JPH04505257A - 核酸を主成分とする診断システムおよび血液製品中のニューモシスティスカリニの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸を主成分とする診断システムおよび血液製品中のニューモジステイスカリニ の検出方法 特異的ポリヌクレオチドセグメントを使用した、核酸ハイブリダイゼーションに よる臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を検出するための方法並びにシステムに関する 。

肺炎はＡＩＤＳにおける最も一般的かつ通性的な感染であり、かつＡＩＤＳおよ び他の免疫障害患者の大きな罹患率および死亡率の原因となる。免疫抑制された 患者、例えば臓器移植レシピエンドなどにおける感染はＰ、カリニにより引き起 こされる付随的な主な問題である。従って、感染の初期段階におけるＰ、カリニ の検出法が有効な診断および治療を可能とするために必要となる。

現在のＰ、カリニ肺炎の検出法は、病原体または疾病の症状の徴候を組織につい て検査することによる、患者の肺の生検に依存している。免疫診断法としては、 Ｐ、カリニ抗原と免疫反応する抗体を使用して、痰または気管吸引物試料中の該 抗原の存在を検出することが報告されている（リム（Ｌｉｍ）の米国特許第３． ９９２．５１６号を参照のこと）。

（Ｈｕｇｈｅｓ　）の文献、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　Ｃａｒｉｎｉｉ　Ｐｎ ｅｕｍｏｎｉｔｉｓ、　１９８７．　Ｖｏｌ。

ＩＩ、ｐｌ）、　３５−４８．　ＣＲＣプレス刊、フロリダ州、ポコラトン（Ｂ ｏｃ。

Ｒａｔｏｎ）を参照のこと。

が低いものとされてきた（ピッ７−（Ｐｉｆｅｒ）、　Ｃｈｅｓｔ、　１９８５ ．８７゜ｐｐ、　６９８−７００）。血液中のＰ、カリニ抗原（抗原血症）に対 するア、ソセイも、肺炎の診断における信頼性について批判されている。ヒリダ イゼーションによるプローブとして使用された（タナベ（Ｔａｎａｂｅ）等、　 Ｊ、　Ｉｎｆ、　Ｄｅｓｅａｓｅｓ、　１９８８．１５？、　ｐＩ）、　５９３ −５９６）。

従って、本発明は哺乳動物における臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を検出する方法 に関連し、該方法は該哺乳動物からの変性脈管流して、ハイブリッド形成反応混 合物を形成することを含む。この混合物を、該プローブが該試料中に存在する任 意の相補核酸配列とハイブリダイズして、ハイブリッド化二重ラセンを形成する のに十分な時間ハイブリッド化条件下に維持する。次いで、この工程（ｂ）で形 成された任意の二重ラセンの存在を検出し、かくして該哺乳動物内におけるＰ、 カリニ感染の存在を検出する。

好ましい態様において、該ポリヌクレオチドプローブは、Ｐ、カリニリポソーム ＲＮＡの核酸配列のＰ、カリニ特異的部分に対して相補的であるヌクレオチド配 列を有する。

ポリメラーゼ連鎖反応が、核酸二重ラセンの検出工程の感度を高めるのに有効な 方法である限りにおいて、この方法はＰＣＲにより生成された増幅核酸生成物を 検出することが更に好ましい。

他の好ましい態様においては、該ハイブリッド化二重ラセンはＲＮＡ−ＤＮＡ二 重ラセンであって、まず該ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンからｃＤＮＡ分子を調製し 、次いで該ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅することにより該二 重ラセンが検出される。

発明の詳細な説明 複素環式塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位である。該塩基はグリ コシド炭素（該ペントースのｌ°炭素）を介して該糖部分に結合されており、こ の塩基と糖との組み合わせがヌクレオシドである。該ヌクレオシドが該ペントー スの３′または５′位に結合した燐酸を含む場合、これをヌクレオチドと呼ぶ。

機能可能に結合されたヌクレオチドの配列は、典型的にここでは「塩基配列」ま たは「ヌクレオチド配列Ｊと呼び、またその式の左がら右への配向を従来の５° −末端から３′−末端への方向とする。

ポリヌクレオチド：　核酸分子であり、ヌクレオチドの単一の線状ストランドを 形成する２以上の機能可能に結合したヌクレオチド（オリゴヌクレオチドとも呼 ばれる）の配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー単位を含む。

ＤＮＡ二重ラセン：　二重ラセン核酸分子であって、該二重ラセンの塩基対に存 在する相補的ヌクレオチド間に水素結合を形成することにより一緒にハイブリッ ド化された２本の相補的ポリヌクレオチドからなる。塩基対を形成するヌクレオ チドはリポ核酸塩基またはデオキシリボ核酸塩基の何れであってもよいので、ｒ ＤＮＡ二重ラセン」とは２本のＤＮＡストランドを含むＤＮＡ−ＤＮＡ二重ラセ ンまたは１本のＤＮＡストランドと１本のＲＮＡストランドとを含むＲＮＡ−Ｄ ＮＡ二重ラセンの何れかを意味する。

塩基対（ｂｐ）：　２重鎖ＤＮＡ二重ラセンにおけるアデニン（Ａ）とチミン（ Ｔ）との組またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との組を意味する。

シリポ核酸（ＤＮＡ）およびポリヌクレオチドを含む分子群の何れかを意味する 。

Ｂ、Ｐ、カリニ感染を検出する方法 ここで使用する用語「臨床的感染」とは、個体の膝上またはそ的に検知し得る症 状、例えば呼吸困難、発熱、咳、チアノーゼ、および散在性両側性浸潤物（ｄｉ ｆｆｕｓｅ　ｂｉｌａｔｅｒａｌ　１ｎｆｉｌｔｒａｔｅ）などが存在すること を意味する。Ｐ、カリニ誘発性疾病の臨床的かつ組織学的証拠の詳細については 、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ、第７ ．８および１０章、　ＣＲＣプレス社刊、１９８７、フロリダ州、ボカラトン（ Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ）を参照のこと。これとは逆に、ここで使用する用語「潜 在的感染（ｌａｔｅｎｔ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）Ｊとは、無症状のＰ。

カリニ感染、即ち少数の微生物の存在または疾病の顕著な臨床的かつ組織学的証 拠がないことを意味する。

本発明は、哺乳動物における臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を検出する方法を意図 しており、該方法は脈管流体試料、例えば血液、血清、血漿などの中のＰ、カリ ニの表現する核酸の存在についてアッセイすることからなる。典型的には、該方 法は該試料をＰ、カリニ特異的ポリヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成 反応にかけ、次いで生成された任意のハイブリッド形成反応生成物の存在、即ち Ｐ、カリニ感染の存在を示す該生成物の存在を検出することにより実施される。

１、変性血液試料 本発明を実施するに際しては、まずアッセイすべき該脈管流体試料、好ましくは 血清または血漿を、核酸／蛋白錯体を解離する変性剤で処理して、ハイブリダイ ゼーション用の核酸を入手し易（することが有利である。有用な変性剤は、有機 溶媒、カオトロピック塩、界面活性剤等である。有機溶媒の例はアセトン、アル コール、アセトン／アルコール混合物などを含む。カオトロピック塩の例は沃化 ナトリウム、グアニジウムクロリド、グアニジウムイソチオシアネートなどを包 含する。界面活性剤の例はアニオン性および非イオン性のものを含む。代表的な アニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）　、ラウリル硫酸ア ンモニウム（ＡＬＳ）　、ラウリル硫酸カリウム、ミリスチル硫酸ナトリウムな どを含む。

好ましくは、該脈管流体試料は、約５〜約１００容のアセトンと、１容の試料と を混合することによりアセトンで処理される。次いで、このアセトン／試料混合 物を、存在するアセトンおよび水を蒸発するのに十分な時間ｉｏｏ　’　ｃに維 持して、乾燥かつ変性された試料を形成する。この乾燥された試料中に存在する 核酸は水性溶媒、好ましくは滅菌したＲＮａｓｅを含まない水と混合することに より可溶化される。

この変性後、該試料中に存在する核酸は、更に当分野で周知の方法により、該試 料中に存在する蛋白物質から単離することができる。これについては、例えばマ ニアティス（ｌｉ！ａｎｉａｔｉｓ）等の論文、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハー バ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）、　１９８２゜ｐ、　４５８を参照のこと。

この利用する核酸単離法は、典型的には当分野で周知の如（、検出すべき核酸の 型、即ちＲＮＡであるかまたはＤＮＡであるかに依存するであろう。

２、　ポリヌクレオチドプローブ 該変性された脈管流体試料は、次いでＰ、カリニ特異的ポリヌクレオチドプロー ブとのハイブリツド形成によりプローブ化される。

ポリヌクレオチドプローブ（セグメント）は約１０〜５００ヌクレオチド塩基に 相当する長さ、好ましくは１５〜２５ヌクレオチド塩基に相当する長さのポリヌ クレオチドであり、Ｐ、カリニゲノムＤＮＡまする。

「実質的に相補的」なる用語およびその文法的に等価な用語は、課題とするポリ ヌクレオチドプローブと、Ｐ、カリニ核酸配列と正確な相補性を有する核酸配列 との間に、該課題のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下でＰ、カ リニ特異的核酸とハイブリダイゼーシヨンし得るのに十分なヌクレオチド塩基配 列の類似性があることを意味する。従って、該ポリヌクレオチドプローブは、該 核酸のヌクレオチド塩基配列（即ち、ターゲット配列）に相補的な正確な配列を 含む必要はない。該ポリヌクレオチドプローブは、該プローブが該ターゲット配 列と実質的な相補性を有する限り、該核酸とハイブリッド形成される。

例えば、非相補的ポリヌクレオチド部分は該相補ポリヌクレオチド部分の５゛− 末端に結合しており、該ヌクレオチド塩基配列の残部は該ターゲット配列に対し て少なくとも実質的に相補的であってもよい。また、非相補的塩基または塩基群 は該ポリヌクレオチド内に散在していてもよく、但し該ポリヌクレオチドは該タ ーゲット配列とハイブリッド化して、ポリヌクレオチドプローブとに該ターゲッ ト配列に対して核酸配列相補性を有する。

的な相補性をもたないヌクレオチドの配列を有することを意味する。従って、Ｐ 、カリニ特異的ポリヌクレオチドは、非Ｐ９カリニゲノムＤＮＡまたはそのＲＮ Ａ転写体とはハイブリッド化しない。

特定することを含む。コンピュータを利用した、既に刊行されたヌクレオチド配 列データバンク、例えばＧＥＮＢＡＮに、ＥＭＢＬなどは周知であり、ヌクレオ チド配列を比較し、実質的に相補性（即ち、相同性）を有するヌクレオチド配列 を特定し、かつ実質的に相補性をもたない（即ち、固有の）ヌクレオチド配列を 特定するための迅速な手段を提供する。

一旦ヌクレオチド配列の比較により、刊行されたデータバンクにおける該ヌクレ オチド配列の固有性を立証し、かつＰ、カリニ特異的ポリヌクレオチドを同定す 葛ことが好ましい。確認ハイブリダイゼーションアッセイは、該Ｐ、カリニヌク レオチド配列がＰ、カリニ由来のおよび種々の非Ｐ、カリニ微生物群由来の核酸 配列の存在下でここに記載されるようなハイブリッド条件下に置（ことを含むも のである。該非Ｐ、カリニ微生物群は、本質的にニジエリヒバイブリッド化され るが、上記の非Ｐ、カリニ微生物由来の核酸とはハイブリッド化されないもので ある。

かくして、本発明は補乳動物内のＰ、カリニ感染の存在を検出する方法を意図し 、該方法は該哺乳動物からの変性された脈管流体試料と、Ｐ、カリニ特異的核酸 にハイブリダイゼーションし得るポリヌクレオチドプローブとを混合することに よりハイブリダイゼ〜ジョン反応生成物を形成することを含む。

有用なＰ、カリニ特異的ポリヌクレオチドの例は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）等の Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８．３３４．　ｐｐ、　５１９−５２２に報告されたＰ 、７’７１三リポソ一ムＲＮＡ配列のＰ、カリニ特異的配列部分と実質的に相補 性の配列を有するものである。

本発明の方法により増幅された核酸生成物を検出する場合、該ハイブリダイゼー ション反応混合物は、２種の別々のポリヌクレオチドプローブと変性された脈管 流体試料とを混合することにより形成される。該混合されるポリヌクレオチドプ ローブの少なくとも一方はＰ、カリニ特異的であり、かつこれら両者は、以下で 更に議論するように、ポリメラーゼ連鎖反応によりハイブリッド化Ｐ、カリニ核 酸配列を増幅するように選択されたヌクレオチド配列を有している。即ち、該２ 種の混合されたポリヌクレオチドは以下の如き特徴を有するヌクレオチド配列を もつ第一および第二ポリヌクレオチドプローブである。該特徴とは、（１）少な くとも一方のポリヌクレオチドはＰ、カリニ特異的であり、（２）これら２種の ポリヌクレオチドはＰ、カリニゲノムＤＮＡの１または他のストランドと実質的 に相補的であり、ここで該第−のポリヌクレオチドはＰ、カリニゲノムＤＮＡ核 酸配列の＋ストランドに対して相補的であり、かつ該第二のポリヌクレオチドは その一ストランドに対して相補的であり、（３）これら２種のポリヌクレオチド は、該Ｐ、力某三ゲノムＤＮＡ上で、相互に約０〜約３００ヌクレオチド塩基、 好ましくは約２０〜約２００塩基離れているヌクレオチド配列に対して実質的に 相補的であり、かつ（４）これら２種のポリヌクレオチドは、該ゲノムＤＮＡ上 の相対的な位置が、該第−のポリヌクレオチドに対するターゲットが該第二のポ リヌクレオチドに対するターゲットと相対的に、該＋ストランド上の３′−位に 存在するようになっている、ヌクレオチド配列に対して相補的である。

本発明の方法が増幅された核酸生成物を検出する場合に使用する好ましいポリヌ クレオチドプローブはポリヌクレオチドＰＮＯ３とＰＮ４０の対、あるいはまた ポリヌクレオチドＰＮ２０とＰＲＯ２との対である。ポリヌクレオチドＰＮ０３ 、ＰＮ４０、ＰＮ２０およびＰＲＯ２のヌクレオチド塩基配列は以下の表１に示 されており、エドマン（Ｅｄｍａｎ）等（上記文献）により報告された該リポソ ームＲＮＡをコードするＰ。

表１；ポリヌクレオチド ポリヌクレオチド表示　ヌクレオチド塩基配列ＩＰＮＯ３ＡＡＴ　ＡＡＣＣＣＡ 　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＧＴＣＣＧＡＰＮ２０　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＡＴＡ　ＣＣＴ　 ＴＡＰＮ４０　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＡＧ　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＴＴＰＲＯ２ ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＩ：ヌクレオチド塩基配列は５゛ から３′の方向（左から右）に示されている。

ポリヌクレオチドセグメントは種々の方法で調製し得、該方法はポリヌクレオチ ドのドウノボケミカル（ｄｅ　ｎｏｖａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ）合成および例えば 大きな核酸フラグメントの制限エンドヌクレアーゼ消化、ストランド分離あるい は核酸鋳型を使用した酵素合成による、遺伝子またはその部分、ゲノム、プラス ミドまたは他のベクターとして存在する天然の核酸配列由来の核酸フラグメント の誘導を含む。

ポリヌクレオチドのドウノボケミカル合成法は、例えばマトウヅシ（Ｍａｔｔｅ ｕｃｃｉ　）等により報告されたフォスフオトリエステル法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１９８１．１０３．　ｐ、　３１８５および米国特許第 ４、３５６．２７０）により実施することができる。

核酸からのポリヌクレオチドの誘導は、核酸のクローニングベクターにより適当 なホストへのクローニング、該ベクターの複製およびその結果としての該クロー ン化した核酸の増殖、次いで該クローン化核酸のサブフラグメントの分離を含む 。

核酸のサブクローニングの説明については、マニアナイス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ　 ｉｓ　）等のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、１９８２，ｐｐ 、　３９０−４０１および米国特許第４．４１６．９８８号および同第４．４０ ３．０３６号を参照のこと。

イゼーション反応混合物を、該ポリヌクレオチドプラスミドが該脈管流体試料中 に存在する任意の相補的核酸配列と／％イブリダイズして、ハイブリッドＤＮＡ 二重ラセンを形成するのに十分な時間、ハイブリダイゼーション条件下に維持す ることを含む。

「ハイブリダイゼーション条件」およびその文法的に等価な用語は、維持時間と の関係で使用される場合には、該ハイブリダイゼーション反応混合物中の試薬お よび付随的な試薬の濃度の関連において、該ポリヌクレオチドが該ターゲット（ Ｐ、カリニ特異的）核酸配列と共にアニールされ、かつ２重鎖ＤＮＡ二重ラセン を形成するのに十分な時間および温度条件下に、該混合物を置（ことを示す。ハ イブリダイゼーションを達成するために必要とされるかかる時間および温度は、 当分野で周知の如く、ハイブリダイズすべき該ポリヌクレオチドセグメントの長 さ、所定のハイブリダイゼーションの厳密性、および該ハイブリダイゼーション 反応混合物中における該ハイブリダイゼーションの速度に影響を与える可能性の ある塩または付随的な試薬の存在に依存する。与えられたハイブリダイゼーショ ン反応混合物に対して、ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当分野 で周知である。

典型的なハイブリッド形成条件は、ｐＨ約５〜９に緩衝された溶液の使用を含み 、ハイブリッド形成は１８〜７０’　Ｃ、好ましくは約５５〜約６５°Ｃの温度 にて、０．５分〜２４時間実施される。小さな反応容積および迅速なハイブリッ ド形成反応のためには、実施例３に記載するように、ハイブリッド形成温度は、 試料をまず１０００Ｃに維持して二重ラセンＤＮＡを変性し、次いでハイブリッ ド形成のために室温（ＲＴ）まで冷却し、更に重合のために加熱し、かつ３０° Ｃに維持する如（変えることができる。

ハイブリッド形成は、周知の如く、均一または不均一フォーマットで実施できる 。該均一ハイブリッド形成反応は完全に溶液で起こり、そこでポリヌクレオチド プローブおよびハイブリッド形成すべき核酸配列（ターゲット）両者は溶液中に 可溶性形状で存在する。不均一反応は反応媒質に不溶性のマトリックスの使用を 含み、該マトリックスに該プローブまたは該ターゲット核酸の何れかが結合され る。

典型的かつ好ましいのは、均一ハイブリッド形成反応、例えば実施例３に記載の 反応であり、該反応ではＤＮＡ二重ラセンの検出工程は、更に以下で説明するよ うに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で形成された該ＤＮＡ二重ラセンを増幅 することにより行われる。

典型的な不均一ハイブリッド形成反応は、マトリックスとしてのニトロセルロー スシートの使用を含み、該シートにはターゲット核酸が結合される。

４、ＤＮＡ二重ラセンの検出 ハイブリッド化ＤＮＡ二重ラセンの形成後、本発明の方法では、該ハイブリッド 形成反応において形成されたポリヌクレオチド含有ＤＮＡ二重ラセンの存在、お よびその結果としての該試料を採取した哺乳動物におけるＰ、カリニ感染の存在 の検出を実施する。

形成されたＤＮＡ二重ラセンの検出は、様々な手段により達成でき、ここにＤＮ Ａ二重ラセンの検出のための好ましい態様を記載するが、当業者には容易に理解 できるように、他の周知の二重ラセン検出手段も本発明の方法および関連する診 断システムで使用するのに適していることは明らかであろう。

−態様において、該ＤＮＡ二重ラセンの検出工程は増幅された核酸生成物の検出 を含む。増幅された核酸生成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる 当分野で周知の増幅法の生成物である。

該増幅生成物は、Ｐ、カリニ特異的ポリヌクレオチドプローブを含むＤＮＡ二重 ラセンの存在下でＰＣＲを実施する場合に生成される。

従って、増幅された核酸生成物の検出を意図する態様は、まずＰＣＨにより任意 のＤＮＡ二重ラセンを増幅して、増幅核酸生成物を形成する工程、および引き続 いての形成された任意の増幅核酸生成物の存在を検出する工程を含む。

ＰＣＲは複数サイクルで実施され、そこで各サイクルは典型的には以下の工程を 含む。

（１）　ＰＣＲ反応混合物を任意のＤＮＡ二重ラセンを変性するのに十分な時間 および温度に維持して、ストランドを分離し、１本鎖核酸を形成する。ＤＮＡ二 重ラセンを変性して、１本鎖核酸を形成することは周知であり、種々の条件下で 実施できる。ＰＣＲフォーマットでは、二重ラセンの変性は典型的には、約１０ 秒乃至５分、好ましくは約１分にて、約９０〜１００°Ｃ１好ましくは９５°Ｃ の迅速な変性（二重ラセン溶融）を達成する温度にて、迅速に実施される。

（２）上記の工程（１）からの変性された混合物は、Ｐ、カリニ特異的ポリヌク レオチドプローブが相補的ターゲットＰ、カリニ特異的ヌクレオチド配列とハイ ブリダイズして、ＤＮＡ二重ラセンを形成するのに十分な時間および温度に維持 する。ハイブリッド形成条件は前に記載されており、ＰＣＲフォーマットで使用 するのに適している。しかしながら、ハイブリッド形成は短時間、５秒〜３分、 好ましくは１分で、３０〜７５°Ｃ１好ましくは約５５〜６５°Ｃにて実施する ことが好ましくかつ有利である。

（３）上記の工程（２）からのハイブリッド化混合物を、次いで周知の如く、ポ リ、メラーゼプライマ一連鎖延長反応が生じて、プライマー連鎖延長生成物が形 成されるような時間および温度にて維持する。プライマ一連鎖延長反応を実施す る条件は周知である。ＰＣＲフォーマットにおいては、この維持工程を迅速に、 約１秒〜５分、好ましくは約２分、約５５〜７５°Ｃ１好ましくは約６５°Ｃに て実施して、多くのサイクルを容易にする。ＰＲＣを数サイクル実施することに より、増幅された核酸生成物が形成される。このＰＲＣは典型的には、少なくと も１５サイクル、好ましくは約２０〜３５サイクル行われる。

ポリメラーゼ連鎖反応を実施する一般的方法および条件については、米国特許第 ４．６８３．２０２号および同第４．６８３．１９５号を参照のこと。

ＤＮＡ二重ラセンの検出の実施に際して、該二重ラセンは脈管流体試料中に存在 するＰ、カリニリポソームＲＮＡ（ｒＲＮＡＪとポリヌクレオチドとの間で形成 されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンであることが好ましい。その場合において、増 幅された核酸生成物の検出は該ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンの増幅により進められ る。

ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンの増幅は、まず該ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンから相補 的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子の調製工程と、続いて実施される該ｃＤＮＡ分子を増 幅して、多数のｃＤＮＡの複製物を形成する工程を含む。

ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンからのｃＤＮＡの調製も周知である。例えば、マニア ティス等の論文、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙＭａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、１９８２を参 照のこと。ハイブリッド化されたＤＮＡポリヌクレオチドプローブ（例えば、プ ライマー）を有するＲＮＡ分子からのｃＤＮＡの調製は、典型的にはマグネシウ ム塩および水性バッファーの存在下で、該ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ラセンをデオキシ ヌクレオチドｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰと混合し、該混 合物を逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくは鳥類の骨髄芽球症ウィルスＲＴ（ＡＭＶ −ＲＴ　’）の存在下で、該二重ラセン中に存在するＲＮＡ分子の少なくとも１ 種のｃＤＮＡ複製物を形成するのに十分な温度および時間にて該混合物を維持す る工程を含む。好ましいｃＤＮＡ調製条件は以下の実施例１に記載する。

本発明の方法におけるＤＮＡ二重ラセンの存在の検出は種々の手段により達成で きる。

ＤＮＡ二重ラセンの存在を検出するための一つの方法においては、該ＤＮＡ二重 ラセンにハイブリッド化されているポリヌクレオチドプローブは該二重ラセンを 検出可能とする標識または指示基を含む。典型的なかかる標識は放射性原子、化 学的に変性されたヌクレオチド塩基などを含む。

ポリヌクレオチドプローブに機能可能に結合もしくはその一部として存在する放 射性元素はＤＮＡ二重ラセンの検出を簡単化する有用な手段を与える。典型的な 放射性元素はβ−線放出するものである。β−線を放出する元素、例えば３１． 　＋４（、３２ｐおよび３３Ｓはβ−線放出放射性元素標識の１群を構成する。

放射性ポリヌクレオチドプローブは、典型的にはＤＮＡポリメラーゼを使用して 、放射性標識されたヌクレオチドを核酸内に組み込むことにより調製され、次い で該標識核酸は変性されて、放射性標識ポリヌクレオチドプローブを形成する。

放射性標識ポリヌクレオチド以外のものとしては、化学的に変性されて、金属錯 化剤、ビオチン含有基、螢光性化合物などを含むポリヌクレオチドがある。

一つの有用な金属錯化剤はランタニドと芳香風β−ジケトンとから形成されたラ ンクニドキレートであり、ここで該ランタニドはキレート形成化合物、例えばＢ ＤＴＡ同族体を介して核酸またはポリヌクレオチドに結合されて、螢光性ランタ ニド錯体を形成する。

これについては、米国特許第４．３７４．１２０号、同第４．５８９．７９０号 、および公開特許出願ＥＰ０１３９６７５およびＷＯ３７１０２７０８を参照の こと。

ビオチンまたはアクリジンエステル−標識オリゴヌクレオチド並びにポリヌクレ オチドの標識のためのその使用は公知であり、例えば米国特許第４．７０７．４ ０４号、公開特許出願ＥＰＯ２１２９５１および欧州特許第００８７８３６号に 記載されている。有用な螢光マーカー化合物はフルオレセイン、ローダミン、テ キサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）、ＮＢＤなどを包含する。

ＤＮＡ二重ラセン中に存在する標識ポリヌクレオチドは該二重ラセン自体を標識 することを可能とし、結果としてアッセイすべき試料中に存在する他の核酸との 識別を可能とする。該二重ラセン中における該標識の存在、゛および結果として の該二重ラセンの存在の検出は、典型的にはＤＮＡ二重ラセンとハイブリッド化 されないあらゆる標識ポリヌクレオチドプローブから該ＤＮＡ二重ラセンを分離 することを含む。

ＤＮＡ二重ラセンからの、−重鎖ポリヌクレオチド、例えば非ハイブリッド化標 識ポリヌクレオチドプローブの分離法は周知であり、典型的には化学的特性にも とずいて二本鎖核酸から一本鎖核酸を分離することを含む。より頻繁に利用され る分離法は、不均質ハイブリダイゼーションフォーマットの使用を含み、そこで は該非ハイブリッド化プローブが、典型的には洗浄により、不溶性のマトリック スに結合された該ＤＮＡ二重ラセンから分離される。

その例はサザンプロット法であり、該方法では該マトリックスはニトロセルロー スシートであり、かつ該標識はｓｔｐである（サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、 　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１９７５．９８．　ｐ、５０３）。

ＤＮＡ二重ラセンの存在の検出法のもう一つの方法、即ちここで好ましい態様の 例として使用する方法において、該ＤＮＡ二重ラセンは上記の如（増幅され、か つ該生成する増幅された核酸生成物が検出される。増幅された核酸生成物の存在 はＰ、カリニ感染の存より実施することができる。好ましい態様において、該増 幅されたの別々の種を観測することを特徴とする特定の増幅生成物の存在（解像 がゲル電気泳動法により実施された場合には、特定の分子量を有する生成物）は 、該ＤＮＡ二重ラセン中に該ポリヌクレオチドが存在し、該ＰＣＲ反応において プライマーとして機能して、ターゲットヌクレオチド配列を含む別々のヌクレオ チド配列を有する核酸の多数の複製物を生成することを示す。多数の核酸特異的 染色剤があり、電気泳動的に分離された核酸を可視化するのに適しているが、エ チジウムプロミドが好ましく、ここでの例として使用する。

該増幅された核酸生成物を検出するのに適した別の方法は、ハイブリダイゼーシ ョンを基本とする検出手段を含み、そこでは該増幅された生成物とハイブリッド 化し得る標識されたポリヌクレオチドプローブが使用される。このような検出手 段の例は、上記のサザンプロット法、生体外標識ポリリボヌクレオチドプローブ を使用するりボヌクレアーゼ保護分析、および特定のヌクレオチド配列を有する 核酸を検出するための同様な方法を包含する。これにライては、例えばオースベ ル（Ａｕｓｕｂｅｌ　）等のＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８７．　ジョンウィリー＆サンズを参 照のこと。

５、　プローブ、組成物およびキット もう一つの態様において、本発明は特異的ポリヌクレオチドプローブ並びにこれ らのポリヌクレオチドプローブを含む組成物および診断キットを意図する。本発 明のポリヌクレオチドプローブの一つは、約１００ヌクレオチド未満、好ましく は約５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約２０〜約３０ヌクレオチドの範囲 内の長さを有する。好ましくは、課題とするポリヌクレオチドプローブの全ヌク レオチド配列がエドマン（Ｅｄｍａｎ）等の論文、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８゜ の一種を含むことを特徴とする。

相互に実質的にハイブリッド化されない複数の本発明のポリヌクレオチドプロー ブを、はぼ当モル量で含む組成物も本発明の目的とするものである。好ましくは 、存在する該プローブはほぼ等しい長さを有するものである。該組成物は、好ま しくは２種のプローブを含み、第一のものはＰＮＯ３の配列を含み、かつ第二の ものはＰＮ４０の配列を含む。

本発明のプローブおよび／または組成物を含む、脈管流体試料本明細書に含まれ ている多くの化合物および基（例えば、核酸）は、相互に平衡状態で種々の形状 、特に様々にプロトン化された形状をもつ。当業者には理解されるであろうよう に、化合物または基の一形態のここでの表示は相互に平衡状態にあるすべての形 状を含むものである。

本明細書において、”ｕＭ”はマイクロモルを、“ｕｌ”はマイクロリッターを 、また“ｕｇ”はマイクログラムをそれぞれ意味する。

す、本発明の範囲を何等限定するものではない。

■、　ポリヌクレオチドの合成 表１に示したデオキシリボヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドＰＮＯ３ およびＰＮ４０はシンセティックジェネティックス社（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、　：カリフォルニア州、サンジエゴ（ＳａｎＤｉｅｇ ｏ））による化学的合成物であった。

化学的合成の後、各ポリヌクレオチドを１５％ゲル上でのポリアクリルアミドゲ ル電気泳動により精製し、水酸化アンモニウム中で６５°Ｃにて１６時間脱保護 し、次いで使用するまで−７０’　Ｃにて水中で濃度約２５０　ｕｇ／ｍｌにて 保存した。

Ｄａｗｌｅｙ）ラットを免疫抑制して、Ｐ、カリニ肺炎を発現させた。この免疫 抑制は飲料水に薬剤を添加した以下の規制飼育により達成した。即ち、２　ｍｇ ／ｌのプレドニソロン（９−α−フルオロ−１６−α−メチル−プレドニソロン ）で１８日、プレドニソロンの投与なしで１０日間、および１−１．５　ｍｇ／ ｌのプレドニソロンで２，５箇月。テトラサイクリン−ＨＣｌをも５００　ｍｇ ／ｌの濃度で間欠的に飲料水に添加して、細菌感染による死亡を防止した。該免 疫抑制から６〜８週間後、これらの肺炎に罹ったラットを殺し、Ｐ、カリニに感 染した肺組織を取り出した。各動物から作製したタッチインプリント（ｔｏｕｃ ｈｉｍｐｒｉｎｔｓ）を、チャルバブジアン（Ｃｈａ　Ｉｖａｖｄ　ｊ　ｉａｎ 　）およびグローニーでホモジナイズした。得られたホモジネートを綿ガーゼを 通して全ての粗大な組織塊を除去し、次いで１２ＭＭフィルター（ヌクレボア（ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）、カリフォルニア州、プレザントン（Ｐｌｅａｓａｎｔｏ ｎ））を通した。濾過したホモジネートを室温にて３０分間４００　Ｘ　ｇにて 遠心分離した。得られた上澄液を捨て、ペレットを、２００　Ｕ／ｍｌのペニシ リン、２００　ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコラボラトリーズ（ＧＩ ＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランドアイランド（ＧｒａｎｄＩｓｌａ ｎｄ）、　ＮＹ）および４　ｍｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを補充した約５倍 容量の燐酸緩衝塩水（ＰＢＤ、　ｐＨ７，２）に再懸濁して、あらゆる細菌およ び真菌の生育を阻害した。存在するＰ、カリニシストの数をピッｙ−（Ｐｉｆｅ ｒ）等の方法（Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅ５６．１９７７、１１．１）ｐ。

３０５−３１６）に従って測定した。単離したＰ、カリニシストは少量のアリコ ートとして一７０°Ｃにて保存した。

３、Ｐ、カリニ感染ラットの血液中のＰ、カリニ特異的核酸の検出以下の試料を それぞれ別々に１００　ｕｌのアセトンと混合して、変性試料の調製を開始した 。（ｉ）Ｐ、カリニ感染肺をもつラットの血液５ｕｌ、（ｉｉ）正常なラット（ 負のコントロール）からの血液５ｕｌ、（ｉｉｉ）　０．２２４　ｕｇのｒＲＮ Ａ　（正のコントロール）を含む単離されたＰ。

に１００°Ｃにて５分間維持し、更に８６ｕｌの滅菌水を添加し、１０００Ｃに て１０分間維持して、変性試料を生成した。

この変性試料を、微小遠心管で１２．０００Ｘｇにて遠心分離して、存在する全 てのデブリスをペレット化した。次いで、各清浄化した試料を、１０ｍ１のｌ０ ＸＴＡＱバツフｙ　−（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，５゜５００ 　ｍＭ　ＫＣＩ、　２５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、各１．８ｍＭのｄＧＴＰ、　ｄＡ ＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、および１００　ｕｌ／ｍｌのＢＳＡ）、２０ ０ピコモル（ｐｍｏ　Ｉ　）のポリヌクレオチドＰＮＯ３を含有する２ｕｌの溶 液、および２００　ｐｍｏｌのポリヌクレオチドＰＮ４０を含む溶液２ｕｌと混 合した。各オリゴヌクレオチドは実施例１で調製したものであった。この混合物 をまず１００　’　Ｃにて２分間保持し、次いで水浴上で１分間室温に維持して 、ＴＡＱバッファー混合物を形成した。

２７．５０の鳥類骨髄芽球症ウィルスの逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）を含む溶液 １ｕｌを該ＴＡＱバッファー混合物と混合し、更に４５°Ｃにて２分間維持して 該ＴＡＱバッファー混合物中に存在する任意のＲＮＡのｃＤＮＡ複製物を形成し た。５Ｕのサームスアクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ；　Ｔ ＡＱ）　ＤＮＡポリメラ〜ゼを含む溶液２ｕｌを該ｃＤＮＡ含有混合物と混合し て、第一のポリメラーゼ連鎖反応混合物を生成した。

得られたＰＣＲ混合物を以下に記載するような多数回のＰＣＲサイクルにかけて 、増幅された核酸生成物を生成した。ＰＣＲの１サイクルは、該混合物をまず９ ５°Ｃで１分間、次いで３００Ｃにて１分間および最後に６５°Ｃで２分間維持 することからなる。該混合物を１２回のＰＣＨに付した後、該サイクルにかけた 混合物８ｕｌを取り出し、保持し、ＩｕｌのＴＡＱ　ＤＮＡポリメラーゼを残り のＰＣＲ混合物と混合し、得られた混合物を更に８回のＰＣＲサイクルに付した 。

この混合物８ｕｌを取り出し、保持し、１２および２０サイクル後に残された試 料をアガロースゲル電気泳動により分析して、該残留試料中に含まれる該ＰＣＲ 増幅ＤＮＡ二重ラセン核酸分子を検出した。

このＰＣＲ処理し、かつ保持した試料をそれぞれ２ｕｌのアガロースゲルローデ ィングバｙ　７７−（ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、ＩＸＴＢＥバ ッファー中の０．５　ｕｇ／ｍｌのエチジウムプロミド（ＢｔＢｒ）を含む４ｘ Ｎｕ−シーブ（Ｓｅｊｖｅ）アガロースゲル上で１２０Ｖにて１時間該混合物を 電気泳動した。ＴＨＥバッファーはｌ０ＸＴＢＢバツフアーをＩＸにまで水を使 用して希釈することにより調製した。ＥＤＴＡバッファーは２ｇのＮａＯＨおよ び１８．６ｇのＥＤ丁Ａ二ナトリウムを１００　ｍｌの水と混合することにより 調製した。ｌ０ＸＴＨＥは１０８ｇのＴｒｉｓ−塩基、５５ｇの粉末硼酸、４０ ｍＪのＥＤＴＡバッファーおよび最終濃度０．５Ｕｇ／ｍｌとなるような量のＥ ｔＢｒを混合し、水で全体積をｌｌとすることにより調製した。ローディングバ ーファーは０．１％のブロモフェノールブルー染料、３３％のスクロース、０． ５　ｕｇ／ｍｌのＥｔＢｒおよびｌ　Ｘ　ＴＢＥを含む。

ゲル電気泳動後、該電気泳動したＤＮＡ二重ラセンをＵ、　Ｖ、光源に暴露する ことにより該二重ラセンを可視化し、発光する核酸を写真撮影した。

上記の方法で得られた結果は、見掛けの分子量で表して約２２０ヌクレオチド塩 基対（ｂｐ）の発光する核酸バンドの検出を示す。この２２０　ｂｌ）バンドは 、Ｐ、カリニ感染ラット、単離Ｐ、カリニｒＲＮＡ、または単離Ｐ、カリニシス トからの、２０ＰＣＲサイクル処理後の試料で観測された。２２０　ｂｐバンド の低順位もコントロール正常ラットからの２０ＰＣＲサイクル処理後の試料で観 測されたが、観測された弱いバンドは正常なラットに固有のＰ、カリニの低濃度 の検出における該方法の感度を反映するものと考えられる。この２２０　ｂｐバ ンドの低順位は負のコントロールとしての水で処理された試料中に観測されるが 、この結果は、電気泳動中の、正のコントロールとしての単離されたＰ、カリニ ｒＲＮＡを含む隣接のゲルレーンとの交叉汚染による結果であると考えられる。

該発光バンドに対する分子量２２０　ｂｐは、ポリヌクレオチドＰＮＯ３および ＰＮ４０を使用してＰＣＨにより生成された増幅核酸生成物について予想された 凡その大きさと一致している。従って、該２２０　ｂｐバンドの可視化はＰ、カ リニ特異的増幅核酸生成物の検出を示し、従って該ラットにおけるＰ、カリニ感 染の検出を表す。

実施例１記載のように調製したポリヌクレオチドＰＮ２０およびＰＨ１０も、上 記のポリヌクレオチドＰＮＯ３およびＰＮ４０の代わりに上記の検出法で使用で きた。前と同一の試料について、ＰＮ２０およびＰＲＯ２を使用して該検出法を 実施して得た結果は、分子量約５ｑｂｐを有する増幅核酸生成物を生成した。約 ５９ｂｐという分子量はポリヌクレオチドＰＮ２０およびＰＲＯ２を使用してＰ ＣＲにより生成した増幅核酸生成物の予想された大きさと一致した。この分子量 ５９ｂｐの増幅生成物は、該方法をＰ、カリニ感染ラット、単離Ｐ、カリニｒＲ ＮＡ、または単離Ｐ、カリニシストからの血液試料について実施した場合に観測 されたが、上記のコントロール試料を処理した場合には観測されなかった。従っ て、該分子量５９ｂｐの増幅生成物は、該ＰＮ２０およびおよび肺炎に罹ってい ないものと診断されたヒト患者から血清試料を得た。次いで、これらの血清試料 を、以下の例外を除き、実施例３に記載の如く処理した。該変性試料をｔｏ　Ｘ 　ＴＡＱバッファーおよびポリヌクレオチドと混合した後、ＪｕｌのＴＡＱ　Ｄ ＮＡポリメラーゼを更に混合し、得られた混合物をＰＣＲ３５サイクルに付した 。

その後、８ｕｌの該サイクルに付した混合物を取り出して、前と同様にアガロー スゲル電気泳動により分析した。

上記方法により得られた結果は、実施例３に記載したものと同者共に、上記の検 出工程を実施した後に２２０１）ｐバンドを示した。

旧■負−Ｐ、カリニ負の患者の抗血清および水からなる負のコントロールはいず れも検出し得る２２０　ｂｐバンドを何等示さず、本発明の方法の特異性を示さ なかった。

上記の増幅Ｐ、カリニ特異的核酸生成物の検出は、実施例３で使用した方法とは 異なり、逆転写酵素（ＲＴ）を使用せずに行った。ＲＴを使用せずに実施した増 幅核酸生成物の検出は、Ｐ、カリニに感染した患者の抗血清がここに記載の方法 により検出可能なりＮＡ−ＤＮＡ幅核酸生成物の可視化、即ちヒトにおけるＰ、 カリニ感染の検出（ま上記方法の教示に従って実施することができる。

上記の記載並びに実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を何等限 定するものではない。当業者は、ここに記載し、かつ特許請求した本発明の精神 並びに範囲内にある上記の伊Ｊ示した態様の様々な改良並びに変法を認識するで あろう。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物におけるニュウモシスティスカリニ感染の存在を検出する方法であ って、以下の諸工程： （ａ）該哺乳動物からの変性された脈管流体試料と、ニュウモシスティスカリニ ゲノムＤＮＡまたはそのＲＮＡ転写体とハイブリッド形成し得るニュウモシステ ィスカリニポリヌクレオチドプローブとを混合する工程、 （ｂ）該プローブが該試料中に存在する任意の相補性核酸配列とハイブリッド形 成して、ハイブリッド化二重ラセンを形成するのに十分な時間、該混合物をハイ ブリダイゼーション条件下に維持する工程、および （ｃ）該工程（ｂ）で形成された任意の二重ラセンの存在を検出し、結果として 該哺乳動物におけるニュウモシスティスカリニ感染の存在を検出する工程 を含むことを特徴とする上記方法。 ２．該ポリヌクレオチドプローブが、ニュウモシスティスカリニのリボソームＲ ＮＡのヌクレオチド配列のニュウモシスティスカリニ特異的部分に対して相補的 な配列を有する請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．該工程（ｃ）が増幅された核酸生成物の検出を含む請求の範囲第１項に記載 の方法。 ４．それぞれ以下の式： ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴ、およびＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＧＴＣＣＧＡで表される核酸配列を有する第一および第二のポリヌクレオ チドプローブを上記工程（ａ）で混合する請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．それぞれ以下の式： ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴ、およびＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＧＴＣＣＧＡで表される核酸配列を有する第一および第二のポリヌクレオ チドプローブを上記工程（ａ）で混合する請求の範囲第３項に記載の方法。 ６．該哺乳動物がヒトである請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．患者におけるニユウモシスティスカリニ感染の存在を検出する方法であって 、以下の諸工程： （ａ）該患者の脈管流体試料由来の２本鎖核酸から蛋白を除く工程、 （ｂ）該蛋白の除かれた核酸のストランドを分離して、相補的１本鎖鋳型を形成 する工程、 （ｃ）該相補的１本鎖鋳型を、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下で、ニ ユウモシスティスカリニ特異的核酸を増幅できるように選択された第一および第 二のポリヌクレオチドと共に処理する工程、および （ｄ）該工程（ｃ）で形成された任意のニユウモシスティスカリニ特異的核酸増 幅生成物の存在および結果としての該患者におけるニュウモシスティスカリニ感 染の存在を検出する工程、を含む上記方法。 ８．それぞれ以下の式： ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴ、およびＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＧＴＣＣＧＡで表される核酸配列を有する第一および第二のポリヌクレオ チドを上記工程（ｃ）で混合する請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．それぞれ以下の式： ＡＴＴＴＡＧＡＴＡＣＣＴＴＡ、およびＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＣＡＣ で表される核酸配列を有する第一および第二のポリヌクレオチドを上記工程（ｃ ）で混合する請求の範囲第７項に記載の方法。 １０．長さが約１００ヌクレオチド未満であり、以下の式で示される配列を含む ことを特徴とするポリヌクレオチド：ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴ Ｔ、またはＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡ１１．本質的に以下の 配列を含む請求の範囲第１０項に記載のポリヌクレオチド： ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴ、またはＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＧＴＣＣＧＡ１２．ほぼ等モル量で、相互にハイブリッド形成せず、それ ぞれ約１００未満のヌクレオチドを有する第一および第二のポリヌクレオチドを 含み、該第一ポリヌクレオチドが以下の式のヌクレオチド配列： ＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴを含み、かつ該第二のポリヌクレオ チドが以下の式のヌクレオチド配列： ＡＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡを含むことを特徴とする組成物。 １３．該第一および第二ポリヌクレオチドがそれぞれ以下の式で表される請求の 範囲第１２項に記載の組成物。 ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴ、およびＡＴＴＡＡＣＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＧＴＣＣＧＡ