ遺伝子）を保有するプラスミドに
ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子を挿入して得られる発現ベ
クターを制限的に線状化し、得られた線状ベクターＤＮ
Ａをワクシニアウイルス感染細胞にトランスフェクトす
ることによって得ることができる。このようなプラスミ
ドの具体例は図１に記載のｐＨＡ−Ｔ７であり、これ
は、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーター領域を含む
ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ製）とワクシニアウ
イルスＨＡ遺伝子を含むプラスミドｐＨＡ１３．１（EM
BO J. 6:339-3384 (1987) ）とを用いて図１に示す手順
で作製することができる。次に、ｐＨＡ−Ｔ７のＥcoＲ
Ｉ−ＨinｄIII にＥ２／ＮＳ１遺伝子領域のアミノ酸番
号３６４（ヌクレオチド番号１４１２；ＮcoＩ部位）か
らアミノ酸番号６６１（ヌクレオチド番号２３０５；Ｓ
acＩ部位）からなるＮcoＩ−ＳacＩ断片（図２のＬＯ−
Ｊ１１；配列番号：１に示される全アミノ酸配列）を挿
入することによってＥ２／ＮＳ１遺伝子発現ベクターｐ
Ｊ１１ΔＵＴＲとすることができる。この発現ベクター
を線状化した後、ワクシニアウイルス感染細胞にトラン
スフェクトすることによって組み換えワクシニアウイル
スＬＯ−Ｊ１１ΔＵＴＲを得ることができる。
【００２５】一方、第２の組み換えワクシニアウイルス
ベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現をＴ
７プロモーターの存在下で操作的に可能にする発現ベク
ターを線状化した後、ワクシニアウイルス感染細胞にト
ランスフェクトすることによって得ることができる。こ
のような発現ベクターは例えば、Ｔ７−１遺伝子（Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＲ１
２１９（J. Mol. Biol. 189: 113〜130 ）からＴ７−１
遺伝子を制限的に切り出し、この遺伝子断片を、ワクシ
ニアウイルスＨＡ遺伝子のＮｒｕＩ認識部位にワクシニ
アウイルスｐ７．５プロモーターが組み込まれているｐ
ＶＲＩ（特開昭６１−２２２１９４号公報）に連結する
ことによって得ることができる（後述の実施例１のｐＶ
Ｒ−Ｔ７−１）。さらに、このｐＶＲ−Ｔ７−１から組
み換えワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１を得ることが
できる。
ベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現をＴ
７プロモーターの存在下で操作的に可能にする発現ベク
ターを線状化した後、ワクシニアウイルス感染細胞にト
ランスフェクトすることによって得ることができる。こ
のような発現ベクターは例えば、Ｔ７−１遺伝子（Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＲ１
２１９（J. Mol. Biol. 189: 113〜130 ）からＴ７−１
遺伝子を制限的に切り出し、この遺伝子断片を、ワクシ
ニアウイルスＨＡ遺伝子のＮｒｕＩ認識部位にワクシニ
アウイルスｐ７．５プロモーターが組み込まれているｐ
ＶＲＩ（特開昭６１−２２２１９４号公報）に連結する
ことによって得ることができる（後述の実施例１のｐＶ
Ｒ−Ｔ７−１）。さらに、このｐＶＲ−Ｔ７−１から組
み換えワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１を得ることが
できる。
【００２６】上記の組み換えワクシニアウイルスＬＯ−
Ｊ１１ΔＵＴＲ及びＬＯ−Ｔ７−１もまた本発明の範囲
に含まれる。
Ｊ１１ΔＵＴＲ及びＬＯ−Ｔ７−１もまた本発明の範囲
に含まれる。
【００２７】トランスフェクション法としては、この業
界で慣用の方法、例えばリン酸カルシウム法（EMBO J.
6: 3370〜3384 (1987) ）及びエレクトロポレーション
法（P. Guoら，J. Virol. 63: 4189〜4198(1989)）が使
用され得る。また、組み換えワクシニアウイルスのスク
リーニングは、先ず赤血球吸着試験（ＨＡ試験）（Shid
a, H., Virology, 150:451-462, 1986）によりＨＡ
（−）の組み換えウイルス候補株を取得し、次いで発現
ベクターに挿入した目的遺伝子をプローブとするプラー
クハイブリダイゼーションによって陽性クローンを検出
する手法により実施し得る。
界で慣用の方法、例えばリン酸カルシウム法（EMBO J.
6: 3370〜3384 (1987) ）及びエレクトロポレーション
法（P. Guoら，J. Virol. 63: 4189〜4198(1989)）が使
用され得る。また、組み換えワクシニアウイルスのスク
リーニングは、先ず赤血球吸着試験（ＨＡ試験）（Shid
a, H., Virology, 150:451-462, 1986）によりＨＡ
（−）の組み換えウイルス候補株を取得し、次いで発現
ベクターに挿入した目的遺伝子をプローブとするプラー
クハイブリダイゼーションによって陽性クローンを検出
する手法により実施し得る。
【００２８】本発明のＥ２／ＮＳ１蛋白質は、上記１種
類又は２種類の組み換えワクシニアウイルスを培養細胞
に感染させることで発現し、特に、ＨＣＶ由来のシグナ
ル配列を含んだ形で発現させるときには培養上清に分泌
する蛋白質として得ることができる。得られた蛋白質は
例えば、その培養上清を塩析し、得られた沈殿物を透析
等で脱塩した後、レンチルレクチンを結合させたアフィ
ニティカラムを用いて糖蛋白質として精製することがで
き、さらに、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質と免疫学的反
応性を示すマウスモノクローナル抗体等の特異抗体を結
合させたアフィニティカラムを用いて純化することがで
きる（図３参照）。上記のＬＯ−Ｊ１１ΔＵＴＲ及びＬ
Ｏ−Ｔ７−１を重感染したＨｅＬａ−Ｓ３（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２．２）細胞において発現して得られる糖蛋白質
（Ｊ１１）は、配列番号：１に示されるアミノ酸番号２
１〜２９８のアミノ酸配列を有し、かつ、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動上約４００００〜約５５００
０ダルトンの分子量を有している。
類又は２種類の組み換えワクシニアウイルスを培養細胞
に感染させることで発現し、特に、ＨＣＶ由来のシグナ
ル配列を含んだ形で発現させるときには培養上清に分泌
する蛋白質として得ることができる。得られた蛋白質は
例えば、その培養上清を塩析し、得られた沈殿物を透析
等で脱塩した後、レンチルレクチンを結合させたアフィ
ニティカラムを用いて糖蛋白質として精製することがで
き、さらに、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質と免疫学的反
応性を示すマウスモノクローナル抗体等の特異抗体を結
合させたアフィニティカラムを用いて純化することがで
きる（図３参照）。上記のＬＯ−Ｊ１１ΔＵＴＲ及びＬ
Ｏ−Ｔ７−１を重感染したＨｅＬａ−Ｓ３（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２．２）細胞において発現して得られる糖蛋白質
（Ｊ１１）は、配列番号：１に示されるアミノ酸番号２
１〜２９８のアミノ酸配列を有し、かつ、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動上約４００００〜約５５００
０ダルトンの分子量を有している。
【００２９】本発明の組み換えＥ２／ＮＳ１蛋白質は、
酵素抗体法等の免疫学的方法で測定することによって、
検体中のＨＣＶ抗体の検出及び定量化に使用することが
できる。
酵素抗体法等の免疫学的方法で測定することによって、
検体中のＨＣＶ抗体の検出及び定量化に使用することが
できる。
【００３０】
実施例１ ２種類ワクシニアウイルス作製用発現ベクタ
ーの構築 ベクターの構築は図１のようにして行なった。以下に概
略を説明する。Ｔ7 プロモーターとＴ7 ターミネーター
領域はpGEMEX-1(Promega製) のものを利用した。まず、
プラスミド pGEMEX-1 DNA ３μｇを制限酵素 XbaI １０
ユニットで３７℃にて２時間、反応液Ｈ（50mM Tris-HC
l (pH7.5) 、 10mM MgCl2 、1mM ジチオスレイトール、
100mM NaCl）中にて消化して、Ｔ7 遺伝子 10 とマルチ
クローニングサイトを含むヌクレオチド番号３０から９
４２を除去した。得られたプラスミドpGEMEX-1ΔXbaI D
NA３μｇを制限酵素 XbaI, HindIII各１０ユニットを含
む反応液H 中にて３７℃２時間で消化し、そこへ制限酵
素EcoRI とNcoIの認識部位を有するENH リンカーを挿入
した。ENH リンカーは、 ENH-1： 5′-CTAGGAATTCCCATGGAAGCTTAGCTAGGT- 3′ ENH-2： 5′-AGCTACCTAGCTAAGCTTCCATGGGAATTC- 3′ の２種のオリゴヌクレオチド各１μｇを９４℃から室温
まで保温することで生成されたアニール生成物からな
る。ENH リンカーを挿入したベクターをpA13-1と命名し
た。
ーの構築 ベクターの構築は図１のようにして行なった。以下に概
略を説明する。Ｔ7 プロモーターとＴ7 ターミネーター
領域はpGEMEX-1(Promega製) のものを利用した。まず、
プラスミド pGEMEX-1 DNA ３μｇを制限酵素 XbaI １０
ユニットで３７℃にて２時間、反応液Ｈ（50mM Tris-HC
l (pH7.5) 、 10mM MgCl2 、1mM ジチオスレイトール、
100mM NaCl）中にて消化して、Ｔ7 遺伝子 10 とマルチ
クローニングサイトを含むヌクレオチド番号３０から９
４２を除去した。得られたプラスミドpGEMEX-1ΔXbaI D
NA３μｇを制限酵素 XbaI, HindIII各１０ユニットを含
む反応液H 中にて３７℃２時間で消化し、そこへ制限酵
素EcoRI とNcoIの認識部位を有するENH リンカーを挿入
した。ENH リンカーは、 ENH-1： 5′-CTAGGAATTCCCATGGAAGCTTAGCTAGGT- 3′ ENH-2： 5′-AGCTACCTAGCTAAGCTTCCATGGGAATTC- 3′ の２種のオリゴヌクレオチド各１μｇを９４℃から室温
まで保温することで生成されたアニール生成物からな
る。ENH リンカーを挿入したベクターをpA13-1と命名し
た。
【００３１】プラスミド pA13-1 DNA １０μｇを制限酵
素BglII とAccIII各３０ユニットで反応液Ｈ中３７℃２
時間消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した約
610bp のDNA 断片 Genecleanキット（BIO 101 社製）を
用いてマニュアルに従って精製した。反応液１（10mM T
ris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2 1mM dATP, dCTP, dGTP,dTT
P、2 unit klenow 断片）にて Klenow 断片によるDNA
断片の平滑末端化を行なった。ワクシニアウイルスHA遺
伝子を含んだプラスミドの作製については、先ず、HA
（ヘマグルチニン）遺伝子を含むベクター pHA13.1（EM
BO J. 6; 3379-3384 (1987) ）DNA ３μｇを制限酵素Hi
ndIII で１０ユニットを用いて反応液Ｈ中にて３７℃、
２時間消化した後、前記の反応液１にて Klenow 断片に
よる DNAの平滑末端化し、DNA ライゲーションキット
（宝酒造（株）製）を用いて連結し、次に、得られたプ
ラスミド３μｇはさらに制限酵素EcoRI とSalI各１０ユ
ニットを含む反応液Ｈにて３７℃２時間の二重消化後、
反応液１中にて Klenow 断片を用いて DNAを平滑末端化
し、DNA ライゲーションキットを用いて連結した。得ら
れたプラスミドはpUC 由来のマルチクローニングサイト
を欠失しており、pA10-1と名付けた。プラスミド pA10-
1 DNA ３μｇを制限酵素 NruI にて反応液２（150mM KC
l 、6mM Tris-HCl(pH7.5) 、6mM MgCl2 、6mM 2-メルカ
プトエタノール）中にて３７℃２時間反応後、前記６１
０ｂｐの平滑末端化したBglII-AccIII DNAとともにDNA
ライゲーションキットにて連結反応を行った。ＨＡ遺伝
子の方向と逆方向にＴ7 プロモーターの配置したプラス
ミドpHA-T7を得た。この pHA-T7 ３μｇを制限酵素EcoR
I とHindIII を各１０ユニット含む反応液Ｈで消化した
ものをフェノール／クロロホルム抽出後に反応液１にて
Klenow断片により平滑末端化した。図２に示すＣ型肝炎
ウイルスのＮＳ１遺伝子領域を含む本出願人による特願
平４−８８１４０号（平成４年３月１２日出願）記載の
ＣＰ−４（微工研菌寄第１２７８６号（平成４年２月２
４日付寄託）５μｇから NcoI-SacI断片を切り出すため
に制限酵素ＳacＩ ２０ユニットとともに反応液Ｌ（10
mM Tris-HCl(pH7.5)、 10mM MgCl2 、1mM ジチオスレイ
トール）にて３７℃２時間インキュベートした後、塩濃
度が１００mMになるように 5M NaClを添加し、さらに制
限酵素 NcoI を２０ユニット反応液に加えて、３７℃４
時間消化した。フェノール／クロロホルム抽出後、DNA
ブランティングキット（宝酒造（株）製）を用いてマニ
ュアルに従い、DNA 断片を平滑末端化した。得られたプ
ラスミド pJ11 ΔUTR をＥ２／ＮＳ１遺伝子領域発現ベ
クターとして用いた。このベクターではＥ２／ＮＳ１蛋
白質のＣ末に存在する疎水性領域を除いたアミノ酸３６
４番目から６６１番目のアミノ酸（後記配列表中の配列
番号：１に示される全アミノ酸に相当する）からなる蛋
白質を発現することができ、シグナル配列としてＣ型肝
炎ウイルス由来のアミノ酸３６４番目から３８３番目の
２０アミノ酸（配列番号：１に示されるアミノ酸番号１
〜２０に相当する）を利用することにより、分泌蛋白質
として発現することが可能となった。
素BglII とAccIII各３０ユニットで反応液Ｈ中３７℃２
時間消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した約
610bp のDNA 断片 Genecleanキット（BIO 101 社製）を
用いてマニュアルに従って精製した。反応液１（10mM T
ris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2 1mM dATP, dCTP, dGTP,dTT
P、2 unit klenow 断片）にて Klenow 断片によるDNA
断片の平滑末端化を行なった。ワクシニアウイルスHA遺
伝子を含んだプラスミドの作製については、先ず、HA
（ヘマグルチニン）遺伝子を含むベクター pHA13.1（EM
BO J. 6; 3379-3384 (1987) ）DNA ３μｇを制限酵素Hi
ndIII で１０ユニットを用いて反応液Ｈ中にて３７℃、
２時間消化した後、前記の反応液１にて Klenow 断片に
よる DNAの平滑末端化し、DNA ライゲーションキット
（宝酒造（株）製）を用いて連結し、次に、得られたプ
ラスミド３μｇはさらに制限酵素EcoRI とSalI各１０ユ
ニットを含む反応液Ｈにて３７℃２時間の二重消化後、
反応液１中にて Klenow 断片を用いて DNAを平滑末端化
し、DNA ライゲーションキットを用いて連結した。得ら
れたプラスミドはpUC 由来のマルチクローニングサイト
を欠失しており、pA10-1と名付けた。プラスミド pA10-
1 DNA ３μｇを制限酵素 NruI にて反応液２（150mM KC
l 、6mM Tris-HCl(pH7.5) 、6mM MgCl2 、6mM 2-メルカ
プトエタノール）中にて３７℃２時間反応後、前記６１
０ｂｐの平滑末端化したBglII-AccIII DNAとともにDNA
ライゲーションキットにて連結反応を行った。ＨＡ遺伝
子の方向と逆方向にＴ7 プロモーターの配置したプラス
ミドpHA-T7を得た。この pHA-T7 ３μｇを制限酵素EcoR
I とHindIII を各１０ユニット含む反応液Ｈで消化した
ものをフェノール／クロロホルム抽出後に反応液１にて
Klenow断片により平滑末端化した。図２に示すＣ型肝炎
ウイルスのＮＳ１遺伝子領域を含む本出願人による特願
平４−８８１４０号（平成４年３月１２日出願）記載の
ＣＰ−４（微工研菌寄第１２７８６号（平成４年２月２
４日付寄託）５μｇから NcoI-SacI断片を切り出すため
に制限酵素ＳacＩ ２０ユニットとともに反応液Ｌ（10
mM Tris-HCl(pH7.5)、 10mM MgCl2 、1mM ジチオスレイ
トール）にて３７℃２時間インキュベートした後、塩濃
度が１００mMになるように 5M NaClを添加し、さらに制
限酵素 NcoI を２０ユニット反応液に加えて、３７℃４
時間消化した。フェノール／クロロホルム抽出後、DNA
ブランティングキット（宝酒造（株）製）を用いてマニ
ュアルに従い、DNA 断片を平滑末端化した。得られたプ
ラスミド pJ11 ΔUTR をＥ２／ＮＳ１遺伝子領域発現ベ
クターとして用いた。このベクターではＥ２／ＮＳ１蛋
白質のＣ末に存在する疎水性領域を除いたアミノ酸３６
４番目から６６１番目のアミノ酸（後記配列表中の配列
番号：１に示される全アミノ酸に相当する）からなる蛋
白質を発現することができ、シグナル配列としてＣ型肝
炎ウイルス由来のアミノ酸３６４番目から３８３番目の
２０アミノ酸（配列番号：１に示されるアミノ酸番号１
〜２０に相当する）を利用することにより、分泌蛋白質
として発現することが可能となった。
【００３２】一方、Ｔ7-1 遺伝子（Ｔ7 RNA ポリメラー
ゼ遺伝子）については、プラスミドpAR1219（J. Mol. B
iol. 189, p.113-130）を primer T7-I5′ 5′- GGATCCCGGGTAAATGAACACGATTAAC-
3′ primer T7-I3′ 5′- GGCCGAATTCATTACGCGAACGCGAA-3′ の２つのプライマー 100 pmoles とAmpliTaq（宝酒造
（株）製）５ユニットを用いて、 Gene Amp PCR Reagen
t キットのプロトコールに従い、PCR により約2.7kb の
Ｔ7-1 遺伝子を増幅した。増幅した T7-1 遺伝子を含む
DNA 断片０. ５μｇは制限酵素EcoRI とSmaIを各２０ユ
ニット含む反応液３（20mM Tris-酢酸、10mM酢酸マグネ
シウム、 50mM 酢酸カリウム、1mM ジチオスレイトール
（pH7.9 ，25℃）にて３７℃、６時間インキュベートし
た。 pUC119 DNA ３μｇを反応液３中にて制限酵素 Sma
I, EcoRI各１０ユニットで４時間反応した生成物と前記
Ｔ7-1遺伝子を含むDNA 断片をDNA ライゲーションキッ
トにより連結反応を行った。得られたプラスミドpUC119
-T7-1 ５μｇを制限酵素SmaI, EcoRI 各２０ユニットで
４時間上記と同様に反応させた後、Ｔ7-1 遺伝子を含む
２．７ｋｂの SmaI-EcoRI 断片を制限酵素 SmaI, EcoRI
各１０ユニットで反応液３にて消化した３μｇのpVR1
（特開昭61-222194 号公報）へ連結反応を行った。得ら
れたプラスミドpVR1-T7-1 から組換えワクシニアウイル
スを構築した。pVR1はワクシニアウイルスHA遺伝子のNr
uI認識部位にワクシニアウイルスP7.5プロモーターが組
み込まれており、このプロモーターによりＴ7-1 遺伝子
が発現されることになる。
ゼ遺伝子）については、プラスミドpAR1219（J. Mol. B
iol. 189, p.113-130）を primer T7-I5′ 5′- GGATCCCGGGTAAATGAACACGATTAAC-
3′ primer T7-I3′ 5′- GGCCGAATTCATTACGCGAACGCGAA-3′ の２つのプライマー 100 pmoles とAmpliTaq（宝酒造
（株）製）５ユニットを用いて、 Gene Amp PCR Reagen
t キットのプロトコールに従い、PCR により約2.7kb の
Ｔ7-1 遺伝子を増幅した。増幅した T7-1 遺伝子を含む
DNA 断片０. ５μｇは制限酵素EcoRI とSmaIを各２０ユ
ニット含む反応液３（20mM Tris-酢酸、10mM酢酸マグネ
シウム、 50mM 酢酸カリウム、1mM ジチオスレイトール
（pH7.9 ，25℃）にて３７℃、６時間インキュベートし
た。 pUC119 DNA ３μｇを反応液３中にて制限酵素 Sma
I, EcoRI各１０ユニットで４時間反応した生成物と前記
Ｔ7-1遺伝子を含むDNA 断片をDNA ライゲーションキッ
トにより連結反応を行った。得られたプラスミドpUC119
-T7-1 ５μｇを制限酵素SmaI, EcoRI 各２０ユニットで
４時間上記と同様に反応させた後、Ｔ7-1 遺伝子を含む
２．７ｋｂの SmaI-EcoRI 断片を制限酵素 SmaI, EcoRI
各１０ユニットで反応液３にて消化した３μｇのpVR1
（特開昭61-222194 号公報）へ連結反応を行った。得ら
れたプラスミドpVR1-T7-1 から組換えワクシニアウイル
スを構築した。pVR1はワクシニアウイルスHA遺伝子のNr
uI認識部位にワクシニアウイルスP7.5プロモーターが組
み込まれており、このプロモーターによりＴ7-1 遺伝子
が発現されることになる。
【００３３】実施例２ 組み換えワクシニアウイルスの
構築 上記のようにして得られた発現ベクターからの組み換え
ワクシニアウイルスの構築は EMBO J.6, 3379-3384 (19
87) にあるリン酸カルシウム法によるDNA 沈殿をワクシ
ニアウイルス感染細胞にトランスフェクトすることによ
り得られる。P.Guo ら（J. Virol. 63: 4189〜4198(198
9)）のエレクトロポレーションを用いる方法からも得ら
れる。後者の方法により組み換えウイルスを作製したの
で具体的に操作手順について以下に述べる。
構築 上記のようにして得られた発現ベクターからの組み換え
ワクシニアウイルスの構築は EMBO J.6, 3379-3384 (19
87) にあるリン酸カルシウム法によるDNA 沈殿をワクシ
ニアウイルス感染細胞にトランスフェクトすることによ
り得られる。P.Guo ら（J. Virol. 63: 4189〜4198(198
9)）のエレクトロポレーションを用いる方法からも得ら
れる。後者の方法により組み換えウイルスを作製したの
で具体的に操作手順について以下に述べる。
【００３４】ワクシニアウイルスLister株をm.o.i.（mu
ltiplicity of infection ）１０でウサギ腎細胞ＲＫ13
細胞（ATCC CCL 37 ） 1×107 細胞に感染させ、３７
℃、５％ＣＯ2 にて１時間保温後、ＰＢＳ（−）にて洗
浄したのち、トリプシン−EDTA（GIBCO 社製）にて細胞
を培養ボトルからはがし、８００rpm 、５分間の遠心操
作により、細胞を回収した。細胞は２０mlの 1×HeBS
（20mM Hepes pH 7.05, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0,7mM
Na2 HPO4 , 6mM デキストロース）に懸濁後、同じ遠心
操作により細胞を回収した。沈殿となっている細胞を1m
l の 1×HeBSに懸濁し、そのうち０．７mlを0.4mm 幅の
Genepulser キュベット（Bio Rad 社製）に移した。あ
らかじめ２５μｇのDNA を制限酵素 ScaI 100 ユニット
を含む反応液Ｈ２００μｌにて４時間３７℃でインキュ
ベートして直鎖状にした。フェノール／クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿により回収した直鎖状DNA はTE
（10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA ）0.1 mlに溶解し、
細胞懸濁液が入った上記Genepulserキュベットに加え
た。氷中１０分間放置したのち、 Bio Rad Genepulser
により２００Ｖ、９６０μＦのパルスを加えた。再び氷
中にて１０分間放置後、 4×106 のＲＫ1 ３細胞に感染
させ、感染２４時間後に細胞を回収し、志田らの方法
（EMBO J. 6, 3379-3384(1987)）により血球凝集能が消
失した組み換えワクシニアウイルスを分離した。得られ
た組み換えワクシニアウイルスは pJ11 ΔUTR から得た
ウイルスを LO-J11 ΔUTR, pVR-T7-1 から得たウイルス
を LO-T7-1と名付けた。
ltiplicity of infection ）１０でウサギ腎細胞ＲＫ13
細胞（ATCC CCL 37 ） 1×107 細胞に感染させ、３７
℃、５％ＣＯ2 にて１時間保温後、ＰＢＳ（−）にて洗
浄したのち、トリプシン−EDTA（GIBCO 社製）にて細胞
を培養ボトルからはがし、８００rpm 、５分間の遠心操
作により、細胞を回収した。細胞は２０mlの 1×HeBS
（20mM Hepes pH 7.05, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0,7mM
Na2 HPO4 , 6mM デキストロース）に懸濁後、同じ遠心
操作により細胞を回収した。沈殿となっている細胞を1m
l の 1×HeBSに懸濁し、そのうち０．７mlを0.4mm 幅の
Genepulser キュベット（Bio Rad 社製）に移した。あ
らかじめ２５μｇのDNA を制限酵素 ScaI 100 ユニット
を含む反応液Ｈ２００μｌにて４時間３７℃でインキュ
ベートして直鎖状にした。フェノール／クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿により回収した直鎖状DNA はTE
（10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA ）0.1 mlに溶解し、
細胞懸濁液が入った上記Genepulserキュベットに加え
た。氷中１０分間放置したのち、 Bio Rad Genepulser
により２００Ｖ、９６０μＦのパルスを加えた。再び氷
中にて１０分間放置後、 4×106 のＲＫ1 ３細胞に感染
させ、感染２４時間後に細胞を回収し、志田らの方法
（EMBO J. 6, 3379-3384(1987)）により血球凝集能が消
失した組み換えワクシニアウイルスを分離した。得られ
た組み換えワクシニアウイルスは pJ11 ΔUTR から得た
ウイルスを LO-J11 ΔUTR, pVR-T7-1 から得たウイルス
を LO-T7-1と名付けた。
【００３５】実施例３ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質（J11 蛋白
質）の精製 Ｅ２／ＮＳ１蛋白質として LO-J11 ΔUTR, LO-Ｔ7-1 を
重感染した細胞において発現される蛋白質（以下J11 蛋
白質と呼ぶ）を培養上清から回収する方法について述べ
る。
質）の精製 Ｅ２／ＮＳ１蛋白質として LO-J11 ΔUTR, LO-Ｔ7-1 を
重感染した細胞において発現される蛋白質（以下J11 蛋
白質と呼ぶ）を培養上清から回収する方法について述べ
る。
【００３６】組み換えワクシニアウイルス LO-J11 ΔUT
R はＴ7 プロモーターの発現制御のもとにＥ２／ＮＳ１
遺伝子を発現することができるウイルスであるので、Ｔ
7 RNA ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイ
ルス LO-Ｔ7-1 と重感染させることによりＥ２／ＮＳ１
遺伝子の発現が得られる。
R はＴ7 プロモーターの発現制御のもとにＥ２／ＮＳ１
遺伝子を発現することができるウイルスであるので、Ｔ
7 RNA ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイ
ルス LO-Ｔ7-1 と重感染させることによりＥ２／ＮＳ１
遺伝子の発現が得られる。
【００３７】ここでは、HeLa-S3 細胞からのJ11 蛋白質
の回収、精製方法について述べる（図３参照）。J11 蛋
白質は、HeLa-S3(ATCC CCL 2.2) に重感染することによ
り感染後２４時間から４８時間において培養上清中に分
泌される。ヌンク１７５cm2ボトル５本にHeLa-S3 細胞
をコンフルエントになるように培養し、培養液（Opti-M
EM（GIBCO 社製）／3% NBS）を除いた後、各ウイルスの
感染 m.o.i. が１０になるように、つまり１細胞あたり
LO-T7-1 と LO-J11 ΔUTR のそれぞれ１０ウイルス粒子
が感染するように調製したウイルス液（Opti-MEM）2ml
をそれぞれの培養ボトルに加え、３７℃、５％ ＣＯ2
１時保温した。１時間後、 Opti-MEM を１８ml各ボトル
に加え、さらに感染４８時間後まで保温した。感染細胞
は培養液とともに400 mlの遠沈ボトルに移し、 4000 rp
m 10分間の遠心操作の後、上清をファルコン 200mlチュ
ーブに移した。上清には飽和硫安濃度が４０％となるよ
うに硫安（NH4 ）2 SO4 を加え、４℃にて１晩放置し
た。5000rpm ３０分間の遠心操作から得られた上清にさ
らに硫安を加えて飽和硫安濃度が６０％になるようにし
て１晩４℃にて放置した。再び同様の遠心操作により得
られた沈殿物よりJ11蛋白質の精製を行った。濃縮され
た沈殿物は、NP40溶解バッファー（0.5% Nonidet P-40,
20mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM PMSF）に溶
解した後、脱塩するために透析を行った。脱塩したＮＳ
1 蛋白質を含む画分は、次に糖蛋白質の濃縮の際に常用
されるレンチル−レクチン Sepharose 4B カラム(Pharm
acia) にかけた。10% メチル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ドを含む NP40 溶解バッファーにより溶出を行った。さ
らに、抗ＮＳ1 抗体（Ｅ2-917 ）を用いたアフィニティ
カラムにかけ、図４に示すようにJ11 蛋白質をかなり純
度の高いものとして1.25×108 の細胞培養上清あたりピ
アス社のBCA 蛋白質アッセイキットを用いて蛋白量を定
量したところ約１２０μｇのJ11 蛋白質（アミノ酸配
列：配列番号１の２１〜２９８、分子量：約40,000〜5
5,000）を精製することができた。
の回収、精製方法について述べる（図３参照）。J11 蛋
白質は、HeLa-S3(ATCC CCL 2.2) に重感染することによ
り感染後２４時間から４８時間において培養上清中に分
泌される。ヌンク１７５cm2ボトル５本にHeLa-S3 細胞
をコンフルエントになるように培養し、培養液（Opti-M
EM（GIBCO 社製）／3% NBS）を除いた後、各ウイルスの
感染 m.o.i. が１０になるように、つまり１細胞あたり
LO-T7-1 と LO-J11 ΔUTR のそれぞれ１０ウイルス粒子
が感染するように調製したウイルス液（Opti-MEM）2ml
をそれぞれの培養ボトルに加え、３７℃、５％ ＣＯ2
１時保温した。１時間後、 Opti-MEM を１８ml各ボトル
に加え、さらに感染４８時間後まで保温した。感染細胞
は培養液とともに400 mlの遠沈ボトルに移し、 4000 rp
m 10分間の遠心操作の後、上清をファルコン 200mlチュ
ーブに移した。上清には飽和硫安濃度が４０％となるよ
うに硫安（NH4 ）2 SO4 を加え、４℃にて１晩放置し
た。5000rpm ３０分間の遠心操作から得られた上清にさ
らに硫安を加えて飽和硫安濃度が６０％になるようにし
て１晩４℃にて放置した。再び同様の遠心操作により得
られた沈殿物よりJ11蛋白質の精製を行った。濃縮され
た沈殿物は、NP40溶解バッファー（0.5% Nonidet P-40,
20mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM PMSF）に溶
解した後、脱塩するために透析を行った。脱塩したＮＳ
1 蛋白質を含む画分は、次に糖蛋白質の濃縮の際に常用
されるレンチル−レクチン Sepharose 4B カラム(Pharm
acia) にかけた。10% メチル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ドを含む NP40 溶解バッファーにより溶出を行った。さ
らに、抗ＮＳ1 抗体（Ｅ2-917 ）を用いたアフィニティ
カラムにかけ、図４に示すようにJ11 蛋白質をかなり純
度の高いものとして1.25×108 の細胞培養上清あたりピ
アス社のBCA 蛋白質アッセイキットを用いて蛋白量を定
量したところ約１２０μｇのJ11 蛋白質（アミノ酸配
列：配列番号１の２１〜２９８、分子量：約40,000〜5
5,000）を精製することができた。
【００３８】実施例４ １種類ワクシニアウイルス作製
用発現ベクターの構築 プラスミド pSF2 B38-16（本出願人による特願平５−８
４２４号（平成５年１月２１日出願））ＤＮＡ３μｇを
制限酵素ＳmaＩ １０ユニットを含む反応液Ｓ（10mM T
ris-HCl (pH7.5), 7mM MgCl2 , 20mM KCl, 7mM ２−メ
ルカプトエタノール，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）にて
３７℃６時間インキュベートした後、フェノール／クロ
ロホルム抽出後エタノール沈殿により精製した。Ｃ型肝
炎ウイルスのＮＳ１遺伝子領域を含む特願平４−８８１
４０号（平成４年３月１２日出願）記載のＣＰ−４（微
工研菌寄第１２７８６号（平成４年２月２４日付寄
託））５μｇから NcoI-SacI断片を切り出すために制限
酵素SacI 20 ユニットとともに反応液Ｌ（10mM Tris-HC
l(pH7.5), 10mM MgCl2 , 1mM ジチオスレイトール）に
て３７℃２時間インキュベートした後、塩濃度が１００
ｍＭとなるように５ＭＮａＣｌを添加し、さらに制限酵
素ＮcoＩを２０ユニット反応液に加えて、３７℃４時間
消化した。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡブ
ランティングキット（宝酒造（株）製）を用いてマニュ
アルに従い、ＤＮＡ断片を平滑末滑化した。得られたプ
ラスミド pSF2 B38-16-J11をＥ２／ＮＳ１遺伝子領域発
現ベクターとして用いた。
用発現ベクターの構築 プラスミド pSF2 B38-16（本出願人による特願平５−８
４２４号（平成５年１月２１日出願））ＤＮＡ３μｇを
制限酵素ＳmaＩ １０ユニットを含む反応液Ｓ（10mM T
ris-HCl (pH7.5), 7mM MgCl2 , 20mM KCl, 7mM ２−メ
ルカプトエタノール，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）にて
３７℃６時間インキュベートした後、フェノール／クロ
ロホルム抽出後エタノール沈殿により精製した。Ｃ型肝
炎ウイルスのＮＳ１遺伝子領域を含む特願平４−８８１
４０号（平成４年３月１２日出願）記載のＣＰ−４（微
工研菌寄第１２７８６号（平成４年２月２４日付寄
託））５μｇから NcoI-SacI断片を切り出すために制限
酵素SacI 20 ユニットとともに反応液Ｌ（10mM Tris-HC
l(pH7.5), 10mM MgCl2 , 1mM ジチオスレイトール）に
て３７℃２時間インキュベートした後、塩濃度が１００
ｍＭとなるように５ＭＮａＣｌを添加し、さらに制限酵
素ＮcoＩを２０ユニット反応液に加えて、３７℃４時間
消化した。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡブ
ランティングキット（宝酒造（株）製）を用いてマニュ
アルに従い、ＤＮＡ断片を平滑末滑化した。得られたプ
ラスミド pSF2 B38-16-J11をＥ２／ＮＳ１遺伝子領域発
現ベクターとして用いた。
【００３９】組換えウイルスの作製、Ｊ１１蛋白質の精
製については、２種類の組換えウイルスにおける方法
（それぞれ実施例２及び３参照）に準じて行ない組み換
えワクシニアウイルスＬＯ−ＳＦ2 Ｂ３８−Ｊ１１を作
製し、同様の結果を得た。動物細胞へはこのウイルスの
みをmoi １０で感染することで発現産物を得た。
製については、２種類の組換えウイルスにおける方法
（それぞれ実施例２及び３参照）に準じて行ない組み換
えワクシニアウイルスＬＯ−ＳＦ2 Ｂ３８−Ｊ１１を作
製し、同様の結果を得た。動物細胞へはこのウイルスの
みをmoi １０で感染することで発現産物を得た。
【００４０】実施例５ 酵素抗体法による非Ａ非Ｂ型慢
性肝炎患者血清中の抗体の検出 精製した抗原を２μg/mlの濃度になるように０．１Ｍ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した。希釈した抗原をヌ
ンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100
μl のせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた
後、ウェルあたり100 μl のブロッキング液（ 0.5％カ
ゼイン、150mM NaCl, 2.5mM EDTA, 0.1M燐酸緩衝液(pH
7.0)）を加え室温に２時間静置した。ウェルを 0.1% Tw
een 20を含むＰＢＳで洗浄した後、検体希釈液（ 0.5％
カゼイン、0.5M NaCl, 2.5mM EDTA, 0.1M 燐酸緩衝液(p
H 7.0)）によって１１倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎
患者血清100 μl を加え、４５分静置した。ウェルを
0.1% Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、100 μl の
ホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識され
た抗ヒトIgG 抗体を加え、４５分静置した。ウェルを
0.1% Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、常法に従
い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表１
にまとめて示す。１７例の非Ａ非Ｂ慢性肝炎患者血清
中、１３例の患者血清においてＪ１１蛋白質と反応する
抗体を検出することができた。
性肝炎患者血清中の抗体の検出 精製した抗原を２μg/mlの濃度になるように０．１Ｍ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した。希釈した抗原をヌ
ンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり 100
μl のせ、室温に２時間静置した。抗原希釈液を除いた
後、ウェルあたり100 μl のブロッキング液（ 0.5％カ
ゼイン、150mM NaCl, 2.5mM EDTA, 0.1M燐酸緩衝液(pH
7.0)）を加え室温に２時間静置した。ウェルを 0.1% Tw
een 20を含むＰＢＳで洗浄した後、検体希釈液（ 0.5％
カゼイン、0.5M NaCl, 2.5mM EDTA, 0.1M 燐酸緩衝液(p
H 7.0)）によって１１倍に希釈した非Ａ非Ｂ型慢性肝炎
患者血清100 μl を加え、４５分静置した。ウェルを
0.1% Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、100 μl の
ホースラディッシュパーオキシダーゼによって標識され
た抗ヒトIgG 抗体を加え、４５分静置した。ウェルを
0.1% Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、常法に従
い、発色法により酵素活性を計測した。その結果を表１
にまとめて示す。１７例の非Ａ非Ｂ慢性肝炎患者血清
中、１３例の患者血清においてＪ１１蛋白質と反応する
抗体を検出することができた。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【発明の効果】本発明により、Ｃ型肝炎ウイルスの構造
蛋白質と考えられる天然Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗
体との間で良好な免疫学的反応性を示す蛋白質、好まし
くは糖蛋白質を効率よく産生することが可能である。得
られる蛋白質は組換えワクシニアウイルスを感染させる
培養細胞の種類によってそれぞれ異なる糖鎖が付与され
た蛋白質として得ることができる。得られた糖蛋白質
は、ＨＣＶ関連抗体の診断薬の抗原として有用である。
例えば、酵素抗体法を用いて患者血清と反応させ、Ｃ型
肝炎ウイルス感染の診断を行なうことができる。
蛋白質と考えられる天然Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対する抗
体との間で良好な免疫学的反応性を示す蛋白質、好まし
くは糖蛋白質を効率よく産生することが可能である。得
られる蛋白質は組換えワクシニアウイルスを感染させる
培養細胞の種類によってそれぞれ異なる糖鎖が付与され
た蛋白質として得ることができる。得られた糖蛋白質
は、ＨＣＶ関連抗体の診断薬の抗原として有用である。
例えば、酵素抗体法を用いて患者血清と反応させ、Ｃ型
肝炎ウイルス感染の診断を行なうことができる。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ ： ２９８ 配列の型 ： アミノ酸 トポロジー ： 直鎖状 配列の種類 ： タンパク質 起源 生物名 ： Ｃ型肝炎ウイルス 配列の特徴 特徴を表す記号 ： sig peptide 存在位置 ： 1 … 20 特徴を決定した方法 ： S 配 列 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Gly Thr His Val Ser Gly Gly Ser Ala Ala Gln Thr 20 25 30 Thr Ser Gly Leu Ala Ser Leu Phe Thr Ser Gly Ser Ala Gln Asn Ile 35 40 45 Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu 50 55 60 Asn Cys Asn Asp Ser Leu Lys Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys 85 90 95 Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val 100 105 110 Glu Pro His Ile Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro 115 120 125 Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly 145 150 155 160 Val Pro Thr Tyr Lys Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu 165 170 175 Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Ser Cys Thr Trp Met 180 185 190 Asn Ser Thr Gly Phe Thr Arg Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile 195 200 205 Gly Gly Thr Gly Asn Asp Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg 210 215 220 Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 225 230 235 240 Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Cys Pro 245 250 255 Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 260 265 270 Val Glu His Arg Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg 275 280 285 Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu 290 295
【図１】Ｅ２／ＮＳ１遺伝子発現ベクターを作製するた
めの、ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子とＴ７プロモータ
ーを配置したプラスミドｐＨＡ−Ｔ７構築方法を示す図
である。
めの、ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子とＴ７プロモータ
ーを配置したプラスミドｐＨＡ−Ｔ７構築方法を示す図
である。
【図２】ＨＣＶゲノムと組み換えワクシニアウイルス発
現遺伝子領域を示す図である。
現遺伝子領域を示す図である。
【図３】Ｊ１１蛋白質の精製工程を示す図である。
【図４】図３に示すＪ１１蛋白質の各精製工程で得られ
るサンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動写
真である。
るサンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動写
真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (9)
- 【請求項１】 天然のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２
／ＮＳ１蛋白質に対する抗体と免疫学的に反応すること
ができる精製組み換えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質の製
造方法であって、 ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺伝子をワク
シニアウイルスプロモーターの制御下に配置して含む組
み換えワクシニアウイルスを作製し、 該組み換えワクシニアウイルスで動物細胞を感染させ、 得られた感染細胞を適当な条件下で培養し、この間に該
細胞内のワクシニアウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼ
を利用して該遺伝子を発現し、 分泌された組み換えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を回収
し、これを精製することを包含する前記方法。 - 【請求項２】 前記ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコー
ドする遺伝子が配列番号：１に示される全アミノ酸配列
又はその部分配列をコードするヌクレオチド配列から構
成される、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 天然のＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質に対
する抗体と免疫学的に反応することができる精製組み換
えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質の製造方法であって、 ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺伝子をＴ７
プロモーターの制御下に配置して、この遺伝子がＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼの存在時のみ発現できるようにした第
１の組み換えワクシニアウイルスを作製し、 さらに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をワクシニアウ
イルスプロモーターの制御下に配置して、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼを発現することができるようにした第２の組
み換えワクシニアウイルスを作製し、 該第１及び第２の組み換えワクシニアウイルスで動物細
胞を重感染させ、 得られた感染細胞を適当な条件下で培養してＨＣＶ Ｅ
２／ＮＳ１蛋白質をコードする遺伝子を発現し、 分泌された組み換えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質を回収
し、これを精製することを包含する前記方法。 - 【請求項４】 前記ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質をコー
ドする遺伝子が配列番号：１に示される全アミノ酸配列
又はその部分配列をコードするヌクレオチド配列から構
成される、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方
法によって製造された、天然のＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１抗
体と免疫学的に反応することができる精製組み換えＨＣ
Ｖ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質。 - 【請求項６】 配列番号：１に示されるアミノ酸番号２
１〜２９８のアミノ酸配列を有しかつ分子量約４０，０
００〜約５５，０００ダルトンの糖蛋白質である、請求
項５記載の精製組み換えＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１蛋白質。 - 【請求項７】 請求項１記載の方法で使用し得る組み換
えワクシニアウイルスＬＯ−ＳＦ2 Ｂ３８−Ｊ１１。 - 【請求項８】 請求項３記載の方法で使用し得る組み換
えワクシニアウイルスＬＯ−Ｊ１１ΔＵＴＲ。 - 【請求項９】 請求項３記載の方法で使用し得る組み換
えワクシニアウイルスＬＯ−Ｔ７−１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5296065A JPH07123996A (ja) | 1993-11-01 | 1993-11-01 | 精製組み換えｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白質およびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5296065A JPH07123996A (ja) | 1993-11-01 | 1993-11-01 | 精製組み換えｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白質およびその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07123996A true JPH07123996A (ja) | 1995-05-16 |
Family
ID=17828657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5296065A Pending JPH07123996A (ja) | 1993-11-01 | 1993-11-01 | 精製組み換えｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白質およびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07123996A (ja) |
-
1993
- 1993-11-01 JP JP5296065A patent/JPH07123996A/ja active Pending
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