JPH04320631A - 病害耐性タバコ植物及びその作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は病害耐性タバコ植物、よ
り詳しくは形質転換によってタバコ疫病菌及びタバコ赤
星病菌に対する抵抗性を付与されたタバコ植物及びその
作製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の微生物（病原菌）に対する抵抗反
応の機構は、単一ではなく植物及び病原菌の種類により
多種多様であるが、多くの植物−病原菌の系においては
共通して宿主の活発な代謝を経て、感染後に抵抗反応が
認められる［Ｏｕｃｈｉ，Ｓ．，Ａｎｎ　　Ｒｅｖ．Ｐ
ｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，２１，２８９−３１５（１９
８３）］。上記感染後に誘導される抵抗反応の代表例と
しては、低分子量の抗菌性物質であるファイトアレキシ
ンの蓄積を例示できる。該ファイトアレキシンは２１科
１００種以上の植物において認められ［Ｂｕｓｈｎｅｌ
ｌ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄＪ．Ｂ．Ｒｏｗｅｌｌ，Ｐｈｙｔｏ
ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，７１，１０１２−１０４１（１９
８１）］、この蓄積が植物の病原菌に対する重要な抵抗
反応機構であると考えられる［Ｋｅｅｎ，ＮＴ．，Ｐｌ
ａｎｔ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊｏｈ
ｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ，ｐｐ１５７−１７７（１９８１）］。また、上記
ファイトアレキシン蓄積等の、植物の抵抗反応を誘導す
る活性をもつ物質が、多数の病原菌から分離されており
、それらはエリシターと総称されている［Ｋｅｅｎ，Ｎ
．Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８７，７４−７５（１９７
５）］。

【０００３】大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　　ｍａｘ）と疫病
菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　　ｍｅｇａｓｐｅｒｍ
ａ　　ｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）の系において、菌
体細胞壁は大豆のファイトアレキシンであるグリセオリ
ンを誘導するエリシターとして知られている［Ｙｏｓｈ
ｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，５４６−５
４７（１９７５）］が、不溶性であるため該細胞壁自体
が宿主（大豆）の受容体に認識されるとは考え難い。こ
の菌体細胞壁からオートクレーブ処理や酸、アルカリ等
の処理でエリシターが可溶化されるが、その活性（エリ
シター活性）は、疫病菌細胞壁全体のそれに比べて極め
て低く、この可溶性のエリシターが実際に感染の場で機
能するか否かは疑問である。この疑問に対し、吉川らは
大豆組織には疫病菌細胞壁から活性の高い可溶性の糖エ
リシターを遊離する因子が存在することを始めて見出し
た［Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｍ．Ｍａｔａｍａ　　
ａｎｄ　　Ｈ．Ｍａｓａｇｏ，Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．，６７，１０３２−１０３５（１９８１）］。 その後、上記疫病菌細胞壁からのエリシター遊離に関与
する宿主因子は、β−１，３−エンドグルカナーゼ（β
−１，３−ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，以下、「β−
１，３−ＥＧ」と略記する）であることが解明され［Ｋ
ｅｅｎ，Ｎ．Ｔ．ａｎｄ　　Ｍ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，
Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７１，４６０−４６
５（１９８３）］、現在では疫病菌細胞壁に本来β−１
，３−グルカンを介して結合しているエリシター分子が
、β−１，３−ＥＧにより遊離し、この遊離したエリシ
ターが大豆細胞の原形質膜上のレセプターに結合して、
大豆細胞の核内におけるグリセオリン合成系酵素群をコ
ードする遺伝子の発現を誘導すると考えられている［Ｓ
ｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ　　Ｊ．Ｅｂｅｌ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８４，４１１７−４１２１（１９８７）：Ｙｏｓｈｉｋ
ａｗａ，Ｍ．，Ｎ．Ｔ．Ｋｅｅｎ　　ａｎｄ　　Ｍ．Ｃ
．Ｗａｎｇ，Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７３，
４９７−５０６（１９８６）：Ｅｓｎａｕｌｔ，Ｒ．，
Ｒ．Ｎ．Ｃｈｉｂｂａｒ，Ｄ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｂ．ｖａｎ
　　Ｈｕｙｓｔｅｅ　　ａｎｄ　　Ｅ．Ｗ．Ｂ．Ｗａｒ
ｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ　　Ｐｌａｎｔ　　Ｐａｔ
ｈｏｌ．，３０，２９３−２９７（１９８７）：Ｙｏｓ
ｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｌ
ａｎｔ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ｊ．Ａ．Ｃａｌ
ｌｏｗ），Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏ
ｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ｐｐ２６７−２９８（１
９８３）］。

【０００４】一方、近年植物の品種改良の一つの手段と
して、例えば病害抵抗性や除草剤抵抗性の獲得、光合成
能の増大、豆類、穀類等の貯蔵蛋白質、脂質、澱粉等の
成分改良や増産、窒素固定能力の付与等の目的で、植物
への有用遣伝子の導入技術、即ち有用な遺伝子を栽培作
物に導入して形質転換植物を創成する試みが種々研究開
発されている。その代表例としては例えばウイルスのコ
ートプロティン遺伝子を導入したウィルス抵抗性植物や
、プロテアーゼインヒビター遺伝子を導入した害虫抵抗
性植物、除草剤抵抗性遺伝子を導入した除草剤抵抗性植
物等の創成が知られている。しかしながら、いまだ上述
したような大豆疫病菌抵抗性に関与すると考えられるエ
リシター遊離因子を、他の植物につき応用する研究はな
されていないし、はたしてこれによって実際に形質転換
植物及びその後代植物が所望の抵抗性を獲得できるか否
かも判明していない現状にある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はタバコ植物に上記遺伝子導入技術を応用して、該植物
に所望の病害抵抗性を付与することにある。

【０００６】上記目的より本発明者らは鋭意研究を重ね
てきたが、その過程で先に上記疫病菌（糸状菌）の細胞
壁から活性の高い可溶性エリシターを遊離させる宿主（
大豆組織）側因子の遺伝子、即ちβ−１，３−ＥＧの遺
伝子の単離に成功した。より詳しくは、通常の遺伝子組
換え技術に従い、まず大豆の子葉組織から全ｍＲＮＡを
抽出し、これと相補的なｃＤＮＡを合成してプラスミド
ベクターλｇｔ１１に挿入し、該プラスミドを大腸菌に
組込んでｃＤＮＡライブラリーを作製し、これより目的
とする大腸菌クローンをスクリーニングし、その有する
ＤＮＡ塩基配列の解析、決定に成功した。かくして得ら
れたβ−１，３−ＥＧ遣伝子（ｃＤＮＡ）は、１０４１
塩基対からなる翻訳可能領域の存在が認められ、その塩
基配列から推定される蛋白質のアミノ酸配列は大豆β−
１，３−ＥＧのそれに一致することが確認された［Ｐｌ
ａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６７３−６８２（
１９９０）］。

【０００７】本発明者らは引き続く研究の結果、上記大
豆β−１，３−ＥＧ遣伝子のタバコ植物への導入に成功
し、かくして得られた形質転換タバコ植物が、タバコ疫
病菌抵抗性を有することを見出し、ここに本発明を完成
するに至った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、大豆β
−１，３−ＥＧ遣伝子の導入によって形質転換されてお
り、タバコ疫病菌及びタバコ赤星病菌に対する抵抗性を
有することを特徴とする病害耐性タバコ植物、及び大豆
β−１，３−ＥＧ遺伝子を有するベクターを転移された
アグロバクテリウム属細菌にてタバコ植物を感染させて
、タバコ疫病菌及びタバコ赤星病菌に対する抵抗性を付
与することを特徴とする病害耐性タバコ植物の作製方法
が提供される。

【０００９】より詳しくは、本発明の病害耐性タバコ植
物は、大豆β−１，３−ＥＧ遣伝子を有するベクターを
転移されたアグロバクテリウム属細菌にてタバコ植物を
感染させることにより創成され、上記ベクターとしては
、代表的には公知のバイナリーベクターｐＲＯＫ１ａが
、アグロバクテリウム属細菌としてはアグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
ＬＢＡ４４０４株がそれぞれ有利に利用できる。また、
本発明の形質転換方法においては、より有利には大豆β
−１，３−ＥＧ遺伝子を有するベクターのアグロバクテ
リウム属細菌への転移がトリペアレンタルメイティング
法により行なわれ、アグロバクテリウム属細菌による感
染がリーフディスク法により行なわれる。

【００１０】本発明により創成される病害耐性タバコ植
物は、上記の通りタバコ疫病菌及びタバコ赤星病菌に対
する抵抗性を付与されていることにより特徴付けられる
。即ち、本発明の病害耐性タバコ植物は、後記実施例に
て詳述する通り、形質転換を行なっていないタバコ植物
と対比して、β−１，３−ＥＧ活性が２〜３倍も増大し
ており、タバコ疫病菌を無傷接種した実験で病斑の形成
及び拡大が抑制され、この特性はタバコ疫病菌を有傷接
種した実験で更に顕著となり、またタバコ赤星病菌を有
傷接種した実験でも同様に病斑形成及び拡大の顕著な抑
制が認められるものである。従って、本発明のタバコ植
物は、糸状菌に対する抵抗性が向上されている点よりそ
の栽培が容易で、品質低下もなく、非常に有用であるこ
とが明らかである。

【００１１】以下、本発明の形質転換タバコ植物の創成
技術につき、（１）利用されるタバコ植物、大豆β−１
，３−ＥＧ遺伝子、その他の材料、（２）発現ベクター
の利用、（３）植物への上記遺伝子の導入及びこれによ
る植物の形質転換、（４）形質転換植物内遺伝子の存在
解析及び該遺伝子の翻訳産物の確認、（５）形質転換植
物の抵抗性検討の順で説明する。

【００１２】（１）利用されるタバコ植物としては、公
知の各種品種のもののいずれでもよく、特に限定はない
が、ブライトイエロー（Ｂｒｉｇｈｔ　　ｙｅｌｌｏｗ
）品種が好ましく、これは例えばＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉ
ｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地で無菌的に２７±１℃下、照明
下で生育させた実生を好適に利用できる。

【００１３】大豆β−１，３−ＥＧ遺伝子としては、代
表的には文献［Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３
，６７３−６８２（１９９０）］に記載のものを利用で
きるが、特にこれに限定される訳ではなく、一般的な遺
伝子工学技術に従い大豆より単離されたβ−１，３−Ｅ
Ｇ遺伝子や該遺伝子のＤＮＡ塩基配列を基にして、例え
ば（ホスファイト　　トリエステル法［Ｎａｔｕｒｅ，
３１０，１０５（１９８４）］等の通常の方法に従い、
別途化学合成されたものであってもよい。上記遣伝子工
学技術に従う大豆からのβ−１，３−ＥＧ遺伝子の単離
は、例えば、大豆の子葉組織から全ｍＲＮＡを抽出単離
し、これに相補的なｃＤＮＡを合成し、所望ｃＤＮＡを
選別し、プラスミドベクターλｇｔ１１等の適当なベク
ターに挿入、該ベクターを大腸菌等の適当な宿主に組込
み（ｃＤＮＡライブラリーを作製し）、目的クローンを
スクリーニングし、ＤＮＡ塩基配列の解析、決定を行な
い、最終的に目的とするＤＮＡ塩基配列を精製すること
により行ない得る。

【００１４】上記全ｍＲＮＡの抽出は、例えばグアニジ
ニウム／セシウムクロライド法［Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕ
ｍ／ｃｅｓｉｕｍ　　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　　ｍｅｔｈｏ
ｄ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　
　ａｎｄ　　Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐ１９４−１９６（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
），１９８２］や超遠心を用いるＣｓＣｌ重層法［Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９）］等に従
い実施できる。得られる全ＲＮＡからの所望ｍＲＮＡの
分離、精製は、例えばオリゴｄＴセルロース［コラボレ
ィティブ　　リサーチ社製）、ポリＵセファロース（フ
ァルマシア社製）］等を用いて吸着カラム法やバッチ法
により実施できる。 目的ｍＲＮＡの精製、濃縮及び同定は、得られるｍＲＮ
Ａを蔗糖密度勾配遠心法等により分画し、分画物につき
蛋白質の翻訳系で蛋白質に翻訳させ、得られる蛋白質の
活性を調べることにより行ない得る。また上記同定は１
，３−ＥＧに対する抗体を用いる免疫法によっても行な
い得る。

【００１５】ｃＤＮＡの合成は、一般的な方法、例えば
岡山−バーグ法［Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ　　ａｎｄ　　Ｐ
．Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　　Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ３，ｐ２８０（１９
８３）］やグブラー−ホフマン法［Ｖ．Ｇｕｂｌｅｒ　
　ａｎｄ　　Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，ｖｏ
ｌ．２５，ｐ２６３−２６９（１９８３）］等に従い実
施できる。より詳しくは、上記で得られたｍＲＮＡに、
市販の逆転写酵素及びＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ等）を作用させて二重
鎖ｃＤＮＡを得、その両端に組み込み可能な形とするた
めの適当なリンカーを付与すればよい。

【００１６】上記で得られるｃＤＮＡをバクテリオファ
ージλやｐＢＲ３２２プラスミド等の適当なベクターに
組み込んだ後、大腸菌等の宿主を形質転換させ、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製し、これより目的クローンをスク
リーニングする方法は、通常の合成オリゴヌクレオチド
プローブを用いる方法や１，３−ＥＧに対する抗体を用
いる方法やセレクティブ・ハイブリダイゼーション・ト
ランスレーション法に従い実施できる。

【００１７】かくして得られる目的遺伝子のＤＮＡ塩基
配列の解析、決定は、マキサム−ギルバート法［Ｍａｘ
ａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ　　ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍ．，６５，４９９−５６０（１９８０）］、Ｍ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
［Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ　　Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．
，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６（１９８２）］、サ
ンガー法［Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ　　ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
４，５４６３（１９７７）］等により行なうことができ
る。

【００１８】上記遺伝子の調製及びこれに引き続く本発
明形質転換植物の創成における遺伝子工学的手法として
は、公知の各種方法をいずれも採用することができる。 例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目的とする
手法（各種制限酵素処理、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等による酵素処理
等は常套手段によることができ、用いられる酵素等も市
販品として容易に入手できる。之等各操作における遺伝
子等の単離、精製も常法、例えばアガロースゲル電気泳
動法等に従えばよい。遣伝子の複製、増殖等は後述する
ように通常のベクターを利用して実施でき、その際用い
られるＤＮＡ断片や合成リンカーも前記化学合成手段を
含む通常の方法に従い容易に製造できる。

【００１９】（２）発現ベクターの利用ベクターの利用
は、この種植物の形質転換方法に用いられる各種の方法
に従って実施することができる。その代表例としては例
えば、Ｔｉプラスミドを利用する方法、カリフラワーモ
ザイクウィルス（ＣａＭＶ）を利用する方法、植物細胞
に特有のオルガネラである葉緑体のＤＮＡより自律的に
複製するＤＮＡを複製開始部位とするベクターを利用す
る方法、ＲＮＡウィルスを用いたＲＮＡベクターを利用
する方法等を例示できる。之等の内で特にＴｉプラスミ
ドを利用する方法は、導入された遣伝子が最終的に植物
のゲノムの中に組込まれ、種子を通じて次の世代にも伝
えられるという、動物細胞でよく用いられるているリン
酸カルシウム法と同様の性質を持っており、本発明に有
利に利用できる。尚、上記Ｔｉプラスミド法は、文献［
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１２１−２０（１９８９）］や文献［現代化学、１９９
０年６月号、２５−２９頁、「植物形質転換法」］等に
詳しく説明されており、本発明でも之等各文献に記載の
方法を、いずれも有利に適用することができる。

【００２０】（３）植物への遺伝子の導入とこれによる
形質転換法上記（２）に従い得られる組換え体Ｔｉプラ
スミドＤＮＡを植物体に導入する方法としては、１）ポ
リエチレングリコールを用いる直接導入法、２）リボソ
ームに包んで導入する方法、３）細胞内に微量を注入す
る方法、４）アグロバクテリウムのスフェロプラストと
植物プロトプラストを融合条件下で混合処理して、アグ
ロバクテリウムを植物細胞中に直接導入する方法等の各
種方法をいずれも採用することができる。それら各方法
はいずれも公知の各種文献に記載の操作に従うことがで
きる。より具体的には、アグロバクテリウムを介したＴ
ｉプラスミドの感染力を利用して植物を形質転換する方
法は、従来より主に１）植物体接種法、２）リーフディ
スク法、３）プロトプラスト共存培養法等に従い行なわ
れており、上記２）リーフディスク法は、その操作自体
非常に簡単であり、熟練を要さず、しかも短時間に所望
の形質転換植物を作製できる点より、本発明においても
最も好ましいもののひとつである。尚、上記形質転換法
の具体的操作は、後記する実施例に詳述した通りである
。

【００２１】かくして得られる本発明の形質転換タバコ
植物は、通常の方法に従いこれを栽培することができる
。殊に、本発明の形質転換タバコ植物は、上記の通り大
豆β−１，３−ＥＧ遺伝子を導入されていることに基づ
いて、病害に対する抵抗性が付与されている点に大きな
特徴を有する。その栽培条件（栽培場所、土壌等）や栽
培方法は、通常のタバコ植物と特に異なるものではない
。

【００２２】（４）形質転換植物内遺伝子の存在解析及
び該遣伝子の翻訳産物の確認上記遣伝子の存在解析は、
通常よく知られている一般的方法に従い行なうことがで
きる。その具体例としては例えばサザンハイブリダイゼ
ーション法を挙げることができる。また、得られる植物
体から自殖により種子をとり、これを植物培養用培地に
播いて生育させ、耐性植物と非耐性植物との個体数を計
測すれば、導入遺伝子がメンデルの法則に従って、後代
に伝達されることが確認できる。

【００２３】（５）形質転換植物の抵抗性検討得られる
形質転換体を、常法に従って生育培養させ、これに各種
の病原菌を通常の方法に従って接種し、所定時間後に該
植物体の例えば葉の状態を肉眼観察することにより、該
植物体の病害抵抗性を容易に判断できる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明形質転換タバコ植物の創成技術及び得られる形質転
換植物の特徴につき実施例を挙げる。

【００２５】尚、以下の各例においては、次のβ−１，
３−ＥＧ活性測定法を採用した。［β−１，３−ＥＧ活
性の測定］ β−１，３−グルカンであるラミナリン（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ）を基質として、このラミナリン溶液（５００
μｇ／ｍｌ）に、供試蛋白溶液５０μｌを加えて、３７
℃でインキュベートし、反応１時間後及び２時間後に生
成した還元糖をネルソン法［福島正美、菅原潔、「化学
と生物」，４，３７−４４（１９６６）］で定量するこ
とにより、β−１，３−ＥＧ活性を測定した。

【００２６】

【実施例１】１．供試植物及び供試菌 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ｔｏｂａｃｃｕｍ，品
種：Ｂｌｉｇｈｔ　　Ｙｅｌｌｏｗ，京都大学農学部よ
り入手）を、後記するようにＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉ
ｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）上で、無菌的に２７±１℃、照明下
に生育させた実生を利用した。

【００２７】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ）ＨＢ１０１株は、４０％グリセロールを含むＬ−
ブロス（ＬＢ）培地［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．
Ｆｒｉｓｃｈ．Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　　Ｍａｎｎｕａｌ（ｓｅｃｏｎｄ　　ｅｄｉｔｉｏｎ
）Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］中で保
存し、形質転換に際してはＬＢ培地で３７℃で一晩培養
して利用した。

【００２８】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ＬＢＡ４４０４
）株［筑波大学生物学化より入手］は、４０％グリセロ
ールを含むＬ−ブロス（ＬＢ）培地中で保存し、タバコ
葉切片への接種に際してはＬＢ培地で２８℃、２日間培
養して利用した。

【００２９】タバコ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
　　ｎｉｖｏｔｉａｎａｅｖａｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｅ）［カリフォルニア大学リバーサイドより入手］は、
ジャガイモ・シュークロース寒天培地（ＰＳＡ）上で保
存し、タバコ植物への接種に際しては、無菌栽培したタ
バコ葉上で１週間培養し、病原性を示したものを利用し
た。

【００３０】タバコ赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　
　ａｌｔｅｒｎａｔａ，ｔｏｂａｃｃｏ　　ｐａｔｈｏ
ｔｙｐｅ）［鳥取大学農学部より入手］は、ＰＳＡ（ポ
テト・デキストラン・アガー）上で保存し、タバコ植物
体への接種に際しては、ＰＳＡ上で形成した胞子を利用
した。

【００３１】２．発現ベクターの調製 ２−ａ．ベクターの調製 カナマイシン耐性を選別マーカーとして持つバイナリー
ベクターｐＲＯＫ１ａ［筑波大学より入手］を用いた。 その特徴を第１図に示す。図において、ＢＲはＴｉプラ
スミドのライトボーダー領域を、ＢＬは同レフトボータ
ー領域を、ＮＰＴ−ＩＩはネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ（カナマイシン耐性）のＤＮＡ断片を、ｎｏ
ｓＰはＴｉプラスミドのノパリン合成遺伝子プロモータ
ーを、ｎｏｓｔはＴｉプラスミドのノパリン合成遺伝子
ターミネーターを、３５ＳＰはカリフラワーモザイクウ
イルス３５Ｓプロモーターをそれぞれ示す。

【００３２】上記ｐＲＯＫ１ａを制限酵素ＢａｍＨＩ（
宝酒造社製）で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒
造社製）を用いて末端平滑化を行なった［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　　ａｎｄ　　Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｎｕａｌ
，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，１，５．６０−５．６３（１９８９
）］後、ベクターのセルフライゲーションを防止するた
めに、アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ　　ｉｎｔ
ｅｓｔｉｎｅ　　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＣＩＰ，宝
酒造社製）により末端の脱リン酸化を行なった［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　　ａｎｄ
　　Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ
　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１，５．７２（１９８９）
］。

【００３３】２−ｂ．導入ＤＮＡ断片の調製導入ＤＮＡ
断片としてβ−１，３−ＥＧのｃＤＮＡ［Ｐｌａｎｔ　
　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６７３−６８２（１９９０
）］を用いた。その塩基配列をこれによりコードされる
推定アミノ酸配列と共に第２図に示す。

【００３４】上記ＤＮＡ断片の末端も、上記２−ａと同
様にしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。

【００３５】２−ｃ．ライゲーション末端平滑化したｐ
ＲＯＫ１ａ及びβ−１，３−ＥＧｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造社製）を用いてライゲーションして、
β−１，３−ＥＧ発現ベクターを得た。尚、上記ライゲ
ーションはハヤシらの方法に従った［Ｈａｙａｓｈｉ，
Ｌ．，Ｍ．Ｎａｋａｚａｗａ，Ｙ．Ｉｓｈｉｚａｋｉ，
Ｎ．Ｈｉｒａｏｋａａｎｄ　　Ａ．Ｏｂａｙａｓｈｉ，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ，１４，７６１７−７
６３１（１９８６）］。

【００３６】２−ｄ．形質転換 ハナハンらの方法　　［Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０（１９８３
）］に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株か
ら調製したコンピテント細胞を上記β−１，３−ＥＧ発
現ベクターで形質転換して、所望の形質転換体を得た。

【００３７】２−ｅ．大腸菌からのプラスミドの抽出カ
ナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地を用いて、形
質転換大腸菌を３７℃で一晩振盪培養し、培養物を遠心
分離（１５００ｇ×５分）して菌体を回収し、アルカリ
ＳＤＳ法［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ　　ａｎｄＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１，１．２５
−１．２８（１９８９）］により、プラスミドを回収し
た。

【００３８】２−ｆ．ベクター内導入ＤＮＡ断片の挿入
方向の確認２−ｄで得たプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）及びＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で
切断し、バイナリーベクターに挿入されたβ−１，３−
ＥＧｃＤＮＡの挿入方向を確認した。また、全長１．２
ｋｂである上記ｃＤＮＡの５′上流側から５００ｂｐの
位置に認識配列が存在する制限酵素ＥｃｏＴ１４１（宝
酒造社製）を用いて、制限酵素ＥｃｏＲ１と共に上記プ
ラスミドを切断し、生成したＤＮＡ断片の大きさよりｃ
ＤＮＡの挿入方向を確認した。

【００３９】その結果を第３図に示す。

【００４０】図において、Ｓｅｎｓｅは順方向に挿入さ
れたものを、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅは逆方向に挿入された
ものを示す。尚、分子量マーカー（Ｍｏｌ．ｗｔ．ｍａ
ｒｋｅｒ）としては、λＤＮＡ（宝酒造社製）を用いた
。

【００４１】第３図より、本来１．５ｋｂの大きさをも
つＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ｃＤＮＡの挿入
により２．８ｋｂの断片として得られ、また、ｃＤＮＡ
が順方向（Ｓｅｎｓｅ）に挿入された際のＥｃｏＲＩ−
ＥｃｏＴ１４１断片は１．３ｋｂの断片として得られ、
逆にｃＤＮＡ断片が逆方向（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に挿
入された際のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＴ１４１断片は１．６
ｋｂの断片として得られた。

【００４２】上記バイナリーベクターにβ−１，３−Ｅ
ＧのｃＤＮＡを、β−１，３−ＥＧ蛋白が正常に合成さ
れる順方向に挿入したベクタープラスミドを「ｐＲＯＫ
１ａ−ＳＥＧ」と命名した。またｍＲＮＡがアンチセン
スに転写される逆方向に上記ｃＤＮＡが挿入されたベク
タープラスミドを「ｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧ」と命名した
。

【００４３】３．アグロバクテリウムへのプラスミドの
導入大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株からのバイナ
リーベクターのアグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｉｆａ
ｘｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株への導入は、バイナリー
ベクターのアグロバクテリウムへの転移に必要な因子を
持つプラスミドｐＲＫ２０１３［筑波大学より入手］を
用いたトリペアレンタルメイティング法［Ｄｉｔｔａ，
Ｇ．，Ｓ．Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｃｏｒｂｉｎ　　
ａｎｄ　　Ｄ．Ｒ．Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，７
３４７−７３５１（１９８０）］によって、以下の通り
行なった。即ち、ｐＲＯＫ１ａ及びｐＲＫ２０１３をそ
れぞれ持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１）株を
、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中で３７
℃で一晩培養した。

【００４４】一方、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４
株をリファンピシン１００μｇ／ｍｌ及びストレプトマ
イシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上で、２８℃
下に２日間培養した。

【００４５】上記で得られた各培養液を混合し、これを
カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、リファンピシン１００μ
ｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン３μｇ／ｍｌを含むＬ
Ｂ寒天培地上で、２８℃下に１日間培養した。その結果
、ｐＲＯＫ１ａの導入によってリファンピシン及びスト
レプトマイシンに加えてカナマイシンにも耐性を示し従
って培地上にコロニーを形成したアグロバクテリウムを
選別し、これを以下の例に用いた。

【００４６】４．植物への遺伝子の導入４−ａ．無菌植
物の育成 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ｔｏｂａｃｕｍ，品種
：Ｂｌｉｇｈｔ　　Ｙｅｌｌｏｗ）の種子をミラクロス
（とは？、会社名）で包み、７０％エタノールに３０分
間、次いで１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸
漬した後、滅菌水で水洗した。これをシャーレ（直径９
ｃｍ）中の１％素寒天上に播種し、２７±１℃、照明下
で１週間培養後、ＭＳ寒天培地上に移植し、培養を続け
た。

【００４７】４−ｂ．葉の切片への感染アグロバクテリ
ウムのタバコ葉への感染は、リーフディスク法［Ｒｏｇ
ｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｒ．Ｂ．Ｈｏｒｓｈ　　ａｎｄ　　
Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ，１１８，６２７−６４０（１９８６）］に従って
、以下の通り行なった。即ち、無菌栽培したタバコ実生
の葉を適当な大きさ（約１ｃｍ×１ｃｍ）に切断し、こ
の葉切片をＬＢ培地中で２８℃、２日間培養したアグロ
バクテリウムを感染させた。次に、アグロバクテリウム
に感染し、形質転換されたタバコ細胞を、カナマイシン
を含むＭＳ寒天培地上で選別し、植物ホルモンとしてナ
フタレン酢酸０．１ｍｇ／１とベンジルアデニン１．０
ｍｇ／１を添加して、不定芽形成を誘導した。 更に、形成された不定芽を植物ホルモン無添加の培地に
移して、不定根形成を誘導して、再生された植物体のそ
れぞれ約２０個体ずつ（本発明のｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧ
及びｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧでそれぞれ形質転換された形
質転換体、並びに比較のためβ−１，３−ＥＧのｃＤＮ
Ａを導入していないバイナリーベクターｐＰＯＫ１ａで
形質転換した形質転換体）を得た。

【００４８】以下、上記本発明のｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧ
で形質転換された形質転換植物個体をそれぞれ「ＴＳ−
１」〜「ＴＳ−２０」と呼び、ｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで
形質転換された形質転換植物個体をそれぞれ「ＴＡ−１
」〜「ＴＡ−２０」と呼び、比較のためβ−１，３−Ｅ
ＧのｃＤＮＡを導入していないバイナリーベクターｐＰ
ＯＫ１ａで形質転換した形質転換植物個体をそれぞれ「
ＴＮ−１」〜「ＴＮ−２４」と呼び、また何等の形質転
換も行なわなかった植物個体をそれぞれ「Ｔ−１」〜「
Ｔ−２０」と呼ぶ。

【００４９】之等各植物を常法に従い栽培した結果を第
４図に示す。

【００５０】図において、１（左下）は上記と同条件下
に得られた形質転換していないタバコ植物を、２（右下
）はｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧで形質転換したタバコ植物を
、３（左上）はｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで形質転換したタ
バコ植物を、また４（右上）はバイナリーベクターｐＰ
ＯＫ１ａで形質転換したタバコ植物をそれぞれ示す。

【００５１】次に、之等各形質転換植物について、以下
の実験を行なった。

【００５２】５．形質転換植物における外来遺伝子の存
在解析 ５−ａ．植物組織からのＤＮＡの抽出 少量のサンプルからＤＮＡを抽出するために、強力な界
面活性剤であるセチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　　ａｍｍｏｎｉｕ
ｍ　　ｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）を用いて組織を処理
し、クロロホルム抽出によりＤＮＡを分離するＣＴＡＢ
法［Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｏ．ａｎｄ　　Ａ．Ｊ．Ｂｅｎ
ｄｉｃｈ，Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５，６
９−７６（１９８５）］を行なった。即ち、新鮮重で０
．５ｇのタバコ葉を液体窒素で凍らせ乳鉢でよく摩砕し
、６５℃の温湯中で２％ＣＴＡＢ溶液を加え、３分間６
５℃で加温後、クロロホルム抽出を行ない、１／１０量
の１０％ＣＴＡＢ溶液を加え、３分間６５℃で加温した
。再びクロロホルム抽出を行なった後、等量の１％ＣＴ
ＡＢ溶液を加えて６５℃で１分間保ち、１００００×ｇ
で３分間遠心分離して得られた沈殿に、５０μｌの滅菌
水を加えて沈殿を溶解させた。これをエタノール洗浄し
たものを精製ＤＮＡ溶液として、その一部につきアガロ
ースゲル電気泳動を行ない、ＲＮＡの混入やＤＮＡの分
解がないことを確認した後、以下のＤＮＡ解析に用いた
。

【００５３】５−ｂ．サザン法 １％アガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を
行ない、定電流５０ｍＡで１時間泳動させた後、サザン
らの方法［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．，９８，５０３−５１１（１９７５）］に従
って、大豆β−１，３−ＥＧのｃＤＮＡをプローブとし
て用いてブロッティングを行ない、アグロバクテリウム
によりタバコゲノムＤＮＡに挿入された大豆のβ−１，
３−ＥＧの検出を行なった。

【００５４】その結果を第５図に示す。図において、レ
ーン１はＴＮ−１を、レーン２はＴＮ−２を、レーン３
はＴＮ−１２を（之等はｐＲＯＫ１ａで形質転換したも
のである）、レーン４はＴＳ−１を、レーン５はＴＳ−
２を、レーン６はＴＳ−３を、レーン７はＴＳ−１０を
、レーン８はＴＳ−１３を、レーン９はＴＳ−１４を（
之等はｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧで形質転換したものである
）、レーン１０はＴＡ−１を、レーン１１はＴＡ−２を
、レーン１２はＴＡ−７（之等はｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧ
で形質転換したものである）を、またレーン１３はＴ−
１（形質転換していないもの）をそれぞれ示す。

【００５５】第５図より、形質転換していないタバコ植
物及びｐＲＯＫ１ａで形質転換したタバコ植物では、い
ずれも大豆β−１，３−ＥＧのｃＤＮＡは検出されなか
ったのに対して、本発明のｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧ及びｐ
ＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで形質転換したタバコ植物では、い
ずれも大豆β−１，３−ＥＧのｃＤＮＡが検出された。

【００５６】６．形質転換植物における外来遣伝子の翻
訳産物の解析 ６−ａ．植物組織からの蛋白の抽出 新鮮重で３ｇのタバコ葉を液体窒素で凍らせて乳鉢でよ
く摩砕し、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．３）を１
０ｍｌ加えた後、１００００×ｇで遠心分離して植物組
織残渣を取り除いた上清に、１００％飽和となるように
硫酸アンモニウム結晶を加えて蛋白分画を沈殿させ、こ
れを１００００×ｇで遠心分離により回収した。これに
１０ｍＭのトリス緩衝液を２ｍｌ加えた後、１０ｍＭの
トリス緩衝液中で透析を行ない、硫酸アンモニウムを除
去したものを蛋白溶液とした。

【００５７】６−ｂ．ウエスタン法 ラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をレメリの方法［Ｌｅａｍｍ
ｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８
５（１９７０）］に従い実施した。濃縮用ゲルは４．５
％、分離用ゲルは１０％で作製し、垂直型泳動装置［ア
トー社製］を用いて定電流１２０ｍＡで４時間泳動を行
なった。泳動後、直ちにゲルをトリス緩衝液（ｐＨ？）
に浸して平行化させた後、電気プロッティング装置［同
上社製］を用いて、定電流１２０ｍＡで１時間、ナイロ
ン膜にブロッティングを行なった。ブロッティング終了
後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ｃｏｏｍａ
ｓｉｅ　　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　　ｂｌｕｅ，ＢＰＢ）
染色液で染色し、またナイロン膜は３％ゼラチンを用い
てブロッティングを行ないβ−１，３−ＥＧ抗血清（２
０００倍希釈）と３０分間反応させ、洗浄後、更にアル
カリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（会
社名）を１時間反応させた後、アルカリフォスファター
ゼの基質及び発色剤を加えて、抗体と結合した蛋白を文
献記載の方法［Ｔｏｗｂｉｎ，Ｔ．，Ｔ．Ｓｔａｒｈｅ
ｌｉｎ　　ａｎｄ　　Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６，４
３５０−４３５４（１９７９）］に従い検出した。

【００５８】尚、上記β−１，３−ＥＧ抗血清は、大豆
の石−１，３−ＥＧだけに特異的に反応し、タバコのβ
−１，３−ＥＧには反応しない抗体であり、これは文献
記載の方法により調製した［Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉ
ｏ１．，９３，６７３−６８２（１９９０）］。

【００５９】上記検出試験の結果、形質転換していない
タバコ植物、ｐＲＯＫ１ａで形質転換したタバコ植物及
びｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで形質転換したタバコ植物では
、大豆β−１，３−ＥＧは検出されなかったが、本発明
のｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧで形質転換したタバコ植物では
、大豆β−１，３−ＥＧが検出された。

【００６０】また、上記本発明の形質転換植物において
合成された大豆β−１，３−ＥＧの分子量は約３３ｋＤ
であり、これは大豆組織中に存在するそれと完全に一致
することが明らかとなった。

【００６１】６−ｃ．β−１，３−ＥＧ活性の測定上記
ウエスタン法に従う各タバコ植物群（本発明群及び比較
群）のそれぞれの個体につき、それらの経時的なβ−１
，３−ＥＧ生産量を前述した測定法に従い調べた。 その結果を第６図に示す。

【００６２】第６図において、横軸は酵素反応時間（時
間）を、縦軸はβ−１，３−ＥＧ活性（β−１，３−ｅ
ｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ΔＡ
６６０ｎｍ）を示す。表中、群Ａは形質転換していない
タバコ植物を、群ＢはｐＲＯＫ１ａ−ＳＥＧで形質転換
したタバコ植物を、群ＣはｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで形質
転換したタバコ植物を、群ＤはｐＲＯＫ１ａで形質転換
したタバコ植物をそれぞれ示し、各グラフは各群に属す
る個体のＮｏ．であり、１はＴ−３を、２はＴ−１を、
３はＴ−２を、４はＴ−４を、５はＴＳ−２を、６はＴ
Ｓ−１３を、７はＴＳ−１を、８はＴＳ−８を、９はＴ
Ｓ−９を、１０はＴＳ−３を、１１はＴＳ−４を、１２
はＴＳ−５を、１３はＴＳ−１０を、１４はＴＳ−１７
を、１５はＴＡ−２を、１６はＴＡ−３を、１７はＴＡ
−４を、１８はＴＡ−１を、１９はＴＮ−５を、２０は
ＴＮ−３を、２１はＴＮ−６を、２２はＴＮ−２を、２
３はＴＮ−１を、２４はＴＮ−１２を、それぞれ示す。

【００６３】第６図より、本発明の形質転換タバコ植物
（群Ｂ）では、形質転換していないタバコ植物（群Ａ）
に比べて、実に約２〜３倍もの酵素活性の増大が認めら
れる個体の存在することが明らかである。

【００６４】６−ｄ．蛋白の定量 蛋白の定量を、ウシ血清アルブミンを標準蛋白として用
いて、ローリー法［Ａｓｗｅｌｌ，Ｇ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３　　ｅｄ．，
Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　　ａｎｄ　　Ｎ．Ｏ．Ｋａ
ｐｌａｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　　Ｙ
ｏｒｋ，ｐｐ７３−１０５（１９５７）］に従って行な
った。

【００６５】７．形質転換植物における抵抗性の検定７
−ａ．接種源の調製 タバコ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　　ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａｅ　　ｖａｒｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ，カ
リフォルニア大学より入手）については、ＭＳ培地上に
接種し、この培地上に無菌栽培したタバコ実生の葉をの
せ、２６℃で培養した。１週間後、タバコ疫病菌に侵さ
れ変色したタバコ葉を切りとり、Ｖ８ジュース寒天培地
（？市販の野菜ジュース缶入？）に移し、２６℃で４日
間培養し、培地全面に広がった菌糸の先端部分をコルク
ボーラーで打ち抜いた菌糸デイスクを接種源として用い
た。

【００６６】タバコ赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　
　ａｌｔｅｒｎａｔａ，ｔｏｂａｃｃｏ　　ｐａｔｈｏ
ｔｙｐｅ，鳥取大学より入手）については、ＰＳＡ上に
接種し、２６℃で４日間培養し、培地全面に広がった菌
糸の先端部分をコルクボーラーで打ち抜き、これをＶ８
ジュース液体培地に移して１０日間培養し、得られた菌
体マットを湿らせた濾紙をしいたシャーレ（直径９ｃｍ
）中に菌体マットの裏面を上にしておき、紙蓋をして、
２６℃で２日間培養し、形成された胞子をハケでかきと
り、１０ｍｌの滅菌水に懸濁させ、胞子濃度が約５００
個／ｍｌになるように調製した胞子懸濁液を接種源とし
て用いた。

【００６７】７−ｂ．接種方法 タバコ疫病菌については、菌糸ディスクによる有傷接種
を以下の通り行なった。即ち、プラスティックケースの
中に湿らせた濾紙をしいた上にガラス台を置き、種々の
形質転換タバコ植物から切り取った葉をならべ、それぞ
れの葉に３ケ所ずつ、有傷接種については束ねた１０本
の針を葉に刺して傷をつけてから、その有傷部に菌糸デ
ィスクを接種し、２６℃で１週間置いた。また、同様に
して無傷接種をも行なった。

【００６８】タバコ赤星菌については、胞子による無傷
接種を次の通り実施した。即ち、上記と同様にプラステ
ィックケース内に置いた葉の３ケ所に、胞子懸濁液を１
００μｌずつ接種し、２６℃で１週間放置した。

【００６９】上記試験の結果、タバコ疫病菌を無傷接種
した場合を第７図に、タバコ疫病菌を有傷接種した場合
を第９図に、またタバコ赤星菌を有傷接種した場合を第
１１図に、それぞれ示す。各図において、Ａは形質転換
していないタバコ植物を、Ｂは本発明の形質転換タバコ
植物を示す。

【００７０】また、上記試験の結果、無病徴を０とし、
病斑の直径が１ｃｍ未満を１と、２ｃｍ未満を２と、そ
れ以上を３とするＤｉｓｅａｓｅ　　Ｉｎｄｅｘ（発病
指数）にて、各供試タバコ植物の葉の３カ所の接種部位
の合計値を計数した。その結果を第１表に示すと共に、
タバコ疫病菌を無傷接種した場合を第８図に、タバコ疫
病菌を有傷接種した場合を第１０図に、またタバコ赤星
菌を有傷接種した場合を第１２図に、それぞれに示す。

【００７１】

【表１】

【００７２】第７図、第９図及び第１１図において、Ａ
は形質転換していないタバコ植物を、Ｂは本発明形質転
換されたタバコ植物をそれぞれ示す。また第８図におい
て、１はＴＳ−１３を、２はＴＳ−１を、３はＴＳ−４
を、４はＴＳ−１７を、５はＴＳ−５を、６はＴＮ−３
を、７はＴＮ−１２を、８はＴＮ−６を、９はＴ−１を
、１０はＴＮ−１を、１１はＴＡ−１をそれぞれ示す。 第１０図において、１はＴＳ−１を、２はＴＳ−３を、
３はＴＳ−４を、４はＴＳ−３を、５はＴ−３を、６は
Ｔ−４を、７はＴＮ−９を、８はＴＡ−４をそれぞれ示
す。第１２図において、１はＴＳ−３０を、２はＴＳ−
４を、３はＴ−３を、４はＴＮ−６を、５はＴＮ−２を
、６はＴ−４を、７はＴＡ−４を、８はＴＡ−１をそれ
ぞれ示す。

【００７３】上記第７図、第９図及び第１０図より、本
発明の形質転換タバコ植物では、病斑の形成及び拡大が
抑制される傾向のあることが明らかである。

【００７４】また、第８図、第１０図及び第１２図より
、大豆石−１，３−ＥＧ遺伝子を順方向に挿入したベク
ターで形質転換した本発明のタバコ植物ではＤｉｓｅａ
ｓｅＩｎｄｅｘの値も小さく、β−１，３−ＥＧ活性の
増大が疫病抵抗性によく反映されていることが明らかと
なった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いるバイナリーベクターｐＲＯＫ１
ａの特徴を示す図である。

【図２】本発明に導入ＤＮＡ断片として用いるβ−１，
３−ＥＧのＣＤＮＡの塩基配列及びこれによりコードさ
れる推定アミノ酸配列を示す。

【図３】プラスミド中に挿入されたβ−１，３−ＥＧの
ＣＤＮＡの挿入方向を調べた図面に代わる写真及び該挿
入方向を示す図である。

【図４】本発明のロＲＯＫ１ａ−ＳＥＧで形質転換され
た形質転換植物個体、ｐＲＯＫ１ａ−ＡＥＧで形質転換
された形質転換植物個体、β−１，３−ＥＧのｃＤＮＡ
を導入していないバイナリーベクターｐＰＯＫ１ａで形
質転換した形質転換植物個体及びなんらの形質転換も行
なわなかった植物個体のそれぞれの生物の形態を示す図
面に代わる写真である。

【図５】サザン法によりタバコゲノムＤＮＡに挿入され
た大豆β−１，３−ＥＧの検出を行なった結果を示す図
面に代わる写真である。

【図６】上記ウエスタン法に従うタバコ植物個体の経時
的β−１，３−ＥＧ生産量を測定した結果を示すグラフ
である。

【図７】タバコ疫病菌を無傷接種した場合の病斑の形成
及び拡大の抑制を調べた生物の形態を示す図面に代わる
写真である。

【図８】タバコ疫病菌を無傷接種した場合のβ−１，３
−ＥＧ活性と病斑の進展度との関係を求めたグラフであ
る。

【図９】タバコ疫病菌を有傷接種した場合の病斑の形成
及び拡大の抑制を調べた生物の形態を示す図面に代わる
写真である。

【図１０】タバコ疫病菌を有傷接種した場合のβ−１，
３−ＥＧ活性と病斑の進展度との関係を求めたグラフで
ある。

【図１１】タバコ赤星菌を有傷接種した場合の病斑の形
成及び拡大の抑制を調べた生物の形態を示す図面に代わ
る写真である。

【図１２】タバコ赤星菌を有傷接種した場合のβ−１，
３−ＥＧ活性と病斑の進展度との関係を求めたグラフで
ある。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大豆β−１，３−エンドグルカナーゼ遺伝
   子の導入によって形質転換されており、タバコ疫病菌及
   びタバコ赤星病菌に対する抵抗性を有することを特徴と
   する病害耐性タバコ植物。
2. 【請求項２】形質転換が、大豆β−１，３−エンドグル
   カナーゼ遺伝子を有するベクターを転移されたアグロバ
   クテリウム属細菌感染により行なわれる請求項１に記載
   の病害耐性タバコ植物。
3. 【請求項３】大豆β−１，３−エンドグルカナーゼ遣伝
   子を有するベクターが、バイナリーベクターｐＲＯＫ１
   ａである請求項２に記載の病害耐性タバコ植物。
4. 【請求項４】アグロバクテリウム属細菌がアグロバクテ
   リウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株であ
   る請求項２に記載の病害耐性タバコ植物。
5. 【請求項５】大豆β−１，３−エンドグルカナーゼ遺伝
   子を有するベクターを転移されたアグロバクテリウム属
   細菌にてタバコ植物を感染させて、タバコ疫病菌及びタ
   バコ赤星病菌に対する抵抗性を付与することを特徴とす
   る病害耐性タバコ植物の作製方法。
6. 【請求項６】大豆β−１，３−エンドグルカナーゼ遺伝
   子を有するベクターのアグロバクテリウム属細菌への転
   移がトリペアレンタルメイティング法により行なわれる
   請求項５に記載の病害耐性タバコ植物の作製方法。
7. 【請求項７】アグロバクテリウム属細菌による感染がリ
   ーフディスク法により行なわれる請求項５に記載の病害
   耐性タバコ植物の作製方法。