JPH06319571A - ストレプトミセス菌類のゲノムｄｎａをクローニングするためのコスミドベクター - Google Patents
ストレプトミセス菌類のゲノムｄｎａをクローニングするためのコスミドベクターInfo
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- JPH06319571A JPH06319571A JP6077319A JP7731994A JPH06319571A JP H06319571 A JPH06319571 A JP H06319571A JP 6077319 A JP6077319 A JP 6077319A JP 7731994 A JP7731994 A JP 7731994A JP H06319571 A JPH06319571 A JP H06319571A
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- cosmid
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- seq
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- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ストレプトミセス菌類からの染色体ＤＮＡ制
限断片のクローニングにおいて含まれる、多くの段階
を、容易にすることを目的とした新規のコスミドクロー
ニングベクターが開示されている。 【構成】 コスミドは、クローニング部位の側方にある
いくつかの制限酵素に対するアデニンとチミンに富んだ
認識配列を持つ。また、新規のコスミドクローニングベ
クターを含む宿主細胞が開示されている。
限断片のクローニングにおいて含まれる、多くの段階
を、容易にすることを目的とした新規のコスミドクロー
ニングベクターが開示されている。 【構成】 コスミドは、クローニング部位の側方にある
いくつかの制限酵素に対するアデニンとチミンに富んだ
認識配列を持つ。また、新規のコスミドクローニングベ
クターを含む宿主細胞が開示されている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アベルメクチンを生産
する微生物であるストレプトミセス アベルミティリス
（Streptomyces avermitilis）を含む、広い種類のスト
レプトミセス菌類の遺伝子クローニングを容易にする、
一組の新規のコスミドクローニングベクターに関するも
のである。
する微生物であるストレプトミセス アベルミティリス
（Streptomyces avermitilis）を含む、広い種類のスト
レプトミセス菌類の遺伝子クローニングを容易にする、
一組の新規のコスミドクローニングベクターに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】抗生物質を生産する微生物においては、
ＤＮＡ組換え技術の適用は、バイオテクノロジーの研究
のますます重要な分野を構成している。ストレプトミセ
ス菌類は、グラム陽性の微生物で、多様な商業的に有用
な治療用の物質を生産するその能力により、よく知られ
ている。既知の自然に存在する抗生物質の６０％以上
は、ストレプトミセス属から得られる。ストレプトミセ
ス菌類の遺伝子クローニング技術の発達は、有用な合成
物を生産するための、ストレプトミセス菌類の産業上の
利用の新たな可能性の始まりである。ＤＮＡ組換え技術
は、選別方法と新規の隔離集団の力価を改良するため；
自然に存在する隔離集団の中では作られない新しい構造
を発生させるため：抗生物質合成遺伝子をクローニング
して異種の宿主中で発現させるため；そして元の親隔離
集団には見られない、新規のあるいは改良された特別な
任務を実行する能力を持つ新しい株の生体プログラム
を、遺伝子レベルで供給するために、現在利用されてい
る。
ＤＮＡ組換え技術の適用は、バイオテクノロジーの研究
のますます重要な分野を構成している。ストレプトミセ
ス菌類は、グラム陽性の微生物で、多様な商業的に有用
な治療用の物質を生産するその能力により、よく知られ
ている。既知の自然に存在する抗生物質の６０％以上
は、ストレプトミセス属から得られる。ストレプトミセ
ス菌類の遺伝子クローニング技術の発達は、有用な合成
物を生産するための、ストレプトミセス菌類の産業上の
利用の新たな可能性の始まりである。ＤＮＡ組換え技術
は、選別方法と新規の隔離集団の力価を改良するため；
自然に存在する隔離集団の中では作られない新しい構造
を発生させるため：抗生物質合成遺伝子をクローニング
して異種の宿主中で発現させるため；そして元の親隔離
集団には見られない、新規のあるいは改良された特別な
任務を実行する能力を持つ新しい株の生体プログラム
を、遺伝子レベルで供給するために、現在利用されてい
る。
【０００３】コスミドベクターは修飾されたプラスミド
であり、バクテリオファージラムダ粒子の中へＤＮＡを
パッケージングするために必要とされるＤＮＡ配列（ｃ
ｏｓ配列）の少なくとも１つのコピーを運搬する。コス
ミドは１つの複製開始点（通常ＣｏｌＥ１開始点）と薬
物耐性のマーカー（通常、アンピシリン耐性）を保持
し、標準の形質転換手法によって大腸菌に導入すること
ができ、プラスミドとして増殖される。コスミドベクタ
ーは、約３５から４５キロベース（ｋｂ）の大きさの範
囲のゲノムのＤＮＡ断片を運搬する能力のために、染色
体のＤＮＡの大きな領域をクローニングするのに有益な
手段である。
であり、バクテリオファージラムダ粒子の中へＤＮＡを
パッケージングするために必要とされるＤＮＡ配列（ｃ
ｏｓ配列）の少なくとも１つのコピーを運搬する。コス
ミドは１つの複製開始点（通常ＣｏｌＥ１開始点）と薬
物耐性のマーカー（通常、アンピシリン耐性）を保持
し、標準の形質転換手法によって大腸菌に導入すること
ができ、プラスミドとして増殖される。コスミドベクタ
ーは、約３５から４５キロベース（ｋｂ）の大きさの範
囲のゲノムのＤＮＡ断片を運搬する能力のために、染色
体のＤＮＡの大きな領域をクローニングするのに有益な
手段である。
【０００４】ストレプトミセスＤＮＡは極めて高いグア
ノシンとシトシン含有量（約７０％）を持つ。さらに、
ストレプトミセス菌類は、比較的大きいゲノム（ほぼ１
０7塩基対）を持つ。このように、それらのＤＮＡ含有
量は大腸菌の約３倍である。このゲノムの複雑性のた
め、ストレプトミセス菌類のＤＮＡライブラリーを組み
立てるときに、大きな断片のクローニングが特に有用で
ある。ランダムなＤＮＡの切断が起り、クローンライブ
ラリーに染色体が最適に表現されていると想定すると、
選別されるクローンの数はゲノムの大きさに直接相関を
示し、ＤＮＡ挿入断片の平均の大きさに逆比例する。従
って、大きなＤＮＡ片をクローニングすることは、特定
の遺伝子のために選別すべきクローンの数を減じるのに
都合がよい。クローン数を減少させることは、連続し
た、そして重複したクローンを同定することによって大
きな染色体の領域の制限酵素地図を確立するために必要
とされる、分析と操作の数を減少することでもある。
ノシンとシトシン含有量（約７０％）を持つ。さらに、
ストレプトミセス菌類は、比較的大きいゲノム（ほぼ１
０7塩基対）を持つ。このように、それらのＤＮＡ含有
量は大腸菌の約３倍である。このゲノムの複雑性のた
め、ストレプトミセス菌類のＤＮＡライブラリーを組み
立てるときに、大きな断片のクローニングが特に有用で
ある。ランダムなＤＮＡの切断が起り、クローンライブ
ラリーに染色体が最適に表現されていると想定すると、
選別されるクローンの数はゲノムの大きさに直接相関を
示し、ＤＮＡ挿入断片の平均の大きさに逆比例する。従
って、大きなＤＮＡ片をクローニングすることは、特定
の遺伝子のために選別すべきクローンの数を減じるのに
都合がよい。クローン数を減少させることは、連続し
た、そして重複したクローンを同定することによって大
きな染色体の領域の制限酵素地図を確立するために必要
とされる、分析と操作の数を減少することでもある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、大きな染色
体のＤＮＡ断片（換言すれば、抗生物質の生合成遺伝子
の一群を運搬するような大きな染色体のＤＮＡ断片）を
クローニングすることと、クローニングされた断片をベ
クターから単一部分として回収することの両方を容易に
する、新規のコスミドクローニングベクターを提供する
ものである。
体のＤＮＡ断片（換言すれば、抗生物質の生合成遺伝子
の一群を運搬するような大きな染色体のＤＮＡ断片）を
クローニングすることと、クローニングされた断片をベ
クターから単一部分として回収することの両方を容易に
する、新規のコスミドクローニングベクターを提供する
ものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、クローニング
部位の側面に配置されたいくつかの制限酵素のための、
アデニンとチミンに富んだ（以下、［Ａ＋Ｔ］−リッチ
と言う）認識配列を持つ、新規コスミドの一組について
述べたものである。［Ａ＋Ｔ］−リッチな認識配列は、
自然に存在するストレプトミセス属のゲノムでは稀にし
か存在しないため、本発明は、どのような特定のグアニ
ンとシトシンに富んだ（以下、［Ｇ＋Ｃ］−リッチとい
う）ゲノムＤＮＡの挿入片についても、単一の制限断片
として分離することを可能にする酵素を少なくとも一つ
は発見する機会を増大する。この特徴は、大きな遺伝
子、あるいは抗生物質合成の遺伝子の群（クラスター）
のような遺伝子の群の、試験管内での取得や操作に役立
つ。さらに、これらのベクターは、素早い、方向性のゲ
ノム歩行と制限地図作成のためのＲＮＡ転写物の合成を
可能にするために、クローニング部位の側面に配置され
たＴ３とＴ７のＲＮＡプロモーターを含んでもよい。本
発明は、さらに、大腸菌内でストレプトミセスＤＮＡラ
イブラリを構成し、これを次にストレプトミセスに移入
するために有用な、大腸菌−ストレプトミセスシャトル
コスミドベクターにも関する。これらのベクターは、ス
トレプトミセス種および高い［Ｇ＋Ｃ］−リッチなゲノ
ムの含有量を持つ他の関連微生物の遺伝子工学を促進す
る。この特徴は、大きな染色体領域（例えば群として集
まった遺伝子（クラスタージーン）、特に抗生物質合成
遺伝子群を運搬する）の試験管内での再構成に役立つ。
部位の側面に配置されたいくつかの制限酵素のための、
アデニンとチミンに富んだ（以下、［Ａ＋Ｔ］−リッチ
と言う）認識配列を持つ、新規コスミドの一組について
述べたものである。［Ａ＋Ｔ］−リッチな認識配列は、
自然に存在するストレプトミセス属のゲノムでは稀にし
か存在しないため、本発明は、どのような特定のグアニ
ンとシトシンに富んだ（以下、［Ｇ＋Ｃ］−リッチとい
う）ゲノムＤＮＡの挿入片についても、単一の制限断片
として分離することを可能にする酵素を少なくとも一つ
は発見する機会を増大する。この特徴は、大きな遺伝
子、あるいは抗生物質合成の遺伝子の群（クラスター）
のような遺伝子の群の、試験管内での取得や操作に役立
つ。さらに、これらのベクターは、素早い、方向性のゲ
ノム歩行と制限地図作成のためのＲＮＡ転写物の合成を
可能にするために、クローニング部位の側面に配置され
たＴ３とＴ７のＲＮＡプロモーターを含んでもよい。本
発明は、さらに、大腸菌内でストレプトミセスＤＮＡラ
イブラリを構成し、これを次にストレプトミセスに移入
するために有用な、大腸菌−ストレプトミセスシャトル
コスミドベクターにも関する。これらのベクターは、ス
トレプトミセス種および高い［Ｇ＋Ｃ］−リッチなゲノ
ムの含有量を持つ他の関連微生物の遺伝子工学を促進す
る。この特徴は、大きな染色体領域（例えば群として集
まった遺伝子（クラスタージーン）、特に抗生物質合成
遺伝子群を運搬する）の試験管内での再構成に役立つ。
【０００７】概括的に言えば、本発明はコスミドクロー
ニングベクターに関するもので：このベクターは大腸菌
の複製開始点；ある抗生物質に感受性の大腸菌宿主に形
質転換されたときに該抗生物質耐性を伝える少なくとも
１つのＤＮＡ部分；少なくとも１つのバクテリオファー
ジからのｃｏｓ配列；制限酵素に対するアデニンとチミ
ンに富んだ認識配列が側面に配置された少なくとも１つ
のクローニング部位；そしてポリリンカー領域の側面に
配置された少なくとも２つの異なったＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターを含んでいる。
ニングベクターに関するもので：このベクターは大腸菌
の複製開始点；ある抗生物質に感受性の大腸菌宿主に形
質転換されたときに該抗生物質耐性を伝える少なくとも
１つのＤＮＡ部分；少なくとも１つのバクテリオファー
ジからのｃｏｓ配列；制限酵素に対するアデニンとチミ
ンに富んだ認識配列が側面に配置された少なくとも１つ
のクローニング部位；そしてポリリンカー領域の側面に
配置された少なくとも２つの異なったＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターを含んでいる。
【０００８】好ましい具体例においては、本発明は：
（ａ）約４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮ
Ａ制限断片で、前記制限断片はＣｏｌＥＩ複製開始点
と、少なくとも１つのバクテリオファージラムダのｃｏ
ｓ部位とを含むものと；（ｂ）約０．８キロベースのＰ
ｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片で、前記ＤＮＡ断片は少
なくとも２つの異なったバクテリオファージプロモータ
ー配列が側面に配置された少なくとも１つのＢａｍＨＩ
クローニング部位とを含み、このＢａｍＨＩクローニン
グ部位はさらに少なくとも２つの制限部位（配列ＩＤ番
号：１）が側面に配置されたものと；そして（ｃ）下記
抗生物質に対して感受性の大腸菌宿主細胞に形質転換さ
れたときに耐性を与える少なくとも１つの抗生物質マー
カーを含むＤＮＡ部分を包含する、コスミドクローニン
グベクターに関する。より好ましくは、（ｄ）ＣｌａＩ
部位に挿入されたＳｓｐＩリンカー（配列ＩＤ番号：
２）と；（ｅ）ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩそしてＢａｍＨＩ
のように示される少なくとも３つの付加的なクローニン
グ部位をさらに包含するコスミドクローニングベクター
である。特に好ましいのは、その中の４．２キロベース
のＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ制限断片がプラスミドｐ
ＣＤ１８４から誘導され；０．８キロベースのＰｓｔＩ
／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片がｐＷＥ１５（配列ＩＤ番号：
１）から誘導され、そのＢａｍＨＩクローニング部位は
少なくともバクテリオファージＴ３とＴ７からのプロモ
ーター配列が側面に配置され、そのＢａｍＨＩクローニ
ング部位はさらに酵素ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩに対するさ
らに少なくとも２つの制限部位（配列ＩＤ番号：１）が
側面に配置され；プラスミドｐＣＤ１８４とｐＣＤ１９
３として述べられるＣｌａＩ部位にＳｓｐＩリンカー
（配列ＩＤ番号：２）が挿入されている、コスミドクロ
ーニングベクターである。コスミドクローニングベクタ
ーはｐＣＤ１８８、ｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３８３、ｐＣ
Ｄ３９７、そしてｐＣＤ４１８の名前で示されるプラス
ミドのような、プラスミドであってもよい。本発明はま
た、ｐＣＤ１８８、ｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３８３、ｐＣ
Ｄ３９７、そしてｐＣＤ４１８のようなプラスミドを含
む大腸菌宿主細胞に関する。コスミドクローニングベク
ターはプラスミドｐＣＤ１８８の全ての構造上の特徴を
含んでもよく、さらにそれは、ＢａｍＨＩクローニング
部位に隣接して位置する付加的なＸｈｏＩクローニング
部位、あるいはＢａｍＨＩクローニング部位に隣接して
位置する付加的なＸｈｏＩとＸｂａＩクローニング部
位；あるいは次のような構成：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／
ＢａｍＨＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／Ｄｒａ
Ｉ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩを持つ複式のク
ローニング部位（マルチプルクローニングサイト）、あ
るいは次のような構成：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／Ｂａｍ
ＨＩ／ＡｓｅＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／Ｄ
ｒａＩ／ＡｓｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ
を持つ複式のクローニング部位を含んでもよい。本発明
は、また、上記に述べたコスミドクローニングベクター
を含む大腸菌宿主細胞に関する。
（ａ）約４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮ
Ａ制限断片で、前記制限断片はＣｏｌＥＩ複製開始点
と、少なくとも１つのバクテリオファージラムダのｃｏ
ｓ部位とを含むものと；（ｂ）約０．８キロベースのＰ
ｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片で、前記ＤＮＡ断片は少
なくとも２つの異なったバクテリオファージプロモータ
ー配列が側面に配置された少なくとも１つのＢａｍＨＩ
クローニング部位とを含み、このＢａｍＨＩクローニン
グ部位はさらに少なくとも２つの制限部位（配列ＩＤ番
号：１）が側面に配置されたものと；そして（ｃ）下記
抗生物質に対して感受性の大腸菌宿主細胞に形質転換さ
れたときに耐性を与える少なくとも１つの抗生物質マー
カーを含むＤＮＡ部分を包含する、コスミドクローニン
グベクターに関する。より好ましくは、（ｄ）ＣｌａＩ
部位に挿入されたＳｓｐＩリンカー（配列ＩＤ番号：
２）と；（ｅ）ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩそしてＢａｍＨＩ
のように示される少なくとも３つの付加的なクローニン
グ部位をさらに包含するコスミドクローニングベクター
である。特に好ましいのは、その中の４．２キロベース
のＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ制限断片がプラスミドｐ
ＣＤ１８４から誘導され；０．８キロベースのＰｓｔＩ
／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片がｐＷＥ１５（配列ＩＤ番号：
１）から誘導され、そのＢａｍＨＩクローニング部位は
少なくともバクテリオファージＴ３とＴ７からのプロモ
ーター配列が側面に配置され、そのＢａｍＨＩクローニ
ング部位はさらに酵素ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩに対するさ
らに少なくとも２つの制限部位（配列ＩＤ番号：１）が
側面に配置され；プラスミドｐＣＤ１８４とｐＣＤ１９
３として述べられるＣｌａＩ部位にＳｓｐＩリンカー
（配列ＩＤ番号：２）が挿入されている、コスミドクロ
ーニングベクターである。コスミドクローニングベクタ
ーはｐＣＤ１８８、ｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３８３、ｐＣ
Ｄ３９７、そしてｐＣＤ４１８の名前で示されるプラス
ミドのような、プラスミドであってもよい。本発明はま
た、ｐＣＤ１８８、ｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３８３、ｐＣ
Ｄ３９７、そしてｐＣＤ４１８のようなプラスミドを含
む大腸菌宿主細胞に関する。コスミドクローニングベク
ターはプラスミドｐＣＤ１８８の全ての構造上の特徴を
含んでもよく、さらにそれは、ＢａｍＨＩクローニング
部位に隣接して位置する付加的なＸｈｏＩクローニング
部位、あるいはＢａｍＨＩクローニング部位に隣接して
位置する付加的なＸｈｏＩとＸｂａＩクローニング部
位；あるいは次のような構成：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／
ＢａｍＨＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／Ｄｒａ
Ｉ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩを持つ複式のク
ローニング部位（マルチプルクローニングサイト）、あ
るいは次のような構成：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／Ｂａｍ
ＨＩ／ＡｓｅＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／Ｄ
ｒａＩ／ＡｓｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ
を持つ複式のクローニング部位を含んでもよい。本発明
は、また、上記に述べたコスミドクローニングベクター
を含む大腸菌宿主細胞に関する。
【０００９】本発明は、また、二機能性の、低コピー数
のシャトルコスミドクローニングベクターを目的とし、
それはクローニング部位の両側部に制限酵素に対する
［アデニン＋チミン］に富んだ認識配列を含む。好まし
い具体例では、ＤＮＡコスミドシャトルクローニングベ
クターは、（ａ）約５キロベースのＢａｍＨＩ制限断片
を含む大腸菌の複製開始点と；（ｂ）大腸菌宿主細胞に
形質転換されたときに耐性を与える少なくとも１つの抗
生物質マーカーを含むＤＮＡ部分と；（ｃ）ストレプト
ミセス属の複製開始点を含む約２５キロベースのＢｇｌ
ＩＩ制限断片と；（ｄ）感受性のストレプトミセス宿主
細胞に形質転換されたときに耐性を与える少なくとも１
つの抗生物質マーカーを含むＤＮＡ断片と；（ｅ）Ｂａ
ｍＨＩクローニング部位と；そして（ｆ）ＢａｍＨＩク
ローニング部位の側面に位置する２つのＣｌａＩ部位
と、を含む。ＢａｍＨＩ制限断片はプラスミドｐＣＤ１
８８のものであってもよく、ＢｇｌＩＩ制限断片はプラ
スミドｐＩＪ９４０のものであってもよい。ベクター
は、広い種類のストレプトミセス属および／または大腸
菌宿主において効率的に複製をする能力を持ってもよ
く、それはｐＣＤ４２５で示されるプラスミドのような
プラスミドであってもよい。本発明は、また、さらにシ
ャトルベクターを含むストレプトミセス属または大腸菌
宿主細胞に関するもので、宿主細胞は、ストレプトミセ
ス アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）；
ストレプトミセス コエリコロール（Streptomyces coe
licolor ）；ストレプトミセス ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）；およびストレプトミ
セス リビダンス（Streptomyces lividans ）から選択
することができ、クローニングシャトルベクターはプラ
スミドｐＣＤ４２５であってもよい。
のシャトルコスミドクローニングベクターを目的とし、
それはクローニング部位の両側部に制限酵素に対する
［アデニン＋チミン］に富んだ認識配列を含む。好まし
い具体例では、ＤＮＡコスミドシャトルクローニングベ
クターは、（ａ）約５キロベースのＢａｍＨＩ制限断片
を含む大腸菌の複製開始点と；（ｂ）大腸菌宿主細胞に
形質転換されたときに耐性を与える少なくとも１つの抗
生物質マーカーを含むＤＮＡ部分と；（ｃ）ストレプト
ミセス属の複製開始点を含む約２５キロベースのＢｇｌ
ＩＩ制限断片と；（ｄ）感受性のストレプトミセス宿主
細胞に形質転換されたときに耐性を与える少なくとも１
つの抗生物質マーカーを含むＤＮＡ断片と；（ｅ）Ｂａ
ｍＨＩクローニング部位と；そして（ｆ）ＢａｍＨＩク
ローニング部位の側面に位置する２つのＣｌａＩ部位
と、を含む。ＢａｍＨＩ制限断片はプラスミドｐＣＤ１
８８のものであってもよく、ＢｇｌＩＩ制限断片はプラ
スミドｐＩＪ９４０のものであってもよい。ベクター
は、広い種類のストレプトミセス属および／または大腸
菌宿主において効率的に複製をする能力を持ってもよ
く、それはｐＣＤ４２５で示されるプラスミドのような
プラスミドであってもよい。本発明は、また、さらにシ
ャトルベクターを含むストレプトミセス属または大腸菌
宿主細胞に関するもので、宿主細胞は、ストレプトミセ
ス アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）；
ストレプトミセス コエリコロール（Streptomyces coe
licolor ）；ストレプトミセス ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）；およびストレプトミ
セス リビダンス（Streptomyces lividans ）から選択
することができ、クローニングシャトルベクターはプラ
スミドｐＣＤ４２５であってもよい。
【００１０】本発明のこれらの、そして他の目的と利点
は、いくつかの発明の具体例を表わす添付の図面の以下
の説明により明らかになるであろう。図面は説明の目的
としてのみ使用されるものであり、発明の限定のために
使用されるものでないことを理解したい。
は、いくつかの発明の具体例を表わす添付の図面の以下
の説明により明らかになるであろう。図面は説明の目的
としてのみ使用されるものであり、発明の限定のために
使用されるものでないことを理解したい。
【００１１】本明細書中で使用される専門用語は、分子
遺伝学の技術に熟練した者によく知られているものであ
る。
遺伝学の技術に熟練した者によく知られているものであ
る。
【００１２】それらの用語の定義は、Benjamin Lewin博
士著，“遺伝子”第２版，1985，John Wiley & Sons, I
nc. ニューヨーク、のような分子生物学の分野における
多くの教本に見出される。本発明でたびたび使用される
用語は、下記（前述した文献も含めて本明細書で引用さ
れる全ての文献は、全ての目的のためにその全てが本明
細書に組み入れられている）に明示される。
士著，“遺伝子”第２版，1985，John Wiley & Sons, I
nc. ニューヨーク、のような分子生物学の分野における
多くの教本に見出される。本発明でたびたび使用される
用語は、下記（前述した文献も含めて本明細書で引用さ
れる全ての文献は、全ての目的のためにその全てが本明
細書に組み入れられている）に明示される。
【００１３】抗生物質：細菌の細胞の成長を抑制する化
学的因子。組換え細菌細胞の選択に使用することができ
る。
学的因子。組換え細菌細胞の選択に使用することができ
る。
【００１４】抗生物質耐性遺伝子：特定の抗生物質に対
して先天的に感受性のある宿主細胞に導かれたときに該
抗生物質に対する耐性を与えるＤＮＡ配列。抗生物質マ
ーカーとしても知られている。
して先天的に感受性のある宿主細胞に導かれたときに該
抗生物質に対する耐性を与えるＤＮＡ配列。抗生物質マ
ーカーとしても知られている。
【００１５】バクテリオファージ：細菌に感染するウィ
ルス。
ルス。
【００１６】ｃＲＮＡ：ＤＮＡと相補性の１本鎖のＲＮ
Ａで、試験管内での転写によりＤＮＡから合成される。
Ａで、試験管内での転写によりＤＮＡから合成される。
【００１７】クローン：単一の先祖と全く同じ多数の細
胞または分子。
胞または分子。
【００１８】クローニングベクター：クローニングされ
るための異種のＤＮＡを挿入することが可能な任意のプ
ラスミド。形質転換の際に異種のＤＮＡを宿主細胞に運
搬する。
るための異種のＤＮＡを挿入することが可能な任意のプ
ラスミド。形質転換の際に異種のＤＮＡを宿主細胞に運
搬する。
【００１９】付着端配列（ｃｏｓ）：試験管内でのパッ
ケージング（インビトロパッケージング）を可能にす
る、バクテリオファージラムダから誘導されたＤＮＡ配
列。
ケージング（インビトロパッケージング）を可能にす
る、バクテリオファージラムダから誘導されたＤＮＡ配
列。
【００２０】コスミド：バクテリオファージラムダのｃ
ｏｓ配列が挿入されたプラスミド。このプラスミドＤＮ
Ａ（異種のＤＮＡ挿入を運搬する）は、試験管内でファ
ージコート蛋白中にパッケージされることが可能であ
る。
ｏｓ配列が挿入されたプラスミド。このプラスミドＤＮ
Ａ（異種のＤＮＡ挿入を運搬する）は、試験管内でファ
ージコート蛋白中にパッケージされることが可能であ
る。
【００２１】ＤＮＡ連結：ＤＮＡの２つの断片を連結す
る化学的結合の形成。
る化学的結合の形成。
【００２２】ハイブリッド形成：キメラのベクターを運
搬する細菌の細胞集落を同定するために用いる技術で、
そのベクター中の挿入されたＤＮＡはある特定の配列と
類似している。
搬する細菌の細胞集落を同定するために用いる技術で、
そのベクター中の挿入されたＤＮＡはある特定の配列と
類似している。
【００２３】キロベース：ＤＮＡまたはＲＮＡの１００
０塩基対に対する略語。
０塩基対に対する略語。
【００２４】リンカー：１つまたはそれ以上の制限酵素
に対するターゲット部位を含む短い合成の二本鎖のオリ
ゴデオキシヌクレオチド。新規のポリリンカーまたは複
式のクローニング部位（ＭＣＳ）を創造するためにベク
ターに付加される。
に対するターゲット部位を含む短い合成の二本鎖のオリ
ゴデオキシヌクレオチド。新規のポリリンカーまたは複
式のクローニング部位（ＭＣＳ）を創造するためにベク
ターに付加される。
【００２５】複製開始点：その部分においてプラスミド
ベクターの複製が始められるＤＮＡ配列。
ベクターの複製が始められるＤＮＡ配列。
【００２６】プラスミド：自律的に自己複製する染色体
外の環状ＤＮＡ。
外の環状ＤＮＡ。
【００２７】プラスミドコピー数：各宿主の染色体に対
する、細菌内で保持されるプラスミド分子の数。
する、細菌内で保持されるプラスミド分子の数。
【００２８】プロモーター：特定のＤＮＡ配列のＲＮＡ
への転写の開始を定義するために重要なＤＮＡ領域。
への転写の開始を定義するために重要なＤＮＡ領域。
【００２９】レプリコン：その中で、ＤＮＡが複製され
る一単位のゲノム。１つの複製開始点を含む。
る一単位のゲノム。１つの複製開始点を含む。
【００３０】制限酵素：特定の短いＤＮＡ配列部分を認
識し、切断する酵素蛋白。
識し、切断する酵素蛋白。
【００３１】制限認識配列：特定の制限酵素により特異
的に認識されるＤＮＡ配列。ターゲット部位としても知
られている。
的に認識されるＤＮＡ配列。ターゲット部位としても知
られている。
【００３２】シャトルベクター：１つまたはそれ以上の
別の宿主（例えば、大腸菌とストレプトミセス）中で、
複製能力がある二機能性のクローニングベクター。
別の宿主（例えば、大腸菌とストレプトミセス）中で、
複製能力がある二機能性のクローニングベクター。
【００３３】転写：ＤＮＡ鋳型上のＲＮＡ合成。
【００３４】細菌細胞の形質転換：付加されたＤＮＡの
取り込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得。
取り込みによる新しい遺伝子マーカーの獲得。
【００３５】本発明の新規のコスミドベクターは、“染
色体歩行”として知られている方策を使用する、連続的
に重複するコスミドクローンの分離を容易にする。望ま
しい具体例では、これらのコスミドベクターはクローニ
ング部位の両側にバクテリオファージプロモーター配列
（例えば、Ｔ３とＴ７）を含む。Ｔ３またはＴ７のどち
らか一方のポリメラーゼに対する鋳型としてのゲノム挿
入片を含むコスミドＤＮＡを使用することによって、方
向性の“歩行”プローブが試験管内（インビトロ）で合
成され、ゲノムのコスミドライブラリーのスクリーニン
グに使用される。
色体歩行”として知られている方策を使用する、連続的
に重複するコスミドクローンの分離を容易にする。望ま
しい具体例では、これらのコスミドベクターはクローニ
ング部位の両側にバクテリオファージプロモーター配列
（例えば、Ｔ３とＴ７）を含む。Ｔ３またはＴ７のどち
らか一方のポリメラーゼに対する鋳型としてのゲノム挿
入片を含むコスミドＤＮＡを使用することによって、方
向性の“歩行”プローブが試験管内（インビトロ）で合
成され、ゲノムのコスミドライブラリーのスクリーニン
グに使用される。
【００３６】さらに、ｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３８３、ｐ
ＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８のような、本明細書中
に開示されたコスミドベクターのいくつかはＸｈｏＩク
ローニング部位を持つ。ＸｈｏＩのクローニング部位と
しての有効性は、ZabarovskyとAllikmets による，Gen
e，42:119，1986，に述べられている。本発明のクロー
ニング方法は、独特の特異性が利用され、その特異性に
よって、ＸｈｏＩで線状化したベクターの両端に現われ
る部分的にふさがれたＸｈｏＩ付着端部分と、部分的に
ふさがれたＳａｕ３ＡＩで消化されたゲノムのＤＮＡと
を結合することができる。部分的にふさぐことは、ベク
ターとゲノムの断片の自己連結反応を防止するため、唯
一の可能な連結産物はゲノム挿入物の単一コピーであ
る。この方法は、また、迅速であり、開始材料が少ない
量で済み、ゲノムの分別を必要としない。
ＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８のような、本明細書中
に開示されたコスミドベクターのいくつかはＸｈｏＩク
ローニング部位を持つ。ＸｈｏＩのクローニング部位と
しての有効性は、ZabarovskyとAllikmets による，Gen
e，42:119，1986，に述べられている。本発明のクロー
ニング方法は、独特の特異性が利用され、その特異性に
よって、ＸｈｏＩで線状化したベクターの両端に現われ
る部分的にふさがれたＸｈｏＩ付着端部分と、部分的に
ふさがれたＳａｕ３ＡＩで消化されたゲノムのＤＮＡと
を結合することができる。部分的にふさぐことは、ベク
ターとゲノムの断片の自己連結反応を防止するため、唯
一の可能な連結産物はゲノム挿入物の単一コピーであ
る。この方法は、また、迅速であり、開始材料が少ない
量で済み、ゲノムの分別を必要としない。
【００３７】好ましい具体例では、本発明は、二機能
性、すなわち、大腸菌とストレプトミセス属の両方での
複製の能力をもつ、新規のコスミドベクターに関する。
このベクターは、従って、ストレプトミセスと大腸菌と
の間を往復することができる。遺伝子クローニングは、
大腸菌の中で行ない（複雑な生合成経路の遺伝子を運搬
する大きな染色体のＤＮＡ断片のような）大きな挿入片
を運搬する選択された組換えベクターは、機能上の解析
のためにストレプトミセス属へ形質転換され得る。
性、すなわち、大腸菌とストレプトミセス属の両方での
複製の能力をもつ、新規のコスミドベクターに関する。
このベクターは、従って、ストレプトミセスと大腸菌と
の間を往復することができる。遺伝子クローニングは、
大腸菌の中で行ない（複雑な生合成経路の遺伝子を運搬
する大きな染色体のＤＮＡ断片のような）大きな挿入片
を運搬する選択された組換えベクターは、機能上の解析
のためにストレプトミセス属へ形質転換され得る。
【００３８】本発明のシャトルベクターは、ストレプト
ミセス中で少ないコピー数に制御する、ストレプトミセ
スの複製開始点ＳＣＰ２＊を運搬することができる。こ
のような、ストレプトミセスの中で少ないコピー数に制
御する能力は、多くのストレプトミセス種のクローニン
グや相補性の研究に利用されるベクターの有利な特徴で
ある。ＳＣＰ２＊は、分子の大きさが３１．４キロベー
スで、Streptomyces coelicolor 中で最初に発見された
繁殖力の要素であり、染色体あたり１から２コピー存在
する（Bibb, M. J. とHopwood, D. A.著，J. Gen. Micr
obiol., 126, pp427-442, 1981）。ＳＣＰ２＊は、幅広
い宿主領域を持つ。コスミドシャトルベクターに運ばせ
るＳＣＰ２＊のレプリコンは、少コピー数のベクターｐ
ＩＪ９４０から誘導される（Lydiate ら.,Gene, 35, p
p. 223-235, 1985 ）。このベクターはStreptomyces az
ureus由来のチオストレプトン−耐性（ｔｓｒ）マーカ
ーを運搬し、特定のリボソームＲＮＡメチラーゼにより
抗生物質チオストレプトン耐性を与える。大きなＤＮＡ
断片（４０ｋｂまで）を安定して保持する能力と遺伝子
過剰量の影響(gene dosage effect)の可能性がない理由
から、ゲノムあたり少数またはただ一つのコピー数を有
するベクターは、生理学上の研究で最も好まれる。
ミセス中で少ないコピー数に制御する、ストレプトミセ
スの複製開始点ＳＣＰ２＊を運搬することができる。こ
のような、ストレプトミセスの中で少ないコピー数に制
御する能力は、多くのストレプトミセス種のクローニン
グや相補性の研究に利用されるベクターの有利な特徴で
ある。ＳＣＰ２＊は、分子の大きさが３１．４キロベー
スで、Streptomyces coelicolor 中で最初に発見された
繁殖力の要素であり、染色体あたり１から２コピー存在
する（Bibb, M. J. とHopwood, D. A.著，J. Gen. Micr
obiol., 126, pp427-442, 1981）。ＳＣＰ２＊は、幅広
い宿主領域を持つ。コスミドシャトルベクターに運ばせ
るＳＣＰ２＊のレプリコンは、少コピー数のベクターｐ
ＩＪ９４０から誘導される（Lydiate ら.,Gene, 35, p
p. 223-235, 1985 ）。このベクターはStreptomyces az
ureus由来のチオストレプトン−耐性（ｔｓｒ）マーカ
ーを運搬し、特定のリボソームＲＮＡメチラーゼにより
抗生物質チオストレプトン耐性を与える。大きなＤＮＡ
断片（４０ｋｂまで）を安定して保持する能力と遺伝子
過剰量の影響(gene dosage effect)の可能性がない理由
から、ゲノムあたり少数またはただ一つのコピー数を有
するベクターは、生理学上の研究で最も好まれる。
【００３９】本発明は、また、ストレプトミセスＤＮＡ
や他の［Ｇ＋Ｃ］−リッチなゲノムＤＮＡのクローニン
グと解析のための、ｐＣＤ１８８、３８２、３８３、３
９７および４１８と命名された新規のコスミドベクター
と、二機能性（シャトル）ベクター（ｐＣＤ４２５）に
関する。
や他の［Ｇ＋Ｃ］−リッチなゲノムＤＮＡのクローニン
グと解析のための、ｐＣＤ１８８、３８２、３８３、３
９７および４１８と命名された新規のコスミドベクター
と、二機能性（シャトル）ベクター（ｐＣＤ４２５）に
関する。
【００４０】本発明のコスミドベクターｐＣＤ１８８
は、以下の要素を包含する。
は、以下の要素を包含する。
【００４１】ａ．ＣｏｌＥ１複製開始点と１つのバクテ
リオファージｃｏｓ部位を持つ、ｐＣＤ１８４由来のほ
ぼ４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断
片； ｂ．クローニング部位の両側にバクテリオファージプロ
モーター配列（Ｔ３とＴ４）が配置されたＢａｍＨＩク
ローニング部位（さらにそれは、前述のＢａｍＨＩクロ
ーニング部位の両側部に配置された制限酵素ＮｏｔＩと
ＥｃｏＲＩに関する２つの制限部位（配列ＩＤ番号：
１）を含む）を含む、ｐＷＥ由来のほぼ０．８キロベー
スのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片； ｃ．１つのＣｌａＩ部位に挿入されたＳｓｐＩリンカー
（したがって、コスミドベクターｐＣＤ１８８は唯一つ
のＢａｍＨＩの側面に配置された２つのＳｓｐＩ部位
（配列ＩＤ番号：２）を持つ）。ＳｓｐＩ制限酵素に対
する認識配列（ＡＡＴＡＴＴ）は、１００％アデニンと
チミン残基から成り、ストレプトミセスのような［Ｇ＋
Ｃ］に富んだゲノムには、非常に稀な配列を形成する。
その結果、ＳｓｐＩを使用することによって、一つの制
限断片として挿入されたストレプトミセスのクローニン
グされたＤＮＡを分離する可能性が高くなる； ｄ．感受性の大腸菌宿主細胞に形質転換されたときに、
抗生物質のアンピシリンに対する耐性を運搬するＤＮＡ
配列。
リオファージｃｏｓ部位を持つ、ｐＣＤ１８４由来のほ
ぼ４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断
片； ｂ．クローニング部位の両側にバクテリオファージプロ
モーター配列（Ｔ３とＴ４）が配置されたＢａｍＨＩク
ローニング部位（さらにそれは、前述のＢａｍＨＩクロ
ーニング部位の両側部に配置された制限酵素ＮｏｔＩと
ＥｃｏＲＩに関する２つの制限部位（配列ＩＤ番号：
１）を含む）を含む、ｐＷＥ由来のほぼ０．８キロベー
スのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片； ｃ．１つのＣｌａＩ部位に挿入されたＳｓｐＩリンカー
（したがって、コスミドベクターｐＣＤ１８８は唯一つ
のＢａｍＨＩの側面に配置された２つのＳｓｐＩ部位
（配列ＩＤ番号：２）を持つ）。ＳｓｐＩ制限酵素に対
する認識配列（ＡＡＴＡＴＴ）は、１００％アデニンと
チミン残基から成り、ストレプトミセスのような［Ｇ＋
Ｃ］に富んだゲノムには、非常に稀な配列を形成する。
その結果、ＳｓｐＩを使用することによって、一つの制
限断片として挿入されたストレプトミセスのクローニン
グされたＤＮＡを分離する可能性が高くなる； ｄ．感受性の大腸菌宿主細胞に形質転換されたときに、
抗生物質のアンピシリンに対する耐性を運搬するＤＮＡ
配列。
【００４２】コスミドベクターｐＣＤ３８２、ｐＣＤ３
８３、ｐＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８は、コスミド
ベクターｐＣＤ１８８の唯一つのＢａｍＨＩ部位の中に
特定のポリリンカーを挿入することによって、構成され
た。その結果、これらの構造により、以下のことを含む
いくつかの付加的な有効な特徴が得られる。
８３、ｐＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８は、コスミド
ベクターｐＣＤ１８８の唯一つのＢａｍＨＩ部位の中に
特定のポリリンカーを挿入することによって、構成され
た。その結果、これらの構造により、以下のことを含む
いくつかの付加的な有効な特徴が得られる。
【００４３】ａ．上記に述べたような（ZavarovskyとAl
likmets, 1986 も参照）、簡易化されたゲノムのクロー
ニング手段のための“部分的にふさがれたＸｈｏＩ”方
策の実行を可能にする、ｐＣＤ３８２の唯一つのＢａｍ
ＨＩ部位に隣接する付加的なＸｈｏＩクローニング部
位； ｂ．ｐＣＤ３８３（配列ＩＤ番号：３）の唯一つのＢａ
ｍＨＩ（配列ＩＤ番号：３）に隣接するＸｈｏＩとＸｂ
ａＩクローニング部位； ｃ．以下の配列：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／
ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／ＤｒａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（配列ＩＤ番号：４）（Ｄｒ
ａＩに対する認識配列がアデニンとチミン残基（ＴＴＴ
ＡＡＡ）のみにより構成されることと、ＢｇｌＩＩとＸ
ｈｏＩクローニング部位を挟んで２つのＤｒａＩ部位が
あるために、一本の断片としてＢｇｌＩＩまたはＸｈｏ
Ｉ部位のどちらか一方にクローニングして、［Ｇ＋Ｃ］
に富んだＤＮＡ挿入片を回収する確率を高めることがで
きる）を伴うｐＣＤ３９７の複式クローニング部位； ｄ．以下の配列：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／
ＡｓｅＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／ＤｒａＩ
／ＡｓｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（配列
ＩＤ番号：５）（ＤｒａＩとＡｓｅＩに対する認識配列
がアデニンとチミン残基（ＡＴＴＡＡＴとＴＴＴＡＡＡ
のそれぞれ）のみにより構成されることと、ＢｇｌＩＩ
とＸｈｏＩクローニング部位を挟んで２つのＡｓｅＩと
２つのＤｒａＩ部位があるために、ＡｓｅＩまたはＤｒ
ａＩのどちらか一方の制限酵素による組換えクローンの
消化によって、一本の断片としてＢｇｌＩＩまたはＸｈ
ｏＩ部位のどちらか一方にクローニングして［Ｇ＋Ｃ］
−リッチなＤＮＡ挿入片を大きな確率で回収することが
できる）を伴うｐＣＤ４１８の複式クローニング部位。
likmets, 1986 も参照）、簡易化されたゲノムのクロー
ニング手段のための“部分的にふさがれたＸｈｏＩ”方
策の実行を可能にする、ｐＣＤ３８２の唯一つのＢａｍ
ＨＩ部位に隣接する付加的なＸｈｏＩクローニング部
位； ｂ．ｐＣＤ３８３（配列ＩＤ番号：３）の唯一つのＢａ
ｍＨＩ（配列ＩＤ番号：３）に隣接するＸｈｏＩとＸｂ
ａＩクローニング部位； ｃ．以下の配列：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／
ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／ＤｒａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（配列ＩＤ番号：４）（Ｄｒ
ａＩに対する認識配列がアデニンとチミン残基（ＴＴＴ
ＡＡＡ）のみにより構成されることと、ＢｇｌＩＩとＸ
ｈｏＩクローニング部位を挟んで２つのＤｒａＩ部位が
あるために、一本の断片としてＢｇｌＩＩまたはＸｈｏ
Ｉ部位のどちらか一方にクローニングして、［Ｇ＋Ｃ］
に富んだＤＮＡ挿入片を回収する確率を高めることがで
きる）を伴うｐＣＤ３９７の複式クローニング部位； ｄ．以下の配列：ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／
ＡｓｅＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／ＤｒａＩ
／ＡｓｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ（配列
ＩＤ番号：５）（ＤｒａＩとＡｓｅＩに対する認識配列
がアデニンとチミン残基（ＡＴＴＡＡＴとＴＴＴＡＡＡ
のそれぞれ）のみにより構成されることと、ＢｇｌＩＩ
とＸｈｏＩクローニング部位を挟んで２つのＡｓｅＩと
２つのＤｒａＩ部位があるために、ＡｓｅＩまたはＤｒ
ａＩのどちらか一方の制限酵素による組換えクローンの
消化によって、一本の断片としてＢｇｌＩＩまたはＸｈ
ｏＩ部位のどちらか一方にクローニングして［Ｇ＋Ｃ］
−リッチなＤＮＡ挿入片を大きな確率で回収することが
できる）を伴うｐＣＤ４１８の複式クローニング部位。
【００４４】本発明のコスミドシャトルベクターｐＣＤ
４２５は、 ａ．ＣｏｌＥＩの複製開始点と、一つのｃｏｓ部位と、
アンピシリン感受性の大腸菌宿主細胞への形質転換の際
に耐性を与えるアンピシリン耐性マーカーとを含む、ほ
ぼ５キロベースのｐＣＤ１８８部分；と ｂ．ＳＣＰ２＊の複製開始点と、感受性のストレプトミ
セス宿主細胞への形質転換の際に耐性を与える２つの抗
生物質耐性マーカー（チオストレプトンとハイグロマイ
シン）とを含む、ほぼ２５キロベースのｐＩＪ９４０部
分（Hopwood ら，1985，“ストレプトミセス−遺伝子操
作の実験室マニュアル”，John Innes財団，英国，参
照）；とを含む。
４２５は、 ａ．ＣｏｌＥＩの複製開始点と、一つのｃｏｓ部位と、
アンピシリン感受性の大腸菌宿主細胞への形質転換の際
に耐性を与えるアンピシリン耐性マーカーとを含む、ほ
ぼ５キロベースのｐＣＤ１８８部分；と ｂ．ＳＣＰ２＊の複製開始点と、感受性のストレプトミ
セス宿主細胞への形質転換の際に耐性を与える２つの抗
生物質耐性マーカー（チオストレプトンとハイグロマイ
シン）とを含む、ほぼ２５キロベースのｐＩＪ９４０部
分（Hopwood ら，1985，“ストレプトミセス−遺伝子操
作の実験室マニュアル”，John Innes財団，英国，参
照）；とを含む。
【００４５】本発明のコスミドシャトルベクターｐＣＤ
４２５は、いくつかの以下の有利な特徴； ａ．唯一つのＢａｍＨＩクローン部位を持つこと； ｂ．唯一つのＢａｍＨＩ部位の両側に位置する２つのＣ
ｌａＩ部位を持つこと（［Ａ＋Ｔ］−リッチなＣｌａＩ
認識配列（ＡＴＣＧＡＴ）は［Ｇ＋Ｃ］−リッチなスト
レプトミセスのゲノムＤＮＡにはそれほどしばしばある
ものではなく、したがって、大きな断片としてクローニ
ングされた挿入物の取得が可能になる）； ｃ．中くらいの大きさのゲノム断片（１０−２０キロベ
ース）に対して有用なコスミドクローニングベクターで
あること； ｄ．挿入されたＤＮＡの一端からプローブを調製するこ
とを可能にするために、クローニング部位の一方側にお
いてＴ７バクテリオファージプロモーターを持つこと； ｅ．大腸菌とストレプトミセスの両方の複製開始点を運
搬するために往復の能力を持つこと； ｆ．クローニングされたＤＮＡの効率的な増大を容易に
するために、大腸菌内での高コピー数を持つこと； ｇ．無数の突然変異種と野生種の株の相補性の研究のた
めに、理想的な選択となる、ストレプトミセス内での低
コピー数を提供すること；を包含する。
４２５は、いくつかの以下の有利な特徴； ａ．唯一つのＢａｍＨＩクローン部位を持つこと； ｂ．唯一つのＢａｍＨＩ部位の両側に位置する２つのＣ
ｌａＩ部位を持つこと（［Ａ＋Ｔ］−リッチなＣｌａＩ
認識配列（ＡＴＣＧＡＴ）は［Ｇ＋Ｃ］−リッチなスト
レプトミセスのゲノムＤＮＡにはそれほどしばしばある
ものではなく、したがって、大きな断片としてクローニ
ングされた挿入物の取得が可能になる）； ｃ．中くらいの大きさのゲノム断片（１０−２０キロベ
ース）に対して有用なコスミドクローニングベクターで
あること； ｄ．挿入されたＤＮＡの一端からプローブを調製するこ
とを可能にするために、クローニング部位の一方側にお
いてＴ７バクテリオファージプロモーターを持つこと； ｅ．大腸菌とストレプトミセスの両方の複製開始点を運
搬するために往復の能力を持つこと； ｆ．クローニングされたＤＮＡの効率的な増大を容易に
するために、大腸菌内での高コピー数を持つこと； ｇ．無数の突然変異種と野生種の株の相補性の研究のた
めに、理想的な選択となる、ストレプトミセス内での低
コピー数を提供すること；を包含する。
【００４６】以下のものは、ブタペスト条約の条件の下
で、寄託の永続性と、それに加えて本願に特許が認めら
れた場合に、一般の人々への即時の入手を可能にする、
公的に認められた保管所であるAmerican Type Culture
Collection, Rockville, メリーランド，に寄託されて
いる。寄託物は、本出願について未決の間、米国特許商
標庁の長官により権利を与えられると３７ ＣＦＲ
１．１４と３５合衆国連邦法規集１２２の下で認定され
た者に、そして本願の対応出願またはその子出願が申請
された外国の特許法に従って、入手が可能である。
で、寄託の永続性と、それに加えて本願に特許が認めら
れた場合に、一般の人々への即時の入手を可能にする、
公的に認められた保管所であるAmerican Type Culture
Collection, Rockville, メリーランド，に寄託されて
いる。寄託物は、本出願について未決の間、米国特許商
標庁の長官により権利を与えられると３７ ＣＦＲ
１．１４と３５合衆国連邦法規集１２２の下で認定され
た者に、そして本願の対応出願またはその子出願が申請
された外国の特許法に従って、入手が可能である。
【００４７】一般の人々への寄託された微生物の利用の
制限は特許が許可されれば、最終的に取り除かれるであ
ろう。
制限は特許が許可されれば、最終的に取り除かれるであ
ろう。
【００４８】
【表１】 本発明におけるＡＴＣＣ寄託 寄託者Pfizer, Inc.による同定番号 ＡＴＣＣ番号 同定の参考としての引用 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３８０ ６９４２７ 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３８１ ６９４２８ 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３８２ ６９４２９ 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３８３ ６９４３０ 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３８４ ６９４３１ 大腸菌（Escherichia coli），ＦＤ ２９３９２ ６９４３４ ストレプトミセス リビダンス （S. lividans ） ＴＫ６４，ＦＤ ２９４１９ ６９４４５
【００４９】
【実施例】以下の詳述された例は、新規のコスミドクロ
ーニングベクターｐＣＤ８８，ｐＣＤ３８２，ｐＣＤ３
８３，ｐＣＤ３９７，ｐＣＤ４１８，そしてｐＣＤ４２
５に関する。これらの例は、本発明を説明するが、本発
明は、これらの例の特定の事項に限定されるものではな
いことが理解されよう。
ーニングベクターｐＣＤ８８，ｐＣＤ３８２，ｐＣＤ３
８３，ｐＣＤ３９７，ｐＣＤ４１８，そしてｐＣＤ４２
５に関する。これらの例は、本発明を説明するが、本発
明は、これらの例の特定の事項に限定されるものではな
いことが理解されよう。
【００５０】実施例１ 大腸菌ＣＤ１５５株の培養とコスミドベクターｐＰＦＺ
５４３の分離 大腸菌ＣＤ１５５株はアンピシリン耐性の形質転換細胞
である。それは、最初は、Maniatisら，分子クローニン
グ−実験室の手引き，Cold Spring Harbor Laboratory,
1989,に記述されたような標準的操作に従ってプラスミ
ドｐＰＦＺ５４３を用いた、コンピテントな大腸菌Ｋ１
２ ＤＨ５−α細胞の形質転換により獲得されたもので
ある。コスミドベクターｐＰＦＺ５４３は、親ベクター
のポリリンカー領域に現われるｄａｍメチル化部位を欠
いたコスミドベクターｐＰＦＺ５１４の改良された誘導
体である。コスミドベクターｐＰＦＺ５１４の構造と利
用は、Binnieら，J. Bacteriol., 1989, 171:887に述べ
られている。
５４３の分離 大腸菌ＣＤ１５５株はアンピシリン耐性の形質転換細胞
である。それは、最初は、Maniatisら，分子クローニン
グ−実験室の手引き，Cold Spring Harbor Laboratory,
1989,に記述されたような標準的操作に従ってプラスミ
ドｐＰＦＺ５４３を用いた、コンピテントな大腸菌Ｋ１
２ ＤＨ５−α細胞の形質転換により獲得されたもので
ある。コスミドベクターｐＰＦＺ５４３は、親ベクター
のポリリンカー領域に現われるｄａｍメチル化部位を欠
いたコスミドベクターｐＰＦＺ５１４の改良された誘導
体である。コスミドベクターｐＰＦＺ５１４の構造と利
用は、Binnieら，J. Bacteriol., 1989, 171:887に述べ
られている。
【００５１】大腸菌ＣＤ１５５株の単一の細菌コロニー
は、１リットルの水溶液につき、５０ミリグラムのアン
ピシリンとともに、１０グラムのバクトトリプトン、５
グラムのバクト酵母抽出物、１０グラムの塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）を含むＬＢ培地に、以下の標準微生物
学の手順により接種された。培養菌は３５°Ｃで一晩
（１２−１５時間）培養された。
は、１リットルの水溶液につき、５０ミリグラムのアン
ピシリンとともに、１０グラムのバクトトリプトン、５
グラムのバクト酵母抽出物、１０グラムの塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）を含むＬＢ培地に、以下の標準微生物
学の手順により接種された。培養菌は３５°Ｃで一晩
（１２−１５時間）培養された。
【００５２】次の朝、細菌の細胞は、４°Ｃ、１０，０
００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより採取され
た。コスミドベクターｐＰＦＺ５４３は、採取された新
鮮な大腸菌ＣＤ１５５の細胞から、Denoyaら，Microbio
s Lett., 1985, 29:87に述べられたように、Birnboimと
Doly, Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513の方法の変形
を使用して分離された。分離されたプラスミドＤＮＡ
は、その後、緩衝液１０マイクロリットル当たりほぼ１
マイクログラムのｐＰＦＺ５４３の濃度に調製するため
に、ＤＮＡ緩衝液（トリスアミノメタン−塩酸（Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ）１０ミリモル，塩化ナトリウム４ミリモ
ル，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）０．１ミリモ
ル；ｐＨ７．５）に溶解された。
００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより採取され
た。コスミドベクターｐＰＦＺ５４３は、採取された新
鮮な大腸菌ＣＤ１５５の細胞から、Denoyaら，Microbio
s Lett., 1985, 29:87に述べられたように、Birnboimと
Doly, Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513の方法の変形
を使用して分離された。分離されたプラスミドＤＮＡ
は、その後、緩衝液１０マイクロリットル当たりほぼ１
マイクログラムのｐＰＦＺ５４３の濃度に調製するため
に、ＤＮＡ緩衝液（トリスアミノメタン−塩酸（Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ）１０ミリモル，塩化ナトリウム４ミリモ
ル，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）０．１ミリモ
ル；ｐＨ７．５）に溶解された。
【００５３】実施例２ コスミドベクターｐＣＤ１８４の構築 コスミドベクターｐＣＤ１８４は、ｐＰＦＺ５４３（図
２参照）のポリリンカー領域の除去により構築された。
“ポリリンカー”、“ポリクローニング部位”、そして
“マルチプルクローニング部位”は接近して配列された
一連の合成のクローニング部位で、一般にクローニング
実験に使用される制限酵素によって認識される配列より
成る。ベクターｐＰＦＺ５４３からのポリリンカーは、
ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＢｇｌＩＩ，Ｘｂａ
Ｉ，ＢａｍＨＩ，そしてＳａｌＩに対する開裂部位の縦
並びの配列から成る。試験管内でプラスミドＤＮＡを特
定の部位で開裂させること、予め開裂されたＤＮＡを連
結させること、そして使用する特定の酵素の選定のため
に使われる技術は、分子生物学の技術を有する者に良く
知られており、例えば、Maniatisらによる、実験室の手
引き“分子クローニング”（Cold Spring Harbor Labor
atory, 1989 ）、に述べられている。プラスミドｐＰＦ
Ｚ５４３に現われるポリリンカーは、以下の技術によっ
て削除された：３０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液中
の３マイクログラムのプラスミドｐＰＦＺ５４３は、２
０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（全ての制限酵素はBoeh
ringerMannheim Biochemicalsより購入された）ととも
に製造者によって指定されたアッセイ緩衝液中で、３７
°Ｃで２時間、総反応量４０マイクロリットルで、イン
キュベートされた。ＳａｌＩによる制限酵素消化に続い
て、ＤＮＡは同量のフェノール−クロロホルムで２回、
同量のエーテルで２回抽出され、そして最後にＤＮＡは
２倍量の無水エタノールによって沈殿された。沈殿され
たＤＮＡは、１００００ｘＧで１０分間の遠心分離によ
り回収され、真空下で乾燥された。その後、ＳａｌＩ処
理されたＤＮＡはＤＮＡ緩衝液１２マイクロリットル中
に溶解され、１ユニットのリガーゼ（New England BioL
abs ）とともに、製造者により指定された条件下で、１
６°Ｃ、総反応量２０マイクロリットルで、一晩（１２
−１５時間）インキュベートされた。反応はアッセイの
試験管を氷の上に移すことで終結され、１５マイクロリ
ットルの反応混合物は、その後、製造者に推奨された方
法により、コンピテントな大腸菌ＨＢ１０１細胞（Life
Technologies, Inc.,Gaithersburg, メリーランドか
ら購入）を形質転換させるのに使用された。多くのアン
ピシリン耐性形質転換体が得られた。これらのコロニー
が、以下のように唯一のＳａｌＩ制限部位を含むプラス
ミドｐＣＤ１８４を持つことが確認された：即ち、ＣＤ
１８４株として示された１つのコロニーが選択され；プ
ラスミドＤＮＡはこの株から（実施例１にｐＰＦＺ５４
３について既に述べられた方法により）分離され、制限
酵素ＳａｌＩによって開裂され、制限酵素ＢａｍＨＩ，
ＸｂａＩ，そしてＢｇｌＩＩに対して感受性の部位を含
まない（図４）ことが示された。
２参照）のポリリンカー領域の除去により構築された。
“ポリリンカー”、“ポリクローニング部位”、そして
“マルチプルクローニング部位”は接近して配列された
一連の合成のクローニング部位で、一般にクローニング
実験に使用される制限酵素によって認識される配列より
成る。ベクターｐＰＦＺ５４３からのポリリンカーは、
ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＢｇｌＩＩ，Ｘｂａ
Ｉ，ＢａｍＨＩ，そしてＳａｌＩに対する開裂部位の縦
並びの配列から成る。試験管内でプラスミドＤＮＡを特
定の部位で開裂させること、予め開裂されたＤＮＡを連
結させること、そして使用する特定の酵素の選定のため
に使われる技術は、分子生物学の技術を有する者に良く
知られており、例えば、Maniatisらによる、実験室の手
引き“分子クローニング”（Cold Spring Harbor Labor
atory, 1989 ）、に述べられている。プラスミドｐＰＦ
Ｚ５４３に現われるポリリンカーは、以下の技術によっ
て削除された：３０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液中
の３マイクログラムのプラスミドｐＰＦＺ５４３は、２
０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（全ての制限酵素はBoeh
ringerMannheim Biochemicalsより購入された）ととも
に製造者によって指定されたアッセイ緩衝液中で、３７
°Ｃで２時間、総反応量４０マイクロリットルで、イン
キュベートされた。ＳａｌＩによる制限酵素消化に続い
て、ＤＮＡは同量のフェノール−クロロホルムで２回、
同量のエーテルで２回抽出され、そして最後にＤＮＡは
２倍量の無水エタノールによって沈殿された。沈殿され
たＤＮＡは、１００００ｘＧで１０分間の遠心分離によ
り回収され、真空下で乾燥された。その後、ＳａｌＩ処
理されたＤＮＡはＤＮＡ緩衝液１２マイクロリットル中
に溶解され、１ユニットのリガーゼ（New England BioL
abs ）とともに、製造者により指定された条件下で、１
６°Ｃ、総反応量２０マイクロリットルで、一晩（１２
−１５時間）インキュベートされた。反応はアッセイの
試験管を氷の上に移すことで終結され、１５マイクロリ
ットルの反応混合物は、その後、製造者に推奨された方
法により、コンピテントな大腸菌ＨＢ１０１細胞（Life
Technologies, Inc.,Gaithersburg, メリーランドか
ら購入）を形質転換させるのに使用された。多くのアン
ピシリン耐性形質転換体が得られた。これらのコロニー
が、以下のように唯一のＳａｌＩ制限部位を含むプラス
ミドｐＣＤ１８４を持つことが確認された：即ち、ＣＤ
１８４株として示された１つのコロニーが選択され；プ
ラスミドＤＮＡはこの株から（実施例１にｐＰＦＺ５４
３について既に述べられた方法により）分離され、制限
酵素ＳａｌＩによって開裂され、制限酵素ＢａｍＨＩ，
ＸｂａＩ，そしてＢｇｌＩＩに対して感受性の部位を含
まない（図４）ことが示された。
【００５４】実施例３ コスミドベクターｐＣＤ１９３の構築 Ａ．コスミドベクターｐＣＤ１８４のＰｓｔＩ／Ｃｌａ
Ｉ消化と、ほぼ４．２キロベースの制限断片の分離 約５マイクログラムのプラスミドｐＣＤ１８４、１０ユ
ニットのＰｓｔＩ制限酵素と１０ユニットのＣｌａＩ制
限酵素は、製造者（Boehringer）により指定されたアッ
セイ緩衝液中で、３７°Ｃで２時間、総反応量６０マイ
クロリットルでインキュベートされた。試料は、その
後、Maniatisらによって述べられたように、１ＸＴＢＥ
緩衝液（９０ミリモルのトリスアミノメタン−塩酸（Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ），ｐＨ８．５，９０ミリモルのホウ
酸，２．５ミリモルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）中で、水平な１．２％アガロースゲルの電気泳動
に、１００Ｖで１．５時間かけられた。分離されたＤＮ
Ａは、臭化エチジウム（エチジウム ブロミド）によっ
て染色されることにより、３６５ナノメータの紫外線に
蛍光性の帯として視覚化されて、ゲルの中の位置を決定
した。４．２キロベースのＤＮＡの帯は、剃刀の刃で薄
く切られ、ＤＮＡは、一方向性の電気泳動抽出器（Inte
rnational Biotechnology Inc., New Haven, コネチカ
ット）を使用して、５０分間、８０ボルトの電気泳動に
よって、アガロースゲルから、７．５モルのアンモニウ
ムアセテートに満たされたＶ形のくぼみに回収された。
ＤＮＡは、その後、エタノールで沈殿されてペレットに
され、最終的に１０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に
再び溶解された。
Ｉ消化と、ほぼ４．２キロベースの制限断片の分離 約５マイクログラムのプラスミドｐＣＤ１８４、１０ユ
ニットのＰｓｔＩ制限酵素と１０ユニットのＣｌａＩ制
限酵素は、製造者（Boehringer）により指定されたアッ
セイ緩衝液中で、３７°Ｃで２時間、総反応量６０マイ
クロリットルでインキュベートされた。試料は、その
後、Maniatisらによって述べられたように、１ＸＴＢＥ
緩衝液（９０ミリモルのトリスアミノメタン−塩酸（Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ），ｐＨ８．５，９０ミリモルのホウ
酸，２．５ミリモルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）中で、水平な１．２％アガロースゲルの電気泳動
に、１００Ｖで１．５時間かけられた。分離されたＤＮ
Ａは、臭化エチジウム（エチジウム ブロミド）によっ
て染色されることにより、３６５ナノメータの紫外線に
蛍光性の帯として視覚化されて、ゲルの中の位置を決定
した。４．２キロベースのＤＮＡの帯は、剃刀の刃で薄
く切られ、ＤＮＡは、一方向性の電気泳動抽出器（Inte
rnational Biotechnology Inc., New Haven, コネチカ
ット）を使用して、５０分間、８０ボルトの電気泳動に
よって、アガロースゲルから、７．５モルのアンモニウ
ムアセテートに満たされたＶ形のくぼみに回収された。
ＤＮＡは、その後、エタノールで沈殿されてペレットに
され、最終的に１０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に
再び溶解された。
【００５５】Ｂ．コスミドベクターｐＷＥ１５のＰｓｔ
Ｉ／ＣｌａＩ消化と、ほぼ０．８キロベースの制限断片
（配列ＩＤ番号１）の分離 ｐＷＥ１５は、Ｔ３とＴ７のバクテリオファージプロモ
ータ（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, カリフ
ォルニアから購入）が側面に位置したＢａｍＨＩクロー
ニング部位を含む８．８キロベースのコスミドベクター
である（図３参照）。ｐＷＥ１５は、０．８キロベース
の範囲に３つのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を持つ
故に、クローニング部位とバクテリオファージプロモー
タを運搬する断片を同定することが最初に必要であっ
た。これは、５つの異なった制限酵素：ＢａｍＨＩ，Ｃ
ｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，そしてＳｓｐＩを使用
した制限解析によって行なわれた。同定は、参照のため
に、製造者から入手したｐＷＥ１５制限酵素地図を使用
して、制限酵素地図作成のための標準の手続き（Maniat
isら, 1989参照）により行なわれた。望ましい断片は、
３つのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ帯の中の最小のものとして同
定され、小さな断片の有効な回収を確実にするために電
気泳動抽出器のくぼみの中のアンモニウム濃度を１０モ
ルに上げることを除いては、上記に述べられたのと同様
な手順に従ってアガロースゲルから回収された。最後の
ＤＮＡペレットは、１０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝
液に再び溶かされた。
Ｉ／ＣｌａＩ消化と、ほぼ０．８キロベースの制限断片
（配列ＩＤ番号１）の分離 ｐＷＥ１５は、Ｔ３とＴ７のバクテリオファージプロモ
ータ（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, カリフ
ォルニアから購入）が側面に位置したＢａｍＨＩクロー
ニング部位を含む８．８キロベースのコスミドベクター
である（図３参照）。ｐＷＥ１５は、０．８キロベース
の範囲に３つのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を持つ
故に、クローニング部位とバクテリオファージプロモー
タを運搬する断片を同定することが最初に必要であっ
た。これは、５つの異なった制限酵素：ＢａｍＨＩ，Ｃ
ｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，そしてＳｓｐＩを使用
した制限解析によって行なわれた。同定は、参照のため
に、製造者から入手したｐＷＥ１５制限酵素地図を使用
して、制限酵素地図作成のための標準の手続き（Maniat
isら, 1989参照）により行なわれた。望ましい断片は、
３つのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ帯の中の最小のものとして同
定され、小さな断片の有効な回収を確実にするために電
気泳動抽出器のくぼみの中のアンモニウム濃度を１０モ
ルに上げることを除いては、上記に述べられたのと同様
な手順に従ってアガロースゲルから回収された。最後の
ＤＮＡペレットは、１０マイクロリットルのＤＮＡ緩衝
液に再び溶かされた。
【００５６】Ｃ．ｐＣＤ１９３を製造するための連結 プラスミドｐＣＤ１８４のほぼ４．２キロベースのＰｓ
ｔＩ／ＣｌａＩ断片（実施例３Ａ参照）約３マイクロリ
ットルと、約８マイクロリットルのほぼ０．８キロベー
スのプラスミドｐＷＥ１５（実施例３Ｂ参照）のＰｓｔ
Ｉ／ＣｌａＩ断片（配列ＩＤ番号：１）は、１ユニット
のリガーゼ（New England Biolabs, Inc., Beverly, マ
サチューセッツ）とともに、製造者によって明示された
条件下、１４°Ｃ、総反応量２０マイクロリットルで一
晩（１２ー１５時間）インキュベートされた。次の朝、
連結混合物が、上記に述べられた方法によって、コンピ
テントな大腸菌ＨＢ１０１の細胞を形質転換させるため
に使用された。ｐＣＤ１９３の制限酵素地図が図５に示
される。
ｔＩ／ＣｌａＩ断片（実施例３Ａ参照）約３マイクロリ
ットルと、約８マイクロリットルのほぼ０．８キロベー
スのプラスミドｐＷＥ１５（実施例３Ｂ参照）のＰｓｔ
Ｉ／ＣｌａＩ断片（配列ＩＤ番号：１）は、１ユニット
のリガーゼ（New England Biolabs, Inc., Beverly, マ
サチューセッツ）とともに、製造者によって明示された
条件下、１４°Ｃ、総反応量２０マイクロリットルで一
晩（１２ー１５時間）インキュベートされた。次の朝、
連結混合物が、上記に述べられた方法によって、コンピ
テントな大腸菌ＨＢ１０１の細胞を形質転換させるため
に使用された。ｐＣＤ１９３の制限酵素地図が図５に示
される。
【００５７】実施例４ コスミドベクターｐＣＤ１８８の構築 Ａ．コスミドベクターｐＣＤ１９３のＣｌａＩ消化と脱
リン酸化 制限酵素消化は、５マイクログラムのプラスミドｐＣＤ
１９３と、ＣｌａＩ制限酵素、および適切なインキュベ
ーション緩衝液が使用されたことを除いて、本質的に上
記実施例のように行なわれた。ＣｌａＩで線状にされた
コスミドベクターｐＣＤ１９３は、その後、子牛の腸の
アルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）（Promega Corp.,
Madison, ウィスコンシンから購入）を使用し、製造者
から手に入れた使用説明書に従って、脱リン酸化され
た。反応混合物は３７°Ｃで３０分間インキュベートさ
れ、ＤＮＡは、その後、連続的にフェノール／クロロホ
ルムおよびエーテルにより抽出され、エタノール沈殿さ
れ、遠心分離によりペレットにされた。最後のペレット
は９マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に再び溶かされ
た。
リン酸化 制限酵素消化は、５マイクログラムのプラスミドｐＣＤ
１９３と、ＣｌａＩ制限酵素、および適切なインキュベ
ーション緩衝液が使用されたことを除いて、本質的に上
記実施例のように行なわれた。ＣｌａＩで線状にされた
コスミドベクターｐＣＤ１９３は、その後、子牛の腸の
アルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）（Promega Corp.,
Madison, ウィスコンシンから購入）を使用し、製造者
から手に入れた使用説明書に従って、脱リン酸化され
た。反応混合物は３７°Ｃで３０分間インキュベートさ
れ、ＤＮＡは、その後、連続的にフェノール／クロロホ
ルムおよびエーテルにより抽出され、エタノール沈殿さ
れ、遠心分離によりペレットにされた。最後のペレット
は９マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に再び溶かされ
た。
【００５８】Ｂ．ＳｓｐＩリンカーのリン酸化 ＳｓｐＩリンカー、５´−ＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＴ−
３´（配列ＩＤ番号：２）が調製された。リンカーＤＮ
Ａのペレット（２６０ナノメータで０．８６ユニットの
可視吸光度を示した）は、３０マイクロリットルのＤＮ
Ａ緩衝液に再び懸濁された。反応物質は以下の成分：７
マイクロリットルのリンカーＤＮＡ、１マイクロリット
ルの１０Ｘキナーゼ緩衝液（７００ミリモルのトリスア
ミノメタン−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）［ｐＨ７．
６］，１００ミリモルの塩化マグネシウム，５０ミリモ
ルのジチオトレイトール（ＤＴＴ））、１マイクロリッ
トルの１０ミリモルのＡＴＰおよび、１マイクロリット
ルのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega Corp. よ
り購入）、より成る。インキュベーションは３７°Ｃで
約１時間であった。
３´（配列ＩＤ番号：２）が調製された。リンカーＤＮ
Ａのペレット（２６０ナノメータで０．８６ユニットの
可視吸光度を示した）は、３０マイクロリットルのＤＮ
Ａ緩衝液に再び懸濁された。反応物質は以下の成分：７
マイクロリットルのリンカーＤＮＡ、１マイクロリット
ルの１０Ｘキナーゼ緩衝液（７００ミリモルのトリスア
ミノメタン−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）［ｐＨ７．
６］，１００ミリモルの塩化マグネシウム，５０ミリモ
ルのジチオトレイトール（ＤＴＴ））、１マイクロリッ
トルの１０ミリモルのＡＴＰおよび、１マイクロリット
ルのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega Corp. よ
り購入）、より成る。インキュベーションは３７°Ｃで
約１時間であった。
【００５９】Ｃ．ｐＣＤ１８８（配列ＩＤ番号：１）を
製造するための連結 ＣｌａＩで線状にされ、脱リン化されたｐＣＤ１９３ベ
クター（実施例４Ａ参照）約９マイクロリットルはリン
カーのリン酸化反応混合液（実施例４Ｂ参照）に加えら
れた。それから、ほぼ１．２マイクロリットルの１０Ｘ
キナーゼ緩衝液、１マイクロリットルの１０ミリモルの
ＡＴＰ、そして、１マイクロリットルのリガーゼ（Coll
aborative Research, Inc., Bedford, マサチューセッ
ツより購入）が次々に加えられ、反応混合物は１４°Ｃ
で、一晩（１２−１５時間）インキュベートされた。次
の朝、上記に論じられた方法によって大腸菌ＨＢ１０１
の細胞を形質転換させるために、連結反応が使用され
た。選択された形質転換細胞はＣＤ１８８株（配列ＩＤ
番号：１）と命名された。同定された形質転換細胞は、
その後、次のコスミドベクターｐＣＤ１８８の製造と分
離に使用された。コスミドベクターｐＣＤ１８８の制限
酵素地図は、図７に示される。構築の概要は図６に示さ
れる。
製造するための連結 ＣｌａＩで線状にされ、脱リン化されたｐＣＤ１９３ベ
クター（実施例４Ａ参照）約９マイクロリットルはリン
カーのリン酸化反応混合液（実施例４Ｂ参照）に加えら
れた。それから、ほぼ１．２マイクロリットルの１０Ｘ
キナーゼ緩衝液、１マイクロリットルの１０ミリモルの
ＡＴＰ、そして、１マイクロリットルのリガーゼ（Coll
aborative Research, Inc., Bedford, マサチューセッ
ツより購入）が次々に加えられ、反応混合物は１４°Ｃ
で、一晩（１２−１５時間）インキュベートされた。次
の朝、上記に論じられた方法によって大腸菌ＨＢ１０１
の細胞を形質転換させるために、連結反応が使用され
た。選択された形質転換細胞はＣＤ１８８株（配列ＩＤ
番号：１）と命名された。同定された形質転換細胞は、
その後、次のコスミドベクターｐＣＤ１８８の製造と分
離に使用された。コスミドベクターｐＣＤ１８８の制限
酵素地図は、図７に示される。構築の概要は図６に示さ
れる。
【００６０】実施例５ コスミドベクターｐＣＤ３８２とｐＣＤ３８３（配列Ｉ
Ｄ番号：３）の構築 Ａ．コスミドベクターｐＣＤ１８８（配列ＩＤ番号：
１）のＢａｍＨＩ消化と脱リン酸化 ベクターｐＣＤ１８８の制限エンドヌクレアーゼ消化と
脱リン酸化は、制限エンドヌクレアーゼ消化の段階で３
マイクログラムのベクターｐＣＤ１８８と、ＢａｍＨＩ
制限酵素と、適切な制限緩衝液を使用することを除い
て、本質的に実施例４Ａに述べられたように行なわれ
た。
Ｄ番号：３）の構築 Ａ．コスミドベクターｐＣＤ１８８（配列ＩＤ番号：
１）のＢａｍＨＩ消化と脱リン酸化 ベクターｐＣＤ１８８の制限エンドヌクレアーゼ消化と
脱リン酸化は、制限エンドヌクレアーゼ消化の段階で３
マイクログラムのベクターｐＣＤ１８８と、ＢａｍＨＩ
制限酵素と、適切な制限緩衝液を使用することを除い
て、本質的に実施例４Ａに述べられたように行なわれ
た。
【００６１】Ｂ．ポリリンカーのリン酸化 ポリリンカー、５´−ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡ
ＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡ
ＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧ−３´（配列ＩＤ番号：３）
が調製された。リンカーＤＮＡのペレット（２６０ナノ
メータで２．５ユニットの可視吸光度を示した）は、１
４マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に再び懸濁された。
このポリリンカーのリン酸化は本質的に実施例４Ｂに述
べられたように行なわれた。
ＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡ
ＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧ−３´（配列ＩＤ番号：３）
が調製された。リンカーＤＮＡのペレット（２６０ナノ
メータで２．５ユニットの可視吸光度を示した）は、１
４マイクロリットルのＤＮＡ緩衝液に再び懸濁された。
このポリリンカーのリン酸化は本質的に実施例４Ｂに述
べられたように行なわれた。
【００６２】Ｃ．ｐＣＤ１８８のＢａｍＨＩ部位へのポ
リリンカーの挿入 実施例５Ｂに述べられたように使用されたリン酸化され
たポリリンカーの量の約半分は、前述の実施例に述べら
れたものと同様な条件下で、約０．１５マイクログラム
のＢａｍＨＩで線状にされたリン酸化されたｐＣＤ１８
８と連結された。連結混合物は、コンピテントな大腸菌
ＤＨ５−アルファ（ＤＨ５−α）細胞を形質転換させる
ために使用された。２つの形質転換細胞が選択され、Ｃ
Ｄ３８２とＣＤ３８３株と命名された。ＣＤ３８２株か
ら分離培養されたプラスミドコスミドベクターｐＣＤ３
８２は、下記の機能的クローニング部位：ＢａｍＨＩと
ＸｈｏＩを持つことがわかった。ＣＤ３８３株から分離
培養されたプラスミドコスミドベクターｐＣＤ３８３
は、下記の機能的クローニング部位：ＢａｍＨＩ、Ｘｂ
ａＩおよびＸｈｏＩ（配列ＩＤ番号：３）（図８参照）
を持つことがわかった。
リリンカーの挿入 実施例５Ｂに述べられたように使用されたリン酸化され
たポリリンカーの量の約半分は、前述の実施例に述べら
れたものと同様な条件下で、約０．１５マイクログラム
のＢａｍＨＩで線状にされたリン酸化されたｐＣＤ１８
８と連結された。連結混合物は、コンピテントな大腸菌
ＤＨ５−アルファ（ＤＨ５−α）細胞を形質転換させる
ために使用された。２つの形質転換細胞が選択され、Ｃ
Ｄ３８２とＣＤ３８３株と命名された。ＣＤ３８２株か
ら分離培養されたプラスミドコスミドベクターｐＣＤ３
８２は、下記の機能的クローニング部位：ＢａｍＨＩと
ＸｈｏＩを持つことがわかった。ＣＤ３８３株から分離
培養されたプラスミドコスミドベクターｐＣＤ３８３
は、下記の機能的クローニング部位：ＢａｍＨＩ、Ｘｂ
ａＩおよびＸｈｏＩ（配列ＩＤ番号：３）（図８参照）
を持つことがわかった。
【００６３】実施例６ コスミドベクターｐＣＤ３９７およびｐＣＤ４１８の構
築 新規のコスミドベクターｐＣＤ３９７とｐＣＤ４１８
は、前述の実施例に述べられたのと同様な技術を使用し
た、特別に設計されたポリリンカー（それぞれ、リンカ
ー＃１８と＃２０である）をベクターｐＣＤ１８８のＢ
ａｍＨＩクローニング部位へ挿入することによって構築
された。２つの新たに設計されたポリリンカー：リンカ
ー＃１８，５´−ＧＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＣ
ＧＡＧＴＴＴＡＡＡＧ（配列ＩＤ番号：４）−３´とリ
ンカー＃２０，５´−ＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡ
ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＧ（配列
番号：５）−３´が調製された。大腸菌ＤＨ５−アルフ
ァ（ＤＨ５−α）のＣＤ３９７株から分離されたプラス
ミドコスミドベクターｐＣＤ３９７は、以下の機能的ク
ローニング部位ＢａｍＨＩ，ＤｒａＩ，ＢｇｌＩＩおよ
びＸｈｏＩを持つことがわかった。大腸菌ＤＨ５−アル
ファ（ＤＨ５−α）のＣＤ４１８株から分離されたプラ
スミドコスミドベクターｐＣＤ４１８は、以下の機能的
クローニング部位ＢａｍＨＩ，ＡｓｅＩ，ＤｒａＩ，Ｂ
ｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ（図８参照）を持つことがわか
った。
築 新規のコスミドベクターｐＣＤ３９７とｐＣＤ４１８
は、前述の実施例に述べられたのと同様な技術を使用し
た、特別に設計されたポリリンカー（それぞれ、リンカ
ー＃１８と＃２０である）をベクターｐＣＤ１８８のＢ
ａｍＨＩクローニング部位へ挿入することによって構築
された。２つの新たに設計されたポリリンカー：リンカ
ー＃１８，５´−ＧＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＣ
ＧＡＧＴＴＴＡＡＡＧ（配列ＩＤ番号：４）−３´とリ
ンカー＃２０，５´−ＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡ
ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＧ（配列
番号：５）−３´が調製された。大腸菌ＤＨ５−アルフ
ァ（ＤＨ５−α）のＣＤ３９７株から分離されたプラス
ミドコスミドベクターｐＣＤ３９７は、以下の機能的ク
ローニング部位ＢａｍＨＩ，ＤｒａＩ，ＢｇｌＩＩおよ
びＸｈｏＩを持つことがわかった。大腸菌ＤＨ５−アル
ファ（ＤＨ５−α）のＣＤ４１８株から分離されたプラ
スミドコスミドベクターｐＣＤ４１８は、以下の機能的
クローニング部位ＢａｍＨＩ，ＡｓｅＩ，ＤｒａＩ，Ｂ
ｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ（図８参照）を持つことがわか
った。
【００６４】実施例７ コスミドシャトルベクターｐＣＤ４２５の構築 Ａ．コスミドベクターｐＣＤ１８８のＢａｍＨＩ消化と
脱リン酸化 ベクターｐＣＤ１８８の制限酵素消化と脱リン酸化は、
約３マイクログラムのベクターｐＣＤ１８８と、Ｂａｍ
ＨＩ制限酵素と、適切な制限緩衝液が、制限エンドヌク
レアーゼ消化の段階で使用されたことを除いて、本質的
に、実施例４Ａに述べられたように行なわれた。
脱リン酸化 ベクターｐＣＤ１８８の制限酵素消化と脱リン酸化は、
約３マイクログラムのベクターｐＣＤ１８８と、Ｂａｍ
ＨＩ制限酵素と、適切な制限緩衝液が、制限エンドヌク
レアーゼ消化の段階で使用されたことを除いて、本質的
に、実施例４Ａに述べられたように行なわれた。
【００６５】Ｂ．ストレプトミセスベクターｐＩＪ９４
０のＢｇｌＩＩ消化 ベクターｐＩＪ９４０の制限エンドヌクレアーゼ消化
は、約２．５マイクログラムのｐＩＪ９４０と、Ｂｇｌ
ＩＩ制限酵素と、適切な制限緩衝液が使用されたことを
除いて、本質的に、上記に述べられたように行なわれ
た。低コピー数のストレプトミセスベクターｐＩＪ９４
０は、John Innes Institute, 英国から、快く提供され
た。
０のＢｇｌＩＩ消化 ベクターｐＩＪ９４０の制限エンドヌクレアーゼ消化
は、約２．５マイクログラムのｐＩＪ９４０と、Ｂｇｌ
ＩＩ制限酵素と、適切な制限緩衝液が使用されたことを
除いて、本質的に、上記に述べられたように行なわれ
た。低コピー数のストレプトミセスベクターｐＩＪ９４
０は、John Innes Institute, 英国から、快く提供され
た。
【００６６】Ｃ．ｐＣＤ４２５の製造のための連結 ＢａｍＨＩで線状にされ、脱リン酸化された約０．６マ
イクログラムのｐＣＤ１８８およびＢｇｌＩＩで線状化
された約２マイクログラムのｐＩＪ９４０を、前記のよ
うにして、１５°Ｃで一晩（１２−１５時間）連結させ
た。選択した大腸菌ＤＨ５−α形質転換体をＣＤ４２５
株と命名した。ＣＤ４２５株から単離したコスミドシャ
トルベクターｐＣＤ４２５の制限酵素地図を図９に示
す。
イクログラムのｐＣＤ１８８およびＢｇｌＩＩで線状化
された約２マイクログラムのｐＩＪ９４０を、前記のよ
うにして、１５°Ｃで一晩（１２−１５時間）連結させ
た。選択した大腸菌ＤＨ５−α形質転換体をＣＤ４２５
株と命名した。ＣＤ４２５株から単離したコスミドシャ
トルベクターｐＣＤ４２５の制限酵素地図を図９に示
す。
【００６７】実施例８ コスミドによるストレプトミセス リビダンス（Strept
omyces lividans ）原形質体の形質転換 シャトルベクターｐＣＤ４２５ ストレプトミセス リビダンスのＴＫ６４株が、この実
験に使用された。この株は、非常によく分析理解されて
おり、ストレプトミセス研究に広く使用されている。ス
トレプトミセス リビダンスの成長と原形質体形成のた
めの培地並びに原形質体の調製および形質転換は、D.
A. Hopwood ら，ストレプトミセスの遺伝子操作−研究
室の手引き 1985, The John Innes Foundation, Norwic
h, 英国，によって述べられたように行なわれた。この
文献は、また、ストレプトミセスリビダンスＴＫ６４株
について述べている。シャトルベクターｐＣＤ４２５に
よって形質転換されたストレプトミセス リビダンス原
形質体（プロトプラスト）は、チオストレプトン耐性に
よって選択された。ベクターｐＣＤ４２５は、親ストレ
プトミセスレプリコンすなわちｐＩＪ９４０と同様の効
率で、ストレプトミセス リビダンスを形質転換させる
ことがわかった。
omyces lividans ）原形質体の形質転換 シャトルベクターｐＣＤ４２５ ストレプトミセス リビダンスのＴＫ６４株が、この実
験に使用された。この株は、非常によく分析理解されて
おり、ストレプトミセス研究に広く使用されている。ス
トレプトミセス リビダンスの成長と原形質体形成のた
めの培地並びに原形質体の調製および形質転換は、D.
A. Hopwood ら，ストレプトミセスの遺伝子操作−研究
室の手引き 1985, The John Innes Foundation, Norwic
h, 英国，によって述べられたように行なわれた。この
文献は、また、ストレプトミセスリビダンスＴＫ６４株
について述べている。シャトルベクターｐＣＤ４２５に
よって形質転換されたストレプトミセス リビダンス原
形質体（プロトプラスト）は、チオストレプトン耐性に
よって選択された。ベクターｐＣＤ４２５は、親ストレ
プトミセスレプリコンすなわちｐＩＪ９４０と同様の効
率で、ストレプトミセス リビダンスを形質転換させる
ことがわかった。
【００６８】いくつかの本発明の実施例が述べられた
が、一方、多くの変化と変形が発明の本質と範囲からは
ずれることなく作られるであろう。
が、一方、多くの変化と変形が発明の本質と範囲からは
ずれることなく作られるであろう。
【００６９】
配列ＩＤ番号：１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ： ７０アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子型： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｉｉｉ）ハイポセティカル： ＮＯ （ｘｉ）配列： 配列ＩＤ番号：１ Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Ala Thr 1 5 10 15 Thr Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Thr Ala Ala Ala Gly Gly Ala 20 25 30 Thr Cys Cys Cys Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ala Gly Thr Cys Gly Thr 35 40 45 50 Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr 55 60 65 Thr Cys 70 配列ＩＤ番号：２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ： １２アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子型： ＤＮＡ（ゲノミック） 配列ＩＤ番号：３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ： ５２アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子型： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｘｉ）配列： 配列ＩＤ番号：３ Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Ala 20 25 30 Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala 35 40 45 50 Gly 配列ＩＤ番号：４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ： ２７アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子型： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｘｉ）配列： 配列ＩＤ番号：４ Gly Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys 1 5 10 15 Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly 20 25 配列ＩＤ番号：５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ： ３７アミノ酸 （Ｂ）型： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ）分子型： ＤＮＡ（ゲノミック） （ｘｉ）配列： 配列ＩＤ番号：５ Gly Ala Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala 20 25 30 Ala Thr Gly 35
【図１】本発明で使用される制限酵素に対するＤＮＡ認
識配列を示す図である。
識配列を示す図である。
【図２】プラスミドｐＰＦＺ５４３の制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図３】プラスミドｐＷＥ１５の制限酵素地図を示す図
である。
である。
【図４】プラスミドｐＣＤ１８４の制限酵素地図を示す
図である。
図である。
【図５】プラスミドｐＣＤ１９３の制限酵素地図を示す
図である。
図である。
【図６】プラスミドｐＣＤ１８８の構築順序を示す図で
ある。
ある。
【図７】プラスミドｐＣＤ１８８の制限酵素地図を示す
図である。
図である。
【図８】プラスミドｐＣＤ１８８、ｐＣＤ３８２、ｐＣ
Ｄ３８３、ｐＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８の複式の
クローニング部位（ＭＣＳ）中に存在する制限認識部位
を示す図である。
Ｄ３８３、ｐＣＤ３９７、そしてｐＣＤ４１８の複式の
クローニング部位（ＭＣＳ）中に存在する制限認識部位
を示す図である。
【図９】プラスミドｐＣＤ４２５の制限酵素地図を示す
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/76 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:55）
Claims (26)
- 【請求項１】 （ａ）ＣｏｌＥＩ複製開始点と、少なく
とも１つのバクテリオファージラムダのＣＯＳ部位を含
む、約４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ
制限断片と、（ｂ）少なくとも２つの異なるバクテリオ
ファージプロモーター配列が側面に配置された少なくと
も１つのＢａｍＨＩクローニング部位を含み、このＢａ
ｍＨＩクローニング部位にはさらに少なくとも２つの制
限部位（配列ＩＤ番号：１）が側面に配置されている、
約０．８キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片
と、（Ｃ）下記抗生物質に対して感受性の大腸菌宿主細
胞に形質転換されたときに耐性を与える少なくとも１つ
の抗生物質マーカーを含むＤＮＡ部分と、から成る、コ
スミドクローニングベクター。 - 【請求項２】 さらに、（ｄ）ＣｌａＩ部位に挿入され
たＳｓｐＩリンカー（配列ＩＤ番号：２）と、（ｅ）Ｅ
ｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩとして示される少
なくとも３つの付加的なクローニング部位とを含む、請
求項１のコスミドクローニングベクター。 - 【請求項３】 ４．２キロベースのＰｓｔＩ／ＣｌａＩ
ＤＮＡ制限断片（配列ＩＤ番号：１）はプラスミドｐ
ＣＤ１８４から誘導され；０．８キロベースのＰｓｔＩ
／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片はｐＷＥ１５から誘導され、そ
の中のＢａｍＨＩクローニング部位には少なくともバク
テリオファージＴ３およびＴ７からのプロモーター配列
が側面に配置され、該ＢａｍＨＩクローニング部位はさ
らに酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩに対する少なくとも
２つの制限部位も側面に配置されており；ＳｓｐＩリン
カー（配列ＩＤ番号：２）はプラスミドｐＣＤ１８４お
よびｐＣＤ１９３（配列ＩＤ番号：１）について述べら
れたＣｌａＩ部位に挿入されている、請求項２のコスミ
ドクローニングベクター。 - 【請求項４】 コスミドクローニングベクターがプラス
ミドである、請求項１のコスミドクローニングベクタ
ー。 - 【請求項５】 プラスミドが、ｐＣＤ１８８（配列ＩＤ
番号：１）、ｐＣＤ３８２（配列ＩＤ番号：３）、ｐＣ
Ｄ３８３（配列ＩＤ番号：３）、ｐＣＤ３９７（配列Ｉ
Ｄ番号：４）およびｐＣＤ４１８（配列ＩＤ番号：５）
で示されるプラスミド群から選択される、請求項４のコ
スミドクローニングベクター。 - 【請求項６】 請求項１のコスミドクローニングベクタ
ーを含む大腸菌宿主細胞。 - 【請求項７】 コスミドクローニングベクターがｐＣＤ
１８８（配列ＩＤ番号：１）、ｐＣＤ３８２（配列ＩＤ
番号：３）、ｐＣＤ３８３（配列ＩＤ番号：３）、ｐＣ
Ｄ３９７（配列ＩＤ番号：４）およびｐＣＤ４１８（配
列ＩＤ番号：５）で示されるプラスミド群から選択され
る、請求項６の宿主細胞。 - 【請求項８】 プラスミドｐＣＤ１８８の全ての構成上
の特徴を含み、さらにＢａｍＨＩクローニング部位の隣
に位置する付加的なＸｈｏＩクローニング部位を含む、
請求項４のコスミドクローニングベクター。 - 【請求項９】 請求項８のコスミドクローニングベクタ
ーを含む大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１０】 プラスミドｐＣＤ１８８（配列ＩＤ番
号：１）の全ての構成上の特徴を含み、さらにＢａｍＨ
Ｉクローニング部位の隣に位置する付加的なＸｈｏＩお
よびＸｂａＩクローニング部位を含む（配列ＩＤ番号：
３）、請求項４のコスミドクローニングベクター。 - 【請求項１１】 請求項１０のコスミドクローニングベ
クターを含む大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１２】 プラスミドｐＣＤ１８８の全ての構成
上の特徴を含み、さらに以下の構成：ＥｃｏＲＩ／Ｎｏ
ｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＤｒａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ／
ＤｒａＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩの複式ク
ローニング部位を含む、請求項４のコスミドクローニン
グベクター。 - 【請求項１３】 請求項１２のコスミドクローニングベ
クターを含む大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１４】 プラスミドｐＣＤ１８８に存在する全
ての構成上の特徴を含み、さらに以下の構成：ＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ／ＡｓｅＩ／ＤｒａＩ／Ｂｇ
ｌＩＩ／ＸｈｏＩ／ＤｒａＩ／ＡｓｅＩ／ＢａｍＨＩ／
ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩを有する複式クローニング部位を
含む、請求項４のコスミドクローニングベクター。 - 【請求項１５】 請求項１４のコスミドクローニングベ
クターを含む大腸菌宿主細胞。 - 【請求項１６】 大腸菌の複製開始点と；下記抗生物質
に対して感受性の大腸菌宿主細胞に形質転換されたとき
に抗生物質耐性を伝える少なくとも１つのＤＮＡ部分
と；少なくとも１つのバクテリオファージからのｃｏｓ
配列と；制限酵素に対する（アデニン＋チミン）に富ん
だ認識配列が側面に配置された少なくとも１つのクロー
ニング部位と；ポリリンカー領域の側面に配置された少
なくとも２つの異なったＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー、からなるコスミドクローニングベクター。 - 【請求項１７】 ストレプトミセス細胞中で低コピー数
に制御するコスミドシャトルクローニングベクターで、
該コスミドシャトルクローニングベクターは； （ａ）約５キロベースのＢａｍＨＩ制限断片を含む大腸
菌複製開始点と、 （ｂ）大腸菌宿主細胞に形質転換されたときに耐性を与
える少なくとも１つの抗生物質マーカーを含むＤＮＡ部
分と； （ｃ）ストレプトミセス複製開始点を含む約２５キロベ
ースのＢｇｌＩＩ制限断片と； （ｄ）感受性のあるストレプトミセス宿主細胞に形質転
換されたときに耐性を与える少なくとも１つの抗生物質
マーカーを含むＤＮＡ部分と； （ｅ）ＢａｍＨＩクローニング部位と： （ｆ）ＢａｍＨＩクローニング部位の側面に配置された
２つのＣｌａＩ部位と、から成るもの。 - 【請求項１８】 ＢａｍＨＩ制限断片がプラスミドｐＣ
Ｄ１８８（配列ＩＤ番号：１）のものである、請求項１
７のコスミドシャトルクローニングベクター。 - 【請求項１９】 ＢｇｌＩＩ制限断片がプラスミドｐＩ
Ｊ９４０のものである、請求項１７のコスミドシャトル
クローニングベクター。 - 【請求項２０】 ベクターが広い種類のストレプトミセ
スおよび／または大腸菌宿主細胞中で効率的に複製する
能力がある、請求項１７のコスミドシャトルクローニン
グベクター。 - 【請求項２１】 コスミドシャトルベクターがプラスミ
ドである、請求項１７のコスミドシャトルクローニング
ベクター。 - 【請求項２２】 ｐＣＤ４２５と命名された請求項２１
のコスミドシャトルクローニングベクター。 - 【請求項２３】 請求項１７のコスミドシャトルクロー
ニングベクターを含むストレプトミセスまたは大腸菌宿
主細胞。 - 【請求項２４】 ストレプトミセス アベルミティリス
（Streptomyces avermitilis）；ストレプトミセス コ
エリコロール（Streptomyces coelicolor ）；ストレプ
トミセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygrosc
opicus）；およびストレプトミセス リビダンス（Stre
ptomyces lividans ）から成る群から選択される、請求
項２３の宿主細胞。 - 【請求項２５】 クローニングシャトルベクターがプラ
スミドｐＣＤ４２５である、請求項２４の宿主細胞。 - 【請求項２６】 クローニングシャトルベクターがプラ
スミドｐＣＤ４２５である、請求項２３の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4871993A | 1993-04-16 | 1993-04-16 | |
| US048719 | 1993-04-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319571A true JPH06319571A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=21956088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6077319A Pending JPH06319571A (ja) | 1993-04-16 | 1994-04-15 | ストレプトミセス菌類のゲノムｄｎａをクローニングするためのコスミドベクター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0620280A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06319571A (ja) |
| CA (1) | CA2121303A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018011518A (ja) * | 2016-07-19 | 2018-01-25 | 国立大学法人 筑波大学 | ストレプトマイセス属微生物用ベクター |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0919623A3 (en) * | 1997-11-17 | 1999-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Procedure and kit for cloning of DNA fragments |
| EP0916733A1 (de) * | 1997-11-17 | 1999-05-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Kit zur Klonierung von Fragmenten |
| US7608448B2 (en) | 2002-03-29 | 2009-10-27 | Wyeth | Method and cloning vectors utilizing intergeneric conjugation for manipulation of actinomycetes biosynthesis genes |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL76421A0 (en) * | 1984-09-27 | 1986-01-31 | Lilly Co Eli | Improvements in or relating to recombinant dna cosmid shuttle vectors |
| US4904598A (en) * | 1986-03-20 | 1990-02-27 | Eli Lilly And Company | Novel plasmid shuttle vectors conferring spiramycin resistance in streptomyces |
| US5149639A (en) * | 1986-03-24 | 1992-09-22 | Abbott Laboratories | Biologically pure cultures of streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production |
| US4874748A (en) * | 1986-03-24 | 1989-10-17 | Abbott Laboratories | Cloning vectors for streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production |
-
1994
- 1994-04-05 EP EP94302414A patent/EP0620280A1/en not_active Withdrawn
- 1994-04-14 CA CA 2121303 patent/CA2121303A1/en not_active Abandoned
- 1994-04-15 JP JP6077319A patent/JPH06319571A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018011518A (ja) * | 2016-07-19 | 2018-01-25 | 国立大学法人 筑波大学 | ストレプトマイセス属微生物用ベクター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2121303A1 (en) | 1994-10-17 |
| EP0620280A1 (en) | 1994-10-19 |
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