JPH0399099A - ポリペプチドおよび該ポリペプチドを有効成分とするプロテアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上のｆｌ用分野］ 本発明は、生体内に存在する種々のブロテアゼの活性を
阻害し、プロテアーゼ活性に起因する諸疾患の治療薬と
して有効な新規なポリペプチドに関するものである。

［従来の技術および課題コ 生体内に存在するプロテアーゼにはトリブシン、キモト
リブンン等の消化酵素の他に蛋白質の生合戚の過程にお
いて蛋白質の修飾・成熟を行う細胞内プａテアーゼがあ
る。特に細胞内プロテアーゼが無秩序に蛋白質の分解を
始めれば、生体自体の存在が危ぶまれることから、細胞
内プロテアーゼ活性は常ζ二制御されていなければなら
ない。

また、特定のウイルス増殖に関与するプロテアーゼ活性
を抑えることはウイルス増殖の抑制につながることにな
る。

そこで、プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ阻害
剤の開発が望まれていた。

ＥＲ題を解決するための手段］ 本発明者等はストレブトマイセス　アルボグリセオラス
（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕ
ｓ）Ｓ−３２５３の培養液から発見され単離された下記
式 Ａｓ　ｐ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　ｌａ−Ｆ’ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ　ｌａ
−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ　−
Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｖａ　ｌ−Ｓｅｒ−Ａ
　ＩａＴｈｒ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍａｌ−Ｔｈｒ−ＬｅｕＴｈｒ−
Ｃｙｓ　−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｈｒ−Ｈ　ｉｓ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌａ−Ａ
　Ｉ　ａ−Ｇ　ｌｙ−Ｓｅｒ−Ａ　ｉａ−Ｃｙｓ　−Ａ
　ｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ＩａＶａ　
ｌ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ　
ｙＧ　Ｉ　ｕ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｍｅｔ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｙ　ｒ−Ａｓ　ｐ−
ＰｒｏＶａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−４ａ　ｌ
−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ　ｌ−Ｔｒｐ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ
　ｌ　ｎＧｌｙ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｉｕ−ＭｅＬ−＾ｓｎ−Ａｌａ
−１１ｉｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ で表されるアミノ酸配列を有するポリベブヂドが、セリ
ンプロテアーゼであるサブチリシンを強く明害すること
に着目し、このポリペブチドのアミノ酸配列を変換する
ことによりプロテアーゼに対する特異性を変換さ０・る
法則を確立し、更にこの法凹にロリって新たなプロテア
ーゼ阻害活性を有するポリペブチドを構築した。すなわ
ち本発明は下記式（Ａ） Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−＾１ａＬｅｕ−Ｖａ　
Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　ｌ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ
　−Ｇ　ｌｙ−Ｖａ　ｌ　−Ｓｅｒ　−Ａ　Ｉ　ａＴｈ
　ｒ−Ｔｈｒ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉ
ｕ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ
Ｔｂｒ−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｔｈ　ｒ−１ｆ　ｉ　ｓ−
ＰｒｏＡｌａ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｃｙ
ｓ−＾１ａ−＾ｓｐ−Ｌｅｕ−ＡＩ．ａ−ＡｌａＶａｌ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−＾ｓｎ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ・−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ
−Ｖａ　Ｉ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｎｅｔ−Ｖａ　
Ｉ　−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＰｒｏＶａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ　−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ　ｌ
−Ｔｒｐ−Ｃ　ｌ　ｕ−Ｇ　ＩｎＧ　Ｉ　ｙ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ　−Ｓｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｕ−
Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ　−Ｐｈｅ−ＳｅｒＡｓ　ｎ−Ｇ　ｌ
　ｕ−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａ　ｌａ
−１１　ｉ　ｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｓｅｒ−ＳｅｒＶａｔ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　（Ａ
　）（ただし、７３番目のアミノ酸残基がＰｈｅ，　Ｔ
ｒｐ，Ｇｌｕ，　　＾ｓｐ１Ｓｅｒ，　　Ｔｈｒ１Ｇｉ
ｎ，　　＾ｓｎ，　　ＩｉｉｓＳＡｌａ，　　Ｖａｌ，
！Ｉｅ，　ＧＩｙｓ　ＰｒｏもしくはＣｙｓに変換され
ているか、７３番目のアミノ酸残基がＬｙｓもしくはＴ
ｙｒのとき７０番目のアミノ酸残基がＧｌｙ％Ａｌａも
しくはＰｈｅに変換されているか、 ７１番目および１０１番目のアミノ酸残基がＳｅｒに変
換されているか、 または２９番目のアミノ酸残基がＡｌａ，　Ｌｙｓもし
くはｎｅｔに変換されている。） で表されるポリペプチド（以下、本発明のポリペブチド
という。）および本発明のポリベプチドを有効成分とす
るプロテアーゼ阻害剤である。

本明細書において、簡略化のために以下の記号を用いる
。

Ａｌａ　　　　　　Ｌ−アラニン Ａｒｇ　　　　　Ｌ−アルギニン Ａｓｎ　　　　　Ｌ−アスパラギン ＾ｓｐ　　　　　Ｌ−アスパラギン酸 ＣｙｓＬ−システイン Ｇｉｎ　　　　　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ １１ｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ ＰＥＧ ＳＤＳ Ｌ−グルタミン酸 グリシン Ｌ−ヒスチジン Ｌ−イソロイシン し一ロイシン し−リジン Ｌ−メチオニン Ｌ−フェニルアラニン し−ブロリン Ｌ−セリン し−スレオニン Ｌ−トリブトファン し−チロシン Ｌ−バリン アデニン シトシン グアニン チミン ポリエチレングリコール ドデシル硫酸ナトリウム ＴＡＭＥ ｓＡＡＰＦ−ＰＮＡ ’ｒ　　Ｌ　Ｍ　Ｅ １３　　Ｔ　Ｅ　Ｅ ｄＡＴＰ ｄＣＴＰ ｄＧＴＰ ｄ　　Ｔ　Ｔ　　Ｐ ｂｐ Ｓ　Ｓ　Ｃ ＳＳＰＥ ＹＥＭＥ培地 ＴＳＢ ＲＮａｓｅ　　Ａ トシルアルギニンメチルエステル Ｎ−スクシニルーＡｌａ一＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ
−ニトロアニリド トンルリジンメチルエステル ペンゾイルチ口シン エチルエステル デオキシアデノシン三リン酸 デオキシシチジン三リン酸 デオキシグアノシン三リン酸 デオキンチミジン三リン酸 塩基対 Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ＣｉｔｒａｔｅＳｔ
ａｎｄａｒｄ　Ｓａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｅ
ＤＴＡＹｃａｓＬ　Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｍａｌｔ　Ｅｘｔ
ｒａｃｔ培地 Ｔｒｙｐｔｏｎ　　Ｓｏｙａ　　Ｂｒｏｔｈリボヌクレ
アーゼＡ 本発明のポリベプチドは、上記式で表されるポリベブチ
ドをコードするＤＮＡを有するプラスミドを用い、カセ
ット変異法または部位特異的変異法により目的とするア
ミノ酸配列をコードする変異プラスミドを構築し、該変
異ブラスミドにより放線菌を形質転換し、当該放線菌を
大量培養することにより製造することかできる。

ブラスミドとして特にｐｓＴ５２を用いるのが好ましく
、このｐｓＩ５２は、ストレブトマイセス　アルボグリ
セオラス　Ｓ−３２５３の染色体ＤＮＡを制限酵素のＳ
ａｌＴおよびＴ３ｇｌｌｌで切断した１　．　８　ｋｂ
ｐの断片（以下、ＳＳＩＤＮＡという。

）を、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３　２　２のＳａｌｌ
−ＢａｒｎＨＩ断片にクローニングして得られたｐＳｒ
３０を更にＳａｌｒ−Ｈｉｎｄｌ’Ｕで切断し、この断
片を大腸菌のブラスミドｐＵｃ１８のＳｍａ　ｒ？４位
に挿入して得ることができる。

更に、得られたｐｓＩ５２を用いてハナハン（　ｔｌ　
ａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ　）の方法に従って大腸菌の形
質転換を行い、培養し、集菌後、アルカリーＳＤＳ、５
Ｍ酢酸カリウム処理し、エタノール沈澱した後、沈澱物
をＲＮａｓｅＡ処理、ＰＥＧ沈澱して大量のｐｓｒ５２
を得ることができる。

ブラスミドｐｓＩ５２の製造工程を第１図に示す。

カセット変異法 （１）第２図に示すように、ｐＵｃＩ８のＡａｔｌＩ−
Ｘｂａｌ断片（２　．　２　ｋｂｐ）（ＩＩ　）、ｐｓ
ｒ５２のＡａｔｌｌ−Ｘｂａｌ断片（１３２ｈｐ）から
Ａ　ａ　ｔ　ＩＩ−１−ｒｐ　ａ　Ｉｆ断片を除いた１
０７ｂｐのＳＳＴＤＮＡ断片（ｌＩ［）および下記に示
す７３番目が種々のアミノ酸になるように設計した二本
鎖ＤＮＡ断片のライゲーションにより、変異ｐｓＩＡＸ
の混合物を構築する。

更に変異ｐｓＩＡＸの混合物を大腸閑に導入し、それぞ
れのコロニーからブラスミドを調製する。

７３番目がどのようなアミノ酸残基に変換したプラスミ
ドが得られたか、ＤＮＡの塩基配列決定法により決定す
る。

ブラスミドを用いたグイデオキシ法によるＤＮＡの塩基
配列決定法は服部らの方法を参考に行うことができる。

すなわち、ブラスミドをアルカリで一本鎖に変性後、プ
ライマーをアニーリングさせる。これに３２ｐまたは３
５Ｓで標識したｄＣＴＰを加え、４等分しそれぞれＡ，
Ｇ，Ｃ，Ｔの反応をさせる。これを７％ポリアクリルア
ミド／７Ｍ尿素のゲル中で電気泳動した後、オートラジ
オグラフィーを行う。［”Ｓ　］ｄ　Ｃ　Ｔ　Ｐを用い
た場合はかならずゲルを乾燥し、変異ｐｓＩＡＸおよび
後述の変異ｐＳＩＳＡを用いた場合、ブライマーとして
はリバースブライマーを用いる。

（２）第３図に示すようにｐＳＩ５２をＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔｌで切断した後、エクソヌクレアーゼ■を作用
させ、ＳＳＩＤＮＡの５′側非翻訳領域のうち、発現に
影響のない部分を取り除いて作成したｐｓ１１８８プラ
スミドから、Ｓｐｈｌ−Ａｌｕｌ断片（９　５　０　ｂ
ｐ）を切り出すことにより、３′側非翻訳領域の不要な
部分を取り除く。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりＡａｔ
Ｕ部位を消去したｐＵＣＩ８に、この断片を組み込んで
得たプラスミドｐＳＩＭＬからＳｍａＩ−Ａａｔｌｌ断
片（２１０ｂｐ）を切り出し、これをｐＵＣ１ＢのＡａ
ｔｎ−ＳｍａＩ断片（２　．　２　ｋｂｐ）にサブクロ
ーニングしてプラスミドｐｓｉｓＡを構築する。

次にプラスミドｐｓ　Ｉ　ＳＡより、ＡｖａｌＢｓｔＥ
ＩＩ断片（ＩＩＩ）と、ベクター側の断片（ＩＶ）を得
る。断片（ＩＩ［）はさらにＨｐａｌｌで切断し、２９
番目の近傍の領域を取り除いたＡｖａｌＬｌｐ　ａ　［
１断片（Ｖ）を得る。そして、断片（Ｉｔ／）、断片（
Ｖ）および２９番目がＬｙｓ，　Ｍｅｔ，　Ａｌａにな
るように設計した下記の二本鎖ＤＮＡ断片のライゲーシ
ョンにより、変異ｐｓ［ｓＡの混合物を構築する。

この混合物を大腸菌に導入し、以下に示すような合成オ
リゴヌクレオチドをプローブとして、２９番目をＬｙｓ
ＳＭｅｔ，　Ａｈａに変換したプラスミドを持つ大腸菌
をコロニーハイプリダイゼイションにより探し出す。変
異の導入は、ＤＮＡの塩基配列決定により確認する。

ＡＣＣＧＧＡＡＸＸＸＧＣＧＧＴＣＡ ＸＸＸ−ＡＡＧ：ｌ，ｙｓ ＡＴＧ：Ｍｅｔ Ｇ　　Ｃ　　Ｃ　　：　　Ａｌａ 大腸閑のコロニーハイブリダイゼイションの方法は、マ
ニアナイスらの方法を参考に行うことができる。すなわ
ちニトロセルロース・フィルターに生やした大腸菌コロ
ニーを、ＳＤＳ、アルカリ処理した後、２ＸＳＳＰＥ等
で中和し、真空下、８０℃で焼き付け、ＤＮＡをフィル
ターに固定する。細胞の残骸を除きプレハイブリダイゼ
インヨンを３７℃で１時間行った後、合成才リゴヌクレ
オチド（３２Ｐで標識）をブローブとして入れ、所定の
温度で一晩ハイブリダイゼイションを行い、６ｘｓｓｃ
、３７°Ｃで３０分間洗浄を２回繰り返し、乾燥させた
後、オー１・ラジオグラフィーを行い、陽性のコロニー
を得る。

部位特異的変異法 （１）カセット変異法により得られなかったものに関し
ては、井上らによる合成ヌクレオチドとブラスミドを用
いた部位特異的変異法により調製する。第４図に示すよ
うに、第２図におけるｐｓＩＡＸをＳｃａ　Ｉで切断後
Ｂａｌ３１ヌクレアーゼでＩＯＯｂｐほど削った断片、
ｐｓｒＡＸをＡａｔＩＩで切断後Ｂａｌ３１ヌクレアー
ゼで３００ｂｐほど削った断片、および５′をリン酸化
した変異導入用の１７ｍａｒの合成オリゴヌクレオチド
（５　０　０倍モル過剰）を混ぜ、加熱により一本鎖に
変性後、徐冷し、ヘテロデュブレックス（ｈｅｔｅｒｏ
ｄｕｐｌｅｘ）を形成させた。このヘテロデュプレック
スの一本鎖部分を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片、４種類のｄＮＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ、ＡＴＰにより修復し、大腸菌に導入する。これ
らのコロニーの中からＫ’Ａが導入されたブラスミドを
コロニーハイブリグイゼイションにより探し出し、陽性
コロニーからプラスミドを凋製し、ＤＮＡの塩基配列決
定法により変異が導入されたことを確認し，変異ｐｓｌ
ＡＸを得る。

変異導入用の１７ｍａｒの合成オリゴヌクレオヂドの塩
基配列を以下に示す。

Ｇ　Ｔ　　Ｇ　　Ｃ　　Ｃ　　Ｃ　Ｇ　　Ｘ　　Ｘ　　
Ｘ　　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃ　　ＧＸ　Ｘ　Ｘ　＝　
Ａ　Ａ　Ｇ　　：　　Ｌｙｓ　　　　　　Ｇ　Ｃ　Ｃ　
　：　　ＡｈａＣ　Ａ　　Ｇ　　：　　Ｇｉｎ　　　　
　　Ｇ　　Ｔ　Ｃ　　：　　ＶａｔＡＡＣ　　：Ａｓｎ
　　　　　　　ＣＣＧ　　：　　ＰｒｏＧＡＣ　　：　
　＾ｓｐ　　　　　　Ｔ　Ｇ　Ｃ　　：　　ＣｙｓＴＴ
Ｃ：Ｐｈｅ （２）７３番目のアミノ酸残基かＭｅｔ，　ＬｙｓＳＴ
ｙｒ，Ｇｌｙ，　ｌｉｅであるプラスミドに対する７０
番目のアミノ酸残基の改変は、変異導入のために下記の
１７ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドを用いる他は（＋
）と同様にして行うことができる。

ＣＴＧＡＣＧＴＣＸＸＸＴＧＣＣＣＧ ＸＸＸ＝ＧＧＣ：Ｇｌｙ ＧＣＧ：＾１ａ ＴＴＣ：Ｐｈｅ （３）７１番目および１０１番目のアミノ酸残基の改変
は、ｐｓＩＡＸをＡａｔｌｌで切断するかわりにＸｂａ
　Ｉで切断後Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで３ｏｏｂｐ削っ
た断片およびＳｃａ　ｌで切断後Ｂａｌ３１ヌクレアー
ゼでＩ００ｂｐ削った断片を用い、（１）と同様にして
１０１番目の変異を導入後、該プラスミドに７１番目の
変異を導入する。

それぞれの変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチドは
以下の如くである。

１０１番目の変異導入 ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡ ７１番目の変異導入 ＣＧＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＴＧＧ 以上のようなカセット変異法および部位特異的変異法に
よって変異を導入した変異ｐｓＩＡＸから再構築したＳ
Ｓ｛　　ＤＮＡを多コピーヘクターｐＩＪ７０２に挿入
して得られるブラスミドを用いて放線菌の形質転換を行
い、目的とするポリベプチドを生産させる。

放線菌の形質転換の方法は、ハンター（Ｉｌｕｎｔｅｒ
）の方法を参考に行うことができる。すなイつち、放線
菌の胞子をＹＥＭＥ培地等の培地に接種し、２５〜３５
℃で１〜４日間培養し、集閑後、リゾチームを働かせて
放線菌のべブヂドグリカン層を消化して得られるプロト
ブラストに変異を導入したプラスミドを加えた後、ＰＥ
Ｇ　Ｉ　５　０　０を含む緩衝液を加えてＤＮＡをプロ
トプラスト内に取り込ませる。これをＲ２プレート｛こ
まき、１日かけて膜を再生した後、抗生物質による選択
をｉＴう。

用いる放射菌としてはストレブトミセス　１ノビダンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）６　
６　ｈ＜好適である。

得ら゛れた形質転換体は、プレート上で抗ＳＳ■抗体と
の沈降線の形成により、本発明のボＩＪペプチドの分泌
を確認する。

分泌が確認された放線菌のコロニーを、そのままあるい
は胞子形戚プレート上で胞子（ニした後、ＴＳＢ培地等
を用いて大量培ｌ（３００７〜２１２）を行うことがで
きる。

培養後、培養液を遠心分離し、菌体を除Ｌ１た上清に６
０％重量比の硫酸アンモニウムを加え、本発明のポリベ
ブチド等の放線菌の体外１こ分泌された蛋白質を沈澱さ
せ、望朶エ沈澱を更Ｃこ遠尼・処理し、回収した沈澱を
透析およびカラム処理を繰り返すことにより精製するこ
とができる。

カラム処理に当たっては、ＤＥ−３２等のイオン交換体
、セフアクリル　Ｓ−２００等のゲノレ濾過の担体を用
いることができ、イオン交換クロマトグラフイーを行う
場合には、塩化ナトｌノウム等を用いて順次濃度を変え
て溶出させるのが好ましい。

本発明のポリベプチドの設計に際しては、活性を阻害し
たいプロテアーゼの活性部位の部分構造に対して立体的
に相浦に結合しうる構造を有するように設計するのが好
ましい。

また、前述の活性部位の部分構造が不明であるときは、
プロテアーゼが特異的に切断する部位のアミノ酸に相当
するベブチドを、そのプロテアーゼの活性部位に供給す
るように設計するのが好ましい。

次に本発明のポリベプチドが、プロテアーゼ阻害活性を
有することについて実験例を挙げて説明する。

実験例ｌ ４ｍのサブチリシン（１４５ｐｄ）と後記実施例で得た
本発明のポリベプチドを１００７Ｊの０．１Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ９．５）中、３７℃でｌＯ分間プレインキユ
ベーションし、複合体を形成させた。

これに３００ＡＩｆｌの１．３３％カゼイン／０．ＩＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）を加え、３７℃で１０分間
インキユベーションし、活性が残存するサブチリシンで
カゼインを消化させた。更にこれに４００μＱの０．４
４Ｍ｝リクロ口酢酸（ＴＣ／ｌｍ＞を加え、未消化のカ
ゼインを沈澱させた。３７℃で２０分間インキユベーシ
ジンした後、１２．００Ｏｒｐｍ，５分間遠心し上清を
とり、この上清２００ＡＩｆｌに対し１７の０．４４Ｍ
炭酸ナトリウムを加えた後、２倍希釈したフェノール試
薬を２００ｄ加えた。

３７℃で２０分間インキユベーションして発色させ、６
６０ｎｍの吸光度を測定した。サブチリシンの酵素活性
が強ければカゼインがよく消化されるため、上清に多く
のベプチドが移行して６　６　０　７７ｍの吸光度が高
くなる。本発明のポリベプチド存在下、非存在下におけ
る消化後の６　６　０　ｎ７Ｉ１の吸光度をそれぞれＴ
％Ｓ１また本発明のポリペプチド存在下、非存在下にお
いて直接ＴＣＡで沈澱させ、消化させなかった時の６　
６　０　ｎ，の吸光度をそれぞれＣ，Ｂとおくことによ
り、阻害率を次のように算出した。

阻害率（％）一　（Ｓ−Ｂ）−（Ｔ−Ｃ）ｘＩｏｏＳ−
Ｂ 酵素に対する本発明のポリベプチドのモル比がｌ：１に
なる時の阻害率（％）を第１表に示す。

第１表 実験例２ ４ｕ９のトリブシン（１７２ｐｄ）と後記実施例で得た
ポリベプチドを２００７ＪのＯ．ｌＭリン酸綬衝液（ｐ
Ｈ７．０）中、３７℃で１０分間プレインキユベートし
、複合体を形成させ、これに２　０　０ＡＩｆｌの１％
カゼイ：／／０．１ＭＩＪ：／酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を加え、３７℃で２０分間インキユベーンヨンし、活性
が残存するトリブシンでカゼインを消化させた。以下、
実施例１と同様にして阻害率を算出した。その結果を第
２表に示す。

第２表 実験例３ トリブシンのかわりに１膚のキモトリプシン（＋６０ｐ
ｇｄ！）を用いる以外は実験例２と同様にして阻害率を
算出した。その結果を第３表に示す。

それぞれＶ　ｌ．　’Ｖ　ｏとして次式により阻害率を
算出した。

阻害率（％）＝（１−−）ＸＩＯＯ ｖＯ その結果を第４表に示す。

実験例４ ４膚のトリプシン（１７２ｐｄ）と本発明のポリベプヂ
ドを２　０　０Ａの５０ｘＭ｝リス塩酸緩衝液／１朋塩
化カルシウム（ｐＨ８．２）中、２５℃で１０分間イン
キユベーシゴンし、これを８　０　０，ｉＪの１四Ｔ．
　ＡＭＥ／５　０ｘＭ　トリス塩酸緩衝液／Ｉ．Ｍ塩化
カルシウム（ｐｌ｛８．２）に加え（最終濃度：ＴＡＭ
ＥＯ　．　８　ＩＲＭ、トリブシン１７２７７Ｍ）、す
ばやく混ぜ２５℃で２４７ｎｍの吸光度の増加を記録し
、グラフより初速度としての傾きを求める。本発明のポ
リペブチドの存在下、非存在下における初速度を実験例
５ ＩＩ６ｌのリジルエンドペプヂダーゼ（３　３　．３　
ｐｄ）と本発明のポリベブチドを２００−の４　０　ｘ
Ｍ　｝リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５℃でｌＯ
分間プレインキユベーションし、これを８００μｅのＩ
　ｍ’ＡＴ　Ｌ　ＭＥ／４　０　ｍＨ　トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に加え（最終濃度：ＴＬＭＥ０．８ｙ
Ｍ、リジルエンドペブヂダーゼ３３．３ｎＭ）、すばや
く，昆ぜ２５℃で２　４　７　ｎｍの吸光度の増加を記
録し、実験例４と同様にして阻害率を算出した。その結
果を第５表に示す。

第５表 様にして阻害率を算出した。その結果を第６表に示す。

第６表 実験例６ ４ｍのキモトリプシン（１６０ｐｄ）と本発明のポリペ
ブヂドを２００−の０．１Ｍトリス塩酸緩衝１（ｐ｝１
７．８）中、２５℃で１０分間プレインキユベーション
し、これを８００ＡのＩ．２５ｉＭＢＴＥＥ／３７，５
ｉＭトリス塩酸緩衝ｔｉ．／３７．５％メタノール（ｐ
Ｈ７．８）に加え（最終濃度：ＢＴＥＥ１ｉＭ、キモト
リプシン１　６　０７１Ｍ、５　０ｘＭ｝リス塩酸緩衝
液／３０％メタノール）、すばやく混ぜ２５℃で２５６
ｎＩｎの吸光度の増加を記録し、実験例４と同次に本発
明のポリペブチドの投与量および製剤化について説明す
る。

本発明のポリベプチドはそのまま、あるいは慣用の製剤
担体と共に動物および人に投与することができる。投与
形態としては必要に応じて適宜選択して使用され、注射
剤、坐剤、粘膜投与製剤等の非経口剤が挙げられる。

非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の
年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で本
発明のポリペプチドの力値として１日１０〜２　０　０
　＋．Ｕ，までの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射
、坐剤、粘膜投与製剤が適当と思われる。

この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一
般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射
用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロ
コシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌
剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口
剤は安定性の点からバイアル等に充填後冷凍し、通常の
凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥
物から肢剤を再調整することもできる。さらに、必要に
応じて適宜、等張剤、保存剤、防腐剤、無痛化剤、分散
剤、抗酸化剤等を加えてもよい。

その他の非経口投与方法としては、直腸内投与のための
坐剤、粘膜投与製剤、軟膏等の塗布剤等による投与方法
が挙げられる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれにより何等制限されるものではない。

実施例１〜９ ■変異プラスミドの製造 ｐＵｃｌ８のＡａｔＩＩ−Ｘｂａｌ断片（２　．　２　
ｋｂｐ）ｐｓ１５２のＡａｔＩＩ−Ｘｂａｌ断片（１３
２ｂｐ）からＡａｔＩＩ−ＨｐａＩＩ断片を除いたＩＱ
７ｂｐのＳＳＩＤＮＡ断片および７３位のアミノ酸残基
が種々のアミノ酸になるように設計された二本ｍＤＮＡ
の３つの断片のライゲーションにより、変異ｐＳＩＡＸ
の混合物を構築し、グイデオキシ法によりＤＮＡの塩基
配列を決定し、７３位がそれぞれＳｅｒ１Ｔｈｒ，　Ｇ
ｌｕ，　Ｔｒｐ．　Ｉｌｉｓ，　！ｌｅ．　Ｇｌｙ，　
ＬｙｓまたはＴｙｒである塩基配列を有する変異ｐｓＩ
ＡＸを得た。

この変異ｐｓ　ＩＡＸのＡａｔＩＩ−Ｘｂａｌの１３２
ｂｐのＳＳＩＤＮＡ，ｐｓＩ５２のＡａ　ｔ　ＩＩ−Ｈ
ｉｎｄｌＩＩのＩ．２ｋｂｐの断片およびｐＳＩ５２の
Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄｌ［Ｉの３　．　５　Ｋｂｌ）の断
片をライゲ一ンヨンし、変異ｐｓｆ５２を得た。

この変異ｐｓＩ５２よりＳａｃｌ−Ｓｐｈｆの変異ＳＳ
ＩＤＮＡを切り出し、放線菌のベクターであるｐｌＪ７
０２のＳａｃｌ−Ｓｐｈｒ郎位１こ導入した。

■形質転換 次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ６
　６の胞子をＹＥＭＥ培地に接種し、３０℃で２日間培
養した。

集菌後、０　．　３　Ｍサッカロースを含む緩衝液中で
リゾチームを働かせ、放線菌のべプチドグリカン層を消
化し、脱脂綿で濾過した後、５０成ずつ遠心チューブに
分取したものをドライアイス／エタノールで急冷し、ブ
ロｌ・ブラストとし解凍後、ＤＮ　Ａを加え、２５％Ｐ
ＥＧＩ５００を含む緩衝液を加え、■で得た放線菌のベ
クターを組み込んだ変異ブラスミドをプロｌ・ブラスト
内に取り込ませた。これをＲ２プレート１こまき、１日
かけて膜を再生した後、抗生物質であるチオベブチンを
寒天とともに重層し、選択を行った。得られた形質転換
体は、プレート上で抗ＳＳＩ抗体との沈降線の形成によ
り、ＳＳＩの分泌を確認し、形質転換された放線菌を得
た。

■ベプヂドの生産・精製 この放線菌のコロニーを、胞子形成プレート上で胞子に
した後、ＴＳＢ培地を用い、３０℃で６日間振盪培養を
行った。この培養肢を ８　．０　０　Ｏｒｐｍ，　３　０分間遠心処理し、菌
体を除いた上清に対して、６０％重量比の硫酸アンモニ
ウムを加え、放線菌の菌体外に分泌された蛋白質を沈澱
させた。この沈澱を２０州トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に溶かし、同緩衝液で２日間透析した。

この液をあらかじめ２０關トリス塩酸緩衝液（ｐｉ７．
２）で平衡化させたＤＥ−３２（ポヮットマン社製）の
カラム（２，２Ｘ２４ｃｘ）にしみ込ませ、蛋白質を吸
着させ、３００１！Ｉ１の同緩衝岐で洗った後、同緩衝
岐中、ＯＭからＩＭの塩化ナトリウムの濃度勾配（総量
１１２）により蛋白質を溶出させた。抗体との反応、阻
害活性、電気泳動により目的とする本発明のべブチドの
存在が確認された分画を集め、透析した後凍結乾燥によ
り濃縮した。これを３−の０：ＩＭトリス塩酸緩衝肢／
０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐｌ＋７．５）に溶かし、同
緩衝液で平衡化させたセフアクリルＳ−２００（ファル
マシア社製）のカラム（２．Ｏ　ｘ　１　０　８ｑ）に
のせ同緩衝液により溶出を行った。上記と同様の方法に
より本発明のペブヂドの存在が確認された分画を集め、
水に対して透析した後、凍結乾燥して、７３位がそれぞ
れＳｅｒ．Ｔｈｒ，　Ｇｌｕ，　Ｔｒｐ，　Ｈｉｓ，　
ｌｌｅ，　ＧｌｙＳＬｙｓま実施例１０〜１７ 実施例１〜っで得たｐＳＩＡＸをＳｃａｌて切断しＢａ
ｌ３１ヌクレアーゼで＋ｏｏｂｐほど削った断片、同じ
（ｐｓＩＡＸをＡａｔＩＩで切断しＢａｌ３１ヌクレア
ーゼで３００ｂｐほど削った断片、および５′をリン酸
化した部泣特異的変異法の説明の（１）で述べた変異導
入用の１７ｍａｒの合成オリゴヌクレオチド（５００倍
モル過剰）を混ぜ、加熱により一本鎖に変性し、徐冷し
てヘテロデコブレックスを形成させた。このヘテロデュ
ブレックスの一本鎖部分を、ＤＮＡポリメラーゼｌのク
レノー切断、４種類のｄＮＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、
ＡＴＰにより修復し、大腸菌に導入した。これらのコロ
ニーの中から、変異導入に使用した合成オリゴヌクレオ
チドを３２ｐで標識したものをプローブとして用いて変
異が導入されたブラスミドをコロニーハイブリダイゼイ
ションにより探し出した。ハイブリダイゼイションの温
度は、ＧまたはＣは４度、ＡまたはＴは２度として加算
しノこ値より５度低い温度とした．，５０゜Ｃを越える
ときはすべて５０°Ｃとした。オートラジオグラフイー
後、陽性のコロニーおりプラスミドを調製した後、ＤＮ
Ａの塩基配列決定法により変異が導入されたことを確認
し、変異ｐｓｒＡｘを得た。

この変異ｐＳＩＡＸを用いて実施例１〜９の■、■と同
様にしてポリベプチドを得た。

実施例１８〜３３ 実施例１〜９の■で得た、７３位のアミノ酸残基がＭｅ
ｔ，　Ｌｙｓ，　Ｔｙｒ，　Ｇｌｙまたはｌｉｅをコー
ドするプラスミドおよび部位特異的変異法の説明の（２
）で述べた変異導入用の１７ｍａｒの合成オリゴヌクレ
オチドを用い、実施例ｌＯ〜ｌ７と同様にして７０位の
アミノ酸残基がそれぞれＧｌｙ，　Ａｌａ，　Ｍｅｔ，
Ｐｈｅであるポリペプチドを得た。

実施例２１，２３．３１および３３で得られたポリペプ
チドは、それぞれ実施例８　，９　．７お上び６で得ら
れたポリペプチドと同一である。

実施例３４ 実施例ｌＯ〜ｌ７と同様にして１０１位のアミノ酸残基
をＳｅｒとしたブラスミドに７１位のアミノ酸残基をＳ
ｅｒとする変異を導入し、ポリペブチドを得た。１０１
位の変異の導入には、ｐｓｒＡＸをＡａｔｌ！で切断す
るかわりにＸｂａ　Ｉで切断した断片を用いた。

実施例３５〜３７ プラスミドｐｓｒｓ２をＢ　ａ　ｍ　Ｈ　ＩおよびＰｓ
ｔｌで切断し、エクソメクレアーゼ■を作用させて、ｐ
ｓ．ＩＩ８８を得た。このブラスミドから、Ｓｌｌ）ｈ
ｌ−Ａｌｕｌを用いて３′側非翻訳領域の不要な部分が
取り除かれたＳＳＩＤＮＡ断片（９５０ｂｐ）を切り出
し、これを更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼによりＡａｔＩ
１部位を消去したｐＵｃ＋８に、組み込んでｐ　Ｓ　ｒ
　Ｍ　Ｌを構築した。

このブラスミドから切断したＳｍａｌ−ＡａｔｌＩ断片
をｐＵｃ１８にサブクローニングしたブラスミドｐｓＩ
ｓＡをＡｖａｌ（Ｓｍａｌと認識配列が同じだが、突出
末端を生ずる）およびＢｓｔＥＩＩ（２９位のすぐ近く
にある）処理し、Ｓ！ＭＤＮＡを含む断片（Ｉｌｌｌ）
と、ベクター側の断片（ＩＶ）を得た。断片（ＩＩＩ）
をＨ　ｐ　ａ　ＩＩで切断し、断片（Ｖ）を得た。そし
て、断片（ＴＶ）、断片（Ｖ）及び２９位のアミノ酸残
基がＬｙｓ，　ＭｅｔまたはＡｌａになるように設計し
たカセット変異法の（２）で述べた二本鎖ＤＮＡの３つ
の断片のライゲーションにより、変異ｐｓＩｓＡの混合
物を構築した。この混合物を大腸菌に導入し、合成オリ
ゴヌクレオチドをプローブとして、２９位のアミノ酸残
基がＬ，ｙ　ｓ　，ＭｅｔまたはＡｌａに変換したブラ
スミドを持つ大腸閑をコロニーハイブリダイゼイシβン
により探１，出した。変異の導入されたｐｓＩｓＡから
Ｓｍａ　ｒ−Ａａｔｌｌを用いてＳＳＩＤＮＡ断片（２
１０ｂｐ）を切り出し、これをｐ　Ｓ　Ｔ　Ｍ　ＬのＳ
　ｍ　ａ　ｒＡａｔｌＩ部位に導入して得られたｐＳＩ
ＭＬより、Ｓａｃｌ−Ｓｐｈｌの変異ＳＳＩＤＮＡ断片
を切り出し、実施例ｌ〜９の■、■と同様にしてベブヂ
ドを得た。

実施例３８ 実施例ｌで得たポリペブチド、注射用蒸留水、塩化ナト
リウムおよびゼラチンをとり、通常の注射剤の製法によ
り注射剤とした。

実施例３９ 実施例２で得たポリペブチド、注射用蒸留水、塩化ナト
リウム、酢酸ナトリウム、ベンジルアルコールおよびゼ
ラチンをとり通常の注射剤の製法により注射剤とした。

実施例４０ 実施例３で得たポリベブチド、注射用蒸留水、塩化ナト
リウム、酢酸ナトリウム、ゼラチンおよびフェノールを
とり通常の注射剤の製法により注射剤とした。

実施例４ｌ 実施例４で得たポリペプチド、注射用蒸留水、塩化ナト
リウム、酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル、
バラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブロビ
ルおよびパラオキシ安息香酸ブチルをとり、通常の注射
剤の製法により注射剤とした。

実施例４２ 実施例５で得たポリベプヂド、塩化ナトリウム、酢酸ナ
トリウム、塩酸、パラオキシ安，ｅ、香酸メチル、バラ
オキシ安息香酸エチル、パラ才キシ安息香酸プロビルお
よびバラ才キシ安息香酸プチルをとり、通常の注射剤の
製法により注射剤とした。

実施例４３ 実施例８で得たポリペブチド、マンニトールを含む水溶
液を凍結乾燥する。これを用時、ゼラチンおよびフェノ
ールを含む水溶液を加えて溶かし注射剤とした。

実施例４４ 実施例１２で得たポリベブチド、酢酸ナトリウムおよび
ヒトアルブミンを含む水溶岐を凍結乾燥する。これを用
時、注射用蒸留水を加えて溶かし注射剤とした。

実施例４５ 実施例ｌ８のポリペプチド、カカオ脂またはウィテップ
ゾールをとり、通常の坐剤の製法により坐剤とした。

実施例４６ 実施例２０のポリベブチド、水酢酸、酢酸ナトリウム、
塩化ペンザルコニウムを含む水溶液より鼻腔内投与スプ
レーを得た。

実施例４７ 実施例２８で得たポリペブチド、氷酢酸、酢酸ナトリウ
ム、胆汁酸塩を含む水溶肢より鼻腔内投与スプレーを得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓ　Ｓ　Ｉ　ＤＮＡを含むプラスミドｐｓ１
５２の構築の工程を示す図、第２図はカセッｌ・変異法
により７３位のアミノ酸残基に変異を導入する工程を示
す図、第３図はカセット変異法により２９位のアミノ酸
残基に変異法を導入する工程を示す図、第４図は部位特
異的変異法により７３位のアミノ酸残基に変異を導入す
る工程を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（Ａ） 【遺伝子の配列がありました】（Ａ） （ただし、７３番目のアミノ酸残基がＰｈｅ、Ｔｒｐ、
   Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈ
   ｉｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏもしく
   はＣｙｓに変換されているか、７３番目のアミノ酸残基
   がＬｙｓもしくはＴｙｒのとき７０番目のアミノ酸残基
   がＧｌｙ、ＡｌａもしくはＰｈｅに変換されているか、 ７１番目および１０１番目のアミノ酸残基がＳｅｒに変
   換されているか、 または２９番目のアミノ酸残基がＡｌａ、Ｌｙｓもしく
   はＭｅｔに変換されている。） で表されるポリペプチド。
2. （２）下記式（Ａ） 【遺伝子の配列がありました】（Ａ） （ただし、７３番目のアミノ酸残基がＰｈｅ、Ｔｒｐ、
   Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈ
   ｉｓ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏもしく
   はＣｙｓに変換されているか、７３番目のアミノ酸残基
   がＬｙｓもしくはＴｙｒのとき７０番目のアミノ酸残基
   がＧｌｙ、ＡｌａもしくはＰｈｅに変換されているか、 ７１番目および１０１番目のアミノ酸残基がＳｅｒに変
   換されているか、 または２９番目のアミノ酸残基がＡｌａ、Ｌｙｓもしく
   はＭｅｔに変換されている。） で表されるポリペプチドを有効成分とするプロテアーゼ
   阻害剤。