JPH0399100A - 細胞増殖促進性タンパク質及びその単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、哺乳動物ハーダー腺に含まれる細胞増殖促進
性タンパク質及びその単離方法に関する．〈従来の技術
） 近年各種の細胞増殖促進因子が注目研究され、これまで
に動物、ヒト細胞、細菌類等を起源とする各種の細胞増
殖因子が発見されている．又、最近では、これらを遺伝
子工学を利用して増産する方法も研究されている． 動物細胞起源のものとしては、マウスＥＧＦ（特開昭５
７−２０６６１７号）、胎盤性或長因子《特開昭６１−
２２９８９４号）、前立腺性成長因子（特開昭６２−１
８１２２２号）等が発見されている４ （発明が解決しようとする課題） 上記技術は創傷治療剤、潰瘍治療剤等への応用が検討さ
れているがいまだ研究途上のものが多く安定性が悪く実
際の治療用としては不適であったり、作用に選択特異性
があり、毒性も強い等の欠陥があった．又、工業的生産
性に乏しいものが多いのが実情である． 本発明は、これらの欠陥のない細胞増殖促進性タンパク
質とその単離方法を提供することを目的とするものであ
る． （課題を解決するための手段） 以上の目的を達成するために、本発明ではほ乳動物ハー
ダー腺に含まれる細胞増殖促進性タンパク質を提案する
ものである． 本発明は、モルモットから近似の蛋白質の存在を確認し
ていたが（特願昭６３−１４３２２号）その後、多数の
動物検体を使用し、さらに詳細に検討し、本発明を完或
した． このタンパク質は、以下のような物理科学的性質を有し
ている． ＜Ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量が１３０００±１０００ （Ｂ）等電点が４．５〜５，５ （Ｃ）メチオニン残基を１とした場合の残基数がアスパ
ラギン及びアスパラギン酸として２．８、グルタミン及
びグルタミン酸として１．６、グリシンとして９，１、
メチオニンとして１．０、アラニンとして２．５、イン
ロイシンとして３、５、セリンとして１３．３、ロイシ
ンとして３．２、リジンとして１１，８、バリンとして
２．４である． 本発明のタンパク質は、哺乳動！ｔｋ　（牛、ブタ、モ
ルモット等）ハーダー腺脱脂抽出液を、イオン交換樹脂
、色素結合樹脂、分子ふるい樹脂及び逆相クロマトグラ
フィー用樹脂を用いたクロマトクラフィーにより単離す
ることができる．単離されたタンパク質は、安定化組或
物となし、細胞損傷による各種疾患例えば、肝臓疾患、
潰瘍、創傷等、ヒト及び動物の疾病の治療用医薬を提供
することができる． なお、各種製剤調製にあたっては、本発明の細胞増殖促
進性タンパク質が極めて不安定であることから、グリセ
ロール類あるいはアルブミン等のタンパク質を安定化剤
として用い、安定化された組成物の形で実際には利用さ
れる．グリセロール類としては、グリセリン、ポリエチ
レングリコール等が利用可能である． （発明の効果） 本発明の細胞増殖促進性タンパク質はヒト及び種々の有
用細胞の継代維持及び無血清培地での培養が可能である
．これらの性質を利用して、人工皮膚や人工肝臓、並び
にコラーゲンの生産には特に有効である． また、本発明を医薬として用いる場合は、具体的には細
胞損傷性の各種の疾患、例えば肝臓疾患、潰瘍、皮膚疾
患（肌荒、火傷、凍傷、しもやけ等）に有効である．こ
の他、皮膚の移植時の＃ｆｌ　ｌ　Ｍ活化のための前処
置剤としても利用できるものである。

本発明の細胞増殖促進性タンパク質を含有ずる医薬の調
製にあっては、安定化された組或物を、そのまま利用す
ることもできるが、賦形剤を添加して、粉末化したり、
さらには、造粒し゜ζ、顆粒剤、錠剤等に、さらには外
用剤の形に製剤化することができる． 本発明の戒人に対する一日投与量は１０ｎｇ〜１００■
程度が望ましい。

（実施例等） 次に試験例、製剤例に関連して、本発明を更に詳細に説
明する。

実施例 （細胞増殖促進性タンパク質の分離精製等）（１）細胞
増殖促進活性の測定 ヒト胎児肺線維芽細胞（ＴＩＧ−３）をトリプシン処理
によってシャーレから剥がした後、亜鈴を含まないブタ
インスリン〈５μｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（
１μｔ　／　ｍｌ　）とデキサメサゾン（１０ｎｇ／　
ｍｌ　）を含むＧＩＢＣＯ社（米国）のＨＣＢＤ−１０
４倍地に７．５　Ｘ　１０４ｃｅｌｌｓ　／　ｍｌにな
るように調製して、８０μ１つつ９６穴プレートに分注
する．この状態で５％二酸化炭素を含むインキュベータ
ー中で３７℃で２〜３日培養して細胞がコンフルエント
な状態になったところで活性測定に用いる．ここに０．
１４Ｈ　ＮａＣｌを含む２０ｌＨＴｒｉｓ−１１ｃＩ，
ｐｆｌ７．８に溶解した３１１一チミジンｆ９　１Ｃ　
ｉ　／ｎｎｏ　ｌ　，Ａｎｅｒｓｈａｎ社）とサンフ゜
ノレを各々１０μ１加えて更に３７℃でインキュベーシ
ョンを４８時間行う． ４［ｆｌ胞はＨＢＳ−チミジン（０．　１４８　ＮａＣ
ｌ，　１０１１８　ＫＣＩ，　１１１８ＥＤ丁＾，　１
ｎＨチミジンを含む１０ｎＨ　ＨＥＰＥＳ，ＤＨ７．２
）で洗浄した後１００μｌのトリグシン（２０Ｕ）を加
えて３７゜Ｃで１０分間インキユベーションした後、セ
ミオートマチックセルハーベスターを用いて、Ｗｈａｔ
ｎａｎ社のＧＦ／Ｃフィルターにトラップする．このフ
ィルターにトラップされた放射活性を測定する．サンプ
ルの稀釈は２０ｍＨ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ７．８に
、５％グリセリンと５■／ｍｌのＢＳＡを含む溶液で行
った．（　２　＞　４［ｌＩ胞増殖促進性タンパク質の
分離精製哺乳動物から得たハーダー腺７０ｆを切り刻ん
だ後、０．１５Ｈ　Ｎａｃｌ，　　５％グリセリンを含
むＨＥＰＥＳバッファ一、ｐＨ７．２　　（以後’ｒ”
ＧＢと略す）の中でホモゲナイズする。その後２０，　
ＯＯＯｘｇ、１時間の遠心によって組織残渣を除き旧１
１ｉｐｏｒｅ社のＨ＋ｌｔｅｘｔｌＡフィルターを通し
て滅菌を行った， この粗抽出液をあらかじめＴＧＢで平衡化しておいたＴ
ＳＫ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（イオン交換樹脂）のカラム
（２．ＩＸ１５ａｎ）にかけて、ＴＧＢで洗浄する．こ
のカラムを０．１５　〜０．８０Ｈ　ＮａＣｌのリニア
ーグラジエントで溶出する画分を３　ｍｌづつ分収しＢ
ｉｏ−Ｒａｄ社のタンパク質測定キットによってタンパ
ク質量を、また上記（１）の方法に従って細胞増殖活性
の測定を行った．その結果を第１図に示す。

細胞増殖活性はＯ、２〜０．３５Ｈ　ＮａＣｌの位置に
溶出されてきていることかわかる。次にこの画分を集め
０．２Ｈ　ＮａＣｌを含むＴＧＢで予め平衡化したブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ　　（色素結合樹脂）のカラ
ム（２．　４　ｘ　２４Ｃ！＋１　）にかけた．カラム
はＯ、２８　ＮａＣｌを含むＴＧＢで洗浄した後２５０
ｍｌの０．６Ｈ　ＮａＣｌを含むＴＧＢで洗浄し、更に
２．２Ｈ　ＮａＣｌを含むＴＧＢで溶出を行い４ｍｌづ
つ分取し、上記のようにタンバク質量と細胞増殖活性の
測定を行った．この時のクロマトパターンを第２図に示
す．この際の細胞増殖活性は両分番号２４〜２７に溶出
された．更にこの活性画分を１。５８　ＮａＣｌを含む
スーパーロース１２（分子ふるい樹脂）のカラムｆｌ．
６Ｘ５０ａｎ）にかけてゲルろ過を行い（流速１ｌ１／
分）　１　ｍｌづつ分取し上記のようにタンパク質量と
細胞増殖活性の測定を行った。この時のクロマトダラム
を第３図に示す。

この際の細胞増殖活性は画分番号４０〜４１に溶出され
た．更に、この画分を脱塩を目的に、アクアボア８０−
３００カラム（逆相クロマトグラフイー用樹脂、１　ｍ
ｍ　ＩＤｘ　３（Ｉｎｎ　）にかけ、０．０５′ＡＴＦ
Ａを含む０〜７０％・アセトニトリルの９０分間のリニ
アクラージエント流速１ｍｌ／分で溶出したところ、ア
セトニトリル濃度４０〜４５％のところに単一ピークと
して活性画分を得た（第５図）． この段階で１８％のＳＯＳ−ＰＡＧＥ　（ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）を行ったところ分子量１３０００
±１０００の位置にシングルバンドとして細胞増殖促進
性タンパク質か検出され精製を終了した．なお、この発
明に係るタンパク質の分子量の決定は分子量マーカー（
ＢＳＡ　６７，０００、ＯＶａｌｂｌＪｌｉｎ　４３，
０００　Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　２０，
１００　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｌｅ　１２４００　Ａｐｒｏ
ｔｉｎｉｎ　ｅ，ｓｏｏ）について１８％のＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、
その泳動距離を上述の本発明品の泳動距離と比較するこ
とによって行った（第６図参照）． 以上の精製の各ステップにおける精製量等をまとめて第
１表に示す． 第１表 （３）等電点の測定 ブルーセファロー・スＣＬ−６８の活性画分２００　＋
３　ｚをＬＫＢ社の８１０１のカラムを用いてシヨ糖密
度勾配中に１％のアンフオライト（ＬＫＢ社）を含む溶
液中で５００Ｖ、４８時間、４℃の条件下で等電点電気
泳動を行い、細胞増殖促進活性が最も強いピークの等電
点を求めた．その結果を第４図に示す。この図から等電
点は４．５〜５．５と算出された．（４）アミノ酸組成
分析 ６Ｎ　ＨＣｉ　１　ｎｉｌに溶解したスーパーロース１
２の活性画分１■を、ドライアイスーアセトンで凍結後
、充分脱気した．これを封管し、１１０±１℃で２４時
間酸加水分解した．室温に冷却後開管し、ロータリーエ
バボレイターで減圧乾固し、０．ＯＩＮＮａＯＨ液を０
．５ｍｌ加えて室温に四時間静置した．更に、０．　０
２Ｎ塩酸１，５ｍｌを加え、その５０μ１を日立８３５
形高速アミノ酸分析計により測定した．その結果、第２
表に示す値を得た． 第２表 試験例 １；細胞増殖促進活性の測定 （１）線維芽細胞に対する増殖促進活性既に公知である
細胞増殖促進因子の酸性ＦＧＦとの比較をするためにＦ
ＧＦ感受性株のヒト梢帯静脈由来細胞κ２１１細胞を１
００１μＥ／＋ｍｌヘバリン、１０　ｎｇ／ｍｌＥＧＦ
及び１０Ｘのウシ胎児血清を含むＨＣＢＤ−１Ｏ４培地
で３７℃で培養した時の結果を第７図のＡに示した。こ
の際、本発明物質を含むブルーセファロースの画分（１
５０μｔ　／　ｍｌ　）を０．８〜５０μ１加えた時の
細胞数を○で示した．また、同じ倍地中に７０ｕ　ｔ　
／　ｍｌの酸性ＦＧＦを加えた時の細胞数を●で示した
． 第７図のＢには、Ｋ２１１細胞と同じ培地条件で培養し
なＦＧＦ感受性ヒト内皮細胞株＾２Ｔ２細胞に本発明物
質を含むブルーセルファロースの画分く１５０μｇ／ｍ
ｌ）を０．８〜５０μｌ加えたときの細胞数を○で示し
た。また、同じ培地中に７０μｚ／ｍｌの酸性ＦＧＦを
加えた時の細胞数を●で示した．第７図のＣには５μｉ
ｒ　／　ｍｌのインスリンとトランスフェリン及び１０
ｎｇ／ｍｌデキサメサゾンを含むＨＣＢＤ−１０４培地
中でヒ）〜胎児肺由来線維芽細胞ＴＩＧ−３　ＭＡ胞を
用いてブルーセファロースの両分（１５０μｇ／ｍｌ）
を０．８〜５０μ１加えた時の細胞数を○で示す。

この結果より、ＦＧＦ感受性のＫ２ＴＩ細胞やＡ２Ｔ２
細胞には殆ど細胞増殖促進活性を示さないが、ＴＩＧ−
３細胞に対して強い増殖促進効果を示すことがわかった
． また、第３表には本発明物質と種々の細胞増殖因子を用
いて、ＦＧＦ感受性株、ヒト膀帯静脈由来内皮細胞Ｋ２
１２細胞及びヒト胎児肺由来線維芽細胞ＴＩＧ−７細胞
の細胞増殖に与える効果を見た。Ｋ２１２細胞は、第７
図でのｋ２１１細胞と同じ培地に、ＴＩＧ−７４１［Ｉ
Ｍ［第７図テノＴＩＧ−３　４１Ｂ胞ト同ｅ培地ニ、１
０ｘｌＯ３Ｃｆ３１ｌＳ／ｃＪの濃度で本発明物質もし
くは種々の細胞増殖因子とともに、２４穴プレートに植
え込み、４日後細胞数を計数した（　ｘ　１０’　ｃｅ
ｌ　Ｉｓ／ｗｅｔ　ｌ　）．なお、塩基性ＦＧＦは１０
ｎｇ／ｍｌ、酸性ＦＧＦは１００ｎｇ／　ｍｌ、ＥＧＦ
は２５μｇ／　ｍｌ、ＰＤＦは２０ｎｇ／ｍｌ、本発明
物質は１０ｎ＋ｒ／ｍｌで試験した．その結果、本発明
物質は分子量、等電点の観点からＦＧＦに近いにも拘ら
ず、ＦＧＦ感受性Ｋ２Ｔ２細胞にはその活性をほとんど
示さず、その作用はＦＧＦとは異なるものであることを
示唆した．第３表 種々の細胞増殖促進因子のＫ２１２及びＴＩＧ−７細胞
に対する作用第４表 この他、ウサギ角膜由来細胞やウマ皮膚由来細胞等に対
しても強い増殖促進効果を示すことかわかった。

（２）或熟ラット初代培養肝細胞に対する効果ウィスタ
一系ラット（１８０〜２０（ｌｒ）を用いてコラゲナー
ゼ連続法（Ｔａｎａｋａ，　Ｋ，　ｅｔａ　ｌ．　，　
Ｂ　ｉｏｃｈｅＩ！．　．　８４９３７〜、９４６，　
１９７８）により肝実質細胞を分離、調製した． 増殖促進効果は中村等の方法（特開昭６０−４５５３４
号）に従って３０−チミジンのＤＮＡ画分への取込活性
（ｄｐｌ／　ｗ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｈｒ）として測定し
た結果を第４表に示す． この結果から明らかのように本発明物質は従来の肝細胞
の細胞増殖促進因子として知られているＥＧＦより強い
増殖促進効果をもっていることがわかる． （３）実験的切開創傷に対する治癒効果ＳＤ系ラヴトく
雄性、９週齢）の背部を剃毛後、７０％アルコールでそ
の部位を消毒し、エーデル麻酔下にて背部正中線沿って
メスで表皮をＩＣＩＩ１の長さに切開し、実験的切開創
傷を作製した．次いで試験化合物を塗布し、実験開始後
、３日、６日、ＩＯ日目の創傷部位の状態を肉眼的観察
を行った。

なお、試験化合物は、製剤例４に従って調製したものを
使用した． 傷口の深さの観察結果は第５表の如くであった．第５表 ・創（＠治癒仮定の肉眼的初見における基準は、傷の深
さ　浅い　、中間＋、探いー、とした。

・数値砒例数で、各群の例数は■０例である．対照群で
は１０日目でもぐ浅い）は３例しか認められなかったか
、試験群では９例の動物に（浅い）が認められ、著しい
θり傷部位の改善傾向が認められた。

２；製剤例 製剤例ｌ（注射剤） 本発明！ｔｉ質　　　　　　　　　　１５０μｇ酢酸ナ
トリウム　　　　　　　　　　３■バラオキシ安息香酸
メチル　　　　　２■グリセロール　　　　　　　　　
　３０ｎ＋ｇポリソルベート　　　　　　　　　　３０
μｇヒトアルブミン　　　　　　　　　　５■注射用蒸
溜水　　　　　　　　　：ａｉ水酸化ナトリウム　　　
　　　　適　量ｐｌ１７．４に調製 上記混合割合で無菌のろ過膜フィルターを通して２ｍｌ
づつアンプルに分注して密封した。

製剤例２（練歯磨） 不冫容性メタリン酸ナトリウム　　４０．０％グリセリ
ン　　　　　　　　　ｉｏ．　ｏ％ソルビトール　　　
　　　　　　１０．０％力ルボキシメチルセルロース　
　　１．０％ラ々リル硫酸ナｌ〜リウム　　　　　２，
０％サツカリンナトリウム　　　　　　０．５％香′ｌ
４０。５％ 本発明物質　　　　　　　　　　　ＩＰＰＭ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　残　　部上記組或
のものを通常の製造法により製造して練歯磨を得た． 製剤例３（咳そう剤） エチルアルコール　　　　　　　１０．０％サッカリン
ナトリウム　　　　　　０．１％香料　　　　　　　　
　　　　　　１．０％ポリオキシエチレンソルビタン ラウリン酸エステル　　　　　　　１．０％本発明物質
　　　　　　　　　　０．０００１ＰＰＭ水　　　　　
　　残部 製剤例４（０／Ｗクリーム） 本発明物質　　　　　　　　　　　０．０１％流動パラ
フィン　　　　　　　　１０．０％ブチレングリコール
　　　　　　　５．０冗ミッヮウ　　　　　　　　　　
　　　２．０冗セタノール　　　　　　　　　　　４，
０％ラノリン　　　　　　　　　　　　２．０％スクワ
ラン　　　　　　　　　　３０．０％４ パラベン ０．２２≦ ポリオキシエチレン モノソルビタンラウリン酸 エステル　２．０％ 精製水　　　　　　　　　　　　残　部製剤例５（口紅
〜リップ製剤） 本発明物質　　　　　　　　　　０．０Ｏ５％バラフィ
ン　　　　　　　　　　２．０％ヒマシ油　　　　　　
　　　　　　５５．Ｏ％ラノリン　　　　　　　　　　
　１１．０％ミリスチン酸イソブロピル　　　１０．０
％酸化チタン　　　　　　　　　　　２　．　０　＋１
７赤色２０２号　　　　　　　　　３，０％香料　　　
　　　　　　　　　　　（ｊｌ％ロウ類　　　　　　　
　　　　　残　部

【図面の簡単な説明】

第１図は精製過程におけるＩＳκＤＥＡＥ−５ＰＷ力ラ
ムの７容出パターンを示す。●がタンパク質量を、○が
３Ｈ−チミジンの取込量を放射活性で示す。 第２図は￥？Ｉ製過程におけるブルーセファロースＣＩ
６Ｂの溶出パターンを示す。 第３図は精製過程におけるスーパーロース１２力ラムの
溶出パターンを示す． 第４図は等電点電気泳動のパターンを示している。 第５図は画分番号４０〜４１のアクアボアＢＵ−３００
力ラムの溶出パターンを示す． 第６図は本発明に係るタンパク質と分子量マーカーとの
電気泳動距離の比較図を示す。 第７図（Ａ）、（Ｂ＞、（Ｃ）はＫ２Ｔ１、Ａ２Ｔ２及
び゛ｒ［Ｇ−３細胞に対する細胞増殖促進活性を測定し
た結果を示す． 第２図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記物理化学的性質を有する哺乳動物ハーダー腺
   に含まれる細胞増殖促進性タンパク質。 （Ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
   子量が１３０００±１０００ （Ｂ）等電点が４．５〜５．５ （Ｃ）メチオニン残基を１とした場合の残基数がアスパ
   ラギン及びアスパラギン酸として２．８、グルタミン及
   びグルタミン酸として１．６、グリシンとして９．１、
   メチオニンとして１．０、アラニンとして２．５、イソ
   ロイシンとして３．５、セリンとして１３．３、ロイシ
   ンとして３．２、リジンとして１１．８、バリンとして
   ２．４である。
2. （２）ヒト及び種々の動物由来の有用細胞の継代維持及
   び無血清培地での培養に有効である特許請求の範囲第１
   項記載の細胞増殖促進性タンパク質。
3. （３）肝細胞に対する強い増殖促進効果を有する特許請
   求の範囲第２項記載の細胞増殖促進性タンパク質。
4. （４）ほ乳動物ハーダー腺脱脂抽出液を、イオン交換樹
   脂、色素結合樹脂、分子ふるい樹脂及び逆相クロマトグ
   ラフィー用樹脂を用いたクロマトグラフィーにより特許
   請求の範囲第１項記載のタンパク質を分離することを特
   徴とする単離方法。