JPH0657152B2 - CSF genes - Google Patents

CSF genes

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JPH0657152B2
JPH0657152B2 JP61166709A JP16670986A JPH0657152B2 JP H0657152 B2 JPH0657152 B2 JP H0657152B2 JP 61166709 A JP61166709 A JP 61166709A JP 16670986 A JP16670986 A JP 16670986A JP H0657152 B2 JPH0657152 B2 JP H0657152B2
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ctg
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cag
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達美 山崎
政幸 土屋
重一 長田
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な主としてヒト顆粒球系細胞のコロニー形
成をさせるために必要な特異的な刺激因子、すなわちコ
ロニー刺激因子(以下「CSF」と略記する)活性を有
する糖蛋白質のポリペプチドをコードする遺伝子、及び
該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、並びにこれを含
む形質転換体に関する。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a novel specific stimulatory factor necessary for colony formation of human granulocyte cells, namely a colony stimulating factor (hereinafter referred to as “CSF”). The present invention relates to a gene encoding a glycoprotein polypeptide having activity, a recombinant vector incorporating the gene, and a transformant containing the same.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

2層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞
を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層
の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球(以下「顆
粒球(granulocyte)」と称す。)や単球マクロファー
ジからなるコロニーが形成されることから、生体物にコ
ロニー形成を促進する因子が存在することが知られてい
た(PluznikとSach;J. Cell. Comp. Physiol., 66巻319
頁(1965),BradleyとMetcalf;Aust.J.Exp. Biol. Med. S
ci.,44巻287頁(1966))。
In the two-layer soft agar culture method, when bone marrow cells as target cells in the upper layer and renal cells or fetal cells in the lower layer are put into culture, a part of the cells in the upper layer proliferate and differentiate, resulting in neutrophil granulocytes (hereinafter, It is known that there is a factor that promotes colony formation in living organisms because colonies composed of granulocytes) and monocyte macrophages are formed (Pluznik and Sach; J. Cell. .Comp. Physiol., Volume 66 319
Page (1965), Bradley and Metcalf; Aust.J.Exp.Biol.Med.S.
ci., 44 , 287 (1966)).

CSFと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、T細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。CSFには顆粒球・単球マクロファージの幹細胞
に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒天
中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを形
成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージCSF
(GM−CSFと略記する)、主として単球マクロファ
ージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロファ
ージCSF(M−CSFと略記する)より未分化な多能
性幹細胞に作用する多能性CSF(multi−CSFと略
記する)、あるいは本発明の如き、主として顆粒球系コ
ロニーを系させる作用をもつ顆粒球CSF(G−CSF
と略記する)などのサブクラスが存在し、それぞれの,
サブクラスによって標的細胞の分化段階も異なることが
考えられる様になってきた[Asano;代謝−Metabolism
and Disease, 22巻 249頁(1985),Yunis等;“Growth a
nd Maturation Factors”edited by Guroff, john Wile
y&Sons, NY, 巻,209頁(1983)]。
It is known that this factor, which is collectively referred to as CSF, is produced by cells that are normally widely distributed in the body, such as T cells, monocyte macrophages, fibroblasts, and endothelial cells. CSF-granulocyte-monocyte that acts on stem cells of granulocyte / monocyte macrophage, stimulates its proliferation and induces differentiation to form colonies composed of granulocytes and monocyte macrophages in soft agar Sphere macrophage CSF
(Abbreviated as GM-CSF), pluripotent CSF acting mainly on undifferentiated pluripotent stem cells than monocyte macrophage CSF (abbreviated as M-CSF) having an action of forming colonies of monocyte macrophages. -Abbreviated as CSF), or a granulocyte CSF (G-CSF) having an action of mainly forming a granulocyte colony as in the present invention.
Abbreviated as).
It has come to be considered that the differentiation stage of target cells varies depending on the subclass [Asano; Metabolism-Metabolism
and Disease, Vol. 22 , pp. 249 (1985), Yunis et al .; “Growth a
nd Maturation Factors ”edited by Guroff, john Wile
y & Sons, NY, Vol. 1 , p. 209 (1983)].

従って個々のサブクラスを精製し、その化学的性状や生
物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々の
血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要なことであ
る。なかでもG−CSFの生物学的作用として、骨髄性
白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が注目さ
れており、特に白血病の治療と予防へのG−CSFの臨
床的有用性が大いに期待されてきた。
Therefore, it is extremely important to purify individual subclasses and examine their chemical and biological properties in more detail for analysis of hematopoietic mechanism and pathological conditions of various hematological diseases. Among them, as the biological action of G-CSF, the induction of differentiation of myeloid leukemia cells and the enhancement of the function of mature granulocytes have attracted attention, and the clinical usefulness of G-CSF for the treatment and prevention of leukemia is particularly great. Has been expected.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problems to be solved by the invention]

G−CSFの単離精製のために従来行われてきた試み
は、細胞培養法を用いて、その培養上清からG−CSF
を単離する方法であるが、G−CSFが低濃度しか産生
されないこと、大量の培養液から微量のG−CSFを得
るには複雑な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ
未だ大量の均一なG−CSFを得るには至っていなかっ
た。従って、組換えDNA技術を用いてG−CSFを大
量に製造することが渇望されていた。
Attempts that have hitherto been made for the isolation and purification of G-CSF use a cell culture method to extract G-CSF from the culture supernatant.
Although it is a method of isolating G-CSF, it has a number of drawbacks such as low production of G-CSF and a complicated purification process to obtain a small amount of G-CSF from a large amount of culture solution. It has not been possible to obtain uniform G-CSF. Therefore, there has been a long-felt desire to produce G-CSF in large quantities using recombinant DNA technology.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

かかる状況において、本発明者らはヒトG−CSF活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子の単離に成功
するとともに、これを組み込んだ組換えベクター、並び
にこれを含有する形質転換体を得ることに成功した。
Under such circumstances, the present inventors succeeded in isolating a gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity, and obtained a recombinant vector incorporating the gene and a transformant containing the vector. Successful.

即ち、本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有す
る糖蛋白質のポリペプチドをコードする遺伝子を提供す
るものである。又該ポリペプチドを産生するために用い
られる組換えベクター、及びこれで宿主を形質転換して
得た形質転換体も同時に提供するものである。
That is, the present invention provides a gene encoding a glycoprotein polypeptide having human granulocyte colony stimulating factor activity. It also provides a recombinant vector used for producing the polypeptide and a transformant obtained by transforming a host with the recombinant vector.

本発明のヒトG−CSF活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子はショ糖密度勾配遠心法により15〜17S
画分として得られる、ヒトG−CSF活性を有するポリ
ペプチドをコードするメッセンジャーRNA(mRN
A)に相補的なDNA(cDNA)である。
The gene encoding the polypeptide having human G-CSF activity of the present invention is 15 to 17S by sucrose density gradient centrifugation.
A messenger RNA (mRN) encoding a polypeptide having human G-CSF activity, which is obtained as a fraction.
It is a DNA (cDNA) complementary to A).

本出願人は2系列のこのようなcDNAを得た。そのう
ちの1つの系列のcDNAは図3(B)のポリペプチドI
又はIIをコードする遺伝子あるいはその一部を有するも
のであり、さらに詳細には図3(A)の塩基配列の5′−
末端から32〜34ヌクレオチド位のATGから650〜652ヌ
クレオチド位のCCCまでの配列、122〜124位のACC
から650〜652位のCCCまでの配列または図3(A)に記
載された配列あるいはその一部を有するものである。
Applicants have obtained two series of such cDNAs. One of the series of cDNAs is polypeptide I of FIG. 3 (B).
Or a gene encoding II or a part thereof, and more specifically, 5′-of the nucleotide sequence of FIG. 3 (A).
Sequence from the end to ATG 32 to 34 nucleotides to CCC 650 to 652 nucleotides, ACC 122 to 124
To the CCC at positions 650 to 652, the sequence shown in FIG. 3 (A), or a part thereof.

この系列のcDNAをcDNA(+VSE)と称する。This series of cDNA is called cDNA (+ VSE).

他の系列のcDNAは図4(B)のポリペプチドI又はII
をコードする遺伝子あるいはその一部を有するものであ
り、さらに詳細には図4(A)の塩基配列の5′−末端か
ら31〜33ヌクレオチド位のATGから640〜642ヌクレオ
チド位のCCCまでの配列、121〜123位のACCから64
0〜642位のCCCまでの配列または図4(A)に記載され
た配列あるいはその一部を有するものである。
Another series of cDNAs is the polypeptide I or II of FIG. 4 (B).
4A has a gene or a part thereof, and more specifically, the sequence from the 5'-end of the base sequence of FIG. 4 (A) to ATG at 31-33 nucleotide positions to CCC at 640-642 nucleotide positions. 64 from ACC 121-123
It has the sequence from 0 to 642st CCC, the sequence shown in FIG. 4 (A), or a part thereof.

この系列のcDNAをcDNA(−VSE)と称する。This series of cDNA is called cDNA (-VSE).

上記の遺伝子は例えばG−CSF活性を有するポリペプ
チドを産生する能力を有する哺乳動物細胞等からG−C
SFをコードするmRNAを調製した後、既知の方法に
より2本鎖cDNAに変換し、このcDNAを含む組換
体の集合(以下cDNAライブラリーと称する)から既
知の方法によりスクリーニングすることによって得られ
る。
The above-mentioned gene is derived from, for example, mammalian cells or the like having the ability to produce a polypeptide having G-CSF activity.
It is obtained by preparing mRNA encoding SF, converting it into a double-stranded cDNA by a known method, and screening from a set of recombinants containing this cDNA (hereinafter referred to as a cDNA library) by a known method.

又、本発明の遺伝子にはヒトG−CSF活性を有するポ
リペプチドをコードするヒト染色体由来の遺伝子も含ま
れている。このヒト染色体由来の遺伝子は転写調節に関
与する塩基配列を含んでいるものであり、又図5に示さ
れる塩基配列または、その一部を有するものである。
The gene of the present invention also includes a human chromosome-derived gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity. The human chromosome-derived gene contains a nucleotide sequence involved in transcriptional regulation, and has the nucleotide sequence shown in FIG. 5 or a part thereof.

なお、染色体由来の遺伝子は、例えばヒト細胞からヒト
染色体遺伝子を含む組換え体の集合(以下、ヒト染色体
遺伝子ライブラリーと称する)を調製した後、既知の方
法によりスクリーニングすることによって得ることがで
きる。
The gene derived from the chromosome can be obtained, for example, by preparing a set of recombinants containing the human chromosomal gene (hereinafter referred to as a human chromosomal gene library) from human cells and then screening by a known method. .

この場合ヒト染色体遺伝子の供給源としては、ヒト細胞
であれば全て実施することができ、肝,腎等の摘出細胞
や腫瘍細胞等の培養細胞等を用いることができる。ま
た、ヒト細胞からヒト染色体遺伝子ライブラリーを調製
するには、既知の方法[Maniatis等;Cell 15 巻687頁
(1978)およびManiatis等;Molecular cloning, Cold Sp
ring Harbor Laboratory 269頁(1982)等を参照]に従っ
て行えばよく、例えばヒト胎児肝等からヒト染色体DN
Aをフェノール等にて抽出し、得られたDNAを制限酵
素で部分的に、若しくは完全に消化させて、適当な長さ
に断片化されたDNAを得、この断片化されたDNAを
T4DNAリガーゼ等を用いて、さらには必要に応じて
EcoRI等の切断部位を含むリンカーを付加して、λ
ファージベクターDNA断片に挿入する。次いでインビ
トロパッケージング法によりλファージ粒子を得、それ
により大腸菌などの宿主細胞を形質転換させることによ
って作成することができる。
In this case, as the source of the human chromosomal gene, all human cells can be used, and isolated cells such as liver and kidney and cultured cells such as tumor cells can be used. In addition, a known method for preparing a human chromosomal gene library from human cells [Maniatis et al .; Cell 15: 687].
(1978) and Maniatis et al .; Molecular cloning, Cold Sp.
ring Harbor Laboratory pp. 269 (1982) etc.], for example from human fetal liver to human chromosome DN.
A is extracted with phenol or the like, and the obtained DNA is partially or completely digested with a restriction enzyme to obtain a fragmented DNA having an appropriate length. The fragmented DNA is converted into T4 DNA ligase. Etc., and further, if necessary, by adding a linker containing a cleavage site such as EcoRI,
Insert into the phage vector DNA fragment. It can then be prepared by obtaining lambda phage particles by the in vitro packaging method and thereby transforming host cells such as E. coli.

上記ベクターとして用いたλファージは、例えばCha
ron4AやEMBL−3,4などが挙げられる。
The λ phage used as the above vector is, for example, Cha.
ron4A, EMBL-3, 4 and the like.

一方、前記mRNAの供給源となる哺乳動物細胞は本発
明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞株CHU−2(C
ollection Nationale De Cultures De Microorganismes
(C.N.C.M)寄託番号I−483)であるが、腫瘍
細胞株にかぎらず、哺乳動物から分離できる細胞、ある
いは樹立した他の細胞株でもよい。又、mRNAの調製
はすでに他のいくつかの生理活性タンパクの遺伝子をク
ローン化する際、用いられた方法、例えば、バナジウム
複合体等を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤処理、フェノール処理を行う(BergerとBir
kenmeier;Biochemistry18巻5143頁(1979)を参照)か、
グアニジンチオシアナート処理後、CsCl密度勾配遠
心を行う(Chirgwin等;Biochemistry18巻5294頁(1979)
を参照)ことによって、全RNAを得た後、オリゴ(d
T)−セルロースやセファロース2Bを担体とするポリ
U−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法あ
るいはバッチ法によりポリ(A)RNA(mRNA)
を得ることができる。またショ糖密度勾配遠心法等によ
りポリ(A)RNAを更に分画することもできる。上
記の如くして得られたmRNAが、G−CSF活性をも
つポリペプチドをコードするものであることを確認する
ためには、mRNAをタンパク質に翻訳させ、生理活性
を調べるか、抗G−CSF抗体を用いてそのタンパクを
同定する等の方法を行えばよい。例えば、アフリカツメ
ガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞にmRNAを注入し
て翻訳させたり(Gurdon等;Nature, 233巻177頁(1972)
を参照)、あるいはウサギ網状赤血球(Reticulocyte)系
や小麦胚芽(Wheat germ)系を利用した翻訳反応が行われ
ている(SchleifとWensink;“Practical Methods in Mo
lecular Biology”,Springer−Verlag,NY,(1981))。G
−CSF活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法を
適用して実施できる。それらの手法については総説があ
る(Metcalf;“Hemopoietic Colonies”,Springer−Ve
rlag,Berlin,Heideiberg,NY(1977))。
On the other hand, in the present invention, the mammalian cell that is the source of the mRNA is a human oral floor cancer-derived cell line CHU-2 (C
ollection Nationale De Cultures De Microorganismes
(CNM) deposit number I-483), but not limited to tumor cell lines, cells that can be isolated from mammals or other established cell lines may be used. In addition, mRNA is already prepared by cloning the gene of several other physiologically active proteins, for example, by treating with vanadium complex or the like in the presence of a ribonuclease inhibitor, treating with a surfactant or phenol. Do (Berger and Bir
kenmeier; Biochemistry 18 : 5143 (1979)) or
After guanidine thiocyanate treatment, CsCl density gradient centrifugation is performed (Chirgwin et al .; Biochemistry 18 : 5294 (1979).
After obtaining total RNA, the oligo (d
T) -cellulose or poly (A + ) RNA (mRNA) by affinity column method or batch method using poly U-sepharose with Sepharose 2B as a carrier
Can be obtained. Further, the poly (A + ) RNA can be further fractionated by a sucrose density gradient centrifugation method or the like. In order to confirm that the mRNA obtained as described above encodes a polypeptide having G-CSF activity, the mRNA is translated into a protein and the physiological activity is examined or anti-G-CSF is used. A method such as identifying the protein using an antibody may be performed. For example, injecting mRNA into Xenopus laevis oocytes for translation (Gurdon et al .; Nature, 233 : 177 (1972)).
, Or the rabbit reticulocyte (Reticulocyte) system or wheat germ (Wheat germ) system (Schleif and Wensink; “Practical Methods in Mo
lecular Biology ”, Springer-Verlag, NY, (1981)).
-The assay of CSF activity can be carried out by applying the soft agar culture method using bone marrow cells. There is a review of these methods (Metcalf; “Hemopoietic Colonies”, Springer-Ve
rlag, Berlin, Heideiberg, NY (1977)).

前述の如き方法で得たmRNAを鋳型にして1本鎖cD
NAを合成した後、この1本鎖cDNAから2本鎖cD
NAを合成し、適当なベクターDNAとの組換えプラス
ミドを作成する。これで大腸菌(Escherichia coli)など
を形質転換して、形質転換株のDNA群(cDNAライ
ブラリー)を得る。
Single-stranded cD using the mRNA obtained by the above-mentioned method as a template
After synthesizing NA, double-stranded cDNA was converted from this single-stranded cDNA.
NA is synthesized to prepare a recombinant plasmid with an appropriate vector DNA. This is used to transform Escherichia coli and the like to obtain a DNA group (cDNA library) of the transformed strain.

mRNAから2本鎖cDNAを得るには、例えばmRN
Aの3′−末端にあるポリA−鎖に相補的なオリゴ(d
T)をプライマーとして逆転写酵素で処理するか、また
はG−CSFタンパクのアミノ酸配列の一部に相応する
オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして
逆転写酵素で処理してmRNAに相補的なcDNAを合
成する。2本鎖のcDNAは、アルカリ処理でmRNA
を分解・除去した後、得られた1本鎖cDNAを逆転写
酵素又はDNAポリメラーゼI(例えばKlenow断片等)
処理後Slヌクレアーゼ等で処理して得るか、あるい
は、直接RNase HおよびDNAポリメラーゼ(例
えば、大腸菌のDNAポリメラーゼI等)等で処理する
ことによっても得ることができる(例えば、Maniatis
等;Molecular cloning, Cold Spring HarborLaborator
y(1982)およびGublerとHoffman;Gene25巻263頁(1983)
を参照)。
To obtain a double-stranded cDNA from mRNA, for example, mRN
The oligo (d) complementary to the poly A-strand at the 3'-end of A (d
T) is treated with reverse transcriptase as a primer, or an oligonucleotide corresponding to a part of the amino acid sequence of G-CSF protein is synthesized, and this is treated with reverse transcriptase as a primer to prepare a cDNA complementary to mRNA. To synthesize. Double-stranded cDNA is mRNA treated with alkaline
After decomposing / removing DNA, the obtained single-stranded cDNA is used for reverse transcriptase or DNA polymerase I (eg Klenow fragment).
After treatment, it can be obtained by treating with Sl nuclease or the like, or can be obtained by directly treating with RNase H and DNA polymerase (eg, DNA polymerase I of Escherichia coli, etc.) (eg, Maniatis).
Etc .; Molecular cloning, Cold Spring HarborLaborator
y (1982) and Gubler and Hoffman; Gene 25 : 263 (1983).
See).

このようにして得られた2本鎖cDNAを適当なベクタ
ー、例えば、pSC101,pDF41,ColE1,pM
B9,pBR322,pBR327,pACYC1などに代表
されるEK型プラスミドベクターや、λgt.λc,λgt
10,λgtWESなどに代表されるファージベクターな
どに組み込んだ後、大腸菌(X1776;HB 101;DH
1,C600株など)等を形質転換してcDNAライブラ
リーを得ることができる(例えば、前出“Molecular cl
oning”を参照)。
The double-stranded cDNA thus obtained is used as an appropriate vector, for example, pSC101, pDF41, ColE1, pM.
B9, pBR322, pBR327, pACYC1 and other EK type plasmid vectors, λgt. λc, λgt
10, E. coli (X1776; HB 101; DH) after being incorporated into a phage vector typified by λgtWES
1, a C600 strain, etc. can be transformed to obtain a cDNA library (for example, “Molecular cl” described above).
oning ”).

2本鎖cDNAをベクターと連結させるには、DNA末
端に連結可能な末端をつけるべく、適当な化学合成DN
A断片を付加し、予め制限酵素を用いて開裂させたベク
ターDNAとATP存在下にT4ファージDNAリガー
ゼで処理することにより行うことができる。あるいは、
予め制限酵素を用いて開裂させたベクターDNAと2本
鎖cDNAのそれぞれにdG,dC−鎖(あるいはd
A,dT−鎖)を付加した後、例えば両DNAを含む溶
液を除冷することによっても行うことができる(前記Mo
lecular cloningを参照)。
In order to ligate the double-stranded cDNA with the vector, a suitable chemically synthesized DN is added so as to attach a ligable end to the DNA end.
It can be carried out by adding the A fragment and treating with T4 phage DNA ligase in the presence of ATP and the vector DNA previously cleaved with a restriction enzyme. Alternatively,
Each of the vector DNA and the double-stranded cDNA which had been cleaved with a restriction enzyme in advance had dG, dC-chain (or d
After addition of (A, dT-chain), it can also be carried out by, for example, cooling the solution containing both DNAs (Mo described above).
See lecular cloning).

こうして得られた組換えDNA体による宿主細胞の形質
転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合Hanahanが詳細
に記述している如き方法(J.Mol. Biol.;166頁557頁
(1983))、すなわち、CaClやMgCl又はRb
Clを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換え
DNA体を加えることにより実施することができる。
Transformation of a host cell with the thus-obtained recombinant DNA is carried out, for example, by the method described in detail by Hanahan when the host cell is Escherichia coli (J. Mol. Biol .; p. 166, p. 557).
(1983)), that is, CaCl 2 , MgCl 2 or Rb
It can be carried out by adding the recombinant DNA body to competent cells prepared in the presence of Cl.

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンcDNAのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法(Taniguchi等; Proc. Jpn. Acad.55巻S
er. B,464頁(1979))や、ハイブリダイゼーション−
トランスレーションアッセイ法(Nagata等;Nature 284
巻316頁 (1980))など、又は該タンパク質のアミノ酸
配列をもとにして化学合成したオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたコロニーあるいはプラークハイブリダイゼ
ーション法(Wallace等;Nucleic Acids Res.巻879
頁(1981)およびBentonとDavise;Science 196巻180頁(1
977))などを用いればよい。
To search for cells carrying the gene of interest, the plus-minus method used in cloning interferon cDNA (Taniguchi et al .; Proc. Jpn. Acad. 55 S
er. B, p. 464 (1979)) and hybridization-
Translation assay (Nagata et al .; Nature 284
Vol. 316 (1980)) or a colony or plaque hybridization method using an oligonucleotide probe chemically synthesized based on the amino acid sequence of the protein (Wallace et al .; Nucleic Acids Res. 9 : 879).
Pp. (1981) and Benton and Davise; Science 196 : 180 (1
977)) or the like may be used.

このようにしてクローン化されたヒトG−CSF活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は適
当なベクターDNAに再び組み込むことにより、他の原
該生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させること
ができる。更にこれらのベクターに適当なプロモーター
及び形質発現に係る配列を導入することにより、それぞ
れの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能で
ある。
The fragment containing the gene encoding the polypeptide having human G-CSF activity thus cloned is reintegrated into an appropriate vector DNA to transform other progenitor or eukaryotic host cells. Can be made. Furthermore, it is possible to express the gene in each host cell by introducing an appropriate promoter and a sequence for expression in these vectors.

哺乳動物由来の宿主細胞としては、COS細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、C−127細
胞、HeLa細胞などがあげられ、これ等の細胞を形質
転換させるベクターとしては、pSV2−gpt(Mulli
ganとBerg;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;78巻2072頁(198
1)を参照)等がある。これ等のベクターは複製起源、選
択マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置する
プロモーター、RNAスプライス部位、ポリアデニル化
シグナルなどを含んでいる。
Mammalian-derived host cells include COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, C-127 cells, HeLa cells, and the like. As a vector for transforming these cells, pSV2-gpt (Mulli
gan and Berg; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 78 : 2072 (198
See (1)). These vectors contain origins of replication, selectable markers, promoters located in front of the gene to be expressed, RNA splice sites, polyadenylation signals and the like.

哺乳動物における遺伝子発現のプロモーターとしてはレ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス40(SV40)などのプロモーター
を用いればよい。例えばSV40のプロモーターを使用
する場合は、Mulliganなどの方法(Nature 277巻108頁
(1979))に従えば容易に実施することができる。
As promoters of gene expression in mammals, retrovirus, polyoma virus, adenovirus,
A promoter such as Simian virus 40 (SV40) may be used. For example, when using the promoter of SV40, a method such as Mulligan (Nature 277, Volume 108, pp
(1979)).

複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、ア
デノウィルス、牛パピローマウィルス(BPV)等の由
来のものを用いることができ、選択マーカーとしては、
ホスホトランスフェラーゼAPH(3′)IIあるいはI
(neo)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、
大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵
素(DHFR)遺伝子等を用いることができる。
As the origin of replication, those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), etc. can be used.
Phosphotransferase APH (3 ') II or I
(Neo) gene, thymidine kinase (TK) gene,
E. coli xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene and the like can be used.

以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトG−CSF活
性を有するポリペプチドを得るには、上記ベクターの適
当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えDNA体により
宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培
養すればよい。さらに細胞内または培養液から該ポリペ
プチドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行う
ことができる。
To obtain a polypeptide having human G-CSF activity using the host-vector system as described above, a host cell is transformed with a recombinant DNA body in which the gene is incorporated into an appropriate site of the above vector, The obtained transformant may be cultured. Further, in order to separate and purify the polypeptide from the inside of the cell or from the culture medium, known means can be used.

一般に真該生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られているように、多形現象(polymorphysm)を
示すと考えられ(例えばNishi等;J. Biochem. 97
153頁(1985)を参照)、この多形現象によって1個また
はそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基
配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合も
ある。
Generally, the gene of the true organism is considered to exhibit a polymorphysm as known in the human interferon gene and the like (for example, Nishi et al .; J. Biochem. Vol. 97) .
Pp. 153 (1985)), this polymorphism may result in the replacement of one or more amino acids, or in some cases, even if there is a change in the base sequence, the amino acids do not change at all.

また例えば図3(B)あるいは図4(B)のアミノ酸配列の中
の1個またはそれ以上のアミノ酸を欠くか又は付加され
たポリペプチド、あるいは1個またはそれ以上のアミノ
酸が1個またはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペ
プチドでもG−CSF活性を有することがある。例え
ば、ヒトインターロイキン2(IL−2)遺伝子のシス
テインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列
に変換して得られたポリペプチドがインターロイキン2
活性を保持することもすでに公知となっている(Wang
等;Science,224巻1431頁(1984))。それゆえ、それ等
天然に存在するかあるいは人工合成されたポリペプチド
がヒトG−CSF活性を有する限りそれ等のポリペプチ
ドをコードする遺伝子、これらの遺伝子を含む組換ベク
ターおよびこれらの組換ベクターによって得られる形質
転換体は全て本発明に含まれる。
Also, for example, a polypeptide lacking or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of FIG. 3 (B) or FIG. 4 (B), or one or more amino acids having one or more amino acids. The polypeptide substituted with the amino acid may also have G-CSF activity. For example, a polypeptide obtained by converting a base sequence corresponding to cysteine of human interleukin 2 (IL-2) gene into a base sequence corresponding to serine is interleukin 2
It is already known to retain activity (Wang
Et al., Science, 224 , 1431 (1984)). Therefore, as long as the naturally occurring or artificially synthesized polypeptides have human G-CSF activity, genes encoding such polypeptides, recombinant vectors containing these genes, and recombinant vectors thereof All transformants obtained by the method are included in the present invention.

本発明のヒトG−CSF活性をもつポリペプチドをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター及びこ
れを有する形質転換体の各製造方法、並びにこの形質転
換体によってヒトG−CSF活性を有する糖蛋白質が得
られるという確認について簡単に説明すると以下の通り
である。
A gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity of the present invention, a recombinant vector having the gene, a method for producing a transformant having the gene, and a sugar having human G-CSF activity by the transformant The confirmation that the protein can be obtained will be briefly described as follows.

(1)プローブの調製 腫瘍細胞株CHU−2の培養上清から精製して得られた
均一ヒトCSFタンパクについてN末端よりアミノ酸配
列を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン処理
などにより断片化した後その断片についてもアミノ酸配
列を決定した[実施例3(i),(ii),(iii)]。
(1) Preparation of probe The amino acid sequence of the homogeneous human CSF protein obtained by purifying from the culture supernatant of the tumor cell line CHU-2 was determined from the N-terminal, and further fragmented by bromocyan degradation, trypsin treatment, etc. The amino acid sequence of the fragment was also determined [Example 3 (i), (ii), (iii)].

そのアミノ酸配列中から図1に示される配列に対応する
3種類のヌクレオチドプローブ(A),プローブ(LC)
およびプローブ(IWQ)を合成した(実施例4)。プ
ローブ(A)は連続した14個のヌクレオチドからなる混合
型プローブである。
From the amino acid sequence, three types of nucleotide probes (A) and probes (LC) corresponding to the sequences shown in FIG.
And a probe (IWQ) were synthesized (Example 4). The probe (A) is a mixed probe consisting of 14 consecutive nucleotides.

プローブ(IWQ)は、ヒトコレシストキニン遺伝子のク
ローン化で用いられた如き(Takahashi等;Proc. Natl.
Acad. Sci., USA,82巻1931頁(1985))デオキシイノシ
ンを使用した30個の連続したヌクレオチドである。プロ
ーブ(LC)は実施例3(i)に示したアミノ酸配列のN
末端から32〜39番に相当する部分を、図3に示した塩基
配列を基にして合成した24個のヌクレオチドからなるプ
ローブである。
The probe (IWQ) was as used in the cloning of the human cholecystokinin gene (Takahashi et al; Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 82 : 1931 (1985)) 30 consecutive nucleotides using deoxyinosine. The probe (LC) is N of the amino acid sequence shown in Example 3 (i).
It is a probe consisting of 24 nucleotides, in which the portion corresponding to the number 32 to 39 from the end was synthesized based on the base sequence shown in FIG.

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を固相法に適用して行うことができ、Narangの総説に記
述されている(Tetrahedron 39巻3−22頁(1983))。
The chemical synthesis of nucleotides can be performed by applying the improved phosphotriester method to the solid phase method and is described in the review by Narang (Tetrahedron 39 : 3-22 (1983)).

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。
The probe used may be based on the amino acid sequence at a position other than the probe used in the present invention.

(2)cDNAライブイリーの構築 CHU−2細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、CsCl密度勾配遠心法により全R
NAを得る。
(2) Construction of cDNA library The guanidine thiocyanate solution was added to CHU-2 cells and homogenized, and total R was measured by CsCl density gradient centrifugation.
Get NA.

この全RNAからオリゴ(dT)セルロースカラムによ
りポリ(A)RNAを選別した後、逆転写酵素により
1本鎖cDNAを合成し、RNase HおよびE.c
oliDNAポリメラーゼIを用いて、2本鎖cDNA
を得た。得られた2本鎖のcDNAにdCを鎖を付加
し、PstI切断部位にdG鎖を付加したpBR322ベ
クターとつなぎ合せて、大腸菌X1776株を形質転換さ
せ、pBR322系cDNAライブラリーを構築した(実
施例5,6)。
After selecting poly (A + ) RNA from this total RNA with an oligo (dT) cellulose column, single-stranded cDNA was synthesized with reverse transcriptase, and RNase H and E. c
Double-stranded cDNA using oliDNA polymerase I
Got A dC chain was added to the obtained double-stranded cDNA and ligated with a pBR322 vector in which a dG chain was added at the PstI cleavage site, and Escherichia coli X1776 strain was transformed to construct a pBR322 cDNA library. Examples 5, 6).

同様にEcoRIリンカーを用いて、2本鎖cDNAを
λgt10ベクターと連結し、λファージ系cDNAライ
ブラリーを構築した(実施例7)。
Similarly, a double-stranded cDNA was ligated to a λgt10 vector using an EcoRI linker to construct a λ phage cDNA library (Example 7).

(3)スクリーニング pBR322系cDNAライブラリー由来の組換え体をワ
ットマン541濾紙に固定し、32Pで放射標識したプロ
ーブ(IWQ)を用いて、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、1個のクローンが選別できた。この
クローンを、サザンブロッティング法(Southern;J.
Mol.Biol.98巻503頁(1975))を用いて更に詳細に検討
したところ、プローブ(A)ともハイブリダイズした。
(3) Screening Recombinant derived from pBR322 cDNA library was immobilized on Whatman 541 filter paper, and colony hybridization was performed using a probe (IWQ) radiolabeled with 32 P. As a result, one clone was selected. did it. This clone was cloned by Southern blotting (Southern; J.
Mol. Biol. 98 , p. 503 (1975)), a further detailed examination revealed that it also hybridized with the probe (A).

このクローンの塩基配列をジデオキシ法(Sanger;Scie
nce 214巻1205頁(1981))によって決定した。
The nucleotide sequence of this clone was determined by the dideoxy method (Sanger; Scie
nce 214 , p. 1205 (1981)).

得られたcDNAインサートの塩基配列を図2に示す。
図2に示される如く、このcDNAインサートはプロー
ブ(IWQ)およびプローブ(A)を含む308塩基対からな
り、実施例3(iii)に示したアミノ酸配列を含む83個の
アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを
有していることがわかった。
The nucleotide sequence of the obtained cDNA insert is shown in FIG.
As shown in FIG. 2, this cDNA insert consists of 308 base pairs containing the probe (IWQ) and the probe (A), and an open reading that encodes 83 amino acids including the amino acid sequence shown in Example 3 (iii). It turned out to have a frame.

この308塩基対を含むpBR322由来のプラスミドを以下
pHCS−1と略記する(実施例8)。
This pBR322-derived plasmid containing 308 base pairs is abbreviated as pHCS-1 (Example 8).

pHCS−1から得られる308塩基対を含むDNA断片
をニックトランスレーション法(前出、Molecular Clon
ingを参照)にて放射標識し、これをプローブとしてλ
gt10由来のcDNAライブラリーをプラークハイブリ
ダイゼーション(BentonとDavis;Science 196巻180頁
(1977)によりスクリーニングして5個のクローンを得、
cDNAを含むと思われるクローンについてその塩基配
列を前述と同様の方法で決定した(図3(A))。
A DNA fragment containing 308 base pairs obtained from pHCS-1 was nick-translated (Molecular Clon, supra).
ing)) and use this as a probe for λ
A cDNA library derived from gt10 was subjected to plaque hybridization (Benton and Davis; Science 196 : 180).
(1977) screened 5 clones,
The nucleotide sequence of a clone suspected of containing cDNA was determined by the same method as described above (FIG. 3 (A)).

図3(A)に示される如く、このcDNAインサートは
一つの大きなオープンリーディングフレームを有する。
As shown in FIG. 3 (A), this cDNA insert has one large open reading frame.

このcDNAによってコードされるアミノ酸配列は図3
(A)に示された如く演えきできる。
The amino acid sequence encoded by this cDNA is shown in FIG.
It can be performed as shown in (A).

実施例3(i)に示されているG−CSFタンパクのN
末端アミノ酸配列との比較により、本cDNAは5′−
末端から32〜34ヌクレオチド位のATG配列から始ま
り、119〜121位のGCC配列で終わる90塩基対によって
コードされるシグナルペプチドおよび122〜124位のAC
C配列から始まり650〜652位のCCC配列で終わる531
塩基対によってコードされる成熟G−CSFポリペプチ
ドに相当する塩基配列を含んでいることがわかった。従
って図3(B)に示されたアミノ3配列Iのポリペプチ
ドは207個のアミノ酸からなり、その分子量は22292.67
ダルトンと計算された。同様にアミノ酸配列IIのポリペ
プチドは177個のアミノ酸からなり、その分子量は1898
6.74ダルトンであった(実施例9)。
N of G-CSF protein shown in Example 3 (i)
By comparison with the terminal amino acid sequence, this cDNA was 5'-
A signal peptide encoded by 90 base pairs starting from the ATG sequence 32 to 34 nucleotides from the end and ending with a GCC sequence 119 to 121 and an AC at 122 to 124
531 starting with the C sequence and ending with the CCC sequence at positions 650 to 652
It was found to contain a base sequence corresponding to the mature G-CSF polypeptide encoded by the base pair. Therefore, the polypeptide of amino 3 sequence I shown in FIG. 3 (B) consists of 207 amino acids and its molecular weight is 22292.67.
Calculated as Dalton. Similarly, the polypeptide of amino acid sequence II consists of 177 amino acids and has a molecular weight of 1898.
It was 6.74 Daltons (Example 9).

但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜34位あるい
は68〜70位のATGも同様に考え得る。EcoR1切断
部位にこのcDNA(+VSE)を挿入したpBR322
を保持するエシエリヒア・コリ(E.coli)X1776株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
(FERM BP−954)。
However, regarding the initiation site of the protein, ATGs at positions 32 to 34 or 68 to 70 may be considered in the same manner. PBR322 with this cDNA (+ VSE) inserted at the EcoR1 cleavage site
Escherichia coli strain X1776, which retains Escherichia coli, has been deposited at the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (FERM BP-954).

図6には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。
FIG. 6 shows the restriction enzyme cleavage site of the obtained gene.

また、このcDNAをpBR327[Soberon等;Gene
287頁(1980)]とEcoRI部位で結合したプラスミド
をpBRG4と称する。
In addition, this cDNA was cloned into pBR327 [Soberon et al .; Gene 9 vol.
P287 (1980)] and the plasmid bound at the EcoRI site are called pBRG4.

このようにして得られたpBRG4を、制限酵素Eco
RIで処理し得られる約1500塩基対のcDNAを含むD
NA断片をニックトランスレーション法(前出のMolecu
lar cloningを参照)にて放射標識し、これをプローブ
として、再びλgt10由来のcDNAライブラリーをプラ
ークハイブリダイゼーション(前出BentonとDavisの文
献参照)によりスクリーニングした。この際、同時にλ
ファージDNAを固定したニトロセルロース濾紙を2枚
作成しておき、先に述べたプローブ(LC)にて同様の
プラークハイブリダイゼーションを行い、両プローブで
ポジティブとなるファージを選別した。完全長と思われ
るクローンを選別し、ジデオキシ法を用いてcDNAイ
ンサートの塩基配列を決定したところ図4(A)に示され
る如くであった。
The pBRG4 thus obtained was digested with the restriction enzyme Eco.
D containing a cDNA of about 1500 base pairs obtained by treatment with RI
Nickel translation method for NA fragments (Molecu
lar cloning)), and using this as a probe, the λgt10-derived cDNA library was again screened by plaque hybridization (see Benton and Davis, supra). At the same time, λ
Two sheets of nitrocellulose filter paper on which phage DNA was immobilized were prepared, and the same plaque hybridization was performed using the above-mentioned probe (LC) to select positive phages with both probes. A clone considered to be full length was selected, and the nucleotide sequence of the cDNA insert was determined by the dideoxy method. The result was as shown in FIG. 4 (A).

このcDNAは一つの大きなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図4(A)に示
された如く演えきできる。
This cDNA has one large open reading frame and the encoded amino acid sequence can be deduced as shown in Figure 4 (A).

実施例3(i)に示されているG−CSFタンパクのN末
端アミノ酸配列との比較により、本cDNAは5′−末
端から31〜33ヌクレオチド位のATG配列から始まり、
118〜120位のGCC配列で終わる90塩基対によってコー
ドされるシグナルペプチドおよび121〜123位のACC配
列から始まり640〜642位のCCC配列で終る522塩基対
によってコードされる成熟G−CSFポリペプチドに相
当する塩基配列を含んでいることがわかった。従って図
4(B)に示されたアミノ酸配列Iのポロペプチドは204個
のアミノ酸からなり、その分子量は21977.35ダルトンと
計算された。同様にアミノ酸配列IIのポリペプチドは17
4個のアミノ酸からなり、その分子量は18671.42ダルト
ンであった(実施例10)。
By comparison with the N-terminal amino acid sequence of the G-CSF protein shown in Example 3 (i), this cDNA begins with the ATG sequence at the 31-33 nucleotide position from the 5'-end,
Mature G-CSF polypeptide encoded by a signal peptide encoded by 90 base pairs ending in the GCC sequence at positions 118-120 and 522 base pairs starting at the ACC sequence at positions 121-123 and ending at the CCC sequence at positions 640-642. It was found to contain a nucleotide sequence corresponding to. Therefore, the polo peptide of amino acid sequence I shown in FIG. 4 (B) was composed of 204 amino acids, and its molecular weight was calculated to be 21977.35 daltons. Similarly, the polypeptide of amino acid sequence II is 17
It was composed of 4 amino acids and had a molecular weight of 18671.42 daltons (Example 10).

但しタンパク質の開始部位に関しては、31〜33位以外に
58〜60位あるいは67〜69位のATGも同様に考え得る。
However, regarding the start site of the protein,
ATGs at positions 58-60 or 67-69 are also conceivable.

EcoRI切断部位に本cDNA(−VSE)を挿入し
たpBR327を保持するエシェリヒア・コリ(E.co
li)X1776株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている(FERMBP−955)。
Escherichia coli harboring pBR327 having the cDNA (-VSE) inserted at the EcoRI cleavage site (E.co.
li) X1776 strain has been deposited at the Institute of Microbial Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (FERMBP-955).

図6には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。
FIG. 6 shows the restriction enzyme cleavage site of the obtained gene.

また、このcDNAをpBR327とEcoRI部位で結
合したプラスミドをpBRV2と称する。
A plasmid obtained by ligating this cDNA to pBR327 at the EcoRI site is called pBRV2.

(4)ヒト染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング Maniatis等の記載した方法(前出Molecular cloningを
参照)に従って調製されたヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーを前述のpHCS−1を用いてスクリーニングした。
(4) Screening of human chromosomal gene library A human chromosomal gene library prepared according to the method described by Maniatis et al. (See above Molecular Cloning) was screened using pHCS-1 described above.

スクリーニングに用いるプローブとしては、pHCS−
1由来の308塩基対のDNA断片の他、pBRG4由来
の約1500塩基対のDNA断片やpBRV2由来の約1500
塩基対のDNA断片、あるいはこれ等のDNA断片の一
部を含む適当な長さのDNA断片、さらには前述のオリ
ゴヌクレオチドプローブ[(IWQ)、(A)、(L
C)]をもちいても実施することができる。
As a probe used for screening, pHCS-
In addition to the 308 base pair DNA fragment derived from No. 1, about 1500 base pair DNA fragment derived from pBRG4 and about 1500 derived from pBRV2
A DNA fragment having a base pair or a DNA fragment having an appropriate length containing a part of these DNA fragments, and further the above-mentioned oligonucleotide probes [(IWQ), (A), (L
C)] can also be used.

pHCS−1由来のDNA断片をニックトランスレーシ
ョン法[Roop等;Cell 15巻431頁(1978)を参照]に従っ
て[32P]で放射標識し、これプローブとしてヒト染
色体由来遺伝子ライブラリーをプラークハイブリダイゼ
ーション(前出のBentonとDavisの文献参照)によりス
クリーニングし、十数個のクローンを得た。
A DNA fragment derived from pHCS-1 was radiolabeled with [ 32 P] according to the nick translation method [Roop et al .; Cell 15: 431 (1978)], and a human chromosome-derived gene library was used as a probe for plaque hybridization. Screening was carried out (see Benton and Davis, supra) to obtain dozens of clones.

得られたクローンからDNAを回収した後、公知の方法
[Fritsch等;Cell 19巻959頁(1980)]に従って制限酵
素地図を作成した。
After recovering the DNA from the obtained clone, a restriction enzyme map was prepared according to a known method [Fritsch et al .; Cell 19: 959 (1980)].

次いで上記のDNAプローブを用いてサザンブロッティ
ング(前出Southernの文献参照)を行い、EcoRIお
よびXhoIで切り出される約4キロ塩基類DNA断片
に、ヒトG−CSFポリペプチドをコードする領域が存
在している可能性があることがわかった。そこで約4キ
ロ塩基対のDNA断片をpBR327のEcoRI部位
にEcoRIリンカーを用いて挿入し、pBRCE3β
を得た。このプラスミドを塩基配列を決定するためのD
NAとし、ジデオキシ法を用いて約3キロ塩基対の塩基
配列を決定したところヒトG−CSFポリペプチドをコ
ードする遺伝子であることが判明した(図5)。
Then, Southern blotting (see the above-mentioned Southern literature) is performed using the above DNA probe, and a region encoding the human G-CSF polypeptide is present in a DNA fragment of about 4 kilobases excised with EcoRI and XhoI. It turns out that there is a possibility. Therefore, a DNA fragment of about 4 kilobase pairs was inserted into the EcoRI site of pBR327 using an EcoRI linker to obtain pBRCE3β.
Got D for determining the nucleotide sequence of this plasmid
When NA was used and the nucleotide sequence of about 3 kilobase pairs was determined by the dideoxy method, it was found to be a gene encoding a human G-CSF polypeptide (FIG. 5).

この約4キロ塩基対のDNA断片をEcoRI部位に挿
入したプラスミドpBR327(pBRCE3β)を保
持するE.coliX1776株は、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。(FERM BP−
956)。
An E. coli strain harboring the plasmid pBR327 (pBRCE3β) in which this DNA fragment of about 4 kilobase pairs was inserted into the EcoRI site. E. coli strain X1776 has been deposited at the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology. (FERM BP-
956).

図3,図4に示されるpBRG4cDNAインサートお
よびpBRV2cDNAインサートとの比較によりこの
DNA断片は、5個のエクソン部分を含むものでもので
あり、pBRG4およびpBRV2から演えきされるア
ミノ酸配列をコードするものであることがわかった。
By comparison with the pBRRG4 and pBRV2 cDNA inserts shown in Figures 3 and 4, this DNA fragment contains 5 exon parts and encodes the amino acid sequence deduced from pBRG4 and pBRV2. I understood it.

また、このDNA断片は、ヒトG−CSFmRNAに転
写されるべき前領域すなわち、ヒトG−CSFの染色体
内遺伝子を含むものであり、さらには転写調節に関与す
る塩基配列を有している[BenoistとChambon;Nature 2
90巻304頁(1981)およびBreathnackとchambon;Ann.Rev.
Biochem.50巻349頁(1981)]。
In addition, this DNA fragment contains a preregion to be transcribed into human G-CSF mRNA, that is, a gene in human G-CSF chromosome, and further has a nucleotide sequence involved in transcriptional regulation [Benoist And Chambon ; Nature 2
90 : 304 (1981) and Breathnack and chamber; Ann. Rev.
Biochem. 50 : 349 (1981)].

(5)動物細胞用組換えベクターの構築 宿主細胞としてC127細胞、NIH3T3細胞を使用
する場合の組換えベクター(BPV由来)およびCHO
細胞を使用する場合の組換えベクター(DHFRを含
む)の構築を+VSE系、−VSE系cDNAおよび染
色体由来遺伝子について各々行った。又、COS細胞に
ついても同様の組換えベクターの構築を行った。ここで
は代表的な例について述べるが詳しくは実施例を参照さ
れたい。
(5) Construction of recombinant vector for animal cells Recombinant vector (derived from BPV) and CHO when C127 cells and NIH3T3 cells are used as host cells
Recombinant vectors (including DHFR) when cells were used were constructed for + VSE system, -VSE system cDNA and chromosomal-derived genes, respectively. Also, the same recombinant vector was constructed for COS cells. A typical example will be described here, but for details, refer to Examples.

(A)+VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA(+VSE)断片をベクタ
ーpdKCPに組み込みpHGA410プラスミドとし
た後(実施例12)(図8)これをEcoRIで部分消化
し、末端をブラントエンド(blunt end)にする。このD
NAにHindIIIリンカーを付加し、次いでHindI
II処理をしT4DNAリガーゼ処理した後これで塩化ル
ビジウム法(前出Molecular Cloning参照)を用い、
E.coli DHI株を形質転換した。得られたプラスミ
ドをpHGA410(H)と命名する(図9)。
Construction of (A) + VSE Recombinant Vector The cDNA (+ VSE) fragment obtained in (3) above was incorporated into the vector pdKCP to form a pHGA410 plasmid (Example 12) (FIG. 8), which was partially digested with EcoRI, Make the end blunt end. This D
HindIII linker was added to NA, followed by HindI
II treatment followed by T4 DNA ligase treatment and then using the rubidium chloride method (see Molecular Cloning above),
E. The E. coli strain DHI was transformed. The resulting plasmid is named pHGA410 (H) (Fig. 9).

pHGA410(H)をSalIで処理し、次いで末端
をブラントエンド化した後再びHindIII処理しHi
ndIII−SalI断片を回収する。
pHGA410 (H) was treated with SalI, then the ends were blunt-ended and then again treated with HindIII to obtain Hi.
The ndIII-SalI fragment is recovered.

一方、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換断片を有するpd
BPV−1プラスミドをHindIII、PvuIIで処理
し大きいほうのDNA断片を分離し、これと先のHin
dIII−SalI断片を結合する。これを用いてE.col
i DHI株を形質転換しpHGG4由来のCSF−c
DNAを有するプラスミド、pTN−G4を得る(図
9)(実施例13)。
On the other hand, pd containing a transforming fragment of bovine papilloma virus
The BPV-1 plasmid was treated with HindIII and PvuII to separate the larger DNA fragment.
The dIII-SalI fragment is ligated. Using this, E. col
pHGF4-derived CSF-c obtained by transforming the iDHI strain
A plasmid having DNA, pTN-G4, is obtained (FIG. 9) (Example 13).

一方、pHGA410プラスミドかpHGA410
(H)プラスミドとpAdD26SVpAプラスミドを
用いてCHO細胞用組換えベクター(+VSE)である
pHGG4−dhfrを構築した(図10a及びb)(実
施例15)。
On the other hand, pHGA410 plasmid or pHGA410
(H) The plasmid and pAdD26SVpA plasmid were used to construct pHGG4-dhfr, which is a recombinant vector (+ VSE) for CHO cells (Fig. 10a and b) (Example 15).

更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含む2
KbのDNA断片をEcoRIおよびBamHI処理に
より回収し、pHGA410(H)のHindIII部位
に挿入してpG4DR1とpG4DR2を構築した(図
10c)(実施例15)。
In addition, 2 including the DHFR gene from pAdD26SVpA
The Kb DNA fragment was recovered by EcoRI and BamHI treatment and inserted into the HindIII site of pHGA410 (H) to construct pG4DR1 and pG4DR2 (Fig.
10c) (Example 15).

(B)−VSE系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたcDNA(−VSE)断片をベクタ
ーpdKCRに組み込みpHGV2プラスミドとした後
(実施例18)これをEcoRIで部分消化し、末端をブ
ラントエンド(blunt end)にする。このDNAにHin
dIIIリンカーを付加し、次いでHindIII処理をしT
4DNAリガーゼ処理した後、これで塩基ルビジウム法
(前出Molecular Cloning参照)を用い、E.coli D
HI株を形質転換した。得られたプラスミドをpHGV
2(H)と命名する(図12)。
(B) -Construction of VSE-based recombinant vector The cDNA (-VSE) fragment obtained in (3) above was incorporated into the vector pdKCR to form a pHGV2 plasmid (Example 18), which was partially digested with EcoRI to terminate the ends. Make it a blunt end. Hin to this DNA
dIII linker was added, followed by HindIII treatment and T
After treatment with 4 DNA ligase, the base Rubidium method (see Molecular Cloning, supra) was used to transform E. coli D
The HI strain was transformed. The obtained plasmid was pHGV
It is named 2 (H) (Fig. 12).

pHGV2(H)をSalIで処理し、次いで末端をブ
ラントエンド化した後再びHindIII処理しHindI
II−SalI断片を回収する一方、ウシ乳頭腫ウィルス
の形質転換断片を有するpdBPV−1プラスミドをH
indIII、PvuIIで処理し大きい方のDNA断片を
分離し、これと先のHindIII−SalI断片を結合
する。これを用いてE.coliDHI株を形質転換し
pHGV2由来のCSF−cDNAを有するプラスミ
ド、pTN−V2を得る(図12)(実施例19)。
pHGV2 (H) was treated with SalI, the ends were blunt-ended, and then treated with HindIII again to be HindI.
While recovering the II-SalI fragment, the pdBPV-1 plasmid containing the transforming fragment of bovine papilloma virus was transformed into H
The larger DNA fragment is separated by treatment with indIII and PvuII, and this is ligated to the above HindIII-SalI fragment. Using this, E. The E. coli strain DHI is transformed to obtain pTN-V2, a plasmid having CSF-cDNA derived from pHGV2 (Fig. 12) (Example 19).

+VSEと同様にpHGV2プラスミドかpHGV2
(H)プラスミドとPAdD26SVpAプラスミドを
用いてCHO細胞用組換えベクター(−VSE)である
pHGV2−dhfrを構築した(図13a及びb)(実
施例21)。
PHGV2 plasmid or pHGV2 as well as + VSE
Using the (H) plasmid and the PAdD26SVpA plasmid, a recombinant vector (-VSE) for pH cells, pHGV2-dhfr, was constructed (Fig. 13a and b) (Example 21).

更にpAdD26SVpAからDHFR遺伝子を含む約
2KbのDNA断片をEcoRIおよびBamHI処理
により回収し、pHGV2(H)のHindIII部位に
挿入してpV2DR1とpV2DR2を構築した(図13
c)(実施例21)。
Furthermore, a DNA fragment of about 2 Kb containing the DHFR gene from pAdD26SVpA was recovered by EcoRI and BamHI treatment and inserted into the HindIII site of pHGV2 (H) to construct pV2DR1 and pV2DR2 (FIG. 13).
c) (Example 21).

(c)染色体由来遺伝子を含む組換えベクターの構築 前記(4)で得られた図5で示される染色体遺伝子を含む
プラスミドpBRCE3βをEcoRIで処理した。
(c) Construction of recombinant vector containing chromosome-derived gene The plasmid pBRCE3β containing the chromosomal gene shown in FIG. 5 obtained in (4) above was treated with EcoRI.

一方Banerji等の文献(Cell 27巻299頁(1981))に記載
されているpSVHプラスミドをKpnIで処理
してグロビリン遺伝子を除き、さらにHindIIIで部
分消化してSV40の後期遺伝子の一部を除いた後、再
結合させて発現用ベクターpML−Eを調製した。
On the other hand, the pSVH + K + plasmid described in Banerji et al. (Cell 27, p. 299 (1981)) was treated with KpnI to remove the globinin gene, and further partially digested with HindIII to partially digest the late gene of SV40. Was removed and then religated to prepare an expression vector pML-E + .

このベクターを、制限酵素EcoRIで処理した後、ア
ルカリホスファターゼ(宝酒造社製)で脱リン酸して得
られたベクターDNAをT4DNAリガーゼ(宝酒造社
製)を加えて上記染色体DNA断片と結合させ、COS
細胞用組換えベクターpMLCE3αを得た(実施例2
4)。図14に示される如くこのプラスミドは、SV40
遺伝子のエンハンサー、SV40の複製開始領域、pB
R322の複製開始領域およびpBR322由来のβ−
ラクタマーゼ遺伝子(Amp)を含むプラスミドで、
SV40遺伝子のエンハンサー下流にヒトG−CSF染
色体遺伝子が接続されている。C127細胞用の発現ベ
クターの構築は以下の如くして行った。即ち、COS細
胞での発現ベクターpMLCE3αより染色体由来のC
SF遺伝子を含むDNA断片を制限酵素で切り出し、ウ
シ乳頭腫ウイルス(BPV)の複製起源を含むDNA断
片およびSV40初期プロモーターを有するDNA断片
にT4DNAリガーゼを用いて連結した。得られたpT
NCE3αはSV40初期プロモーターの下流に染色体
由来のCSF遺伝子が連結され、BPVの65%部分を含
む発現ベクターである。
This vector was treated with a restriction enzyme EcoRI and then dephosphorylated with alkaline phosphatase (Takara Shuzo), and the resulting vector DNA was added to T4 DNA ligase (Takara Shuzo) to ligate with the above chromosomal DNA fragment to form COS.
A recombinant vector pMLCE3α for cells was obtained (Example 2
Four). As shown in Figure 14, this plasmid
Gene enhancer, replication initiation region of SV40, pB
Replication origin region of R322 and β-derived from pBR322
A plasmid containing the lactamase gene (Amp r ),
The human G-CSF chromosomal gene is connected downstream of the enhancer of the SV40 gene. The expression vector for C127 cells was constructed as follows. That is, the C derived from the chromosome was derived from the expression vector pMLCE3α in COS cells.
The DNA fragment containing the SF gene was excised with a restriction enzyme and ligated to the DNA fragment containing the replication origin of bovine papilloma virus (BPV) and the DNA fragment having the SV40 early promoter using T4 DNA ligase. The obtained pT
NCE3α is an expression vector in which a chromosome-derived CSF gene is linked downstream of the SV40 early promoter and contains 65% of BPV.

一方、CHO細胞用発現ベクターは、上記と同様の染色
体由来のCSF遺伝子とSV40初期プロモーター部分
を含むDNA断片及びpAdD26SVpA由来のDH
FR遺伝子を含むDNA断片をT4DNAリガーゼによ
り連結したものである。得られたpT26SVCE3α
はSV40プロモーター下流に染色体由来CSF遺伝
子、アデノウイルス主後期プロモーター下流にDHFR
遺伝子を有する発現ベクターである。
On the other hand, the expression vector for CHO cells comprises a DNA fragment containing the same CSF gene derived from the chromosome and the SV40 early promoter portion as described above and DH derived from pAdD26SVpA.
The DNA fragment containing the FR gene is ligated with T4 DNA ligase. The obtained pT26SVCE3α
Is a chromosome-derived CSF gene downstream of the SV40 promoter and DHFR downstream of the adenovirus major late promoter.
It is an expression vector having a gene.

(6)動物細胞による形質発現 ここでは代表的な例について述べるが、その他の場合に
ついては各実施例を見られたい。
(6) Expression by Animal Cell Here, a representative example will be described, but in other cases, see each example.

(A)マウスC127細胞による形質発現 pTN−G4プラスミドまたはpTN−V2プラスミド
をBamHIで処理しておき、これを用いて培養増殖さ
せておいたC127細胞をリン酸−カルシウム法で形質
転換する。得られた形質転換細胞を培養しCSF生産能
の高いクローンを選別する。形質発現したG−CSFは
これらの形質転換細胞の培養液から回収精製され、ヒト
−G−CSF活性を示すことが確認された。又試料のア
ミノ酸分析及び糖含有量分析により目的糖蛋白質の確認
もなされた。
(A) Expression by mouse C127 cells The pTN-G4 plasmid or pTN-V2 plasmid is treated with BamHI, and the C127 cells that have been cultured and grown using this are transformed by the phosphate-calcium method. The obtained transformed cells are cultured and a clone having a high CSF-producing ability is selected. The expressed G-CSF was recovered and purified from the culture medium of these transformed cells, and it was confirmed that it exhibits human-G-CSF activity. The target glycoprotein was also confirmed by amino acid analysis and sugar content analysis of the sample.

尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用いたCS
F試料をエルソン−モルガン法によるアミノ糖定量、オ
ルシノール硫酸法による中性糖の定量またはチオバルビ
ツール法によるシアル酸の定量にてそれぞれ実施した。
定量方法は生化学実験講座第4巻「糖質の化学(下
巻)」(東京化学同人)の13章に記載されている。各定
量値から重量%を換算した結果、発現ベクター及び培養
条件等の違いにより、得られたG−CSFの糖含量は1
〜20(重量%)の範囲に分布していた。
Regarding sugar content analysis, CS used for amino acid analysis
The F sample was subjected to quantification of amino sugars by the Elson-Morgan method, quantification of neutral sugars by the orcinol sulfate method, or sialic acid by the thiobarbitur method.
The quantification method is described in Chapter 13 of Biochemistry Experiment Course Vol. 4, "Sugar Chemistry (2nd Volume)" (Tokyo Kagaku Dojin). As a result of converting weight% from each quantitative value, the sugar content of the obtained G-CSF was 1 due to the difference in the expression vector and the culture conditions.
It was distributed in the range of up to 20 (% by weight).

(B)COS細胞による形質発現 前記(5)−(C)で得たヒト染色体由来のG−CSF
遺伝子を含むベクターpMLCE3αは、サルのCV−
1細胞由来でSV40の複製起源(origin)欠損
変異株で形質転換されSV40の大型T抗原を表現して
いるCOS細胞(Gluzman等;Cell 32巻175頁(1981)を
参照)を宿主細胞として形質発現させたところヒトG−
CSF活性を示すことがわかった(実施例25)。
(B) Expression by COS cells G-CSF derived from human chromosome obtained in (5)-(C) above
The vector containing the gene pMLCE3α is CV-
A COS cell (Gluzman et al .; see Cell 32, p. 175 (1981)) expressing a large T antigen of SV40, which was derived from one cell and was transformed with a replication-defective mutant of SV40, was used as a host cell. When expressed, human G-
It was found to show CSF activity (Example 25).

さらにCOS細胞を回収し、mRNAを分析したところ
図3(A)および図4(A)に示されるアミノ酸配列そ
れぞれに対応するmRNAが存在していた。
When COS cells were further collected and analyzed for mRNA, mRNA corresponding to each of the amino acid sequences shown in FIGS. 3 (A) and 4 (A) was present.

〔実施例〕〔Example〕

以下実施例をあげて本発明に詳細に説明するが、その前
にCSF活性の測定法について参考例で説明しておく。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but before that, a method for measuring CSF activity will be described with reference to Examples.

<参考例>CSF活性の測定方法 本発明において用いられたCSF活性(以下CSAと略
す)の測定方法は次のとおりである。
<Reference Example> Method for measuring CSF activity The method for measuring CSF activity (hereinafter abbreviated as CSA) used in the present invention is as follows.

「CSAの測定方法」 (a)ヒト骨髄細胞を用いる場合: BradleyT.R.,Metcalf D.等の方法(Aust.J.Ex
p.Biol.Med.Sci.44巻287〜300頁,1966年)に準じて単
層軟寒天培養法により行った。すなわちウシ胎児血清0.
2ml,被検検体0.1ml,ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液0.1m
l(1〜2×10有核細胞),改変McCoy′s 5A培養
液0.2ml,寒天を0.75%含む改変McCoy′s5A培養液0.
4mlを混合して直径35mmの組織培養プラスティックディ
ッシュに入れて固まらせたのち、37℃,5%炭酸ガス/
95%空気,100%湿度の条件で培養を行い、10日後に形
成されたコロニー数(50個以上の細胞からなる集落を1
コロニーとする)を数え、1個のコロニーを形成する活
性を1単位(Unit)としてCSAを求めた。
"Method for measuring CSA" (a) When using human bone marrow cells: Bradley T. et al. R. , Metcalf D.D. Etc. method (Aust.J.Ex
p.Biol.Med.Sci. 44 , 287-300, 1966) according to the monolayer soft agar culture method. That is, fetal bovine serum 0.
2 ml, test sample 0.1 ml, human bone marrow non-adherent cell suspension 0.1 m
l (1 to 2 × 10 5 nucleated cells), modified McCoy's 5A culture solution 0.2 ml, modified McCoy's 5A culture solution containing 0.75% agar.
After mixing 4 ml and putting it in a tissue culture plastic dish with a diameter of 35 mm to solidify, 37 ° C, 5% carbon dioxide gas /
Cultivated under the conditions of 95% air and 100% humidity, and the number of colonies formed after 10 days (a colony consisting of 50 or more cells
CSA was determined by counting the number of colonies) and the activity of forming one colony as 1 unit (Unit).

(b)マウス骨髄細胞を用いる場合: ウマ血清0.4ml,被検検体0.1ml,C3H/He(メス)マ
ウスの骨髄細胞浮遊液0.1ml(0.5〜1×10有核細
胞),寒天を0.75%含む改変McCoy′s5A培養液0.4ml
を混合し直径35mmの組織培養用プラスティックディッシ
ュに入れて固まらせたのち、37℃,5%炭酸ガス/95%
空気、100%湿度の条件下にて5日間培養し、形成され
たコロニー数(50個以上の細胞からなる集落を1コロニ
ーとする)を数え、1個のコロニーを形成する活性を1
単位(Unit)としてCSAを求めた。
(b) When using mouse bone marrow cells: horse serum 0.4 ml, test sample 0.1 ml, C3H / He (female) mouse bone marrow cell suspension 0.1 ml (0.5 to 1 × 10 5 nucleated cells), agar 0.75 % Modified McCoy's 5A Culture Solution 0.4 ml
After mixing and placing in a plastic dish for tissue culture with a diameter of 35 mm to solidify, 37 ° C, 5% carbon dioxide gas / 95%
After culturing for 5 days in air and 100% humidity, the number of colonies formed (a colony consisting of 50 or more cells is defined as 1 colony) is counted, and the activity of forming 1 colony is 1
CSA was calculated as a unit.

尚、上記(a),(b)の方法において用いた「改変McCoy′
s5A培養液および(a)で用いたヒト骨髄非付着性細胞
浮遊液は次の如くして作成した。
The “modified McCoy ′” used in the above methods (a) and (b) was used.
The s5A culture medium and the human bone marrow non-adherent cell suspension used in (a) were prepared as follows.

「改変McCoy′s5A培養液(2倍濃度)」 McCoy′s5A培養液(GIBCO社製)12g,MEM
アミノ酸ビタミン培地(日水製薬社製)2.55g、重炭酸
ナトリウム2.18g、ペニシリンGカリウム50000単位を
2回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μmのミリポアフィル
ターにて濾過滅菌を行った。
"Modified McCoy's 5A culture solution (double concentration)"McCoy's 5A culture solution (manufactured by GIBCO) 12 g, MEM
2.55 g of an amino acid vitamin medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 2.18 g of sodium bicarbonate and 50,000 units of penicillin G potassium were dissolved twice in 500 ml of distilled water, and then sterilized by filtration with a 0.22 μm Millipore filter.

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をRPMI1640培養
液にて5倍に希釈し、Ficol−Paque液(ファルシア社
製)に重層し、400×g,30分,25℃にて遠心を行い、
界面の細胞層(比重<1.077)を回収する。この細胞を
洗浄後、20%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培養液に
て5×10Cell/mlの濃度に調整し、25cm2の組織培養
用プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて30
分間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を回
収し、再度25cm2プラスチックフラスコに入れ、2時間3
0分インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を集
めて用いた。
"Human bone marrow non-adherent cell suspension" A bone marrow fluid obtained by sternal puncture of a healthy person was diluted 5 times with RPMI1640 culture solution, and overlaid with Ficol-Paque solution (Falcia), 400 xg, 30 Centrifuge at 25 ℃ for min.
The interface cell layer (specific gravity <1.077) is collected. After washing the cells, they were adjusted to a concentration of 5 × 10 6 cells / ml with RPMI1640 culture medium containing 20% fetal bovine serum, placed in a 25 cm 2 tissue culture plastic flask, and placed in a carbon dioxide incubator for 30
After incubating for 2 minutes, the non-adherent cells in the supernatant were collected and placed again in a 25 cm 2 plastic flask for 2 hours 3 hours.
After incubating for 0 minutes, the supernatant non-adherent cells were collected and used.

実施例1「CHU−2」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
nu/nuマウスに移植した。この腫瘍は移植約10日後
に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。この
腫瘍を移植12日後に無菌的に摘出し、1〜2mm角に細
切し、これを以下の如く培養した。
Example 1 Establishment of "CHU-2" Tumors of a cancer of the floor of the mouth with a marked increase in neutrophils were transplanted into nu / nu mice. About 10 days after transplantation, this tumor showed a marked increase in tumor and an increase in neutrophils. This tumor was aseptically excised 12 days after transplantation, cut into 1-2 mm 3 squares, and cultured as follows.

上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチック遠心
管に入れ、5mlのトリプシン溶液(トリプシン0.25%,
EDTA0.02%含む)を加え、37℃の温浴中で10分間振
とうしたのち上清を捨て、再度、同トリプシン溶液5ml
を加え、37℃で15分間攪拌しながらトリプシン消化を行
った。
10-15 pieces of the above-mentioned minced tumor mass were placed in a 50 ml plastic centrifuge tube, and 5 ml of trypsin solution (trypsin 0.25%,
(Containing 0.02% EDTA), shaken in a 37 ° C warm bath for 10 minutes, discard the supernatant, and again add 5 ml of the same trypsin solution.
Was added, and trypsin digestion was performed while stirring at 37 ° C for 15 minutes.

上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を1ml加えて
トリプシンの作用を止めたのち氷中に保存した。
The supernatant cell suspension was collected, 1 ml of fetal bovine serum was added to stop the action of trypsin, and the cells were stored in ice.

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて1,500r.p.m.10分間の遠心により細胞ペレット
を得た。
The above operation was performed again to collect the cell suspension, and the cell pellet was obtained by centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes together with the previous time.

この細胞ペレットをウシ胎児血清を10%含むF−10にて
2回洗浄したのち、25cm2のプラスチック培養フラスコ
に細胞濃度5×10個/フラスコになるようにして植え
込んだ。ウシ胎児血清を10%含有するF−10培養液を用
い、炭酸ガスインキュベーター(炭酸ガス濃度5%,湿
度100%)中にて一晩インキュベートしたのち、上清を
非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を
継続した。培養開始後6日目に細胞がいっぱいに増殖し
たので、この時点で培養液を新しいものに替えた。翌
日、この培養液を捨て、RPMI1640で5倍希釈した抗
マウス赤血球抗体(Cappel社製)2mlと同じくR
PMI1640で2.5倍希釈したモルモット補体(極東製薬
社製)2mlを加え37℃,20分間インキュベートした。イ
ンキュベーション終了後ウシ胎児血清を10%含むF−10
にて2回洗浄しnu/nuマウス由来のフィブロブラス
トを除去し引き続きウシ胎児血清を10%含むF−10倍養
液を加えて、さらに2日間培養を行った後細胞の一部を
取り出し限界希釈法によりクローニングを行った。得ら
れた11個のクローンについてCSF活性を調べたとこ
ろ、他のものよりも約10倍高い活性を示すクローン(C
HU−2)が得られた。
This cell pellet was washed twice with F-10 containing 10% fetal bovine serum and then seeded in a 25 cm 2 plastic culture flask at a cell concentration of 5 × 10 6 cells / flask. After incubating overnight in a carbon dioxide gas incubator (carbon dioxide gas concentration 5%, humidity 100%) using F-10 culture solution containing 10% fetal bovine serum, the supernatant was removed together with non-adherent cells, and a fresh The culture solution was added to continue the culture. On the 6th day after the start of the culture, the cells were fully grown, so the culture medium was replaced with a new one at this point. The next day, this culture solution was discarded, and R was the same as 2 ml of anti-mouse erythrocyte antibody (manufactured by Cappel) diluted 5 times with RPMI1640.
2 ml of guinea pig complement (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted 2.5 times with PMI1640 was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 20 minutes. After the incubation, F-10 containing 10% fetal calf serum
After washing twice with NU / nu to remove fibroblasts derived from nu / nu mice, and then adding F-10 times nutrient solution containing 10% fetal bovine serum, and culturing for 2 more days Cloning was performed by the dilution method. When the CSF activity of the 11 clones obtained was examined, a clone showing about 10 times higher activity than other clones (C
HU-2) was obtained.

実施例2 CSFの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した15
0cm2の培養フラスコ2本より細胞を回収し、これをウシ
胎児血清を10%含有するF−10培養液500mlに浮遊させ
たのち、1580cm2のガラス製ローラーボトル(Belc
o社製)に移し、0.5 r.p.mの速度で回転培養を行っ
た。細胞がローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した
時点で培養液を血清を含まないRPMI1640に交換し、
4日間培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を
10%含有するF−10を加えて培養を続行する。3日間培
養したのち再び血清を含まないRPMI1640に液替を行
い、4日後に培養上清を回収した。以下同様の操作をく
り返すことにより、毎週1ボトルより500mlずつの血清
を含まない培養上清が得られ、しかもこの方法によりか
なり長期間にわたって細胞を維持し、培養上清を回収す
ることが可能であった。得られた培養上清5を1バッ
チとし、これに0.01%ツィーン20を添加後Hol low Fibe
r DC−4およびAmicon PM−10(アミコン社製)
を用いた限外濾過法により約1000倍に濃縮したのち、こ
れを以下の順序で精製した。
Example 2 Isolation of CSF The cells established as described above grew completely densely 15
Cells were collected from two 0 cm 2 culture flasks, suspended in 500 ml of F-10 culture solution containing 10% fetal bovine serum, and then placed in a 1580 cm 2 glass roller bottle (Belc).
(manufactured by O Co.) and subjected to rotary culture at a speed of 0.5 rpm. When the cells were completely and densely grown on the inner wall of the roller bottle, the culture solution was replaced with serum-free RPMI1640,
After culturing for 4 days, the culture supernatant was collected and fetal bovine serum was added.
F-10 containing 10% is added to continue the culture. After culturing for 3 days, the serum-free RPMI1640 was changed again, and after 4 days, the culture supernatant was collected. By repeating the same procedure below, 500 ml of serum-free culture supernatant can be obtained from one bottle each week, and this method allows cells to be maintained and collected for a considerably long period of time. Met. The obtained culture supernatant 5 was made into one batch, and 0.01% Tween 20 was added to this, and Hol low Fiber was added.
r DC-4 and Amicon PM-10 (Amicon)
After being concentrated to about 1000 times by the ultrafiltration method using, it was purified in the following order.

(i)直径4.6cm,長さ90cmのUltrogel AcA 54カラム(L
KB社製)を用い、0.15M NaCl及び0.01%ツィー
ン20(半井化学社製)を含む0.01Mトリス塩酸緩衝液
(pH7.4)を用いて前記濃縮した培養上清5mlを流速約5
0ml/時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじめウシ
血清アルブミン(分子量67,000),オボアルブミン(分
子量45,000),チトクロームC(分子量12,400)にてキ
ャリブレーションを行った。ゲル濾過終了後各フラクシ
ョンより0.1mlずつを採取し、10倍に希釈した後、前述
した「CSAの測定方法(b)」により活性を示す画分を
調べた。この結果、先ずVe=400〜700mlの画分がマク
ロファージ優位のCSAを示し、Ve=800〜1200mlの
画分が顆粒球優位のCSAを示すことがわかったので、
後者の画分を集めPM−10(アミコン社製)を用いる限
外濾過器によって約5mlに濃縮した。
(i) Ultrogel AcA 54 column with a diameter of 4.6 cm and a length of 90 cm (L
(Manufactured by KB) and 0.01M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.15M NaCl and 0.01% Tween 20 (manufactured by Hanai Chemical Co., Ltd.) were added to 5 ml of the above-mentioned concentrated culture supernatant to obtain a flow rate of about 5
Gel filtered at 0 ml / hr. The column was previously calibrated with bovine serum albumin (molecular weight 67,000), ovalbumin (molecular weight 45,000) and cytochrome C (molecular weight 12,400). After completion of gel filtration, 0.1 ml was collected from each fraction and diluted 10-fold, and then the active fraction was examined by the above-mentioned "CSA measurement method (b)". As a result, first, it was found that the fraction of Ve = 400 to 700 ml showed macrophages-dominated CSA, and the fraction of Ve = 800 to 1200 ml showed granulocyte-dominated CSA.
The latter fraction was collected and concentrated to about 5 ml by an ultrafilter using PM-10 (manufactured by Amicon).

(ii)上記濃縮画分にn−プロパノール(東京化成社
製,アミノ酸配列決定用)を30%含む0.1%トリフルオ
ロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、
15,000r.p.m.10分の遠心により沈澱を除去した。次いで
先のn−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水
溶液で平衡化したμ Bondapak C18カラム(Wate
rs社製、セミ分取用,8mm×30cm)に吸着後、30〜60
%の直線濃度勾配のn−プロパノールを含む0.1%トリ
フルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト
装置は日立685−50型を、検出は日立638−41型検出器
(いずれも日立製作所製)を用い、220nmと280nmの吸収
を同時に測定した。溶出後、各画分より10μlを分取10
0倍希釈したのち、前述の「CSAの測定法(b)」により活
性を示す画分を調べた。この結果、n−プロパノール40
%にて溶出されるピークに活性が認められたので、この
ピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同
様にしてCSAを調べたところ、やはりn−プロパノー
ル40%の位置のピークに活性が認められたので、このピ
ークを集め(4フラクション=4ml)凍結乾燥した。
(Ii) A 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution containing 30% of n-propanol (manufactured by Tokyo Kasei Co., for amino acid sequencing) was added to the concentrated fraction, and the mixture was allowed to stand in ice for about 15 minutes.
The precipitate was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes. Then, a μ Bondapak C18 column (Wate, equilibrated with an aqueous solution containing n-propanol and trifluoroacetic acid) was used.
30-60 after adsorbing to rs, semi-preparative, 8 mm x 30 cm)
Elution was carried out sequentially with a 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution containing a linear concentration gradient of n-propanol. Hitachi 685-50 type was used as the high performance liquid chromatograph, and Hitachi 638-41 type detector (both manufactured by Hitachi Ltd.) was used for detection, and absorption at 220 nm and 280 nm was measured at the same time. After elution, collect 10 μl from each fraction.
After 0-fold dilution, the active fraction was examined by the above-mentioned "CSA assay method (b)". As a result, n-propanol 40
%, Activity was observed in the peak that was eluted, and when this peak was collected and re-chromatographed again under the same conditions and CSA was examined in the same manner as above, activity was again observed in the peak at the position of 40% n-propanol. Was observed, this peak was collected (4 fractions = 4 ml) and freeze-dried.

(iii)上記凍結乾燥粉末をn−プロパノールを40%含む
0.1%トリフルオロ酢酸水溶液200μlに溶解し、TSK
−G3000SWカラム(東洋曹達社製,7.5mm×60cm)を
用いた高速液体クロマトグラフィ(HPLC)にかけ
た。溶出は同水溶液により0.4ml/分の流速で行い、フ
ラクションコレクターFRAC−100(ファルマシア社
製)により0.4mlずつ分取した。分取した各画分につい
てCSAを前記と同様にて調べた結果、保持時間が37〜
38分の画分(分子量約2万に相当)に活性が認められた
ので、この画分を回収し、更に分析用μBondapakC18カ
ラム(4.6mm×30cm)による精製を施したのち、メイン
ピークを回収し凍結乾燥した。得られた標品について前
述の「CSAの測定方法(a)」によって検定したところ
ヒトG−CSF活性を有することを認めた。
(iii) The freeze-dried powder contains 40% of n-propanol.
Dissolve in 200 μl of 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and prepare TSK
It was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) using a G3000SW column (Toyo Soda Co., Ltd., 7.5 mm × 60 cm). Elution was performed with the same aqueous solution at a flow rate of 0.4 ml / min, and 0.4 ml each was collected with a fraction collector FRAC-100 (manufactured by Pharmacia). As a result of examining CSA for each of the fractions collected in the same manner as above, the retention time was 37-
Since activity was observed in the 38-minute fraction (equivalent to a molecular weight of about 20,000), this fraction was collected and further purified using an analytical μBondapak C18 column (4.6 mm x 30 cm), then the main peak was collected. And freeze dried. The obtained preparation was assayed by the above-mentioned “method for measuring CSA (a)” and found to have human G-CSF activity.

実施例3 アミノ酸配列の決定 (i) N末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー(アプライドバイオシステ
ム社製)を用いてエドマン(Edman)分解し、得ら
れたPTHアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置
(ベックマン・インストルメンツ社製)およびUltrasph
ere−ODSカラム(ベックマン・インストルメンツ社
製)を用いて常法により分析した。カラム(5μm,直
径4.6mm,長さ250mm)を開始緩衝液(15mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH4.5,40%アセトニトリルを含む水溶液)に
て平衡化したのち、検体(20μlの開始緩衝液にて溶
解)を注入して開始緩衝液によるイソクラティック溶出
により分離を行った。流速は1.4ml/分、カラム温度は4
0℃に保持した。PTHアミノ酸の検出は269nmと320nm
の紫外部吸収を利用した。あらかじめ標準PTHアミノ
酸(シグマ社製)各2n molを同一の系で分離して保持
時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。
Example 3 Determination of amino acid sequence (i) Determination of N-terminal amino acid sequence A sample was subjected to Edman degradation using a gas phase sequencer (manufactured by Applied Biosystems), and the obtained PTH amino acid was analyzed by a high performance liquid chromatography apparatus. (Manufactured by Beckman Instruments) and Ultrasph
An ere-ODS column (manufactured by Beckman Instruments) was used for analysis by a conventional method. Equilibrate the column (5 μm, diameter 4.6 mm, length 250 mm) with a starting buffer solution (15 mM sodium acetate buffer pH 4.5, an aqueous solution containing 40% acetonitrile), and then dissolve the sample (20 μl starting buffer solution). ) Was injected and the separation was performed by isocratic elution with a starting buffer. Flow rate is 1.4 ml / min, column temperature is 4
Hold at 0 ° C. Detection of PTH amino acids is 269 nm and 320 nm
The ultraviolet absorption of was used. 2 nmol of each standard PTH amino acid (manufactured by Sigma) was separated in the same system to determine the retention time, and the retention time of the test sample was identified.

この結果、N末端から40残基目までのアミノ酸配列は次
の如く決定された。
As a result, the amino acid sequence from the N-terminal to the 40th residue was determined as follows.

N−Thr−Pro−Leu−Gly−Pro−A
la−Ser−Ser−Leu−Pro−Gln−Se
r−Phe−Leu−Leu−Lys−Cys−Leu
−Glu−Gln−Val−Arg−Lys−Ile−
Gln−Gly−Asp−Gly−Ala−Ala−L
eu−Gln−Glu−Lys−Leu−Cys−Al
a−Thr−Tyr−Lys− (ii)ブロムシアン分解 試料を70%ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン20
0当量を加えて、37℃で一夜反応させた。次に反応物を
凍結乾燥後、TSK G3000SWカラム(東洋曹達社
製)を用いたHPLCで分画し4つのピークを得た。ピ
ークを分子量の大きい順にCN−1,CN−2,CN−
3,CN−4と命名し、収率のよいCN−1,CN−2
についてアミノ3酸配列を自動気相式シークエンサー
(アプライドバイオシステム社製)を用いて(i)と同様
の条件で分析した。
H 2 N-Thr-Pro- Leu-Gly-Pro-A
la-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Se
r-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu
-Glu-Gln-Val-Arg-Lys-Ile-
Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Ala-L
eu-Gln-Glu-Lys-Leu-Cys-Al
a-Thr-Tyr-Lys- (ii) Bromcian decomposition A sample of Bromcyan was dissolved in 70% formic acid and purified by sublimation.
0 equivalent was added, and the mixture was reacted overnight at 37 ° C. Next, the reaction product was freeze-dried and then fractionated by HPLC using a TSK G3000SW column (manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) to obtain four peaks. The peaks are arranged in descending order of molecular weight, CN-1, CN-2, CN-
3, CN-4, which is a good yield of CN-1, CN-2
Was analyzed for the amino triacid sequence using an automatic gas phase sequencer (manufactured by Applied Biosystems) under the same conditions as in (i).

その結果、CN−1はG−CSFタンパクのN末端から
ペプチドであることがわかった。さらにCN−2は以下
のアミノ酸配列を有していた。
As a result, it was found that CN-1 was a peptide from the N-terminus of G-CSF protein. Furthermore, CN-2 had the following amino acid sequence.

Pro−Ala−Phe−Ala−Ser−Ala−P
he−Gln−Arg−Arg−Ala−Gly−Gl
y−Val−Leu−Val−Ala−Ser−His
−Leu−Gln− (iii)トリプシン分解 試料を8M尿素を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.4)
に溶かし、0.1%2−メルカプトエタノールを含む0.1M
トリス塩酸緩衝液(pH7.4)を加えて最終的に2Mの尿
素となるように調整した。次いで試料と酵素が50:1と
なるようにTPCK処理トリプシン(シグマ社製商品名)を
加え、25℃で4時間反応させた後、さらに同量のTPC
K処理トリプシンを加えて、再度25℃で16時間反応させ
た。反応後、反応物をC8カラム(山村化学社製)を用
いた高速逆相カラムクロマトグラフィーに付した。溶出
は0.1%TFAを含むn−プロパノールを用い、n−プ
ロパノール濃度を5%〜60%に直線的に上げて行った。
280nmの紫外部吸収を測定して得られたピークのうち、
メインピークについて(i)と同条件下に自動気相式シー
クエンサー(アプライドバイオシステム社製)を用いて
アミノ酸配列を分析した。その結果、メインピークは(i
i)のCN−2断片の一部を含む以下の配列を有するペプ
チドであることがわかった。
Pro-Ala-Phe-Ala-Ser-Ala-P
he-Gln-Arg-Arg-Ala-Gly-Gl
y-Val-Leu-Val-Ala-Ser-His
-Leu-Gln- (iii) trypsin degradation The sample was 0.1M Tris-HCl buffer (pH7.4) containing 8M urea.
0.1M containing 0.1% 2-mercaptoethanol
Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4) was added to adjust the final concentration to 2M urea. Next, TPCK-treated trypsin (trade name, manufactured by Sigma) was added so that the sample and the enzyme became 50: 1, and the mixture was reacted at 25 ° C for 4 hours, and then the same amount of TPC was added.
K-treated trypsin was added, and the mixture was reacted again at 25 ° C for 16 hours. After the reaction, the reaction product was subjected to high-speed reverse phase column chromatography using a C8 column (manufactured by Yamamura Chemical Co., Ltd.). Elution was performed by using n-propanol containing 0.1% TFA and increasing the n-propanol concentration linearly from 5% to 60%.
Of the peaks obtained by measuring the ultraviolet absorption at 280 nm,
The amino acid sequence of the main peak was analyzed under the same conditions as (i) using an automatic gas phase sequencer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the main peak is (i
It was found to be a peptide having the following sequence containing a part of the CN-2 fragment of i).

Gln−Leu−Asp−Val−Ala−Asp−P
he−Ala−Thr−Thr−Ile−Trp−Gl
n−Gln−Met−Glu−Glu−Leu−Gly
−Met−Ala−Pro−Ala−Leu−Gln−
Pro−Thr−Gln−Gly−Ala−Met−P
ro−Ala−Phe−Ala−Ser− 実施例4 DNAプローブの作成 (i)プローブ(IWQ)の合成 実施例3.(iii)で得られたアミノ酸配列の中からIl
e−Trp−Gln−Gln−Met−Glu−Glu
−Leu−Gly−Metで示される10個のアミノ酸の
配列に基づいて、30個の連続するヌクレオチドを得た
(図1)。図1の配列に於いて、例えば5′−末端から
9位のヌクレオチドはdAおよびdGを等量含む混合物
であることを示す。原料のヌクレオチドは主にダイマー
を使用し、必要に応じて随時モノヌクレオチドも使用し
た。グラスフィルター付きカラムに出発原料のヌクレオ
チド樹脂Ap−d(G)(ヤマサ醤油社製)20mgを入れ
塩化メチレンにて洗浄を繰り返した後、3%トリクロロ
酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、4,4′−ジメトキ
シトリチル基を脱離せしめ、次いで1mlの塩化メチレン
でカラムを数回洗浄した。無水ピリジンで洗浄して溶媒
を置換したのちヌクレオチドダイマー(DMTr)Ap
Tp(NHR)(日本ゼオン社製;NHRはトリエ
チルアンモニウム,DMTrはジメトキシトリチルを示
す)20mgと0.2mlのピリジンを加えて真空ポンプにてカ
ラム内を真空乾燥した。次いで、2,4,6−トリメチ
ルベンゼンスルホニル−3−ニトロトリアゾリド(MS
NT,和光純薬社製)20mgと無水ピリジン0.2mlを加え
た後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に45分間
時々振とうさせることによってヌクレオチド樹脂とダイ
マーを縮合させた。反応終了後、ピリジンにてカラムを
洗浄し、次いで未反応のOH基を過剰の無水酢酸と4−
ジメチルアミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチ
ル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。以下同
様に、(DMTr)Ip(NHR3),(DMTr)GpGp(NHR3),(DMTr)Ip(N
HR3),(DMTr)GpTp(NHR3)と(DMTr)TpTp(NHR3)の等量混合
物,(DMTr)ApAp(NHR3)と(DMTr)ApGp(NHR3)の等量混合
物,(DMTr)ApGp(NHR3)と(DMTr)GpGp(NHR3)の等量混合
物,(DMTr)GpAp(NHR3),(DMTr)TpGp(NHR3),(DMTr)ApAp
(NHR3)と(DMTr)GpAp(NHR3)の等量混合物,(DMTr)CpAp(N
HR3),(DMTr)ApAp(NHR3)と(DMTr)ApGp(NHR3)との等量混
合物,(DMTr)GpCp(NHR3),(DMTr)TpGp(NHR3),(DMTr)Ip
(NHR3),(DMTr)ApTp(NHR3)[(DMTr)Ip(NHR3)はヤマサ醤
油社製,その他は全て日本ゼオン社製]の順で、前述の
操作を繰り返すことによって縮合させた。最終段階の反
応終了後、アセチル化することなしに、ピリジン,塩化
メチレン,エーテルの順で樹脂を洗浄した後、乾燥させ
た。乾燥させた樹脂を1Mテトラメチルグアニジンおよ
び1Mα−ピコリンアルドキシムを含むジオキサン1m
l,ピリジン0.5ml,水0.2mlの混合液1.7mlに懸濁した
後、一夜室温にて放置した後、100〜200μlまで減圧濃
縮した。この濃縮液に少量(2〜3滴)のピリジンを加
えた後、濃アンモニア水2〜3mlを加え55℃で6時間加
温した。次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られ
た水層を減圧濃縮した後、50mMトリエチルアンモニウ
ム酢酸溶液(pH7.0)に溶解せしめてC−18カラム(1.0
×15cm,Waters社製)を用いたカラムクロマトグ
ラフィーに付した。溶出は、50mMトリエチルアンモニ
ウム酢酸溶液(pH7.0)中10%〜30%の直線濃度勾配の
アセトニトリルで行い、アセトニトリル濃度が25%付近
の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃縮した。
Gln-Leu-Asp-Val-Ala-Asp-P
he-Ala-Thr-Thr-Ile-Trp-Gl
n-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-Gly
-Met-Ala-Pro-Ala-Leu-Gln-
Pro-Thr-Gln-Gly-Ala-Met-P
ro-Ala-Phe-Ala-Ser- Example 4 Preparation of DNA probe (i) Synthesis of probe (IWQ) Example 3. Il from the amino acid sequence obtained in (iii)
e-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu
Based on the sequence of 10 amino acids shown by -Leu-Gly-Met, 30 consecutive nucleotides were obtained (Fig. 1). In the sequence of FIG. 1, for example, the nucleotide at position 9 from the 5'-end is shown to be a mixture containing equal amounts of dA and dG. The starting material nucleotides were mainly dimers, and if necessary, mononucleotides were also used. 20 mg of nucleotide resin Ap-d (G) (manufactured by Yamasa Shoyu Co., Ltd.) as a starting material was placed in a column with a glass filter, and washing with methylene chloride was repeated, and then 4,4 with a methylene chloride solution containing 3% trichloroacetic acid The'-dimethoxytrityl group was eliminated and then the column was washed several times with 1 ml of methylene chloride. After washing with anhydrous pyridine to replace the solvent, nucleotide dimer (DMTr) Ap
20 mg of Tp (NHR 3 ) (manufactured by Zeon Corporation; NHR 3 is triethylammonium, DMTr is dimethoxytrityl) and 0.2 ml of pyridine were added, and the inside of the column was vacuum dried with a vacuum pump. Then, 2,4,6-trimethylbenzenesulfonyl-3-nitrotriazolide (MS
(NT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 mg and anhydrous pyridine 0.2 ml were added, the column was replaced with nitrogen gas, and the nucleotide resin and the dimer were condensed by occasional shaking at room temperature for 45 minutes. After completion of the reaction, the column was washed with pyridine, and then the unreacted OH group was treated with excess 4-acetic anhydride.
After acetylation with a pyridine solution containing dimethylaminopyridine, the column was washed again with pyridine. Similarly, (DMTr) Ip (NHR 3 ), (DMTr) GpGp (NHR 3 ), (DMTr) Ip (N
HR 3), (DMTr) equal mixture of GpTp (NHR 3) and (DMTr) TpTp (NHR 3) , an equal mixture of (DMTr) ApAp (NHR 3) and (DMTr) ApGp (NHR 3) , (DMTr ) ApGp (NHR 3 ) and (DMTr) GpGp (NHR 3 ) equal mixture, (DMTr) GpAp (NHR 3 ), (DMTr) TpGp (NHR 3 ), (DMTr) ApAp
Equivalent mixture of (NHR 3 ) and (DMTr) GpAp (NHR 3 ), (DMTr) CpAp (N
HR 3), (mixture of equal amounts DMTr) APAP and (NHR 3) and (DMTr) ApGp (NHR 3) , (DMTr) GpCp (NHR 3), (DMTr) TpGp (NHR 3), (DMTr) Ip
(NHR 3 ), (DMTr) ApTp (NHR 3 ) [(DMTr) Ip (NHR 3 ) is manufactured by Yamasa Shoyu Co., and all others are manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.] . After completion of the reaction in the final step, the resin was washed with pyridine, methylene chloride and ether in this order without acetylation and then dried. The dried resin was treated with 1M of dioxane containing 1M tetramethylguanidine and 1M α-picoline aldoxime.
The mixture was suspended in 1.7 ml of a mixed solution of 1, 1, 0.5 ml of pyridine and 0.2 ml of water, allowed to stand at room temperature overnight, and then concentrated under reduced pressure to 100 to 200 μl. After adding a small amount (2-3 drops) of pyridine to this concentrated solution, 2-3 ml of concentrated aqueous ammonia was added and the mixture was heated at 55 ° C for 6 hours. Then, ethyl acetate was added for extraction and separation, and the obtained aqueous layer was concentrated under reduced pressure, and then dissolved in a 50 mM triethylammonium acetic acid solution (pH 7.0), and a C-18 column (1.0
It was subjected to column chromatography using × 15 cm, manufactured by Waters. Elution was performed with 10% to 30% linear concentration gradient of acetonitrile in 50 mM triethylammonium acetic acid solution (pH 7.0), and the peak fraction eluted at a position where the acetonitrile concentration was around 25% was concentrated under reduced pressure.

この濃縮液に80酢酸を加えて室温下に30分間放置した
後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水層を減
圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、C18カラム(セン
シュー科学社製,SSC−ODS−272,6φ×200mm)
を用いた高速液体クロマトグラフィーに付して、さらに
精製した。溶出は50mMトリエチルアンモニウム酢酸溶
液(pH7.0)中10%〜20%の直線濃度勾配のアセトニト
リルを用いて行い、10A260units以上の収量で合
成DNAが得られた。
After adding 80 acetic acid to this concentrated liquid and leaving it at room temperature for 30 minutes, ethyl acetate was added and the aqueous layer obtained by extraction and separation was concentrated under reduced pressure. The concentrate obtained was a C18 column (SSC-ODS-272, 6φ × 200 mm, manufactured by Senshu Scientific Co., Ltd.).
Further purification was performed by high performance liquid chromatography using. Elution was performed using acetonitrile with a linear concentration gradient of 10% to 20% in a 50 mM triethylammonium acetic acid solution (pH 7.0), and synthetic DNA was obtained in a yield of 10A 260 units or more.

(ii)プローブ(A)の合成 実施例3.(iii)で得られたアミノ酸配列の中からMe
t−Pro−Ala−Phe−Alaで示される5個の
アミノ酸の配列に基づいて14個の連続するヌクレオチド
を得た(図1)。
(ii) Synthesis of probe (A) Example 3. From the amino acid sequences obtained in (iii), Me
14 contiguous nucleotides were obtained based on the sequence of 5 amino acids shown in t-Pro-Ala-Phe-Ala (Fig. 1).

合成は、プローブ(IWQ)と同様な方法で行いヌクレ
オチド樹脂AP−d(T)(ヤマサ醤油社製)に(DMTr)
CpAp(NHR3);(DMTr)GpGp(NHR3);(DMTr)CpAp(NHR3),(D
MTr)CpTp(NHR3);(DMTr)CpGp(NHR3)および(DMTr)CpCp(N
HR3)の等量混合物;(DMTr)ApGp(NHR3),(DMTr)TpGp(NHR
3),(DMTr)GpGp(NHR3)および(DMTr)CpGp(NHR3)の等量混
合物;(DMTr)ApAp(NHR3);(DMTr)CpAp(NHR3)と(DMTr)Cp
Gp(NHR3)の等量混合物;(DMTr)Gp(NHR3)(いずれも日本
ゼオン社製)の順に縮合させて約10A260unitsの
合成DNAを得た。
The synthesis was carried out in the same manner as the probe (IWQ), and the nucleotide resin AP-d (T) (manufactured by Yamasa Shoyu Co., Ltd.) (DMTr) was used.
CpAp (NHR 3 ); (DMTr) GpGp (NHR 3 ); (DMTr) CpAp (NHR 3 ), (D
MTr) CpTp (NHR 3); (DMTr) CpGp (NHR 3) and (DMTr) CpCp (N
HR 3 ) equal mixture; (DMTr) ApGp (NHR 3 ), (DMTr) TpGp (NHR
3 ), (DMTr) GpGp (NHR 3 ), and (DMTr) CpGp (NHR 3 ), an equal mixture; (DMTr) ApAp (NHR 3 ); (DMTr) CpAp (NHR 3 ) and (DMTr) Cp
An equal amount mixture of Gp (NHR 3 ); (DMTr) Gp (NHR 3 ) (all manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.) was condensed in this order to obtain about 10A 260 units of synthetic DNA.

得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列をMaxam−Gilbe
rt法により調べたところ図1に示された塩基配列を有し
ていることが確認された。
The nucleotide sequence of the obtained oligonucleotide was analyzed by Maxam-Gilbe
When examined by the rt method, it was confirmed to have the base sequence shown in FIG.

(iii)プローブ(LC)の合成 アプライドバイオシステム社のDNA合成機380Aによ
り、自動合成を行った。この方法はCaruthers等の記載
した原理(J.Am.Chem.Soc, 103巻3185頁(1981))に
基づいており、ホスホアミダイト法と称されている。
(iii) Synthesis of probe (LC) Automatic synthesis was performed using a DNA synthesizer 380A manufactured by Applied Biosystems. This method is based on the principle described by Caruthers et al. (J. Am. Chem. Soc, 103 : 3185 (1981)) and is called the phosphoamidite method.

5′のジメトキシトリチル基(DMTr)を脱保護した
dG−S(Sは支持体)にテトラゾールで予め活性化し
た(DMTr)−dTのホスホアミダイト体を縮合させ
た後、未反応の水酸基をアセチル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体に導いた。DMTr基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して図1に示される
如き配列の24個のヌクレオチドを合成した。得られたヌ
クレオチドを支持体から開裂せしめ脱保護した後、C18
カラム(センシュー科学社製SSC−ODS−272)を
用いた逆相系高速液体クロマトグラフィーにて精製し
た。
After the 5'-dimethoxytrityl group (DMTr) was deprotected, dG-S (S is a support) was condensed with the (DMTr) -dT phosphoamidite body previously activated with tetrazole, and then the unreacted hydroxyl group was replaced with acetyl. Then, it was oxidized with iodine in the presence of water to give a phosphate. The DMTr group was deprotected, and then the condensation was repeated in the same manner to synthesize 24 nucleotides having the sequence shown in FIG. The resulting nucleotide is cleaved from the support and deprotected, then C18
It was purified by reverse phase high performance liquid chromatography using a column (SSC-ODS-272 manufactured by Senshu Scientific Co., Ltd.).

実施例5 CHU−2細胞の培養とmRNAの精製 1) CHU−2細胞の培養と細胞の回収 樹立されたCHU−2細胞を150cm2の培養フラスコ2本
に完全に密に増殖さた後、これをウシ胎児血清を10%含
有するRPMI1640培養液500mlに浮遊させたのち、158
0cm2のガラス製ローラーボトル(Belco社製)に移
し、0.5r.p.m.の速度で4日間回転培養を行った。細胞
がローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で、
ローラーボトルから培養液を除き、あらかじめ37℃に加
温したEDTAを0.02%含む生理食塩水100mlを加え、3
7℃で2分間加温後、ピペット操作にて細胞をはく離せ
しめた。得られた細胞懸濁液を1500r.p.m.10分間の遠心
にて細胞ペレットを得る。細胞をEDTAを含まない生
理食塩水5mlに再び懸濁し、1500r.p.m.10分間遠心にて
細胞ペレットを得た(湿重量約0.8g)、このようにし
て得られた細胞はRNA抽出操作を行うまで−80℃にて
凍結保存する。
Example 5 CHU-2 Cell Culture and mRNA Purification 1) CHU-2 Cell Culture and Cell Recovery After the established CHU-2 cells were completely and densely grown in two 150 cm 2 culture flasks, This was suspended in 500 ml of RPMI1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum, and then 158
It was transferred to a 0 cm 2 glass roller bottle (manufactured by Belco) and subjected to rotary culture at a speed of 0.5 rpm for 4 days. When the cells have grown to the inner wall of the roller bottle completely densely,
Remove the culture solution from the roller bottle and add 100 ml of physiological saline containing 0.02% of EDTA preheated to 37 ° C.
After heating at 7 ° C for 2 minutes, the cells were separated by pipetting. The obtained cell suspension is centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain a cell pellet. The cells were resuspended in 5 ml of physiological saline containing no EDTA and centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain a cell pellet (wet weight: about 0.8 g). The cells thus obtained were subjected to RNA extraction operation. Store frozen at -80 ℃.

2)mRNAの精製 上記の如くして得られたCHU−2細胞からのmRAN
の単離は本質的に“Molecular cloning”[Maniatis
等,Cold Spring Harbor,196頁(1982)]に記載されて
いるようにして実施した。凍結保存されていたCHU−
2細胞(湿重量3.8g)に20mlの6Mグアニジン溶液
(6Mグアニジンチオシアナート,5mMクエン酸ナト
リウム(pH7.0),0.1M β−メルカプトエタノール,
0.5%ザルコシル硫酸ナトリウム)に懸濁し、Vortexミ
キサーにて2〜3分よく混合した後、18Gの注射針を装
てんした20ml容の注射器を用いて10回吸入排出を繰り返
した。ベックマン社製SW40Tiローターに合うポリア
ロマー製の遠心チューブに6mlの5.7M CsCl−0.1
M EDTA,(pH7.5)を先に加えておき、チューブ
が満たされるように上述の細胞が壊れて粘稠になったグ
アニジン溶液約6mlを重層した。このようにして調製さ
れた遠心チューブ4本を30,000r.p.m.、20℃で15時間遠
心した後、得られたペレットを少量の70%エタノールを
用いて3回洗浄した。
2) Purification of mRNA mRAN from CHU-2 cells obtained as described above
Isolation is essentially “Molecular cloning” [Maniatis
Et al., Cold Spring Harbor, p. 196 (1982)]. CHU- that was stored frozen
20 ml of 6M guanidine solution (6M guanidine thiocyanate, 5 mM sodium citrate (pH 7.0), 0.1 M β-mercaptoethanol, was added to 2 cells (wet weight 3.8 g).
The mixture was suspended in 0.5% sodium sarcosyl sulfate), mixed well with a Vortex mixer for 2 to 3 minutes, and inhaled and discharged 10 times using a 20 ml syringe equipped with an 18G injection needle. Add 6 ml of 5.7M CsCl-0.1 to a polyallomer centrifuge tube that fits the Beckman SW40Ti rotor.
M EDTA, (pH 7.5) was added in advance, and about 6 ml of a guanidine solution in which the above-mentioned cells were broken and became viscous so as to fill the tube was overlaid. Four centrifuge tubes thus prepared were centrifuged at 30,000 rpm at 20 ° C. for 15 hours, and the resulting pellet was washed 3 times with a small amount of 70% ethanol.

各々のチューブから得られたペレットを合して550μl
の水に溶解せしめNaCl濃度が0.2Mとなるように調
整したのち、フェノールクロロホルム(1:1)処理、
クロロホルム処理後、2.5倍容量のエタノールを加えて
エタノール沈澱を行い全RNAを得た(湿細胞3.8gよ
り全RNA約10.1mgを得た)。
Combine the pellets from each tube with 550 μl
Dissolved in water and adjusted to a NaCl concentration of 0.2 M, then treated with phenol-chloroform (1: 1),
After the chloroform treatment, 2.5 times volume of ethanol was added and ethanol precipitation was performed to obtain total RNA (about 10.1 mg of total RNA was obtained from 3.8 g of wet cells).

全RNAからポリ(A)−RNAの精製は以下の如く
行った。この方法はmRNAが3′末端にポリA鎖を付
加していることを利用したアフィニティークロマトグラ
フィーである。オリゴ(dT)−セルロース(P−L
Biochemicals社製Type7)を用い、吸着は全RNAを吸
着緩衝液(10mMトリス−塩酸(pH7.5),0.5M Na
Cl,1mM EDTA,0.1%SDS溶液を含む)に
溶解し、65℃で5分間加熱した後、同溶液にて充てんさ
れたオリゴ(dT)−セルロースカラムに通過させて行
い、溶出はTE溶液(10mMトリス−塩酸(pH7.5)、
1mM EDTAを含む)で行った。未吸着通過液は再
び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、1回目の溶
出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
(A)−RNA400μgを得た。
Purification of poly (A + ) -RNA from total RNA was performed as follows. This method is affinity chromatography which utilizes the fact that mRNA has a poly A chain added to the 3'end. Oligo (dT) -cellulose (PL
Using Biochemicals Type 7), for adsorption, total RNA was adsorbed with an adsorption buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M Na).
Cl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS solution is included), heated at 65 ° C. for 5 minutes, passed through an oligo (dT) -cellulose column filled with the same solution, and eluted with TE solution ( 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5),
1 mM EDTA was included). The unadsorbed flow-through solution was passed through the same column again to carry out the same elution operation, and mixed with the first eluate. Using such an operation, 400 μg of poly (A + ) -RNA was obtained.

このようにして調製したmRNAをSchleifとWensinkの
実験技術書(Practical Methods in Molecular Biolog
y,Springer-Verlag,New York,Heiderberg,Berlin,(198
1))中に記載されている方法と同様の操作で、ショ糖密
度勾配遠心法によりサイズ分画した。
The mRNA prepared in this manner was used in Schleif and Wensink's Practical Methods in Molecular Biolog.
y, Springer-Verlag, New York, Heiderberg, Berlin, (198
Size fractionation was performed by the sucrose density gradient centrifugation method by the same operation as the method described in 1)).

すなわち、SW40Tiローター(Beckman社製)用チュ
ーブに5%〜25%のショ糖密度勾配を作る。ショ糖溶液
は0.1M NaCl,10mMトリス−塩酸(pH7.5),1
mM EDTA,0.5%SDSの溶液にそれぞれ5%、2
5%の割合いでRNaseフリーのショ糖(Schwarz/Ma
nn社製)を含んでいる。
That is, a sucrose density gradient of 5% to 25% is created in a SW40Ti rotor (Beckman) tube. The sucrose solution is 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1
5% and 2% in solutions of mM EDTA and 0.5% SDS, respectively.
5% RNase-free sucrose (Schwarz / Ma
nn).

上記で述べた如き方法で調製したmRNA(ポリ
(A)−RNA)800μgを200μl〜500μlのTE
溶液に溶解せしめ、65℃で5分間加熱後急冷した後、シ
ョ糖密度勾配液の上にのせる。30000r.p.m.にて20時間
遠心後0.5mlずつの分画を集め260nmの吸光度を測り、同
様に行った標準RNA(28S,18S,5Sのリボソーム
RNA)の位置に基づいて、分画されたRNAのサイズ
を決めると同時に各分画のG−CSF活性をアフリカツ
メガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞系を用いて調べ
た。すなわち各分画のmRNAを1μg/μlの濃度の
水溶液に調製し、ツメガエル(生後約1年)から取り出
した卵母細胞1個に50ngのmRNAの割合いで注入した
後、96穴のマイクロタイタープレートの1穴に卵母細胞
を10個ずつ入れ、それぞれ100μlのバース培地(88 mM
NaCl,1mMKCl,2.4mM NaHCO,0.82mM
MgSO,0.33mM Ca(NO,0.41mM C
aCl,7.5mMトリス−塩酸(pH7.6),ペニシリン10
mg/l,ストレプトマイシン硫酸10mg/)中で48時間
室温で培養した後上清を回収し、濃縮・精製してG−C
SF活性を測定する。
800 μg of mRNA (poly (A + ) -RNA) prepared by the method as described above was added to 200 μl to 500 μl of TE.
It is dissolved in a solution, heated at 65 ° C. for 5 minutes and then rapidly cooled, and then placed on a sucrose density gradient solution. After centrifuging at 30,000 rpm for 20 hours, 0.5 ml fractions were collected, the absorbance at 260 nm was measured, and the fractionated RNA was determined based on the position of the standard RNA (28S, 18S, 5S ribosomal RNA) which was similarly measured. , And the G-CSF activity of each fraction was examined at the same time by using an oocyte system of Xenopus laevis. That is, mRNA of each fraction was prepared in an aqueous solution at a concentration of 1 μg / μl, and 50 ng of mRNA was injected into one oocyte taken out from Xenopus laevis (about 1 year old), followed by 96-well microtiter plate. Put 10 oocytes in each well and add 100 μl of Barth's medium (88 mM
NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO 3 , 0.82 mM
MgSO 4 , 0.33 mM Ca (NO 3 ) 2 , 0.41 mM C
aCl 2 , 7.5 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6), penicillin 10
mg / l, streptomycin sulphate 10 mg /) for 48 hours at room temperature, then collect the supernatant, concentrate and purify to G-C.
SF activity is measured.

この結果、15〜17S画分にG−CSF活性が認められ
た。
As a result, G-CSF activity was observed in the 15-17S fraction.

実施例6 cDNAの合成(pBR系cDNAライブラ
リーの構築) 前述の方法で得られたポリ(A)−RNAからLan
d等の方法[Nucleic Acids Res.,9巻2251頁1981)]に
基づき、GublerとHoffmanの方法[Gene,25巻263頁
(1983)]を加味してcDNAを合成した。
Example 6 Synthesis of cDNA (Construction of pBR cDNA Library) Lan from poly (A + ) -RNA obtained by the above-mentioned method.
Based on the method of D et al. [Nucleic Acids Res., 9: 2251, 1981)], the method of Gubler and Hoffman [Gene, 25: 263.
(1983)] was added to synthesize cDNA.

1)1本鎖cDNAの合成 エッペンドルフ社製1.5ml容チューブに以下の如くの順
序で試薬を入れる。80μlの反応緩衝液(500mM K
Cl,50mM MgCl,250Mmトリス−塩酸,pH8.
3),20μlの200mMジチオスレイトール,32μlの12.5
mM dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTT
Pを各々12.5mM含む),10μlのα−32P−dCT
P(アマシャム製,PB10205),32μlのオリゴ(d
T)12−18(P−L Biochemicals社製),500μ
g/ml),20μlのポリ(A)−RNA(2.1μg/
μ),蒸溜水206μの計400μlの反応液を65℃で5
分間加熱後、42℃で5分間加温する。この反応液に逆転
写酵素(宝酒造製)120単位を加え、さらに42℃、2時
間反応させた後、RNaseインヒビター(Bethesda Re
search Laboratories社製)2μl、20μlのTE溶
液、16μlの100mMピロリン酸ナトリウム、48単位
(4μl)の逆転写酵素を追加して、今度は46℃2時間
反応せしめた。0.5M EDTA 8μl,10%SDS
8μlを加えて反応を停止させた後、フェノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱(2回)を行い一本鎖
cDNAを得た。
1) Synthesis of single-stranded cDNA Put reagents into a 1.5 ml tube manufactured by Eppendorf Co. in the following order. 80 μl of reaction buffer (500 mM K
Cl, 50 mM MgCl 2 , 250 Mm Tris-HCl, pH 8.
3), 20 μl of 200 mM dithiothreitol, 32 μl of 12.5
mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTT
P containing 12.5 mM), 10 μl of α- 32 P-dCT
P (Amersham, PB10205), 32 μl oligo (d
T) 12-18 (manufactured by PL Biochemicals), 500 μ
g / ml), 20 μl of poly (A + ) -RNA (2.1 μg /
μ), distilled water 206μ, total 400μl of reaction solution at 65 ℃
After heating for 1 minute, heat at 42 ° C for 5 minutes. To this reaction solution, 120 units of reverse transcriptase (Takara Shuzo) was added and further reacted at 42 ° C for 2 hours, and then RNase inhibitor (Bethesda Re
(manufactured by Search Laboratories) 2 μl, 20 μl TE solution, 16 μl 100 mM sodium pyrophosphate, 48 units (4 μl) of reverse transcriptase were added, and reacted at 46 ° C. for 2 hours this time. 0.5M EDTA 8μl, 10% SDS
After adding 8 μl to stop the reaction, phenol-chloroform treatment and ethanol precipitation (twice) were performed to obtain single-stranded cDNA.

2)1本鎖cDNAへのdc−鎖付加 上記で得られた一本鎖cDNAを60μlの蒸溜水に溶解
後、60μlのdC−鎖付加緩衝液(400mMカコジル酸
カリウム;50mMトリス−塩酸(pH6.9);4mMジチ
オスレイトール;1mMCOCl;1mM dCT
P)に加え、37℃で5分間加温した。この反応液にター
ミナルトランスフェラーゼ(27unit/μl、P-L Bioche
micals社製)3μlを加えて37℃で2.5分間反応した
後、フェノール−クロロホルム処理(1回)、および、
エタノール沈澱(2回)を行い、100mM NaClを
含むTE溶液40μlに溶解せしめた。
2) Addition of dc-chain to single-stranded cDNA After dissolving the single-stranded cDNA obtained above in 60 μl of distilled water, 60 μl of dC-chain addition buffer (400 mM potassium cacodylate; 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 6 .9); 4 mM dithiothreitol; 1 mM COCl 2 ; 1 mM dCT
P) and heated at 37 ° C. for 5 minutes. Add terminal transferase (27 unit / μl, PL Bioche
(manufactured by micals) was added and reacted at 37 ° C. for 2.5 minutes, followed by phenol-chloroform treatment (once), and
Ethanol precipitation (twice) was performed, and it was dissolved in 40 μl of a TE solution containing 100 mM NaCl.

3)2本鎖cDNAの合成 上記40μlのDNA溶液に4μlのオリゴ(dG)
12−18(200μg/ml,P-L Biochemicals社製)を
加え65℃5分間、続いて42℃で30分間加温した後、反応
液を0℃に保った。この反応液に緩衝液80μl(100m
Mトリス−塩酸、pH7.5,20mM MgCl,50mM
(NHSO,500mM KCl),4μlの4
mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dT
TPを各々4mMを含む)、60μlの1mM β−NA
D及び210μlの蒸溜水、20μlのE.coli DN
AポリメラーゼI(宝酒造社製)、15μlのE.col
i DNAリガーゼ(宝酒造社製)、15μlのE.co
li RNase H(宝酒造社製)を加え12℃にて1
時間反応させた後、さらに4μlの4mMdNTPを追
加し、25℃で1時間反応して、フェノール−クロロホル
ム処理、エタノール沈澱(1回)を行って、約8μgの
2本鎖cDNAを得た。この2本鎖cDNAをTE溶液
に溶解せしめ、1.2%アガロースゲル電気泳動を行い、
約560塩基対(bp)〜2キロ塩基対(Kbp)の大き
さに相当する部分をワットマンDE81(ワットマン社
製)に吸着させ溶出回収したところ、約0.2μgが回収
された。
3) Synthesis of double-stranded cDNA 4 μl of oligo (dG) was added to 40 μl of the above DNA solution.
12-18 (200 μg / ml, manufactured by PL Biochemicals) was added and heated at 65 ° C. for 5 minutes and then at 42 ° C. for 30 minutes, and then the reaction solution was kept at 0 ° C. 80 μl of buffer solution (100 m
M Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM MgCl 2 , 50 mM
(NH 4 ) 2 SO 4 , 500 mM KCl), 4 μl of 4
mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dT
Each containing 4 mM TP), 60 μl of 1 mM β-NA
D and 210 μl of distilled water, 20 μl of E. coli DN
A polymerase I (Takara Shuzo), 15 μl of E. col
i DNA ligase (Takara Shuzo), 15 μl of E. co
Add li RNase H (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to 1 at 12 ° C
After reacting for 4 hours, 4 μl of 4 mM dNTP was further added, reacted at 25 ° C. for 1 hour, treated with phenol-chloroform and precipitated with ethanol (once) to obtain about 8 μg of double-stranded cDNA. This double-stranded cDNA is dissolved in TE solution and subjected to 1.2% agarose gel electrophoresis,
When a portion corresponding to the size of about 560 base pairs (bp) to 2 kilo base pairs (Kbp) was adsorbed on Whatman DE81 (manufactured by Whatman) and eluted and recovered, about 0.2 μg was recovered.

4)2本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記の如く得られた2本鎖cDNAを40μlのTE溶液
に溶解し、2)の項で述べたdC−鎖付加緩衝液8μlを
加え37℃で2分間加温した後、1μlのターミナルトラ
ンスフェラーゼ(27unit/μl)を加えて37℃で3分間
反応せしめた。反応液を直ちに0℃に冷却し0.5M E
DTA1μlを加えて反応を停止した後、フェノール−
クロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、得られた沈
澱をTE溶液10μlに懸濁した。
4) Addition of dC-chain to double-stranded cDNA The double-stranded cDNA obtained as described above was dissolved in 40 μl of TE solution, and 8 μl of the dC-chain addition buffer described in 2) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. After heating for 2 minutes, 1 μl of terminal transferase (27 unit / μl) was added and reacted at 37 ° C. for 3 minutes. The reaction solution was immediately cooled to 0 ° C. and 0.5 M E
After stopping the reaction by adding 1 μl of DTA, phenol-
Chloroform treatment and ethanol precipitation were performed, and the obtained precipitate was suspended in 10 μl of TE solution.

5)pBR系cDNAライブラリーの構築 市販のオリゴ(dG)鎖付加pBR322ベクター(ベセ
スダリサーチラボトリーズ社製、10ng/μl)4μlと
上記dC−鎖付加2本鎖cDNA2μlを75μlの0.1
M NaClを含むTE溶液の中でアニールさせた。ア
ニールは65℃、5分加温した後40℃にて2時間加温、そ
の後、室温になるまで放置して行った。
5) Construction of pBR cDNA library 4 μl of commercially available oligo (dG) chain-added pBR322 vector (manufactured by Bethesda Research Laboratories, 10 ng / μl) and 2 μl of the above dC-chain-added double-stranded cDNA were added to 0.1 μl of 75 μl.
Annealed in TE solution with M NaCl. Annealing was performed by heating at 65 ° C. for 5 minutes, then at 40 ° C. for 2 hours, and then leaving it to reach room temperature.

一方、Maniatisらの実験書[Molecular cloning,Cold S
pring Harbor, 249頁(1982)]に記載されている方法等
を用いて大腸菌X1776株からコンピテント細胞を調製
し、上記アニールされたプラスミドにより形質転換を行
い、トランスフォーマント(形質転換体)が得られた。
On the other hand, Maniatis et al. [Molecular cloning, Cold S
pring Harbor, p. 249 (1982)] and the like to prepare competent cells from Escherichia coli X1776 strain, and transform with the above annealed plasmid to obtain a transformant (transformant). Was given.

実施例7 cDNA合成(λファージ系ライブラリーの
構築) 1)1本鎖cDNAの合成 実施例5で述べた方法に従って3.8gの凍結保存CHU
−2細胞から2回オリゴ(dT)セルロースカラムによ
る精製を経て400μgのポリ(A)−RNAを得た。
Example 7 cDNA synthesis (construction of λ phage-based library) 1) Synthesis of single-stranded cDNA According to the method described in Example 5, 3.8 g of cryopreserved CHU was stored.
-2 cells were purified twice with an oligo (dT) cellulose column to obtain 400 μg of poly (A + ) -RNA.

このポリ(A)−RNA12μgを溶解したTE溶液10
μlを10μgのアクチノマイシンD(シグマ社製)を含
む反応チューブに入れた後、以下の順序で試薬類を加え
た;20μlの逆転写緩衝液(250mMトリス−塩酸(pH
8.3),40mM MgCl,250mM KCl),20μ
lの5mM dNTP(dATP,dGTP,dCT
P,dTTPを各々5mM含む)、20μlのオリゴ(d
T)12−18(0.2μg/ml P-L Biochemicals社
製),1μlの1Mジチオスレイトール,2μlの30 u
nit/μlのRNasin(プロメガバイオテク社),1
0μlの逆転写酵素(10unit/μl生化学工業社製),
1μlのα−[32p]dATP(10μCiアマシャム社
製),16μlの水で計100μlの液量の反応液になる。
反応液を42℃で2時間保った後、5μlの0.5m ED
TA及び1μlの20%SDSを加えて反応を停止した。
フェノール−クロロホルム(100μl)処理、エタノー
ル沈澱(2回)を行って約4μgの1本鎖cDNAを得
た。
TE solution 10 in which 12 μg of this poly (A + ) RNA was dissolved
After placing μl in a reaction tube containing 10 μg of actinomycin D (manufactured by Sigma), reagents were added in the following order: 20 μl of reverse transcription buffer (250 mM Tris-HCl (pH
8.3), 40 mM MgCl 2 , 250 mM KCl), 20μ
l 5 mM dNTP (dATP, dGTP, dCT
P and dTTP each contained 5 mM), 20 μl oligo (d
T) 12-18 (0.2 μg / ml PL Biochemicals), 1 μl of 1M dithiothreitol, 2 μl of 30 u
nit / μl RNasin (Promega Biotech), 1
0 μl of reverse transcriptase (10 unit / μl made by Seikagaku Corporation),
1 μl of α- [ 32 p] dATP (10 μCi manufactured by Amersham) and 16 μl of water make a total reaction volume of 100 μl.
After keeping the reaction solution at 42 ℃ for 2 hours, 5 μl of 0.5m ED
The reaction was stopped by adding TA and 1 μl of 20% SDS.
Phenol-chloroform (100 μl) treatment and ethanol precipitation (twice) were performed to obtain about 4 μg of single-stranded cDNA.

2)2本鎖cDNAの合成 上記の如く得られたcDNAを29μlのTE溶液に溶解
し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした;25μlの
ポリメラーゼ緩衝液(400mM Hepes(pH7.6;16
mM MgCl;63mMのβ−メルカプトエタノール;
270mM KCl);10μlの5mM dNTP;1.0μl
の15mM β−NAD;1.0μlのα−[32p]dA
TP(10μCi/μl);0.2μlE.coliDNA
リガーゼ(60unit/μl宝酒造社製);5.0μlのE.
coli DNAポリメラーゼI(New England Biolabs
社,10 unit/μl);0.1μlのRNase H(60un
it/μl宝酒造社製);28.7μlの蒸溜水。
2) Synthesis of double-stranded cDNA The cDNA obtained as described above was dissolved in 29 μl of TE solution and reagents were added in the following order to prepare a reaction solution; 25 μl of polymerase buffer (400 mM Hepes (pH 7.6; 16
mM MgCl 2 ; 63 mM β-mercaptoethanol;
270 mM KCl); 10 μl of 5 mM dNTPs; 1.0 μl
15 mM β-NAD; 1.0 μl of α- [ 32 p] dA
TP (10 μCi / μl); 0.2 μlE. coli DNA
Ligase (60 unit / μl manufactured by Takara Shuzo); 5.0 μl of E.
coli DNA polymerase I (New England Biolabs
Company, 10 unit / μl); 0.1 μl of RNase H (60un
it / μl Takara Shuzo); 28.7 μl of distilled water.

反応液を14℃で1時間インキュベートした後、室温にも
どして、さらに1時間インキューベートした。次いで5
μlの0.5M EDTAと1μlの20%SDSを加えて
反応を停止させ、フェノール−クロロホルム処理、エタ
ノール沈澱を行った。得られたDNAを0.5mM EDT
A20μlに溶解せしめ、3μlのKlenow緩衝液
(500mMトリス−塩酸(pH8.0),50mM MgC
),3μlの5mM dNTP,及び水4μlを加
えて反応液を調製した後、1μlのDNAポリメラーゼ
(KlenoW断片)(宝酒造社製)を加えて30℃15分
インキュベートした。
The reaction solution was incubated at 14 ° C. for 1 hour, then returned to room temperature and further incubated for 1 hour. Then 5
The reaction was stopped by adding μl of 0.5 M EDTA and 1 μl of 20% SDS, followed by phenol-chloroform treatment and ethanol precipitation. The obtained DNA is treated with 0.5 mM EDT
A solution was dissolved in 20 μl and 3 μl of Klenow buffer (500 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM MgC)
1 2 ), 3 μl of 5 mM dNTP, and 4 μl of water to prepare a reaction solution, and then 1 μl of DNA polymerase (KlenoW fragment) (Takara Shuzo) was added and incubated at 30 ° C. for 15 minutes.

この反応液に70μlのTE溶液を加えて希釈し、さらに
5μlの0.5M EDTA,1μlの20%SDSを加え
て反応を停止した。反応液をフェノール−クロロホルム
処理し、エタノール沈澱を行って約8μgの2本鎖cD
NAを得た。
70 μl of TE solution was added to the reaction solution to dilute it, and 5 μl of 0.5 M EDTA and 1 μl of 20% SDS were added to stop the reaction. The reaction solution was treated with phenol-chloroform and precipitated with ethanol to give about 8 μg of double-stranded cD.
I got NA.

3)2本鎖cDNAのメチル化 2)の項で合成した2本鎖cDNAの水溶液30μl、メチ
ル化緩衝液(500mMトリス−塩酸(pH8.0),50mM
EDTA)40μl,SAM溶液(800μM S−アデノ
シル−L−メチルメチオニン(SAM),50mM β−
メルカプトエタノール)20μl,水100μlを加えた混
合液にEcoRIメチラーゼ(New England Biolabs
社,20unit/μl)15μlを加えて全反応液を200μl
とし、37℃2時間インキュベートした。フェノール処
理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱を行って
DNAを回収した。
3) Methylation of double-stranded cDNA 30 μl of aqueous solution of double-stranded cDNA synthesized in 2), methylation buffer (500 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM)
EDTA) 40 μl, SAM solution (800 μM S-adenosyl-L-methylmethionine (SAM), 50 mM β-
20 μl of mercaptoethanol) and 100 μl of water were added to a mixed solution of EcoRI methylase (New England Biolabs
Co., Ltd., 20unit / μl) Add 15μl and add 200μl
And incubated at 37 ° C. for 2 hours. After phenol treatment and ether treatment, ethanol precipitation was performed to collect DNA.

4)EcoRIリンカーの付加 上記メチル化された2本鎖DNA約1.2μgにリガーゼ
緩衝液(250mMトリス−塩酸 (pH7.5),100mM
MgCl)1.5μl,あらかじめリン酸化されたEc
oRIリンカー0.5μl(10mer,宝酒造社製),1.5μ
lの10mMATP,100mMジチオスレイトール1.5μ
l,2μlのHOを加え、反応液を15μlとしてT4
DNAリガーゼ(3.4u/μl,宝酒造社製)0.7μlを
加えて4℃で一晩反応させた後、65℃にて10分間加熱し
リガーゼを失活させた。この反応液をさらに100mMト
リス−塩酸(pH7.5),5mM MgCl,50mM
NaCl,100μg/mlのゼラチンの濃度で全液量が50
μlになるように調製した後、EcoRI(10unit/μ
l)3.5μlを加え、37℃、2時間反応させた。次いで
0.5MのEDTA2.5μl、20%SDS0.5μlを加えた
後フェノールークロロホルム処理を行いエタノール沈澱
によりDNAを回収した。この後Ultrogel AcA34(LK
B社製)のゲル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動
法にて未反応のEcoRIリンカーを除去し、リンカー
付加2本鎖cDNA約0.5〜0.7μgを回収した。
4) Addition of EcoRI linker About 1.2 μg of the above-mentioned methylated double-stranded DNA was ligase buffer (250 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM)
MgCl 2 ) 1.5 μl, prephosphorylated Ec
oRI linker 0.5 μl (10mer, Takara Shuzo), 1.5 μl
l 10 mM ATP, 100 mM dithiothreitol 1.5μ
1, 2 μl of H 2 O was added to make the reaction mixture 15 μl, and then T4
After adding 0.7 μl of DNA ligase (3.4 u / μl, manufactured by Takara Shuzo) and reacting overnight at 4 ° C., the ligase was inactivated by heating at 65 ° C. for 10 minutes. This reaction solution was further added with 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 50 mM.
NaCl, 100 μg / ml gelatin concentration, the total liquid volume is 50
After making up to μl, EcoRI (10 unit / μ
l) 3.5 μl was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 2 hours. Then
After adding 2.5 μl of 0.5 M EDTA and 0.5 μl of 20% SDS, phenol-chloroform treatment was performed and ethanol precipitation was performed to recover DNA. After this Ultrogel AcA34 (LK
Unreacted EcoRI linker was removed by gel filtration method (manufactured by Company B) or agarose gel electrophoresis method, and about 0.5 to 0.7 μg of double-stranded cDNA with linker was recovered.

5)2本鎖cDNAとλgt10ベクターの結合 上記のリンカー付加2本鎖cDNAを、2.4μgの予じ
めEcoRI処理したλgt10ベクター(ベクタークロ
ーニングシステム社),リガーゼ緩衝液(250mMトリ
ス塩酸,100mM MgCl)1.4μl,蒸溜水6.5μ
lを加えて、42℃、15分間処理した後、10mM ATP
1μl,0.1Mジチオスレイトール1μl,TDNA
リガーゼ0.5μlを加え全量を15μlとした後、12℃で
一晩反応させた。
5) Ligation of double-stranded cDNA and λgt10 vector The above-mentioned linker-added double-stranded cDNA was 2.4 μg of EcoRI-treated λgt10 vector (Vector Cloning System), ligase buffer (250 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2 ) 1.4 μl, distilled water 6.5 μl
l, and treated at 42 ° C for 15 minutes, then 10 mM ATP
1 μl, 0.1 M dithiothreitol 1 μl, T 4 DNA
After adding 0.5 μl of ligase to make the total amount 15 μl, the mixture was reacted at 12 ° C. overnight.

6)インビトロパッケージング 上記5)で得られた組換え体DNAの約1/3をインビトロ
パッケージングキット(プロメガ バイオテク社)を用
いてパッケージングし、ファージプラークを得た。
6) In vitro packaging About 1/3 of the recombinant DNA obtained in 5) above was packaged using an in vitro packaging kit (Promega Biotech) to obtain phage plaques.

実施例8 プローブ(IWQ)によりpBR系ライブラ
リーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン541濾紙を
のせ37℃で2時間放置した。以下、TaubとThompsonの方
法[Anal.Biochem. 126巻222頁(1982)]に準じて濾紙を
処理した。
Example 8 Screening of pBR system library by probe (IWQ) Whatman 541 filter paper was put on an agar medium on which colonies were grown, and left at 37 ° C. for 2 hours. Hereinafter, the filter paper was treated according to the method of Taub and Thompson [Anal. Biochem. 126 : 222 (1982)].

すなわち、541濾紙にコロニーを移した後、クロラムフ
ェニコール(250μg/μl)を含んだ寒天培地に移
し、さらに37℃で一晩放置した。
That is, the colonies were transferred to 541 filter paper, transferred to an agar medium containing chloramphenicol (250 μg / μl), and further left at 37 ° C. overnight.

541濾紙を取り出した後、室温下で0.5N NaOH
溶液を浸した濾紙上に3分間放置し、これを2回くり返
した。以下同様な操作を0.5Mトリス−塩酸(pH8)溶
液を用いて3分間、2回行ない、更に4℃下に0.05Mト
リス−塩酸(pH8)溶液で3分、1.5mg/mlのリゾチー
ム液(0.05Mトリス−塩酸(pH8),25%ショ糖を含
む)で10分間、次いで37℃下に1×SSC(0.15)MN
aCl及び0.15Mクエン酸ナトリウム)溶液で2分間、
200μg/mlプロテアーゼKを含む1×SSC溶液で30
分、再び室温下に1×SSC溶液で2分間、95%エタノ
ール溶液で2分間、2回行った後、541濾紙を乾燥させ
た。得られた乾燥541濾紙を室温下にフェノール:クロ
ロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1,100m
Mトリス−塩酸(pH8.5),100mM NaCl,10mM
EDTAで平衡化したもの)溶液に30分間浸した。以
下同様の操作を5×SSC溶液で3分間、3回、次いで
95%エタノール溶液で3分間、2回行った後、濾紙を乾
燥させた。
After removing the 541 filter paper, use 0.5N NaOH at room temperature.
The solution was left on the filter paper soaked for 3 minutes, and this was repeated twice. The same procedure is repeated twice for 3 minutes using a 0.5 M Tris-hydrochloric acid (pH 8) solution, and further for 3 minutes with a 0.05 M Tris-hydrochloric acid (pH 8) solution at 4 ° C. for 1.5 mg / ml of lysozyme solution ( 0.05M Tris-hydrochloric acid (pH 8), containing 25% sucrose) for 10 minutes, then at 37 ° C., 1 × SSC (0.15) MN
aCl and 0.15M sodium citrate) solution for 2 minutes,
30 in 1 × SSC solution containing 200 μg / ml Protease K
Then, the mixture was again treated with a 1 × SSC solution for 2 minutes and a 95% ethanol solution for 2 minutes twice at room temperature, and then the 541 filter paper was dried. The dried 541 filter paper obtained was allowed to stand at room temperature with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1,100 m).
M Tris-hydrochloric acid (pH8.5), 100 mM NaCl, 10 mM
Soaked in EDTA solution) for 30 minutes. The same operation is repeated with a 5 × SSC solution for 3 minutes 3 times, and then
After performing the treatment twice with a 95% ethanol solution for 3 minutes, the filter paper was dried.

プローブ(IWQ)を常法(Molecular cloningを参
照)に従って32Pを用いて放射標識した後、Wallace
等の方法(Nucleic Acids Res.9巻879頁(1981))に従
ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。6×N
ET[0.9M NaCl0.09Mトリス−塩酸(pH7.5),
6mM EDTA],5×Denhardt溶液,0.1%SD
S,0.1mg/ml変性DNA(仔牛胸腺DNA)を含むハ
イブリダイゼーション緩衝液中で65℃、4時間、プレハ
イブリダイゼーションを行った後、放射標識化したプロ
ーブ(IWQ)1×10cpm/mlを含む前記ハイブリダ
イゼーション緩衝液を用いて56℃で一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。反応終了後541濾紙を室温下に0.1%
SDSを含む6×SSC溶液で30分、2回おび56℃、1.
5分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行った。
The probe (IWQ) was radiolabeled with 32 P according to the standard method (see Molecular cloning) and then Wallace
Colony hybridization was performed according to the method described above (Nucleic Acids Res. 9: 879 (1981)). 6 x N
ET [0.9M NaCl 0.09M Tris-hydrochloric acid (pH 7.5),
6 mM EDTA], 5 x Denhardt's solution, 0.1% SD
Pre-hybridization was performed in a hybridization buffer containing S, 0.1 mg / ml denatured DNA (calf thymus DNA) at 65 ° C. for 4 hours, and then radiolabeled probe (IWQ) 1 × 10 6 cpm / ml Hybridization was carried out at 56 ° C. overnight using the above-mentioned hybridization buffer containing After completion of the reaction, use 541 filter paper at room temperature for 0.1%
30 minutes twice with 6 × SSC solution containing SDS and 56 ° C., 1.
After washing for 5 minutes, autoradiography was performed.

シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ(IWQ)を用いてサザンプロッティングを行
った。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラ
フィーは前述と同一の条件で行なった。
After separating the plasmid from the clone that gave a signal,
Southern blotting was performed using a probe (IWQ). Hybridization and autoradiography were performed under the same conditions as described above.

同様にプローブ(A)を用いてサザンブロッティングを
行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダイ
ゼーション緩衝液を用い、49℃で1時間行い、39℃まで
除冷後さらに39℃で1時間行なった。反応終了後、ニト
ロセルロースフィルターを0.1%SDSを含む6×SS
Cで室温下に30分で2回洗滌し、次いで39℃で3分間洗
滌した後、オートラジオグラフィーを行なった。
Similarly, Southern blotting was performed using the probe (A). Hybridization was carried out at 49 ° C. for 1 hour using the above-mentioned hybridization buffer, after cooling to 39 ° C., and further at 39 ° C. for 1 hour. After the reaction was completed, use a nitrocellulose filter with 6xSS containing 0.1% SDS.
After washing twice at room temperature for 30 minutes at C and then at 39 ° C. for 3 minutes, autoradiography was performed.

この結果、1個のクローンがポジティブなものとして得
られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ図
2に示した如く、ブローブ(IWQ)及びプローブ
(A)部分を含む308塩基対よりなるDNAであること
が判明し、このインサートを含むpBR322由来プラス
ミドをpHCS−1と命名した。
As a result, one clone was obtained as a positive clone, and its nucleotide sequence was determined by the dideoxy method. As shown in FIG. 2, a DNA consisting of 308 base pairs containing the probe (IWQ) and the probe (A) portion was obtained. The pBR322-derived plasmid containing this insert was named pHCS-1.

実施例9 pHCS−1由来DNAプローブによるλフ
ァージ系ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法[Science 196巻,180頁,(197
7)]に準じてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。実施例8で得られたpHCS−1をSau3Aおよ
びEcoRIで処理して約600塩基対のDNA断片を
得、このDNA断片を常法に従いニックトランスレーシ
ョンにより放射標識した。ファージプラークの生じた寒
天培地上にニトロセルロース濾紙(S&S社)をのせて
ファージを移し、0.5M NaOHにてDNAを変性さ
せ、以下の順序で濾紙を処理した。0.1M NaOH,
1.5M NaClで20秒続いて0.5Mトリス−塩酸(pH7.
5),1.5M NaClで20秒2回,最後に120mM N
aCl,15mMクエン酸ソーダ,13mM KH
,1mM EDTA,pH7.2で20秒処理した。
Example 9 Screening of λ Phage-based Library with pHCS-1 Derived DNA Probe Method of Benton and Davis [Science 196 , 180, (197)
7)] and plaque hybridization was performed. The pHCS-1 obtained in Example 8 was treated with Sau3A and EcoRI to obtain a DNA fragment of about 600 base pairs, which was radiolabeled by nick translation according to a conventional method. Nitrocellulose filter paper (S & S) was placed on the agar medium in which the phage plaque was generated, the phage was transferred, the DNA was denatured with 0.5 M NaOH, and the filter paper was treated in the following order. 0.1M NaOH,
20 seconds with 1.5M NaCl followed by 0.5M Tris-HCl (pH 7.
5), twice with 1.5 M NaCl for 20 seconds, and finally with 120 mM N
aCl, 15 mM sodium citrate, 13 mM KH 2 P
It was treated with O 4 , 1 mM EDTA, pH 7.2 for 20 seconds.

次いで濾紙を乾燥し、80℃で2時間加熱してDNAを固
定した。5×SSC,5×Denhardt溶液,50mMリン酸
緩衝液,50%ホルムアミド,0.25mg/mlの変性DNA
(鮭静巣DNA),及び0.1%SDSを含むハイブリダ
イゼーション緩衝液中で42℃にて一晩プレハイブリダイ
ゼーションを行い、ニックトランスレーションにより放
射標識化したpHCS−1プローブ4×10cpm,/mlを
含むハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC,5×
Denhardt溶液,20mMリン酸緩衝液(pH6.0),50%ホ
ルムアミド,0.1%SDS,10%デキストラン硫酸、0.1
mg/mlの変性DNA(鮭静巣DNA)の混合液)で42℃
にて20時間ハイブリダイゼーションを行った。
The filter paper was then dried and heated at 80 ° C. for 2 hours to fix the DNA. 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 50 mM phosphate buffer, 50% formamide, 0.25 mg / ml denatured DNA
Pre-hybridization was performed overnight at 42 ° C. in a hybridization buffer containing (salmon nest DNA) and 0.1% SDS, and radiolabeled pHCS-1 probe by nick translation 4 × 10 5 cpm, / Hybridization buffer containing 5 ml (5 x SSC, 5 x
Denhardt solution, 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), 50% formamide, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate, 0.1
42 ° C with a mixed solution of denatured DNA (salmon nest DNA) of mg / ml)
Hybridization was carried out for 20 hours.

ニトロセルロース濾紙を室温下に0.1%SDSを含む2
×SSCで20分間洗滌し、次いで44℃で、0.1%SDS
を含む0.1×SSCで30分間、さらに室温下で0.1×SS
Cで10分間洗滌した後、オートラジオグラィーで検出し
た。
Nitrocellulose filter paper containing 0.1% SDS at room temperature 2
Rinse with SSC for 20 minutes, then 0.1% SDS at 44 ° C.
In 0.1 × SSC for 30 minutes, then 0.1 × SS at room temperature
After washing at C for 10 minutes, it was detected by autoradiography.

その結果、5個のポジティブなクローン(G1〜5)が
得られた。そこで、得られたクローンのうち完全長cD
NAを含むと思われるクローンのDNA塩基配列をジデ
オキシ法にて調べたところ図3(A)に示される如き塩基
配列が得られた。そこでこのcDNAをλgt10ベクタ
ーより切りだし、pBR327[Soberon等;Gene9巻287
頁(1980)]とEcoRI部位で結合させ、プラスミドと
して大量調製した。このプラスミドをpBRG4と称す
る。
As a result, 5 positive clones (G1-5) were obtained. Therefore, of the obtained clones, full-length cDNA
When the DNA base sequence of the clone suspected of containing NA was examined by the dideoxy method, the base sequence shown in FIG. 3 (A) was obtained. Therefore, this cDNA was cut out from the λgt10 vector, and pBR327 [Soberon et al .; Gene 9: 287
Page (1980)] at the EcoRI site and prepared in large quantities as a plasmid. This plasmid is called pBRG4.

実施例10. pBRG4由来DNAプローブおよびプロ
ーブ(LC)によるλファージ系ライブラリーのスクリ
ーニング 実施例9で用いたBentonとDavisの方法(前出の文献を
参照)に準じてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセル
ロース濾紙(S&S社製)をのせてファージを移し、0.
5M NaOHにてDNAを変性させ、以下の順序で濾
紙を処理した。0.1M NaOH、1.5M NaClで20
秒、続いて0.5Mトリス−塩酸(pH7.5)、1.5M Na
Clで20秒2回、最後に120mM NaCl、15mMクエ
ン酸ソーダ、13mM KHPO、1mM EDT
A、(pH7.2)で20秒処理した。次いで濾紙を乾燥し、8
0℃で2時間加熱してDNAを固定した。このようにし
て同一の濾紙を2枚作製し、pBRG4由来DNAプロ
ーブとプローブ(LC)によるスクリーニングにそれぞ
れ供した。pBRG4由来DNAプローブによる場合
は、pBRG4をEcoRIで処理して約1500塩基対の
DNA断片を得、このDNA断片を常法に従ってニック
トランスレーションにより放射標識した。上記濾紙を5
×SSC、5×Denhardt溶液、50mMリン酸緩衝液、50
%ホルムアミド、0.25mg/mlの変性DNA(鮭精巣DN
A)、及び0.1%SDSを含むハイブリダイゼーション
緩衝液中で42℃にて一晩、プレハイブリダイゼーション
を行い、上記の放射標識した約1500塩基対のDNAプロ
ーブ(約1×10 cpm/ml)を含むプレハイブリダイ
ゼーション緩衝液[5×SSC、5×Denhardt溶液、20
mMリン酸緩衝液(pH6.0)、50%ホルムアミド、0.1%
SDS、10%デキストラン硫酸、0.1mg/mlの変性DN
A(鮭精巣DNA)の混合液]で42℃にて20時間ハイブ
リダイゼーションを行った。ニトロセルロース濾紙を室
温下に、0.1%SDSを含む2×SSCで20分間洗滌
し、次いで44℃で、0.1%SDSを含む0.1×SSCで30
分間、さらに室温下で0.1%SSCで10分間洗滌した
後、オートラジオグラィーで検出した。
Example 10. Screening of λ phage system library with pBRG4-derived DNA probe and probe (LC) Plaque hybridization was performed according to the method of Benton and Davis used in Example 9 (see the above-mentioned document). Place the nitrocellulose filter paper (S & S) on the agar medium in which the phage plaque was generated, transfer the phage, and
The DNA was denatured with 5M NaOH and the filter paper was treated in the following order. 20 with 0.1M NaOH and 1.5M NaCl
Second, followed by 0.5M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5M Na
20 times twice with Cl, and finally 120 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, 13 mM KH 2 PO 4 , 1 mM EDT
A, (pH 7.2) was treated for 20 seconds. The filter paper is then dried and
DNA was fixed by heating at 0 ° C. for 2 hours. In this way, two identical filter papers were prepared and subjected to screening with the pBRG4-derived DNA probe and the probe (LC). In the case of using the pBRG4-derived DNA probe, pBRG4 was treated with EcoRI to obtain a DNA fragment of about 1500 base pairs, and this DNA fragment was radiolabeled by nick translation according to a conventional method. 5 pieces of the above filter paper
X SSC, 5 x Denhardt's solution, 50 mM phosphate buffer, 50
% Formamide, 0.25 mg / ml denatured DNA (salmon testis DN
A) and prehybridization at 42 ° C. overnight in a hybridization buffer containing 0.1% SDS, and the above radiolabeled DNA probe of about 1500 base pairs (about 1 × 10 6 cpm / ml). Prehybridization buffer containing [5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 20
mM phosphate buffer (pH 6.0), 50% formamide, 0.1%
SDS, 10% dextran sulfate, 0.1 mg / ml denatured DN
Hybridization was performed at 42 ° C. for 20 hours with a mixed solution of A (salmon testis DNA). Rinse the nitrocellulose filter paper at room temperature with 2x SSC containing 0.1% SDS for 20 minutes, then at 44 ° C with 0.1x SSC containing 0.1% SDS for 30 minutes.
After being washed with 0.1% SSC for 10 minutes at room temperature, the cells were detected by autoradiography.

プローブ(LC)の場合は、濾紙を0.1%SDSを含む
3×SSCで、65℃にて2時間前処理した後、6×NE
T、1×Denhardt溶液、100μg/mlの変性DNA(鮭
精巣DNA)を含む溶液中、65℃で2時間、プレハイブ
リダイゼーションを行った。
In the case of probe (LC), filter paper was pretreated with 3 × SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 2 hours, and then 6 × NE.
Prehybridization was carried out at 65 ° C. for 2 hours in a solution containing T, 1 × Denhardt's solution and 100 μg / ml denatured DNA (salmon testis DNA).

放射標識したプローブ(LC)(2×10 cpm/ml)
を含むハイブリダイゼーション緩衝液[6×NET、1
×Denhardt溶液、100μg/ml変性DAN(鮭精巣DN
A)]で63℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った
後、ニトロセルロース濾紙を室温下に、0.1%SDSを
含む6×SSCで20分間洗滌し、この洗滌を3回行った
後、0.1%SDSを含む6×SSCにて、63℃で2分間
洗滌した。
Radiolabeled probe (LC) (2 × 10 6 cpm / ml)
Hybridization buffer containing [6 × NET, 1
× Denhardt's solution, 100 μg / ml denatured DAN (salmon testis DN
A)] at 63 ° C. overnight, and then the nitrocellulose filter paper is washed at room temperature with 6 × SSC containing 0.1% SDS for 20 minutes, and then washed 3 times, and then 0.1%. It was washed with 6 × SSC containing SDS at 63 ° C. for 2 minutes.

濾紙を乾燥した後オートラジオグラフィーで検出した。The filter paper was dried and then detected by autoradiography.

このようにして行ったスクリーニングに於いて、2つの
プローブの両方にポジティブなクローンを選別し、その
うち完全長のcDNAを含むと思われるクローンの塩基
配列をジデオキシ法にて調べたところ、図4(A)に示さ
れる如き塩基配列が得られれた。そこでこのcDNAを
λgt10ベクターより切りだし、pBR327とEcoR
I部位で結合させ、プラスミドpBRV2を得た。
In the screening carried out in this manner, positive clones were selected for both of the two probes, and the nucleotide sequence of the clones that were considered to contain the full-length cDNA was examined by the dideoxy method. A base sequence as shown in A) was obtained. Therefore, this cDNA was cut out from the λgt10 vector, and pBR327 and EcoR were cut out.
Ligation at the I site gave plasmid pBRV2.

実施例11 ヒト染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニ
ング 1)ヒト染色体遺伝子ライブラリーの構築 ヒト染色体遺伝子ライブラリーはManiatis(Harvard Uni
versity)から供与を受けたが、これは次ぎのようにして
作られたものである。
Example 11 Screening of human chromosomal gene library 1) Construction of human chromosomal gene library The human chromosomal gene library is Maniatis (Harvard Uni
versity), which was made as follows.

ヒト胎児肝臓から染色体全DNAをフェノールなどで抽
出し、制限酵素HaeIIIとAluIで部分消化する。
こうして得られたDNA断片の中から鎖長が18〜25Kb
程度のフラグメントをショ糖密度勾配遠心法により濃縮
し、次に制限酵素EcoRIの切断箇所を持つ短鎖合成
ヌクレオチドを介して大腸菌ファージλCharon4
AのアームDNAに接続し、感染性のあるファージDN
A組換え体を作成する。次に、さらに感染性を高める目
的でパッケージング法により完全なファージλ粒子にし
てある。このようにして作られたヒト遺伝子ライブラリ
ーは原理的にはほとんど全てのヒト遺伝子を含む鎖長が
18〜25KbのヒトDNAを含んだ組換え体の集合である
と考えられる。
Chromosomal total DNA is extracted from human fetal liver with phenol or the like and partially digested with restriction enzymes HaeIII and AluI.
Among the DNA fragments thus obtained, the chain length is 18 to 25 Kb
Concentrated fragments are concentrated by sucrose density gradient centrifugation, and then Escherichia coli phage λCharon4 is mediated by a short synthetic nucleotide having a cleavage site of restriction enzyme EcoRI.
Infectious phage DN that is connected to the arm DNA of A
Make A recombinant. Next, for the purpose of further increasing the infectivity, complete phage λ particles are formed by a packaging method. In principle, the human gene library created in this way has a chain length containing almost all human genes.
It is considered to be a set of recombinants containing human DNA of 18 to 25 Kb.

2)pHCS−1由来DNAプローブによるヒト染色体
遺伝子ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法[Science 196巻180頁(1977)]に
準じてプラークハイブリダイゼイションを行った。実施
例8で得られたpHCS−1をSau3AおよびEco
RIで処理して約600塩基対のDNA断片を得、このD
NA断片を常法に従いニックトランスレーションにより
放射標識した。ファージプラークの生じた寒天培地上に
ニトロセルロースろ紙(S&S社)をのせてファージを
移し、0.5M NaOHにてDNAを変性させ、以下の
順序でろ紙を処理した。0.1M NaOH,1.5M Na
Clで20秒,続いて0.5M トリス塩酸(pH7.5),1.5
M NaClで20秒2回,最後に120mM NaCl,1
5mMクエン酸ソーダ,13mM KHPO,1mM
EDTA,(pH7.2)で20秒処理した。
2) Screening of human chromosomal gene library with pHCS-1 derived DNA probe Plaque hybridization was performed according to the method of Benton and Davis [Science 196: 180 (1977)]. The pHCS-1 obtained in Example 8 was treated with Sau3A and Eco.
Treatment with RI gave a DNA fragment of about 600 base pairs,
The NA fragment was radiolabeled by nick translation according to a conventional method. Nitrocellulose filter paper (S & S) was placed on the agar medium in which phage plaque was generated, the phage was transferred, the DNA was denatured with 0.5 M NaOH, and the filter paper was treated in the following order. 0.1M NaOH, 1.5M Na
Cl for 20 seconds, followed by 0.5M Tris-HCl (pH 7.5), 1.5
20 seconds twice with M NaCl, and finally 120 mM NaCl, 1
5 mM sodium citrate, 13 mM KH 2 PO 4 , 1 mM
It was treated with EDTA, (pH 7.2) for 20 seconds.

次いでろ紙を乾燥し、80℃で2時間加熱してDNAを固
定した。5×SSC、5×Denhardt溶液、50m
Mリン酸緩衝液、50%ホルムアミド、0.25mg/mlの変性
DNA(鮭精巣DNA),及び0.1%SDSを含むハイ
ブリダイゼーション緩衝液中で42℃にて一晩ハイブリダ
イゼーションを行いニックトランスレーションにより放
射標識したpHCS−1プローブ4×10cpm/ml
を含むハイブリダイゼーション緩衝液[5×SSC、5
×Denhardt溶液、20mMリン酸緩衝液(pH6.
0)、50%ホルムアミド、0.1%SDS、10%デキストラ
ン硫酸、0.1mg/mlの変性DNA(鮭精巣DNA)の混
合液]で42℃にて20時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。
Then, the filter paper was dried and heated at 80 ° C. for 2 hours to fix the DNA. 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 50m
Hybridization buffer containing M phosphate buffer, 50% formamide, 0.25 mg / ml denatured DNA (salmon testis DNA) and 0.1% SDS hybridized at 42 ° C overnight and radiated by nick translation Labeled pHCS-1 probe 4 × 10 5 cpm / ml
Hybridization buffer containing [5 × SSC, 5
× Denhardt's solution, 20 mM phosphate buffer (pH 6.
0), 50% formamide, 0.1% SDS, 10% dextran sulfate, and a mixed solution of 0.1 mg / ml denatured DNA (salmon testis DNA)] at 42 ° C. for 20 hours.

ニトロセルロースろ紙を室温下に0.1%SDSを含む2
×SSCで20分間洗浄し、次いで44℃で0.1%SDSを
含む0.1×SSCで30分間、さらに室温下で0.1×SSC
で10分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで検出し
た。
Nitrocellulose filter paper containing 0.1% SDS at room temperature 2
Wash with × SSC for 20 minutes, then 0.1 × SSC containing 0.1% SDS at 44 ° C for 30 minutes, then 0.1 × SSC at room temperature.
After 10 minutes of washing, the cells were detected by autoradiography.

その結果、十数個のポジティブなクローンが得られた。As a result, dozens of positive clones were obtained.

これらのクローンから組換え体DNAをManiatisの方法
で(Cell 15巻687頁(1978))により調製した。
Recombinant DNA was prepared from these clones by the method of Maniatis (Cell 15: 687 (1978)).

得られたDNAはEcoRI,BaMHI,BglII等
の各制限酵素にて処理した後、アガロースゲル電気泳動
で分析し、Fritsch等の方法(前出文献を参照)に従っ
て制限酵素地図を作成した。
The obtained DNA was treated with restriction enzymes such as EcoRI, BaMHI, and BglII, analyzed by agarose gel electrophoresis, and a restriction enzyme map was prepared according to the method of Fritsch (see the above-mentioned literature).

上記スクリーニングに用いた放射標識されたpHCS−
1由来のDNA断片のプローブを用いてサザンハイブリ
ダイゼーションを行い、その結果、プローブとハイブリ
ダイズした中からEcoRIにより切断された約8キロ
塩基対のDNA断片を選び、pBR327のEcoRI
部位にサブクローニングした。
Radiolabeled pHCS- used in the above screening
Southern hybridization was carried out using a probe of the DNA fragment derived from 1. As a result, a DNA fragment of about 8 kilobase pairs cleaved by EcoRI was selected from among the hybridized with the probe, and EcoRI of pBR327 was selected.
Subcloned into the site.

さらに、このサブクローニングされたDNAについて上
記の如き制限酵素による処理を行い、サザンハイブリダ
イゼーションを繰り返し行うことにより、EcoRI及
びXhoIで切り出される約4キロ塩基対のDNA断片
にヒトG−CSFポリペプチドをコードする遺伝子が存
在することが判明した。
Furthermore, the subcloned DNA is treated with the restriction enzymes as described above, and Southern hybridization is repeated to encode a human G-CSF polypeptide into a DNA fragment of about 4 kilobase pairs cut out with EcoRI and XhoI. It turned out that there is a gene that does.

そこでデオキシ法を用いてこのDNA断片の約3キロ塩
基対の配列を調べたところ図5に示される塩基配列が得
られた。
Then, when the sequence of about 3 kilobase pairs of this DNA fragment was examined by the deoxy method, the base sequence shown in FIG. 5 was obtained.

また、このDNA断片の制限酵素切断部位は図7に示さ
れる如くであった。
The restriction enzyme cleavage site of this DNA fragment was as shown in FIG.

ヒト染色体遺伝子のスクリーニングに用いるプローブと
して上述の他、pBRG4由来のDNA及びpBRV2
由来のDNAで行った。
In addition to the above-mentioned probes used for screening human chromosomal genes, pBRG4-derived DNA and pBRV2
It was carried out with the DNA of the origin.

両DNAとも、EcoRIで処理した1500塩基対のDN
A断片を直接上記の如くニックトランスレーション法に
て放射標識するか、EcoRIで処理した後DraI処
理して得られる約700塩基対のDNA断片を同様に放射
標識したものを、前述と同条件にてプラークハイブリダ
イゼーションすることによりクローンを選別した後、サ
ザンハイブリダイゼーションによる分析を行って図5に
示される塩基配列を有するDNA断片を得ることができ
た。得られたプラスミドをpBRCE3βと命名した。
Both DNAs are 1500 bp DN treated with EcoRI
The A fragment was directly radiolabeled by the nick translation method as described above, or treated with EcoRI and then with DraI, and the resulting DNA fragment of about 700 base pairs was also radiolabeled under the same conditions as described above. After selecting clones by performing plaque hybridization, a Southern fragment analysis was performed to obtain a DNA fragment having the nucleotide sequence shown in FIG. The resulting plasmid was named pBRCE3β.

実施例12.pHGA410ベクターの調製 (動物細胞用、+VSE系) 実施例9で得られた図3(A)で示されるcDNAのE
coRI断片を制限酵素DraIにて37℃で2時間で
処理した後、DNAポリメラーゼIのKlenow断片
(宝酒造社製)で処理し、末端を平滑末端とした。1μ
gのBglIIリンカー(8mer;宝酒造社製)をAT
Pを用いてリン酸化した後、上記で得られた約1μgの
DNA断片混合物と結合させた。次いで制限酵素Bgl
IIで処理してアガロースゲル電気泳動を行い、最も大き
いDNA断片だけを回収した。
Example 12. Preparation of pHGA410 vector (for animal cells, + VSE system) E of cDNA obtained in Example 9 and shown in FIG. 3 (A)
The coRI fragment was treated with the restriction enzyme DraI at 37 ° C. for 2 hours, and then treated with the Klenow fragment of DNA polymerase I (Takara Shuzo) to make the ends blunt. 1μ
AT of ggl BglII linker (8mer; manufactured by Takara Shuzo)
After phosphorylation with P, it was ligated with about 1 μg of the DNA fragment mixture obtained above. Then the restriction enzyme Bgl
After treatment with II, agarose gel electrophoresis was performed, and only the largest DNA fragment was recovered.

このDNA断片は図6に示すようにヒトG−CSFポリ
ペプチドをコードする部分を含む約710塩基対に相当し
ていた。ベクターpdKCR(Fukunaga等;Proc.Natl.A
cad.Sci.USA;81巻5086頁(1984))を制限酵素BamHI
で処理した後、アルカリフォスファターゼ(宝酒造社
製)で脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DN
Aリガーゼ(宝酒造社製)を加えてcDNA断片と結合
させpHGA410を得た(図8)。図8に示されるご
とくこのプラスミドは、SV40初期遺伝子のプロモー
ター、SV40の複製開始領域、ウサギβ−グロビン遺
伝子の一部、pBR322の複製開始領域およびpBR
322由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子(AmP)をふ
くみ、SV40初期遺伝子のプロモーター下流にヒトG
−CSF遺伝子が接続されている。
As shown in FIG. 6, this DNA fragment corresponded to about 710 base pairs containing the portion encoding the human G-CSF polypeptide. Vector pdKCR (Fukunaga et al .; Proc.Natl.A
cad.Sci.USA; 81: 5086 (1984)) with the restriction enzyme BamHI
Treated with alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and then dephosphorylated to obtain T4DN.
A ligase (Takara Shuzo) was added and ligated with the cDNA fragment to obtain pHGA410 (FIG. 8). As shown in FIG. 8, this plasmid contains the promoter of the SV40 early gene, the replication initiation region of SV40, a part of the rabbit β-globin gene, the replication initiation region of pBR322 and pBR322.
322-derived β-lactamase gene (AmP r ) is included, and human G is located downstream of the SV40 early gene promoter.
-The CSF gene is connected.

実施例13.C127細胞用組替えベクターの構築(+V
SE) 1).pHGA410(H)の構築 実施例12で得られたpHGA410プラスミド(図8)
20μgを50mM Tris−HCl(pH7.5)、7mM
MgCl、100mM NaCl、7mM2−メルカ
プトエタノール、0.01%ウシ血清アルブミン(BSA)
の反応液に溶解し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製、
10〜15単位)を加えて約30分37℃にて反応させ、Eco
RIによる部分消化を行った。次いでフェノール−クロ
ロホルム(1:1)処理を2回行いエーテル処理、エタ
ノール沈澱を行ってDNA断片を処理した。
Example 13. Construction of recombinant vector for C127 cells (+ V
SE) 1). Construction of pHGA410 (H) The pHGA410 plasmid obtained in Example 12 (Fig. 8).
20 μg to 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM
MgCl 2 , 100 mM NaCl, 7 mM 2- mercaptoethanol, 0.01% bovine serum albumin (BSA)
Of the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo,
10 to 15 units) and react at 37 ° C for about 30 minutes, then Eco
Partial digestion with RI was performed. Then, phenol-chloroform (1: 1) treatment was performed twice, ether treatment and ethanol precipitation were performed to treat the DNA fragment.

このDNA断片を50mMTris−HCl、5mMMgCl
、10mMDTT、1mMのdATP、dCTP、dGT
P、DTTPからなる50μlの液に溶解しE.coli
DNAポリメラーゼ−Klenow断片(宝酒造社製)
5μlを加えて14℃2時間キュベートしブラントエンド
(blunt end)にした。
This DNA fragment was added to 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl
2 , 10mM DTT, 1mM dATP, dCTP, dGT
It was dissolved in 50 μl of a solution containing P and DTTP, and then E. coli
DNA polymerase-Klenow fragment (Takara Shuzo)
5 μl was added and incubated at 14 ° C. for 2 hours to make a blunt end.

これから0.8%アガロースゲル電気泳動により約5.8Kb
の断片6μgを回収した。
Approximately 5.8 Kb by 0.8% agarose gel electrophoresis
6 .mu.g of the fragment were recovered.

回収したDNA断片5μgを再び50mMTris−HCl
(pH7.6)、10mMMgCl、10mMDTT、1mMATP
からなる反応液50μl中に溶解し、HindIIIリンカ
ー(宝酒造社製)2μg、及びT4DNAリガーゼ(宝
酒造社製)100単位を加えて、4℃にて一晩反応した。
5 μg of the recovered DNA fragment was added again to 50 mM Tris-HCl.
(PH7.6), 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP
The reaction mixture was dissolved in 50 μl of a reaction solution consisting of 2 μg of HindIII linker (Takara Shuzo) and 100 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo), and reacted overnight at 4 ° C.

次いで、フェーノル処理、エーテル処理、エタノール沈
澱後、10mMTris−HCl(pH7.5)、7mMMgCl
、60mMNaClの溶液30μlに溶解し、制限酵素Hi
ndIII10単位存在下3時間37℃でインキュベートし
た。再びT4DNAリガーゼにより処理した後、このD
NAを塩化ルビジウム法(前記の「Molecular Clonin
g」参照)によりE.coli DHI株に形質転換
し、アンピシリン耐性(Amp)のコロニーを得てp
HGA410プラスミドのEcoRI部位がHindII
Iに置きかわったプラスミドを保持する菌を選択した。
このようにして得られたプラスミドをpHGA410
(H)と命名する(図9)。
Next, phenol treatment, ether treatment, ethanol precipitation, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2
2. Dissolve in 30 μl of a solution of 60 mM NaCl and
Incubated at 37 ° C. for 3 hours in the presence of 10 units of ndIII. After treatment with T4 DNA ligase again, this D
NA is determined by the rubidium chloride method (the above-mentioned “Molecular Clonin
g))). E. coli DHI strain was transformed with ampicillin-resistant (Amp r ) colonies to obtain p.
EcoRI site of HGA410 plasmid is HindII
Bacteria carrying the plasmid replaced by I were selected.
The plasmid thus obtained was used as pHGA410.
It is named (H) (FIG. 9).

2).発現用組換えベクターpTN−G4の構築 上記1)で得られたpHGA410(H)(20μg)を10
mMTris−HCl(pH7.5)7mM MgCl、17
5mM NaCl、0.2mMEDTA、7mM2−メルカプトエ
タノール、0.01%ウシ血清アルブミンからなる反応液50
μlに溶解し、制限酵素SalI(宝酒造社製)20単位
を加え、37℃にて5時間インキュベートした。次いでフ
ェーノル処理、エタノール沈澱後、DNAポリメラーゼ
Klenow断片(宝酒造社製)にて前出の反応と同様
に14℃約2時間インキュベートし、ブラントエンドにし
た。これを、アガロース電気泳動で回収することなくエ
タノール沈澱したDNA断片を制限酵素HindIIIに
て処理して、約2.7kbのHindIII−SalI断片
を1%アガロースゲル電気泳動にて5μg回収した。
2). Construction of Recombinant Vector pTN-G4 for Expression pHGA410 (H) (20 μg) obtained in the above 1) was used for 10 times.
mM Tris-HCl (pH 7.5) 7 mM MgCl 2 , 17
Reaction solution consisting of 5 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 7 mM 2-mercaptoethanol, 0.01% bovine serum albumin 50
It was dissolved in μl, 20 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 hours. Then, after phenol treatment and ethanol precipitation, the mixture was incubated with DNA polymerase Klenow fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.) at 14 ° C. for about 2 hours in the same manner as the above reaction to give a blunt end. The DNA fragment obtained by ethanol precipitation was treated with a restriction enzyme HindIII without being recovered by agarose electrophoresis, and 5 μg of a HindIII-SalI fragment of about 2.7 kb was recovered by 1% agarose gel electrophoresis.

一方、ウシ乳頭腫ウイルス[bovine papilloma virus
(BPV)]を有するプラスミドpdBPV−1(Sarve
r,N.,Sbyrne,J.C&Howley,P.M.(1982)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA79巻7147-7151;Dr.Howleyより入手)をNagataらの
方法の如く(Fukunaga,Sokawa,& Nagata,(1984)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA81巻5086-5090)HindIII及びPvuI
Iで処理して8.4kbのDNA断片を得ておく。
On the other hand, bovine papilloma virus
(BPV)] containing the plasmid pdBPV-1 (Sarve
r, N., Sbyrne, JC & Howley, PM (1982) Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA Vol. 79 7147-7151; obtained from Dr. Howley) as in the method of Nagata et al. (Fukunaga, Sokawa, & Nagata, (1984) Proc. Nat.
l.Acad.Sci.USA Vol. 81 5086-5090) HindIII and PvuI
Treatment with I gives a 8.4 kb DNA fragment.

この8.4kbのDNA断片と上記の約2.7kbのH
indIII−SAlIDNA断片を常法に従ってT4D
NAリガーゼにより処理し、前出の「Molecular Clonin
g」に記載された塩基ルビジウム法によりE.coli
DHI株に形質転換し、pHGA410由来G−CS
FのcDNAを有するプラスミドを保持するE.col
iコロニーを選別した。このプラスミドをpTN−G4
と命名する(図9)。
This 8.4 kb DNA fragment and the above-mentioned approximately 2.7 kb H
The indIII-SAlI DNA fragment was treated with T4D according to a conventional method.
After treatment with NA ligase, the above-mentioned "Molecular Clonin
by the base rubidium method described in "g." coli
Transformed into DHI strain, pHGA410-derived G-CS
E. coli harboring a plasmid carrying the cDNA for F. col
i colonies were selected. This plasmid was designated as pTN-G4
(Fig. 9).

一方、アデノウイルスTypeII〔蛋白質核酸酵素27巻
12月号(1982年),共立出版発行〕よりVAI及びVA
IIを含む約1700bpのSalI−HindIII断片を含
むプラスミド△pVAよりVAIおよびVAIIを含む断
片を回収した。この断片を先に述べたpTNG4のHi
ndIII部位に挿入してpTNG4VAαおよびpTN
G4VAβを得た(図9)。このプラスミドはアデノの
VA遺伝子によりSV40の初期プロモーターからの転
写産物の発現効率を高めるようにしたものである。
On the other hand, adenovirus Type II [protein nucleic acid enzyme 27
December issue (1982), published by Kyoritsu Shuppan], VAI and VA
Fragments containing VAI and VAII were recovered from the plasmid ΔpVA containing the approximately 1700 bp SalI-HindIII fragment containing II. This fragment is the Hi of pTNG4 described above.
pTNG4VAα and pTN inserted at the ndIII site
G4VAβ was obtained (FIG. 9). In this plasmid, the expression efficiency of the transcription product from the SV40 early promoter was enhanced by the adenovirus VA gene.

実施例14 C127細胞の形質転換及びその発現(+V
SE) 実施例13で得たpTN−G4をマウスC127細胞に形
質転換する前に制限酵素BamHIで処理する。即ちp
TN−G4プラスミド20μgを10mMTris−HCl
(pH8.0),7mM MgCl,100mM NaCl,2mM
2−メルカプトルエタノール,0.01%BSAの混合液10
0μlに溶解せしめBamHI(宝酒造社製)20単位で
処理し、フェノール処理、エーテル処理、エタノール沈
澱を行った。
Example 14 Transformation of C127 cells and expression thereof (+ V
SE) pTN-G4 obtained in Example 13 is treated with a restriction enzyme BamHI before being transformed into mouse C127 cells. That is p
20 μg of TN-G4 plasmid was added to 10 mM Tris-HCl.
(PH8.0), 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 2 mM
2-mercaptor ethanol, 0.01% BSA mixed solution 10
It was dissolved in 0 μl and treated with 20 units of BamHI (Takara Shuzo), followed by phenol treatment, ether treatment, and ethanol precipitation.

マウスC127I細胞は10%牛胎児血清(GIBCO社
製)を含むDulbecco′s minimal essential培地中で増
殖させる。径5cmのプレートに増殖したC127I細胞
に、プレート当たり上記調製DNAを10μgの割り合い
でリン酸−カルシウム法(Haynes,J&Weissmann,C(1983)
Nucleic Acid Res.11巻687−706参照)にて形質転換を
行い、グリセロール処理の後、12時間37℃でインキュベ
ートした。
Mouse C127I cells are grown in Dulbecco's minimal essential medium containing 10% fetal bovine serum (GIBCO). C127I cells grown on a plate having a diameter of 5 cm were treated with the above-prepared DNA at a ratio of 10 μg per plate by the phosphate-calcium method (Haynes, J & Weissmann, C (1983).
Nucleic Acid Res. 11 : 687-706) was used for transformation, and after glycerol treatment, it was incubated at 37 ° C. for 12 hours.

次ぎに、この細胞を3枚の新しい径5cmプレートに移
し、1週間2回の割り合いで培地交換をした。16日目に
Foci(集塊)を形成した部分をそれぞれ新しいプレ
ートに移し、上述の培地で継代培養し、G−CSF生産
能の高いクローンを選別した。その結果〜1mg/のレ
ベルのG−CSF生産がみられた。更にクローニングを
続けた結果、10mg/以上のレベルのG−CSF産生を
確認した。
Next, the cells were transferred to three new 5 cm diameter plates, and the medium was exchanged twice a week. On the 16th day, the Foci (aggregate) forming part was transferred to a new plate and subcultured in the above-mentioned medium to select clones having high G-CSF production ability. As a result, a G-CSF production level of ˜1 mg / was observed. As a result of further continuing cloning, production of G-CSF at a level of 10 mg / or higher was confirmed.

尚、宿主細胞には上記のC127I細胞のほかNIH3
T3細胞も用いることができる。
In addition to the above C127I cells, NIH3 is used as the host cell.
T3 cells can also be used.

実施例15CHO細胞によるG−CSFの発現(+VS
E) 1).pHGG4−dhfrの構築 実施例12で得たpHGA410プラスミド20μgを10mM
Tris−HCl(pH7.5)、7mMMgCl、175mM
NaCl、0.2mM EDTA、0.7mM 2−メルカプトエ
タノール、0.01%BSAを含む溶液100μlに溶解し、
制限酵素SalI(宝酒造社製)20単位を加え37℃一晩
反応した後、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノー
ル沈澱を行った。
Example 15 Expression of G-CSF by CHO cells (+ VS
E) 1). Construction of pHGG4-dhfr 20 μg of pHGA410 plasmid obtained in Example 12 was added to 10 mM.
Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 175 mM
Dissolve in 100 μl of a solution containing NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.7 mM 2-mercaptoethanol, 0.01% BSA,
After adding 20 units of restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) and reacting overnight at 37 ° C., phenol treatment, ether washing and ethanol precipitation were performed.

次ぎに、得られたDNA沈澱を50mMTris−HCl、
5mMMgCl、10mMDTT、1mMのdATP、dCT
P、dGTP、TTPからなる反応液100μlに溶解
し、E.coli DNAポリメラーゼ−Klenow
断片(宝酒造社製10μl)を加えて14℃2時間反応さ
せ、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行った。
Next, the obtained DNA precipitate was treated with 50 mM Tris-HCl,
5 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM dATP, dCT
It was dissolved in 100 μl of a reaction solution consisting of P, dGTP and TTP, and E. E. coli DNA polymerase-Klenow
A fragment (10 μl manufactured by Takara Shuzo) was added and reacted at 14 ° C. for 2 hours, followed by phenol treatment, ether washing and ethanol precipitation.

このDNAにEcoRIリンカーを付加する。即ち上記
DNAを50μlの50mMTris−HCl(pH7.4)、1
0mMDTT、0.5mMスペルミジン、2mMATP、2.5mMヘ
キサミン塩化コバルト、20μg/mlBSAからなる反応
液に溶解し、EcoRIリンカー(宝酒造社製)を加
え、200単位のT4DNAリガーゼ(宝酒造社製)を加
え4℃、12〜16時間反応した。フエノール処理、エ
ーテル洗浄、エタノール沈澱を常法に従って行った後、
該DNAをEcoRIで部分消化し、1%アガロースゲ
ル電気泳動で約2.7kbのフラグメントを3μg回収し
た。
An EcoRI linker is added to this DNA. That is, the above DNA was added to 50 μl of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1
It was dissolved in a reaction solution consisting of 0 mM DTT, 0.5 mM spermidine, 2 mM ATP, 2.5 mM hexamine cobalt chloride, and 20 μg / ml BSA, added with EcoRI linker (Takara Shuzo), and added 200 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) at 4 ° C., Reacted for 12-16 hours. After performing phenol treatment, ether washing, and ethanol precipitation according to the usual method,
The DNA was partially digested with EcoRI and 3 μg of a fragment of about 2.7 kb was recovered by 1% agarose gel electrophoresis.

一方、pAdD26SVpAプラスミド(kaufman,R.G.
&Sharp,P.A(1982)Mol.Cell Biol,2巻1304〜1319)をE
coRIにて処理し、バクテリアアルカリフォスファタ
ーゼ(BAP)処理して脱リン酸を行う。即ち、pAd
D26SVpA20μgとEcoRI20単位を反応液50
mMTris−HCl(pH7.5)、7mMMgCl、100mM
NaCl、7mM2−メルカプトエタノール、0.01%BS
Aの混合液100μlに加え、37℃10時間反応させ、続い
て上記反応液にBAP5単位を加え、68℃にて30分間反
応した。
On the other hand, pAdD26SVpA plasmid (kaufman, RG
& Sharp, PA (1982) Mol. Cell Biol, Volume 2 1304-1319)
CoRI treatment, bacterial alkaline phosphatase (BAP) treatment and dephosphorylation. That is, pAd
20 μg of D26SVpA and 20 units of EcoRI were added to the reaction solution 50
mMTris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 100 mM
NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 0.01% BS
It was added to 100 μl of the mixed solution of A and reacted at 37 ° C. for 10 hours, then 5 units of BAP was added to the above reaction solution and reacted at 68 ° C. for 30 minutes.

その後フェノール処理をし、電気泳動にてpAdD26
SVpAのEcoRI断片を回収した(〜5μg)。
After that, it is treated with phenol and electrophoresed into pAdD26.
The EcoRI fragment of SVpA was recovered (-5 μg).

上記した約2.7kbの断片とpAdD26SVpAの断片
のそれぞれ0.5μgずつをアニールした。このプラスミ
ドをE.coli DHI株に塩化ルビジウム法により形質
転換してpHGG4−dhfrのプラスミドを保持する
コロニーを選択する。得られたプラスミドをpHGG4
−dhfrと命名した(図10a)。
0.5 μg each of the above-mentioned about 2.7 kb fragment and the pAdD26SVpA fragment was annealed. This plasmid was transformed into E. The Escherichia coli DHI strain is transformed by the rubidium chloride method, and colonies carrying the pHGG4-dhfr plasmid are selected. The resulting plasmid was pHGG4
It was named -dhfr (Fig. 10a).

なお、上記の別法として、pHGG4プラスミドをSa
lI処理し、EcoRIリンカーを付加することなしに
EcoRIで部分消化し約2.7kbの断片を回収し、
E.coli DNAポリメラーゼ−klenow断片
で該DNA断片を処理し末端をブラントエンド化する。
As an alternative to the above, the pHGG4 plasmid was replaced with Sa
treated with II and partially digested with EcoRI without adding an EcoRI linker to recover a fragment of about 2.7 kb,
E. The DNA fragment is treated with E. coli DNA polymerase-klenow fragment to blunt end the ends.

一方前述と同じ方法でpAdD26SVpAのブラント
エンド化したEcoRI断片を調製し、両者をT4DN
Aリガーゼ処理してpHGG4−dhfrを調製するこ
ともできる。
On the other hand, a blunt-ended EcoRI fragment of pAdD26SVpA was prepared in the same manner as described above, and both were treated with T4DN.
It is also possible to prepare pHGG4-dhfr by treating with A ligase.

また実施例13の1)で得られたpHGA410(H)を実
施例13の2)記載した如く、制限酵素HindIIIおよび
SalIにて処理し、HindIII−SalI断片を上
記pAdD26SVpAのブラントエンド化したEco
RIに連結してもpHGG4−dhfrを得ることがで
きる(図10b)。
The pHGA410 (H) obtained in 1) of Example 13 was treated with the restriction enzymes HindIII and SalI as described in 2) of Example 13 and the HindIII-SalI fragment was blunt-ended with pAdD26SVpA.
PHGG4-dhfr can also be obtained by ligation to RI (Fig. 10b).

2).pG4DR1およびpG4DR2の構築 1)の項で述べたpAdD26SVpA10μgを50mM
Tris−HC(pH7.5)、7mM MgCl、100m
M NaCl、7mM 2−メルカプトエタノール、0.
01%BSAを含む反応液50mlに溶解し、制限酵素Eco
RIおよびBamHIそれぞれ10単位を加え、37℃10時
間反応させた。常法に従いフェノール処理、エーテル洗
浄を行った。1%低融点アガロース電気泳動にて、約2
KbのDNA断片を回収した後、DNAポリメラーゼー
Klenow断片にて、常法に従いブラントエンド化し
て、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行った。
2). Construction of pG4DR1 and pG4DR2 10 μg of pAdD26SVpA described in the section 1) was added to 50 mM.
Tris-HC (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 100 m
M NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 0.
Dissolve in 50 ml of reaction solution containing 01% BSA and use the restriction enzyme Eco
RI and BamHI (10 units each) were added and reacted at 37 ° C. for 10 hours. Phenol treatment and ether washing were performed according to a conventional method. Approximately 2 by 1% low melting point agarose electrophoresis
After the Kb DNA fragment was recovered, it was blunt-ended with a DNA polymerase Klenow fragment according to a conventional method, followed by phenol treatment, ether washing, and ethanol precipitation.

一方、実施例13の1)で得られたpHGA410(H)10
μgを10mM Tris−HCl(pH7.5)、7mM
MgCl、60mM NaClを含む反応液50μlに溶
解し、HindIII10単位を加えて37℃、6時間反応
させた。常法に従い1%低融点アガロース電気泳動にて
DNA断片を回収し、更にBAP処理をした後、Kle
now断片にてブラントエンド化した。フェノール処
理、エーテル洗浄を行った後、先に述べた約2KbのD
NA断片とT4DNAリガーゼを用いてブラントエンド
結合させた。すなわち、それぞれのDNA断片1μgを
66mM Tris−HCl(pH7.5)、6.6mM MgC
、5mM DTT、1mM ATPを含む反応液30
μgに溶解せしめ、T4DNAリガーゼ50単位を加え、
6℃、12時間反応せしめた後、E.coliDHI株に
形質転換した。このようにして、図10cに示すpG4D
R1およびpG4DR2を得た。
On the other hand, pHGA410 (H) 10 obtained in 1) of Example 13
μg to 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM
It was dissolved in 50 μl of a reaction solution containing MgCl 2 and 60 mM NaCl, 10 units of HindIII was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 6 hours. The DNA fragment was recovered by 1% low-melting point agarose gel electrophoresis according to a conventional method, further subjected to BAP treatment, and then Kle.
It was blunt-ended with the now fragment. After phenol treatment and ether washing, D of about 2Kb as described above
Blunt end ligation was performed using the NA fragment and T4 DNA ligase. That is, 1 μg of each DNA fragment
66 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6.6 mM MgC
Reaction solution containing l 2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP 30
Dissolve in μg, add 50 units of T4 DNA ligase,
After reacting at 6 ° C. for 12 hours, E. E. coli strain DHI. Thus, pG4D shown in FIG. 10c
R1 and pG4DR2 were obtained.

3)形質転換と発現 CHO細胞(dhfr-株、コロンビア大学、Dr.L.Chasinよ
り入手)を9cm径のプレート(Nunc社製)中10%仔牛
血清を含むα最小必須培地(α−MEM、アデノシン、
デオキシアデノシン、チミジン添加)で培養増殖し、こ
れをリン酸−カルシウム法(Wigler等、Cell14巻725頁
(1978))によって形質転換した。
3) Transformation and expression CHO cells (dhfr - strain, obtained from Dr. L. Chasin, Columbia University) in a 9 cm plate (Nunc) containing 10% fetal calf serum containing α minimum essential medium (α-MEM, Adenosine,
Cultured and proliferated with deoxyadenosine and thymidine, and this was subjected to the phosphate-calcium method (Wigler et al., Cell 14, p. 725).
(1978)).

即ち1)で調製したpHGG4−dhfrプラスミド1μ
gにキヤリアーDNA(子牛胸線DNA)を適量加え
て、TE溶液375μlに溶解し1M CaCl 125μ
lを加える。3〜5分氷上で冷やし500μlの2×HB
S(50mMHepes、280mM NaCl、1.5mMリン酸緩
衝液)を加え再び氷冷後、上記のCHO細胞培養液1ml
と混合し、プレートに滴下した後、COインキュベー
ター中で9時間培養した。プレートから培地を除去し、
TBS(Tris-Buffered Saline)にて洗浄後、20%グリ
セロール含有TBS添加、再び洗浄した後、非選択培地
(前出α−MEM培地、ヌクレオチド添加)を添加して
2日間インキュベートし選択培地(ヌクレオチド無添
加)で1:10に細胞を分割した。次いで2日毎に選択培
地にて培地交換を行いながら培養を続行し生じたコロニ
ーを選別して新しいプレートに移した。
That is, 1 μm of the pHGG4-dhfr plasmid prepared in 1)
An appropriate amount of carrier DNA (calf thorax DNA) was added to g and dissolved in 375 μl of TE solution, and 1M CaCl 2 125 μm was added.
Add l. Cool on ice for 3 to 5 minutes 500 μl of 2 x HB
S (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1.5 mM phosphate buffer) was added and ice-cooled again, then 1 ml of the above CHO cell culture medium
Was mixed with the mixture, added dropwise to the plate, and then cultured in a CO 2 incubator for 9 hours. Remove the medium from the plate,
After washing with TBS (Tris-Buffered Saline), addition of 20% glycerol-containing TBS, washing again, addition of a non-selection medium (alpha-MEM medium described above, addition of nucleotides), incubation for 2 days, and selection medium (nucleotide Cells were divided 1:10 with no addition). Then, the culture was continued while exchanging the medium with the selective medium every two days, and the resulting colonies were selected and transferred to a new plate.

新しいプレートでは0.02μMメトトレキセート(MT
X)存在下で増殖し、0.05μM、更に0.1μM MTX
存在下で増殖させてクローニングを行った。なおCHO
細胞の形質転換はCHO細胞に対しpHGG4とpAd
D26SVpAを同時形質転換(Co transformation)す
ることによっても行うことができる(Scahill等.Proc.N
atl.Acad.Sci.USA80巻4654-4658(1983)参照)。
0.02 μM methotrexate (MT
X) Proliferated in the presence of 0.05 μM and then 0.1 μM MTX
It was grown in the presence and cloned. CHO
Transformation of cells was performed by using pHGG4 and pAd for CHO cells.
It can also be performed by cotransformation of D26SVpA (Scahill et al. Proc. N.
atl.Acad.Sci.USA 80 Vol. 4654-4658 (1983)).

また、以下に述べる方法によってもCHO細胞の形質転
換を行った。即ち、上記2)の項で調製したpG4DR1
あるいはpG4DR2をあらかじめそれぞれSalIお
よびKpnIで処理してDNA断片を得て、そのうちの
10μgを上記と同様にCHO細胞に形質転換させた。こ
のようにして形質転換された細胞を選択培地にて上記の
如く培養を続けると約7日目で明らかなコロニーが1プ
レートにつき100個以上出現した。コロニーを一つ一つ
選別することなしに、再び新しいプレートに移しかえた
後、0.01μM MTX存在下に選択培地で培養を続ける
と、十数個のコロニーが出現した。更にこのような手法
によりMTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.1μMと
上昇させ、生き残ってきたコロニーを選別した。また、
得られた十数個のコロニーをそれぞれ選別した後、MT
X濃度を上昇させても同様のコロニーの選別を行うこと
ができた。
CHO cells were also transformed by the method described below. That is, pG4DR1 prepared in the above 2)
Alternatively, pG4DR2 was previously treated with SalI and KpnI to obtain DNA fragments, and
10 μg was transformed into CHO cells as above. When the cells thus transformed were continued to be cultured in the selective medium as described above, 100 or more clear colonies appeared per plate on about the 7th day. When the colonies were transferred to a new plate again without selecting them one by one, and continued to be cultured in a selective medium in the presence of 0.01 μM MTX, dozens of colonies appeared. Furthermore, the MTX concentration was increased to 0.02 μM, 0.05 μM, and 0.1 μM by such a method, and the surviving colonies were selected. Also,
After selecting each of the obtained dozens of colonies, MT
Even if the X concentration was increased, similar colony selection could be performed.

又いわゆるポリシストロニック遺伝子を有する組換えベ
クターを構築し、これを用いてCHO細胞を形質転換す
ることができた。即ち、pAdD26SVpAをPst
I処理し、2つの断片を回収しこれらとpBRG4由来
のCSFcDNA断片を結合することにより、アデノウ
イルスプロモーター、CSFcDNA、DHFR、SV
40のポリA部位の順序に配列した組換えベクターを構
築しCHO細胞にいれて実施した。
In addition, a recombinant vector having a so-called polycistronic gene was constructed, and this could be used to transform CHO cells. That is, pAdD26SVpA is set to Pst
I treatment, two fragments were recovered, and by ligating these fragments with the pBRG4-derived CSF cDNA fragment, adenovirus promoter, CSF cDNA, DHFR, SV
A recombinant vector having 40 poly A sites arranged in order was constructed and put into a CHO cell.

実施例16 発現物質のG−CSF活性検定 (+VSE) 実施例14及び実施例15で得られたC127細胞及びCH
O細胞の培養上清を夫々1N酢酸によりpH4に調整し、
等容量のn−プロパノールを加えた後、生じた沈澱を遠
心除去し、C8逆相系担体(山村化学社製)を充填した
オープンカラム(1φ×2cm)に通し、50%n−プロパ
ノールで溶出させた。溶出液を水で2倍に希釈した後、
YMC−C8カラム(山村化学社製)を用いた逆相高速
液体クロマトグラフィーにて0.1%TFAを含む30〜60
%の直線濃度勾配のn−プロパノールにて溶出を行っ
た。n−プロパノール濃度が40%付近の位置で溶出され
る画分を分取した後、凍結乾燥し、0.1Mグリシン緩衝
液(pH9)に溶解せしめた。このような過程を得ること
によって、ヒトG−CSFはC127及びCHO細胞上
清から約20倍に濃縮された。
Example 16 G-CSF activity assay of expressed substances (+ VSE) C127 cells and CH obtained in Example 14 and Example 15
The culture supernatant of O cells was adjusted to pH 4 with 1N acetic acid,
After adding an equal volume of n-propanol, the resulting precipitate was removed by centrifugation, passed through an open column (1φ × 2 cm) packed with a C8 reverse phase carrier (Yamamura Chemical Co., Ltd.), and eluted with 50% n-propanol. Let After diluting the eluate twice with water,
30-60 containing 0.1% TFA by reverse phase high performance liquid chromatography using YMC-C8 column (manufactured by Yamamura Chemical Co., Ltd.)
Elution was performed with n-propanol having a linear concentration gradient of%. The fraction eluted at a position where the n-propanol concentration was around 40% was collected, freeze-dried, and dissolved in 0.1 M glycine buffer (pH 9). By obtaining such a process, human G-CSF was concentrated about 20-fold from C127 and CHO cell supernatants.

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトG−CS
FcDNAを含まないプラスミドで細胞を形質転換した
後その培養上清を濃縮した。得られた標品について参考
例に記載された「ヒトG−CSAの測定方法(a)」に
基づいた方法にてヒトG−CSF活性を検定した。尚、
発現効率が十分に高い場合は培養上清を直接検定に供し
てもよい。ここでは濃縮した例について結果を示した。
その結果は表−1の通りであった。
As a control, human G-CS was prepared according to the method described above.
After transforming the cells with the plasmid containing no FcDNA, the culture supernatant was concentrated. The obtained preparation was assayed for human G-CSF activity by a method based on "Method for measuring human G-CSA (a)" described in Reference Example. still,
When the expression efficiency is sufficiently high, the culture supernatant may be directly subjected to the assay. The results are shown here for concentrated examples.
The results are shown in Table 1.

実施例17 アミノ酸分析および糖分析(+VSE) 1)アミノ酸組成の分析 実施例16で得た粗CSF試料を更に実施例2の(iii)の
方法にしたがって精製した。この精製CSF試料を常法
により加水分解し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を
日立835アミノ酸自動分析装置(日立製作所社製)を用
いて特殊アミノ酸分析法により分析した。この結果を表
−2に示した。尚、加水分解条件は次の如くである。
Example 17 Amino Acid Analysis and Sugar Analysis (+ VSE) 1) Analysis of Amino Acid Composition The crude CSF sample obtained in Example 16 was further purified according to the method of Example 2 (iii). The purified CSF sample was hydrolyzed by a conventional method, and the amino acid composition of the protein portion was analyzed by a special amino acid analysis method using a Hitachi 835 amino acid automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.). The results are shown in Table-2. The hydrolysis conditions are as follows.

6N HCl,110℃,24時間,真空中 4N メタンスルホン酸+0.2%3−(2−アミノ
エチル)インドール,110℃,24時間,48時間,72時
間,真空中 試料は、40%n−プロパノールと0.1%トリフルオロ酢
酸を含む溶液(1.5ml)に溶かした後、各々0.1mlをと
り、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又はの試薬
を加えて真空封管し、加水分解に供した。
6N HCl, 110 ° C., 24 hours, in vacuum 4N methanesulfonic acid + 0.2% 3- (2-aminoethyl) indole, 110 ° C., 24 hours, 48 hours, 72 hours, in vacuum Sample is 40% n- After dissolving in a solution containing propanol and 0.1% trifluoroacetic acid (1.5 ml), 0.1 ml of each was taken and dried with dry nitrogen gas, or the reagent was added and the tube was sealed in a vacuum and subjected to hydrolysis. .

表中、実測値はの24時間値との24,48,72時間値の
合計4回の平均値である。但し、Thr,Ser,1/
2Cys,Met,Val,IleおよびTrpは以下
の方法で算出した。(生化学実験講座、タンパク質化学
II(東京化学同人出版)を参照) ・ Thr,Ser,1/2Cys,Metはの24,
48,72時間値の経時変化をとり、零時間に補外。
In the table, the actual measurement value is the average value of the 24 hour value and the 24, 48, 72 hour value in total of 4 times. However, Thr, Ser, 1 /
2Cys, Met, Val, Ile and Trp were calculated by the following method. (Biochemistry Laboratory, Protein Chemistry
II (See Tokyo Kagaku Doujin Shuppan) ・ For Thr, Ser, 1 / 2Cys, Met, 24,
Extrapolated to zero time by taking the change with time for 48 and 72 hours.

・Val,Ileはの72時間値。・ Val and Ile are 72-hour values.

・Trpはの24,48,72時間値の平均値 2)糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製CSF試料200ng
に内部標準としてイノシトール25nmolを加えた後、
1.5N HClを含むメタノール溶液(500μl)を加え
て窒素ガス置換した封管中、90℃で4時間反応させた。
開管後炭酸銀(AgCo)を加えて中和した後、無
水酢酸50μlを加え振とう後、室温にて暗所に一晩放置
した。上層をサンプルチューブにとり、窒素ガスにて乾
燥した。沈澱にメタノールを加え洗浄後軽く遠沈し、上
層を同じサンプルチューブに加え乾燥した。これに50μ
lのTMS化試薬(ピリジン:ヘキサメチルジシラザ
ン:トリメチルクロロシラン=5:1:1に混合したも
の)を加え40℃で20分反応させた後、Deep Freezerに保
存した。尚、スタンダードとしてガラクトーク(Ge
l)、N−アセチルガラクトサミン(GelNAc)、
シアル酸などを各50nmolおよびイノシトール25nm
olを合わせ同様の操作を行った。
・ Trp is the average of 24, 48 and 72 hours 2) Sugar composition analysis 200 ng of purified CSF sample used in the above amino acid composition analysis
After adding 25 nmol of inositol as an internal standard to
A methanol solution (500 μl) containing 1.5 N HCl was added and the reaction was carried out at 90 ° C. for 4 hours in a sealed tube in which the atmosphere was replaced with nitrogen gas.
After the tube was opened, silver carbonate (Ag 2 Co 3 ) was added for neutralization, 50 μl of acetic anhydride was added, the mixture was shaken, and then left overnight at room temperature in the dark. The upper layer was placed in a sample tube and dried with nitrogen gas. Methanol was added to the precipitate, which was washed and then centrifuged briefly, and the upper layer was added to the same sample tube and dried. 50μ to this
1 TMS reagent (a mixture of pyridine: hexamethyldisilazane: trimethylchlorosilane = 5: 1: 1) was added, reacted at 40 ° C. for 20 minutes, and then stored in Deep Freezer. In addition, as a standard,
l), N-acetylgalactosamine (GelNAc),
50 nmol of sialic acid and 25 nm of inositol
and the same operation was performed.

このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマト分
析を行った。
Gas chromatographic analysis was performed on this sample under the following conditions.

(分析条件) カラム:2%OV−17VINport HP60〜80メッシュ,3
m,ガラス 温度:110℃〜250℃まで4℃/分の昇温 キャリヤーガス:最初は1.2〜1.6Kg/cm2 (窒素圧) 終了時は2〜2.5Kg/cm2 感度:10MΩレンジ0.1〜0.4V 圧 :水素ガス0.8Kg/cm2 空気 0.8Kg/cm2 サンプル量:2.5〜3.0μl 分析の結果、本発明のCSFからガラクトース、N−ア
セチルガラクトサミンおよびシアル酸が確認された。
(Analysis conditions) Column: 2% OV-17VINport HP60-80 mesh, 3
m, glass Temperature: 110 ℃ ~ 250 ℃ 4 ℃ / min temperature rise Carrier gas: 1.2 ~ 1.6Kg / cm 2 (nitrogen pressure) at the end 2 ~ 2.5Kg / cm 2 Sensitivity: 10 3 MΩ range 0.1-0.4 V pressure: hydrogen gas 0.8 Kg / cm 2 air 0.8 Kg / cm 2 sample amount: 2.5-3.0 μl As a result of analysis, galactose, N-acetylgalactosamine and sialic acid were confirmed from the CSF of the present invention.

実施例18.pHGV2ベクターの調製 (動物細胞用、−VSE系) 実施例10で得られた図4(A)で示されるcDNAのE
coRI断片を制限酵素DraIにて37℃で2時間で処
理した後、DNAポリメラーゼIのKIenow断片
(宝酒造社製)で処理し、末端を平滑末端とした。1μ
gのBglIIリンカー(8mer;宝酒造社製)をAT
Pを用いてリン酸化した後、上記で得られた約1μgの
DNA断片混合物を結合させた。次いで制限酵素Bgl
IIで処理してアガロースゲル電気泳動を行い、最も大き
いDNA断片だけを回収した。
Example 18. Preparation of pHGV2 vector (for animal cells, -VSE system) E of cDNA obtained in Example 10 and shown in Fig. 4 (A)
The coRI fragment was treated with the restriction enzyme DraI at 37 ° C. for 2 hours, and then treated with the KIenow fragment of DNA polymerase I (Takara Shuzo) to make the ends blunt. 1μ
AT of ggl BglII linker (8mer; manufactured by Takara Shuzo)
After phosphorylation with P, about 1 μg of the DNA fragment mixture obtained above was ligated. Then the restriction enzyme Bgl
After treatment with II, agarose gel electrophoresis was performed, and only the largest DNA fragment was recovered.

このDNA断片は図6に示すようにヒトG−CSFポリ
ペプチドをコードする部分を含む約700塩基対に相当し
ていた。ベクターpdKCR(Fukunaga等;Proc.Natl.
Acad.Sci.USA;81巻5086頁(1984))を制限酵素BamHI
で処理した後、アルカリフォスファターゼ(宝酒造社
製)で脱リン酸して得られたベクターDNAをT4DN
Aリガーゼ(宝酒造社製)を加えてcDNA断片と結合
させpHGV2を得た(図11)。図11に示されるごとく
このプラスミドは、SV40初期遺伝子のプロモータ
ー、SV40の複製開始領域、ウサギβ−グロビン遺伝
子の一部、pBR322の複製開始領域およびpBR3
22由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子(Amp)を含
み、SV40初期遺伝子のプロモーター下流にヒトG−
CSF遺伝子が接続されている。
As shown in FIG. 6, this DNA fragment corresponded to about 700 base pairs containing the portion encoding the human G-CSF polypeptide. Vector pdKCR (Fukunaga et al .; Proc.Natl.
Acad. Sci. USA; 81 : 5086 (1984)) with the restriction enzyme BamHI
Treated with alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and then dephosphorylated to obtain T4DN.
A ligase (Takara Shuzo) was added and ligated with the cDNA fragment to obtain pHGV2 (FIG. 11). As shown in FIG. 11, this plasmid contains the promoter of the SV40 early gene, the replication initiation region of SV40, a part of the rabbit β-globin gene, the replication initiation region of pBR322 and pBR3.
22-derived β-lactamase gene (Amp r ), and human G-in the downstream of the SV40 early gene promoter.
The CSF gene is connected.

実施例19 C127細胞用組換えベクターの構築(−V
SE) 1)pHGV2(H)の構築 実施例18で得られたpHGV2プラスミド(図11)20μ
gを用いて、実施例13の1)に記載した方法と同様にして
pHGV2(H)と命名するプラスミドを得た(図1
2)。
Example 19 Construction of recombinant vector for C127 cells (-V
SE) 1) Construction of pHGV2 (H) 20 μ of pHGV2 plasmid (FIG. 11) obtained in Example 18
Using g, a plasmid named pHGV2 (H) was obtained in the same manner as described in Example 13 1) (Fig. 1).
2).

2)発現用組換えベクターpTN−V2ならびにpTNV
AαおよびpTNVAβの構築 上記1)で得られたpHGV2(H)20μgを用いて、実
施例13の2)に記載した方法と同様にしてpHGV2由来
G−CSFのcDNAを有するプラスミドを保持する
E.coliコロニーを選別した。得られたプラスミド
をpTN−V2と命名する(図12)。
2) Recombinant expression vector pTN-V2 and pTNV
Construction of Aα and pTNVAβ Using 20 μg of pHGV2 (H) obtained in 1) above, E. coli carrying a plasmid having the G-CSF cDNA derived from pHGV2 was carried out in the same manner as in 2) of Example 13. E. coli colonies were selected. The resulting plasmid is named pTN-V2 (Fig. 12).

一方アデノウイルスTypeII〔蛋白質核酸酵素27巻12
月号(1982年)、共立出版発行〕よりVAIおよびVA
IIを含む約1700bpのSalI−HindIII断片を含
むプラスミド△pVAよりVAIおよびVAIIを含む断
片を回収した。この断片を先に述べたpTN−V2のH
indIII部位に挿入してpTNVAαおよびpTNV
Aβを得た(図12)。このプラスミドはアデノのVA遺
伝子によりSV40の初期プロモーターからの転写産物
の発現効率を高めるようにしたものである。
On the other hand, adenovirus Type II [protein nucleic acid enzyme 27, 12
Monthly issue (1982), published by Kyoritsu Shuppan], VAI and VA
Fragments containing VAI and VAII were recovered from the plasmid ΔpVA containing the approximately 1700 bp SalI-HindIII fragment containing II. This fragment is the H of pTN-V2 described above.
pTNVAα and pTNV inserted into the indIII site
Aβ was obtained (Fig. 12). In this plasmid, the expression efficiency of the transcription product from the SV40 early promoter was enhanced by the adenovirus VA gene.

実施例20 C127細胞の形質転換およびその発現(−
VSE) 実施例19で得たpTN−V2をマウスC127細胞に形
質転換する前に制限酵素BamHIで処理する。
Example 20 Transformation of C127 cells and expression thereof (-
VSE) pTN-V2 obtained in Example 19 is treated with a restriction enzyme BamHI before being transformed into mouse C127 cells.

次いでマウスC127I細胞を上記調製DNAで形質転
換して発現させ(実施例14参照)G−CSF産生能の高
いクローンを選別した。その結果〜1mg/のレベルの
G−CSF生産がみられた。
Then, mouse C127I cells were transformed with the above-prepared DNA for expression (see Example 14), and clones having high G-CSF producing ability were selected. As a result, a G-CSF production level of ˜1 mg / was observed.

更にクローニングを続けていくことにより、10mg/レ
ベルのG−CSF生産能を有するクローンが選別でき
た。同様にして実施例19で得たpTNVAαおよびpT
NVAβでC127細胞をそれぞれ形質転換し、G−C
SF生産能の高いクローンを選別した結果,pTNVA
αについては20mg/以上の高生産クローンを得ること
ができた。またpTNVAβからは数mg/の生産能を
有するクローンを得ることができた。
By continuing the cloning, a clone having a G-CSF productivity of 10 mg / level could be selected. Similarly, pTNVAα and pT obtained in Example 19 were obtained.
C127 cells were respectively transformed with NVAβ, and G-C
As a result of selecting a clone having high SF production ability, pTNVA
Regarding α, a high-producing clone of 20 mg / or higher could be obtained. Also, a clone having a productivity of several mg / can be obtained from pTNVAβ.

尚、宿主細胞には上記のC127I細胞のほかにNIH
3T3細胞も用いることができる。
In addition to the above C127I cells, NIH is used as a host cell.
3T3 cells can also be used.

実施例21CHO細胞によるG−CSFの発現(−VS
E) 1)pHGV2−dhfrの構築 実施例18で得たpHGV2プラスミド20μgから実施例
15の1)に記載した方法によって得られる約2.7kbの断
片とPAdD26SVpAの断片のそれぞれ0.5μgず
つをアニールした。このプラスミドをE.coli D
HI株に塩化ルビジウム法により形質転換してpHGV
2−dhfrのプラスミドを保持するコロニーを選択し
た。得られたプラスミドをpHGV2−dhfrと命名
した(図13a)。
Example 21 Expression of G-CSF by CHO cells (-VS
E) 1) Construction of pHGV2-dhfr From the pHGV2 plasmid 20 μg obtained in Example 18 to Example
0.5 μg each of the approximately 2.7 kb fragment and the PAdD26SVpA fragment obtained by the method described in 1) of 15) were annealed. This plasmid was transformed into E. coli D
HI strain was transformed by the rubidium chloride method to pHGV
Colonies harboring the 2-dhfr plasmid were selected. The resulting plasmid was named pHGV2-dhfr (Fig. 13a).

尚、上記の別法として、pHV2プラスミドをSalI
処理し、EcoRIリンカーを付加することなしにEc
oRIで部分消化し、約2.7kbの断片を回収し、E.
coli DNAポリメラーゼ−Klenow断片で該
DNA断片を処理し末端をブラントエンド化した。
As an alternative method to the above, the pHV2 plasmid was replaced with SalI.
Ec without treatment and without the addition of an EcoRI linker
It was partially digested with oRI and a fragment of about 2.7 kb was recovered.
The DNA fragment was treated with E. coli DNA polymerase-Klenow fragment to blunt end the ends.

一方前述と同じ方法でPAdD26SVpAのブラント
エンド化したEcoRI断片を調製し、両者をT4DN
Aリガーゼ処理してpHGV2−dhfrを調製するこ
ともできた。
On the other hand, a blunt-ended EcoRI fragment of PAdD26SVpA was prepared by the same method as described above, and both were treated with T4DN.
It was also possible to prepare pHGV2-dhfr by treating with A ligase.

また実施例19の1)で得られたpHGV2(H)を実施例
13の2)で記載した如く制限酵素、HindIIIおよびS
alIにて処理し、HindIII−SalI断片を上記
pAdD26SVpAのブラントエンド化したEcoR
I断片に連結してもpHGV2−dhfrを得ることが
できた(図13b)。
In addition, pHGV2 (H) obtained in 1) of Example 19 was used in the Example.
As described in 13-2), the restriction enzymes HindIII and S
EcoR in which the HindIII-SalI fragment was blunt-ended with the above pAdD26SVpA after treatment with alI.
It was possible to obtain pHGV2-dhfr even when ligated to the I fragment (Fig. 13b).

2).pV2DR1およびpV2DR2の構築 1)の項で述べたpAdD26SVpA10gを50mM T
ris−HCl(pH7.5)、7mM MgCl、100m
M NaCl、7mM 2−メルカプトエタノール、0.
01%BSAを含む反応液50mlに溶解し、制限酵素Eco
RIおよびBamHIそれぞれ10単位を加え、37℃10時
間反応させた。常法に従いフェノール処理、エーテル洗
浄を行った。1%低融点アガロース電気泳動にて、約2
KbのDNA断片を回収した後、DNAポリメラーゼK
lenow断片にて、常法に従いブラントエンド化し
て、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行った。
2). Construction of pV2DR1 and pV2DR2 10 g of pAdD26SVpA described in the section 1) was added to 50 mM T
ris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 100 m
M NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 0.
Dissolve in 50 ml of reaction solution containing 01% BSA and use the restriction enzyme Eco
RI and BamHI (10 units each) were added and reacted at 37 ° C. for 10 hours. Phenol treatment and ether washing were performed according to a conventional method. Approximately 2 by 1% low melting point agarose electrophoresis
After recovering the Kb DNA fragment, DNA polymerase K
The lenow fragment was blunt-ended according to a conventional method, treated with phenol, washed with ether, and precipitated with ethanol.

一方、実施例19の1)で得られたpHGV2(H)10μg
を10mM Tris−HCl(pH7.5)、7mM Mg
Cl、60mM NaClを含む反応液50μlに溶解
し、HindIII10単位を加えて37℃、6時間反応さ
せた。常法に従い1%低融点アガロース電気泳動にてD
NA断片を回収し、更に、BAP処理をした後、Kle
now断片にてブラントエンド化した。フェノール処
理、エーテル洗浄を行った後、先に述べた約2KbのD
NA断片とT4DNAリガーゼを用いてブラントエンド
結合させた。即ち、それぞれのDNA断片1μgを66m
M Tris−HCl(pH7.5)、6.6mM MgC
、5mM DTT、1mM ATPを含む反応液30
μlに溶解せしめ、T4DNAリガーゼ50単位を加え、
6℃、12時間反応せしめた後、E.coliDHI株に
形質転換した。このようにして、図13cに示すpV2D
R1およびpV2DR2を得た。
On the other hand, 10 μg of pHGV2 (H) obtained in 1) of Example 19
10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM Mg
It was dissolved in 50 μl of a reaction solution containing Cl 2 and 60 mM NaCl, 10 units of HindIII was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 6 hours. D by 1% low melting point agarose electrophoresis according to standard method
After recovering the NA fragment and further subjecting it to BAP treatment, Kle
It was blunt-ended with the now fragment. After phenol treatment and ether washing, D of about 2Kb as described above
Blunt end ligation was performed using the NA fragment and T4 DNA ligase. That is, 1 μg of each DNA fragment is 66 m
M Tris-HCl (pH7.5), 6.6 mM MgC
Reaction solution containing l 2 , 5 mM DTT, 1 mM ATP 30
Dissolve in μl, add 50 units of T4 DNA ligase,
After reacting at 6 ° C. for 12 hours, E. E. coli strain DHI. Thus, the pV2D shown in FIG.
R1 and pV2DR2 were obtained.

3)形質転換と発現 上記1)で調製したpHGV2−dhfrプラスミドを用
いて、実施例15の3)に記載の方法と同様にしてCHO細
胞株を形質転換して発現させた。
3) Transformation and expression Using the pHGV2-dhfr plasmid prepared in 1) above, a CHO cell line was transformed and expressed in the same manner as in 3) of Example 15.

なお、CHO細胞の形質転換はCHO細胞に対しpHG
V2とpAdD26SVpAを同時形質転換(Co transf
ormation)することによっても行うことができる。
In addition, the transformation of CHO cells was performed using pHG for CHO cells.
V2 and pAdD26SVpA co-transformed (Co transf
Ormation) can also be performed.

また、以下に述べる方法にによってもCHO細胞の形質
転換を行った。即ち、上記2)の項で調製したpV2DR
1あるいはpV2DR2をあらかじめそれぞれSalI
およびKpnIで処理してDNA断片を得て、そのうち
10μgを上記と同様にCHO細胞に形質転換させた。こ
のようにして形質転換された細胞を選択培地にて上記の
如く培養を続けると約7日目で明らかなコロニーが1プ
レートにつき100個以上出現した。コロニーを一つ一つ
選別することなしに、再び新しいプレートに移しかえた
後、0.01μM MTX存在下に選択培地が培養を続ける
と、十数個のコロニーが出現した。更にこのような手法
によりMTXの濃度を0.02μM、0.05μM、0.01μMと
上昇させ、生き残ってきたコロニーを選別した。また、
得られた十数個のコロニーをそれぞれ選別した後、MT
X濃度を上昇させても同様のコロニーの選別を行うこと
ができた。
CHO cells were also transformed by the method described below. That is, pV2DR prepared in the above 2)
1 or pV2DR2 in advance with SalI
And KpnI to obtain a DNA fragment.
10 μg was transformed into CHO cells as above. When the cells thus transformed were continued to be cultured in the selective medium as described above, 100 or more clear colonies appeared per plate on about the 7th day. After selecting the colonies one by one and transferring them to a new plate again, when the selective medium was continued to be cultured in the presence of 0.01 μM MTX, dozens of colonies appeared. Furthermore, the MTX concentration was increased to 0.02 μM, 0.05 μM, and 0.01 μM by such a method, and the surviving colonies were selected. Also,
After selecting each of the obtained dozens of colonies, MT
Even if the X concentration was increased, similar colony selection could be performed.

又、いわゆるポリシストロニック遺伝子を有する組換え
ベクターを構築し、これを用いてCHO細胞を形質転換
することができた。即ち、pAdD26SVpAをPs
tI処理し、2つの断片を回収しこれらとpBRV2由
来のCSF cDNA断片を結合することにより、アデ
ノウィルスプロモーター、CSF cDNA、DHF
R,SV40のポリA部位の順序に配列した組換えベク
ターを構築しCHO細胞にいれて実施した。
In addition, a recombinant vector having a so-called polycistronic gene was constructed, and this could be used to transform CHO cells. That is, pAdD26SVpA is set to Ps
By treating with tI, recovering the two fragments, and ligating these with the pBRV2-derived CSF cDNA fragment, adenovirus promoter, CSF cDNA, DHF
A recombinant vector in which the poly A sites of R and SV40 were arranged in this order was constructed and put into CHO cells, and then carried out.

実施例22発現物質のG−CSF活性検定(−VSE) 実施例20および実施例21で得られたC127細胞及びC
HO細胞の培養上清から、実施例16に記載の方法と同様
にしてヒトG−CSFを得、そのヒトG−CSF活性を
検定した。その結果は表−3の通りであった。
Example 22 G-CSF activity assay (-VSE) of expressed substance C127 cells and C obtained in Example 20 and Example 21
Human G-CSF was obtained from the culture supernatant of HO cells in the same manner as in Example 16, and its human G-CSF activity was assayed. The results are shown in Table-3.

実施例23アミノ酸分析および糖分析(−VSE) 1)アミノ酸組成の分析 実施例22で得た粗CSF試料を更に実施例2の(iii)の
方法にしたがって精製した。この精製CSF試料を実施
例17の1)に記載の方法によってアミノ酸組成分析に付し
た。この結果を表−4に示す。
Example 23 Amino Acid Analysis and Sugar Analysis (-VSE) 1) Analysis of Amino Acid Composition The crude CSF sample obtained in Example 22 was further purified according to the method of Example 2 (iii). This purified CSF sample was subjected to amino acid composition analysis by the method described in Example 17 1). The results are shown in Table-4.

2)糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製CSF試料をもちい
て、実施例17の2)に記載したのと同じ方法及び同じ分析
条件によって糖組成を分析した。分析の結果、本発明の
CSFからガラクトース、N−アセチルガラクトサミン
及びシアル酸が確認された。
2) Sugar composition analysis The sugar composition was analyzed by the same method and the same analysis conditions as described in 2) of Example 17 using the purified CSF sample used in the above amino acid composition analysis. As a result of the analysis, galactose, N-acetylgalactosamine and sialic acid were confirmed from the CSF of the present invention.

実施例24 COS細胞用染色体由来遺伝子含有組換えベ
クターの構築 実施例11で得られた図5で示される染色体遺伝子を含む
プラスミドpBRCE3βをEcoRIで処理した。一
方Banerji等の文献(Cell 27巻299頁(1981))に記載さ
れているpSVHプラスミドをKpnIで処理し
てグロビン遺伝子を除き、さらにHindIIIで部分消
化してSV40の後期遺伝子の一部を除いた後、再結合
させて発現用ベクターpML−Eを調製した。
Example 24 Construction of chromosome-derived gene-containing recombinant vector for COS cells The plasmid pBRCE3β containing the chromosomal gene shown in FIG. 5 obtained in Example 11 was treated with EcoRI. On the other hand, the pSVH + K + plasmid described in Banerji et al. (Cell 27, 299 (1981)) was treated with KpnI to remove the globin gene, and then partially digested with HindIII to partially digest the late gene of SV40. Was removed and then religated to prepare an expression vector pML-E + .

このベクターを、制限酵素EcoRIで処理した後、ア
ルカリホスファターゼ(宝酒造社製)で脱リン酸して得
られたベクターDNAをT4DNAリガーゼ(宝酒造社
製)を加えて上記染色体DNA断片と結合させ、pML
CE3αを得た。図14に示される如くこのプラスミド
は、SV40遺伝子のエンハンサー、SV40の複製開
始領域、pBR322の複製開始領域およびpBR32
2由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子(Amp)を含むプ
ラスミドで、SV40遺伝子のエンハンサー下流にヒト
G−CSF染色体遺伝子が接続されている。
This vector was treated with a restriction enzyme EcoRI, and then dephosphorylated with alkaline phosphatase (Takara Shuzo), and the resulting vector DNA was ligated with the above chromosomal DNA fragment by adding T4 DNA ligase (Takara Shuzo) to obtain pML.
CE3α was obtained. As shown in FIG. 14, this plasmid contains SV40 gene enhancer, SV40 replication initiation region, pBR322 replication initiation region and pBR32.
A human G-CSF chromosomal gene is connected downstream of the enhancer of the SV40 gene in a plasmid containing the β-lactamase gene (Amp r ) derived from 2.

実施例25 COS細胞でのヒトG−CSF染色体遺伝子
の発現 仔牛血清10%を含むDMEM(日水製薬社製,ダルベッ
コ変法イーグル培地「ニッスイ」)培地(10ml)を用い
て、直径9cmのペトリ皿(Nunc社製)中で約70%密にま
で増殖させたCOS−1細胞(米国,Cold Spring Harb
or 研究所Dr.Gluzmanより譲受)をリン酸−カルシウム
法(Wigler等;Cell14巻725頁(1978))およびDEAE−
デキストラン:クロロキン法(例えば、Gordon等;Scie
nce 228巻810頁(1985)を参照)によって形質転換した。
Example 25 Expression of Human G-CSF Chromosome Gene in COS Cells Using a DMEM (Nissui Pharmaceutical Co., Dulbecco's modified Eagle medium "Nissui") medium (10 ml) containing 10% fetal calf serum, Petri having a diameter of 9 cm was used. COS-1 cells (Cold Spring Harb, USA) grown to approximately 70% dense in a dish (Nunc)
or assigned from Dr. Gluzman of the Institute) phosphate-calcium method (Wigler et al .; Cell 14 725 (1978)) and DEAE-
Dextran: chloroquine method (eg Gordon et al .; Scie
nce 228 , p. 810 (1985)).

リン酸−カルシウム法の場合は以下の如く実施した。In the case of the phosphate-calcium method, it was carried out as follows.

実施例24で調製したプラスミドpMLCE3α160μg
をTE溶液320μlに溶解せしめ、3.2mlの蒸溜水を加え
た後さらに504μlの2MCaClを加えた。
Plasmid pMLCE3α 160 μg prepared in Example 24
Was dissolved in 320 μl of TE solution, 3.2 ml of distilled water was added, and then 504 μl of 2M CaCl 2 was added.

この溶液に4mlの2×HBS[50mM Hepes,28
0mM NaCl,1.5mMリン酸緩衝液,(pH7.12)]
を加えて20〜30分間氷冷した後、COS−1細胞の増殖
したペトリ皿1枚につき1mlずつ滴下した。37℃のCO
インキュベーターにて4時間培養させた後、無血清の
DMEM培地で細胞を洗浄し、次いで20%のグリセロー
ルを含むDMEM培地5mlを加えて室温で約3分間放置
し、再び無血清のDMEM培地で洗浄した。無血清のD
MEM培地を除いた後、仔牛血清10%を含むDMEM培
地10mlを加えて一夜COインキュベーター中で培養
し、再び同培地にて培地交換を行ってさらに3日間培養
した。
Add 4 ml of 2 x HBS [50 mM Hepes, 28
0 mM NaCl, 1.5 mM phosphate buffer, (pH7.12)]
Was added and ice-cooled for 20 to 30 minutes, and then 1 ml was added dropwise to each Petri dish in which COS-1 cells were grown. CO at 37 ℃
After culturing for 4 hours in a 2 incubator, the cells were washed with serum-free DMEM medium, then 5 ml of DMEM medium containing 20% glycerol was added and left at room temperature for about 3 minutes, and again with serum-free DMEM medium. Washed. Serum-free D
After removing the MEM medium, 10 ml of DMEM medium containing 10% fetal calf serum was added, and the cells were cultured overnight in a CO 2 incubator, and the medium was exchanged again with the same medium for further 3 days of culture.

DEAE−デキストラン:クロロキン法を用いた場合は
以下の如くである。
When the DEAE-dextran: chloroquine method is used, it is as follows.

リン酸カルシウム法と同様にCOS−1細胞を70%密に
まで培養し、無血清のDMEM培地で細胞を2回洗浄し
た。これに250μg/mlのDEAE−デキストランおよ
び実施例24で調製した2μg/mlのプラスミドpMLC
E3αを含む無血清DMEM培地を加え、37℃,12時間
培養した。次いで、細胞を無血清DMEM培地で2回洗
浄し、10%仔牛血清と1mMクロロキンを含むDMEM
培地にて、37℃,2時間培養を続けた。その後細胞を無
血清のDMEM培地で2回洗浄した後、10%仔牛血清を
含むDMEM培地を添加し、37℃にて3日間培養した。
Like the calcium phosphate method, COS-1 cells were cultivated to 70% confluence, and the cells were washed twice with serum-free DMEM medium. To this was added 250 μg / ml DEAE-dextran and 2 μg / ml plasmid pMLC prepared in Example 24.
A serum-free DMEM medium containing E3α was added, and the mixture was cultured at 37 ° C for 12 hours. Then, the cells were washed twice with serum-free DMEM medium, and DMEM containing 10% fetal calf serum and 1 mM chloroquine was added.
Culture was continued in the medium at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the cells were washed twice with serum-free DMEM medium, then DMEM medium containing 10% fetal calf serum was added, and the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days.

このようにして得られたCOS−1細胞の培養上清を1
N酢酸によりpH4に調整し、等容量のn−プロパノール
を加えた後、生じた沈澱を遠心除去し、C8逆相系担体
(山村化学社製)を充填したオープンカラム(1φ×2
cm)に通し、50%n−プロパノールで溶出させた。溶出
液を水で2倍に希釈した後、YMC−C8カラム(山村
化学社製)を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー
にて0.1%TFAを含む30〜60%の直線濃度勾配のn−
プロパノールで溶出させた。n−プロパノール濃度が40
%付近の位置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥
し、0.1Mグリシジン緩衝液(pH9)に溶解せしめた。
このような経過を経ることによって、ヒトG−CSFは
COS−1細胞上清から約20倍に濃縮された。
The culture supernatant of COS-1 cells thus obtained was
The pH was adjusted to 4 with N acetic acid, an equal volume of n-propanol was added, the resulting precipitate was removed by centrifugation, and an open column (1φ × 2) packed with a C8 reverse phase carrier (manufactured by Yamamura Chemical Co., Ltd.)
cm) and eluted with 50% n-propanol. The eluate was diluted twice with water, and then subjected to reverse phase high performance liquid chromatography using a YMC-C8 column (manufactured by Yamamura Chemical Co., Ltd.) to obtain a linear concentration gradient n- of 30 to 60% containing 0.1% TFA.
Elute with propanol. n-propanol concentration is 40
The fraction eluted at a position of about% was collected, lyophilized and dissolved in 0.1 M glycidin buffer (pH 9).
Through such a process, human G-CSF was concentrated about 20 times from the COS-1 cell supernatant.

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトG−CS
F染色体遺伝子を含まないpML−EでCOS−1細
胞を形質転換した後、その培養上清を濃縮した。
As a control, human G-CS according to the method described above
COS-1 cells were transformed with pML-E + containing no F chromosome gene, and the culture supernatant was concentrated.

得られた標品について参考例に記載された「ヒトG−C
SAの測定方法(a)」に基づいた方法にてヒトG−C
SF活性を検定した。結果は表−5の通りであった。
The "human G-C" described in Reference Example for the obtained preparation was obtained.
Human GC by a method based on SA measurement method (a) ”
SF activity was assayed. The results are shown in Table-5.

実施例26 C127細胞によるヒトG−CSF染色体遺
伝子の発現 実施例24で得られたpMLCE3αプラスミドをEco
RIで処理し、前出のMolecular Cloningに記載された
方法によって、約4Kbの断片を回収して染色体由来の
G−CSF遺伝子の源とする。
Example 26 Expression of human G-CSF chromosomal gene by C127 cells The pMLCE3α plasmid obtained in Example 24 was transformed with Eco.
After treatment with RI, a fragment of about 4 Kb is recovered as a source of the G-CSF gene derived from the chromosome by the method described in Molecular Cloning, supra.

これをDNAポリメラーゼI−Klenow断片で処理
し、ブラントエンドにしておく(A)。
This is treated with DNA polymerase I-Klenow fragment to leave it as a blunt end (A).

一方、実施例12で調製したpHGA410プラスミドか
ら、上記と同様Molecular Cloningの方法によりSV4
0プロモーター部分(EcoRI−EcoRIの約0.4
Kb断片)を切り出し、DNAポリメラーゼI−Kle
now断片で処理する(B)。
On the other hand, SV4 was prepared from the pHGA410 plasmid prepared in Example 12 by the same molecular cloning method as above.
0 promoter part (EcoRI-about 0.4 of EcoRI
Kb fragment), and DNA polymerase I-Kle
Treat with now fragment (B).

更に、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV)を有するプラスミ
ドpdBPV−1(Sarver,N.,Sbyrne,J.C&Howley,P.M.
(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 79巻7147〜7151;Dr H
owleyより入手)をHindIIIおよびPvuIIで処理し
約8.4KbのDNA断片を得、これをDNAポリメラー
ゼI−Klenow断片処理後、バクテリヤアルカリフ
ォスファターゼにて脱リン酸しておく(C)。
In addition, the plasmid pdBPV-1 containing bovine papilloma virus (BPV) (Sarver, N., Sbyrne, JC & Howley, PM.
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci., USA Volume 79 7147-7151; Dr H
(obtained from owley) is treated with HindIII and PvuII to obtain a DNA fragment of about 8.4 Kb, which is treated with DNA polymerase I-Klenow fragment and then dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (C).

以上の(A),(B)及び(C)のDNAを各々0.1μ
gずつ20μlの反応液(50mM Tris−HCl(pH
7.6)、10mM MgCl,10mM DTT,1mM
ATP)に溶解し、T4DNAリガーゼ180単位を加
えて、4℃に一晩反応した。
The above DNAs (A), (B) and (C) are each 0.1 μm
20 μl of reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH
7.6), 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM
ATP), 180 units of T4 DNA ligase was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. overnight.

この反応液を用い、前出のMolecular Cloningに記載さ
れた塩化ルビジウム法によりpTNCE3αプラスミド
を得た。
Using this reaction solution, the pTNCE3α plasmid was obtained by the rubidium chloride method described in Molecular Cloning above.

なお、染色体由来のG−CSF遺伝子の源としては、上
記(A)のかわりに、pMLCE3α20μgを10mM
Tris−HCl(pH8.0),7mM MgCl,100
mM NaCl,7mM2−メルカプトエタノール,0.
01%BSAの混合液100μlに溶解し、StuI20単位
を加え、37℃,5時間インキュベートした後、1.2%ア
ガロースゲル電気電気泳動にて約1.78KbのDNA断片
を得て、この断片を用いてもよい。
As the source of the G-CSF gene derived from the chromosome, 20 μg of pMLCE3α was replaced with 10 mM instead of the above (A).
Tris-HCl (pH8.0), 7 mM MgCl 2 , 100
mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 0.
It was dissolved in 100 μl of a mixed solution of 01% BSA, 20 units of StuI was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 hours, and then a DNA fragment of about 1.78 Kb was obtained by 1.2% agarose gel electrophoresis. Good.

このようにして得たpTNCE3αプラスミドで実施例
14と同様にしてマウスC127I細胞を形質転換し、発
現させ、G−CSF生産能の高いクローンを選別した。
The pTNCE3α plasmid thus obtained was used in the examples
Mouse C127I cells were transformed and expressed in the same manner as in 14, and a clone having high G-CSF producing ability was selected.

実施例27 CHO細胞によるヒトG−CSF染色体遺伝
子の発現 実施例26のC127細胞の場合と同様にpMLCE3α
プラスミドをStuIで処理して約1.78KbのDNA断
片を回収するか、或いはEcoRI処理して約4Kbの
EcoRI断片を回収して染色体由来のG−CSF遺伝
子の源とする。
Example 27 Expression of human G-CSF chromosomal gene by CHO cells As in the case of C127 cells in Example 26, pMLCE3α was expressed.
The plasmid is treated with StuI to recover a DNA fragment of about 1.78 Kb, or treated with EcoRI to recover an EcoRI fragment of about 4 Kb as a source of the G-CSF gene derived from the chromosome.

これとDNAポリメラーゼI−Klenow断片で処理
しておく(a)。
This is treated with DNA polymerase I-Klenow fragment (a).

また、実施例26と同じく、pHGA410からSV40
プロモーター部分(EcoRI−EcoRI断片)を切
り出して、約0.4Kbの断片を得て、同様にDNAポリ
メラーゼI−Klenow断片処理をしておく(b)。
Also, as in Example 26, pHGA410 to SV40
The promoter part (EcoRI-EcoRI fragment) is cut out to obtain a fragment of about 0.4 Kb, which is similarly treated with DNA polymerase I-Klenow fragment (b).

一方、pAdD26SVpAプラスミド(Kaufman,R.G.
& Sharp,P.A(1982)Mol.Cell.Biol,2巻1304〜1319)を
EcoRIで処理した後、DNAポリメラーゼI−Kl
enow断片で処理し、続いてバクテリアアルカリフォ
スファターゼ処理して脱リン酸する(c)。
On the other hand, pAdD26SVpA plasmid (Kaufman, RG
& Sharp, PA (1982) Mol. Cell. Biol, vol. 2, 1304-1319) was treated with EcoRI, and then DNA polymerase I-Kl was used.
Treatment with Enow fragment followed by bacterial alkaline phosphatase to dephosphorylate (c).

上記の(a),(b)および(c)を各々0.1μgずつ2
0μlの反応液(50mM Tris−HCl(pH7.6),
10mMMgCl,10mMDTT,1mM ATP)に
溶解し、T4DNAリガーゼ180単位を加え、4℃にて
一晩反応せしめた。
0.1 μg each of (a), (b) and (c) above 2
0 μl of reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.6),
It was dissolved in 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP), 180 units of T4 DNA ligase was added, and the reaction was carried out at 4 ° C. overnight.

次いで、その反応液を前出のMolecular Cloningに記載
された塩化ルビジウム法により、E.coliDHI株
に形質転換しTetのコロニーを得て、プラスミドp
D26SVCE3αを含む菌を選択した。
Then, the reaction solution was treated with E. coli by the rubidium chloride method described in the above Molecular Cloning. E.coli DHI strain to obtain Tet r colonies, and to obtain plasmid p
Bacteria containing D26SVCE3α were selected.

プラスミドpD26SVCE3αは図15に示す通りSV
40の初期遺伝子にCSF遺伝子を連結し、更にアデノ
ウイルス主後期プロモーターの下流にDHFR遺伝子を
連結した形となっている。
The plasmid pD26SVCE3α is SV as shown in FIG.
The CSF gene is linked to the 40 early genes, and the DHFR gene is linked to the downstream of the adenovirus major late promoter.

一方、pAdD26VpAを実施例15の2)で述べた如く
EcoRIおよびBamHIで処理して得られた約2K
bのDHFR遺伝子を含むDNA断片と上述の(a)お
よびpHGA410(H)のEcoRI−SalI断片
と連結させることによりAmpの発現ベクターpDR
CE3α(図15)を構築した。
On the other hand, about 2K obtained by treating pAdD26VpA with EcoRI and BamHI as described in 2) of Example 15
The expression vector pDR of Amp r by ligating the DNA fragment containing the DHFR gene of b with the EcoRI-SalI fragment of (a) and pHGA410 (H) above.
CE3α (FIG. 15) was constructed.

このpD26SVCE3αプスミドおよびpDRCE3
αプラスミドを実施例15と同様にしてCHO細胞に形質
転換しMTX選択を繰り返してG−CSF生産株を得
た。
This pD26SVCE3α psmid and pDRCE3
The α plasmid was transformed into CHO cells in the same manner as in Example 15, and MTX selection was repeated to obtain a G-CSF producing strain.

実施例28 発現物質のG−CSF活性検定(ヒト染色体
由来遺伝子) 実施例26および実施例27で得られたC127細胞および
CHO細胞の培養上清から、実施例25に記載の方法と同
様にしてヒトG−CSFを得、そのヒトG−CSF活性
を検定した。その結果は表−6の通りであった。
Example 28 G-CSF activity assay for expressed substances (human chromosome-derived gene) From the culture supernatants of C127 cells and CHO cells obtained in Examples 26 and 27, the same method as described in Example 25 was performed. Human G-CSF was obtained and its human G-CSF activity was assayed. The results are shown in Table-6.

実施例29 ヒトG−CSFの感染防御効果 <試験方法> 1.シュードモナス アエルギノーザ(Pseudom onas ae
ruginosa)感染に対する防御効果 8〜9週令(体重35.3±1.38g)のIICR系
マウス(雄)にエンドキサン(シオノギ社社製、商品
名)200mg/Kgを腹腔内投与した後3群に分け、その2
群にヒトG−CSF(25000u/マウス又は50000u/マ
ウス)を含む溶媒(生理食塩水中1%プロパノール、0.
5%(W/V)マウス血清アルブミン)を、そして別の
1群には溶媒のみを、それぞれ24時間毎に0.1mlずつ4
回皮下投与した。4回目の投与後3時間して各々の群に
シュードモナス アエルギノーザ(Pseudomonas aerugin
osa)GNB−139(3.9×10CFU/マウス)を皮下投
与して感染させた。感染後21時間して、さらにもう一度
ヒトG−CSF(25000u/マウス又は50000u/マウ
ス)を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮
下投与した。
Example 29 Infection protective effect of human G-CSF <Test method> 1. Pseudomonas aeruginosa
Ruginosa) Protective effect against infection 8 to 9 weeks old (body weight 35.3 ± 1.38 g) IICR mice (male) were intraperitoneally administered with 200 mg / Kg of endoxan (Shionogi Co., Ltd., trade name) 3 groups Divided into 2
Group G containing human G-CSF (25000u / mouse or 50000u / mouse) in a solvent (1% propanol in physiological saline, 0.
5% (w / v) mouse serum albumin), and another group with solvent only, 0.1 ml every 24 hours.
It was administered subcutaneously once. Three hours after the 4th administration, Pseudomonas aerugin (Pseudomonas aerugin
osa) GNB-139 (3.9 × 10 5 CFU / mouse) was subcutaneously administered to infect. Twenty-one hours after the infection, a solvent containing human G-CSF (25000 u / mouse or 50,000 u / mouse) or only the solvent was subcutaneously administered to the corresponding groups.

感染後10日目まで生存マウス数により感染防御効果を調
べた。
The infection protective effect was examined by the number of surviving mice until 10 days after infection.

(菌液の調製) ハートインフュージョン液体培地(Difco社製、商
品名)を用いて37℃で一夜シュードモナース アエルギ
ノーザGNB−139を振とう培養する。培養液を生理食
塩水に懸濁させて調製した。
(Preparation of Bacterial Solution) Pseudomonas aeruginosa GNB-139 was shake-cultured overnight at 37 ° C. in a heart infusion liquid medium (manufactured by Difco, trade name). The culture solution was prepared by suspending it in physiological saline.

<結果> 実施例17のアミノ酸組成分析に用いたのと同じCHO
細胞由来の精製ヒトG−CSF試料(+VSE)につい
て上記試験を行った。
<Results> The same CHO used in the amino acid composition analysis of Example 17
The above test was performed on a purified human G-CSF sample (+ VSE) derived from cells.

その結果を表−7に示す。The results are shown in Table-7.

同様にして前記実施例17のアミノ酸組成分析に用いたの
と同じC127細胞由来の精製ヒトG−CSF試料を用
いて上記試験の感染防御効果を調べたところ、ほぼ同様
の結果が得られた。
In the same manner, the same protective results of the above test were examined using the same purified human G-CSF sample derived from C127 cells as used in the amino acid composition analysis of Example 17, and almost the same result was obtained.

実施例23のアミノ酸組成分析に用いたのと同じCHO
細胞由来の精製ヒトG−CSF試料(−VSE)につい
て上記試験を行った。
The same CHO used for the amino acid composition analysis of Example 23.
The above test was performed on purified human G-CSF samples (-VSE) derived from cells.

その結果を表−8に示す。The results are shown in Table-8.

同様にして前記実施例23のアミノ酸組成分析に用いたの
と同じC127細胞由来の精製ヒトG−CSF試料を用
いて上記試料の感染防御効果を調べたところ、ほぼ同様
の効果が得られた。
Similarly, when the same purified human G-CSF sample derived from C127 cells used for the amino acid composition analysis of Example 23 was examined for the protective effect against infection of the above sample, almost the same effect was obtained.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明のヒトG−CSF活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子、これを含む組換えベクター、及び該ベ
クターを含む形質転換体によって、大量、均一なヒトG
−CSFの取得が可能となり、待望されていた白血球減
少症や骨髄性白血病の治療剤、或いは造血機能回復促進
剤や感染防御剤等が具現化された効果は極めて大なるも
のがあるといえる。
A gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity of the present invention, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the vector produce a large amount of uniform human G
It is possible to obtain -CSF, and it can be said that the long-awaited therapeutic agent for leukopenia and myeloid leukemia, the hematopoietic function recovery-promoting agent, the infection-preventing agent, and the like have been realized.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

図1はプローブ(IWQ)、プローブ(A)およびプロ
ーブ(LC)の配列を示す。 図2はpHCS−1インサートの塩基配列を示す。 図3(A)はpBRG4のcDNAインサートの塩基配
列を示す。 図3(B)(I)はpBRG4 cDNAから演えきし
たヒトG−CSF前駆体のアミノ酸配列を示す。 図3(B)(II)はpBRG4 cDNAから演えきし
たヒト成熟G−CSFのアシノ酸配列を示す。 図4(A)はpBRV2のcDNAインサートの塩基配
列を示す。 図4(B)(I)はpBRV2 cDNAから演えきし
たヒトG−CSF前駆体のアミノ酸配列を示す。 図4(B)(II)はpBRV2 cDNAから演えきし
たヒト成熟G−CSFのアミノ酸配列を示す。 図5はヒトG−CSFをコードするヒト染色体遺伝子の
塩基配列を示す。 図6はpBRG4またはpBRV2由来ヒトG−CSF
cDNAの制限酵素切断部位を示す。 図7はヒトG−CSFをコードするヒト染色体遺伝子制
限酵素切断部位を示す。 図8はpHGA410の概略構造を示す。 図9は発現用組換えベクターpTN−G4,pTN−G
4VAαおよびpTN−G4VAβの構築プロセスを示
す。 図10aおよび図10bはpHGG4−dhfrの構築プロ
セスを示す。 図10cはpG4DR1およびpG4DR2の構築プロセ
スを示す。 図11はpHGV2の概略構造を示す。 図12は発現用組換えベクターpTN−V2,pTN−V
AαおよびpTN−VAβの構築プロセスを示す。 図13aおよび図13bは発現用組換えベクターpHGV2
−dhfrの構築プロセスを示す。 図13cはPV2DR1およびpV2DR2の構築プロセ
スを示す。 図14はpMLCE3αの概略構造を示す。 図15はpD26SVCE3αとpDRCE3αの概略構
造を示す。
FIG. 1 shows the sequences of probe (IWQ), probe (A) and probe (LC). FIG. 2 shows the nucleotide sequence of pHCS-1 insert. FIG. 3 (A) shows the nucleotide sequence of the pBRG4 cDNA insert. FIG. 3 (B) (I) shows the amino acid sequence of the human G-CSF precursor deduced from pBRG4 cDNA. FIG. 3 (B) (II) shows the asinoic acid sequence of human mature G-CSF deduced from pBRG4 cDNA. FIG. 4 (A) shows the nucleotide sequence of the pBRV2 cDNA insert. FIG. 4 (B) (I) shows the amino acid sequence of the human G-CSF precursor deduced from pBRV2 cDNA. FIG. 4 (B) (II) shows the amino acid sequence of human mature G-CSF deduced from pBRV2 cDNA. FIG. 5 shows the nucleotide sequence of a human chromosomal gene encoding human G-CSF. FIG. 6 shows human G-CSF derived from pBRG4 or pBRV2.
The restriction enzyme cleavage site of cDNA is shown. FIG. 7 shows a human chromosomal gene restriction enzyme cleavage site encoding human G-CSF. FIG. 8 shows a schematic structure of pHGA410. FIG. 9 shows recombinant vectors pTN-G4 and pTN-G for expression.
4 shows the construction process of 4VAα and pTN-G4VAβ. 10a and 10b show the construction process of pHGG4-dhfr. Figure 10c shows the construction process of pG4DR1 and pG4DR2. FIG. 11 shows a schematic structure of pHGV2. FIG. 12 shows recombinant vectors pTN-V2 and pTN-V for expression.
3 shows the construction process of Aα and pTN-VAβ. 13a and 13b show the recombinant vector pHGV2 for expression.
-Shows the construction process of dhfr. Figure 13c shows the construction process of PV2DR1 and pV2DR2. FIG. 14 shows a schematic structure of pMLCE3α. FIG. 15 shows a schematic structure of pD26SVCE3α and pDRCE3α.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 37/02 ABY 8314−4C C07K 13/00 8318−4H C12P 21/02 H 8214−4B (C12P 21/02 C12R 1:91) (31)優先権主張番号 特願昭60−270839 (32)優先日 昭60(1985)12月3日 (33)優先権主張国 日本(JP) 微生物の受託番号 FERM BP−954 微生物の受託番号 FERM BP−955 微生物の受託番号 FERM BP−956─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location // A61K 37/02 ABY 8314-4C C07K 13/00 8318-4H C12P 21/02 H 8214-4B (C12P 21/02 C12R 1:91) (31) Priority claim number Japanese patent application Sho 60-270839 (32) Priority date Sho 60 (1985) December 3 (33) Priority claim country Japan (JP) Accession number FERM BP-954 Microorganism accession number FERM BP-955 Microorganism accession number FERM BP-956

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードするcDN
A。 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu)mCys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro(ただしmは0または
1を表わす)
1. A cDNA encoding a human granulocyte colony stimulating factor containing a base sequence encoding the following amino acid sequence:
A. Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro (where m is 0 or 1)
【請求項2】下記の塩基配列を含む特許請求の範囲第1
項記載のcDNA。 ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG)m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC(ただしmは0または
1を表わす)
2. A first claim containing the following base sequence:
CDNA according to the item. ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG) m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC (where m represents 0 or 1)
【請求項3】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含む顆粒球コロニー刺激因子をコードするcDNAを
含有する組換えベクター。 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu)mCys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro(ただしmは0または
1を表わす)
3. A recombinant vector containing a cDNA encoding a granulocyte colony stimulating factor, which comprises a base sequence encoding the following amino acid sequence. Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro (where m is 0 or 1)
【請求項4】cDNAが下記塩基配列を含む特許請求の
範囲第3項記載の組換えベクター。 ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG)m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC(ただしmは0または
1を表わす)
4. The recombinant vector according to claim 3, wherein the cDNA contains the following nucleotide sequence. ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG) m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC (where m represents 0 or 1)
【請求項5】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードするcDN
Aを含有する組換えベクターで形質転換された哺乳動物
細胞。 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu)mCys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro(ただしmは0または
1を表わす)
5. A cDNA encoding human granulocyte colony stimulating factor containing a base sequence encoding the following amino acid sequence:
A mammalian cell transformed with a recombinant vector containing A. Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Me
t Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp
Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Se
r Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln
Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Gl
u Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cy
s His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu
Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gl
n Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Le
u Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Il
e Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala
Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Se
r Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Va
l Leu Arg His Leu Ala Gln Pro (where m is 0 or 1)
【請求項6】cDNAが下記塩基配列を含む特許請求の
範囲第5項記載の形質転換された哺乳動物細胞。 ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG)m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC(ただしmは0または
1を表わす)
6. The transformed mammalian cell according to claim 5, wherein the cDNA contains the following nucleotide sequence. ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG AT
G GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG
ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TC
C CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA
GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GA
G AAG CTG (GTG AGT GAG) m TGT GCC ACC TAC AAG CTG T
GC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG
GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC C
AG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT
AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC C
TG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC
ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ACC A
TC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC
CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC T
CT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC
TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC G
TT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC (where m represents 0 or 1)
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