JPH05506235A - 蛍光ペプチド及び酵素活性の測定におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛′ペプチド　び　；　の゛　における　の発明の背景 １、発明の分野 本発明は、蛍光ペプチドに関する。より詳しく言うと、本発明は、その他の発色 団（７クセブター基）による蛍光発色団（ドナー基）によりもたらされる所謂蛍 光の分子内または内部消光を示すペプチドに関する。

発色団基間のペプチド結合の酵素開裂は蛍光を増加させる結果となるので、この ようなペプチドは、酵素の特異性の測定に特に有用である。従って、様々のアミ ノ酸配列及び鎖長を有する一連の内部的に消光した蛍光ペプチドは、例えば、種 々の生物系の酵素活性の測定のためのスクリーニングプログラムにおける有用な 道具となり得る。このようなアッセイは、例えばＨＩＶ−１に由来する生物学的 プロテアーゼ及び細胞プロテアーゼの研究を促進させ得るものである。

２、従来技術の説明 本明細書においては、ペプチド化学における通常の略語を使用する。アミノ酸の 記号は、ｌ　ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会に従い、特に断らない限り、ア ミノ酸はＬ一体である。表１中において使用されるアミノ酸の一文字コードは、 Ｉ　ＬＪ　Ｐ　Ａ　Ｃ、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂ’ｉｏｃｈｅｍ、、１３８、ｐ、　３ ７　（１９８４）により推奨されるものである。

下記のその他の略語を使用した： ＾Ｂｚ＝０−７ミノベンゾイル ＨＰＬＣ・高性能液体クロマトグラフィーｄａｎｓｙｌ、ｄｎｓ　＝１５−ジメ チルアミノナフチＪレスルホニＢａＣリーブチルオキシカルボニル ＤＭＦ　−Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミドＤＣＣＩ　＝Ｎ、Ｎ’−ジシクロへ キシルカルボジイミドＦｍｏｃ　＊フルオレンー９−イルメチルオキシカルボＩ Ｒ−赤外スペクトル 丁ＨＦ　＝テトラヒトＯフラン ＴＦＡ　＝　トリフルオロ酢酸 Ｔ１ｃ：薄層りＯマトグラフイー 一ト 以下、シエヒター及びバーガーにより、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、ｖｏｌ、　２７、ｐ、＋５７〜＋６２、（＋９６７）に記 載されたように、術語（・・・Ｓ２、Ｓ４、Ｓ＋゛、Ｓ、゛・・・）を、酵素の サブサイト特異性を定義するために使用しており、これらのサイトにおける基質 の対応結合位置のために（”’　ｐ　ｔ、Ｐｌ、Ｐ１′、Ｐ２゛・・）を同様に 使用している。

タンパク質分解酵素は通常、ポリペプチド鎖中の一定のペプチド結合に選択性を 示す。ある酵素、例えばトリプシンにとって、加水分解の速度は、ペプチド結合 を形成するアミノ酸残基の種類によって主として決定され、主な結合部位、即ち 、Ｓｌ及びＳ、′は、酵素と基質の間の相互作用にとって最も重要であることを 示唆している。その他の酵素とともに、所ｒＲ筒二の緒のまたはより大きい影響 さえも与える。極端な場合、例えば、ホルモン作用及び凝結に関与するいくつか の酵素の場合において、酵素が前記の切断しやすい結合の回りの同定されたアミ ノ酸配列を認識するときにのみ、開裂が生じる。しかしながら、ズブチリシンの ような非特異的であることが一般的に認められる酵素についてさえも、二次的な 相互的作用が支配的な役割を演じることが知られている。酵素の事象から離れて 、このような相互作用が開裂速度にどのように影響を与えるかを理解するために 、及び結合部位における突然変異性に関する部位の重大性を評価するために、従 来行われていた方法より詳しい方法で、基質の各位置に関する酵素の優先性をマ ツピングすることが必要である。このような研究は、遺伝子操作された微生物に より生成された融解タンパク質の特異的開裂のためのタンパク質分解酵素の適用 によって、さらに話題となっている。純１の高い生物学的活性ペプチドを生じさ せるペプチド結合の合成のためのこのような酵素の利用は、このような知識から も利益を得る。

プロテアーゼ特異性についての情報は、合成ペプチド、長さを有する４〜８のア ミノ酸残基を使用して、及びＨＰＬＣによる加水分解、またはより最近では、ブ ＯトンＮＭＲスペクトル（メルダール、Ｍ、及びブレラダム、Ｋ、「固相合成シ ンポジウムの会報」、オックスフォード、１９８９、印刷中）に従って得られた 。

しかしながら、このような方法は、時間がかかり、困難でしかも反応性が劣るの で、合成ペプチドが、発色団によって適当に誘導化され、それらの加水分解の後 に、吸収または蛍光の変化が起こり得ることが要求される。

ペプチド−ＰＮａ及びペプチド−〇Ｎｐ基質のＣ末端からのそれぞれｐ−二トＯ アニリンまたはｐ−二トＯフェノールの解離を分光測定することは、もつとも普 通に採用されている方法の１つである。残念なことに、これらの方法は、あまり 感度がよくなく、切断しやすい結合は、天然のペプチド結合ではない。位置Ｐ＋ ・、Ｐ２１、・・・Ｐ、・ではなく、基質位１１Ｐ５、Ｐ２・・・Ｐｎの影響の みを研究することができる（図１参照）。その上、このタイプの基質は、塩基に 不安定で、溶液中の合成方法によってのみ合成することができる。他のタイプの 基質は、ニトロフェニル吸収の変化の分光測定による検出の後に、−Ｐｈａ　（ ８０２）−Ｐｈｓ−ペプチド結合の加水分解を必要とする。この方法は、感度が 非常に低く、−Ｐｈｍ−（Ｎｏ２）−残基がＰ、サブサイト中に受容されること が要求される。より感度の良い基質は、蛍光プローブを導入することによって得 ることができる。このようなペプチド基質は、そのペプチドのＣまたはＮ末端に おける蛍光基の付加によって構成されてきた。ペプチドβ−ナフチルアミドは、 高感度の蛍光基質として頻繁に使用されている。アミノエチル−２−７ミノービ リジン（ＡＥＡＰ）は、Ｃ末端蛍光ラベルとして使用されている。Ｎ末端ラベル のためのその他のプローブとしては、Ｎ−ピリジン−２−イルグリシン及びシア ノベンゾイソインドール（ＣＢ＋）がある。ダンシル基（１−ジメチルアミノナ フタレン−５−スルホニル）は、通常末端に付加されるが、ペプチドの固相合成 が報告されており、それによると、ダンシル基は、樹脂から開裂した後Ｃ末端エ チレンジアミンか、またはリジン残基の側鎖に付加される。ダンシル基質は、酵 素基質複合体の研究に応用されてきた。ダンシル化（及びマンシル化）されたペ プチドは、微小環境の極性によってそれらの蛍光強度が変化するので、基質が水 がらより疎水性の酵素的空洞へ移動するのにつれて、蛍光の増加が観察される。

酵素中のダンシル基のトリプトファン残基への近接は、エネルギーのトリプトフ ァンからダンシル基への転移をもたらすこととなる（ヤロンら、　（＋９７９） 、　「＾ｎａ１．　８ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　９５．２２８〜２３５参Ｆ、！り分子 内で消光された基質は、蛍光基質のその他の基を構成する。蛍光基に加えてこれ らの基質は、消光発色団を含み、これらの間に位置するペプチド結合が酵素によ り開裂されたときに、蛍光の増加が観察される。

ヤロンらによる「ｕｐ、　ｃｉｔ、　Ｊ及び米国特許第４．３１４．９３６号（ 両者とも本明細沓中に採り入れられている）に記載されているように、２つの機 構が内部消光のためのエネルギー転移プロセスにおいて作用している。分子内衝 突による消光は、有効な転移を確実にするために充分な接触複合体の必要な形成 が頻繁に起こるように、蛍光ドナー及びアクセプターの間に短い間隔が必要であ る。対照してみると、長領域の共鳴エネルギー転移による蛍光の消光は、長い距 離にわたって有効である。従って、フルオレセインからり００フイルへの転移は 、溶液中の８０人の距離において生じることが可能である。フエスターにより（ １９Ｂ４）　ｒ　Ａｎｎ、　Ｐｈｙｓｉｋ」、６、（２）、５５〜７５に開示さ れているように、共鳴エネルギー転移理論の重要性は、転移プロセスはドナーが ７クセブターの励起と同時に基底状態に戻る非放射平行プロセスであることであ る。転移の有効性は、ドナー発色団の発光と７クセプター発色団の吸収の分光一 体的オーバーラップに直接関連する。この転移は、発色団間の距離の第六のエネ ルギー源に応じて減少し、従って、分光的オーバーラツプは、有効な消光を行う ために完全でなければならない。

文献に記載された内部消光した基質のほとんどは、衝突型であり、はんのわずか のアミノ酸のみが、ドナー及びアクセプターの間に挿入されることができる。

高収量を伴う小さな蛍光ブＯ−ブである７ントラニロイル（２−７ミノベンゾイ ルまたは＾８２）基は、−Ｐｈ・（Ｎｏり一とともに使用されているが（米国特 許第４．３１４゜９３６号及びヤロンらｒ　ｏｐ、　ｃｉｔ、Ｊ参照）　、−Ｐ ｈｓ　（Ｎｏｗ）　−基は２以下の残基によって分離されたときに消光基として のみ機能するので、これらの基質は衝突型である。

ダンシル基はまた、−Ｐｈａ　（ＮＪ）−と組み合わせて、衝突型の分子内消光 された基質として使用されている。フレミンガーら、（１９８１）　、　ＦＥＢ Ｓ　Ｌａｔｔｅｒｓ、１３５、）３１〜１３４、内部消光された衝突型の基質に 使用されるその他の蛍光プローブは、ビメイン基（Ｉｌｉａ＋）　（サトーら、 （１９８８）、ｒＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｂ＠ｍ、Ｊ　ＩＳ、２９８〜ｆｆ０ ６）及びナフチル基（ヤロンら、「ｏｐ、　ｅｉｔ、　Ｊ　）である。８ｉｍ基 は、　Ｔｒｐ残基を含む類ペプチド中に導入され、それがＢｉｎ＋蛍光をトリペ プチドレベルまで消光する。ナフチル蛍光を消光するアントラセン−９−イルカ ルボニル基によりＮ末端において誘導化されたペプチド２−ナフチルエチルアミ ンは、トリプシン基質のために使用されている（ヤロンら）。

共鳴エネルギー転移型と考えられているトリプトファン含有ダンシルペプチドさ えもが、テトラペプチドＤｎｓ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−丁「ｐの４．５倍消 光し、その消光は、残基の各添加に対して５のファクターで減少する（ヤロンら 参照）。

ヘプタペプチド０ｎｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｒｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｒｒｐ−１ ／ａ　Ｉは、多くの酵素のプロテアーゼ特異性を探索するために使用されている （Ｎ９＆＾ｕｌｄ、（＋９８９）、「Ａｎａｌ、ｃｈ＠ｍ、Ｊ　、　１８３．５ ０〜５６）。

このペプチドは、ヘキサペプチド配列によってＴｒｐから分離されたダンシル基 によりトリプトファン蛍光の分子内消光を示す。

ダンシル基とＴｒｐの間の直鎮距離は約２２人であり、それは５０％の消光のみ をもたらすべきである。しかしながら、結果は消光は８５％より高い比率で有効 であったことを示しており、２つの発色団は、直鎮の計算が予」すするよりも接 近しているが、または、あるいは介在するＰｒｏ残基の存在によって、エネルギ ー転移に最適な配座内に固定されることができることを示唆している。

上記のペプチドは、このように特別の場合を示すものであり、Ｏｎｓ／Ｔｒｐの 組み合わせは、一般的により長いペプチドの内部消光には応用不可能であると言 うことができる。

さもなければ、ダンシル含有基質は、固相上で合成することができ、新規な突然 変異酵素のスクリーニングプログラムにおいて必要な非常に多種のペプチドを得 ることが必須である平行多重カラムペプチド合成方法によって調製されることが できるので、理想的である。多重カラムペプチド合成は、ホルム　＾及びメルダ ール閘、（１９８８）、ペプチド、＋９８８、Ｐｒｏｃ、２［１’ｔｈ　Ｅｕｒ 。

ｒ＠ｐｔ、　Ｓｙｍｐ、　２０８〜２１０及び特許出願Ｗ　Ｏ９０１０２６０５ に記載されている（両者は参考文献として本明細書中に採り入れられている）、 分光測定的により有望で長領域のエネルギー転移対は、アンドラ二ロイル基及び ＰＨ２基の組み合わせである（ブラータバノバ、Ｅ、に、及びベトコツ、　Ｑ、 Ｏ，（１９８７）　、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　Ｊ、、２４８．９５７〜９６０及び（ ＋９８７）　、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈａｍ、１６２．２１３−２１８）であり、 それが少なくとも４つの残基を分離させる。

しかしながら、このような基質は、従来の固相またはきず、Ｃ末端ペプチド結合 は、不安定である。

マタヨシら、５ｃｉｅｎｃｅ、（＋９９０）　、２４７，９５４−９５８は、Ｄ ＡＢＣＹＬ／εＤＡＮＳ対に基づく内部消光された蛍光基質を研究した。

研究された２つのオクタペプチドは、Ｃ末端蛍光ドナーとして、ＥＤＡＮＳ　（ ５−（２−アミノエチル／アミノ）ナフタレン−７−スルホン酸及び消光７クセ ブターとして、ＧＡＢＡ　（−７ミノ酪酸）スペーサーを介して結合されたＤＡ ＢＣＹＬ　（４−（４−ジメチルアミノフェニル−アゾ）安息香酸を有する５ａ ｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−１１ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ及び５ａｒ−Ｖ ａ　Ｉ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＶａＩ−Ｖａｌ−Ｇｌｎである。

オクタペプチドは、ＨＩＶ−ＩＰＲ，ＨＩＶ−１ウイルスによりコードされたｌ １ｋｄプロテアーゼ及びトリ骨髄芽球ウィルスに由来する関連プロテアーゼに出 来する。

０ＡＢＣＹＬ基のバルク性は、基質結合の潜在的立体障害を避けるために、ＧＡ ＢＡまたはその他のスペーサーの使用を必要とする。

またこのような型の基質は、ＥＤＡＮＳ基の特性によって、多重カラムペプチド 合成方法により調製することができる。

本発明の目的 本発明の目的は、上記の欠点を有しない分子内消光された蛍光ペプチド類を提供 することにある。

より詳しく言うと、本発明の目的は、長領域共鳴エネルギー転移によって分子内 消光される多種類のペプチドを提供することであり、消光は、５０人より長い距 離にわたって有効であり、換言すれば、ドナーとアクセプターは、１５より多い アミノ酸によって分離される。

本発明のその他の目的は、ペプチドを同時平行多重カラム合成方法による合成に 付することかできる、上記特徴を有するペプチドを提供することにある。

本発明の概要 本発明は、特定のドナー／７クセプター対を選択すること、即ち、蛍光ドナーと してアンドラ二ロイル（ローアミノベンゾイル）基を、消光アクセプターとして ３−ニドｏチロシンを使用することによって上記の目的を達成することができる という驚くべき発見に基づくものである。

アンドラ二０イル基は、高収率の小型の極性基である。アントラニルイル基は、 その他のより脂肪親和性の高い蛍光プローブと比較して、ペプチドの水中での溶 解性を増し、酵素及びペプチドアミノ酸のスペクトル領域の充分外側の３２（ｌ ｎｍにおいて励起することができる。アントラニルアミドの発光は、励起波長か ら光分離れた４２０ｎｍにおいて最大を示す。この消光基は従って、アントラニ ルアミドの発光帯と同じ幅及び形状を有する吸収帯において４２０ｎｍの近辺で 吸収しなければならない。さらに、それは、固相への付着のためにカルボン酸及 びペプチドとのアミド結合形成のためにアミン基を含むことが好ましい。３−二 トロチロジンはこのような要求を満たし、連続的流動ポリアミド方法によるＦｍ ｏｃベースの固相ペプチド合成に容易に組入れることができることを発見した。

３−ニトロチロシンは、蛍光消光物質としては過去、文献に記載されていないが 、テトラニトロメタンによる誘導化によるタンパク質中のチロシンの位置の分光 分析の特性決定における使用については、リオルダンらにより、（１９Ｂ？）　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６．３５８〜３６１に記載されている。その吸収帯 のために、それはアントラニロイルとともにのみならず、４００〜４６０ｎｍの スペクトル領域中の発光を有するその他の蛍光物質、例えば、１．８−７ミノナ フタレンスルホン酸、アントラセン及びウンベリフェロンとともに使用すること ができる。同様に、消光７クセブターの吸収帯内での最大発光を有する蛍光ドナ ーを使用してスペクトルのオーバーラツプをできるだけ完全にするような条件で のみ、３−ニトロチロシンに構造的に関連する化合物を消光アクセプターとして 使用することができる。

従って、本発明は、下記一般式 ％式％ で示される分子内消光を示す蛍光ペプチドに関する。

但し、上記式中、Ｑは蛍光消光する置換されたアミノ酸残基 を示し、上記式中、Ｒ７、Ｒ２、Ｒ１、Ｒ４及びＲ６は、水素、ヒドロキシ、ア ルキル、アルコキシ、アミノ、ニトロ、アミド、ハロゲン、アリールまたはアラ ルキルから独立に選択され、Ｒ５からＲ１の少なくとも１つがヒドロキシであり 、少なくとも１つカートロであり、Ｘは、存在しないかまたは−ＧＯ−ＮＨ−１ −ＣＯ−Ｏ−１−Ｓ−２−Ｓ−Ｓ−１−〇−１−ＮＨ−及び−Ｃ，）１．−のい ずれかの組み合わせから選択されることができるスペーサー基であり、ｎ及びｍ は、０から１０の！１数であり、Ｆは、消光残基Ｑの吸収帯内で最大発光を有す る蛍光基であり、 Ａは、アミノ酸残基及びペプチド残基から選択されるスペーサー存在物であり、 ７ミド結合またはエステル結合を介して前記蛍光基Ｆに結合した非ペプチド分子 存在物を含むことができ、 Ｙ、は、○Ｈ，ＮＨ２、アミノ酸残基、ペプチド残基またはＣ末端保護基であり 、 Ｙ２は、Ｈ、アミノ酸残基、ペプチド残基またはＮ末端保護基である。

好適な消光残基Ｑは、３−ニトロチロシン、即ち、ｎ−１、Ｒｊ＝　ＯＨ及びＲ 、＝＝　Ｎ　Ｏ２である。従ッテ、好適な蛍光ペプチドは、一般式 ％式％） （式中、Ｆ、は、４Ｈ〜４６（ｌｎｍの最大発光を有する蛍光基であり、Ａ１は 、ペプチド結合を介して基Ｆに結合したアミノ酸残基またはペプチド残基であり 、Ｙ、は上記定義の通りである）で示される。

好適な蛍光基ＦまたはＦｌは、アントラニＯイル基（＾Ｂｙ）である。Ａはアミ ノ酸残基、または好ましくはペプチド残基、特に２〜２５、好ましくは２〜１５ のアミノ酸を含むペプチド残基である。

明瞭にするために、上記式中で使用される記号Ｆ、Ａ、Ｑ及びＹは、下記表１中 で使用されるアミノ酸の１文字コードと混同しないように注意されたい。

本明細書中、「フルキル」は、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する１ＩＩＪ ４状または分枝鎮状のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロ ピル。

ローブチル、イソブチル、ｔａｒ、ブチル、７ミル及びヘキシルを意味する。

「アルコキシ」は同様に定義される。

「アリール」は、例えば、複素環式アリール及び例えばフェニルを包含する。

「アラルキル」は、例えばベンジル及びフェネチルを包含する。

上記の基は不活性の置換基、例えばハロゲンまたはニトロによって任意に置換さ れることができる。

「１１０ゲン」は、Ｆ、Ｃ１，Ｂｒ及び１を称する。

スペーサーアミノ酸の特性は臨界的ではなく、非アミノＨ存在物、例えば単糖類 または少糖類を含むことができる。

有用なアミノ酸の例としては、例えばモノアミノモノカルボン酸のような脂肪族 アミノ酸、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、７ラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｔ ）、ノルバリン（Ｎｖａｌ）、ロイシン（Ｌｓｕｌ、イソロイシン（ｉｓａ−Ｌ ａｕ）及びノルロイシン（Ｎｌ＠ｕ）、ヒドロキシアミノ酸、例えばセリン（Ｓ ｅｒ）、スレオニンＢｈｒ）及びホモセリン（ｈｏｍｏ−５ａｒ）、イオウ含有 アミノ酸、例えばメチオニン（Ｍ＠ｔ）、シスチン（ＣｙｓＳ）及びシスティン （ＣｙｓＨ）、モノアミノジカルボン酸、例えばアスパラギンｉ１！（＾ｓｐ） 、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びそのアミド、例えばアスパラギン（＾ｓｎｌ及び グルタミン（Ｇｌｎ）、ジアミノモノカルボン酸、例えばオルニチン（Ｏｒｎ） 及びリジン（Ｌｙｓ）及びアルギニン（Ａｒｐ）、芳香族アミノ酸、例えばフェ ニルアラニン（Ｐｈｅ）及びチロシン（丁ｙｒ）並びに複素環式アミノ酸、例え ばヒスチジンｆＨｉｓ）、ブＯリン（Ｐｒｏ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が 挙げられる。慣用ではない構造の有用なアミノ酸の例としては、ペニシラミン（ Ｐ＊ｎ）、アミノリン酸、例えばアラニン−リン酸（Ａｌａｓ）、アミノスルホ ン酸、例えばタウリン（Ｔａυ）、ω−アミノ酸、例えばβ−アラニン（Ｂ＾ｌ ａ）、イソアミノ酸、例えばα−メチルアラニン（＾ｉｂ）、ハロゲンまたはニ ドＯのような不活性、ｆ換基によって置換されたアミノ酸が挙げられる。

これらは、適当な場合には０体及び１体の両者を含む。

所望により、個々のアミノ酸は、それ自体知られた方法で側鎖を保護することが できる。

本発明によるペプチドは、新規の酵素またはその活性のために必要な流体を含む 酵素のスクリーニングの目的に対して特に有用であるため、特別の化合物をその ペプチド鎖中に導入することが望ましい。

一般的には、「ペプチド残基」という表現は、巣にペプチド結合によってのみ結 合されたアミノ酸の配列を包含するだけでなく、１またはそれ以上の結合がペプ チド結合ではなく例えばいわゆるデブシペプチド中に見られるようなエステル結 合であるような配列をも包含するものと、広く解釈される。前記スペーサー存在 物は、非ペプチド存在物、例えば単糖類または少糖類の断片、例えば（ａ−Ｄ− Ｇｌｃ（Ｉ−４））４をも包含することができる。

特に、蛍光基Ｆは、必ずしも、アミドまたはペプチド結合を介してアミノ故に結 合する必要はない。

蛍光基及びそれが付加されるアミノ酸の特性に応じて、それは例えばエステル結 合によって結合することもできる。

従って、Ｆがアンドラ二０イル基であり、Ｎ末端アミノ酸がＳａｒ及びＴｈｒの ようなヒドロキシアミノ酸である場合において、エステル結合及びアミノ結合の 両方が可能である。

同様に、１より多い７ミノ基を含むアミノ酸の場合には、蛍光基はα−７ミノ基 に付加する必要はない。

従って、例えば、ＣまたはＮ末端アミノ酸がＬｙｓである場合において、基Ｆは ε−アミノ基に付加されることがたぶん可能である。

本発明はまた、１またはそれ以上の上記定義のペプチドを含む酵素の活性の決定 に使用される基質に関すその他の観点において、本発明は、試料中の酵素活性を 検出または測定するための方法に関し、その方法は、酵素活性にとって好ましい 条件、即ち、ｐＨ２〜１２において、前記試料を１またはそれ以上の基質ととも にインキユベートシ、インキュベーションの前後に発光する蛍光を測定及び比較 することを含む。

好ましい発色団＾Ｂｔ及びＴｙｒ（Ｎｏ２）の保護された前駆体の合成を反応図 式（図２）に簡単に図示し、以下より詳しく説明する。アントラニル酸によるア シル化は、カップリングを完全にするために高レベルの活性化が要求される。保 護されていないアントラニル酸の７ミノ基を脱離して、溶液中での合成のための ベンゾトリアゾールエステルのようにカルボキシル基を活性化することは、その ような化合物の反応性が低いため充分ではない。それは未保護の７ミノ基とカル ボキシル基との相互作用に起因するものと考えることができ、７ミノ基の保護は 、従って反応性を高めるものである。

このような保護は、２またはそれ以上のアントラニル酸残基の導入を防止すると いう利点も有している。従って、アントラニル酸（１）は、乾ｉＤＭＦ及びトリ エチルアミン中で８ｏｃ２０と反応して、６０％のＢｏａ−Ａ８　ｘ−ＯＨ（２ ）を生成し、それが、アサ−トンらによる（　＋９８８）、Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　 Ｓｏｃ、　Ｐｓｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ＋　、２８８７〜２Ｂ９４の手順を使用し て、Ｉ）ＣＣ＋及びＤｈｂｔ−ＯＨとの反応により、高度に活性化されたＢｏａ −＾Ｂ　ｚ−０−Ｏｈｂ　ｔ　（１）に９７％の収率で転換された。化合物３は 、固相状での高速力、ツブリング反応に使用されることができる。

３−ニトロチロシン（４）は、ショツテン−バウマン条件下でのＦｍａｃ−０− ＮＳｕとの反応により、９１％の収率で、Ｆｍａｃ−Ｔｙｒ　（ＮＯ２）　−Ｏ Ｈ（５）へ転化されることができる。

活性化されたフェノールのいずれのアシル化は、弱塩基、例えばピペリジンによ る処理によって回復することができるので、フェノール性ヒドロキシル基は保護 が必要でない。固相合成の目的のために、化合物５は、０．５当量のＤＣＣＩ及 びＤＭＡＰ触媒との反応によって、樹脂道されるＦｍｏｃ−Ｔｙｒ−（８０２） −ＯＨとの反応の前に、１またはそれ以上のアミノ酸を樹脂に結合させることが できこのシステムの多用途性を示すために、表２中のペプチド６〜７５は、２０ ウエルのマニュアル合成装置での平行多重カラムペプチド合成によって調製され た（メルダール及びブレラダム　ｏｐ、　ｃｉｔ、及びホルム及びメルダールｏ ｐ、　ｃｉｔ、参Ｆ！Ａ　）。このペプチドは、アサ−トンらによりｏｐ、　ｃ ｉｔ、に記載されたＤｈｂｔエステル方法により合成された。以下さらに説明す るように、アシル化の完了は、全てのペプチド生成物の高純度を確保するために 、目でモニターした（本明細書中に参考文献として採り入れられているキヤメロ ンら、Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｘ　Ｉ、２Ｂ９５ −２９０１参照）。ペプチドを分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋なペプチドを 速度論の実験に使用した。エンドベブチターゼズブチリシンＡを試験酵素として 選択した。

合成された基質は、ズブチリシンＡの基質選択性の現、存の情報に基づいて選択 された：ａ）Ｐ、位における芳香族アミノ酸残基に対する選択性、ｂ）ｐ、’　 位における非バルク性残基に対する選択性、Ｃ）Ｐ２°位に−ＴＹｒ　（ＮＯ２ ）−を与える酵素の考えられる能力そして最後はｄ）基質と３２、Ｓ、及びＳ４ サブサイトとの間の相互作用の多大な影響（フィリップ及びペングー、（＋９１ １３ン、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　［１ｉｏｃｈｓｍ、、５１．５−３’ｌ’Ｊ　 ！９．　）　、即ち、加水分解の速度への鎖長の影響。溶解性を高め、外来カル ボキシペプチダーゼによる消化に対してペプチドを保護するためｔこ、Ｃ末端と して７スバラギン酸が選択された。これを基礎に、全ての合成された基質におい て、−Ｐｈｓ−Ｇｌｙ−または−Ｐｈａ−５ｅｒ−結合が好適な開裂点であると 予測される。長ペプチドの開裂点は、ＨＰＬＣによる分離後の生成物のアミノ酸 分析により決定され、−Ｐ　ｈ　ａ　−ＧＩＹ−開裂点が確認された。

図面の簡単な説明 図１は、ペプチド基質上の切断しゃすい結合に関する酵素のサブサイト特異性（ ｓ、、ｓ２、ｓｌ、ｓ１゛　、Ｓ、′）及び対応する基質の結合位Ｒ（ｐ、、Ｐ ２、Ｐｌ、Ｐｌｏ、Ｐｉ’）を示す。

図２は、好適な蛍光及び消光発色団の前駆体の合成を示す。

図３は、本発明によるペプチドの酵素加水分解を示す。

好適実施例の詳細な説明 実験手順 一般的手順 溶媒をラッシピリングの充填カラム中で、適当な圧力において蒸留した。ＤＭＦ を、使用前にＤｈｂｔ−ＯＨと混合することにより分析した。ＴＨＦ及びジオキ サンを精製及び乾燥のために活性アルミナの短カラムを通過させた。Ｆｍｏｃア ミノ酸はベイヶムまたはミリゲンがら購入し、アサ−トンらによりｏｐ、ｃｉｔ 、に記載されたように、活性０ｈｂｔエステルに転移させた。０ｈｂｔエステル の純度を、ＨＰＬＣ及びＩＲスペクトルによって調べた。

Ｆｍａｃ−０−ＮＳｕ、　ニドｏチロシン、０ｈｂｔ−０）１．０ＣＣＩ及びｆ ｌｏｅ、０は、フルリカ製である。「マクロソーブ−３Ｐ日　２５ｏ」は、スタ ーリングオーガニクスから購入し、エチレンジアミン及びヒドロキシメチルフェ ノキシ酢酸ｏｈｂｔエステルにより誘導化した。’Ｈ−ＩＪＭＲ−スペクトルは 、ブラッカーのＡＭ５００５００ＭＨｚスペクトロメーター上に記録し、１日ス ペクトルは、パーキンエルマーの１５７スベクトロフオトメーター上に記録し、 ＨＰＬＣは、緩衝液Ａ（［１，１％ＴＦＡ）及びＭ受液Ｂ（アセトニトリル中０ ．１％ＴＦＡ及び１０％水）を使用して、流速１ｍ１／分で、適当な勾配により 、ツババック５　ｕ　Ｃ＋ｓ逆相カラムを使用して、水勾配ＨＰＬＣ装置で行っ た。完全に脱保護されたペプチドを、６ＮのＨＣｌ中で１１０℃において加水分 解し、デュラムのアミノ酸分析装置により分析した。

実施例１ 蛍光及び消光発色団の前駆体の調製（図２参照）２−ｔ−ブチルオキシカルボニ ルアミノベンゾエート１１ｏｃ２　（５１，６ｇ、２３６ｍｍｏｌ）　、　７ン トラニルｉ！（＋）（２５゜９９．１８９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５ ０ｍｌ、３６０ｍｍｏｌ）を、Ｄ　Ｍ　Ｆ　（５０ｍ１）中に溶解した。数分以 内に気体の発生が始まり、前記気体の発生が終わるまで、２４時間２０　”Ｃに おいて前記混合物を放置した。ＥｔＯＡｃ中のＴＩｃが反応が完結したことを示 し、前記混合物を木炭で処理し、ＤＭＦですすいだセライトを介して濾過した。

ＤＭＦを真空下において３０”Ｃで除去し、残存物をジクロロメタン（２００ｍ １）中に溶解し、１０％炭酸ナトリウム溶液（１００ｍ１）で抽出した。暗褐色 の水性相をジグ００メタンで抽出し、廃棄した。合わせた有機相を水１０Ｇｍｌ で３回抽出した。

水性の抽出物をｐＨ２に酸性化し、ジエチルエーテル（３Ｘ　ｌ００ｍ１）で抽 出した。硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、容量をＩＱ［１ｍｌに減じ、生 成物が結晶化するまで石油エーテルを添加した。粗生成物を５０％水性エタノー ルから再結晶して、純粋な１ｌｏｃ−７ントラニルＨ（２）　２６９　（６０％ ）を得た。融点１４９〜１５０℃。

分析値　ＣＨＮ（％） 計算値 （Ｃ＋ｔＨ＋５ＮＯ−として） ６０．７５　８．３７　５．９０ 実測値　６０．７２　８．３７　６．０２ｓ６．８．４８　（８，４）；　１３ ｏｃ、　１．５５；　ＣＱＯＨ，１０，０２゜３．４−ジヒドロ−４−オキソ− １，２，３−ベンゾトリアゾール−３−イル−２−ｔ−ブチルオキシ−カルボニ ル７ミノベンゾエート（３） ２−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ安息香酸（２）（２，３７９、ＩＯｍｍ ｏｌ）をジクロｏメタ：／　（１５ｍ１）　及Ｕ　ＴＨＦ（５ｍｌ）中に溶解し た。この混合物を一５℃に冷却し、ＤＣＣＩ　（２，０６９、Ｉｌｌｍｍａｌ） を添加した。５分後に、Ｄｈｂｔ−０）１　（ｌｏｍｍｏｌ、１．６３９）を添 加し、この混合物を一５℃において１時間及び４℃においで１６時間攪拌した。

濾過後に、溶媒を真空下で除去し、得られた生成物をジエチルエーテル（３ｉ１ ｍｌ）から結晶化させた。濾過ｆこより生成物３．７９（９７％）が得られ、そ れをＨＰＬｃにより精製した。融点１５５〜１５６℃。

５９．８８　４．７５　１４．８５ 実瀾値　５９．５５　４．８３　１４．５９（７，４）；　Ｈ６’、８．１０　 （７，４，７，７）、　１２１；　Ｈ７’、　７．９３　（７，７，７，８）； Ｈ８’、８．４２　（７，８，１，２）；　Ｂｏｃ、　１．５２：　ＮＨ，９， ５８、Ｎ　−フルオレン−９−イルメチルオキシカルボニル−３−二トロチロジ ン（５） ＨＴｙｒ　ｆＮＯｔ）　−ＯＨ（４）　（３，３’９９．１５ｍｍｏｌ）を炭酸 ナトリウム（３，！Ｉｌ！、、、３８ｍｍｏｌ）を含む水５０ｍ１中に溶解し、 ジオキサン（２Ｏｎ＋Ｉ）を添加した。Ｆｍｏｅ−０−ＮＳｕ　（５，１２０ｇ 、１５、５ｍｍｏ　ｌ　）をジオキサン（２０ｍ１）中に溶解し、０℃において 滴下した。この混合物を０℃において１時間及び２０℃において３時間攪拌した 。ジオキサンを真空下で除去し、残留物を水５０ｍ１で希釈した。副生成物をエ ーテルで抽出し、溶液をクエン酸により酸性化した。

沈殿物を濾過により集め、乾燥させた。生成物を酢酸エチルで抽出し、濾過した 後に、それを３倍量の石油エーテル（２：　７）を添加することにより結晶化し た。

濾過により結晶性物質を集め、石油で洗浄して、生成物８，０９９（収率９１％ ）を得た。融点１４５〜１４８℃。

分析値　ＣＨＮ（％） 計算値 （Ｃ＋＊Ｈ＋＊Ｎ４０ｓとして） ６４．２８　４．５０　６．２５ 実測値　６３，４４　４．５８　８１６’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）：　６　ｐ ｐｍ　（Ｊ　Ｈ２）；　０１−）！、　ｉｏ、ｓ２：　Ｈ２，４−７２（５，０ ，６，０゜７．０　Ｈｚ）；　Ｈ３，３，１２（１３，５，６−０）；　Ｈ３’ 、　３．２６　（１３，５，５，０）；　Ｈ５゜７．９６：　Ｈ５’、　７．３ ５　（８，０）；　８６°、　７−１２　（８，０）；　Ｆｍｏｃ　４．２４　 （６，５）；４．４５　（６，５，ｘｏ、ｓ）；　４．５４　（６−５，１０， ５）、　７．３７　（７ｔＯ）、　７．４４　（７，５゜７．０）、　７．５４ 　（７・５．７．５）、　７．８１　（７，５＋。

実施例２ ２０ウ工ル合成装置によるＡＢｚ−ペプチド−Ｔｙｒ（Ｎ。

２）−ＡＳ９の多重カラム合成 Ｆｍｏｃ−＾Ｈｒ　（ｔａｕ）　−ＯＨ（６５０ｍｇ、１．６２５ｍｍｏｌ）を ジクロ。

メタン（１５ｍｌ）中に溶解し、この溶液を０℃に冷却した。Ｄ　ＣＣＩ　（１ ６７ｍｇ、０．８１２ｍｍｏｌ）　ヲ添加Ｌ　Ｔ：、得うれた混合物を０℃にお いて１５分間攪拌した。濾過及び蒸発後、残留物をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し 、焼結漏斗中の予め膨潤された酸不安定な「マクロソーブ５ＰＲ−２５０Ｊ樹脂 （８５ｈｇ、０．６１３ｍｍｏｌ）に添加した。

ＤＭＡＰ　（２０，５ｍ９．０．１６３ｍｍｏｌ）を添加し、その物質を回転運 動により１時間振盪した。前記樹脂をＤＭＦ（２０ｍｌ）で洗浄し、ピペリジン （ＯＭＦ中２０％、１５ｍ１）を脱保護の目的で添加した。１０分間振盪した後 、ピペリジンを除去し、樹脂をＤ　Ｍ　Ｆ　ｌ００ｍ１により通す方法で洗浄し た。Ｆｍｏｃ−ｒｙｒ　（Ｎｏ、）　−ＱＨ（２１９ｍｇ、４８９作ｏｆ）及び Ｔ　Ｂ　Ｔ　Ｕ　（１５７１１９，４８９＋ｎｍａｌ）を添加し、ＤＭＦ　（１ ５ｍ１）中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（０，６３ｍｇ、４８９ｍ ｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を２時間振盪した。全ての試薬をＤＭＦによ る洗浄により除去し、ＤＭＦをジエチルエーテルとともに除去した。

前記樹脂を乾燥させ、２ｏウ工ルマニユアル多重カラムペプチド合成装置の７ウ エル中に、９０ｍｇの分量を計り入れた。全ての溶媒をＩＯＱｍｌのプロピレン シリンジで取扱った。ＤＭＦにより樹脂を膨潤させた後、ウェルの下の室上で、 真空下で、樹脂から溶媒を排出させ、流量計を介して空気をわずかに加圧した。

Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ（各ウェル中５００１．Ｉｌ）中のピペリジン（２０％）に よる１分間及び１０分間の処理により除去した。このピペリジン溶液を吸引によ り除去し、ウェルをＤＭＦ（１回当り１ｍｌで５回）で洗浄した。下記表１中の ペプチド６〜１５のＣ末端から位置３に相当するＦｍｏｃアミノＦｉ［１ｈｂｔ エステル（２，５ａ量）を、相互汚染を妨げるためのポリエチレンカバー中の孔 を介して、前記合成装置中の各ウェル中に直接計り入れた（表１中、簡潔にする ために、アミノ酸の１文字コードを使用した）。わずかに加圧し、ＤＭＦ（４０ ０μｍ）を各ウェルに添加した。２時間の間、このウェルシステムを３０分毎に 振盪した。反応混合物を除去し、ウェルをＤＭＦ（１回当り１ｍｌで５回）で； 先浄した。各Ｆｍｏｃアミノｉ！Ｄｈｂｔエステル（２，５当量）を適用するこ とにより、各ペプチド６〜１５の端部までこの合成サイクルを繰り返した。

添加された最後の残基は、Ｂｏｃ−Ａ［１ｚ−０−ＯＨＢＴ　（２，５当量）で あり、ＤＭＦ及びジエチルエーテルで洗浄した後、この樹脂を乾燥させた。ペプ チドを水性ＴＦＡ（９５％、１ｍ１）により前記樹脂から開裂させ、それによっ て、Ｂｏｃ基もＡＢｚ基から除去された。

実施例３ 分子内消光された基質の酵素加水分解 実施例２において調製されたペプチド６〜１５を、Ｊ度０．２〜１．　［１ｍＭ となるように、ＤＭＦ中に溶解した。

この溶液（＋２！Ｂｔ　＋）を５０ｍＭのビシン、２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ８゜ ５（２３７５μｍ）に添加し、３２０ｎｍにおける励起による４２０ｎｍにおけ る溶液の初期蛍光を測定した。同じビシン暖衝液中のズブチリシンＡのストック 溶液から、適白量を添加して、最終酵素濃度を２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−Ｉ′ｍｇ／ｍｌ 　〜２　ｍｇ／ｍ１とした。この反応の後、３２Ｑｎｍにおける励起による４２ ０ｎｍにおける発光をモニターした。温度を、２４℃に維持した。加水分解を完 了するまで実施し、シーゲルにより（１９８８）、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃａ１ｃｕｌａｔｉｏｎｓＪ　、ジョンウィリーアンドサンズ、３９３〜３９６ に記載されたミカエリス−メンテンの式の積分方式を使用する漸進曲線から、特 異定数ｋｊ、、／Ｌを測定した。

ペプチドが０．４〜５０μｍの濃度に溶解されたときに、限られた蛍光が、３２ ０ｎｍの励起により４２０ｎｍにおいて観察された。ズブチリシンＡをｎＭ量添 加することにより、図３の化合物６により例示されるように、蛍光が増加した。

１０未満の鎖長を有する全ての基質について、基質の蛍光は、最終開裂生成物の く３％であった。より長いペプチドについては、初期蛍光の漸進的な増加が観察 された。各アミノ酸の平均長さを３人と仮定すると、前記ドナーアクセプターシ ステムは、５０人より長い距離にわたって有効であり、アントラニルアミド及び ３−ニド０チロシンは、理想的な長領域共鳴エネルギー転移対であると考えるこ とができる。

１または２のアラニル残基による延長によって、各ヶ、２及び５のオーダでに、 、、／に、、が増加するので、化合物６．７及び８の加水分解のに、、／に、、 値（表１）が、鎖長の重要性を確認している。その他の２のアラニル残基、例え ば化合物１０による延長は、ｋ、、、／に、にわずかな影響を与えている。

しかしながら、化合物９中の３つのアラニル残基について、ｋ、１７にヨは、化 合物８及び１０よりも３〜５倍小さい。これは幾分驚くべきことであるが、この ことは、＾Ｂｒ基の影響が化合物８に対する好適性を増加させ、または化合物９ に対する好適性を減少させることを示している。この基質中の芳香族ＡＢｚ基が ２４位に存在し、ズブチリシンＡがこの位置における芳香族アミノ酸残基に選択 性を示すことが知られているので、上記の前者の可能性が提案されるのである。

化合物８と１１及び化合物８と１２の加水分解のに６、、／に、値の比較により 、ズブチリシンＡは、Ｐ、°位におけるＧＩＹ及びＳａｒの等しい選択性を示し 、８７位におけるＰｒｏがＡｌａに関して逆効果を与えることが示される。

化合物１３〜１５について、鎖長は各々３つのアミノ酸残基により化合物１０に 関して、さらに増加する。

ｋ、、、／ｋＭは、約２００．０００において安定し、非常に長い基質について はわずかに減少し、一方、分子内消光の有効性が、アンドラ二Ｏイル基と３−ニ ドＯチＯシン残基の間の鎖長の減少に応じて減じることは記述に値す従って、間 隔が約４８人に相当する１６のアミノ酸である化合物１５について、ズブチリシ ン開裂後の蛍光の約１５％の初期蛍光が１！察される。

実際のスクリーニングの目的では、約２０〜２７のアミノ酸に相当する約６０〜 ８０人の上限が妥当であると考えられる。

しかしながら、多数の介在アミノ酸に対する明確にされた上限は存在しない。上 記の実施例は、可能な比較を行うために慎重に選択したものであり、ペプチドの 第二及び第三構造の影響を減少させるように、アミノ酸配列を設計した。

例えばａ−ラセン構造を有する長ペプチドの場合には、ドナー／７クセプター対 が、無秩序の構造と比較して非常に多くのアミノ酸により分離される場合でも分 子内消光を得ることができる。

実施例４ 酸性条件下での加水分解 本発明による蛍光ペプチドの多用途性をさらに示すために、実施例２において調 製されたペプチド＾［１ｚ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｐｈ　＠−Ｔ ｙｒ　（８０２）　−＾５ｐ−ＯＨ（０，５μ　ｍ）　を　５０ｍ−のギＲ２， ５ｍｌ、ｐＨ３，４中に溶解した。ペプチドをペプシン（５ＬＪＩ、０．　Ｉｍ ９／ｍｌ）の添加により加水分解したところ、１．５時間の加水分解の後１こ、 １０倍の蛍光の増加を伴う漸進曲線が得られた。

便宜上、下記表１中において使用される１文字コードを、対応する略字とともに 以下挙げる。

＾１ｌＡＩａ；　ＦｌｌＰｈｅ；　Ｇ−Ｇｌｙ；ＤｌｌＡｓｐ；に＝Ｌｙｓ；　 Ｐ＊Ｐｒｏ；　５＝Ｓｓｒ；　Ｙ寞Ｔｙｒ１−上 Ｌ５　ＡＢｚ−５ＤＳＤＳＧＳＫＳ−Ａ　４．１９；　Ｆ　１．ユ６；　１Ｂ、 ５　１３５０００乏 ？　Ｐ　Ｐ　７ｔ−ｒｖＪ　？４　Ｙ　！　二〇　二　ｃＩ５　〜　の　０　コ 　■　〜　ロ　６０　０　Ｃ１ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　。

要約書 一般式、Ｆ−Ａ−Ｑ−Ｙ、またはＹｚ−０−Ａ−Ｆで示される分子内消光を示す 蛍光ペプチド（上記式中、Ｑは蛍光消光する置換されたアミノ酸残基（１）を示 し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３，Ｒ，及びＲ６は、水素、ヒトＯキシ、アルキ ル、アルコキシ、アミノ、ニトロ、アミド、ハロゲン、アリールまたはアラルキ ルから独立に選択され、Ｒ１からＲ６の少なくとも１つがヒトＯキシであり、少 なくとも１つがニトロであり、Ｘは、存在しないかまたは−ＣＯ−ＮＨ−１−Ｃ Ｏ−Ｏ−１−Ｓ−、−５−５−１−０−１−ＮＨ−及び−Ｃｓ−Ｈａ−のいずれ かの組み合わせから選択されるスペーサー基であり、ｎ及びｍは、Ｏから１０の ！２数であり、Ｆは、消光残基０の吸収帯内で最大発光を有する蛍光基であり、 Ａは、アミノ酸残基及びペプチド残基から選択されるスペーサー存在物であり、 アミド結合またはエステル結合を介して蛍光基Ｅに結合した単糖類または少糖類 のような非ベブチド分子存在物を有することができ、Ｙ、は、ＯＨ，ＮＨ２，ア ミノ酸残基、好適には固相に付着可能なペプチド残基またはＣ末端保Ｉ基であり 、Ｙ２は、Ｈ、アミノ酸残基、ペプチド残基またはＮ末端像Ｉ基である）。好適 なペプチドは、Ｑが３−ニトロ−チロシンであるペプチド、即ち、Ｆ　＋−Ａｔ 　Ｔ　ｙ　ｒ　（ＮＯ３）−Ｙ、（式中、Ｆｌは、４００から４６０ｎｍの最大 発光を有する蛍光基、望ましくは７ントラニロイルであり、Ａ−謡、基Ｆにペプ チド結合を介して基Ｆに結合した、アミノ酸残基または好ましくは２〜１５のア ミノ酸を有するペプチド残基であり、Ｙ、は、上記定義の通りである）である。

このペプチドは、酵素活性にとって好ましい条件下で前記試料とともにインキュ ベートし、インキュベーションの前後に発光した蛍光を測定及び比較することに よって、試料、例えば生物系における酵素活性の測定のための基質として有用で ある。このペプチドは、平行多重カラム固相合成によって有利に製造することが できる。

請求の範囲 補正書の写しく翻訳文）提出書（曲法組８４条の７副組平成　４　年　１０　月 　１９　日しヨ２、発明の名称 蛍光ペプチド及びｓａｇ性の測定におけるその使用氏名（名称）　カルルスベル グ　アクテイーゼルスカプ０の整数であり、 １、　下記一般式 ％式％ で示される分子内消光を示す蛍光ペプチド。

但し、上記式中、Ｑは蛍光消光する！換されたアミノ酸残基 を示し、上記式中、Ｒ，、Ｒ２、Ｒ１、Ｒ４及びＲ８は、水素、ヒトＯキシ、ア ルキル、アルコキシ、アミノ、ニドＯ１７ミド、ハロゲン、アリールまたはアラ ルキルから独立に選択され、Ｒ１からＲ６の少なくとも１つがヒトＯキシであり 、少なくとも１つがニトロ×は、存在しないかまたは一〇〇−ＮＨ−１−ＣＯ− ○−１−Ｓ−２−Ｓ−Ｓ−１−〇−１−ＮＨ−及び−〇　ａ　Ｈ−のいずれかの 組み合わせから選択され得るスペーサー基であり、ｎ及びｍは、０から１Ｅは、 消光残基Ｑの吸収帯内で最大発光を有するアミノ酸からなるペプチド残基である 請求の範囲第１から４項のいずれかに記載のペプチド。

Ｉｆ、Ａが、単糖類または少糖類存在物を含む請求の範囲第１から５のいずれか に記載のペプチド。

７、　請求の範囲第１から６項のいずれかに記載の１またはそれ以上の蛍光ペプ チドを含む酵素活性の測定のための基質。

８、　酵素活性にとって好ましい条件下で、請求の範囲第７項に記載の１または それ以上の基質とともに試料をインキュベートし、インキュベーションの前後に 発光する蛍光を測定及び比較することを特徴とする試料中の酵素活性の検出また は測定方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　４年１０月１９ ６１ 氏名（名称）　カルルスベルグ　アクテイーゼルスカブ７、　酵素活性にとって 好ましい条件下で、請求の範囲第６項に記載の１またはそれ以上の基質とともに 試料をインキュベートし、インキュベーションの前、途中及び後に発光する室光 を測定及び比較することを特徴とする試料中の酵素活性の検出または測定方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書鳴詑組８４条ノ８１平成　４年１０　月　１９　 日■

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．下記一般式 Ｆ−Ａ−Ｏ−Ｙ１またはＹ２−Ｏ−Ａ−Ｆで示される分子内消光を示す蛍光ペプ チド。 但し、上記式中、Ｑは蛍光消光する置換されたアミノ酸残基 ▲数式、化学式、表等があります▼ を示し、上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素、ヒドロキシ、ア ルキル、アルコキシ、アミノ、ニトロ、アミド、ハロゲン、アリールまたはアラ ルキルから独立に選択され、Ｒ１からＲ５の少なくとも１つがヒドロキシであり 、少なくとも１つがニトロであり、 ｎは、０から２０、好ましくは０から４の整数であり、 Ｆは、消光残基Ｏの吸収帯内で最大発光を有する蛍光基であり、 Ａは、アミノ酸残基及びペプチド残基から選択されるスペーサー存在物であり、 アミノ結合またはエステル結合を介して蛍光基Ｆに結合した非ペプチド分子存在 物を有することができ、 Ｙ１は、ＯＨ、ＮＨ２、アミノ酸残基、ペプチド残基またはＣ末端保護基であり 、 Ｙ２は、Ｈ、アミノ酸残基、ペプチド残基またはＮ末端保護基である。
2. ２．下記一般式 Ｆ１−Ａ１−Ｔｙｒ（ＮＯ２）−Ｙ１ で示される請求の範囲第１項に記載のペプチド。 但し、上記式中、Ｆ１は、４００から４６０ｎｍの最大発光を有する蛍光基であ り、Ａ１は、ペプチド結合を介してＦに結合したアミノ酸残基またはペプチド残 基であり、Ｙ１は、上記定義の通りである。
3. ３．ＦまたはＦ１が、ＡＢｚ（アントラニロイル）である請求の範囲第１または ２項に記載のペプチド。
4. ４．Ｙ１が、ＯＨ、固相に付着可能なアミノ酸残基または固相に付着可能なＣ末 端アミノ酸残基を有するペプチド残基である請求の範囲第１から３項のいずれか に記載のペプチド。
5. ５．ＡまたはＡ１が、アミノ酸残基または２〜２５のアミノ酸からなるペプチド 残基である請求の範囲第１から４項のいずれかに記載のペプチド。
6. ６．Ａが、単糖類または少糖類存在物である請求の範囲第１から５のいずれかに 記載のペプチド。
7. ７．請求の範囲第１から６項に記載の１またはそれ以上の蛍光ペプチドを含む酵 素活性の測定のための基質。
8. ８．酵素活性にとって好ましい条件下で、請求の範囲第７項に記載の１またはそ れ以上の基質とともに試料をインキュベートし、インキュベーションの前後に発 光する蛍光を測定及び比較することを特徴とする試料中の酵素活性の検出または 測定方法。