JPH0349629A

JPH0349629A - 新品種のネギ属雑種植物およびその製造法

Info

Publication number: JPH0349629A
Application number: JP1186643A
Authority: JP
Inventors: Wataru Kawasaki; 渉川崎; Jinichiro Kojima; 小島　甚一郎; Masahiro Kano; 正博加納; Osamu Kimura; 修木村; Tamaki Murayama; 村山　玉樹
Original assignee: MOMOYA KK
Current assignee: MOMOYA KK
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1991-03-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕く産業上の利用分野〉本発明は、細胞融合法を用いた新品種のユリ科ネギ属雑
種植物およびこの雑種植物を作出する方法に関す゛るも
のである。

く従来の技術〉新し＜４Ｍ１ｍ植物を作出する場合には、これまでは、
人為的交雑育種法により行われてきたが、この方法には
以下のような制限がある。

その一つは、槓物が交雑できる範囲は限られでおり、多
くの場合、近縁種間でしか遺仏了交換ができなく不稔性
も障害となっている。

二つめは、交雑によって好ましい因了しそうでない因子
も雑種に組み込まれ、希望する埴物を得るには長期にわ
たる選抜と固定が必要となる。

三つめは、両親の細胞質が混じり合うことはないため細
胞質遺伝子の改良はほとんど不１１能である。

また、細胞融合法によれば、異粍の核や細胞質遺伝子を
、形質転換しようとする植物に付与し新しい形質を獲得
させることができる。しかし、融合細胞からの植物体再
生例はいくつか報告されているが、ネギ属間の雑種植物
作出に関しては全く確立されていない。

〔発明の概要〕

く要旨〉本発明は、ユリ科ネギ属値物であるラッキョウ類、タマ
ネギ類、ニラ類、ネギ類、およびニンニク類などについ
て、それぞれのネギ属の間でプロトプラスト融合により
、新しいネギ属雑種植物を普遍的にｉｎ　ｖｉｔｒｏで
大量に作出する一連のプロセスを構築することを目的と
するものであり、本発明者らは、ネギ属植物由来のプロ
トプラストと他のネギ属植物由来のプロトプラストを細
胞融合法により融合させた後、培養してコロニーを形成
させ、該コロニーを２．４−Ｄを含むカルス増殖川培地
で増殖させ、２．４−Ｄを除いた培地中で培養して、雑
種植物を再分化させ、さらに多芽体増殖という方法で培
養することにより雑ｉｔａ物を大量に作出できることを
見出し、この知見をもとに本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明による新品種のネギ属雑種埴物は、ネ
ギ属植物由来のプロトプラストと他のネギ属柏物由来の
ブロトプラストとの細胞融合により得られるものである
。

また、本発明によるネギ属雑種植物の製造法は、ネギ属
植物由来のプロトプラストと他のネギ属植物由来のプロ
トプラストとを細胞融合させた後、これを培養してカル
スを形成させ、該カルスを植物ホルモンを含む固体培地
上で培養して、雑柚埴物体を再分化させ、多芽体を増殖
させて大量培五すること、を特徴とするものである。

く発明の効果〉本発明によれば、ネギ属植物と他のネギ属植物間の雑種
植物を、従来の交雑育種法では得られない改良された形
質を有し且つ遺伝的に安定した状態で、効率よく大量に
得ることができる。

〔発明の具体的説明〕

ネギ属雉柿植物本允明による新品種のネギ属雑種植物は、ネギ属植物由
来のプロトプラスＩ・と他のネギ属埴物山来のブロトプ
ラストとの細胞融合により得られるものであることは前
λ己したところである。

本発明雑種植物の出来となるネギ属植物は、ユリ科ネギ
属（Ａｌｌｌｕ＋ｓ）に属するものであり、この代表例
としてはラッキョウ類、タマネギ類、ニラ類、ネギ類あ
るいはニンニク類Ｃ−があげられる。

ネギ属雑種植物の製造法本発明によるネギ属雑種植物の製造法は、ネギ属埴物由
来のプロトプラストと他のネギ属埴物由来のプロトプラ
ストとを細胞融合させた後、これを培養してカルスを形
戊させ、該カルスを埴物ホルモンを含む固体培地上で培
養して、雑種植物体を再分化させ、多芽体を七殖させて
大量培養することを特徴とするものであることは前記し
たところである。

ネギ属植物および他のネギ属植物は、上記したネギ属（
ＡＩｌｌｕｍ）の中から適当な組合せを選択すればよい
。

くプロトプラストの調製〉プロトプラストを得るための槌物材料としては、葉肉組
織をはじめとする柚物体の一部、茎、根、鱗茎などから
誘導された培養細胞、特に、組織１４などから得られる
あらかじめ安定七殖させたカルスが好ましい。組織片か
らカルスを得る方法、カルス化のための使用培地などの
条件は、通常行なわれている方法に従えばよい。

プロトプラストの調製は、細胞壁を消化する醇素、すな
わちペクチナーゼやセルラーゼなどの酊索、を使用し、
通常の方法に従って細胞融合させようとする植物種の組
織あるいはカルス等をＡＰ素処理して細胞を分離し、必
要に応じてこれを洗浄することにより行なうことができ
る。具体的にはたとえば、上記カルス等を、常法に従っ
て、セルラーゼであるセルラーゼオノヅカＲＩＯあるい
はセルラーゼオノヅカＲＳ（ヤクルト薬品工業株式会社
製）とべクチナーゼであるペクトリアーゼＹ一２３（盛
進製薬株式会社製）あるいはマセロザイムＲ−１０（ヤ
クルト薬品工業株式会社製）の細胞壁分解酵素を含む酵
素液中で２３℃、２〜３時間程度処理することによって
得ることができる。

上記のように単離されて調製されたプロトプラストは、
そのまま細胞融合の工程に供することかできるが、相対
的に比重の大きい細胞、すなわち分裂活性の高い細胞、
を選択して使用することにより、細胞融合をより効率よ
く行なうことができる。相対的に比重の大きい細胞を分
両するには、たとえば密度勾配遠心分離法などを使用す
ればよい（特願昭６３−１１１７６２号明細書を参照）
。

く細胞融合〉所望の異なる植物種のプロトプラスト同士を細胞融合さ
せるには、前述のようにして単離したプロトプラストを
適当な細胞浮遊岐、例えば２，５ｍＭｃａｃｌ２、０．
６Ｍ７ンニトール液に、適当な細胞濃度、例えば等密度
で合計が１×１０Ｂ〜５×１０Ｂ個／ｍｌ程度となるよ
うに混合して、例えば、通常のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を用いる方法により細胞融合を実施すること
ができる。このポリエチレングリコール液としては、例
えば、２５〜４５％ＰＥＧ（１５４０）　、１０、５ｍ
Ｍ　　ＣａＣＩ２、０．７ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４”Ｈ２
０，０．１Ｍグルコース、ｐＨ５．５を用いる事が出来
る。細胞融合のための他の方法として、電気細胞融合に
よる方法が可能である。例えば、その条件は、細胞融合
用チャンバーを用いて高周波電界周波数０．２５〜２Ｍ
Ｈｚ，高周波電界強度１０〜８０Ｖ，高周波電界印加時
間５〜１０ｓｅｃｓ高電圧パルス幅１０〜５０μＳｅｅ
　、高電圧電界強度０．５〜２　，　Ｏ　Ｋ　Ｖ　／　
ｃＩＩ　，融合後放置時間３０分程度、の電気融合条件
であり、この電気細胞融合ｌ去によりプロトプラスト同
士を融合させることができる。

他にも細胞融合する方広として、デキストラン法、高ｐ
Ｈｉ％Ｃａ２＋等が考えられるが、発明における細胞融
合法としては電気細胞融合法がより好ましい。

くカルス形戊〉上述の工程で得られた融合細胞をカルス形成川の培地を
用いて培養することにより、カルスが形成される。カル
ス形成のための招養に用いられる融合細胞は、上述のよ
うな細胞融合処理後、約３０分程度放置し、適当な条件
で遠心分離して融合プロトプラストを含む分画を集めた
ものを使用することが好ましい。

分画された融合プロトプラストは、例えば特４ｆ１昭６
３−１１１７６２号明細書に記載のＳＨ改変培地（１）
〜（３）（具体例は後述されている）を用い、同書の培
養方法に従って、または弗じて培徨することができる。

すなわち、まず、分画された融合プロトプラストをＳＨ
改変培Ｊｌ！！（１）中に適当な細胞濃度、た５とえば、５×１０　〜１×１０Ｂ個／ｍｌ程度となるよ
うに培地の固化剤（たとえばジュランガム）で包埋して
、培養温度１５〜３０℃程度、好ましくは２０〜２５℃
、で２〜１４日間程度、好ましくは７〜１０日間初期培
養する。

次いで、初期の培養後に、ＳＲ改変培地（２）で培養す
る。この場合ＳＨ改変培地（２）は初期培養のＳＨ改変
培地（１）上に重層すればよい。

培養条件は、たとえば、温度が１５〜３０’Ｃ程度、好
ましくは２０〜２５℃、培養期間が２〜１４１１間程度
、好ましくは１０日間程度である。

培養の後半では、上記のＳＨ改変培地（２）を除去しＳ
Ｈ改変培地（３）を添加して培養する。

この培養は定期的に該培地（３）を交換して継続する。

上述のような融合プロトプラストの継続Ｎ　ｉｎｋによ
り、カルスが形成される。

なお、ＳＨ改変培地（１）〜（３）の組成の具体例を示
すと下記の様である（特廓昭６３−１　１１７６２号明
細書参照）。

第１表　ＳＨ改変培地（１）の組戊ＳＨ改変培地（１）は、上記の＜Ａ＞と＜Ｂ＞との培地
を１：１の割合で混合したものである。

＜Ａ＞くＢ〉ＳＨ改変培地（１）の形態は、液体、半固体、固体培地
などが挙げられる。培地の固化剤としては、寒天、アガ
ロース、ジュランガムなどがあり、ジュランガムを用い
た固体培地が好ましい。

この発明では、培養は、培地を変えて実施され、その様
な培養培地として、ｍ期の培地と同手，ｌに、例えば、
ムラシゲ◆スクーグ（Ｍｕｒａｓｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）
氏ＭＳ培地、リンスマイヤーｅスクーグ（Ｌｌｎｓｍａ
ｌｏｒ−Ｓｋｏｏｇ）氏ＬＳ培地、シｘ．ンク・ヒルデ
プラント氏（Ｓｅｈｅｎｋ−１ｌｉ　Ｉｄｅｂｒａｎｄ
ｔ）のＳＨ培地、Ｇａａｂｏｒｇの８５培地などがある
が、前記のＳＨ改変培地（１）の（ＮＨ４）２ＳＯ４とＫＨ２ＰＯ４との濃度を２倍にしジュランガムを除去し
たＳＨ改変培地（２）がある。

ＳＨ改変培地（２）の形態は、肢体、半因体、固体培地
などが挙げられるが、液体か望ましい。

史に、その後に定期的に交換する培地として、ＳＨ改変
培地（３）、すなわち、１／２ＳＨコンディション培地
とＳＨ改変培地（２）を１＝１に混合した培地を用いる
ことが好ましい。

上記の培養培地には、植物ホルモン類として、例えば、
インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
　、インドール醋酸（Ｉ　ＢＡ）　、２．４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（２．４−Ｄ）などのオーキシン類、お
よびペンジルアデニン（ＢＡ）　、カイネチン、ゼアチ
ンなどのサイトカイニン類などがある（以上に関する詳
細については特願昭６３−１　１　１７６２号明細書に
３ｅ＋載され）でいる）。

く植物体の再生〉上記カルス形成の工程で得られたカルスは、埴物ホルモ
ンを含有する固体培地で培養して分化させることにより
、植物体に再生される。

この工程では、得られたカルスをシュー１・再牛用培地
、たとえば特願昭６３−１６４８２０号明細書記載の再
分化促進固体培地、に移埴して多芽体を形成させ、この
多芽体を分離して更にシュト増殖用培地、たとえば特願
昭６３−１６４８２０号の明細書記載の茎葉増殖固体培
地、で大量培養し、引き続き発根を促進させる培地、た
とえば特願昭６３−１６４８２０号明細書記載の茎葉生
育固体培地、に移植し、継続して培養を実施して植物体
に再生することができる。培養培地に含まれる植物体ホ
ルモンとしては、前記した例などから選択すればよい。

このようにして得られた幼植物体は、通常の方法で、た
とえばポットに移植して生長させることにより、種苗と
して使用できる植物体、すムわちネギ属雑種植物体、に
まで生育させることができる。

く実施例〉以下は本発明の丈施例を説明するものであるが、本発明
はこれによって限定されるものではない。

（１）プロトプラストの調′！Ａ＝ラッキョウの茎頂近傍組織片を１０−５ＭＢＡ、１　０
−５Ｍ２．４　−　Ｄを含むＬＳ培地に置床し、苦色ブ
ドウ状カルスを得、このカルスをＳＨ液体培地に移して
振とう培養した。ついで黄色ブドウ状カルスを細切後、
１％セルラーゼオノヅカＲＳ，０．１％ベクトリアーゼ
Ｙ−２３、１０ｍＭＣａＣｌ２・２Ｈ２０及び０．６Ｍ
７ンニトールを含む酵素液（ｐＨ５．５）に移して、２
３℃、２時間穏やかに振とうしてプロトプラストを７ｔ
ｊ離した。酵素処理液をナイロンメッシュで冫戸過して
未消化物を除去し、濾液を１００ｘｇで３分間遠心分離
して沈澱画分を集め、次いで、１０ｍＭＣａＣｌ２・２
Ｈ２０及び０、６Ｍ７ンニトールを含む液で２回洗浄後
、フイコールにより比重の重いプロトプラストを分画し
た。

一方、無菌化したニラの種子を、１０−５ＭＢＡ、１　
０’Ｍ２，　４　−　Ｄを含むＬＳ培地に置床して、得
られたカルスを前述と同様に酵累処理を行いプロトプラ
ストを単離した。

（２）細胞融合：上記（１）で調製したプロトプラストをそれぞれ等密度
でＩ　Ｘ　１　０６個／ｍｌとなるように２．５ｍＭ　
　ＣａＣｌ２、０．６Ｍマンニトールを含む溶液中で混
合し、その０．８ｍｌを電気融合用チャンバー内に満た
し３分放置後、高周波電昇周波数ＩＭＨｚ，高周波電界
強度４０ｖ１高周波電昇印加時間５ｓｅｃｓ高電圧パル
ス幅３０μｓｅｃ、高電圧電界強度１，５ＫＶ／ａｍの
電気融合条件にて細胞融合させた。

（３）融合細胞の培養：上記（２）で得た融合処理後のプロトプラストを、前記
ＳＨ改変培地（１）中に、８Ｘ１０５個／ｍｌの密度で
包埋して培養を行った。１０Ｉ１後、ＳＨ改変培地（２
）を重層し、さらに１０！Ｉ後ＳＨ改変培地（２）を除
去し、ＳＨ改変培地（３）を添加して培養した。この培
養は定期的にＳＨ改変培地（３）を交換して培養を継続
するとカルスが形成された。次いで１　『６ＭＢＡ，１
０−６Ｍ２．４−Ｄを含むＳＨ培地上でカルスを増殖さ
せた後、不定芽再分化用培地（｝Ｉｌｌ述の培地冫に移
埴し、約１ケ月後に多芽体を形成したので、多芽体を切
断して不定芽増殖用培地（前述の培地）で大量地埴させ
、発根用培地（前述の培地）に継代したところ発根がみ
られた。

得られた植物体について、下記のノｊ法により雑種検定
をしたところ、雑種植物であることか判りた。

すなわち雑種検定の結果は、葉形態が両親の中間の特徴
を現し、Ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
のアイソザイムの電気泳動パターンは、異なる位置に険
出される両親株のアイソザイムを合わせもち、さらに染
色体数は４８本であることを確誌した。

Claims

【特許請求の範囲】１、ネギ属植物由来のプロトプラストと他のネギ属植物
由来のプロトプラストとの細胞融合により得られる、新
品種のネギ属雑種植物。２、ネギ属植物由来のプロトプラストと他のネギ属植物
由来のプロトプラストとを細胞融合させた後、これを培
養してカルスを形成させ、該カルスを植物ホルモンを含
む固体培地上で培養して、雑種植物体を再分化させ、多
芽体を増殖させて大量培養することを特徴とする、ネギ
属雑種植物の製造法。３、プロトプラストをネギ属植物由来のカルスから調製
することを特徴とする、請求項２記載の製造法。４、細胞融合のためのプロトプラストとして、比重の大
きい細胞分画を使用することを特徴とする、請求項２記
載または３記載の製造法。