JPH0464592B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は、グルコースのような化学物質；エタ
ノールのような低級アルコール；コレステロー
ル；尿酸；ヘモグロビン；及びカリウムの存在を
測定するための、新規かつ改良された、流体分析
用の試験具、特に、試験流体中の化学物質の濃度
を表示する反射率の読取りをより高い正確度で行
うと共に補正することができる新規かつ改良され
た方法及び試験具に関する。更に詳しくは、本発
明は、主色原体を形成することができる反応体系
と、上記反応体系に既知の濃度で包含せしめた、
主色原体について測定された反射率の読取り値を
補正するための、２次的不活性色原体物質を包含
する新規かつ改良された試薬片に関する。 ［発明の背景及び従来技術］ 既知濃度を有する１以上の化合物をまずガスク
ロマトグラフイーなどにより測定して試料中の他
の１以上の化合物の未知の濃度を計算するための
基準として用いる、１以上の、グラフのピーク高
又はピーク域を得ることにより、種々の化合物の
濃度を測定することは良く知られている。ピーク
高及びピーク域の両者を用いた定量分析技術のう
ち、広く用いられるものとしては、測定すべき未
知の化合物、すなわち分析対象物に類似した特性
を有する公知化合物を添加する技術が挙げられ
る。この方法によれば、一定濃度の公知化合物を
未知の試料に加えてクロマトグラム中に別個のピ
ークを得、この別個のピークを内部マーカーとし
て用い、上記マーカーの読取りの不正確度に比例
して未知化合物の測定濃度が調整される。 このようにして、論理的には、未知化合物の測
定における損失又は利得には、全く等しい損失又
は利得が内部マーカー化合物の測定において必ず
伴うので、検出器のマーカーに対する不正確な応
答から得られた補正係数が未知化合物に対する検
出器の応答に適用されることになる。対象となる
化合物及び内部マーカーの測定における損失又は
利得の同一性は種々の要因、特に対象成分及び内
部マーカー化合物の構造的同等性（特に抽出性、
溶媒溶解性、反応、測定装置から測定可能な信号
を得るために上記マーカー及び試料に施される他
の操作手順に対する検出器の応答及び許容能力に
おける同等性）によつて決まる。 スナイダー及びカークランド（Snyder and
Kirkland）のイントロダクシヨン・ツー・モダ
ン・リキツド・クロマトグラフイー
（Introduction to Modern Liquid
Chromatography）、第２版、554頁に記載される
ように、公知のマーカー化合物からの選択は極め
て難かしい。すなわち、内部マーカーは妨害のな
い完全に分離されたピークを有するものでなけれ
ばならず、対象化合物（類）に近接して溶離され
ねばならず（K′値が殆ど同じである）、予備処
理、誘導体の形成等が伴う分析について対象化合
物（類）と同等の挙動を示すものでなければなら
ず、最も高い精度を得るためには多成分混合物に
とつて１以上の内部マーカー化合物が必要とさ
れ、対象化合物と殆ど一致するピーク域又はピー
ク高の比を与える濃度となるように加えねばなら
ず、試料中には本来存在せずまた安定なものでな
ければならず、また試料成分、カラム充填物や可
動相とは不反応性のものでなければならない。 これらの難かしい必要条件のために必然的に完
壁とは言えない内部マーカー化合物を用いなけれ
ばならないことから、不正確度を低減する方法と
して公知の内部マーカー化合物を加えることは、
主にガスクロマトグラフイー分析に限られてお
り、赤外線及び発光分光分析法においては殆ど用
いられず、定量分析のための発射率又は吸光度が
測定される試料においては全く用いられていな
い。 試薬片は、低濃度の種々の化合物の定量分析、
特に体液中の病因学的に重要な物質の分析、例え
ば血液中グルコースの定量分析に広く用いられて
いる。通常、試薬片は試料中の対象化合物と反応
することができる試薬を担持した液体吸収性又は
吸着性の試薬材料から成る。未知化合物の定量測
定は、反応生成物の出現又は試薬片中に既知の濃
度で含浸せしめられた既知反応剤の消失を検知す
ることにより行なわれる。例えば、マイルス・ラ
ボラトリーズのエイムス・デイビジヨン（Ames
Division、Miles Labaratories、Inc.）は、グル
コース、コレステロール、トリグリセリド、尿
酸、血液中尿窒素（BUN）、ヘモグロビン、カリ
ウム及び他の病因学的に重要な物質に対して反応
性の試薬を包含する種々の試薬片を製造してい
る。通常、試薬片に吸収された反応生成物は反射
光度計で定量的に測定される。体液が、反応剤を
吸収した試薬片と反応した後に測定された試薬片
の反射率により、検出された化合物の比色法的定
量測定を行うことができる。これらの試薬片は定
量分析にとつて非常に有効であり、通常約±２〜
10％のばらつきはあるものの精度の高いものであ
る。 全ての臨床的に用いられる試薬において見られ
る通常の化学的可変性以外の、試薬片の定量測定
におけるばらつきの最も重要な理由は下記の通り
である。 (1) 特に反射率及び吸収能若しくは吸着能におけ
るばらつき；及び (2) 形成された反応生成物の量の測定又は反応剤
の消失の測定に用いられる装置のばらつき（検
出器の応答）。本発明によれば、試薬片又は他
の反応剤若しくは触媒を含有する材料は既知濃
度の不活性色原体マーカーを含み、これは試料
成分の濃度に比色定量的に応答を示す色原体染
料の比色定量的応答とは別個の波長ピークを有
する比色定量的反射率応答を与える。 大きく異る波長で測定された反射率又は吸光度
の読取り値の間にはかなりの差が生ずる。したが
つて、液体試料成分の定量的測定に用いられる反
射率（吸光度）の読取り値を補正せんとする先の
試みは、低波長若しくは高波長で測定された試薬
片中色原体の既知濃度における読取り値を得るこ
とにより、装置を初期較正することに向けられて
いた。 本発明によれば、既知の不活性な２次的色素材
料から得られた反射率又は吸光度の読取り値が、
色原体の測定波長や液体試料中で定量的に測定さ
れる成分の濃度に関らず、液体試料と試薬成分と
の相互作用によつて形成された主色原体材料の反
射率測定又は吸光度測定における不正確度をその
まま表示するものである。この特色は最も意外で
あり、主色原体以外に２次的不活性色素材料を包
含せしめられていないものから得られたものと比
較して濃度測定値の正確度を約２倍とすることが
できる。 ［発明の概要］ 要するに、本発明の目的とするところは新規か
つ改良された反応剤キヤリア、又は試薬片、並び
に試料中のある成分の存在及びその相対濃度をよ
り正確に測定する方法にある。反応剤キヤリア、
又は試薬片としては、セルロースのような発色性
の所定の試料成分と相互作用せしめ、測定可能な
応答を生じせしめるために選択された反応体系を
担持することができる反応剤吸収性若しくは反応
剤吸着性材料が挙げられる。試薬片のマトリツク
ス又はキヤリアを形成する好適な反応剤吸収
（着）性材料としては、紙のような吸収性材料、
発泡材料、不織布、ゲルの発泡材料、転相フイル
ム、その他の好適な不活性の多孔質マトリツク
ス、ポリマーフイルム等が挙げられる。当業界で
公知のように、試薬片は通常、不活性ポリマーシ
ート材のような支持体層に固定された１以上の反
応剤及び／又は反応触媒を含浸せしめた紙から
成るものである。所定の試料成分との相互作用又
は反応を達成するには、試薬片を試料中に浸漬す
るか又は試料を試薬片上にピペツトで滴下する。
化学反応又は相互作用により試薬片の反射率に変
化が生じる。次に、試料中の所定成分の濃度を、
カラーチヤートと目視比較してやや大まかな定量
測定値を得るか、又は試薬片を反射率測定装置中
に配置してより正確な定量測定結果を得ることに
よつて測定する。 本発明によつて、主発色性指示薬若しくは主色
変化性指示薬以外に、主指示薬又は色原体の吸光
波長ピークとは少くとも80nｍ、好ましくは120n
ｍ異る吸光波長ピークを有する、２次的不活性色
素化合物として色素若しくは染料を反応剤キヤリ
ア中又は液体試料中に包含せしめることにより液
体試料中の成分の存在及びその濃度の定量に用い
られる反射率若しくは吸光度測定値の正確度が予
期しない程高められ、種々の反応剤キヤリアのば
らつきや、反射率測定装置又は吸光度測定装置に
おけるばらつきが実質的に排除されることが判明
した。本発明の利点を十分活用するためには、色
素物質又はマーカーはキヤリア中の反応体系に対
して不活性であり、かつ液体試料に対しても不活
性であることが必要で、主色原体の光反射率の応
答とは本質的に異つた光反射率又は吸光度の応答
を与えて測定値のばらつきが補償できるものでな
くてはならない。このようにして、キヤリア又は
試料中に包含せしめた２次的色素マーカーの反射
率又は吸光度測定から得られたいかなる不正確度
も、試料と試薬組成物との相互作用又は反応の結
果形成された主色原体の反射率又は吸光度の測定
値の補償に用いることができ、したがつて、液体
試料中の所定成分の濃度が測定される。 非常に意外なことに、２次的不活性色素マーカ
ーを試薬若しくは反応剤キヤリア、又は液体試料
中に、既知濃度で包含せしめることにより、試料
成分と試薬片中の反応剤との反応又は相互作用の
結果として得られる主色原体による発色又は色変
化から得られる反射率又は吸光度の測定値の補正
に使用可能な正確度補正係数が提供されることが
判明した。 したがつて、本発明の目的は、液体中の化学物
質の相対濃度を測定するための新規かつ改良され
た方法及び試験具を提供することである。 本発明の他の目的は、液体試料中のグルコー
ス、コレステロール、尿酸、ヘモグロビン、又は
カリウムと反応して、試験具中の主及び２次的不
活性色原体染料において比色的に測定可能な変化
を生じせしめ、２つの明らかに異つた波長におい
て反射率を測定して主色原体の反射率測定値を補
正するため新規かつ改良された方法及び試験具を
提供することである。 本発明のまた更なる目的は、２種類の材料が反
応剤系、すなわち試薬片又は試料のどちらかに包
含され、既知濃度の２次的着色材料が、主色原体
形成材料の反射率測定値のための反射率読取り値
の補正係数を提供して濃度測定を正確なものとす
る、新規かつ改良された方法及び試薬片を提供す
ることである。 本発明の上記の及びその他の目的及び利点は、
下記のより詳細な説明と共に図面を合わせ用いる
ことにより明らかとなろう。 ［好ましい実施態様の詳細な説明］ 本発明の製品及び方法は、反応剤組成物との反
応又は相互作用により反射率又は吸光度測定装置
で測定することのできる、測定可能な色変化を生
ずることのできる、いかなる液体試料成分の相対
濃度の測定においても有用である。２次的不活性
色素マーカーを包含せしめることのできる好適な
試薬片としては、セラライザー（SERALYZER）
の商標によりマイルス・ラボラトリーズ社のエイ
ムズ・デイビジヨンによつて製造される、コレス
テロール、尿酸、ヘモグロビン、トリグリセリド
及びカリウムの定量測定用試験片が挙げられる。
本発明の試験具及び方法は、色変化率を測定して
液体試料中の所定成分の相対的終極濃度を得るよ
りも、終点分析において最も有用である。 試料と試薬との反応又は相互作用により形成さ
れた主色原体、及び２次的不活性色素マーカーの
光反射率又は吸光度は用いられる特定の染料の特
定の光波長においてそれぞれ測定される。本発明
の利点を十分に活用するためには、主色原体と２
次的不活性色素マーカーの反射率は、それぞれ、
吸光波長ピークで測定し、主色原体及び２次的色
素マーカーは少くとも80nｍ異る吸光波長ピーク
を有するものでなければならない。 ２次的不活性色素マーカーの見掛濃度は、最大
吸光波長にて得られた反射率と共に不活性色素マ
ーカーの既知濃度から計算され、この見掛濃度を
用いて、最大吸光波長における主色原体の反射率
の測定から得られた分析対象物の濃度の補正係数
が提供される。この補正係数により、分析対象物
の計算濃度が試薬片の特性、例えば厚さ及び散乱
係数（scattering coefficient）におけるばらつ
き並びに装置のばらつきについて補正される。本
発明の試験具及び方法により、濃度測定の正確度
が約２倍改善されることは非常に驚くべきことで
ある。例えば、２次的不活性色素マーカーを用い
ないコレステロール試薬片において、同一試験に
よる変動係数は約４％であるのに対して、２次的
不活性色素マーカーを加えることにより、同一試
験における変動係数は２％未満に低減される。 ２次的不活性色素マーカーは、キヤリア又は試
験片に含まれる反応剤組成物に対しても、また分
析される試料に対しても不活性の染料である。上
記不活性染料は、試験中に既知の濃度となるよう
に均一に混合しても、また反応剤組成物と共に試
薬片中に含浸せしめてよい。 本発明によれば、試料中の所定成分の濃度に応
答を示す主色原体又は指示薬と共に２次的不活性
色素物質を包含せしめることにより、不活性色素
物質及び色原体の測定波長や、所定の試料成分の
濃度に関わらず、既知の濃度で存在する２次的不
活性色素物質について行なわれた反射率又は吸光
度測定値に基いて、主色原体物質についせ行なわ
れた反射率又は吸光度の不正確度の相関関係が、
得られることが明らかになつた。理論的には、あ
る染料の反射率測定における不正確度は、上記の
２つの染料の反射率が全く同一で、分析対象物の
ある特定の濃度における場合のみに、試料成分反
射率測定値の不正確度と相関させることができる
ため、これらの結果は最も予期し得ないものであ
つた。しかしながら、分析対象物が試験具の試薬
成分と実質的に完全に反応した後に得られる反射
率測定値補正用の２次的不活性色素物質の反射率
から得られた不正確度の相関関係は、広い範囲の
測定波長（約300〜約1000nｍ）にわたつて、ま
た不活性色素物質と２次的色原体の無数の組合せ
（反射率範囲約５〜約70％）において、更に広範
な、分析対象物の濃度範囲にわたつて正確度の高
いものである。 分析対象物の濃度の有用な補正値を与える２次
的不活性色素マーカーの測定についても、上記相
関関係は濃度単位並びに反射率測定値において正
確度の高いものではなくてはならない。これを実
証するために、クベルカームンクの無限厚等式： Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）²／2R を用いて上記反射率をＫ／Ｓに変換した。上記式
中、Ｋは吸光度係数であり、Ｓは散乱係数であ
り、Ｒは、試薬片の基材又はパツドの支持材の反
射率に影響されないような十分な厚さ（無限厚）
を有する試料の反射率である。 血清又は全血中グルコースの定量分析に用いら
れる試薬片は周知である。上記試薬片には、グル
コースからグルコン酸と過酸化水素への酸化反応
に触媒として作用する、グルコースオキシダーゼ
のような酵素；ｏ−トリジンのような指示薬又は
酸化性染料（主色原体）；及び上記指示薬の酸化
反応に触媒として作用する過酸化活性を有する物
質から成る反応体系が含まれる。上記染料又は指
示薬は血液試料中のグルコース濃度に応じた酸化
の程度に従つて視認可能な色調の変化をもたら
す。 反応系中に生じる反応は次式： グルコース＋O₂グルコースオキシダーゼ ―――――――――――――→ グルコン酸＋H₂O₂ H₂O₂＋酸化性染料過酸化活性を有する物質 ―――――――――――――――→ 酸化染料＋H₂O （色変化） 現下の試薬片には、通常、上記のようなグルコ
ースと反応することができる反応剤組成物を含浸
させた、例えばセルロース系の吸収性材料のよう
なマトリツクス材料及びマトリツクス材料の血球
による汚染を防止するための、血球を別するこ
とのできるマトリツクス被覆材が包含されてい
る。 指示薬の酸化による色変化は、反射分光光度計
で測定され、試料（例えば全血）中のグルコース
濃度が測定される。 全血や尿の他にも、グルコースを測定できる他
の体液がある。公表された資料によれば、汗は低
くかつ変化するグルコース濃度を有する、血液の
限外過物であることが示されている。上記文献
によれば、細胞外の間隙及び筋肉内又は皮下部位
におけるグルコース濃度は、血液中のグルコース
濃度よりも低いが、これは血液グルコースの格好
な尺度であると考えられている。このように、グ
ルコースは、その潜在的有効量が皮フの下部に到
達する。 本発明は、広い観点においては、試薬組成物と
相互作用して主色原体又は色変化を示すことの可
能な化合物を生成することができる資料成分の測
定を目的とするものである。例えばグルコースを
伴う反応中に形成された化合物は、更にそれ自体
では全く色変化を生じないか又は僅かな色変化し
か生じないが、発色物質とは反応して色を生じる
他の物質と反応させることができる。２以上の物
質が、反応中に形成された化合物と発色物質との
間に介在することができる。酵素は生物学的触媒
であり、それらの多くはある唯一特定の決つた化
学物質との特定の反応に触媒として作用する変つ
た特異性を有している。例えばグルコース、コレ
ステロール及び尿酸の酵素は、検体液中にグルコ
ース、コレステロール及び尿酸が含まれている場
合には、それぞれこれらの反応に触媒として作用
して所定の反応生成物を生成するものである。主
色原体又は指示薬物質は反応生成物又は中間物質
の存在下に発色又は色変化することの可能なもの
である。酵素や発色若しくは色変化性成分は、あ
る程度のリアクタンスを惹起するに十分な量又は
反応組成物中に検知可能な変化を生じるに十分な
量を試験具又は試薬片の吸収性又は吸着性材料の
反応系に包含せしめることができる。グルコー
ス、コレステロール又は尿酸の酵素、例えばグル
コースオキシダーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ若しくはウリカーゼ；及び過酸化活性を有する
物質、例えば西洋わさびペルオキシダーゼの適量
とは、例えば約20ｇの吸収性マトリツクス材に対
して1000〜100000単位である。発色剤又は色変化
性薬剤の適量とは、例えば、乾燥しているものを
基準として、マトリツクス材料と試薬組成物との
総重量の0.01〜30重量％、好ましくは１〜10重量
％である。 主発色物質は、反応剤系（試薬片又は液体試料
のどちらか）に包含させるが、これは試薬組成物
又は液体試料と相互作用して着色物質又は当初の
物質の色とは異る色を発する。発色物質は、試薬
組成化合物の直接の作用の結果として色変化する
のではなく、それ自体では鮮明には発色しない他
の化合物を介在せしめてこれに反応生成物を作用
させることによつて色変化するのである。 グルコースの定量分析のための、本発明試験具
の試薬組成物の好ましいグルコース指示薬は、グ
ルコースオキシダーゼ、グルコースペルオキシダ
ーゼ又は過酸化活性を有するペルオキシダーゼ様
物質、及び過酸化水素の存在下に発色又は色変化
することができる主色原体化合物から成る。本発
明試験具のマトリツクス中に包含されたこの反応
体系がグルコース又はグルコース含有物質、例え
ば糖尿病患者の血液と接触させた場合、ペルオキ
シダーゼは過酸化水素と主色変化性化合物の反応
の触媒として作用して上記化合物の酸化物を生成
する。第１の色変化性化合物は、過酸化活性を有
する物質の存在下に発色又は色変化することがで
きる化合物であればいかなるものでもよい。２種
以上の、過酸化活性を有する物質を反応体系に存
在させてもよい。例えば、ヨウ化ナトリウムをテ
トラメチルベンジジン又はグアヤクゴムと共に存
在させてもよい。 グルコース、コレステロール及び尿酸の定量測
定のための、過酸化水素及び過酸化活性を有する
物質の存在下に発色する、ペルオキシダーゼの発
色物質及びペルオキシダーゼ様物質としては下記
の物質が挙げられる。 (1) モノアミン、例えばアニリン及びその誘導
体、オルト−トルイジン、パラ−トルイジン
等； (2) ジアミン、例えばオルト−フエニレンジアミ
ン、Ｎ，N′−ジメチル−パラ−フエニレンジ
アミン、Ｎ，N′−ジエチルフエニレンジアミ
ン、ベンジジン及びその誘導体、例えばテトラ
メチルベンジジン（青色又は茶色を発色する）、
ジアニシジン（緑色又は茶色に変色する）等； (3) フエノール、例えばフエノール自体（黄色を
発色する）、チモール、オルト−、メタ−及び
パラ−クレゾール（緑黄色、桃色及び乳白色を
それぞれ発色する）、α−ナフトール（深紅色
を発色する）、β−ナフトール（白色沈澱を生
成する）等； (4) ポリフエノール、例えばカテコール、グアイ
ヤコール（橙色を発色）、オルシノール、ピロ
ガロール（赤色系色又は黄色を発色する）、ｐ，
ｐ−ジヒドロキシジフエニル及びフロログルシ
ノール； (5) 芳香族酸、例えばサリチル酸、ピロカテチユ
イツク酸（Pyrocatechuic acid）、没食子酸； (6) ロイコ染料、例えばロイコマラカイトグリー
ン（マラカイトグリーン色を発色）及びロイコ
フエノールフタレイン（好ましくはアルカリ性
媒体中で用いる）； (7) 有色染料、例えば２，６−ジクロロフエノリ
ンドフエノール； (8) 種々の生物学的物質、例えばエピネフリン、
フラボンチロシン、ジヒドロキシフエニルアニ
リン（橙赤色を発色する）及びトリプトフア
ン；及び (9) その他の物質、例えばグアヤクゴム、グアイ
ヤコール酸、ナジ試薬（青色系色を発色）、カ
リウム、ナトリウム、その他水溶性ヨウ化物及
びビリルビン（緑色系色を発色）。 過酸化活性を有する、代表的物質としては、植
物ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、バレイシヨペルオキシダーゼ；ヨウ化
物、モリブデン酸塩、例えばヨウ化カリウム及び
モリブデン酸ナトリウム；計量された少量の全
血、赤血球のみ、凍結乾燥した血液；ウロヘミン
及びその他の過酸化活性を有するポルフイリン物
質並びに、ここで参照例として用いる米国特許第
3298789号及び同第2981606号に開示されるような
化合物及び化合物の組合せが挙げられる。 本発明の試験具又は試薬片及び方法は、グルコ
ース、コレステロール又は尿酸と酸素との反応に
触媒として作用することのできる化合物、例えば
グルコースオキシダーゼを含有する反応系に対し
て特に有用であり、この場合、下記の例示的触媒
反応： グルコース＋O₂＋H₂Oグルコースオキシダーゼ ――――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸 から結果的に形成されるある濃度のH₂O₂は、別
の反応系の成分と相互作用してキヤリアマトリツ
クス中に目視的に検知可能な色変化を生じる。主
色原体の反射率は好適な分光光度計によつて検出
される。 本発明によれば、試薬系に包含せしめた２次的
不活性染料は、主色原体について測定された反射
率を補正して実質的に改良された濃度の正確度を
与えることを可能にする。試料成分の定量測定に
用いられる他のいかなる試薬片も、本発明の原理
に従つて、試薬片中又は試料中に、２次的不活性
色原体染料を既知の濃度で包含させることにより
改良することができる。マイルス・ラボラトリー
ズ社のエイムズ・デイビジヨンによつて現在製造
される、グルコースの測定と類似した血清中コレ
ステロールの定量測定用の試薬片は、酸素存在下
にコレステノンと過酸化水素とを生成する、コレ
ステロールの酸化反応に依存するものである。反
応中に形成された過酸化水素はペルオキシダーゼ
の存在下に３−メチル−１−ベンゾチアゾリノン
ヒドロゾン（MBTH）とジリン酸プリマキンと
の着色複合体を形成する酸化結合反応によつて測
定される。上記着色複合体の光反射率は600nｍ
における反射率測定によつて測定される。 コレステロールエステル類コレステロールエステ
ル ――――――――――――→ ヒドロラーゼコレステロール コレステロール＋O₂コレステロール ―――――――→ オキシダーゼコレステノン＋H₂O₂ H₂O₂＋MBTH＋ジリン酸プリマキンペルオキシダー
ゼ ―――――――――→ 着色複合体＋H₂O 上記のコレステロール定量試験の正確度は、試
薬片又は試料中に２次的不活性色原体マーカーを
既知濃度において包含せしめることにより約２倍
に改良される。本発明によれば、試薬組成物は通
常、1.2％ｗ／ｗペルオキシダーゼ−100IU／mg
（西洋ワサビ）；2.7％ｗ／ｗコレステロールオキ
シダーゼ−9.2単位／mg（微生物）；1.0％ｗ／ｗ
コレステロールエステルヒドラーゼ−15.4単位／
mg（微生物）；2.0％ｗ／w3−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン；15.3％ｗ／ｗジリン
酸プリマキン；9.4％ｗ／ｗ緩衝剤；0.02％ｗ／
ｗインドシアニングリーン；及び残余部分として
不反応性成分を含む。 現在製造されている血清中尿酸の定量分析用試
薬片は、ウリカーゼ反応によつて生じた過酸化水
素を、ペルオキシダーゼ存在下の３−メチル−２
−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）と
ジリン酸プリマキンとの酸化結合反応によつて測
定する反応に基くものである。上記方法には２種
類の別個の反応が含まれている。第１の反応にお
いては、尿酸、酸素及び水が、ウリカーゼの存在
下に、アラントイン、二酸化炭素及び過酸化水素
を生成する。 尿素＋O₂＋H₂Oウリカーゼ ―――――→ H₂O＋アラントイン＋CO₂＋H₂O₂ 第１の反応で発生した過酸化水素は、次にペル
オキシダーゼの存在下にMBTHとジリン酸プリ
マキンと結合して着色複合体を形成する。 H₂O₂＋MBTH＋ジリン酸プリマキンペルオキシダー
ゼ ―――――――――→ H₂O₂＋着色複合体 一定期間のインキユベーシヨンを行なつた後、
560nｍにおける反射率の変化を測定することに
より、血清尿酸の濃度を測定した。同様にして、
上記尿酸の定量試験の正確度を試薬片中又は試料
中に、既知濃度にて、２次的不活性色原体マーカ
ーを包含させることによつて約２倍改良すること
ができる。尿酸分析用の試薬片は、通常、13.4％
ｗ／ｗジリン酸プリマキン；8.3％ｗ／ｗメチル
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン；5.5％ｗ／ｗ緩
衝剤；29.1％ｗ／ｗウリカーゼ（豚肝臓）；2.6％
ｗ／ｗペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）；0.08％
ｗ／ｗインドシアニングリーン；及び残余部分と
して無反応性成分を包含する。２次的不活性染料
の800nｍにおける測定を行なつて、主色原体の
560nｍにおける反射率の補正係数を得た。 本発明によれば、２次的不活性色原体、例えば
インドシアニングリーンを試験片又は試料（血
清）中に約２×10^-4〜２×10^-1重量％包含せしめ
ることにより、濃度測定における正確度が意外な
ほど改善される。本明細書中に開示した試薬片の
ための他の好適な２次的不活性色素マーカー、染
料又は着色剤材料も、試薬組成物及び試料に対し
て不活性である限り用いることができ、例えば
３，3′−ジエチルチアトリカルボシアニンイオダ
イド；１，1′，３，３，3′3′−ヘキサメチル−４，
4′，５，５−ジベンゾ−２，2′−インドトリカル
ボシアニンペルクロレート；１，1′−ジエチル−
４，4′−カルボシアニンイオダイド；５，5′−ジ
クロロ−11−ジフエニルアミノ−３，3′−ジエチ
ル−10，12−エチレンチアトリカルボシアニンペ
ルクロレート；アンヒドロ−１，１−ジメチル−
２−（７−（１，１−ジメチル−３−（４−スルホ
ブチル）−２−（1H）−ベンゼン(e)インドリニリデ
ン）−１，３，５−ヘプタトリエニル）−３−（４
−スルホブチル）−1H−ベンズ(e)−インドリウム
ヒドロキシドナトリウム塩；アンヒドロ−11−
（４−エトキシカルボニルピペラジン−１−イル）
−10，12−エチレン−３，３，3′，3′−テトラメ
チル−１，1′−ビス−（３−スルホプロピル）−
４，4′，５，5′−ジベンゾインドトリカルボシア
ニンヒドロキシドトリエチルアミン塩；及びチオ
ニンが挙げられる。これらの染料の全ては、所定
の試料成分の濃度に比例して形成される主色原体
物質について測定された反射率測定値を補正する
ための有効な相関関係を反射率の読取り値におい
て提供することが証明されている。 現在製造されている、全血中ヘモグロビンの定
量分析用の試薬片は、ヘモグロビンをメトヘモグ
ロビンの形で定量測定することに基くものであ
る。ヘモグロビンは細胞膜の溶解により赤血球か
ら遊離される。次に、ヘモグロビン中の２価の鉄
をフエリシアン化カリウムによつて３価の状態と
なるように酸化してメトヘモグロビンを形成す
る。535nｍにおける色（主色原体）の範囲は反
応した試料中のメトヘモグロビン（内存するもの
及び新規に変換されたもの）の濃度に比例する。 ヘモグロビンフエリシアニド ――――――――→ メトヘモグロビン 45〜180秒のインキユベーシヨンと試験時間の
後に、血液試験中のヘモグロビンの濃度を、
535nｍ（メトヘモグロビンの特性を示す）にお
ける反射率を測定することによつて得た。 本発明によれば、上記反応のための試薬組成物
は、通常、49％ｗ／ｗフエリシアン化カリウム；
39％ｗ／ｗリン酸塩緩衝剤；２次的染料として
0.5％ｗ／w1，1′−ジエチル−４，4′−カルボシ
アニンイオダイド；及び残余部分として不反応性
成分を含む。本発明によれば、反射率の測定は、
535nｍ（主色原体）及び535nｍにおける読取り
値の補正を行うために710nｍ（２次的色原体）
にて行う。 血清又は血漿からのトリグリセリドの定量分析
に用いられる試薬片はトリグリセリドから遊離さ
れるグリセロールを酵素を用いて比色的定量を行
うことに基くものである。この工程に伴う一連の
反応は下記の通りである。 トリグリセリドリパーゼ ――――→ PH８ ――→グリセロール＋遊離脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ―――――――――――→ Mg＋２ ―→グリセロール−３−ホスフエート＋ADP グリセロール −３− ＋ NAD⁺ホスフエート―――→ グリセロール−３−ホスフエート ――――――――――――――――――→ デヒドロゲナーゼ ジヒドロキシア セトン− ＋ NADH３−ホスフエート NADH＋INTジアホラーゼ ――――――――→ 波長＝580nｍ ――――→NAD⁺＋INTH 内存するグリセロール及びトリグリセリドの酵
素的加水分解によつて生成されたグリセロールを
グリセロールキナーゼ（GK）を触媒とする反応
においてトリリン酸アデノシン（ATP）によつ
てホスホリル化し、グリセロール−３−ホスフエ
ートとADPとを得た。グリセロール−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ（Ｇ−３−PDH）は、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
の存在下においてNADHを生成するグリセロー
ル−３−ホスフエートの酸化反応に触媒として作
用する。上記のNADHはジアホラーゼを触媒と
する反応においてホルマザン染料（INT）を還
元するのに用いられる。反射率光度計により、主
及び２次的色原体の反射率における変化を測定す
ることによつて試料トリグリセリドの濃度が得ら
れる。本発明によれば２次的色原体約２×10^-4〜
２×10^-1重量％をトリグリセリド試薬片又は試料
（血清）中に包含させることにより濃度測定の正
確度が予期しないほど改良される。 上記のトリグリセリド定量測定用の試薬組成物
は、通常、1.2％ｗ／ｗリパーゼ（微生物）−
3600IU／mg；0.5％ｗ／ｗグリセロールキナーゼ
（微生物）−60IU／mg；1.1％ｗ／ｗグリセロール
−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ（兎）−
110IU／mg；1.4％ｗ／ｗジアホラーゼ（微生物）
−35IU／mg；7.3％ｗ／wNAD；3.0％ｗ／
wATPジナトリウム塩；1.6％ｗ／ｗ硫酸マグネ
シウムヘプタハイドレート；5.0％ｗ／wINT；
0.025％ｗ／w1，１−ジメチル−２−（７−（１，
１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−２−
（1H）−ベンゼン(e)インドリニリデン）−１，３，
５−ヘプタトリニエル）−３−（４−スルホブチ
ル）−1H−ベンズ(e)インドリウムヒドロキシドナ
トリウム塩；71％ｗ／ｗゼラチン；及び残余部分
として不反応性成分を含む。試薬組成物は、支持
体片、例えばポリエチレンテレフタレートの層上
にフイルムの形に流延し、所望の反射率測定は
580nｍ（主色原体）と790nmm（２次的不活性色
原体）において行なわれる。 血清又は血漿中のカリウムの定量測定に用いら
れる試薬片は、比色法による、イオノフオアを媒
体とする水性相と有機相間のカチオン−プロトン
交換反応に基くものである。試薬域は、有機相と
水性相を形成する成分を含有する紙製マトリツク
スから成る。試料を施すと、水溶性の緩衝剤が溶
解して上記の水性相は再構成される。有機相中の
K⁺ _-選択製イオノフオアである２，３−（ナフト）
−15−クラウン−５を媒体としてカリウムイオン
は水性相から有機相へ移送される。有機相中の電
荷は、同一相中の指示薬染料、７−デシル−
MeDPINから同時にプロトンが失われることに
よつて中和状態に維持される。染料の脱プロトン
化の結果、640nｍにおける吸収ピークが現われ
る。 上記反応のしくみは下記の通りである。 反応による発色の程度は試料中のカリウムの量
に比例し、これは640nｍ（主色原体）における
反射分光分析によつて監視される。 本発明によれば、カリウム分析用の試薬組成物
は、例えば、2.4％ｗ／w7−（ｎ−デシル）−２−
メチル−４−（3′，5′−ジクロルフエン−4′−オ
ン）−インドナフトール；6.9％ｗ／w2，３−ナ
フト−15−クラウン−５；83.0％ｗ／ｗ緩衝剤；
0.16％ｗ／w5，5′−ジクロロ−11−ジフエニルア
ミノ−３，3′−ジエチル−10，12−エチレン−チ
アトリカルボシアニンペルクロレート；及び残余
部分として不反応性成分から成る。試薬組成物は
紙に含浸させ、反射率測定は640nｍ（主色原
体）と800nｍ（２次的色原体）において行なう。 本発明によれば、２次的色原体を、カリウム試
薬片又は試料（血清）中に２×10^-4〜２×10^-1重
量％包含させることによつて濃度測定の正確度が
予期しないほど改良される。 本発明により、(1)２次的不活性色原体染料マー
カーを試薬片又は試料中に包含せしめた場合の、
その測定における計算可能な、測定の不正確度
と、(2)試薬組成物と試料中の特定成分との相互作
用に比色的応答を示す主色原体染料の反射率の測
定値との間には非常に重要な相関関係が見出され
た。主色原体の反射率測定値に２次的不活性色原
体マーカーを関係させることにより、測定の正確
さが約２倍に改良される。２次的不活性色原体マ
ーカーは、試薬パツドの散乱係数、パツドの厚
さ、パツドの嵩、試薬片の基板若しくは支持体材
料の反射率におけるばらつき、試薬パツドの位置
のばらつき及び分光光度形内のドリフトを補正す
る。主色原体について測定した反射率は、主及び
２次的色原体染料の吸収波長ピークが少くとも
80nｍ異るものである限り、２次的色原体の濃度
や波長に関わらず、２次的不活性マーカー色原体
の反射率測定値における不正確度と密接に関連さ
せることができるのは非常に驚くべきことであ
る。 ２次的不活性染料の反射率の予測値及び実測値
に基く主色原体の反射率測定値の補正の例とし
て、下記の、試料１〜３に示した計算値（補正値
及び未補正値）は、本明細書の32〜33頁に記載し
た尿酸と試薬組生物に基くものである。 補正なしの計算式 Ｘ＝Ｌ＋（Ｈ−Ｌ）（K_X1＋K_L1）／K_H1−K_L1 補正を伴う計算式 Ｘ＝［Ｌ＋（Ｈ−Ｌ）（K_X１−K_L1）／K_H1−K_L1］ ×（K_L2＋K_H2）／2K_X2 上記式中、 Ｌ＝低カリブレータ（低濃度測定標準物質）の濃
度 Ｈ＝高カリブレータ（高濃度測定標準物質）の濃
度 K_X1＝主色原体の波長における試料のＫ／Ｓ値 K_X2＝２次的色原体の波長における試料のＫ／Ｓ
値 K_L1＝主色原体の波長における低カリブレータの
Ｋ／Ｓ値 K_L2＝２次的色原体の波長における低カリブレー
タのＫ／Ｓ値 K_H1＝主色原体の波長における高カリブレータの
Ｋ／Ｓ値 K_H2＝２次的色原体の波長における高カリブレー
タのＫ／Ｓ値 Ｘ＝試料の濃度 またキヤリブレータのデータとしては下記の通
りである。 Ｌ＝1.9mg／dl Ｈ＝7.2mg／dl K_L1＝0.6644 K_L2＝1.124 K_H1＝1.717 K_H2＝1.102 試料データ 試料１：1.9mg／dlで検定 K_X1＝0.7168 K_X2＝1.312 補正前の計算値 ＝2.16mg／dl 誤差＝−13.9％ 補正後の計算値 ＝1.83mg／dl 誤差＝−3.7％ 試料２：4.5mg／dlで検定 K_X1＝0.103 K_X2＝0.998 補正前の計算値 ＝4.108mg／dl 誤差＝−8.7％ 補正後の計算値 ＝4.58mg／dl 誤差＝＋1.8％ 試料３：7.2mg／dlで検定 K_X1＝1.400 K_X2＝0.9199 補正前の計算値 ＝5.60mg／dl 誤差＝−22.2％ 補正後の計算値 ＝6.78mg／dl 誤差＝−5.8％ 第１図に示すように、主色原体として種々の、
アマラントの混合物と、２次的不活性色原体染料
として種々の濃度の３，3′−ジエチルチアトリカ
ルボシアニンイオダイドとを用いて、種々の波長
及び濃度の組合わせから得られたデータは、主及
び２次的染料の両者について広範囲にわたる反射
率を示した。主及び２次的染料の混合物の水溶液
を種々の濃度で調製した。上記混合物7μをタ
イプ54の紙［ニユー・ジヤージー州、クリフト
ンのホワツトマン社（Whatman Inc.of
CliFton，N.J.）］のパツド（0.5×１cm又は0.2×
0.4インチ）上にピペツトで滴下し、種々の波長
で反射率の測定を行なつて、主及び２次的色原体
染料の間に相関関係が有るか否かを調べた。表１
には、第１図中の記号に対応する測定波長及び濃
度を示す。

【表】 第１図に示すように、一定のどの測定波長及び
濃度においても、２次的色原体染料について測定
された反射率における増加は、主色原体染料の測
定された反射率においても同様の増加があること
を意味するものである。したがつて、２つの波長
における測定値（１つは主色原体染料、もう１つ
は２次的原体染料）を用いることにより、試薬片
及び分光光度計の応答におけるばらつきによる、
主色原体染料の反射率測定値の不正確度を補正す
るのに有効な相関関係が示された。第１図のデー
タは、第１及び第２次的色原体染料の反射率が、
有用な相関関係を得るために同一である必要はな
いことを示している。 分析対象物の濃度の有用な補正値を提供するた
めの２次的色原体マーカーの測定を行なうために
は、濃度単位において相関関係がなければならな
い。これを証明するために、第２図に示すよう
に、第１図の反射率測定値を、クベルカームンク
の無限厚等式を用いてＫ／Ｓ値に変換した。観察
された相関関係は反射率測定値において観察され
たものと非常に類似していた。Ｋ／Ｓ値のばらつ
き率が第１及び２次的色原体について同様である
ならば、第１及び２次的色原体のＫ／Ｓ値の比率
に対するグラフと第１及び２的色原体染料のＫ／
Ｓ値の相関勾配は同一の勾配となるはずである。
第２図に示すように、この関係は、当該技術にお
いて非常に驚くべきことであり、主色原体の濃度
測定値の補正を可能にする。第２図の右上部の、
飛び離れた位置にある測定値は非常に高いＫ／Ｓ
値を示しているが、これはパツド表面からの反射
率が大きいためにＫ／Ｓ値に影響したものであ
る。 第１の相関関係において残される誤差は、濃度
単位におけるばらつき係数1.5〜２％の範囲に相
当する。これは、１つの波長における測定によつ
て得られるものよりもはるかに良好である。 コレステロールの定量測定 紙製試薬片に、1.2％ｗ／ｗプペオキシダーゼ
−103IU／mg（西洋ワサビ）；2.7％ｗ／ｗコレス
テロールオキシダーゼ−9.2単位／mg（微生物）；
1.0％ｗ／ｗコレステロールエステルヒドラーゼ
−15.4単位／mg（微生物）；2.0％ｗ／w3−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン；15.3％
ｗ／ｗジリン酸プリマキン；9.4％ｗ／ｗ緩衝
剤；0.02％インドシアニングリーン染料及び残余
成分として無反応製溶媒等を含浸させてマイル
ス・ラボラトリーズ社のエイムズデイビジヨンか
ら得られるセラライザー・コレステロール用試薬
片と同様のものを得た。 上記コレステロール用試薬を用いて得られたデ
ータは第３図に示す通りである。内部標準が無く
ても相互関係は明白であるが（表の左欄のデー
タが示すように）、性能が改良されるほど十分良
好なものではない。試薬中に、２次的不活性色原
体マーカーが存在することにより、驚くべきほど
より良好な相関関係が観察され、データの補正に
より性能が２倍改良される。ばらつき係数を表
中に示した。不活性の、２次的色原体は、理論的
には反復実験において誤差1.5％の精度を示すこ
とができる。これは、主色原体染料のみの反射率
測定による現下の試薬片を用いて得られるものよ
りも、はるかに良好である。

【表】 リーン
尿酸の定量測定 紙製試薬片に、13.4％ｗ／ｗジリン酸プリマキ
ン；8.3％ｗ／ｗメチルベンゾチアゾリンヒドラ
ゾン；5.5％ｗ／ｗ緩衝剤；29.1％ｗ／ｗウリカ
ーゼ（豚肝臓）；2.6％ｗ／ｗペルオキシダーゼ
（西洋ワサビ）；0.08％ｗ／ｗインドシアニングリ
ーン染料及び残余の試薬組成物として無反応性溶
媒を含浸させて、マイルス・ラボラトリーズ社の
エイムズ・デイビジヨンのセラライザー尿酸用試
薬片と同様のものを得た。 尿酸についても、コレステロールと同様の挙動
が得られたＫ／Ｓデータのグラフを第４図に示
す。変動係数は表中に示した。上記図中の右上
部に飛び離れて存在する値を除けば、内部標準を
有する高濃度の尿酸試料の変動係数は3.5％に低
下する。

【表】

【表】 リーン
BUN（血液尿窒素）及びクレアチニン用の試薬
系により指示薬Ｋ／Ｓの変化率が測定される。上
記指示薬の変化率を内部標準の定数Ｋ／Ｓと相関
させようとしても、これらの試薬にとつて有用な
関係は得られない。 ヘモグロビンの定量測定 微細孔性ポリウレタン片に、49％ｗ／ｗフエリ
シアン化カリウム、39％ｗ／ｗホスフエート緩衝
剤；0.05％ｗ／w1，1′−ジエチル−４，4′−カル
ボシアニンイオダイド及び残余部分として無反応
性成分からなる試薬組成物を含浸させた。次いで
試薬片に１滴の全血を接触せしめ、535nｍ及び
710nｍにおける反射率を測定した。２次的不活
性染料の反射率を710nｍにて測定することによ
り、535nｍにおける反射率の測定値の補正が可
能となり、血液試料中ヘモグロビンの計算濃度の
正確度を約２倍にする。 トリグリセリドの定量測定 1.2％ｗ／ｗリパーゼ（微生物）−3600IU／mg；
0.5％ｗ／ｗグリセロールキナーゼ（微生物）−
60IU／mg；1.1％ｗ／ｗグリセロール−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ（兎）−110IU／mg；
1.4％ｗ／ｗジアホラーゼ（微生物）−35IU／mg；
7.3％ｗ／wNAD；3.0％ｗ／wADPジナトリウム
塩；1.6％ｗ／ｗ硫酸マグネシウムヘプタハイド
レート；5.0％ｗ／wINT；0.025％ｗ／w1，１−
ジメチル−２−（７−（１，１−ジメチル−３−
（４−スルホブチル）−２−（1H）−ベンズ(e)イン
ドリニリデン）−１，３，５−ヘプタトリエニル）
−３−（４−スルホブチル）−1H−ベンズ(e)イン
ドリウムヒドロキシドナトリウム塩）；71％ｗ／
ｗゼラチン及び残余部分として不反応性成分から
成る試薬組成物を調整した。上記の試薬組成物を
フイルム上に流延し、乾燥した。フイルムに１滴
の血清を接触せしめ、580nｍ及び790nｍにおけ
る反射率を測定した。２次的不活性染料の790n
ｍにおける反射率の測定値により、50nｍにおい
て測定された反射率測定値の補正が可能となり、
血清中のトリグリセリドの計算濃度の正確度を倍
加することができ、有利である。 カリウムの定量測定 紙製試薬片に、2.4％ｗ／w7−（ｎ−デシル）
−２−メチル−４−（3′，5′−ジクロロフエン−
4′−オン）−インドナフトール；6.9％ｗ／w2，３
−ナフト−15−クラウン−５；83.0％ｗ／ｗ緩衝
剤；0.016％ｗ／w5，5′−ジクロロ−11−ジフエ
ニルアミノ−３，3′−ジエチル−10，12−エチレ
ンチアトリカルボシアニンペルクロレート；及び
残余部分として不反応性成分から成る試薬組成物
を含浸させた。上記試薬片に１滴の血清を接触せ
しめ、反射率を640nｍ及び800nｍにおいて測定
した。２次的不活性染料の800nｍにおける反射
率を測定することにより、640nｍにおける反射
率測定値の補正が可能となり、血清試料中のカリ
ウムの計算濃度の正確度を約２倍にすることがで
きる。 上記の数示を鑑みれば、本発明の修正及び変形
が数多く可能である。したがつて、特許請求の範
囲内で、上記に詳述した以外にも本発明を実施す
ることが可能であることは理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々の波長及び濃度で測定された、
主及び２次的色原体化合物の反射率を比較したグ
ラフであり、２次的染料について測定された反射
率の上昇が主色原体の反射率測定における上昇と
関連性を有することを示すものである。第２図
は、主色原体と２次的色原体のＫ／Ｓ値の比率に
対する、主色原体のＫ／Ｓ及び２次的色原体の
Ｋ／Ｓの相関勾配の関係を示すグラフである。第
３図は、２次的色原体を使用して、あるいは使用
せずに、各色原体の吸収帯の最大波長及び種々の
コレステロール濃度にて測定された、コレステロ
ール（主）色原体とインドシアニングリーン（２
次的）色原体のＫ／Ｓ値の関係を示すグラフであ
る。第４図は、２次的色原体を使用して、あるい
は使用せずに、各色原体の吸収帯の最大波長及び
種々の尿酸濃度にて測定された、尿酸（主）色原
体とインドシアニングリーン（２次的）色原体の
Ｋ／Ｓ値の関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験流体中の試験化合物の相対濃度を測定す
   るための試験具であつて、試験流体との相互作用
   により、主色原体を形成してキヤリアの光反射率
   若しくは吸光度に変化を生じせしめることができ
   る試薬組成物を均一に包含する試薬キヤリアと、
   上記キヤリア中に均一に、若しくは上記試験流体
   中に所定の濃度で包含させた２次的不活性色素マ
   ーカーとから成り、上記２次的色素マーカーが試
   験流体及び試薬組成物に対して不活性であり、か
   つ主色原体の吸光波長ピークから少くとも80nｍ
   離れた吸光波長ピークを有することを特徴とする
   試験具。 ２ 試薬キヤリアが、液体吸光性又は液体吸着性
   の吸収性材料である特許請求の範囲第１項記載の
   試験具。 ３ 試薬キヤリアが、発泡材料、不織布、ゲルの
   フイルム、ポリマーフイルム、転相フイルム及び
   その他の液体透過性材料より成る群から選ばれる
   特許請求の範囲第１項記載の試験具。 ４ ２次的不活性色素マーカーが、試験具と試料
   との接触により形成された主色原体の最大吸光ピ
   ークから少くとも120nｍ離れた、高い最大吸光
   ピークを有する染料から成る特許請求の範囲第１
   項記載の試験具。 ５ 液体試料中の所定の化学物質の濃度を測定す
   る方法であつて、 所定量の試薬組成物を試薬キヤリアに分配し、
   （ここで試薬組成物は液体試料中の所定成分と相
   互作用して、主色原体に発色もしくは色変化を惹
   起することにより、所定波長におけるキヤリアの
   光反射率に測定可能な変化をもたらすことのでき
   る化合物を包含し、また、該反応剤組成物は、主
   色原体の吸光波長ピークから少くとも80nｍ離れ
   た吸光波長ピークを有する２次的不活性色素マー
   カーを含む）； キヤリアを乾燥し； 乾燥したキヤリアの表面に液体試料を接触せし
   めて、該キヤリア中の主色原体及び２次的色素の
   両者の特性を示す波長において検知可能な色変化
   を惹起し； 第１の色原体の光反射率の特性を示す波長にお
   いて、キヤリアの光反射率を測定し、かつ不活性
   な２次的色素マーカー物質の光反射率の特性を示
   す波長において、キヤリアの光反射率を測定し； 第１の色原体における色変化の程度に基いて該
   所定化学物質の濃度を、２次的色素マーカー物質
   についての光反射率の測定値に基いて補正するこ
   とから成ることを特徴とする方法。 ６ キヤリアの反射率の測定が主色原体及び２次
   的不活性色素マーカー物質の吸光度が最大となる
   波長で行なわれる特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７ 液体試料が生物学的流体である特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ８ 液体試料が全血、血清又は血漿である特許請
   求の範囲第７項記載の方法。