JPH0634758B2 - ポリヌクレオチド配列の検出用組成物および検出方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド配列の検出用組成物および検出方法

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JPH0634758B2 JP60188690A JP18869085A JPH0634758B2 JP H0634758 B2 JPH0634758 B2 JP H0634758B2 JP 60188690 A JP60188690 A JP 60188690A JP 18869085 A JP18869085 A JP 18869085A JP H0634758 B2 JPH0634758 B2 JP H0634758B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は、核酸ハイブリッド化の技術を用いる広範囲の
遺伝学的分析に関するものである。これらの遺伝学的分
析は、たとえば外来微生物による感染の診断ならびに特
異的遺伝特性および異常性の検出を包含する。さらに詳
細には本発明は、目的とするポリヌクレオチド配列の存
在の検出に関するものである。
〔従来技術とその問題点〕
試料中の目的とするポリヌクレオチド配列の一般的な検
出方法は、 (a)目的とするポリヌクレオチド配列の少なくとも１部
を単一鎖型となし、 (b)目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
補的であり、かつこれにハイブリッド化することがで
き、さらに検出可能な標識により標識される第一ポリヌ
クレオチド配列からなる組成物を加え、 (c)組成物の少なくとも１部を実質的に単一鎖型とな
し、 (d)目的とするポリヌクレオチド配列をハイブリッド化
させうる条件下で組成物と接触させかつ (e)目的とするポリヌクレオチド配列を検出可能な標識
により検出する ことからなっている。
この方法はしばしば、(1)前記組成物がさらに同一分子
または別の分子のいずれかにおいて目的とするポリヌク
レオチド配列に対し実質的に相補的でなくかつ検出可能
な標識により標識されるような第二ポリヌクレオチド配
列を含む場合、および(2)目的とするポリヌクレオチド
配列が目的としないポリヌクレオチド配列を含む試料中
に潜在的に含有されている場合、有用でない。条件(1)
と(2)との両者が存在する場合、信号検出は、目的とす
るポリヌクレオチド配列が検出されるのかまたは目的と
せずに前記標識された第二ポリヌクレオチド配列に対し
ハイブリッド化しうるポリヌクレオチド配列が検出され
るのかどうか曖昧となる。
例として条件(1)は第一ポリヌクレオチド配列が組換核
酸技術により産生される場合、全く自然に生ずる。組換
核酸技術は、目的とするポリヌクレオチド配列に対し実
質的に相補的でない第二ポリヌクレオチド配列（この場
合ベクター配列）を伴なって第一ポリヌクレオチド配列
を同一分子上で、すなわち組換分子上で経済的に大規模
産生することを可能にする。しばしば、全組換分子を標
識するのは第一ポリヌクレオチド配列のみを標識するよ
りも容易かつ経済的である。しかしながら、これは目的
とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補的でな
い標識された第二ポリヌクレオチド配列（すなわちこの
場合ベクター配列）をも生ずる。
他の例として、条件(1)は目的とするポリヌクレオチド
配列に対し実質的に相補的でない第二ポリヌクレオチド
配列と共に第一ポリヌクレオチド配列がベクター中に挿
入されて単一の組換分子を形成する場合にも生ずる。こ
れは、第一ポリヌクレオチド配列を第二ポリヌクレオチ
ド配列から分離することが困難もしくは不便であり、或
いは第一ポリヌクレオチド配列と第二ポリヌクレオチド
配列との間の境界が未知であるという事実に基づいてい
る。
したがって、上記２つの例のいずれにおいても、目的と
するポリヌクレオチド配列の検出方法を行なう場合、標
識された第二ポリヌクレオチド配列は試料中に含有され
うる相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリッド化する
ことができ、すなわち条件(2)が存在する。これは間違
った結果をもたらしうる。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、(1)試料中の目的とする特異性ポリヌ
クレオチド配列の存在または不存在を検出する場合、お
よび(2)目的とするポリヌクレオチド配列の存在を試料
中に含有されうる目的としないポリヌクレオチド配列の
存在から識別する場合に有効である、ポリヌクレオチド
配列からなる組成物およびその使用方法を提供すること
である。
〔発明の要点〕
本発明は、目的とするポリヌクレオチド配列を目的とし
ないポリヌクレオチド配列を含有しうる試料から検知す
る組成物において、 (a)目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
補的であり、かつこれにハイブリッド化することがで
き、さらに検知可能な第一標識で標識される第一ポリヌ
クレオチド配列と、 (b)目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
補的でなく、または実質的に同一でなく、かつ前記検出
可能な第一標識により標識される第二ポリヌクレオチド
配列と、 (c)前記第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補
的であり、または同一であり、かつ検出可能な第二標識
により標識されないかまたは標識される第三ポリヌクレ
オチド配列と、からなるポリヌクレオチド配列の検出用
組成物を提供する。
さらに、本発明は、目的とするポリヌクレオチド配列を
検査すべき試料中の目的としないポリヌクレオチド配列
の潜在下または顕在下に検出するに際し、 (a)（ｉ）目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質
的に相補的でありかつこれにハイブリッド化することが
でき、さらに検出可能な第一標識により標識される第一
ポリヌクレオチド配列と、 （ii）目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に
相補的でなく、または実質的に同一でなく、かつ前記検
出可能な第一標識により標識される第二ポリヌクレオチ
ド配列と、 （iii）前記第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に
相補的であり、または同一であり、かつ検出可能な第二
標識により標識されないかまたは標識される第三ポリヌ
クレオチド配列と からなる組成物を加え、 (b)検査すべき試料中の目的とする前記ポリヌクレオチ
ド配列および目的としない前記ポリヌクレオチド配列の
少なくとも１部を単一鎖型となし、 (c)前記組成物の少なくとも１部、好ましくはほぼ全部
を単一鎖型となし、 (d)検査すべき試料中の目的とするポリヌクレオチド配
列および目的としないポリヌクレオチド配列をハイブリ
ッド化させうる条件下で前記組成物と接触させ、かつ (e)目的とする前記ポリヌクレオチド配列を前記検出可
能な第一標識によって検出する ことを特徴とするポリヌクレオチド配列の検出方法を提
供する。
本発明は、目的とするポリヌクレオチド配列の検出に関
する。好ましくは、本発明は、診断試料における目的と
するポリヌクレオチド配列の検出に関する。
目的とするポリヌクレオチド配列は、試料中に天然に存
在するまたは試料中に添加された任意のポリヌクレオチ
ド配列とすることができる。これは、細胞系における物
質に存在することができ、或いは細胞系から誘導するこ
ともできる。これは、ウイルスもしくはビロイドまたは
ウイルス状粒子としての亜細胞成分とすることもでき
る。さらに、これはデオキシリボ核酸配列またはリボ核
酸配列であってもよい。またこれは単一鎖であっても或
いは二重鎖であってもよい。またこれは、病原体に由来
するものであってもよい。さらにこれは、たとえばナイ
セリア・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)また
はナイセリア・ゴノロエア(Neisseria gonorrhoea)のよ
うな原核生物；たとえばヒトのような真核生物、或いは
たとえば単純疱疹ウイルスＩもしくは単純疱疹ウイルス
IIのようなウイルス、或いはたとえばＢ−ラクタマーゼ
特異性プラスミドのような特殊の染色体遺伝要素の配列
とすることもできる。目的とするポリヌクレオチド配列
は、ゲノムの全体または任意の部分から生ずることもあ
る。
ポリヌクレオチド配列の組成物 本発明は、核酸ハイブリッド化に有用なポリヌクレオチ
ド配列の組成物に関するものである。この組成物は、目
的とする特異性ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
補的であり、かつこれにハイブリッド化することがで
き、さらに検出可能な第一標識により標識される第一ポ
リヌクレオチド配列と、目的とする前記ポリヌクレオチ
ド配列に対し実質的に相補的でなく、または実質的に同
一でなくかつ前記検出可能な第一標識により標識される
第二ポリヌクレオチド配列と、第二ポリヌクレオチド配
列に対し実質的に相補的であり、または実質的に同一で
あり、かつ検出可能な第二標識により標識されないか、
または標識される第三ポリヌクレオチド配列とからなっ
ている。
第一および第二ポリヌクレオチド配列は別々の分子とし
て存在することができ、或いは共有結合することもでき
る。第三ポリヌクレオチド配列は別の分子として存在す
る。
本発明の組成物における第一，第二および第三ポリヌク
レオチド配列はデオキシリボ核酸またはリボ核酸配列と
することができ、かつ単一鎖分子または二重鎖分子のい
ずれであってもよい。ポリヌクレオチド配列は、当業者
に公知の任意の方法、たとえば合成産生方法または酵素
的産生方法によってインビトロおよびインビボの両者で
産生させまたは得ることができる。
本発明の方法を行なう場合、本発明の組成物における第
三ポリヌクレオチド配列の存在は、検査される試料中に
存在し第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補的
である任意のポリヌクレオチド配列に対する第二ポリヌ
クレオチド配列のハイブリッド化を阻止するように作用
する。この阻止作用は、第二ポリヌクレオチド配列が間
違った結果をもたらす傾向を制限する。
ベクター配列としての第二ポリヌクレオチド配列 本発明の１具体例において、目的とするポリヌクレオチ
ド配列に対し実質的に相補的であり、かつこれにハイブ
リッド化しうる第一ポリヌクレオチド配列は標準的組換
核酸技術によりベクター中にクローン化されて組換分子
を形成する。
かくして、組換分子は、本発明のこの具体例において第
一ポリヌクレオチド配列と第二ポリヌクレオチド配列、
すなわちベクターとからなっている。
ベクターはプラスミド，コスミド，細菌性ウイルスまた
は動物ウイルスとすることができる。ベクターはリボ核
酸またはデオキシリボ核酸であってもよい。さらにベク
ターは、単一鎖であっても或いは二重鎖であってもよ
い。
組換分子の１部である第一ポリヌクレオチド配列は、た
とえば大腸菌（イー・コリ）のような宿主の内部で発酵
により経済的に多量に産生させることができる。組換分
子は標準法により精製することができる。
検査すべき試料中の目的とするポリヌクレオチド配列を
検出するには、組換分子中に存在する第一ポリヌクレオ
チド配列を検出可能な第一標識により標識するのが望ま
しい。これは２種以上の方法で行なうことができる。
１つの方法において、第一ポリヌクレオチド配列は、た
とえば組換分子を制限酵素により切断した後にアガロー
スゲル電気泳動にかけてベクターから大部分分離され、
抽出されかつ標識される。かくして、ほぼ第一ポリヌク
レオチド配列のみが標識され、ベクターは標識されな
い。
第二のより経済的な方法においては、全組換分子を標識
する。この方法は、たとえば標識されたヌクレオチド三
燐酸の存在下でＤＮＡ酵素ＩおよびＤＮＡポリメラーゼ
を用いてニック翻訳により行なうことができる〔ピー・
ダブリュー・リグビー等、ジャーナル・モレキュラ・バ
イオロジー、第１１３巻、第２３７頁(1977)〕。この結
果、組換分子（すなわち第一および第二ポリヌクレオチ
ド配列）が生じ、これは均一に標識される。
第二の方法は、第一の方法により生ずる多くの欠点を持
たない。最良の場合にも第一の方法は極めて面倒であ
り、各工程、特にゲル電気泳動の工程は極めて時間がか
かる。しばしばゲル電気泳動の工程は第一ポリヌクレオ
チド配列の純粋な分離を確保するには反復する必要があ
る。たとえそうしても、第一ポリヌクレオチド配列が微
量の第二ポリヌクレオチド配列、すなわちベクター配列
により依然として汚染されるであろう。このような場
合、本発明は有利である。さらに、組換分子の固有の性
質は、第一および第二ポリヌクレオチド配列が容易には
分離され得ないことである。たとえば、第一ポリヌクレ
オチド配列が第二ポリヌクレオチド配列と同じもしくは
近似した寸法である場合、これら２種のポリヌクレオチ
ド配列の分離は容易でない。
第一ポリヌクレオチド配列を標識するための選択的方法
が第二ポリヌクレオチド配列をも標識する場合、および
第二ポリヌクレオチド配列に対し相補的なポリヌクレオ
チド配列が検査される試料中に含有されている場合は、
標識されかつハイブリッド化されたポリヌクレオチド配
列の検出に基づく分析結果の解釈が問題となる。第二ポ
リヌクレオチド配列は間違った結果を生じうる。
全組換分子を標識する本発明のこの具体例において、本
発明の組成物は第三ポリヌクレオチド配列を含む。第三
ポリヌクレオチド配列は検出可能な第二標識により標識
されないかまたは標識され、かつ第二ポリヌクレオチド
配列に対し実質的に相補的または実質的に同一である。
本発明の組成物中における第三ポリヌクレオチド配列の
存在は、検査される試料中に存在し目的としないが第二
ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補的である全て
のポリヌクレオチド配列に対する第二ポリヌクレオチド
配列のハイブリッド化を阻止するよう作用する。この阻
止作用は、２つの方法のいずれか一方または双方におい
て達成されると思われる。
第一に、第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補
的である第三ポリヌクレオチド配列は、第二および第三
ポリヌクレオチド配列を単一鎖にしてこれをハイブリッ
ド化させうる条件下で接触させれば、第二ポリヌクレオ
チド配列に対してハイブリッド化することができる。第
二に、第二ポリヌクレオチド配列と実質的に同一である
第三ポリヌクレオチド配列は、目的としないが第二ポリ
ヌクレオチド配列に対し相補的であり、かつ検査される
試料中に存在する全てのポリヌクレオチド配列に対しハ
イブリッド化することができる。これら阻止作用のいず
れも間違った結果が生ずる傾向を防止すると思われる。
染色体における第一ポリヌクレオチド配列に連続する
が、これとは区別される配列としての第二ポリヌクレオ
チド配列 本発明の他の具体例において、目的とするポリヌクレオ
チド配列に対し実質的に相補的でありかつこれにハイブ
リッド化しうる第一ポリヌクレオチド配列は染色体中に
おいて目的とすると第一ポリヌクレオチド配列に対し実
質的に相補的でなく、または実質的に同一でないが検査
される試料中の目的としないポリヌクレオチド配列に対
し潜在的に実質上相補的である第二ポリヌクレオチド配
列に共有結合させる。第一ポリヌクレオチド配列と第二
ポリヌクレオチド配列とは単一の境界または複数の境界
を有することができる。これら境界は既知であっても未
知であってもよい。或る場合には、第一ポリヌクレオチ
ド配列を第二ポリヌクレオチド配列から単離するのは最
良の場合にも困難であり、かつ一般に不可能である。し
たがって、第一および第二ポリヌクレオチド配列の両者
を標識するのが好ましい。
本発明のこの具体例における特定例は、第一ポリヌクレ
オチド配列がナイセリア・ゴノロエア(Neisseria gonor
rhoea)の遺伝物質に対し特異的なポリヌクレオチド配列
であるような場合である。ポリヌクレオチド配列は、こ
れが専らポリヌクレオチド配列Ａにハイブリッド化しう
る場合のみポリヌクレオチド配列Ａに対し特異性である
といわれる。ナイセリア・ゴノロエアおよびナイセリア
・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)は顕著な核
酸同一性を有することが知られている。ナイセリア・ゴ
ノロエアのゲノムのポリヌクレオチド配列の８０％以上
がナイセリア・メニンギチジスのゲノムのポリヌクレオ
チド配列に対し実質的に相補的であるか、または実質的
に同一である〔デー・ティー・キングスベリー、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（１９６７）、第９４
巻、第８７０−８７４頁〕。この例において、ナイセリ
ア・ゴノロエアのデオキシリボ核酸から得られＮ・ゴノ
ロエアに対し特異性のｐ−ポリヌクレオチド配列とＮ・
ゴノロエアおよびＮ・メニンギチジスの両者に対し特異
性である第二ポリヌクレオチド配列とからなるポリヌク
レオチド断片をベクター中へクローン化させて組換ＤＮ
Ａ分子を形成させる。第一および第二ポリヌクレオチド
配列をベクターから精製し、そして両者を検出可能な第
一標識で標識する。本発明の組成物は、これら標識され
た第一および第二ポリヌクレオチド配列の他に、検出可
能な第一標識により標識されず、かつ第二ポリヌクレオ
チド配列に対し実質的に相補的であり、または実質的に
同一である第三ポリヌクレオチド配列を含む。この第三
ポリヌクレオチド配列は、適量で存在させると、標識さ
れた第三ポリヌクレオチド配列が目的としないポリヌク
レオチド配列に対しハイブリッド化するのを効果的に防
止し、すなわち試料はＮ・メニンギチジスＤＮＡを含む
ことができる。かくして、間違った信号が発生しない。
数種の方法のいずれか１つにおいて、第三ポリヌクレオ
チド配列を与えることができる。たとえば、Ｎ・メニン
ギチジスから単離されたベクターと挿入ポリヌクレオチ
ド配列とよりなり、かつ第二ポリヌクレオチド配列に対
し実質的に相補的であり、または実質的に同一であるポ
リヌクレオチド配列を含む組換分子を組成物に添加する
ことができる。好ましくは、第三ポリヌクレオチド配列
からなる全ゲノムＮ・メニンギチジスＤＮＡを組成物に
添加することができる。
本発明のこの具体例における他の特定実施例において、
目的とする特定ポリヌクレオチド配列は単純疱疹ウイル
スＩに対し特異的な配列である。第一ポリヌクレオチド
配列は単純疱疹ウイルスＩＤＮＡに対し特異的である。
標識される第二ポリヌクレオチド配列は単純疱疹ウイル
スＩＤＮＡおよび単純疱疹ウイルスIIＤＮＡに対し特異
的な配列である。標識されない第三ポリヌクレオチド配
列は、第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補的
であるかまたは実質的に同一である配列、すなわちもし
既知であれば単純疱疹ウイルスＩのＤＮＡと単純疱疹ウ
イルスIIのＤＮＡとに対し特異的である単純疱疹ウイル
スIIのＤＮＡの部分である。この第三ポリヌクレオチド
配列は、たとえば組成物中に全ゲノム単純疱疹ウイルス
IIのＤＮＡを含ませて供給することができる。この組成
物は、目的とする特定ポリヌクレオチド配列、すなわち
単純疱疹ウイルスＩのＤＮＡの検出を可能にすると共
に、第二ポリヌクレオチド配列が単純疱疹ウイルスIIの
ＤＮＡを検出する傾向を抑制する。
本発明のこの具体例における他の例をさらに下記第Ｉ表
に示すが、これらのみに限定されない： 宿主配列としての第二ポリヌクレオチド配列 本発明の第３の具体例において、第一ポリヌクレオチド
配列、すなわち目的とするポリヌクレオチド配列に対し
実質的に相補的でありかつこれにハイブリッド化しうる
ポリヌクレオチド配列は、染色体外ポリヌクレオチド配
列として宿主の内部に産生される。第二ポリヌクレオチ
ド配列は宿主ポリヌクレオチド配列である。
第一ポリヌクレオチド配列は標準法により実質的に精製
することができる。しかしながら、これらは微量の第二
ヌクレオチド配列、すなわち宿主ポリヌクレオチド配列
により汚染されていてもよい。すなわち、第一ポリヌク
レオチド配列が検出可能な第一標識により標識される場
合、微量の宿主ポリヌクレオチド配列も標識される。検
査すべき試料が第二ポリヌクレオチド配列、すなわち宿
主ポリヌクレオチド配列に対し相補的なポリヌクレオチ
ド配列を含有する場合、間違った結果が生じうる。この
望ましくない結果を防止するため、本発明の組成物は、
この具体例において検出可能な第一標識により標識され
ない宿主配列である第三ポリヌクレオチド配列を含む。
本発明のこの具体例における特定例は、第一ポリヌクレ
オチド配列がイー・コリ宿主において増殖する腸侵入性
プラスミドであるような場合である。検査すべき試料は
ヒト患者の大便から得られる。かくして、この試料はイ
ー・コリポリヌクレオチド配列を含有することが予想さ
れる。標識されたポリヌクレオチド配列が少量の標識さ
れた第二ポリヌクレオチド配列、すなわちイー・コリポ
リヌクレオチド配列で汚染されている場合にも、間違っ
た結果が生じうる。しかしながら、第三ポリヌクレオチ
ド配列、すなわち未標識のイー・コリポリヌクレオチド
配列を含ませれば、この望ましくない結果の傾向が抑制
される。
勿論、本発明の或る具体例、すなわち上記３つの具体例
においては、ベクター配列としての第二ポリヌクレオチ
ド配列と、第一ポリヌクレオチド配列と染色体結合した
配列としての第二ポリヌクレオチド配列と、宿主ポリヌ
クレオチド配列としての第二ポリヌクレオチド配列とを
組み合せることができる。検出可能な第一標識により標
識されない第三ポリヌクレオチド配列は、ベクター配列
と第一ポリヌクレオチド配列に対し染色体結合した配列
とに対し実質的に相補的であるかまたは実質的に同一で
ある配列とポリヌクレオチド宿主配列とから構成するこ
とができる。
さらに、本発明の或る種の具体例においては、これら３
種の上記具体例の２つのみを組み合せる。
第三ポリヌクレオチド配列の好適分子形状 本発明により提供される組成物における第三ポリヌクレ
オチド配列の最適寸法分布を決定するため実験を行なっ
た。第三ポリヌクレオチド配列断片は実質的に任意の長
さとしうるが、ただしこれら断片は安定なハイブリッド
を形成するのに十分な長さであると思われる。しかしな
がら、本発明の好適具体例は、第三ポリヌクレオチド配
列断片が長さ約５０〜約２５０ヌクレオチドであるよう
な場合である。これらの短い断片は、好ましくはＤＮＡ
酵素Ｉでの制御切断により産生される。代案として、音
波処理または他の適するヌクレアーゼによる切断も使用
することができる。
さらに、本発明の組成物における第三ポリヌクレオチド
配列の適量を決定するため実験を行なった。組成物中の
第三ポリヌクレオチド配列の量が多い程、第二ポリヌク
レオチド配列に対する検出可能な第一標識により発生す
る信号を阻止する組成物の効果が大であることが判明し
た。使用すべき第三ポリヌクレオチド配列の量は、下記
するように本発明の方法をどのように実施するかに依存
する。
検出可能な標識および検出 本発明における標識されたポリヌクレオチド配列は、検
出可能な標識により標識されるポリヌクレオチド配列を
意味する。核酸ハイブリッド化の技術に現在使用されて
いるかまたは将来開発されるであろう任意の検出可能な
標識を使用することができる。検出可能な標識の選択
は、本発明に対し臨界的でない。適する検出可能な標識
は放射性核種ならびにビオチン化成分、抗原、糖類、弗
素および燐、酵素、アポ酵素および補因子、リガンド、
アロステリック有効体、フェリチン、染料、微小球を包
含する化学標識を包含する。
検出可能な第一標識は、この検出可能な第一標識を検出
可能な第二標識から識別する有効な方法が存在してこれ
を使用する場合は、本発明の意味において検出可能な第
二標識とは相違するといわれる。たとえば、Ｈ３および
Ｐ３２の両者は放射性標識である。これらは、Ｈ３の低
エネルギ崩壊からＰ３２の高エネルギ崩壊を識別するプ
ログラミングされたシンチレーション計数の意味におい
て異なる検出可能な標識である。これらは、シンチレー
ション計数が崩壊エネルギを識別しない場合には異なる
検出可能な標識でない。
他の例は、標識されたポリヌクレオチド配列の次の対に
より与えられる：Ａはビオチニル化ヌクレオチドにより
標識されるポリヌクレオチド配列であり、ＢはポリＴに
より３′末端で標識されるポリヌクレオチド配列であ
る。Ａは適当なクロモゲン基質の存在下で発色するアビ
ジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体により検出さ
れる。この方法は本出願人による同時出願の１９８４年
１月２６日付け出願の米国特許出願第574,632号および
１９８３年１月２７日付け出願の米国特許出願第461,46
9号各明細書に記載されており、これらの開示を参考の
ためここに引用する。Ｂはビオチニル化ポリＡポリヌク
レオチドブリッジを介して間接的に検出される。ポリＡ
ポリヌクレオチドに含有されるビオチンを、クロモゲン
基質の存在下でアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ
複合体により検出する。この方法は本出願人による同時
出願の１９８３年５月５日付け出願の米国特許出願第49
1,929号明細書に開示されている。所望ならば、Ａおよ
びＢの検出を分けることもできる。実際に、ＡおよびＢ
の検出を分ける場合、ＡおよびＢは異なる検出可能な標
識である。実際に、ＡおよびＢの検出を分けない場合、
ＡおよびＢは異なる検出可能な標識でない。
本発明のポリヌクレオチド組成物の使用方法 さらに、本発明は本発明による組成物の使用方法にも関
するものである。これら組成物は、全ての核酸ハイブリ
ッド化法に使用することができる。これらの方法は、限
定はしないが、２相ハイブリッド化および１相ハイブリ
ッド化を包含する。２相ハイブリッド化の例は、その場
におけるハイブリッド化並びに透明および不透明な表面
上に固定されたポリヌクレオチド配列に対するハイブリ
ッド化である。１相ハイブリッド化の例は、溶液におけ
るポリヌクレオチド配列に対するハイブリッド化であ
る。特定方法の選択は、本発明に対し臨界的でない。
検査すべき試料の遺伝学的物質を使用される特定方法に
要求されるように作成し、この特定方法は当業者に公知
であろう。これらの方法は、単一鎖型である試料の遺伝
学的物質の少なくとも１部を与えるが、好ましくは試料
における遺伝学的物質のほぼ全部が単一鎖型である。
本発明の組成物におけるポリヌクレオチド配列の少なく
とも１部を単一鎖型とする。しかしながら、これらポリ
ヌクレオチド配列を実質的に単一鎖型にするのが極めて
好ましい。何故なら、二重鎖型におけるポリヌクレオチ
ド配列は一般にハイブリッド化に関与しないからであ
る。各成分、すなわち第一ポリヌクレオチド配列と第二
ポリヌクレオチド配列と第三ポリヌクレオチド配列とを
単独でまたは任意の組み合せとして実質的に単一鎖型と
することができる。このように単一鎖型にされた組成物
におけるこれらポリヌクレオチド配列を使用して、単一
鎖型にされた検査すべき試料の作成遺伝学的物質をハイ
ブリッド化させうる条件下で接触させる。第三ポリヌク
レオチド配列を第二ポリヌクレオチド配列より前または
それとほぼ同時に作成試料と接触させるのが極めて好ま
しい。これに反し、第三ポリヌクレオチド配列が存在し
ない時間を与えれば、第二ポリヌクレオチド配列が、検
査される試料中に存在する目的としない相補的ポリヌク
レオチド配列にハイブリッド化させるであろう。これは
組成物中に第三ポリヌクレオチド配列を含ませる目的に
反し、検出可能な第一標識の検出に際し間違った結果を
もたらす。この好適条件において、本発明の方法を実施
するには３種の好適具体例が存在する。
本発明による方法の第一の好適具体例においては、組成
物の第一，第二および第三ポリヌクレオチド配列を検査
すべき試料とほぼ同時に接触させる。この具体例におい
ては、第三ポリヌクレオチド配列を組成物における第二
ポリヌクレオチド配列の量よりも約１００倍〜約１００
０倍多い重量で組成物中に存在させるのが好ましい。約
１０００倍より多い量は、第二ポリヌクレオチド配列を
殆んどそれ以上阻止しない。しかしながら、目的としな
いが第二ポリヌクレオチド配列に対しハイブリッド化し
うるポリヌクレオチド配列の量を組成物における第二ポ
リヌクレオチド配列の量よりも多く試料が含有する場
合、第三ポリヌクレオチド配列は、目的とないが第二ポ
リヌクレオチド配列に対しハイブリッド化しうるポリヌ
クレオチド配列の量よりも約１００〜約１０００倍多い
重量で存在させるべきである。実際上、このような状態
は極めて稀である。
本発明による方法の第２の好適具体例においては、第
一，第二および第三ポリヌクレオチド配列を溶液中で互
いに接触させかつ相当の時間にわたりハイブリッド化さ
せて、第二ポリヌクレオチド配列のハイブリッド化をほ
ぼ完結させると共に、第一ポリヌクレオチド配列のハイ
ブリッド化を完結させないようにする。この具体例にお
いては、第三ポリヌクレオチド配列を組成物における第
二ポリヌクレオチド配列の量よりも約１００〜約１００
０倍多い重量にて組成物に存在させるのが好適である。
この過剰の第三ポリヌクレオチド配列は、第一ポリヌク
レオチド配列の復元を加速することなく第二ポリヌクレ
オチド配列のハイブリッド化を促進する。必要とされる
過剰時間および結果を得るのに必要な余分の工程の点
で、この具体例は大して好ましくない。しかしながら、
本発明のこの具体例は、目的としないが第二ポリヌクレ
オチド配列に対しハイブリッド化しうるポリヌクレオチ
ドを検査すべき試料が著量で含有する場合、より好適で
ある。何故なら、組成物中の第二ポリヌクレオチド配列
は既にほぼ完全にハイブリッド化しており、試料中の他
のポリヌクレオチド配列に対しハイブリッド化しえない
からである。
本発明による方法の第３の好適具体例においては、組成
物の第三ポリヌクレオチド配列を検査すべき試料におけ
る遺伝学的物質と接触させてほぼ完全にハイブリッド化
させた後、第二ポリヌクレオチド配列を試料における遺
伝学的物質と接触させる。この具体例においては、第三
ポリヌクレオチド配列を、目的としないが組成物におけ
る第二ポリヌクレオチド配列に対しハイブリッド化しう
るポリヌクレオチド配列の量よりも約１０倍乃至約１０
０倍多い重量にて組成物中に存在させるのが好適であ
る。この量は一般に目的としないが組成物中の第二ポリ
ヌクレオチド配列にハイブリッド化しうる全てのポリヌ
クレオチド配列に対しハイブリッド化させるのに充分で
ある。この具体例は、必要とされる過剰の時間および結
果を得るのに必要な余分の工程の点で好適でない。しか
しながら、検査すべき試料が目的としないが第二ポリヌ
クレオチド配列に対しハイブリッド化しうる著量のポリ
ヌクレオチド配列を含有する場合、組成物につき必要と
される第三ポリヌクレオチド配列の量に関し好適であ
る。
ハイブリッド化反応か終了した後、生成した安定な遺伝
学的ハイブリッド物質を検出可能な第一標識によって検
出する。
本発明の或る具体例において、ハイブリッド化反応が終
った後、検出工程は検査すべき試料にハイブリッド化し
た組成物の部分をハイブリッド化しなかった部分から分
離する分離工程を必要とする。この種の分離は、洗浄工
程により行なうことができる。たとえば、検査すべき試
料を、ニトロセルロースフイルタに固定化させる。ビオ
チニル化ヌクレオチドを使用して第一および第二ポリヌ
クレオチド配列を標識する。ハイブリッド化反応の終了
後、ニトロセルロースフイルタを洗浄して組成物中の未
ハイブリッド化配列を除去する。固定されたターゲット
に結合されている分子に含有されるビオチニル化ヌクレ
オチドを、次いで任意適当な手段により検出する。
本発明の或る具体例においては、ハイブリッド化が終了
した後、分離工程を検出工程で必要としない。たとえ
ば、これは使用する検出可能な標識が不対称化学ルミネ
ッセンス発光体／吸収体系であるような場合である。こ
の具体例において、信号は組成物中の標識されたポリヌ
クレオチド配列が検査される試料の実質的に相補的な配
列に対しハイブリッド化されている場合にのみ発生す
る。この検出方法は、１９８３年１月２６日付けで公告
されたヨーロッパ特許第００７０６８５号公報に開示さ
れている。他の例は、検出可能な標識として膠着しうる
微小球を使用する。この方法は、１９８４年４月２７日
付けで出願された本出願人による同時出願の米国特許出
願第６０５０２２号明細書に開示されている。
多重検出 組成物の第三ポリヌクレオチド配列は、所望ならば、検
出可能な第二標識により標識することができる。この場
合、試料中の遺伝学的物質とハイブリッド化する任意の
第三ポリヌクレオチド配列を検出することができかつ目
的としないが組成物の第二ポリヌクレオチド配列に対し
ハイブリッド化しうるポリヌクレオチド配列の存在を推
定により検出することができる。このような検出は、試
料中の目的としないポリヌクレオチド配列の量が検出可
能な第二標識により発生する信号によって示されるよう
に多く、検出可能な第一標識からの任意の結果の意味を
再評価することが必要となる場合に特に有利である。何
故なら、第二ポリヌクレオチド配列の幾分かが試料中の
目的としないポリヌクレオチド配列に対しハイブリッド
化しかつ検出可能な第一標識からの信号に関与するから
である。
〔発明の実施例〕
以下、限定はしないが実施例により本発明を説明する。
実施例Ｉ 本発明のこの実施例においては、モデル系を使用して目
的とするポリヌクレオチド配列〔すなわちクラミジア・
トラコマチス(Chlamydia trachomatis)の９キロベース
ＤＮＡ断片〕の検出を、目的としないポリヌクレオチド
（すなわちｐＢＲ３２２）の存在下で例示する。
プラスミド プラスミドｐＣＨＬ２はプラスミドｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩ部位にクローン化させたクラミジア・トラコマチ
スからの９キロベースＢａｍＨＩ断片よりなっている。
この０キロベースＢａｍＨＩ断片は、ｐＢＲ３２２に対
し実質的な相補性を持たない。
目標試料の作成 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH7.5)、0.1ｍＭＥＤＴＡにお
ける２２０μｇ／mlの濃度の音波処理されたｐＣＨＬ２
プラスミドＤＮＡを、0.5Ｍの最終濃度までＮａＯＨを
添加して変性させた。アルカリ性ＤＮＡ溶液の容量に等
しい容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ(pH7.5)を加えて、溶液
を中和した。次いで、２０Ｘ ＳＳＣを２Ｘ ＳＳＣ
（１Ｘ ＳＳＣ＝0.15Ｍ ＮａＣｌ，0.015Ｍ クエン
酸ナトリウム，pH7.0である）の最終濃度まで加えた。
次いで、２０μｇのＤＮＡに均等な量を、「ミニホール
ド・ドット・ブロット」装置を使用してニトロセルロー
スフイルタ（予め蒸留水にて６５℃で濡らし、次いで６
Ｘ ＳＳＣ中で浸漬したもの）の上の３０個所にそれぞ
れ施こした。各穴部を２００μの２Ｘ ＳＳＣで洗浄
し、次いでフイルタを風乾した後、減圧下に８０℃にて
２時間焼成した。次いで、フイルタ上の各スポットを抜
き取って直径３／１６インチの小さい円型フイルタを３
０個作成し、これらは２μｇの結合させた変性ｐＣＨＬ
２ＤＮＡを含有した。比較目標として、ＤＮＡを施こさ
なかったニトロセルロースフイルタから同じく３０個の
同様なフイルタを抜き取った。
ポリヌクレオチド組成物の作成 Ａ．標識されたポリヌクレオチド配列の作成 １．クラミジア断片の単離 ｐＣＨＬ２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、得られた断
片を0.5％低融点アガロースゲルにて分離した。寸法9.0
ｋｂに相当する帯域をゲルから切り取り、そしてＤＮＡ
を沃化ナトリウムと粉末化フリントガラスとを用いてゲ
ルスライス物から抽出した〔これについてはフォーゲル
シュタインおよびギレスピーによりプロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７６
巻、第６１５−６１７頁（１９７９）に記載されてい
る。〕この精製された断片の１部を0.7％アガロースゲ
ルで試験して、ｐＢＲ３２２ベクターによる精製クラミ
ジア断片の汚染につき検査した。精製断片の汚染は見ら
れなかった。しかしながら、残部のクラミジアＤＮＡ断
片を第２回のゲル電気泳動と単離とにかけて、ｐＢＲ３
２２ベクター配列による汚染の可能性を全て排除した。
２．ＤＮＡ試料のニック翻訳 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH7.4)、0.1ｍＭ ＥＤＴＡに
おける２μｇのＤＮＡへ、１０μの１０Ｘニック翻訳
緩衝液〔0.5Ｍトリス−ＨＣｌ(pH7.5)、0.05Ｍ ＭｇＣ
ｌ２、0.1Ｍ β−メルカプトエタノール、0.5mg／mlの
牛血清アルブミン〕と蒸留水とを全容量８５μまで加
えた。これに１μのＤＮＡ酵素Ｉ（１mg／ml保存溶液
から新たに稀釈した１Ｘニック翻訳緩衝液の５０００倍
液）を加えた。この反応物を３７℃にて５分間、次いで
６８℃にて１０分間培養した。
次いで、氷上でこの反応混合物へ１μのそれぞれ１０
０ｍＭ ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを加え、次いで５０ｍ
ＣｉのＨ３−またはＰ３２−ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの
いずれかを加えた。この反応混合物を１４℃にて５分間
培養し、その際２μのＤＮＡポリメラーゼＩ（２０単
位に相当）を添加した。１４℃にて３０分後、反応を４
μの0.5Ｍ ＥＤＴＡを添加して停止させ、そして反
応物を氷上に置いた。放射能標識されたＤＮＡを、セフ
ァデックスＧ５０（媒体）カラムにより未結合ヌクレオ
チドから分離した。
純粋なクラミジア断片ＤＮＡをＰ３２標識ヌクレオチド
により2.1×１０７cpm／μｇの比活性までニック翻訳
し、かつｐＢＲ３２２をＨ３標識ヌクレオチドにより３
×１０６cpm／μｇの比活性までニック翻訳した。
Ｂ．未標識ポリヌクレオチド配列の作成 Ｔ．Ｅ．（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、0.1ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、pH7.5）の１４５μにおける３１μｇのｐＢＲ３
２２をＤＮＡ酵素Ｉでの切断により約２５〜約１２５塩
基対の範囲の分子寸法まで分解した。ＤＮＡ酵素Ｉは0.
01Ｎ ＨＣｌ、５０％グリセリン中の１mg／ml溶液とし
て−２０℃で保存し、かつＴ．Ｅ．で使用直前に稀釈し
た。切断は、５０ｍＭのトリス(pH7.5)と１ｍＭのＭｎ
Ｃｌ２と１００μｇ／mlの牛血清アルブミンと１００ｎ
ｇのＤＮＡ酵素Ｉとを含有する２００μの全容量にお
いて３７℃で１０分間行なった。反応を２０μの0.5
Ｍ ＥＤＴＡの添加により氷上で停止させた。切断の生
成物をＨｉｎＦＩで切断されたｐＢＲ３２２を分子量標
識として使用することにより４％アガロースゲルで分析
した。
試料ＤＮＡまたは比較フイルタによるハイブリッド化 試料ＤＮＡを有するニトロセルロースフイルタまたは比
較フイルタを、３０枚の円盤からなる各バッチにおいて
５０mlの予備ハイブリッド化溶液を含有する２５０mlビ
ーカーにおいて６５℃で予備ハイブリッド化させた。こ
の予備ハイブリッド化は、３Ｘ ＳＳＣにて１０分間、
３Ｘ ＳＳＣ、５Ｘデンハルト（５Ｘデンハルト＝0.1
％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％牛血
清アルブミン）にて６０分間、および３Ｘ ＳＳＣ、５
Ｘデンハルト、0.1％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）にて２時間行ない、１００μｇ／mlの音波処理され
た牛胸腺ＤＮＡは添加直前に５〜７分間煮沸した。ハイ
ブリッド化は、全容量５００μかつ３Ｘ ＳＳＣ、５
Ｘデンハルト、0.1％ＳＤＳおよび１００μｇ／ml牛胸
腺ＤＮＡを含有する1.5mlのエッペンドルフ管にて行な
った。チューブ１〜１６にはｐＣＨＬ２ＤＮＡを有する
ニトロセルロースフイルタ円盤を入れた。チューブ１７
〜３２には目的とする配列を含まない比較円盤を入れ
た。未標識のＤＮＡ酵素Ｉで切断されたｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡを５〜７分間煮沸し、次いで氷上に置いた。これを
チューブ１〜１６およびチューブ１７〜３２へＨ３標識
ｐＢＲ３２２ＤＮＡの量よりも０，５，１０，２０，３
０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１
５０，２００，５００および１０００倍過剰となる重量
で加えた。1.25×１０５cpmの煮沸されたＨ３標識ＤＮ
Ａをハイブリッド化物のそれぞれに加え、これは５３μ
中に含有されるＤＮＡのｎｇ数を示す。Ｐ３２標識ク
ラミジアＤＮＡの同数のcpmを6.0μの容量に加えた。
ハイブリッド化を６５℃にて振とうしながら１６時間進
行させた。
フイルタの洗浄 各フイルタを２Ｘ ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳにより６５℃
で３回迅速に洗浄し、次いでそれぞれ２Ｘ ＳＳＣ、0.
1％ＳＤＳにて６５℃で３０分間づつ４回洗浄した。次
いで、フイルタを赤外ランプで乾燥させ、シンチレーシ
ョン壜に加え、そして「オムニフルオール」シンチレー
ション液を用いて計数した。各壜についてＨ３およびＰ
３２のカウントを識別するようプログラミングしたベッ
クマンＬＳ６８００型シンチレーションカウンタで計数
した。シンチレーションカウンタの第一のエネルギスペ
クトルチャンネルは０〜３００の範囲における低エネル
ギＨ３崩壊を検出するようセットした。第二チャンネル
は５００〜１０００の範囲における高エネルギＰ３２崩
壊を検出するようセットした。これら条件下において、
Ｐ３２のカウントが第一チャンネルへ漏れる量は、第二
チャンネルのカウント数の1.65％であり、かつＨ３のカ
ウントが第二チャンネルに漏れる量は第一チャンネルの
カウントの0.1％未満であった。
結果 １６枚の比較フイルタから得られたバックブランドカウ
ントは、5.90cpm〜13.60cpmの範囲であった。
Ｈ３標識ｐＢＲ３２２ＤＮＡよりも１０００倍過剰の未
標識のＤＮＡ酵素処理されたｐＢＲ３２２ＤＮＡにおい
て、Ｈ３信号の９８％が抑制されうる。同時に、これら
の結果は、フイルタ上で相補的配列に結合されたＰ３２
標識クラミジア・トラコマチスＤＮＡからの信号が影響
を受けなかったことを示している。
実施例II 本発明のこの実施例においては、ＤＮＡ酵素Ｉにより長
さ約２５〜約１２５ヌクレオチドの範囲の寸法まで切断
した未標識ｐＢＲ３２２の所定量が、相補的目標配列に
対する標識ｐＢＲ３２２ＤＮＡのハイブリッド化を阻止
する作用において、未標識の完全長さの線状ｐＢＲ３２
２の同量よりも効果的であることを例示した。
プラスミド 実施例Ｉに示したと同じプラスミド、すなわちｐＣＨＬ
２、ｐＢＲ３２２を使用した。
目標試料の作成 クラミジア・トラコマチスからの９ｋｂＤＮＡ断片を実
施例Ｉに記載したと同様に精製した。完全なスーパーコ
イルされたｐＢＲ３２２を短時間の音波処理により破壊
した。それとは別に、各ＤＮＡを実施例Ｉに記載したと
同様にＮａＯＨとトリス−ＨＣｌ(pH7.5)と２０ＸＳＳ
Ｃとにより順次に処理した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡまたは
クラミジア・トラコマチスＤＮＡの試料２００μｇを実
施例Ｉに記載したと同様にニトロセルロースに施こし
た。次いで、これらフイルタを乾燥させ、かつ減圧下で
８０℃にて２時間焼成した。フイルタ上の各スポットを
次いで切り取り、クラミジア・トラコマチスＤＮＡを含
有する直径３／１６インチの円型フイルタまたはｐＢＲ
３２２ＤＮＡを含有する３／１６×３／１６インチの正
方形フイルタまたはＤＮＡを含有しない直径３／１６イ
ンチの比較フイルタを得た。
標識されたポリヌクレオチド配列の作成 ベクター配列ｐＢＲ３２２とクラミジア・トラコマチス
配列とを含有する全プラスミドｐＣＨＬ２を、Ｐ３２標
識デオキシヌクレオチドを用いて実施例Ｉに前記したと
同様に１μｇ当り1.5×１０７cpmの比活性までニック翻
訳した。
未標識ｐＢＲ３２２ＤＮＡの作成 １．プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを実施例Ｉに記載し
たと同様にＭｎ＋＋インオの存在下でＤＮＡ酵素Ｉによ
り処理して、約５０塩基対のメジアン寸法を有する分子
を得た。
２．プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを、ＢａｍＨＩでの
切断により線状化した。
ハイブリッド化 クラミジア断片ＤＮＡを含有する円盤またはｐＢＲ３２
２ＤＮＡを含有する正方形フイルタまたは目標ＤＮＡを
含まない比較円盤の各フイルタを、実施例Ｉに前記した
と同様にバッチとして予備ハイブリッド化させた。これ
らハイブリッド化は、実施例Ｉにおけると同様に1.5ml
エッペントルフ管において５００μの容量で行なっ
た。8.8ｎｇのニック翻訳されたｐＣＨＬ２ＤＮＡ(1.25
×１０５cpm）を各ハイブリッド化物に加えた。最初の
２６個のハイブリッド化物は１個の円形フイルタおよび
１個の正方形フイルタを含んだ。さらに、未標識のＤＮ
Ａ酵素処理されたｐＢＲ３２２ＤＮＡまたはＢａｍＨＩ
切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡを、標識された試料より
も重量で０，５，１０，２０，３０，４０，５０，６
０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，５０
０または１０００倍過剰に相当する種々の量で加えた。
２６個の比較ハイブリッド化物を同様に作成したが、た
だしこの場合は目標ＤＮＡ配列を含有しない１個のニト
ロセルロースフイルタを各ハイブリッド化物に加えた。
ハイブリッド化条件および洗浄条件は実施例Ｉに前記し
たと同様である。フイルタを乾燥させ、各フイルタをシ
ンチレーションカウンタで別々に計数した。
結果 実施例III この実施例は、ベクターｐＢＲ３２２中へクローン化さ
せたナイセリア・ゴノロエアからのＤＮＡ断片よりなる
組換プラスミドを使用して、たとえ前記断片がナイセリ
ア・メニンギチジスの配列に対し実質的に相補的である
配列を含んでいても、どのようにＮ・ゴノロエアＤＮＡ
を検出しうるかを示している。
プラスミド ｐＡＬ１は、単独重合体ｄＧ：ｄＣ追跡法によってｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔＩ部位にクローン化させたＮ・ゴノロ
エアＤＮＡの1.1ｋｂ断片よりなっている。
目標試料の作成 Ｎ・ゴノロエアまたはＮ・メニンギチジスからの染色体
ＤＮＡをマルムールの方法〔ジャーナル・モレキュラー
・バイオロジー、第３巻、第２０８−２１８頁（１９６
１）〕により作成した。２μｇのＮ・ゴノロエアＤＮＡ
または２μｇのＮ・メニンギチジスＤＮＡをそれぞれ実
施例ＩおよびIIに記載したように作成した１６個の円形
および正方形のニトロセルロースフイルタへ固定化し
た。比較フイルタはＤＮＡを含有しない。
標識されたポリヌクレオチド配列の作成 プラスミドｐＡＬ１ＤＮＡを、４種のＰ３２標識ヌクレ
オチドを用いて実施例Ｉに前記したようにニック翻訳に
より標識した。標識ＤＮＡの比活性は2.7×１０８cpm／
μｇであった。1.25×１０５cpmの放射能標識された試
料をそれぞれ５００mlのハイブリッド化反応に添加し、
これは0.47μｇの試料ＤＮＡに相当する。
未標識ポリヌクレオチド配列の作成 １．この実験で使用した放射能標識したポリヌクレオチ
ド配列ｐＡＬ１はベクタープラスミドｐＢＲ３２２を含
有したので、未標識ｐＢＲ３２２をハイブリッド化反応
において重量で１０００倍過剰に使用して、標識ポリヌ
クレオチド配列の成分から生ずる望ましい信号を阻止し
た。未標識ｐＢＲ３２２ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの
音波処理により約３００塩基対のメジアン寸法の線状断
片を得ることにより作成した。
２．試料ｐＡＬ１と交差反応することが示されている菌
株Ｎ・メニンギチジスからの染色体ＤＮＡを音波処理に
より破壊して、約３００塩基対のメジアン寸法の線状分
子を得た。ＤＮＡをエタノール沈澱させ、そして蒸留水
中に１０mg／mlの濃度で再懸濁させた。
ハイブリッド化 ハイブリッド化物は６５℃に設定し、かつ３Ｘ ＳＳＣ
と５Ｘデンハルトと0.1％ＳＤＳと１００μｇ／ml牛胸
腺ＤＮＡとを含有した。チューブ１〜１６には２μｇの
Ｎ・ゴノロエアＤＮＡを有する１個の円形フイルタと２
μｇのＮ・メニンギチジスＤＮＡを含む１個の正方形フ
イルタとを入れた。チューブ１７および３２には１個の
比較フイルタを入れた。未標識ｐＢＲ３２２ＤＮＡを１
０００倍過剰で加え、かつ未標識Ｎ・メニンギチジスＤ
ＮＡをｐＡＬ１試料ＤＮＡの量よりも０，１２５，２５
０，５００，１０３，２×１０３，3.9×１０３，7.8×
１０３，1.6×１０４，6.25×１０４，1.25×１０５，
2.5×１０５，５×１０５，１０６および２×１０６倍
過剰の量で加えた。ＤＮＡを５〜７分間煮沸し、次いで
ハイブリッド化反応にかける前に氷上に置いた。ハイブ
リッド化は６５℃にて１６時間行なった。
次いで、これらフイルタを２Ｘ ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ
にて６５℃で３回洗浄した。フイルタを赤外ランプで乾
燥させ、そして標準型シンチレーションカクテルを用い
てベックマンＬＳ６８００型シンチレーションカウンタ
により別々に計数した。
結果 これらの結果から、たとえば下記するように多くの重要
な結論を引き出すことができる： １．Ｎ・メニンギチジスＤＮＡを含有するフイルタに結
合したカウント数は、Ｎ・ゴノロエアＤＮＡを含有する
フイルタに結合したカウント数の9.4％であった。した
がって、ｐＡＬ１に含有されるＮ・ゴノロエアＤＮＡの
1.1ｋｂ断片の幾分かが目標Ｎ・メニンギチジスに対し
実質的に相補的であった。
２．未標識Ｎ・メニンギチジスＤＮＡの増加量をハイブ
リッド化反応に添加すると、目標Ｎ・ゴノロエアおよび
目標Ｎ・メニンギチジスに対する標識ｐＡＬ１のハイブ
リッド化が抑制された。未標識Ｎ・メニンギチジスＤＮ
Ａを２×１０６倍過剰まで加えると、目標Ｎ・ゴノロエ
アＤＮＡに対するｐＡＬ１試料のハイブリッド化が正常
値の２４％まで減少する。同じ条件下で、目標Ｎ・メニ
ンギチジスＤＮＡに対するｐＡＬ１の試料のハイブリッ
ド化は殆んど検出されえないレベルまで減少する。
３．未標識Ｎ・メニンギチジスＤＮＡの量を選択するこ
とができ（３×１０４倍過剰）、この量においてＮ・メ
ニンギチジスの染色体ＤＮＡに対する試料の交差反応性
は僅か２％まで減少する一方、試料はＮ・ゴノロエアの
染色体ＤＮＡに対する親和性を７４％保持する。
４．この実施例は、本発明を使用してどのようにＮ・ゴ
ノロエアＤＮＡに対するＮ・メニンギチジスＤＮＡの誤
認を防止しうるかを示している。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】目的としないポリヌクレオチド配列を含有
    しうる試料から、目的とするポリヌクレオチド配列を検
    知する組成物において、 (a)目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
    補的でありかつこれにハイブリッド化することができ、
    さらに検知可能な第一標識により標識される第一ポリヌ
    クレオチド配列と、 (b)目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に相
    補的でなく、または実質的に同一でなく、かつ前記検出
    可能な第一標識により標識される第二ポリヌクレオチド
    配列と、 (c)前記第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に相補
    的であり、または同一であり、かつ検出可能な第二標識
    により標識されないかまたは標識される第三ポリヌクレ
    オチド配列と、 からなるポリヌクレオチド配列の検出用組成物。
  2. 【請求項２】第一ポリヌクレオチド配列と第二ポリヌク
    レオチド配列とが組換分子から誘導され、前記第二ポリ
    ヌクレオチド配列がベクターポリヌクレオチド配列から
    なる特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  3. 【請求項３】第一ポリヌクレオチド配列が染色体中の第
    二ポリヌクレオチド配列に共有結合されている特許請求
    の範囲第１項記載の組成物。
  4. 【請求項４】第一ポリヌクレオチド配列がＮ・ゴノロエ
    ア，単純疱疹ウイルスＩ，単純疱疹ウイルスII，ブルセ
    ラ・アボルツス，ボルデテラ・ヘルツシス，シゲラ・デ
    ィセンテリヤ，ヘモフィルス・インフレンザ，ミコバク
    テリウム・チュバキュロシス，シュードモナス・シュー
    ドマレイ，サルモネラ・チフィイ，サルモネラ・チィフ
    ィムリウムおよびＮ・メニンギチジスよりなる群から選
    択されるポリヌクレオチド配列に対し特異性である特許
    請求の範囲第３項記載の組成物。
  5. 【請求項５】第二ポリヌクレオチド配列が宿主ポリヌク
    レオチド配列である特許請求の範囲第１項記載の組成
    物。
  6. 【請求項６】第三ポリヌクレオチド配列が標識されない
    特許請求の範囲第１項記載の組成物。
  7. 【請求項７】目的とするポリヌクレオチド配列を、目的
    としないポリヌクレオチド配列の潜在下または顕在下に
    検出するに際し、 (a)（ｉ）目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質
    的に相補的でありかつこれにハイブリッド化することが
    でき、さらに検出可能な第一標識により標識される第一
    ポリヌクレオチド配列と、 （ii）目的とするポリヌクレオチド配列に対し実質的に
    相補的でなく、または実質的に同一でなく、かつ前記検
    出可能な第一標識により標識される第二ポリヌクレオチ
    ド配列と、 （iii）前記第二ポリヌクレオチド配列に対し実質的に
    相補的であり、または同一であり、かつ検出可能な第二
    標識により標識されないかまたは標識される第三ポリヌ
    クレオチド配列と からなる組成物を加え、 (b)目的とする前記ポリヌクレオチド配列および目的と
    しない前記ポリヌクレオチド配列の少なくとも１部を単
    一鎖型となし、 (c)前記組成物の少なくとも１部を単一鎖型となし、 (d)前記試料中の目的とするポリヌクレオチド配列およ
    び目的としないポリヌクレオチド配列を、ハイブリッド
    化させうる条件下で前記組成物と接触させ、かつ (e)目的とする前記ポリヌクレオチド配列を前記検出可
    能な第一標識によって検出することを特徴とするポリヌ
    クレオチド配列の検出方法。
  8. 【請求項８】目的とするポリヌクレオチド配列および目
    的としないポリヌクレオチド配列のほぼ全部を単一鎖型
    となし、かつ組成物のほぼ全部を単一鎖型にする特許請
    求の範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】試料中の目的とするポリヌクレオチド配列
    および目的としないポリヌクレオチド配列を第三ポリヌ
    クレオチド配列と接触させた後、試料中の目的とするポ
    リヌクレオチド配列および目的としないポリヌクレオチ
    ド配列を第一ポリヌクレオチド配列および第二ポリヌク
    レオチド配列と接触させる特許請求の範囲第８項記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】組成物を実質的に単一鎖型とした後かつ
    目的とするポリヌクレオチド配列および目的としないポ
    リヌクレオチド配列を組成物と接触させる前に、第二ポ
    リヌクレオチド配列をハイブリッド化させうる条件下で
    第三ポリヌクレオチド配列と接触させる特許請求の範囲
    第８項記載の方法。
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Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US5176995A (en) * 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US5008182A (en) * 1986-01-10 1991-04-16 Cetus Corporation Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
US6872817B1 (en) 1986-01-16 2005-03-29 The Regents Of The Univ. Of California Method of staining target interphase chromosomal DNA
US5756696A (en) 1986-01-16 1998-05-26 Regents Of The University Of California Compositions for chromosome-specific staining
US5447841A (en) * 1986-01-16 1995-09-05 The Regents Of The Univ. Of California Methods for chromosome-specific staining
US6475720B1 (en) 1986-01-16 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
US7115709B1 (en) 1986-01-16 2006-10-03 The Regents Of The University Of California Methods of staining target chromosomal DNA employing high complexity nucleic acid probes
US6280929B1 (en) 1986-01-16 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Method of detecting genetic translocations identified with chromosomal abnormalities
US6344315B1 (en) 1986-01-16 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
US4900659A (en) * 1986-01-30 1990-02-13 Enzo Biochem, Inc. Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US7138516B1 (en) 1986-11-24 2006-11-21 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US7087742B1 (en) 1986-11-24 2006-08-08 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5079351A (en) * 1986-11-26 1992-01-07 Cetus Corporation Oligonucleotides and kits for detection of htlvi and htlvii viruses by hybridization
GB8709803D0 (en) * 1987-04-24 1987-05-28 Mcfadden J J Treatment of crohn's disease &c
US5225324A (en) * 1987-04-24 1993-07-06 Bioscience International, Inc. Diagnostics for mycobacteria in public health, medical, and veterinary practice
EP0365595A4 (en) * 1987-06-26 1990-06-05 Du Pont SEPARATION OF CONTAMINATED SEQUENCES FROM RECOMBINANT CLONED DNA USING AFFINITY PARTICLES.
PT88144A (pt) * 1987-07-31 1989-06-30 Gen Probe Inc Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
CA1339351C (en) * 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5108895A (en) * 1988-08-02 1992-04-28 Ortho Diagnostic System Inc. Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea
US5099011A (en) * 1988-08-02 1992-03-24 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea
US6203977B1 (en) * 1988-11-15 2001-03-20 Yale University Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization
US7172863B1 (en) 1988-12-09 2007-02-06 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US6955915B2 (en) 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6416952B1 (en) 1989-06-07 2002-07-09 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
GB2241242A (en) * 1990-01-10 1991-08-28 Univ Surrey DNA probe for Neisseria meningitidis
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5849481A (en) * 1990-07-27 1998-12-15 Chiron Corporation Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides
WO1992002526A1 (en) * 1990-07-27 1992-02-20 Chiron Corporation Large comb-type branched polynucleotides
US5264343A (en) * 1990-08-31 1993-11-23 Eleanor Roosevelt Institute Method for distinguishing normal and cancer cells
US5183737A (en) * 1990-09-28 1993-02-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repetitive DNA sequence specific for mycobacterium tuberculosis to be used for the diagnosis of tuberculosis
US5168039A (en) * 1990-09-28 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repetitive DNA sequence specific for mycobacterium tuberculosis to be used for the diagnosis of tuberculosis
US5256536A (en) * 1990-11-09 1993-10-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Nucleotide probe for Neisseria gonrrhoeae
EP0834575B1 (en) 1990-12-06 2001-11-28 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Identification of nucleic acids in samples
US5527679A (en) * 1991-05-01 1996-06-18 Dana Farber Cancer Institute β5 protein and DNA encoding the same
US5387510A (en) * 1991-10-02 1995-02-07 Eastman Kodak Company Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5556961A (en) * 1991-11-15 1996-09-17 Foote; Robert S. Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5677195A (en) * 1991-11-22 1997-10-14 Affymax Technologies N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6849462B1 (en) 1991-11-22 2005-02-01 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
US5550040A (en) * 1993-06-23 1996-08-27 Hoffman-La Roche Inc. Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US5952172A (en) 1993-12-10 1999-09-14 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US6071699A (en) 1996-06-07 2000-06-06 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US5591578A (en) 1993-12-10 1997-01-07 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US5824473A (en) * 1993-12-10 1998-10-20 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5620850A (en) 1994-09-26 1997-04-15 President And Fellows Of Harvard College Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5830645A (en) * 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5861287A (en) * 1995-06-23 1999-01-19 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5614386A (en) * 1995-06-23 1997-03-25 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5728529A (en) * 1995-06-23 1998-03-17 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis
US6048688A (en) * 1996-11-12 2000-04-11 Kimberly-Clark Corporation Method for detection of Pseudomonas aeruginosa using polymerase chain reaction
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
FR2746413B1 (fr) * 1996-03-19 1998-04-24 Bio Merieux Detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US7014992B1 (en) * 1996-11-05 2006-03-21 Clinical Micro Sensors, Inc. Conductive oligomers attached to electrodes and nucleoside analogs
US7160678B1 (en) 1996-11-05 2007-01-09 Clinical Micro Sensors, Inc. Compositions for the electronic detection of analytes utilizing monolayers
US7381525B1 (en) 1997-03-07 2008-06-03 Clinical Micro Sensors, Inc. AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids
US6096273A (en) 1996-11-05 2000-08-01 Clinical Micro Sensors Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids
US7393645B2 (en) * 1996-11-05 2008-07-01 Clinical Micro Sensors, Inc. Compositions for the electronic detection of analytes utilizing monolayers
US7045285B1 (en) 1996-11-05 2006-05-16 Clinical Micro Sensors, Inc. Electronic transfer moieties attached to peptide nucleic acids
DE69836012T2 (de) 1997-05-02 2007-04-05 Gen-Probe Inc., San Diego Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
US6013459A (en) * 1997-06-12 2000-01-11 Clinical Micro Sensors, Inc. Detection of analytes using reorganization energy
US5962273A (en) * 1997-11-04 1999-10-05 Becton Dickinson And Company Detection of Neisseria gonorrhoeae by amplification and detection of its nucleic acid
AU764926B2 (en) 1998-01-27 2003-09-04 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6686150B1 (en) 1998-01-27 2004-02-03 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6268146B1 (en) 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6270973B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Multiplex method for nucleic acid detection
US6391551B1 (en) 1998-03-13 2002-05-21 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6159693A (en) * 1998-03-13 2000-12-12 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6235480B1 (en) 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US6277578B1 (en) 1998-03-13 2001-08-21 Promega Corporation Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target
US7090975B2 (en) * 1998-03-13 2006-08-15 Promega Corporation Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection
US6312902B1 (en) 1998-03-13 2001-11-06 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6335162B1 (en) 1998-03-13 2002-01-01 Promega Corporation Nucleic acid detection
US6703211B1 (en) 1998-03-13 2004-03-09 Promega Corporation Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP
US6270974B1 (en) 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
CA2327542C (en) * 1998-05-04 2011-11-22 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
US20050244954A1 (en) * 1998-06-23 2005-11-03 Blackburn Gary F Binding acceleration techniques for the detection of analytes
US6290839B1 (en) 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
US6761816B1 (en) * 1998-06-23 2004-07-13 Clinical Micro Systems, Inc. Printed circuit boards with monolayers and capture ligands
US7087148B1 (en) 1998-06-23 2006-08-08 Clinical Micro Sensors, Inc. Binding acceleration techniques for the detection of analytes
US6740518B1 (en) * 1998-09-17 2004-05-25 Clinical Micro Sensors, Inc. Signal detection techniques for the detection of analytes
AU1241000A (en) * 1998-10-27 2000-05-15 Clinical Micro Sensors, Inc. Detection of target analytes using particles and electrodes
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning
US6833267B1 (en) * 1998-12-30 2004-12-21 Clinical Micro Sensors, Inc. Tissue collection devices containing biosensors
US7312087B2 (en) 2000-01-11 2007-12-25 Clinical Micro Sensors, Inc. Devices and methods for biochip multiplexing
US6942771B1 (en) 1999-04-21 2005-09-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes
US20020177135A1 (en) * 1999-07-27 2002-11-28 Doung Hau H. Devices and methods for biochip multiplexing
ATE417127T1 (de) 1999-07-26 2008-12-15 Clinical Micro Sensors Inc Nukelinsäuresequenzbestimmung mittels elektronischem nachweis
US6361958B1 (en) * 1999-11-12 2002-03-26 Motorola, Inc. Biochannel assay for hybridization with biomaterial
US6875619B2 (en) 1999-11-12 2005-04-05 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
US6753143B2 (en) 2000-05-01 2004-06-22 Clinical Micro Sensors, Inc. Target analyte detection using asymmetrical self-assembled monolayers
US6602400B1 (en) 2000-06-15 2003-08-05 Motorola, Inc. Method for enhanced bio-conjugation events
JP4382265B2 (ja) * 2000-07-12 2009-12-09 日本電気株式会社 酸化シリコン膜の形成方法及びその形成装置
US20030143556A1 (en) * 2001-04-03 2003-07-31 Gary Blackburn Nucleic acid reactions using labels with different redox potentials
US20050009101A1 (en) * 2001-05-17 2005-01-13 Motorola, Inc. Microfluidic devices comprising biochannels
US20030175947A1 (en) * 2001-11-05 2003-09-18 Liu Robin Hui Enhanced mixing in microfluidic devices
AU2003210818A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-02 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treatment of infectious and inflammatory diseases
US20050267025A1 (en) * 2002-02-01 2005-12-01 Ho John L Compositions and methods for treatment of infectious and inflammatory diseases
US7229800B2 (en) * 2004-04-16 2007-06-12 Becton, Dickinson And Company Neisseria gonorrhoeae assay
US8124334B2 (en) * 2004-07-06 2012-02-28 Enzo Biochem, Inc. Selective detection of oncogenic HPV
AU2006244394B2 (en) 2005-05-06 2010-10-21 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid target capture
US20100279422A1 (en) * 2006-08-21 2010-11-04 Cmed Technologies Ltd. Method of surface plasmon resonance (spr) technology to detect genomic disorders for prenatal diagnosis
WO2008036465A2 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 CMED Technologies Ltd. Office of Walkers Limited A method to assess cancer susceptibility and differential diagnosis of metastases of unknown primary tumors
US8153445B2 (en) * 2006-09-19 2012-04-10 Cmed Technologies Ltd. Method for screening of infectious agents in blood
US20100047815A1 (en) * 2006-09-21 2010-02-25 Cmed Technologies Ltd. Method to detect tumor markers and diagnosis of undifferentiated tumors
WO2008070223A2 (en) * 2006-09-21 2008-06-12 Cmed Technologies Ltd. A method to remove repetitive sequences from human dna
US20090311699A1 (en) * 2006-09-25 2009-12-17 Cmed Technologies Ltd. Method of surface plasmon resonance (spr) to detect genomic aberrations in patients with chronic lymphocytic leukemia
GB2455929B (en) * 2006-09-25 2011-08-31 Cmed Technologies Limited A method for the identification of human immunodeficiency virus related antibodies in blood
WO2008085554A2 (en) * 2006-09-25 2008-07-17 Cmed Technologies Ltd. A method to detect virus related immunologigal markers for the diagnosis of hepatitis b virus infection
WO2008082710A2 (en) * 2006-09-25 2008-07-10 Cmed Technologies Ltd. A method of surface plasmon resonance (spr) technology to detect genomic aberrations in patients with multiple myeloma
US20100047789A1 (en) * 2006-09-25 2010-02-25 Cmed Technologies Ltd. Method of surface plasmon resonance (spr) to detect genomic disorders for postnatal diagnosis
WO2008057652A2 (en) * 2006-09-25 2008-05-15 Cmed Technologies Ltd. A method to detect virus related immunological markers for the diagnosis of hepatitis c virus infection
US8114682B2 (en) * 2006-09-27 2012-02-14 Cmed Technologies Ltd. Method for the quantitative evaluation of sex hormones in a serum sample
US20100004872A1 (en) * 2006-09-27 2010-01-07 Cmed Technologies Ltd. Method for quantitative measurement of cardiac biochemical markers
WO2008070241A2 (en) * 2006-09-27 2008-06-12 Cmed Technologies Ltd. A method to measure serum biomarkers for the diagnosis of liver fibrosis
WO2008066994A2 (en) * 2006-09-27 2008-06-05 Cmed Technologies Ltd. Application of surface plasmon resonance technology to maternal serum screening for congenital birth defects
US20100086937A1 (en) * 2006-09-27 2010-04-08 Cmed Technologies Ltd. method to detect treponema pallidum immunological markers for the diagnosis of syphilis
US8158343B2 (en) * 2006-09-27 2012-04-17 Cmed Technologies Ltd. Method to detect virus related immunological markers for the diagnosis of respiratory tract infections
WO2008067007A2 (en) * 2006-09-28 2008-06-05 Cmed Technologies Ltd. A method for quantitative measurement of thyroid homrones and related antibodies in a serum sample
US8110408B2 (en) * 2006-09-28 2012-02-07 Cmed Technologies Ltd. Method for quantitative detection of diabetes related immunological markers
US8168379B2 (en) 2007-10-04 2012-05-01 Cmed Technologies Ltd. Application of surface plasmon resonance technology for detecting and genotyping HPV

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
US4717653A (en) * 1981-09-25 1988-01-05 Webster John A Jr Method for identifying and characterizing organisms
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser

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ES8703934A1 (es) 1987-03-01
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ATE71982T1 (de) 1992-02-15

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