JPH05505625A - アミリン活性検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミリン活性検定 ［関連特許出願］ この特許出願は、参考のためにその内容を本明細書に包含させた米国特許出願第 ６４０４７８号（１９９１年１月１０日出願）の一部継続出願である。

［発明の分野］ この発明はブドウ糖代謝の科学に関連するものであって、ホルモン活性検定、お よびそのような検定の用途に関するものである。より詳細には、この発明はアミ リン活性検定、およびアミリン作用のアゴニストおよびアンタゴニストとして作 用する物質の同定、特性決定、および評価するための新規生物検定方法の用途に 関する。

［発明の背景および緒言］ すべての代謝経路は、個々の細胞、臓器、または全身の要求に適うように調節さ れなければならない。生体内で遭遇する各種の栄養学的、代謝的、および病理学 的な条件で供給が維持されるなら、燃料分子、例えば炭水化物を提供する代謝経 路の調節は不可欠である。代謝的燃料の調節は、他に替わり得る燃料を利用可能 とすることを含み、各組織に固有の燃料の必要量を貯蔵することを含む。またそ れは、血中濃度の制御機構とともに、身体全体を通じて関与するさまざまな基質 の輸送をも含む。

これらの機構は摂食時と絶食時の間のブドウ糖（グルコース）の持続的な供給を 確保する。酵素欠損に典型的に随伴する多くの病状は、低い血中グルコース値（ 低血糖）をもたらす。そのほか病理学的な酵素欠損症は、さまざまな、ただし何 れの場合も同程度に炭水化物代謝に重大な変化、例えばインスリン欠乏を起こし 得る。その結果、糖尿病および高い血中グルコース値（高血糖）を生じる。

グルコースは代謝エネルギーの流通の基本であることが知られており、血流によ って体内のすべての組織および臓器へ循環する。休息状態では、ヒトは標準的に 単位時間当たり約１０グラムのグルコースを利用し、その６０％は脳へ送られる 。活動状態では、脳は単位時間当たり約６グラムのグルコース消費を持続するが 、筋肉のグルコース利用は１時間当たり４０グラムまで飛躍的に増加する。

食事時に摂取した食物は代謝によって消費され、その結果、グルコースは脳およ びその他の臓器および組織が必要とするより一層高い割合で循環へ流入する。

受は入れきれない血糖値の上昇（即ち高血糖）を避けるため、グルコースは循環 から取り出され、主としてグリコーゲンとして筋肉組織内に貯蔵される。インス リンによって調節されるこのプロセスを「インスリン刺激によるグルコースの取 り込み」という。

血中グルコース値の上昇およびその他の食餌消費に関連する刺激に反応して、す い臓によりインスリンが血流中へ分泌される。インスリンはすい臓ランゲルハン ス島のβ細胞で産生されるタンパク質ホルモンである。インスリンは２つの方法 で血中グルコースを減少させる。第１の方法は、インスリンが筋肉および脂肪組 織（所謂、「末梢」組織）へ信号を送り、それぞれグリコーゲンおよび脂肪とし て貯蔵するグルコースの取り込みを増大する。第２の方法は、インスリンが肝臓 へ信号を送り、グルコースの分泌を低下させる。

運動中、筋肉のエネルギー所要量は劇的１；増大する。筋肉はまずグルコース供 給が使い果たされるまで、内在性のグリコーゲン貯蔵からグルコースを取り出す 。

また脳および筋肉以外の組織が必要とするグルコースは肝臓によって循環内へ放 出される。肝グルコース貯蔵からの取り出しのプロセスにはすい臓も関与するが 、このプロセスを「グルカゴン刺激によるグルコースの分泌」という。

激しい活動が関連する血中グルコース値の低下に反応して、すい臓によりグルカ ゴンが血流中へ分泌される。グルカゴンはすい臓ランゲルハンス島のα細胞で産 生されるポリペプチドホルモンである。グルカゴンは主としてグリコーゲンをグ ルコースへ破壊し、続いて肝臓によるこのグルコースの分泌の刺激によって血中 グルコースを増加する。したがって肝臓の重要な働きは、血中グルコース値を比 較的一定な濃度に維持することであると理解される。

炭水化物代謝のプロセスには、解糖系（好気的および嫌気的条件下の双方とも） 、ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの酸化、筋肉および肝臓におけるグリコーゲン 生合成、筋肉および肝臓におけるグリコーゲン分解、肝臓および腎臓における糖 新生経路、ベントースリン酸経路、ウロン酸経路、フルクトース、ソルビトール （ポリオール）、ガラクトース、およびアミノ糖（ヘキソサミン類）の代謝に関 連する経路等が含まれる。これらの経路には多数の酵素が関与しており、そのよ うな酵素として、グルコキナーゼ、グリコーゲンシンターゼ系酵素、ホスホフル クトキナーゼ１、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（解糖 およびグリコーゲン形成に関与する酵素）、ピルビン酸カルボキンラーゼ、ホス ホエノールピルビン酸カルボキンキナーゼ、フルクトース−１，６−ビホスフア ターゼおよびグルコース−６−ホスファターゼ（糖新生に関与する酵素）、およ びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲ ナーゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、アセチルＣｏＡカルボキ シラーゼ、および脂肪酸合成酵素（ベントースリン酸経路および脂質生合成に関 与する酵素）等が挙げられる。

然し今日まで、燃料代謝に関する多数の基本的なメカニズムは混乱したままであ り、学術論争の対象となっている。例えば絶食時から摂食時へ移行する間の全身 的なグルコース代謝および肝グリコーゲン飽和のメカニズムに関する見解は長年 にわたって変わり続けている［Ｊ、Ｄ、マツクガリーら、アニュアル・レビュー ・オブ・ニュートリジョン、７巻、５１〜７３頁（１９８７年）］。本明細書に 示したクーパーによる第３のすい臓ホルモン、アミリンの同定は既に混乱してい た燃料代謝図へさらに新たな因子をつけ加え、燃料代謝経路および燃料代謝経路 メカニズムの両者の再評価が必要となった［例えばＧ、Ｊ、Ｓ、クーノ（−ら、 〕（イオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ、１０１４巻、２４７〜２５２頁 （１９８９年）〕。ただしこれらのメカニズムのある部分は十分に確立されてい る。

グリコーゲンは代謝エネルギー産生および貯蔵の重要な要素であり、グルコース の動員され易い貯蔵形であると理解されている。グリコーゲンはグルコース残基 の極めて巨大な分枝鎖ポリマーであって、その大部分はα−１，４−グリコシド 結合によって連結されている。分枝鎖は２つのグルコース単位間のα−１，６− 結合によって生じる。グリコーゲン貯蔵の２つの主要な部位は肝臓および骨格筋 である。グリコーゲン濃度は肝臓の方が高いが、骨格筋質量の方が一層大きいか ら、グリコーゲン総量としては骨格筋の方に一層多く貯蔵されている。

既に説明したように、グリコーゲンの合成および分解は、そのことが血中グルコ ース値の調節のため生体によって利用されるから重要であり、グリコーゲンは激 しい筋肉の活動時の利用のためのグルコースの貯蔵庫を提供する。筋肉グリコー ゲンの機能は、筋肉自身が、主として筋肉内で解糖に利用し易いヘキソース単位 の供給源として働くことである。肝グリコーゲンは、血中グルコース値の維持（ 特に食事と食事の間の）のため、ヘキソース単位を放出することに大きく関与し ている。グリコーゲンの合成と分解は、異なった反応経路を介して起こることが 分かっている。他の多くの生物学的経路と同様に、グリコーゲン代謝の酵素は可 逆的リン酸化によって調節される。

第１図はグリコーゲン代謝の調節が、基質制御下（アロステリーによる）および ホルモン制御下にあるグリコーゲンシンターゼとグリコーゲンホスホリラーゼの 活性のバランスによって行われることを示している。骨格筋ホスホリラーゼは２ 種の相互転換可能な形で存在する。ホスホリラーゼａは活性であり、ホスホリラ ーゼｂは正常ではそれよりも活性が低い。ホスホリラーゼｂは、分子の２つのサ ブユニットのそれぞれにあるセリン残基のリン酸化によってホスホリラーゼａに 転換される。エピネフリンおよびグルカゴンのようなホルモンは標的細胞の形質 膜にある受容体へ結合し、アデニル酸シクラーゼの活性化を誘起する。アデニル 酸シクラーゼは形質膜でＡＴＰからサイクリックＡＭＰの生成を触媒する。サイ クリックＡＭＰの細胞内濃度が増加するとプロティンキナーゼが活性化される（ この酵素はサイクリックＡＭＰが存在しないと不活性である）。プロティンキナ ーゼはホスホリラーゼキナーゼおよびグリコーゲンシンターゼの両酵素をリン酸 化する。これらの酵素のリン酸化はグリコーゲン合成および分解の協調調節の起 動力である。

グリコーゲン分解およびグリコーゲン形成のプロセスはともにｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ依 存性プロティンキナーゼの活性によって制御されるから、グリコーゲン分解を停 止することと、グリコーゲン形成を刺激することが同時進行的にでき、あるいは その逆を行うこともできる。ホスホリラーゼキナーゼおよびグリコーゲンシンタ ーゼは、何れも別のキナーゼおよびホスファターゼによって１ケ所以上の部位で 可逆的にリン酸化され得る。これらの２次的なリン酸化は、リン酸化および脱リ ン酸化に対する１次部位の感受性を修飾する。サイクリックＡＭＰ依存性プロテ ィンキナーゼによるリン酸化がホスホリラーゼに対して始動する（ホスホリラー ゼキナーゼの活性化により）と、同時にグリコーゲンシンターゼが、不活性形へ 転換されることにより、その酵素作用を（直接的に）停止する。即ち、グリコー ゲンの分解（グリコーゲン分解）の阻害は究極的にグリコーゲンの合成（グリコ ーゲン形成）を増強し、グリコーゲン形成の阻害は究極的にグリコーゲン分解を 増強する。グリコーゲンの代謝調節にさらに重要なことは、ホスホリラーゼａ１ ホスホリラーゼキナーゼ、およびグリコーゲンシンターゼｂ　（Ｄ−型）の脱リ ン酸化が、何れもプロティンホスファターゼ１として知られている広い特異性を 有する単一の酵素によって行われる知見である。今度は阻害因子−１を介し、ｃ ＡＭＰ依存性プロティンキナーゼによってプロティンホスファターゼ−１が阻害 される。

第１図にはまたｃＡＭＰ依存性プロティンキナーゼによるグリコーゲン分解およ びグリコーゲン形成の制御を示す。ｃＡＭＰの濃度増加によりグリコーゲン分解 をもたらす反応には、グリコーゲンシンターゼａのグリコーゲンシンターゼｂへ の転換、ホスホリラーゼキナーゼｂのホスホリラーゼキナーゼａへの転換、およ びグリコーゲンホスホリラーゼｂのグリコーゲンホスホリラーゼａへの転換等が 含まれる。これと平行して逆方向への転換がこれらの条件下で阻害される。ホス ホジェステラーゼ活性によってｃＡＭＰ濃度が減少すると、グリコーゲン形成へ 導く逆反応が起こる。解糖、糖新生、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成を含 む炭水化物燃料の代謝に関する考察については、例えばＪ、Ｄ、マツクガリーら （前掲）、Ｌ、ストライアー［バイオケミストリー（第３版、１９８８年）］を 参照せよ。

１９２９年にコリおよびコリは、哺乳動物でグルコース炭素は肝グリコーゲン→ 血中グルコース→筋肉グリコーゲン−血中乳酸−肝グリコーゲンの経路を通って 循環しているであろうと提案した［Ｃ，Ｆ、コリおよびＧＴ、コリ、ジャーナル ・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、８１巻、３８９〜４０３頁（１９２９ 年）］。その経路の一部で筋肉グリコーゲン異化作用は次のように進行する。グ リコーゲンがグリコーゲンホスホリラーゼａおよびオルトリン酸の存在で開裂し て、リン酸化された糖であるグルコース−１−リン酸を生じる。酵素グリコーゲ ンホスホリラーゼａはグリコーゲン分子の非還元性末端からのグリコジル残基の 逐次離脱を促進し、その間、末端残基のＣ−１および隣接残基のＣ−４の間のグ リコシド連鎖を切断する。グリコーゲンの加リン酸分解的開裂によって生成した グルコース−１−リン酸は別の酵素ホスホグルコムターゼによりグルコース−６ −リン酸へ転換される。

篤２図は、肝臓および筋肉における解糖系、糖新生、およびグリコーゲン代謝制 御におけるかぎ酵素を示したものである。筋肉と肝臓の経路における主な相違は 、筋肉の場合、グルカゴンによって影響されず、グルコース−６−ホスファター ゼ酵素を含んでいないことで、図中に示した肝臓経路では、これらは何れもその 一部分を構成する。グルコース−６−ホスファターゼはグルコースを肝臓から離 脱させることができる加水分解酵素である。この酵素はグルコース−６−リン酸 からのグルコース生成を触媒し、それによってグルコースはグルコース輸送体を 介して肝細胞から出ることができる。グルコース−６−リン酸は輸送できない。

グルコース−６−ホスファターゼ酵素は脳および筋肉には存在しない。結局、グ ルコース−６−リン酸は、ＡＴＰ産生のためにこの燃料を多量に必要とする筋肉 および脳に保持される。対照的に専ら他の組織の利益のためにグルコースを貯蔵 し、放出している「料地的な」臓器である肝臓にとってはグルコースは主要な燃 料ではない。

グリコーゲン代謝は特異的なホルモンによって深刻な影響を受ける。インスリン の作用機序はまだ完全には解明されていないが、インスリンは肝臓のグリコーゲ ン合成能を増大させることが分かっている。またインスリンは肝における解糖を 促進し、その結果、脂肪酸の合成を増大する。ただし肝臓の解糖が脂肪酸合成の ためのピルビン酸の主な供給源なのか、あるいはその有力な供給源であるだけな のかはまだ確立されていない。またインスリンはグルコースが筋肉および脂肪細 胞へ入るのを促進する。ホルモンであるエピネフリンおよびグルカゴンはインス リンのこれらの作用に対抗する一定の効果をもつ。筋肉の活動、もしくは筋肉活 動の促進は、副腎髄質からのエピネフリンの放出をもたらす。エピネフリンは筋 肉内でグリコーゲンの分解を著しく刺激し、それより程度は劣るが、肝臓内のグ リコーゲン分解も刺激する。このカテコールアミンホルモンのもう１つの作用は 、筋肉によるグルコースの取り込みを阻害することである。それに代わって、脂 肪組織から放出された脂肪酸が燃料として使用される。またエピネフリンは、グ ルカゴン分泌を刺激し、インスリン分泌を抑制することにより、それぞれ肝臓に よって血中へ放出されるグルコースの量を増加し、筋肉によるグルコースの利用 を減少させる。

先に指摘したように、肝臓は、血糖値が低いとすい臓のα細胞によりて分泌され るポリペプチドホルモンであるグルカゴンに反応する。グルカゴンは肝臓内のグ リコーゲン分解を刺激すると同時に、グリコーゲン合成を阻害することによって 血糖値を増加する。これらの作用の究極的な結果として、肝グリコーゲン排出の 著しい増加が生じる。

新しく発見されたすい臓ホルモンアミリンは、主としてすい臓β細胞で見いださ れ、インスリンと一緒に分泌される。最初アミリンは２型糖尿病患者で見られる 島アミロイドの主タンパク質の構成成分として発見された［例えばＧ、Ｊ、Ｓ。

クーパーら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８４巻、８６２８〜８６３２頁（１９８７年 ）、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパーら、バイオキミカ・工・バイオロジカル４巻、２４７ 〜２５２頁（１９８９年）］。ヒト・アミリンは一風変わったアミノ酸組成を示 し、酸性残基を含んでいない。アミリンはＣｙｓ”〜ＣｙＳフの分子内ジスルフ ィド結合およびカルボキシ末端アミド基の２ケ所の翻訳後修飾を有する３７アミ ノ酸のペプチドである。またクーパーは合成分子のペプチド構造内のこれら２つ の翻訳後修飾がともに存在することが最高の生物活性を生じることを発見した〔 例えばＧ、Ｊ、Ｓ、クーパーら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８４巻、８６２８〜８６ ３２頁（１９８７年）、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパーら、ダイアビーテス１９８８、Ｒ ，ラーキン、Ｐ、チンメット、Ｄ、キスホルム編（エルセビール社、アムステル ダムＬ４９３〜４９６頁（１９８９年）］。

ヒト・アミリンはヒトＣＧＲＰ−１およびＣ０ＲＰ−２＜それぞれカルシトニン 遺伝子関連ペプチド１および２）と４３〜４６％の配列同一性を有する。またヒ ト・アミリンはインスリン、シラキシン類、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）と 比較的弱い配列類似性をもつ。この配列類似性に関する知見は、ＣＧＲＰ類、ア ミリン、およびレラキシンのＡ鎖関連領域、インスリンおよびＩＧＦを含むペプ チドホルモンのスーパーファミリーがあるという決定を裏付ける［Ｇｊ、Ｓクー パーら、プログレス・イン・グロース・ファクター・リサーチ、１巻、９９〜１ ０５頁（１９８９年）］。

アミリンはヒトの染色体１２上に存在する単一遺伝子の生産物である。この遺伝 子はプレプロアミリンおよびプロアミリン配列、典型的な５′および３゛二塩基 性プロセツシングングナル、およびカルボキシ末端Ｔｙｒのためのコドンに対す る３’Ｇ１ｙ残基を含むポリペプチドホルモンを暗号化している典型的な特徴を 有する［Ａ、Ｎ、ロバーツら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、９６６２〜９６６ ６頁（１９８９年）］。アミリン類およびＣＧＲＰ間には、特にアミノ末端領域 およびカルボキシ末端領域に高度の種間保存性がある。強い保存性を宵するこれ らの領域は、少なくともその幾つかの生物活性に必要な翻訳後修飾を含んでいる 分子内構造領域と対応している。アミリン分子の中間部分にある可変配列は、主 としてアミロイド生成に関与しているというべき領域を含んでいる。

アミリンは島で合成され［Ｊ、Ｄ　レフラーら、プロアミリン配列・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、３ １２７〜３１３０頁（１９８９年）、およびＡＮ、ロノく−ツら、プロアミリン 配列・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・Ｕ ＳＡ、８６巻、９６６２〜９６６６頁（１９８９年）コ、栄養分泌促進剤に反応 してインスリンと一緒に分泌される［Ａ、オガワら、ジャーナル・オブ・クリニ カル・インベスティゲーション、８５巻、９７３〜９７６頁（１９９０年）コ。

アミリンはβ細胞分泌顆粒にインスリンと一緒に詰め込まれている。摘出した潅 流ラットすい臓を使用した実験で、グルコースおよびアルギニンは、何れもイン スリンで見られたのと類似した２層性パターンでアミリン分泌を刺激できること が判明した。そのうえインスリンの場合のように、アミリン分泌は２つの分泌促 進剤を併用することにより増幅される［オガワら、ジャーナル・オブ・クリニカ ル・インベスティゲーション、８５巻、９７３〜９７６頁（１９９０年）、フエ ーマンら、ＦＥＢＳレターズ、２６２巻、２７９〜２８１頁（１９９０年）］。

ラットのすい臓をモデルとして使用した推定で、アミリンの質量はグルカゴンの 質量の約４〜６倍、ソマトスタチンの質量の１〜２倍であるが、すい城内のアミ リン・タンパク質含量は確実には決定されていない。

島アミロイドの蓄積は２型糖尿病で見られる島β細胞の喪失およびインスリン分 泌の欠損とよく相関している［Ｗ、ゲブツ、ジ・アイレツツ・オブ・ランゲルハ ンス、Ｓ、Ｊ、クーパースタインおよびり、ワトキンス編（アカデミツクブレス 社、ニューヨーク、ＮＹ）、３２１〜３５６頁（１９８０年）、Ｎ、Ｃ，フエー マンら、ＦＥＢＳレターズ、２６２巻、２７９〜２８１頁（１９９０年）、Ｇｊ 。

Ｓ　クーパーら、バイオキミカ・工・バイオロジカル４７〜２５８頁（１９８９ 年）〕。多くのモデル系でインスリン抵抗性を起こし得るアミリンの作用は、糖 尿病のすい臓でヒトの島アミロイドにアミリンが存在することを考え併せると、 アミリンがインスリン非依存性糖尿病の病因の中心であるという決定を裏付ける ［例えばＧ、Ｊ、Ｓ、クーパーら、バイオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ 、１０１４巻、２４７〜２５８頁（１９８９年）、ＢレイトンおよびＧ、Ｊ、Ｓ 、クーパー、ネーチャー（ロンドン）、３３５巻、６３２〜６３５頁（１９８８ 年）］。アアリアはまた動物の生体内でグルコース代謝に著しい効果をもたらす ことが報告されている。真性糖血症性高インスリン血症のグルコース堆積を利用 した実験で、アミリンは、ラットでインスリンを介する肝グルコース排出の抑制 を逆転させた［Ｊ、Ｍ、モリナ、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパー、Ｂレイトン、Ｊ、Ｍ、 オレフスキー、ダイアビーテス、３９巻、２６０〜２６５頁（１９９０年）およ びＳ、Ｊ、クープマンズら、ダイアビーテス、３９巻、ｌ０ＩＡ（１９９０年） ］。アアリアはまたグルコースの末梢の取り込みを減少させた［Ｊ。

Ｍ、モリナ、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパー、Ｂ、レイトン、Ｊ、Ｍオレフスキー、ダイ アビーテス、３９巻、２６０〜２６５頁（１９９０年）、Ｓ、Ｊ、クープマンズ ら、ダイアビーテス、３９巻、ｌ０ＩＡ　（１９９０年）、Ｄ、Ａ、ヤングら、 ダイアビーテス、３９巻（増刊、１号）、１１６Ａ　（１９９０年）］。

血漿乳酸は、糖新生および脂肪酸合成の主な３炭素基質であることが以前から知 られている。他の重要な３炭素基貫はアラニンおよびグリセリンである。それだ けに現在乳酸は、肝臓におけるグリコーゲンの貯蔵および脂肪細胞におけるトリ グリセリドの貯蔵へ導く経路の連環のかぎとなる１員であると考えるものがある 。またあるものは、乳酸を、嫌気的条件下にＡＴＰの形でエネルギーを供給し空 間および時間の双方への代謝的な負荷を分配する解糖系の最終産物と見なしてい る。例えばストライアー（前掲）は、乳酸を代謝における行き止まりと把え、ピ ルビン酸が還元されて乳酸となる唯一の目的は、活動中の骨格筋および赤血球で 解糖が進行できるようにＮＡＤ−を再生することであるとしている。換言すれば 、先にコリ回路に関して説明したように、肝臓は収縮しつつある骨格筋ヘグルコ ースを供給し、骨格筋はグルコースの乳酸への解糖的転換からＡＴＰを誘導し、 ついで肝臓によってグルコースが乳酸から合成されると信じられている。

コリ回路へ入る乳酸の主な供給源は、いまなお討論の対象である。あるものは糖 尿病患者では乳酸が筋肉に由来することを示した［Ｂカパルドら、ジャーナル・ オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、７１巻、１２ ２０〜１２２３頁（１９９０年）コが、一方、あるものはそれが筋肉ではなく、 脂肪のような組織に由来すると述べている［Ｐ、Ａ、ジャンセンら、ダイアベタ ロシア、３３巻、２５３〜２５６頁（１９９０年）コ。さらに他のグループは、 その供給源がなんであれ、肝臓への基質配送が増大し、肝内基質のグルコースへ の転換効率が増大することは、２型糖尿病に特徴的な糖新生の増大にとってとも に重要な因子であるが、糖新生前駆物質の増大した肝臓への配送を担当している のは筋肉ではなく、組織であると結論している陣ンソリら、ジャーナル・オブ・ クリニカル・インベスティゲーション、８６巻、２０３８〜２０４５頁（１９９ ０年１２月）］。

アミリンの役割もまた、なお討論の対象である。試験管内骨格筋で、アミリンは 、グルコースのグリコーゲンへの組込み〔Ｂ、レイトンおよびＧ、Ｊ、Ｓ、クー パーら、３３５巻、６３２〜６３５頁（１９８８年）、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパーら 、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８５巻、７７６３〜７７６６頁（１９８８年）、Ｂ、レ イトンおよびＥ、フット、バイオケミカル・ジャーナル、２６９巻、１９〜２３ 頁（１９９０年）］、糖糖新生ヤングら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィ ジオロジー、２５９巻、４５７〜４６１頁（１９９０年）、Ｂ、レイトン、Ｅ、 　Ａ、フット、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパー、ダイアベタロシア・メディシン、６巻、 増刊２号、Ａ４　（１９８９年）］、グリコーゲン形成［ヤングら（前掲）コ、 グルコース取り込み［ヤングら（前掲）、Ｔ、Ｐ、キアラルジ、Ｇ、Ｊ、Ｓ、ク ーパー、およびＭ、ストルブ、ダイアビーテス、３９巻、１４９Ａ　（１９９０ 年）、Ｄクロイタ−ら、ダイアビーテス、３９巻、増刊１号＋　１２１Ａ　（１ ９９０年）、Ｂ、レイトンら、ＦＥＢＳレターズ、２４９巻、３５７〜３６１頁 （１９８９年）］等を含む、さまざまな炭水化物代謝経路に関連し、またはそれ に関与していると論じられた。

骨格筋におけるアミリンの効果は繊維形の分布によって左右される［Ｂ、レイト ン、Ｅ、Ａ　フット、Ｇ、　Ｊ、　Ｓ、クーパー、ダイアベタロシア・メデイシ ン、６巻、増刊２号、Ａ４　（１９８９年）］。試験管内でアミリンは、赤色筋 （ヒラメ筋）および白色筋（長指伸筋）の両者でグリコーゲン合成を阻害するこ とが報告されているが、一方、白色筋だけでグリコーゲン分解（ついて乳酸産生 ）を刺激することが報告されている。調査しだ哺乳動物の大部分で白色筋（ＩＩ 型）繊維は大きい筋肉塊を構成していた（Ｍ、Ａ、アリアノら、ジャーナル・オ ブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー、２１巻、５１〜５５頁 （１９７３年）］。

単離した赤色筋（ヒラメ筋）でアミリンのグリコーゲン合成に対する効果は、純 粋なβ−アドレナリン・アゴニストであるイソプレナリンの効果と同等の強さで あると報告された［Ｂ、レイトンおよびＧ、Ｊ、Ｓ、クーパー、ネーチャー（ロ ンドン）、３３５巻、６３２〜６３５頁（１９８８年）］。Ｌ６ミオサイトでは 、１０ｐＭでグルコースの取り込みの最大低下が報告されている［Ｔ、Ｐ、キア ラルジ、Ｇ、　Ｊ、　Ｓ、クーパー、Ｍストルプ、ダイアビーテス、３９巻、１ ４９Ａ　（１９９０年）、Ｄ、クロイタ−ら、ダイアビーテス、３９巻ミ増刊１ 号：　１２１Ａ　（１９９０年）］。

「トリートメント・オブ・タイプ２・ダイアビーテス・メリタス」と題したアミ リン・コーポレーションの国際特許出願ＰＣＴ／１Ｊｓ８９１０Ｏ０４９号は、 国際特許公開番号ＷＯ３９１０６／３５の番号を付して１９８９年７月１３日に 公開された。クーパーおよびグリーンによって報告されたこの発明は、アミリン の効果を阻止または軽減し、例えば２型糖尿病の処置を可能とする化合物および 方法を含んでいる。２型糖尿病はインスリン抵抗性であることを特徴とし、イン スリンの作用に対する末梢組織の正常な代謝反応の不全と定義付けられる。臨床 的な見地から、インスリン抵抗性は、正常または上昇したインスリン濃度にもか かわらず、正常または上昇した血糖値が持続するときに存在する。そのような状 態は、本質的に、基礎グリコーゲン合成またはインスリン刺激によるグリコーゲ ン合成の何れか、またはその両者を正常値以下に低下するグリコーゲン合成阻害 を表している。

特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８９１０００４９号には、例えばアミリンまたはＣＧＲＰ を置換または変化させたペプチドまたはサブペプチドを含む競合的な阻害剤の使 用によって、アミリン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）　、およ びその他のアミリンアゴニストの結合を阻止することにより、またはアミリンま たはＣ０ＲＰの発現または生産または放出の調節によって、アミリン調節を達成 する手段を報告し、権利範囲として主張している。反応を惹起することな（アミ リン受容体へ結合する化学的なアミリンアンタゴニストを使用して、生体のグル コースに対する基礎またはインスリン刺激による反応を阻害し、またはそれらの 分子のインスリン放出に対する妨害を防止するように作用するアミリンまたはア ミリンアゴニストの効果を低下させる。

この特許出願はまた、２型糖尿病の処置に有用性をもつ追加的な化合物を同定す る方法を報告している。この点に関して、この特許出願は合成またはその他のア ミリンアンタゴニストを生物学的にスクリーニングする用途を報告している。

例えば可能性のある、または疑わしいアンタゴニストを、精製したアミリンと一 緒に単離した筋肉または筋肉細胞へ加え、組織培養中で、インスリンの存在また は存在なしで、細胞によるグルコースの取り込みをモニターする。可能性のある 、または疑わしいアンタゴニストの存在で取り込みが増加すれば、化合物が必要 な阻害作用を有することを示したと期待される。この特許出願はまた、類似のプ ロトコールで、単離した肝細胞、ランゲルハンス島、または単離した島β細胞を 使用し、インスリンの取り込みの増加を代わりにモニターする用途を報告してい る。

この出願はまたアミリンまたは微量滴定板に固定化したモノクローナル抗体から の抗イデイオタイプ抗体に置き換え得る１またはそれ以上の化合物を含有する試 験試料の作用を用いて、上記の生物学的試験パラメーターのもとにさらに評価す べき物質をスクリーニングする免疫検定型スクリーニングを報告している。　可 能性のある、または疑わしいアミリンアゴニストまたはアンタゴニストを同定す るだけでなく、その主要な作用部位（複数もあり）で、細胞作用の他の修飾物質 から独立して、即ちインスリン刺激によるプロセスの阻害を測定する必要なく、 アミリン活性の刺激能、または阻害能に基づいて、その特性を明らかにし、具体 的に評価するさらに機能的な検定方法（複数もあり）があれば、その有用性は大 きい。この発明はこの作用部位を発見し、そのような検定方法を創案し、これを 本明細書で報告する。

さらに新規検定方法に基づいて、生体内における炭水化物代謝に対するアミリン の作用の予想外でしかも重要なその他の特徴を発見し、本明細書で報告する。

第１に発明者らは、下記の実施例で報告するように、アミリンがこれまで信じら れてきたように、生体内でグルコース値を増加するのではな（、専ら血漿乳酸値 を増加するように作用し、絶食動物では、乳酸の増加についで際立った血漿グル コース値の増加をもたらすことを発見した。より具体的には、軽く麻酔したラッ トで１８時間絶食し肝グリコーゲンの貯蔵を枯渇させて、アミリン注射を行うと 乳酸産生が刺激された。これらの血漿乳酸の上昇に続いて約１０〜３０分後に血 漿グルコース値が増加した。重要なことは、これらの効果が静脈内注射および皮 下注射の両方で観察されたことである。摂食ラットではアミリンの効果は絶食動 物の場合とは異なっていた。恐らく正常な肝グリコーゲン貯蔵を有する摂食ラッ トでは、アミリンによって上記と同じく著しい血漿乳酸の上昇が起こったが、こ の乳酸上昇ののち、血漿グルコースは僅かに中等度の上昇または何らの上昇をも 示さない。前述のように、グルカゴンもまた、低血糖を防止するグルカゴンの重 要な対抗調節機能を反映する作用として、血漿グルコースを増加させることが知 られている。しかし摂食ラットおよび絶食ラットの両方で、アミリンは際立った 血漿乳酸の増加を生じるが、グルカゴンは血漿乳酸値に何ら効果を示さなかった 。

またアミリンは絶食ラットでグルカゴンより一層大きい血漿グルコースの増加を 来たすことが判明したが、摂食ラットではこれらの相対的活性が逆転する。

発明者らはアミリンがインスリンの同化ホルモン作用のパートナ−であることを 発見した。アミリンは、肝グリコーゲン合成の本質的な達成手段である糖新生の ための３炭素基質の供給を用量依存的な態様で直接刺激する。またアミリンは脂 肪細胞でインスリン刺激によるグルコース取り込みに影響を与えることなく、骨 格筋のインスリン感受性を低下し、肝における脂肪酸合成のために３炭素基質の 供給を増大する。これらの発見は、アミリン作用に影響を与える既知または疑わ しいアミリン作用のアゴニストまたはアンタゴニストの作用能を評価する追加的 な検定方法に論拠を提供し、所望により陽性および／または陰性対照検定によっ て作成した用量反応像と対照させて、その既知または疑わしいアゴニストまたは アンタゴニストの用量反応像を作成し得る。

［発明の要約コ この発明は、２型糖尿病で代表的に見いだされるすい臓アミロイド塊から単離し 精製されたホルモンであり、生理的およびある種の病理的な両条件で、とりわけ グルコース代謝におけるコリ回路を調節する機能を担うアミリンの効果を調節す る１またはそれ以上の試験化合物を含有する試験試料の活性について、これを同 定し、特性を決定し、評価する方法を提供する。具体的にはこの発明は、好適な 細胞を使用する系において、グリコーゲンホスホリラーゼａの活性を究極的に増 強するアミリン、またはＣＧＲＰのようなアミリンアゴニストの作用に対する化 合物の効果を同定し、特性決定し、評価する方法を提供する。そのような系で、 グリコーゲンを炭水化物貯蔵形として利用するアミリン感受性細胞を、アミリン のアゴニストまたはアンタゴニストと推定され得る対象化合物（複数もあり）と インキュベートする。試験化合物が推定されるアミリンアンタゴニストである場 合は、ついでアミリンまたはアミリンアゴニストを細胞へ添加する。ついで１態 様では、予定した時間後、ホスホリラーゼａが触媒するグリコーゲン分解速度を 測定して細胞を評価する。この発明はまた、所望により対照検定の使用を期待し 得る。即ち、Ｃ０ＲＰまたはアミリン自身のような既知のアミリンアゴニストお よび／またはＣＧＲＰ、〜、７のような既知のアミリンアンタゴニストを利用し て、陽性および／または陰性対照、または対象化合物（複数もあり）の参考のた めの標準を用意する。また検定系のアミリン活性化はインスリンによって修飾す ることができるから、この検定は、インスリンのアゴニストの同定および評価に 使用でき、さらにもう１つの態様として、アミリンのアンタゴニストとインスリ ンのアゴニスト間の鑑別に使用できる。

この発明の新規検定方法に含まれる１態様は、アミリンの活性を阻害できる試験 化合物を同定するのに使用し、またはアミリン活性を阻害することが既知である 試験化合物の力価を評価するのに使用する第１検定方法であって、その方法は、 試験試料およびアミリン感受性細胞系を選び、ここて試験試料は１またはそれ以 上の試験化合物を含有し、アミリン感受性細胞系はグリコーゲンを炭水化物の貯 蔵形として利用でき、その細胞内でグリコーゲンホスホリラーゼを活性化するア ミリンまたはアミリンアゴニストの活性化能を反映したアミリン感受性である細 胞であり、それらのアミリン感受性細胞系および試験試料を予定した時間インキ ュベートし、アミリンまたはアミリンアゴニストの予定量を試験試料およびアミ リン感受性細胞系へ添加し、細胞系内の細胞内容物を取り出すために細胞系を破 砕し、グリコーゲンホスホリラーゼａの活性を評価し、試験化合物がアミリンま たはアミリンアゴニストによるグリコーゲンホスホリラーゼａの活性化を阻害で きるかどうか決定し、あるいは試験試料の阻害能を測定することからなる。アミ リンまたはアミリンアゴニストによるグリコーゲンホスホリラーゼａの活性化を 阻害する試験試料の阻害能の決定は、定性的に評価し得、即ちイエス・ノー回答 で得られる。アミリンまたはアミリンアゴニストによるグリコーゲンホスホリラ ーゼａの活性化を阻害する試験試料の阻害能の測定は、半定量的または定量的に 実施できる。またこの検定方法は、陽性対照、陰性対照、またはその両者の使用 を含み得る。そのような対照検定（複数もあり）を用いて、アミリンまたはアミ リンアゴニストによるグリコーゲンホスホリラーゼａの活性化を阻害する試験化 合物（複数もあり）の阻害能の決定または測定を助けることができる。陰性対照 検定は、上記の第１検定方法にしたがい、ただし試験化合物（複数もあり）を添 加しないで実施できる。アミリンアゴニストを上記の第１検定方法に利用する場 合、または上記の第１検定方法にしたがい陰性対照検定を実施する場合は、アミ リンアゴニストとして例えばＣ０ＲＰを含み得る。陽性対照検定は上記の第１検 定方法にしたがって実施し得るが、その場合、使用する試験化合物は、ＣＯＲＰ 　１３７のようなグリコーゲンホスホリラーゼのアミリン活性化を阻害すること が既知である化合物である。これらの方法は、ヒラメ筋検定のような単離した筋 肉組織標本を含む任意の数の細胞に基づく系で実施し得る。

この発明の新規検定方法に含まれるさらにもう１つの態様は、アミリンのアゴニ ストとして作用できる試験化合物を同定するのに使用し、またはアミリンアゴニ スト活性を有することが既知である試験化合物の力価を評価するのに使用する第 ２検定方法であって、その方法は、試験試料およびアミリン感受性細胞系を一緒 に選ぶ段階を含み、ここで試験試料およびアミリン感受性細胞系は上記と同様で あり、アミリン感受性細胞系および試験試料を予定した時間インキュベートし、 その系で、細胞内容物を取り出すために細胞系を破砕し、グリコーゲンホスホリ ラーゼａの活性を評価し、その化合物がグリコーゲンホスホリラーゼａの活性化 を刺激できるかどうかを決定し、またはグリコーゲンホスホリラーゼａの活性化 を刺激する試験試料の刺激能を測定する。またアミリンのアゴニストを同定し、 または評価するこの方法は、陽性対照、陰性対照、またはその両者の使用を含み 得る。陰性対照検定は上記の第２検定方法で説明したように実施でき、その場合 、試験化合物（複数もあり）には、Ｃ０ＲＰ、、、のようなアミリンアンタゴニ ストを含み得る。陽性対照検定は、上記の第２検定方法で説明したように実施で き、ただしＣＧＲＰのようなアミリン受容体を介してグリコーゲンホスホリラー ゼの活性化を刺激することが既知である試験化合物を使用し得る。

またインスリンのアゴニストとして作用できる試験化合物を同定するのに使用し 、またはインスリンアゴニスト活性を有することが既知である試験化合物の力価 を評価するのに使用する方法もこの発明によって期待でき、その方法は、試験試 料およびインスリンまたはアミリン感受性細胞系を一緒に選ぶ段階を含み、ここ で試験試料は１またはそれ以上の試験化合物を含有し、グリコーゲンを炭水化物 の貯蔵形として利用できる細胞を含むインスリン感受性またはアミリン感受性細 胞系は、その細胞内でグリコーゲンホスホリラーゼを活性化するアミリンまたは アミリンアゴニストの活性化能を反映したアミリン感受性であり、そしてその細 胞内でグリコーゲンホスホリラーゼ活性化を阻害するインスリンまたはインスリ ンアゴニストの阻害能を反映したインスリン感受性であり、そのアミリン感受性 細胞系および試験試料を予定した時間インキユベートシ、細胞系内の細胞内容物 を取り出すために細胞系を破砕し、グリコーゲンホスホリラーゼａの活性を評価 し、グリコーゲンホスホリラーゼａの活性化を阻害する試験試料の阻害能を決定 し、またはこれを測定することからなる。そのような細胞系の例として、本明細 書で説明した単離したヒラメ筋検定を含む。

この発明のさらにもう１つの態様として、試験化合物を、インスリン感受性であ るがアミリン感受性でない細胞を含む第２試験方法と一緒に選ぶことにより、グ リコーゲンホスホリラーゼａ活性を阻害することを決定し、または既知である試 験化合物（インスリンのアゴニストまたはアミリンのアンタゴニストような）の 特異性を評価できる。そのような第２試験方法には、インスリンを介するグルコ ースの取り込みを実験的に評価できる脂肪細胞を含む。

さらにアミリン活性を阻害できる試験化合物を同定し、またはアミリン活性を阻 害することが既知である試験化合物の力価を評価するのに使用し得る検定方法は 、試験試料および試験方法を一緒に選び、ここで試験試料は１またはそれ以上の 試験化合物を含有し、試験方法は、アミリンまたはアミリンアゴニストの導入に 反応して乳酸排出の上昇およびグルコース値の上昇を示す生物学的生体モデルを 含み、アミリンまたはアミリンアゴニストの予定した量を試験系へ添加し、この 試験系で乳酸の上昇の存在またはその量を測定することからなる。この方法はさ らに試験系でグルコース上昇の存在またはその量の測定を含む。所望によりこの 検定方法には陽性対照検定、陰性対照検定、またはその両者の使用を含み得る。

この検定方法および対照検定では、任意の試験化合物（複数もあり）のアミリン 阻害の評価について乳酸およびグルコースの再反応に対する用量反応曲線を作成 でき、好ましく利用できる。生体系を例示すれば、ラットのような実験動物を含 む。

またさらにアミリン活性をシミュレートすることができる試験化合物の同定、ま たはアミリン活性をシミュレートすることが既知である試験化合物の力価を評価 するのに使用する検定方法を報告する。この方法は、試験試料および試料方法を 一緒に選ぶ段階を含み、ここで試験試料は１またはそれ以上の試験化合物を含有 し、試験方法は、アミリンまたはアミリンアゴニストの導入に反応して乳酸値の 上昇およびグルコース値の上昇を示す生物学的生体モデルを含み、この試験方法 で乳酸の上昇の存在またはその量を測定し、所望により、さらにこの試験方法で グルコースの上昇の存在またはその量を測定する。直ちにこの方法を進めて、陽 性対照検定、陰性対照検定、またはその両者を、アミリン活性をシミュレートす る試験化合物の評価に利用し得る。これらの検定および対照検定で、それぞれ乳 酸およびグルコースに対する効果を反映する好適な用量反応曲線を作成し、この 評価を助けることができる。

さらにこの発明のもう１つの態様として、アミリンまたはアミリンアゴニストを 含有することが既知であり、または疑わしい試験試料中の生物活性物質の量を測 定する検定方法を提供する。その方法は、アミリン生物活性を検定すべき試験試 料および試験方法を一緒に選ぶ段階を含み、ここでその試験方法は生物学的生体 モデルを含み、その生物学的モデルはアミリンまたはアミリンアゴニストの導入 に反応して乳酸値の上昇を示し、続いてグルコース値の上昇を示し、乳酸値の上 昇量を測定し、異なった量の試験試料を使用して検定方法を反復し、試験試料の アミリン生物活性を測定するのに使用する乳酸値上昇の用量反応像を作成するこ とからなる。所望によりこの方法は、さらにその試験方法でグルコースの上昇量 を測定し、異なった量の試験試料を使用して検定方法を反復し、試験試料のアミ リン生物活性を測定するのに使用するグルコースの上昇の用量反応像を作成する 段階を含む。この方法は、さらに試験試料の用量反応像（複数もあり）を、１ま たはそれ以上の陽性対照検定、１またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両 者について作成した用量反応像と比較し、試験試料のアミリン生物活性を測定す ることを含む。この方法は、さらに試験試料で作成した用量反応像（複数もあり ）を、アミリン標準、陰性対照標準、またはその両者について作成した用量反応 像と比較することを含み得る。本明細書で報告し、権利範囲を主張する生体内乳 酸およびグルコース反応の検定は、予期しなかった予想外な再現性および精度を 示す。

上記の方法のすべてで使用し、１またはそれ以上の試験化合物を含有し、陽性の 結果を生じた試験試料は、ついでこれを分割し、必要で好適であれば、何回も再 試験し、１またはそれ以上の試験化合物を含有する試験試料中で陽性結果を生じ るのに関与した試験化合物（複数もあり）を同定することができる。

また以上報告し、権利範囲を主張する検定方法に有用なアミリンアゴニストには 、　［Ｐｒｏ”］　−ヒトアミリン、　［Ｌｅｕ”］−ヒトアミリン、およびシ クロＬ’　［Ａｓｐ”、Ｌｙｓ’］−ヒトアミリンを包含する。

［図面の簡単な説明］ 第１図は筋肉内のグリコーゲン代謝に関するある種の異化および同化経路、特に ホスホリラーゼ制御を示す。

第２図は肝臓および筋肉内の解糖系、糖新生、およびグリコーゲン代謝の制御に 関与する各種酵素を示す。活性化および阻害をそれぞれ＋および−で示す。Ｄは ジカルボン酸輸送体、Ｔはトリカルボン酸輸送体を表す。

第３図はアミリンおよびインスリンの存在におけるグリコーゲンホスホリラーゼ 活性を示す。インスリン単独（７，１ｎＭ）　、ラットアミリン単独（３４ｒ＋ ）ｌ）、またはインスリン（７，１ｎｌ［）＋ラットアミリン（７６ｎｍ）と１ 時間インキュベーション後の単離したヒラメ訪中のグリコーゲンホスホリラーゼ ａを示す。縦棒は平均値士ＳＥＭ（各点はｎ＝４）を表す。

第４図はグリコーゲンホスホリラーゼ／アミリンの用量反応関係を示す。インス リン７．１ｎＭの存在で、アミリン濃度を増大させて１時間インキュベーション したのちの単離したヒラメ筋肉のグリコーゲンホスホリラーゼ活性。縦棒は平均 値±ＳＥＭ（各点はｎ＝４）を表す。

第５図はソマトスタチン潅流（３，４ｎＭ／ｈｒ）　、アミリン６６ｎｊｌ／ｋ ｇ　（白丸）、ペプチド対照（山角）、またはフエントラミン（白三角）を注射 したラットのアミリンに対する血圧反応（ＢＰ対照、白三角）を反復した血漿グ ルコース反応（平均値二ＳＥＭ、各曲線はｎ＝６）を示す。記号の上の星印はア ミリン処置群とペプチド対照群との差を示す。記号の下の星印はアミリン処置群 とＢＰ対照群との差を示す。

第６図は第５図で示した各群の血漿乳酸反応（平均値±ＳＥＭ、各曲線はｎ＝６ ）を示す。記号および星印は第５図と同意義である。

第７Ａ図は、アミリン血圧反応を反復するために設計した計画で、アミリン（６ ６ｎＭ／ｋｇ）　、ペプチド対照、またはフエントラミンを注射したラットの平 均動脈圧反応（２秒平均値±Ｓ、Ｅ、、網掛けで示す）を示す。亜急性血圧反応 を平均血圧（３０秒平均±Ｓ、Ｅ、）として第７Ｂ図に示す。記号、誤差範囲、 星印は第５図と同意義である。また急性血圧反応を注射時毎にプロットする。

第８図は、上記各図の説明と同様に、２．５ｎＭアミリン（白丸）、ペプチド対 照（山角）、またはフエントラミン（白三角）を静脈注射したラットで、放射性 同位元素を用いて測定した非定常性の内在性（肝性）グルコース産生を示す。試 料数、記号、縦棒、星印は第５図および６図と同意義である。

第９図は、１８時時間量ラットで、グルカゴン１００ｇｇ静脈注射（０時間）後 にアミリン１００μｇ静脈注射（６時間）した血漿動脈グルコース値（９Ａ）お よび乳酸値（９Ｂ）に対する効果を示す。

第１０図は、摂食ラット（・・・・−ｏ−−−一）および絶食ラット（−０−） （２０±１時間）で、グルカゴン１００μｇ静脈注射（０時間）後にアミリン１ ０（ｂ＋ｇ静脈注射（６時間）した血漿動脈グルコース値および血漿動脈乳酸値 に対する効果を示す。

第１１図は血糖／血中乳酸／血圧反応のアミリン静脈注射に対する反応。アミリ ン２５．５ｎｌｌ（）、または食塩水（−８）をラットに静脈注射後（それぞれ ｎ＝６）の血漿グルコース（上段）、血漿乳酸（中段）、平均動脈圧（下段）。

記号は平均値±ＳＥＭを表す。

第１２図は血糖／血中乳酸／血圧反応のアミリン皮下注射に対する反応。アミ１ １図から重ねた。記号は平均値±ＳＥＭを表す。

第１３図はグルコース、乳酸、平均動脈圧の変化に対するアミリン用量反応。

注射後３０分に測定した血漿グルコース（上段）、血漿乳酸（中段）の増加から 食塩水注射（それぞれ領４５ｍＭ、　０．０７ｍＭ）の反応を差し引く。平均動 脈圧（下段）は注射後１分の変化。

第１４図は試験管内のアゴニストおよびアンタゴニスト活性。単離したヒラメ筋 を、ホルモン無添加（対照Ｌ７．１ｎＭインスリン、７．１ｎＭインスリン＋１ ０ＱｎＭ７ミリン、および７．１ｎＭインスリン＋１１００ｎアミリン＋１００ ａＭ１００ａ　Ｐ　５−ｓｔ金含有クレブス・リンガ−重炭酸緩衝液で３０分間 前前部室る。次の時間、培地へ添加した’［Ｊ　１４ｃｍグルコースの総取り込 み量を抽出したグリコーゲンで測定した。ｎ＝筋肉１２片（平均値±ＳＥＭ）。

第１５図は試験管内の用量反応。試験管内でヒラメ筋を用いてＵ１４Ｃ−グルコ ースのグリコーゲン取り込みを阻害する１００ｎＪＩアミリン効果に拮抗する用 量反応。ＥＣ，。は５．９２μ輩土０．１３１ｏｇ単位であった。

第１６図は生体内におけるアミリンアゴニストおよびアンタゴニスト反応。無刺 激（ｎ＝７）およびｈｃＧＲＰａ−ｉフの連続前潅流（下方）で刺激後（ｎ＝３ 、発明の詳細な説明コ 試験管内研究では、アミリンは骨格筋へ作用して、グルコースの取り込み速度お よびグリコーゲンへの組み入れ速度を減少することが判った。試験管内研究から 、アミリンは糖新生を増大し、グリコーゲン含量を減少し、乳酸産生を増大でき ることが提案されていた。然しこれらの提案はまた、グリコーゲンの合成阻害に よって説明され得る（ヤングら、前掲）ことが提案され、最近の１報告ではイン スワンの存在で、アミリンが筋肉グリコーゲン分解を促進せず、即ち、乳酸産生 を増強しないと述べられている（Ｂ　レイトンおよびＥ、フット、前掲）。

予想外なことに、発明者らはアミリンが肝グリコーゲン分解、糖新生、骨格筋グ リコーゲン分解を刺激し、インスリンを介するグリコーゲン合成を阻害すること を発見した。さらに発明者らは、末梢組織におけるアミリンの主たる作用部位は グリコーゲンホスホリラーゼａ活性の刺激にあることを見いだした。グリコーゲ ンホスホリラーゼはグリコーゲンの分解を触媒する。ホスホリラーゼｂはこの酵 素の不活性形であり、低ＡＴＰ／高ＡＭＰにより、または筋肉収縮によって生じ る細胞内カルシウムの一過性の増大により活性化される。ホスホリラーゼａはこ の酵素の活性形であって、上記の条件の何れとも無関係に活性である。ただしこ れまでホスホリラーゼｂ／ホスホリラーゼａ転換の唯一既知の活性化因子は、ｃ ＡＭＰ依存性キナーゼを介して作動するアドレナリン刺激（エピネフリン）であ った。重要なことにインスリンはこのアドレナリン転換を阻害しないようである 。アミリン含有クレブス・リンガ−重炭酸緩衝液で、単離したラットヒラメ筋を インキュベートすると、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼｂ／ホスホリラーゼａ 転換を刺激する。この転換はインスリンが存在しなくても起こる。然しアドレナ リンを介するホスホリラーゼの活性化とは対照的に、媒質中のインスリンの存在 （１０００μＵ／ｍｌ）はホスホリラーゼ活性のアミリン刺激を著しく阻害する 。

実施例１に示したように、発明者らはグリコーゲンホスホリラーゼａの間接的な 刺激により、グリコーゲン分解を増強するアミリンの作用を証明した。グリコー ゲンホスホリラーゼａ活性は、粉末化した凍結ラット筋肉抽出物で試験した。

第３図に示した結果のように、単離したラット骨格筋を、インスリンの存在なし でアミリン３４ｎＭで処理すると、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼａの活性は ２゜８倍増強された（酵素タンパク質１ｍｇ当たりの基礎水準８．５±０．８／ ｎＭ／分に対してタンパク質１ｍｇ当たり２３．７±４．１ｎＬ／分）。さらに アミリンは、インスリン７．１ｎｌｉの存在で、グリコーゲンホスホリラーゼａ の活性に用量依存性の増加を生じた（第４図参照）。酵素活性は、アミリンが存 在しない基礎水準（タンパク質１ｍｇ当たり６．８±０．７ｎＭ／分）から、７ ８１ｎＭのアミリン濃度でタンパク質１ｍｇ当たり１８１±２．９ｎＭ／分へと ２．７倍増加した（＋）＜Ｏ，０ＯＣ）１）アミリンが存在しない場合、インス リン７、ｌｎＭではグリコーゲンホスホリラーゼａ活性に有意な変化を生じなか った（第１表）。これに反してアミリンが存在すると、インスリンはグリコーゲ ンホスホリラーゼａ活性を有意に減少させた。

即ち、インスリンが存在しない場合、アミリン３４ｎＭで、酵素活性はタンノく り質ｌｌ１ｇ当たり２３．７±４．１ｎＭ／分であった。インスリン濃度が７， １ｎＭでは、アミリン７５ｎＭの存在でホスホリラーゼ活性はタンパク質１ｍｇ 当たり９．４±１．ＯｎＭ／分へ低下した（アミリン３４ｎＭ単独と比較して、 ｐ＜０．０２）。

この新しく発見されたアミリンの活性は、アミリンアゴニストおよびアンタゴニ ストの活性スクリーニングおよび／またはそれらの活性の評価に細胞レベルで行 う方法にこれを使用できるようにした。反応カスケード：［１］グリコーゲン、 、、　＋　ｐ　：→グリコーゲン。−１，＋グルコースー１−リン酸［２］　グ ルコース−１−リン酸→グルコースー６−リン酸［３］グルコース−６−リン酸 ＋ＮＡＤＰ”→６−ホスホグルコンー６−ラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ′″によっ てＮＡＤＰＨを生成し、これは蛍光を発する。ＡＴＰを添加し、カルシウム（Ｃ ａ　２ａを低値に保つと、ＡＴＰはホスホリラーゼｂ活性を阻害する。ついで他 の酵素を十分量添加すると、ＮＡＤＰおよびＰ、が十分に存在する場合、反応速 度（ＮＡＤＰＨ蛍光の増加速度によって測定）は、グリコーゲンホスホリラーゼ ａの存在量によって制限される。グリコーゲンホスホリラーゼａの存在は、アミ リンとの前部室の直接的な結果である。アミリンアゴニストおよびアドレナリン アゴニストは反応速度を増大させる。アミリンアンタゴニストは、その後のアミ リン適用によって期待される反応速度を阻害する。

この方法の１実施態様では、実施例１に示したように単離した哺乳動物骨格筋標 本を検定系として使用する。この方法の別の１態様では、グリコーゲンを炭水化 物貯蔵形として利用し、アミリンによる最大刺激に対してホスホリラーゼ活性に 少なくとも約３倍の増加を示すアミリン感受性培養細胞を使用する。好ましいの はミオサイト（筋肉）組織または細胞系である。最も好ましいのは骨格筋組織ま たは細胞系である。また筋肉表現型特性を保持している筋肉細胞系も好ましい。

さらにこの発明のもう１つの態様では、ウィルス性ＬＴＲプロモーターのような 好適なプロモーター組立て物を使用して、ミオＩＤ遺伝子を例えば繊維芽細胞系 へトランスフェクトできるワイトラウブらが報告した方法［サイエンス、２５１ 巻、７６１〜７６６頁（１９９１年）コに基づ（遺伝子工学によって筋肉様細胞 系を作り出す。ついで細胞を惹起させ、骨格筋様細胞表現型へ分化させる。選ば れた組織標本または細胞系をついで対象となる化合物、例えば推定されるアミリ ンアゴニストまたは推定されるアミリンアンタゴニストと予定時間インキュベー トする。検定が推定または既知のアミリンアンタゴニストを同定し、評価し、ま たは特性決定するのに用いる場合は、アミリンアゴニストを細胞培養へ添加する 約１０分、２０分、または３０分前に、この化合物を、好ましくは少なくとも最 大アミＩＪン反応の約７５％を惹起し得る最終濃度（ＥＣｔｓ）となるよう（ζ 添加する。細胞を破砕し、ＡＴＰ無機リン酸、ホスホグルコースイソメラーゼ、 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびＮＡＤＰを混合物へ添加し、 約５分間インキュベートする。細胞は、音波処理のような物理的手段、および細 胞膜を破壊する界面活性剤のような細胞溶解化合物等を含む当業界既知の方法に よって破壊し得る。このインキュベーションに続いて、グリコーゲンホスホリラ ーゼａ活性を任意の幾つかの既知方法を用いて測定し得る。本明細書で説明する 方法では、一定間隔で変化するＮＡＤＰＨ蛍光の変化を用いて、ホスホリラーゼ ａが触媒するグリコーゲン分解速度を測定する。グリコーゲンホスホリラーゼは 、グリコーゲン加リン酸分解の方向、またはグリコーゲン合成方向の何れの方向 でも測定できる。

即ちグリコーゲンホスホリラーゼの活性はまた、逆反応グルコース−１−リン酸 ＋グリコーゲン、。−１，→グリコーゲン。、＋Ｐ１からも測定できる。酵素活 性を反応速度からの推論によって決定できるように、上記の方法を用いて、条件 がＯ久遠度を示すように変えることができる。例えば！４（または３２ｐを使用 してグルコース−１−リン酸を放射能標識し、グリコーゲンまたは無機リン酸へ の取り込みをそれぞれ追跡する［Ｄ、Ｐ、ギルボエら、アナリティカル・バイオ ケミストリー、４７巻、２０〜２７頁（１９７２年）］。

またグリコーゲンホスホリラーゼ活性を評価するその他の方法もこの発明に好ま しく使用できる。グリコーゲンホスホリラーゼ活性は、示差分光旋光法［Ｍメー ソン、Ｐ、ファセラ、アナリティカル・バイオケミストリー、４３巻、５７〜６ ５頁（１９７１年）］、グリコーゲン合成の方向でホスホリラーゼを測定する濾 紙手法［Ｐ、ワンプ、■、ニスマン、アナリティカル・バイオケミストリー、４ ７巻、４９５〜５００頁（１９７２年）コ、どちらの方向ででも酵素速度を測定 し得る滴定検定法［Ｋ、ファルタ−１Ａ、ラクトン、アナリティカル・バイオケ ミストリー、５３巻、６１３〜６２３頁（１９７３年）］、遊離リン酸を測定す るｐＨ電極検定法［Ｐ、Ａ、マツククラッケン、Ｗ、　Ｍ、ラザフォード、アナ リティカル・バイオケミストリー、１０１巻、２７５〜２７７頁（１９８０年） コ、ＮＡＤＰＨ生成を測定する生物発光法［Ｒ，Ｊ　ツーゲス、アナリティカル ・バイオケミストリー、１３１巻、３１８〜３２３頁（１９８３年）コ、無機リ ン酸を測定する各種の分光光度検定法［Ｄ、　Ａベンチｍ＝ら、アナリティカル ・バイオケミストリー、１３２巻、２５４〜２５８頁（１９８３年）、Ｓ、サヘ キら、アナリティカル・バイオケミストリー、１４８巻、２７７〜２８１頁（１ ９８５年）］を用いることによりモニターすることができる。

また例えば即時リン酸測定法［ｒ、Ｔ、カーニーら、アナリティカル・バイオケ ミストリー、８５巻、３２１〜３２４頁（１９７８年）］、または自動化グリコ ーゲンホスホリラーゼ測定装置［Ｒ，Ｈ，ハシュケ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、ハイルマイア ー、アナリティカル・バイオケミストリー、４７巻、４５１〜４５６頁（１９７ ２年）〕等を含む各種のグリコーゲンホスホリラーゼ検定法を用いて、多数の試 料を同時に処理することができる。

また発明者らは、予想外にもアミリンが血漿グルコースおよび乳酸の両者で、実 質上、活発な増加を生じることを見いだした。実施例２に示したように、この高 乳酸血症は１〜２時間、高血糖症は２〜３時間持続した。これらの反応は（対応 する対照群と比較して）４〜５時間持続する内在性（肝性）グルコース産生の増 加を伴った。低血圧対照群と比べて有意なこれらの反応の増加から、これらが単 なる低潅流の結果ではなくアミリンの直接的な効果から生じたものであることが 分かる。同様に処置群間で測定した血漿カテコールアミンに差がないことは、観 察した効果がこれらの作用因子によって起こったのではないことを示している。

アミリンの場合、観察された高血糖へ導く処理しきれない過度のグルコース出現 率は長い絶食期間にもかかわらず起こった。ラットにおけるそのような絶食期間 では、肝グリコーゲンは典型的に０．２％（ｖｔ／ｉｔ）に枯渇する［Ｇ、　Ｉ 　シャルマンら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、７ ６巻、１２２９〜１２３６頁（１９８５年）］。

第５図は、アミリンの注射後、急速な血漿グルコースの増加があったことを示す 。この上昇は対照動物で見られた一層遅く持続した血漿グルコースの上昇より統 計的に大きく、高血糖は数時間持続した。血漿乳酸の結果を第６図に示す。血漿 乳酸濃度はアミリン注射後３０分以内に２３０％まで増加し、有意な上昇は少な （とも２時間持続した。血圧の結果を第７図に示す。実験条件下で平均動脈圧の 有意な降下があったので、血圧対照群はこれらの変化を反復し、何れにしても低 下した動脈圧から生じる組織潅流の低下に帰し得る高血糖および高乳酸血症の要 素を評価できるように設計した。然し注射後６時間を経過しても、アミリン処置 群およびフェントラミン処！群の間になんら有意な動脈圧の差は認められなかっ た。一方、グルコース像および乳酸像ではこれらの２群間に有意な差があり、そ のような差がアミリンの血管作用効果に起因するのではないことが判明した。第 ８図に示したように、アミリンはまた、注射後１時間以内に内在性グルコース産 生に２１４％の増加を来した。この増加は、対照群と比較して４時間上昇を持続 した。

第６図で観察されたアミリン投与後の血漿中の乳酸の出現は、前記のように、そ れが筋肉グリコーゲンの分解に由来することと一致する。肝グルコースの産生お よび血漿グルコースは血漿乳酸の場合より一層長く、対照値より有意に上昇する 。他の研究では、一般にインスリンを介する代謝変化を修飾する作用に関してア ミリンを注目しているが、後述するように、ソマトスタチン潅流を用いて内因性 のインスリンおよびグルカゴン分泌を阻害し、アミリンの効果がこれらのホルモ ンの変化と無関係であることを測定した。アミリンの１回大量投与後の代謝パラ メーターの範囲を観察した。観察した一連の効果は、アミリン大量投与後、筋肉 の乳酸が血漿内へ放出され、肝臓へ供給されて、そこで糖新生の基質として利用 される測定と一致する。即ち、アミリンはコリ回路の回転を増強する。アミリン は、末梢組織からの糖新生基質の放出および肝における糖新生／グリコーゲン分 解を修飾することによってコリ回路（グルコース→３炭素化合物→グルコース） を通る流れを制御する。コリ回路を通る食後の流れは、肝グリコーゲン増量の主 なメカニズムであるようである［Ｃ，Ｂニ二一ガード、Ｌ、Ｊ、バーシュ、Ｄ、 Ｗ。

フォスター、Ｊ、Ｄ、マツクガリー、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー、２５８巻、８０４６〜８０５２頁（１９８３年）］。

実施例３は、絶食ラットで血漿グルコース値および乳酸値に与えるアミリンおよ びグルカゴン大量注射の効果を検討したものである。第９Ａおよび９Ｂ図に示し たように、不飽和条件下で（実施例２で示した実験はソマトスタチン飽和下で実 施した）、アミリンは血漿グルコースおよび乳酸の両者の急速な上昇を起こした 。グルコースの上昇は３０分で有意であり、１．５土０．２２時間でピークに達 した。然し乳酸値の増加は、注射後３０分以内にピークに達した。これとは対照 的にグルカゴンの注射では有意な血糖反応を起こしたが、アミリンの場合よりは るかに少なかった。ただしグルカゴンは対照と比べて有意な乳酸の変化を生じな かった。

実施例４に示した検討は、絶食ラット（２０±１時間）および摂食ラットの両者 で、グルカゴン投与（０時間）に続いて、アミリンを投与（６時間）したグルカ ゴンの効果を観察したものである（第１０図および第１表参照）。摂食ラットで は、グルカゴン注射によって急速な血糖反応を生じ、約０．６時間持続した。

グルカゴンは直接的な肝グリコーゲン分解の刺激を介して速やかな効果を生じる と考えられており、ヒトでは、最初の対抗調節的な肝グリコーゲン産生の８５％ であると考えられている。肝グリコーゲン形成の様式として、持続した対抗調節 的なホルモン刺激により次第にグリコーゲン分解に置き換わる糖新生を生じると 報告されている［Ｌ、レカバリエールら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィ ジオロジー、２５６巻、８４４〜８５１頁（１９８９年）コ。

これとは対照的に、２０時間絶食ラットではグルカゴンに対する血糖反応は比較 的少なかった。絶食ラットでは肝グリコーゲンは１８〜２４時間で最小であり、 約０１〜０．２％（ｗｔ／ｗｔ）であった。この検討では、肝グリコーゲン含量 は測定しなかったが、観察したデータから、グルカゴン注射後にグリコーゲン形 成を制限する肝グリコーゲン枯渇と一致した。

絶食動物で、アミリン注射は、相対的な乳酸の急速な崩壊を反映する血漿乳酸の 飛躍的な増加と血漿グルコースの著しい増加を生じた。摂食動物では、絶食動物 で観察したのとほぼ等しい血漿乳酸の増加があった。然し絶食動物と比較すると 、血糖反応の消失があり、このことは血漿乳酸のゆるやかな崩壊とよく一致して いた。

実施例６は、軽く麻酔したラットで、アミリンが血漿乳酸およびグルコースで用 量依存性の増加を生じることを示す（第１１〜１３図参照）。この結果も、これ らの代謝反応がアミリンの高投与量で出現する心血管系の変化によるものではな いことを示している。第１に、アミリン１００μｇの大量静脈注射で一過性の低 下を起こすのとは対照的に、アミリン同量の皮下注射では血圧になんら有意な変 化を起こさない。しかも血漿乳酸および血漿グルコースは実質上増加を示し、グ ルコースでは５．５ｎＭから１００Ｍへ、乳酸では０．１５ｎＭから１．２５ｎ Ｍへと増加する（第１２図参照）。皮下注射の場合、注射後の反応の上昇時間は 若干遅く、その傾きも遅延しており、この投与経路ではアミリンの血流への到達 が遅いことと一致する。グルコースおよび乳酸の反応曲線上面積（実験曲線一対 照曲線の積分値）は静脈投与および皮下投与の経路間で有意の差はなかった。第 ２に、第１３図の用量反応測定では、グルコースおよび乳酸の用量反応曲線が血 圧反応と比較して左側へ移行して現れることを示す。即ち、アミリンの静脈投与 は代謝的反応を発現するが、心血管反応は検出されない。アミリンの代謝的効果 と心血管効果を同時にモニターし、後者（心血管効果）が存在しない前者（代謝 的効果）を示したこれらの実験は新規である。血流および潅流圧の変化が、虚血 に起因する筋肉の乳酸産生を増加させ、交感神経アドレナリン系の賦活およびカ テコールアミン値の上昇による肝グルコース排出を増大し得ることはよく理解し 得よう。実施例２および６に示した実験は、アミリン作用が実質上グルカゴン分 泌の増加を介するものでない決定を支持するものである。

これらの結果の重要な特徴は、研究した限り、最も著しいアミリン作用は血漿乳 酸の増加であり、最も低い投与量でも摂食状態および絶食状態でその程度は類似 しており、高血糖反応を進行させるようであることである。アミリンによって起 こる高血糖は、試験管内で明らかにアミリンの直接的な反応である骨格筋に対す るアミリンの一次効果と一致する。発明者らは、この作用を強力に支持するメカ ニズムは、前述のように、また単離したヒラメ筋でアミリンを介するホスホリラ ーゼａの刺激が関連する実施例１の実験で説明するように、グリコーゲン分解の 刺激であると確信する。注目すべき重要な点は、血漿乳酸を増加し、ホスホリラ ーゼを活性化するアミリンの作用は、高乳酸血症がソマトスタチン処理動物で見 られ、ホスホリラーゼ活性化がインスリン無添加培質でインキュベートした筋肉 で起こることから、インスリンの作用と無関係であることである。

実施例７の実験は、アミリンアンタゴニストとしてのヒトＣＧＲＰｓ−ｓ−ｙの 試験管内および生体内の効果を示す。またアミリンによって生じる血圧の変化に 対するその効果を検討した。第１４および１５図に試験管内の結果を示す。この 成績から、ヒラメ筋検定で、インスリンは放射能標識したグルコースのグリコー ゲンへの取り込みを刺激することが分かる。アミリンを試験系へ添加すると、イ ンスリンの効果の阻害が起こる。ヒトＣＧ　ＲＰ　ａ−Ｎ７を試験系へ添加する と、アミリンによるインスリンの阻害は逆転する。このアンタゴニストを単独で 投与しても、なんら効果はない。第１５図はアンタゴニストヒトＣＧ　ＲＰ　ａ −ｓｙの用量依存性の効果を示す。生体内の結果を第１６図に示す。ヒトＣＧＲ Ｐｇ−３□は、血中乳酸値およびグルコース値を上昇するアミリンの効果に完全 に拮抗する。

以下に示す実施例は本明細書で説明し、権利範囲を主張するこの検定方法を例示 し、裏付けるためのものであって、この発明の方法を制限するためのものではな い。

実施例１ これらの実施例では、グリコーゲンホスホリラーゼａの間接的刺激によるアミリ ンのグリコーゲン分解増強能を証明する。バーラン・スプレーグドーリー・ラッ ト（雄性、２００　ｇ）を１２時間、１２時間周期の明暗循環（実験は明周期中 に実施する）で２２．７±０．８℃で飼育し、飼料および水は自由に摂取させた （飼料はＬＭ−４８５、チクラド社、マジソン、Ｗｌ）。動物は実験４時間前に 絶食させた。

最初に、この研究に使用したラット・アミリン（ロット＃ＺＧ４８５、バヶム社 、トーランス、ＣＡ）の活性をヒラメ筋に基づく検定を用いて測定した。測定し たＥＣ５゜は６．７±１．５ｎＭであった。タンパク質を含有しない緩衝液中の アミリンの濃度を先に報告された定量的アミノ酸分析［Ｇｊ、Ｓ、クーパーら、 プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８５巻、７７６３〜７７６６頁（１９８８年）］により測 定した。可溶性インスリン（「ヒユーマリン−ＲＪ　、１００　Ｕ／ｍｌ）はイ ーライ・リリー社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。この研究で使用 したインスリンの活性単位（Ｕ）とモル単位との間の換算係数は１ａＵ／ａ＋１ ＝７．１ｉ）Ｍであった。ほかに付言しない場合、他のすべての試薬は分析級ま たはそれ以上の品賀のものであった。

摘出し、細片化したラットヒラメ筋の単離、および種々のインスリン濃度および アミリン１度の存在でのインキュベーションは、先に報告された方法にしたがっ て実施した［Ｂ、レイトン、Ｇ、Ｊ、Ｓ　クーパー、ネーチャー、３３５巻、６ ３２〜６３５頁（１９８８年）、レイトンら、ＦＥＢＳレターズ、２４９巻、３ ５７〜３６１頁（１９８９年）］。４本の筋肉細片をそれぞれの処理条件でイン キュベートした。

対照インキュベーションはインスリン（７，１ｎＭ）またはアミリン（３４ｎｊ ｌ）の存在または存在なしで実施した。グリコーゲンホスホリラーゼ活性に対す るアミリンの用量依存性の効果を一定量のインスリンの存在（７，１１Ｍ）でア ミリン濃度を増大させて（０，０，３９，３，９，７６，７８１ｎＭ）検討した 。

インキュベーションののち、筋肉を直ちに液体窒素中で凍結し、グリコーゲンホ スホリラーゼａ活性の測定を実施するまで一７０℃で貯蔵した。

粉末化し、凍結した筋肉抽出物中のグリコーゲンホスホリラーゼａの活性を、先 に報告された方法を用いて測定した［Ａ、Ｗ、タンおよびＦ、Ｑ、ヌットール、 バイオキミ力・工・バイオフィジカ・アクタ、４１０巻、４５〜６０頁（１９７ ５年）コ。酵素活性をタンパク質１　ｍｇ／　１分間当たりに換算したｎＭ（ナ ノモル）・グリコジル単位で表す。筋肉組織抽出物中のタンパク質濃度はブラフ オードの方法にしたがい測定した［Ｍ、Ｍブラフオード、アナリティカル・バイ オケミストリー、７２巻、２４８〜２５４頁（１９７６年）コ。

すべての結果は平均値±ＳＥＭで表す。統計分析は対応しないスチューデントの 両側を検定を用いて実施し、有意水準を検定した。

圭離したラット骨格筋をインスリンの存在なしでアミリン３４ｎＭで処理すると 筋肉グリコーゲンホスホリラーゼａ活性は２８倍［タンパク質１ｍｇ当たりの基 準値８．５士領８ｎＭ／分からタンパク質ｌｌ１１ｇ当たり２３．７±４．１ｎ Ｍ／分］まで増大した（ｐ＜０．０００１）（第３図参照）。

実施例２ 実験計画の各処置はそれぞれ雄性バーラン・スプレーグドーリ−・ラント６匹（ 体重３８８±７ｇ１日令９３±２日）ずつを使用した。動物は１２時間・１２時 間周期の明暗循環（実験は明周期中に実施する）で２２．７±０８℃で飼育し、 飼料および水は自由に摂取させた（飼料はＬＭ−４８５、チクラド社、マジソン 、ｗ丁）。動物を１夜絶食させた（手術前１３．３±２．８時間）。５％ハロタ ンで麻酔を導入し、手術中は２％、代謝記録中は領８〜１％で維持した。気管切 開し、右大腿動脈および静脈にカニユーレ装着を実施した。

大腿動脈導管を圧トランスジューサー（スベクトレームドＰ２３ＸＬトランスジ ューサー、１３−４６１５−５８型増幅器、ゴールド社、クリーブランド、ＯＨ ）へ接続し、ヘパリン化食塩水（２Ｕ／＋ａｌ）を３　、０　ｍｌ／ｈｒの速度 で潅流した。

長時間にわたって潅流する薬剤はすべてこの潅流へ添加した。大腿静脈導管は急 性（大量）注射に使用した。

四肢病−ＥＣＧをＥＣＧ／バイオタッチ増幅器（１３−４６１５−６５Ａ型、ゴ ールド社、クリーブランド、ＯＨ）からモニターし、心拍数を誘導した。

サーミスター探子および加熱操作板のスイッチによりコア温度の閉回路制御を提 供する制御装ｆｉ（７３Ａ型、ＹＳＩ社、イエロースプリングズ、ＯＨ）を使用 して結腸温を測定した。

気管内チューブを、気管内の流れで小さい狭窄を横切る圧差を測定するために特 別に組み立てられた呼吸描記装置へ連結した。カリブレーションテーブル（ラブ チック・ノートブック・ファンクション）を使用して、アウトプットを線形化し てオンラインで流した。呼吸質量分析計（ＭＧＡ３０００、エアスペック社、ビ ギンヒル、ゲント、英国）を使用して気管の流路からの試料をＮ２、○３、Ａｒ 。

Ｃｏ２、水蒸気、およびハロタンについて連続的に分析した。

気管内の流れのシグナル、０２およびＣ○２濃度、心拍数、動脈圧、および結膓 温について定期的に試料を取り、コンピューター化したデータ蓄積装ｆｆ（ＤＴ ２８０１ＡＡ／Ｄコンバーター、データ・トランスレージ３ン社、マルボロー、 ＭＡ／ＡＳＴプレミアム３８６コンピユーター、ＡＳＴリサーチ社、アービン、 ＣＡ／ラブチック・ノートブック・ソフトウェア、ラボラトリーテクノロジーズ 社、ウイルミントン、ＭＡ）を使用して２０Ｈｚ、１２ビツトの精度で貯蔵した 。

ガス張力および流路のシグナルを同調させ、酸素消費率および呼吸比を３０秒間 隔で誘導するのに使用した。カニユーレ挿着の際に、ソマトスタチン（３，４ｎ ｌｌ／ｈｒ）（Ｓ−９１２９、シグマ社、セントルイス、ＭＯ）および３−［” Ｈコーゲルコース（４４，４ｋＢｑ／ｈｒ）　にューイングランド・ニューフレ ア社／デュポン、ウイルミントン、ＤＥ）を含有するヘパリン化食塩水を潅流し た。

カニユーレ挿着の際に、ソマトスタチン（３，４ＩＭ／ｈｒ）（Ｓ−９１２９、 シグマ社、セントルイス、ＭＯ）および３−　［３Ｈ］−グルコースにューイン グランド・ニューフレア社／デュポン、ウイルミントン、ＤＥ）を含有するヘパ リン化食塩水を潅流した。

３つの処置群に分けた。

（１）アミリン大量投与群（ｎ＝６）：２時間潅流後、新たに溶解したラット・ アミリン（ロット＃ＺＧ４８５、バケム社、トーランス、ＣＡ）２５．３ＩＭを 含有する食塩水１００ｍ１の大量を動物に注射した。最初に、この研究に使用し たペプチドの生物活性をヒラメ筋に基づく検定法を用いて確かめた［Ｂ、レイト ン、Ｇ、Ｊ、Ｓ、クーパー、ホーチャー、３３５巻、６３２〜６３５頁（１９８ ８年）］（ＥＣｓｏ＝６．７±１．５ｎＭ）。

（２）対照群（ｎ＝６）：新鮮なアミリンの代わりに、１２１℃で９０分間オー トクレーブ滅菌したこれと同じペプチド２５．５ＩＭ　（ｎ＝３）または食塩水 単独（ｎ＝３）の何れかをラットに注射した。オートクレーブで滅菌したアミリ ンと食塩水に対する反応の間に差がなかったので、データを単一の対照群ヘブー ルし、これを「ペプチド対照群」と呼んだ。

（３）血圧対照群（ｎ＝６）ニアミリン６６ｎＭ／ｋｇの大量注射によって生じ た一過性の低血圧パターンを似せるように計算した計画で、新鮮なアミリンの代 わりにフエントラミン１８ｎＭ（刺激）の食塩水５０μｍ溶液を大腿静脈カニユ ーレから注射した。

大量注射の０．５．０．２５．０時間前、および注射後０．５．１．１．５．２ ．３．４．５．６時間に動脈試料を採取した。試料をＮａ！・ＥＤＴＡ　（最終 温度約５ｍＭ）へ採り、分離した血漿をグルコース、乳酸、トリチウム化したグ ルコース、インスリン、およびラット・アミリンについて分析した。

グルコースおよび乳酸を固定化酵素化学によって分析した（グルコースオキシダ ーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、分析機２３００−３ＴＡＴ型、ＹＳＩ社、イエロ ースプリングズ、○Ｈ）。

過塩素酸沈殿によってあらかじめ除タンパクした血漿の蒸発後、残留するトリチ ウムを計数したのち、トリチウム化したグルコースの比活性を測定した［Ｊ。

Ｄ、ベスト、ジュツエピッチ、Ｍ、Ａ、ブファイファー、Ｊ、Ｃ，ベアード、Ｊ 、Ｂ。

ハルター、Ｄ、ポーター、ダイアビーテス、３１巻、３３３〜３３８頁（１９８ ２年）コ。放射性グルコースの一定潅流速度（４４、４ｋＢｑ／ｈｒ）で、ステ ィールの非定常状態トレーサー希釈法［Ｒ，スティール、アナールズ・オブ・ザ ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、８巻、４２０〜４３０頁（ １９５９年）］の修飾［Ｊ、ブロイエツト、Ｆ、ローナー・シーンレノ−１Ｅ、 イオネスキュー、Ｊ、テレタッツ、Ｊ、　Ｆ、サラター、Ｂ、シーンレノ−、ア メリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー、２５２巻、Ｅ７７〜Ｅ８４頁（ １９８７年）］を用いて、トリチル化したグルコース比活性および推定グルコー ス空間から内在性グルコースの産生率を決定した。

インスリンは放射免疫測定法（マイクロメゾイック・ヒユーマン・インスリン・ ＲＩＡキット、ＩＣＮバイオメジカルズ社、ホージャム、ＰＡ）により測定した （感度６ｐｉｌ、ラットインスリンとの交差反応性８９．５％）。ラットアミリ ンはＣ−１８樹脂抽出し、８０％アセトニトリル１０．１％トリフルオロ酢酸で 溶出後、放射免疫測定法（キットＲＩＫ７３２３、ベニスラ・ラボラトリーズ社 、ベルセント、ＣＡ）により測定した。

血漿カテコールアミン（エピネフリンおよびノルエピネフリン）は、アルミナで 血漿抽出後、電気化学検出によるＨＰＬＣを使用して、注射後０．２．４．６時 間に測定した。抽出の前に、内部標準（ジヒドロキシ酪酸）を血漿へ加えるワイ カー法［Ｈワイカー、Ｍフエラウディ、Ｈ，ヘイグル、Ｒプルート、クリ二カ・ 工・キミ力・アクタ、１４１巻、１７〜２５頁（１９８４年）ｊの修飾を行い５ ０！■試料の分析（変動係数７．８％）を可能にした。

統計分析は５ＹＳＴＡＴシステム（ンスタット社、エバンストン、ＩＬ）　・ル ーティングに含まれているスチューデントのｔ検定により、有意水準ｐ＜０．０ ５を用いて検定した。池に説明しない場合、すべての結果は平均値士標準誤差で 報告する。

測定した血中グルコース値および乳酸値を第５図に示す。アミリン（６６ｎｌｌ ／ｋｇ）の注射後、血漿グルコースは５．９±０．３Ｉから１１．０±０．６ｍ ｍ１（グルコース）へと急速な増加を示した。これとは対照的に長時間実験条件 では、対照動物で−１ゆるやかな持続した血漿グルコースの上昇が起こった。ア ミリン処置ラット（第１群）では不活性ペプチド対照群（第２群）と比べて、有 意な高血糖が少なくとも３時間続き、血圧対照群と比べて少なくとも２時間続い た。第６図に示したように、血漿乳酸濃度は注射後３０分までに２３０％増加し 、少なくとも２時間有意な上昇値を示した。

ソマトスタチンの２時間潅流後、平均動脈圧で１０１±２から８３±５　ｍｍＨ ｇへと有意な降下があった（１３．４７±０．２７　：　１１．０７＝ｏ、　６ ７ｋＰａ、　ｐ＜０゜０１）。追加的なアミリンの大量注射では、平均動脈圧の 降下が約６０秒以内に完全に起こり、平均動脈圧はさらに一層降下した。アミリ ン注射群では、注射後３０分でも、血圧はなお有意に低く　（７３：　９１Ｉｍ Ｈｇ）　、心拍数は有意に高かった（３３６・３２０／分）が、注射後６０分で 、両者はペプチド対照群値（第２群）へ回復した（第７図参照）。

血圧対照群（篤３群）はソマトスタチン潅流の存在でアミリン大量投与群血管作 用によって起こる動脈圧の変化を反復するように設計され、それによって血圧低 下から生じる組織潅流の低下に起因するかもしれない高血糖および高乳酸血症の 要素を評価した。

注射６時間後まで、アミリン処置群とフエントラミノ処置群との間の平均動脈圧 に有意差はなかった。第７Ａ図に、標的（第１群）動脈圧パターンと比較したフ エントラミン１８１Ｍの反復刺激に対する動脈圧反応を示す。この群では、正常 血圧対照群より増大したグルコースおよび乳酸反応があった。然しそれは第５図 および６図に示したアミリン反応はど大きくなく、明らかに異なった時間的パタ ーンを示した。

血中カテコールアミン（ノルエピネフリン）値は何れの処置群（アミリン処置群 ：ペプチド処置群、アミリン処置血圧対照群、ペプチド対照群：血圧対照群）の 何れの時点でも（注射後、０．２．４．６時間）、１つの例外（ペプチド対照群 〉アミリン処置群、２時間値）を除いて差はなかった。３処置群のすべて、およ び低血圧群（アミリン処置群＋血圧対照群）からプールしたデータセットで、注 射前値よりノルエピネフリンの有意な増加を示したものはなかった。これと同じ 方法で分析したエピネフリン値も、比較した何れの時点でもなんら有意の差はな く、またプールしたデータセットで時間の増加もなかった。アミリン処置群、ペ プチド対照群および血圧対照群で、血漿ノルエピネフリン値はそれぞれ３．９± ０．４．５．１±０．６、および３．９±Ｑ、３ｎｉｌであり、血漿エピネフリ ン値はそれぞれ４．１±０．９．３，７±０，４、および５，５±Ｑ、ｇｎｌｌ であった。

血中インスリン値に関しては、何れの処置群とも、実験期間を通じて注射前値か ら変化した血漿インスリン濃度はなく、高血糖の徴候の観察から予想され得る高 インスリン血症をソマトスタチンが有効に阻害していることを示した。同様に実 験期間を通じて、どの時点をとっても（０，２，４，６時間）処置群間になんら の差はなかった。グルコース刺激によるインスリン分泌はソマトスタチン潅流に よって有効に阻害され、グルカゴン分泌が同様に確実に阻害されることが判った ＥＪ、Ｅ、ゲリッチ、Ｍ、ロレンジ、Ｖンユナイダー、Ｃ，Ｗ、ファン、ＪＨ， カラム、Ｒ，グイルミン、Ｐ、Ｈフォーンヤム、ダイアビーテス、２３巻、８７ ６〜８８０頁（１９７４年）］。血漿インスリン値はアミリン処置群、ペプチド 対照群および血圧対照群で、それぞれ１２８±２１．１８４±２２、および１５ ３±１５ｐｍであった。

放射性同位元素によって測定したアミリン注射群における内在性グルコースの産 生は、注射後１時間および２時間のそれぞれ対応する対照値の２１４％および２ １９％に増大し、有意に上昇したまま（ペプチド対照群および注射前値と比較し て）４時間持続した（第８図参照）。アミリン注射は、０．１２ｍＭ／分の血漿 グルコース濃度増加の初速度を生じた。推定グルコース空間（９７ｍＭ）全体に 分布したとすると、これはグルコース消失（１３，３ＩＩＭ／分）より過度のグ ルコース出現を生じたことを表す。この増加は対照群で測定した値（１３，５μ Ｍ／分）を超え、グルコース産生体止速度のほぼ２倍を表す。

同様にアミリン注射群における内在性グルコースの産生は、注射後５時間の血圧 対照群と比較して有意に上昇したままであった。第８図に示したように、対照群 では、どの時点でも互いに他の群と差がなかった。

酸素消費率は、実験期間を通じて、何れの実験群またはペプチド対照群ともなん ら変化がなかった。それらは何れの群間でも差がなかった［それぞれ注射前、７ ．８９±０．３８および７．４４±０．３４ｍ１／分：血糖反応ピーク時（注射 後１時間、７．８２±０．５５および７．３２±０．２６ｍ１／分コ。

１夜絶食後の呼吸比（ＲＱ）は、アミリン処理動物（０，７２０±０．０１４） およびペプチド対照群（０，７４７’：０．０１８）と１夜絶食後の理論的最小 値に近かった。注射前値からアミリン注射後までＲＱに変化はなく、アミリン処 置群とペプチド対照群間で差はなかった。

実施例３ この実施例では、絶食麻酔ラットにおける血漿グルコースおよび乳酸に対するア ミリンおよびグルカゴンの効果を比較する。

雄性バーラン・スプレーグドーリ−・ラット１６匹を、１２時間：１２時間周期 の明暗循環（実験は明周期中に実施する）で２２，７±０．８℃で飼育し、飼料 および水は自由に摂取させた（飼料はＬＭ−４８５、チクラド社、マジンン、Ｗ Ｉ）。動物を実験前に１夜絶食させた。５％ハロタンで麻酔を導入し、手術中は ２％、代謝記録中は０８〜１％で維持した。気管切開し、右大腿動脈および静脈 にカニユーレ装着を実施した。

大腿動脈導管を圧トランスジューサー（スペクトレームドＰ２３ＸＬトランスジ ューサー、１３−４６１５−５８型増幅器、ゴールド社、クリーブランド、ＯＨ ）へ接続し、ヘパリン化食塩水（２Ｕ／ｍｌ）を３．０ｍｌ／ｈｒの速度で潅流 した。

長時間にわたって潅流する薬剤はすべてこの潅流へ添加した。大腿静脈導管は急 性（大量）注射に使用した。四肢誘導ＥＣＧをＥＣＧ／バイオタッチ増幅器（１ ３−４６１５−６５Ａ型、ゴールド社、クリーブランド、ＯＨ）からモニターし 、心拍数を誘導した。

サーミスター探子および加熱操作板のスイッチによりコア温度の閉回路制御を提 供する制御装置（７３Ａ型、ＹＳＩ社、イエロースプリングズ、ＯＨ）を使用し て結腸温を測定した。心拍数、動脈圧および結腸温のシグナルについて定期的に 試料を取り、コンピューター化したデータ蓄積装置（ＤＴ２８０１Ａ　Ａ／Ｄコ ンバーター、データ・トランスレーション社、マルボロー、ＭＡ／ＡＳＴプレミ アム３８６コンピユーター、ＡＳＴリサーチ社、アービン、ＣＡ／ラブチック・ ノートブック・ソフトウェア、ラボラトリ−チクノロシーズ社、ウイルミントン 、ＭＡ）を使用して２０ｋ、１２ビツトの精度で貯蔵した。

３つの処置群に分けた。

（１）アミリン大量投与群（ｎ＝６、体重＝３１０±７ｇ、３１０±７０±２日 、２０．０土０．７時間給食）：２時間潅流後、新たに溶解したラット・アミリ ン（ロット＃ＺＧ４８５、バケム社、トーランス、ＣＡ）２５．５ｎｌ［を含有 する食塩水１００μｍの大量を動物に注射した。最初に、この研究に使用するペ プチドの生物活性をヒラメ筋に基づ（検定法を使用して確かめた（ＥＣｓ。＝６ ．７±１．５ｎｉｌ）。

（２）グルカゴン大量投与群（ｎ＝６、体重；３３１±５ｇ、日令＝７６±１日 、１８．７±０．４時間給食、ラットおよびヒトのグルカゴンの構造は同一であ る）：潅流２時間後、基準試料を採り、動物にグルカゴン２８．７ａｌｌ（注射 用グルカゴン米局方、イーライ・リリー社、インディアナポリス、ＩＮ、ロフト １４ＭＣ５１Ｄ、グルカゴン１ｍｇおよびラクトース４９Ｉ！ｇを含有）の希釈 液１００μｍ溶液（１，６％グリセリンおよび０．２％フェノールの水溶液１＋ ａｌに溶解）を大量注射した。６時間後、グルカゴン反応を観察したのち、２５ ．５ｎＭのう・ソト・アミリン（第１群に対応）を注射し、反応をさらに２時間 観察した。

（３）対照群（ｎ＝３、体重＝３５４±１７ｇ、日令＝８２±１日、１９５±０ ．７時間給食）、対照動物は食塩水単独を注射した。

大量注射の０．５．０．２５．０時間前、および注射後０．５．１．１．５．２ ．３．４．５．６時間（第１群）、および６．５．７．７．５．８時間（第２群 ）に動脈試料を採取した。動脈試料をヘパリン化した毛細管へ採り、分離した血 漿について直ちにグルコースおよび乳酸を固定化酵素化学によって分析した（グ ルコースオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、分析機２３００−３ＴＡＴ型、 ＹＳＩ社、イエロースプリングズ、ＯＨ）。統計分析は５ＹＳＴＡＴシステム（ シスタット社、エバンストン、ＩＬ）　・ルーティングに含まれているスチュー デントのｔ検定によって検定した。他に説明しない場合、すべての結果は平均値 土標準誤差で報告する。

結果を第９Ａおよび９Ｂ図にプロットした。アミリン注射（大量静脈注射、２５ ．５ｎＭ）により、血漿グルコースおよび乳酸はともに急速な増加を生じた。対 照を超える血漿グルコースの上昇値は３０分以内に有意であり、２時間以上持続 した。血糖反応のピークは１．５０立０．２２時間で起こり、注射前値より５． ５９＝０．４６１Ｍの増加を示した。血漿乳酸値は注射後３０分以内にピークに 達し、注射前値０．７５±０．０６１Ｍより１．０２±０．１１＋ｉｌと１３６ ％増加した（増加対照、ｐ＜０．００１）。

グルカゴン注射（大量静脈注射、２８．７ｎｌｌ）により、静脈注射後１．５８ ±０゜２４時間に起こり、１．９４：０．３４ｍＭのピーク値を示す血糖反応を 生じた（第９Ａ図参照）。グルカゴンによる血糖反応はどのアミリン反応よりも 低かった［アミリン単独反応の３５％（ｐ＜０．００１）　、グルカゴン注射後 のアミリン反応の３５％（ｐ＜０．００３）］。対対照物と比較して、グルカゴ ンによる血漿乳酸の増加は何れも無視し得るものであった（Ｏ１０９±０．０４ １１Ｍ）　（第９Ｂ図参照）。

グルカゴンの注射後６時間に、アミリン（静脈大量注射、２５．５ｎＭ）は５． ６０±０．８６ｍＭの血糖反応を生じ、そのピークは注射後１．６７±０８１７ 時間であった。また注射後３０分以内でピークに達する明瞭な乳酸反応（３，４ ４±０゜４２ｍＭＭ）を生じた（第９Ａおよび９Ｂ図参照）。グルカゴン注射後 、アミリンによって生じる乳酸反応の量はアミリン単独の場合の３．４倍大きか った（ｐｒｏ。

００１）。血糖反応の量はほとんど同じであった（ｐ＝０．９９）。

アミリンによって生じるグルコース曲線の傾きのｔ１／２は、それぞれアミリン ×単独で１７５分、グルカゴン注射後にアミリン注射した場合で５９分であった 。

対応する乳酸の値は５５分および３４分であった。平均動脈圧は、アミリン単独 群：対照群、アミリン単独群：グルカゴン群、またはアミリン単独群：グルカゴ ン注射後アミリン注射群の何れの比較でも、注射前および注射後のどの時点を比 較してもなんら有意差がなかった。

実施例４ 本実施例では摂食ラットおよび絶食（２０±１時間）ラットにおいて、グルカゴ ン投与（０時間）、続いてアミリン投与（６時間）した場合の血漿グルコースお よび乳酸に及ぼす影響を比較した。

雄バーラン・スプラーグ・ダウレイラットは、２２．７±０．８℃で、明暗サイ クル１２：１２時間（実験は明サイクル中に実施）で、摂食および摂水は自由に させて（飼料ＬＭ−４８５、チクラッド、マジソン、ＷＩ）飼育した。絶食動物 は、実験前２０±１時間絶食した。摂食動物は外科的処置を行うまで食餌を摂ら せた。

麻酔は５％ハロタンで導入し、外科的処置中は２％、代謝記録中は０．８−１％ ハロタンで維持した。気管切開および右大腿動脈および伏在静脈のカニユーレ挿 着を行った。

大腿動脈系を圧変換器（スペクトラムドＰ２３ＸＬトランスデユーサ−１１３− ４６１５−５８型増幅器、ゴールド、クレーブランド、ＯＮ）に連結し、ヘパリ ンを加えた生理食塩水（２Ｕ／ｃｌ）を３．０ｍｌ／時間で潅流した。長時間潅 流する薬物は全てこの潅流液に添加した。急速（大量）注射には静脈系を用いた 。

四肢心電図はＥＣＧ／バイオタッチ増幅器（１３−４６１５−６５Ａ型、ゴール ド、クリーブランド、ＯＨ）を介して監視し、心拍数を誘導した。

加熱した手術台のスイッチングによりコア温度の閉鎖系ループ制御を提供する調 節装置（７３Ａ型、ＹＳＩ、イエロー・スプリングス、ＯＨ）およびサーミスタ プローブを用いて、結腸温度を測定した。

心拍数、動脈圧および結腸温度の信号は定期的にサンプリングし、コンピュータ ーデータ獲得システム（Ｄ７２８０１Ａ　Ａ／Ｄコンバーター、データトランス レーション、マールボロ、ＭＡ；ＡＳＴプレミアム３８６コンピユーター、ＡＳ Ｔリサーチ、イルビン、ＣＡ、ラブチック・ノートブック・ソフトウェア、ラボ ラトリ−・チクノロシーズ・コーポレーション、ウィルミントン、ＭＡ）を用い て２０Ｈｚで１２ビツトの精度で貯えた。

処置群は２群であった。

１、グルカゴン大量＋アミリン大量、絶食（ｎ＝　６　；体重＝３３１±５ｇ： 年齢７６±１日：絶食１８．７±０．４時間）。ラットおよびヒトグルカゴンの 構造は同等である。２時間潅流および基礎試料の摂取後、動物にグルカゴン８６ ．４ナノモル／ｋｇの希釈液１００μｌ溶液を大量注射した（注射ＵＳＰ用グル カゴン、イーライ・リリー・アンド・カンパニー、インディアナポリス、ＩＮ： ロット番号４ＭＣ５１Ｄ、１．６％グリセリンおよび０．２％フェノールの水溶 液１ｍｌに溶解したグルカゴン１ｍｇ５ラクトース４９ｍｇを含有）。グルカゴ ン反応を６時間観察してから、ラットアミリン７６．８ナノモル／ｋｇ（第１群 あたりとして）を注射し、反応はさらに４時間続いた。

２、グルカゴン大量＋アミリン大量、摂食（ｎ＝９＋体重＝３２２±１１ｇ：年 齢６３±３日：絶食０時間）。食餌の摂取を継続した以外は、これらの動物はＡ 群と同一の処置を行った。

動脈試料は大量注射前０５．０２５および０時間、並びに注射後０．５．１．１ ．５．２．３．４．５．６．６５．７．７．５．８．９および１０時間後に採取 した。動脈試料をヘパリン処理したキャピラリーに収集し、分離した血漿は、固 定化酵素反応（グルコースオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アナライザー ２３００−８ＴＡＴ型、ＹＳＩ、イエロー・スプリングス、ＯＨ）を用いて、グ ルコースおよび乳酸を即座に分析した。パックされた赤血球は赤血球容積の損失 を最小にするために再潅流した。

２時間毎にインスリン測定用の血漿を採取した。感度６ｐＭ、ラットインスリン に対する交叉反応性が８９．５％の放射性免疫検定（ミクロメゾイック・ヒト・ インスリンＲＩＡキット、ＩＣＮバイオメディカルズ、ホルシャム、ＰＡ）によ り、インスリン測定した。

２０時時間量ラットにグルカゴンを注射した結果、静脈内注射後１．５８±０゜ ２４時間に、１．９４±０．３４＋ａＭの血糖反応のピークを生じた（図１０参 照）。

グルカゴンに対する血糖反応は、アミリン単独（その反応の３５％、ｐ＜ｏ、ｏ 。

１）、または同一の動物に引き続いてアミリンを注射した場合（第１群のアミリ ン反応の３５％、Ｐ＜０．００３）のいずれで観察されるよりも弱かった。対照 動物と比較すると、グルカゴンによる血漿乳酸の有意な増加は認められなかった （０゜０９士領０４ｍＭ：　Ｐ＝０．０６）。グルカゴン注射した群では、報告 されている変力効果および変時性効果に合致する有意な平均動脈圧（Ｐ＜０．０ ５）および心拍数（Ｐ＜０．０５）の上昇が認められた。

絶食ラットにグルカゴン注射した後６時間で、アミリンは結果的に、血漿グルコ ース５６０±０．８６＋Ｍを増加し、主要値（ｐｒｅｒａｉｌｉｎｇ　Ｌｅｖｅ ｌ）　８　、３７±０゜４８１１Ｍを超え、注射後１．６７±０．２７時間でピ ークに達し、アミリン単独で観察された型とほぼ同等であった。３．４４±０． ４２ｍＭの活発な乳酸反応も認められ（アミリン単独の場合の３．４倍）、絶食 群では３４分間、アミリン誘起の乳酸の低下が認められた。アミリン単独を注射 したラットで観察されたのと類似の動脈圧効果も認められた。

絶食動物（第１群）と比較して、摂食動物は静脈内グルカゴンに対して活発な血 糖反応を示した（図１０参＠）。血漿グルコースの増加は注射前の値を超え、６ ２９力１９２ｍＭであった。しかしながら、アミリン誘起の場合には高血糖がよ り長く延長されるのに比較して、グルカゴンに対する血糖反応は、対照に比して ０．６時間しか続かなかった。絶食動物（第１群）と同様、グルカゴンは、血漿 乳酸の有意な増加とは関連しなかった（３０分間０．０７±Ｑ、Ｑ８ｍＭの増加 、有意でない）。

これらの同一の摂食ラットにアミリン投与し、６時間後、絶食う・ソトに誘起さ れる反応の５６％の血中乳酸反応を示す結果となった（乳酸増加１９２力０２２ ｍＭ、第２群対第１群、Ｐ＜０．０５）。血漿グルコースの増加は、絶食う・ン トで観察されたものに比べて低下した（２時間のグルコース増加１．７６±０３ ７ｍＭ１第２群反応＝第１群反応の３１％、Ｐｒｏ、０１）。摂食う・ソトの血 漿乳酸は、絶食ラットに比較してより長時間、より高値（ｔｌ／２．１３８分） を維持した。

第１群および第２群の血漿インスリン値は表１で比較する。食餌動物では絶食動 物での値の約５倍高かった。

表１ 絶食および摂食ラットにおけるインスリン値（ｐＭ）時間（時）　絶食（第１群 ）　摂食（第２群）　ＰＯ（グルカゴン投与前）　４６２±３．６　２７９．６ ±９４．８　＜０．０３２　４３．８土４，２　２３２．８±６５．４　＜Ｑ、 　０１４　５８８±９．０　３１０．ｇ±４８．０　＜　０．００１６（アミリ ン投与前）　４５．０±２．４　１９７．４±１９．２　＜　０．００１実施例 ５ この実施例では、ヒラメ筋ベースの検定（レイトン、Ｂ　およびクー、（、Ｇ。

Ｊ　Ｓ、ネーチャー３３５巻、６３２−６３５頁（１９８８伍））においてアミ リン・アゴニスト活性を測定した。

結果は表２に記載する。

表２ アミリン・アゴニストの活性 ペプチド　ヒラメ筋検定におけるＥＣ５゜ンクロ２’７［、ＡＳｐ２、Ｌｙｓ’ ］　−２２，９６ｎＭ±０．１８対数単位ヒトアミリン ［Ｐｒｏ”］−ヒトアミリン　１１ｎＭ：０．１０対数単位ｒＬｅｕ２３１−ヒ トアミリン　９４．４８ｎＭ：！：０．１９対数単位実施例６ 以下に示すさらなる実験では、ラットアミリンを、高インスリン血症がなくソマ トスタチン“クランプをも受けていないラットに注射して、完全なホルモン制御 反応の存在下におけるその作用を検定した。血漿グルコース、乳酸値および血圧 は、絶食動物にアミリンを一連の投与量で静脈中注射した後監視し、また、皮下 注射に対する反応も観察した。摂食動物のアミリン反応の研究もまた以下に示し 、絶食および摂食麻酔ラットにおけるアミリンおよびグルカゴンに対する反応を さらに比較した。

動物・雄バーラン・スプレーグ・ドーリ−・ラット５２匹を、２２７±０．８℃ で、明暗サイクル１２＋１２時間（実験は明サイクル時に実施）で、摂食および 摂水（飼料ＬＭ−４８５、チクラッド、マジソン、Ｗｌ）は自由に摂らせて飼育 した。絶食動物は実験前２０±１時間食飼を与えなかった。摂食動物は外科的処 置まで食餌を与えた。

外科的処置／方法。麻酔は５％ハロタンで導入し、外科的処置中は２％で、代謝 記録中は０．８−１％で維持した。気管切開および右大腿動脈および伏在静脈に カニユーレ挿着を行った。

大腿動脈系を圧変換器（スペクトラムドＰ２３ＸＬトランスデユーサ−１１３− ４６１５−５８型増幅器、ゴールド、クリーブランド、ＯＨ）に連結し、ヘパリ ン処理した生理食塩水（２Ｕ／ｍｌ）を３．０＋ａｌ／時間で潅流した。長時間 潅流薬物は全てこの潅流液に添加した。急速（大量）注射には静脈系を用いた。

心拍数心電図は、ＥＣＧ、’バイオタッチ増幅器（１３−４６１５−６５Ａ型、 ゴールド、クリーブランド、ＯＨ）を介して監視し、心拍数を誘導した。

加熱した手術台のスイッチングによりコア温度の閉鎖系ループ制御を提供する調 節器（７３Ａ型、ＹＳＩ、イエロー・スプリングス、ＯＨ）およびサーミスタプ ローブを用いて結腸温度を測定した。

心拍数、動脈圧および結腸温度の信号は定期的にサンプリングし、コンピュータ ー・データ獲得システム（ＤＴ２８０１ＡＳＡ／Ｄコンバーター、データトラン スレーション、マールボロ、ＭＡ；　ＡＳＴプレミアム３８６コンピユーター、 ＡＳＴリサーチ、イルビン、ＣＡニラブチツク・ノートブック・ソフトウェア、 ラボラトリ−・チクノロシーズ・コーポレーション、ウィルミントン、ＭＡ）を 用いて２０Ｈ２で１２ビツトの精度で貯えた。

処置群 １、アミリン−大量（図１１参照０ｎ＝６：体重＝３１０±７ｇ：日齢＝１１０ ±２日：絶食し、十分な生物学的活性に必要な２Ｃｙｓ−７Ｃｙｓ　Ｓ−Ｓ結合 を有し、Ｃ末端アミド化したラットアミリン（ロッド番号ＺＧ４８５、ハゲム、 トランス、ＣＡ）を用時溶解したものを７６．８ナノモル／ｋｇ含有する生理食 塩水の１００μ！大量投与した。市販により入手可能なアミリンの生物学的活性 （単離ラットヒラメ筋（１８）におけるインスリン刺激グリコーゲン合成の阻害 のＥＣ，。とじて測定）は１００倍に変化し得る（コーパー、Ｇ、Ｊ、Ｓ、ら、 提出済）。従って、この研究に用いるペプチドの活性は、ヒラメ筋ベースの検定 を用いて最初に確認した（ＥＣｓｏ＝６．７±１．５μＭ）。

２、皮下注射（図１２参照Ｘｎ＝２；体重＝３３３．３３４ｇ：日齢９２．９３ 日、絶食２１＋１５．１９：５０時間：分）。これらの動物は他の全てと同様に カニユーレ挿着したが、外科的処置の２時間後に１００μｇアミリンのＱ、１ｍ ｌ生理食塩水溶液を、静脈内ではなく皮下投与した。

３、服量反応群（図１３参照０ｎ＝２６）これらの動物は、第１群の動物と同様 に取り扱ったが、データは注射の２時間後のみに回収し、アミリンの用量は以下 のように変化させた：Ｏμｇアミリン（ｎ＝３；体重＝３５４±１７ｇ１日齢＝ ８１±１日：絶食１９５±０．７時間）、０．０１　μｇアミリン（ｎ＝３；体 重＝３７９±５ｇ９日齢＝７８±１日、絶食２０士領５時間）、０．１μｇアミ リン（ｎ＝　３　；体重＝３３６±９ｇ：　日齢８９±１日：絶食１９．１±１ ．２時間）、１μｇアミリン（ｎ＝　３　；体重＝３４１±１０ｇ；日齢８５± ０．３日：絶食２０．８±１．８時間）、１０μｇアミリン（ｎ＝４：体重＝３ ５６±１３ｇ；日齢８０±３日：絶食２０゜６±１．１時間）、１００μｇアミ リン（ｎ＝７；体重＝３１０±７ｇ；　日齢＝１１０±２日：絶食２０±０．７ 時間）、１０００μｇアミリン（ｎ＝　３　：体重＝３１４土７ｇ；日齢＝８１ ±０．３日：絶食２２．７±１．８時間）。

化学分析・動脈試料は注射前０．５．０．２５および０時間、および注射後０゜ ５．１．１．５．２時間（第３群）、３．４．５．６時間（第１および第２群） 、並びに６５．７．７．５．８．９および１０時間（第４、第５および第６群） に採取した。動脈試料はヘパリン処理したキャピラリー中に回収し、分離血漿は 即座に固定化酵素反応（グルコースオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アナ ライザー２３００−３ＴＡＴ型、ＹＳＩ、イエロー・スプリングス、ＯＨ）を用 いてグルコースおよび乳酸を分析した。パックした赤血球は赤血球量の損失を最 小限にするために、再潅流した。

血漿を回収して２時間毎にインスリンを測定した。インスリンは感度が６μＭで 、ラットインスリンに対する交叉反応性が８９．５％である放射性免疫検定（マ イクロメゾイック・ヒトインスリンＲＩＡキット、ＩＣＮバイオメディカルズ、 ホルシャム、ＰＡ）により定量した。

計算方法。ベアワイズ統計分析にはシスラットシステム（シスラット、エバンス トン、ＩＬ）に含まれるスチューデントのｔ検定ルーチン（プールド・パライア シス法）を用いた。別にことわらない場合は、全ての結果は平均値上平均値の標 準誤差として記載し、Ｐ＜０．０５は有意性の水準として用いる。

指数の減衰は、シスラットのノンリンモジュールに包含されるルーチンを用いて 、非直線回帰分析により一分画モデル（Ｙ＝Ａ、　ｅ−ｋｔ＋Ｂ）に合致させた 。

Ｓ字形服量反応分析は、最小２乗反復ルーチンを用いて４パラメーター・ロジス ティック関数 （式中、Ａは最大反応であり、Ｄは最低値であり、ＣはＥＤ、。であり、ｄＢは 曲線の勾配を決定する指数である）に合致させた。

絶食動物へのアミリンの静脈内注射 図１１は、多量のアミリン、ラット膵臓により２４時間で分泌されると推定され る概量である１００μｇを静脈内注射した場合の反応を示す。急速で一過性の血 圧降下が認められ、これは以前に報告されたペプチドの血管拡張作用に合致する 。しかしながら、血圧は３０分以内に対照値まで回復する。血漿乳酸は２．４倍 に増加し、ピークは３０分で１．７ｍＭであった。血漿乳酸は３時間までに対照 値に回復した。この結果より、この反応は高血糖反応に先行し、注射後の時間に 血漿グルコースは６．２ｍＭからプラトーの１１．８ｍＭまで増加し、その後徐 々に減少し４時間で対照値まで減少した。

絶食動物へのアミリンの皮下注射 アミリンを静脈内大量投与すると、初期アミリン血漿および細胞外液濃度が極度 に高くなり、これが原因で一過性の血圧降下をもたらすことになる。従って、同 量の１００μｇのアミリンを皮下注射した場合の効果を評価した。図１２に示す ように、顕著な高乳酸血症および高血糖効果は、予期される幾分遅延した時間経 過で依然存在し、乳酸のピークは１−１１／２時間であり、グルコースのピーク は２時間である。重要なことには、血圧への影響は有意ではなく、乳酸反応が動 脈血流および血圧の変化とは独立していることを示し、むしろ、恐らく骨格筋へ のアミリンの作用の直接的な結果であることが示された。

収量反応関係 図１３は、アミリンの規定用量を静脈内注射した後３０分間のグルコースおよび 乳酸の対照に対する増加の平均を示す。これはまた、血圧の１分間の低下をも示 す（これは本実験計画で認められた最低に近い）。領１μｇアミリンの注射によ り認識可能な高血糖効果および明らかに有意（Ｐ＜０．０５）な高乳酸血症効果 が示され、１μｇの注射では両項目で有意な上昇が示された。１０μｇ以下の用 量では血圧に変化はなく、従って、アミリンの少量注射により代謝には影響を及 ぼすが血圧の測定可能な変化は引き起こさなかった。動物の体重並びに血漿およ び組織間液が占める体重の割合（約２５％）（すなわち細胞外液）から、細胞表 面受容体に相関するアミリン細胞外濃度が、（結合、細胞の分離、減成、および 分泌がないと仮定した場合でさえも）３００μＭでのみピークに達するであろう ことが算出できる。

高血糖反応はロジスティック関数に適合しており、傾斜は０．６１でＥＤ、。は ５．７μｇである。表３参照。乳酸反応は、アミリン１ｍｇ注射しても明白なプ ラトーが認められないので、このような関数に容易に適合できない。このことは 、これらの高アミリン用量で認められる著明な低血圧の高乳酸血症効果を反映し ており、実際に、ＣＧＲＰ血管受容体でアミリン相互作用を反映する反応の２次 相であると考えられる。

表３ アミリン用量／反応媒介変数 Ａ（最大反応）　Ｂ（傾斜）　Ｃ（ＥＤ５゜）　Ｄ（基底値）グルコース　４． ７２ａ＋Ｍ　−０，６１４５，７１μｇ　６．３４ｍＭ乳酸　２．３０ｍＭ　− ０，２４３１８１，６μｇ　０．７５＋Ｍ動脈圧　４４．４ｍ＋ｍＨｇ　Ｏ，９ ２５３３，８μｇ　９２．２ｍｉＨｇアミリン用量対動脈血漿グルコース、乳酸 （注射後３０分）および平均動脈圧（注射後１分）の最適合口ジスティック関数 の媒介変数。

実施例７ グルコース代謝、アミリン処理し単離した剥離ラットヒラメ筋、および１８時時 間量した正常ラットにアミリン注射した場合のイン・ビポに及ぼすアミリン作用 の、２種のモデルににおける拮抗物質としてのｈｃＧＲＰｓ−３ｔの効果を測定 した。さらにアミリン誘起による血圧変化に及ぼす影響を観察した。

動物。バーラン・スプラーグ・ダウレイ・ラット（３３２±９ｇ雄、９３±５日 齢）を２２．７±０．８℃で１２：１２時間の明・暗サイクル（実験は明サイク ル中に実施）で、摂食および原水は自由に摂らせて飼育した（飼料ＬＭ−４８５ 、チクラッド、メジラン、ＷＩ）。動物はヒラメ筋の単離前４時間、およびイン ・ビポ実験前２０±０，５時間絶食した。

化学薬品。可溶性インスリン（ヒユームリン−Ｒ，１００Ｕ／＋１）はイーライ ・リリー・アンド・カンパニー、インディアナポリス、ＩＮより購入した。本研 究で用いたインスリンの活性単位Ｕ１およびモル濃度単位の間の変換係数は１μ Ｕ／ｍｌ　７．１μＭであった。ＨＣＧＲＰｓ−３ｔ（Ｄット番号ＺＨ２０１） はバヶム（トランス、ＣＡ）より入手した。このペプチドの化学的同一性および 純度は、アミノ酸分析、気相タンパク配列決定、およびＦＡＢ質量分析により約 ９８％であると決定された。本研究で用いたラットアミリン（ロット番号ＺＧ４ ８５、バヶム）の活性はＥＣ，。　６．７±１．５ｎＭで測定した。ラットアミ リンおよびｈＣＧＲＰ、−８７の貯蔵溶液は１５０＋Ｍ　Ｎａ（Ｊ’中に毎日新 しく調製した。タンパク不含貯蔵溶液中のアミリンおよびｈＣＧＲＰｓ−ｓｙの 濃度は、アミノ酸定量分析を用いて確認した。［Ｕ−１’ｃ］−グルコース（１ ２，６ＧＢｑ／ミリモル）は二ニー・イングランド・ニューフレア（ウィルミン トン、ＤＥ）より購入した。その他の全ての試薬は、分析用水準かまたはそれよ り良買であった。

種々濃度のインスリン、アミリンおよびｈＣＧＲＰａ−ｓ７の存在下での剥離ラ ットヒラメ筋の単離および恒温培養、並びにグリコーゲンへの放射性グルコース の取り込み速度の測定は、前述の方法、レイトン、Ｂ、およびクーパー、Ｇ、Ｊ Ｓ９、ネイチャー３３５巻、６３２−６３５頁（１９８８年）：クーパー、　Ｇ 、Ｊ。

Ｓ、ら、プロノーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス ・オブ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ、８５巻、７７６３−７７６ ６頁（１９８８年）に準じて実施した。筋肉は、以下の組成のクレブス・リンガ −重炭酸塩緩衝液１０ｍ１を３７℃で含有するエルレンメイヤー・フラスコ中で 予め恒温培養した：　ＮａＣ１１１８，５ｍＭ；　ＮａＨＣＯ２２５０１Ｍ；　 ＫＣｌ５．９４ｍＭ：ＣａＣＡ’２２．５４ｍＭ：　ＫＨ２ＰＯ４１，１９ｃＭ ；　ＭｇＳＯ４１，１９ｍＭ；　Ｄ−グルコース５．５ｍＭ：　ｐ８７．４０６ フラスコは０２：　Ｃｏ２（９５：５容量／容量）で継続的にガス供給した。こ の振とう水浴中の培養液中３７℃で３０分間、予め恒温培養した後、剥離した筋 肉を、同じ培養液に［Ｕ１４］−グルコース（０，５μＣｉ／ｍ１）、ヒトイン スリン（７，１ｎＭ）、ラットアミリン（１００ｎＭ）および漸次的濃度のｈＣ ＧＲＰａ−３□（０，１，１０，１００，１０００、ｌＸｌ０’、３Ｘ１０’、 ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｑ　５ｎＭ）を添加したものを含有する類似のバイアルに移した（ 図１４）。筋肉はさらに６０分間恒温培養し、次にブロッティングして、［ｔＪ 　１４］−グルコースのグリコーゲンへの取り込みを測定した。４片の剥離筋肉 を各々の処理条件で恒温培養し、各実験は３回繰り返した。

外科的処置および方法。麻酔は、１８時間絶食ラットで５％ハロタンを用いて導 入し、外科的処置中は２％、引き続いて代謝記録中は０．８−１％で維持した。

気管切開および右大腿動脈および静脈のカニユーレ挿着を行い、コア温度は加熱 した手術台をスイッチングする温度調節器（７３Ａ型、ＹＳＩ、イエロー・スプ リングス、ＯＨ）で調節した。

大腿動脈系は圧変換器（スペクトラムドＰ２３ＸＩＪランスデューサー、１３− ４６１５−５８型増幅器、ゴールド、クリーブランド、ＯＨ）に連結し、ヘパリ ン処理生理食塩水（２Ｕ／１ｌｌ）、３．Ｏｎ＋１／時間で潅流した。大腿静脈 系は急速（大量）注射に用い、ｈＣＧＲＰ＋＋−ｓｙは長期間投与するためにこ の潅流液に添加した。

動脈圧の信号をサンプリングし、コンピューターデータ獲得システム（ＤＴ２８ ０１Ａ　Ａ／Ｄコンバーターズ、データトランスレーション、マールボロ、ＡＳ Ｔプレミアム３８６コンピユーター、ＡＳＴリサーチ、イルビン、ＣＡニラブチ ツク・ノートブック・ソフトウェア、ラボラトリ−・チクノロシーズ・コーポレ ーション、ウィルミントン、ＭＡ）を用いて１２ビツトの精度で２０Ｈｚで貯え た。

処置群。処置群は３群であった。（１）アミリン大量（ｎ＝７）・最初の２時間 の潅流の後、用時溶解したラットアミリン２５５ナノモルを含有する生理食塩水 １００μｌを静脈内投与した。（２）アミリン大量によるｈＣＧＲＰｇ−３７プ ライム連続潅ｆｉ（ｎ＝３）　動物にｔ＝−３０分でｈＣＧ　ＲＰ　８−３７７ ７）　１６０　ｆ　／　モｈヲ大Ｍａ射し、続いてこのペプチド１．６マイクロ モル／時間を２時間、連続潅流し、次に３２０ナノモル／時間でさらに１時間潅 流し、分配された全ｈＣＧＲＰｇ−３ｔは３．７マイクロモル／ラット＝１１． １マイクロモル／ｋｇであった。ｔ＝Ｑ分では、動物に上記（１）と同様、２５ ．５ナノモルの新鮮ラットアミリンを含有する生理食塩水１００μｌを静脈内投 与した。（３）生理食塩水対照（ｎ＝７）・新鮮なアミリンの代わりに賦形薬生 理食塩水１００μｌを注射した。

動脈試料は大量注射前０，５．０．２５および０時間、並びに注射後０．５．１ ．１．５．２．３および４時間に採取した。試料をヘパリン処理したキャピラリ ー中に回収し、分離血漿はグルコースおよび乳酸を分析した。グルコースおよび 乳酸は固定化酵素反応（グルコースオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アナ ライザー２３−８ＴＡＴ型、ＹＳ１１イエロー・スプリングス、ＯＨ）により分 析した。

統計分析は、非対、２テイル・スチューデントｔテスト（プールド・パライアレ ス法）を用い、シスラットシステム（ンスラット、エバンストン、ＩＬ）に包含 されるルーチンを用い、記載したような有意性の水準で実施した。結果は平均埴 土ｓ、　ｅ、　ｍ、とじて記載した。ＥＣ，、値を誘導するＳ字形服量反応分析 は、最小二乗反復ルーチンを用いて４変数ロジステイツク関数に合致させた。デ リーン、Ａ、ら、アルフィツト・コンピューター・プログラム（ＮＩＨ，ベセス ダ、ＭＤ２０８９２）。

上記実施例２、′３．４および６と一致して、アミリンは血漿乳酸および血漿グ ルコースを増加させ、動脈圧を低下させた。ヒｈｃＧＲＰｓ−３ｔは、アミリン がイン・ビトロで骨格筋グリコーゲンへのグルコースの取り込みを低下させる効 果に拮抗しく図１４および１５）、イン・ビボでアミリンに誘起される血漿乳酸 およびグルコース値の上昇を完全に妨げる（図１６）。これはまた、アミリンに 誘起される動脈圧の低下をも妨げる（データは示していない）。

アミリンがインスリンに刺激されるグルコースのグリコーゲンへの取り込みを阻 害する効果に拮抗するｈＣＧＲＰｓ−ｓ７の効果は、イン・ビトロでラット骨格 筋において測定した（図１４）。インスリン（７，１ｎＭ）はグルコースの筋肉 グリコーゲンへの取り込み速度を３．４倍、０．８３（±０．０８）から２．８ ４（±０．２２）マイクロモル／ｇ・時間に上昇させた；この効果はラットアミ リン（１００ｎＭ）により完全に逆転され、そのため、放射性グルコースのグリ コーゲンへの取り込み速度は対照（ゼロ　インスリン／ゼロ　アミリン）と最高 のホルモン状態（インスリン７．１ｎＭ／アミリン１０１００ｎの間で差はなく なった。ｈｃＧＲＰｓ−３□は用量依存的に、アミリンに誘起されるインスリン 刺激のグルコース取り込みの抑制を逆転し、ＥＣ５゜が５．９２μＭ（±０．１ ３対数単位）で十分にインスリン反応を回復させた（図１５）。１００μＭ　ｈ ｃＧＲＰｓ−ｓ、は、グルコースの取り込みに及ぼす１００μＭアミリンの効果 を完全に排除したが、単独で投与した場合に測定可能な効果はなかった（結果は 提示していない）。

拮抗物質ｈｃＧＲＰｓ−ｓ、が、イン・ビボで絶食麻酔ラットにおける炭水化物 代謝、血圧および血漿カルシウム値に及ぼすアミリンの作用を改変する能力もま た評価（図１６）。上記実施例６で示すように、アミリンは正常ラットに注射し た場合、乳酸およびグルコースの血中濃度を用量依存的に上昇させる効果を呈す る。

アミリン（６６ナノモル／ｋｇ）を１８時間絶食した正常ラットに注射した場合 、血中乳酸が急速に上昇し、続いて血中グルコース値が上昇する。グルコース値 の上昇は、一部は内因性のグルコース産生の増強に起因し、これはグリコーゲン ホスホリラーゼのアミリン活性化に続いて起こる筋肉からの乳酸の放出によりエ ネルギー補給されたグルコース新生の結果であると考えられる。これらのアミリ ンの効果は、カテコラミン、グルカゴンまたはインスリンの値の変化には依存し ておらず、アミリンに誘起される動脈圧の急速な変化により説明されず、または ＥＤＴＡＩ！起の低カルシウム血症は血漿グルコースを変化させないので、アミ リン誘起のより緩慢なカルシウムの変化により説明されない（ヤマグチ９Ｍ、お よびヤマモト、Ｔ、ケミカル・アンド・ファーマシューテイカル・プレチン、２ ５巻、２１８９−２１９４頁（１９７７年））。本実施例では、う・ソトをｈＣ ＧＲＰ＋＋−３□で処理した後、アミリン投与後の乳酸およびグルコースの血中 濃度は、対照動物（生理食塩水単独）と異ならない。すなわち、ｈｃＧＲＰａ− ｓ７は、アミリンが乳酸またはグルコースの血中濃度を上昇させる効果を完全に 拮抗した。

本発明は具体的な態様、用途および方法に関して記載しているが、本発明から逸 脱せずに種々変更および改変を行うことができることは理解されよう。

ホスホリラーゼ活性　（ｎモル／分／ｍ９　蛋白　）ホスホリラーゼ−ａ　（ｎ モル／　分／ｍ９　蛋白　）＊ 注射後時間 Ｆ／Ｇ　５゜ 注射後時間 Ｆ／Ｇ　６゜ 注射後時間 羨　８　盲　３　旨 血漿グルコ−ス、　ｍｇ／ｄＬ土ＳＥＭ血漿乳酸１ｍ鍼＋叩閤 Ｆ／Ｇ、　ＩＣ） アミリン注射後時間 アミリン注射後時間 アミリン用量伊９） 基礎　インスリン　インスリン　インスリンＦ／Ｇ　１５゜ 血漿乳酸　（ｍＭ） 血漿グルコース　（ｍＭ） （〕 要　約　書 インビボ生物学的モデルで高乳酸血及び／又は過血糖を生ずる。アミリンの能力 を阻止又は装うことができる化合物を確認又は検定する方法を開示する。方法は 又、アミリンのこれらの作用の一方又は両方を装うことが知られ又は予期される 化合物の能力を評価するのに用いるためと開示される。図は、ソマトスタチン＋ アミリン（白丸）、ペプチドコントロール（白画角）又はクエントラミン（白玉 角）を注入したラットの血漿グルコース反応を示す。

国際調査報告 Ｉｎ＋ｅｎ−市一〜！−ｔｍｎＨａイ〜噂９Ｕ力１謁

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）試験試料および試験系を一緒に選び、ここで試験試料は１またはそれ 以上の試験化合物を含有し、試験系は生物学的生体モデルを含み、その生体モデ ルはアミリンまたはアミリンアゴニストをモデルへ導入した二とに反応して乳酸 値の上昇を示し、それに続いてグルコース値の上昇を示すことを特徴とし、（ｂ ）アミリンまたはアミリンアゴニストの予定量を試験系へ添加し、（ｃ）試験系 で乳酸上昇の存在またはその量を測定し、（ｄ）試験系でグルコース上昇の存在 またはその量を測定し、または（ｅ）試験系で乳酸の上昇およびグルコースの上 昇の存在またはそれらの量を測定する ことを含むアミリンの活性を阻害できる化合物を同定し、またはアミリンの活性 を阻害することが既知または疑わしい試験化合物の力価を評価することに使用す る検定方法。
2. ２．さらに陽性対照検定、陰性対照検定、またはその両者の使用を含む請求項１ に記載の方法。
3. ３．陽性対照検定を請求項１の記載にしたがって実施し、試験化合物がアミリン アンタゴニストである請求項２に記載の方法。
4. ４．陰性対照検定を請求項１の方法の記載にしたがって試験試料を添加せずに実 施する請求項２に記載の方法。
5. ５．陰性対照検定をアミリンアゴニストで実施する請求項４に記載の方法。
6. ６．アミリンアゴニストが、ＣＧＲＰ、［Ｐｒｏ２９］−ヒトアミリン、［Ｌｅ ｕ２３］−ヒトアミリン、およびシクロ２７［Ａｓｐ２，Ｌｙｓ７］−ヒトアミ リンからなる群から選ばれる請求項７に記載の方法。
7. ７．生体モデルがラットである請求項１に記載の方法。
8. ８．１種類以上のラットを使用し、そのラットが摂食、絶食、またはその両者で ある請求項７に記載の方法。
9. ９．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン阻害 活性特徴を評価するのに使用するため、乳酸の上昇に対する用量反応像を作成す る段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
10. １０．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン阻 害活性特徴を評価するのに使用するため、グルコースの上昇に対する用量反応像 を作成する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
11. １１．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン阻 害活性特徴を評価するのに使用するため、乳酸の上昇およびグルコースの上昇に 対する用量反応像を作成する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
12. １２．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性阻害作用を評価する段階をさらに含む請求 項９に記載の方法。
13. １３．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性阻害作用を評価する段階をさらに含む請求 項１０に記載の方法。
14. １４．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性阻害作用を評価する段階をさらに含む請求 項１１に記載の方法。
15. １５．（ａ）試験試料および試験系を一緒に選び、ここで試験試料は１またはそ れ以上の試験化合物を含有し、試験系は生物学的生体モデルを含み、その生体モ デルはアミリンまたはアミリンアゴニストをモデルへ導入したことに反応して乳 酸値の上昇を示し、それに続いてグルコース値の上昇を示すことを特徴とし、（ ｂ）試験系で乳酸上昇の存在またはその量を測定し、（ｃ）試験系でグルコース 上昇の存在またはその量を測定し、または（ｄ）試験系で乳酸の上昇およびグル コースの上昇の存在またはそれらの量を測定する ことを含むアミリンの活性をシミュレートすることができる化合物を同定し、ま たはアミリンの活性をシミュレートすることが既知または疑わしい試験化合物の 力価を評価することに使用する検定方法。
16. １６．さらに陽性対照検定、陰性対照検定、またはその両者の使用を含む請求項 １５に記載の方法。
17. １７．陽性対照検定を請求項１５に記載の方法にしたがって実施し、試験試料が アミリンまたはアミリンアゴニストを含んでいる請求項１６に記載の方法。
18. １８．生体モデルがラットである請求項１５に記載の方法。
19. １９．１種類以上のラットを使用し、そのラットが摂食、絶食、またはその両者 である請求項１８に記載の方法。
20. ２０．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン活 性シミュレーション特徴を評価するのに使用するため、乳酸の上昇に対する用量 反応像を作成する段階をさらに含む請求項１５に記載の方法。
21. ２１．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン活 性シミュレーション特徴を評価するのに使用するため、グルコースの上昇に対す る用量反応像を作成する段階をさらに含む請求項１５に記載の方法。
22. ２２．試験試料の異なった量を用いて検定方法を反復し、試験試料のアミリン活 性シミュレーション特徴を評価するのに使用するため、乳酸の上昇およびグルコ ースの上昇に対する用量反応像を作成する段階をさらに含む請求項１５に記載の 方法。
23. ２３．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性シミュレーション特徴を評価する段階をさ らに含む請求項２０に記載の方法。
24. ２４．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性シミュレーション特徴を評価する段階をさ らに含む請求項２１に記載の方法。
25. ２５．試験試料のための用量反応像を１またはそれ以上の陽性対照検定、または １またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成した用量反応像 と比較して、試験試料のアミリン活性シミュレーション特徴を評価する段階をさ らに含む請求項２２に記載の方法。
26. ２６．（ａ）試験試料および試験系を一緒に選び、ここで試験系は生物学的生体 モデルを含み、その生物学的モデルはアミリンまたはアミリンアゴニストをモデ ルへ導入したことに反応して乳酸値の上昇を示し、それに続いてグルコース値の 上昇を示すことを特徴とし、 （ｂ）この試験系で乳酸の上昇量を測定し、（ｃ）試験試料の異なった量を使用 して検定方法を反復し、（ｅ）試料試料のアミリン生物活性を測定するために使 用する乳酸値の上昇に対する用量反応像を作成する ことを含むアミリンまたはアミリンアゴニストを含有することが既知または疑わ しい試験試料中の生物活性物資の量を測定する方法。
27. ２７．（ｆ）試験系中のグルコースの上昇量を測定し、（ｇ）異なった試験試料 量を使用して検定方法を反復し、（ｈ）試験試料のアミリン生物活性の測定に使 用するためのグルコース上昇に対する用量反応像を作成する ことをさらに含む請求項２６に記載の方法。
28. ２８．試験試料のための用量反応像（複数もあり）を１またはそれ以上の陽性対 照検定、または１またはそれ以上の陰性対照検定、またはその両者について作成 した用量反応像と比較して、試験試料のアミリン活性を測定することをさらに含 む請求項２６または２７に記載の方法。
29. ２９．試験試料のための用量反応像（複数もあり）をアミリン標準で作成した用 量反応像と比較することをさらに含む請求項２６または２７に記載の方法。
30. ３０．試験試料のための用量反応像（複数もあり）を陰性対照標準で作成した用 量反応像と比較することをさらに含む請求項２６または２７に記載の方法。
31. ３１．試験試料のための用量反応像（複数もあり）をアミリン標準で作成した用 量反応像および陰性対照標準で作成した用量反応像と比較することをさらに含む 請求項２６または２７に記載の方法。