JPH02163090A - 芳香族化合物シス−ジヒドロキシ誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生化学的工程を利用する物質の製造方法に関
し、更に詳細には、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）属に属
する微生物を用いる芳香族化合物のシス−ジヒドロキシ
誘導体の製造方法に関するものである。

芳香族化合物のシス−ジヒドロキシ誘導体は、エンジニ
アリングプラスチックスの内で最近特に注目を集めてい
るポリパラフェニレンの工業的原料として特に有用な化
合物である。また、上記芳香族化合物のシス−ジヒドロ
キシ誘導体の１つであるシス−１，２−ジヒドロキシ−
シクロヘキサ−３，５−ジエンは、カテコールを介して
、オルト−またはメタ−バスウェイを経て、ＴＣＡサイ
クルへ入ってくるため、生化学的にも重要な物質である
。

したがって、本発明は、微生物工業の技術分野のみなら
ず、芳香族化学、高分子化学及び生化学の技術分野にお
いても、非常に重要な役割を果たすものである。

〔従来の技術〕

汎用プラスチックスよりも更に高度な物性を具備したい
わゆるエンジニアリングプラスチックスの内、最近では
特に、窒素中では重量減少の開始点が６００°Ｃ以上と
いう極めて耐熱性のすぐれたポリバラフェニレン（Ｐ　
Ｐ　Ｐ）が、苛酷な条件下で使用される各種工業製品の
材料として期待されている。

そして、Ｐ、Ｋｏｖａｃｉｓ　らによりＣｕＣ１ｚとＡ
ｌＣ１，とを触媒としてベンゼンからＰＰＰを合成する
方法が開発されたが（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、
８５４５４（１９６３））、収率が低く、そこで戸嶋ら
によってその改良法が開発されたが（現代化学８月号、
１４　（１９８７））、ＰＰＰは溶媒に不溶であり且つ
熱可塑性でないため、このような直接合成法では成型の
点で問題がある。

これに対してシス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキ
サン−３，５−ジエンを原料としてＰＰＰを製造する方
法においては、溶媒に可溶の前駆体ポリマーの段階で成
型しておき、これを加熱することによってＰＰＰに転換
すればよく、上記した直接合成法よりも特に工業的な面
ではるかにすぐれている。したがってＰＰＰの工業的製
造原料として、シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘ
キサン−３，５−ジエンはきわめて重要な化合物である
。

しかしながら、シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘ
キサ−３，５−ジエンは立体異性をとる化合物であるの
で、シス体のみを選択的に合成する必要がある。そこで
、シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサン−３，
５−ジエンの選択的製法が中部らによって開発されたも
のの（Ｂｅｒ、、　９２，１６３　（１９５９））、工
程が煩雑であるため工業的規模の生産にはほど遠いもの
である。

そこで、シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−
３，５−ジエンのみをｉ！沢的に製造する全く別種の方
法の開発の必要に迫られ、シュードモナス・プチダをも
ちいてベンゼンをシス−１，２−ジヒドロキシ−シクロ
ヘキサ−３，５−ジエンに転換する生化学的方法が開発
された（ヨーロンパ特許明細書第７６６０６号）。

本発明は、従来知られていないシュードモナス・エルギ
ノーサに属し芳香族化合物をシス−ジヒドロキシ誘導体
に変更する能力を生ずる微生物を利用して芳香族化合物
のシス−ジヒドロキシ誘導体を選択的に生産するもので
あるが、このようなことは従来知られておらず新規であ
る。

〔発明が解決しようとする課題］ 上記したように、芳香族化合物のシス−ジヒドロキシ誘
導体の生化学的製造において、従来未知のシュードモナ
ス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）に属し芳香族化合物をシス−ジヒドロキシ
誘導体に変換しうる微生物を用いて、芳香族化合物から
シス−ジヒドロキシ誘導体を有利に得ようとするもので
ある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明は、シュードモナス・エルギノーサの菌体を芳香
族化合物に作用させて対応するシス１，２ジヒドロキシ
誘導体を製造する方法にあるが、本発明においては当該
微生物を培養しながら培地に蓄積せしめることも可能で
あり、また、通常に培養して菌体を集めて反応させても
よし、或いはこれらを機械的（例えば超音波）その他の
方法で破壊して得た菌体処理物も使用可能である。

本発明者らは、コークス工場の土壌中よりベンゼンを炭
素源として生育する菌株をスクリーニングしたところ、
特にベンゼン資化性にすぐれた菌株を分離することに成
功した。

この分離菌は、Ｍ５６、Ｍ９といった無機培地にベンゼ
ン蒸気を加えた培地に増殖するが、１００％飽和渾気で
はその毒性のために生育できず、約３０％飽和濃度以下
であることが必要であった。

この分離菌は、ダラム陰性の桿菌で、極鞭毛を有し、運
動性があり、絶対好気性、糖非発酵性であり、電子顕微
鏡による観察からも、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）属に属するものと認められた。

そして更に、Ｈ，０ｙａｉｚｕ及びに、Ｋｏｍａｇａｔ
ａの菌体脂肪酸分析によるシュードモナスの分類を行っ
た（Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．，２９
．１７−４０（１９８３））。

先ず、凍結乾燥菌体を５％Ｎａ０ｔ１１５０％ＭｅＯＨ
で１００°Ｃ１１時間ケン化した後抽出した脂肪酸を１
５％ＢＣ１ｘ　・ＭｅＯｌｌで８５°Ｃ３５分間メチル
エステル化し、次いでＧＬＣ分析を行った。ヒドロキシ
酸はＴＬＣ分析により確認した。

ＧＬＣ分析：１５％ＥＧＳ（３，０ｍｍｍ　Ｘ　２．１
ｍ）、１８０°ＣＴＬＣ分析：　５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ
　６０　ＴＬＣ（ジエチルエーテル二〇−ヘキサン ＝ｌ：４） 上記分析の結果、本分離菌の菌体脂肪酸成分は、１２：
Ｏｌ　１４：Ｏｌ　１６：０．１６；１、１８：０１１
８：１、Δ１７、Δ１９．３−０１１・１０：０．３−
０１１・１２：　Ｏ（Ｔｒａｃｅ）、２−Ｏｆｆ・１２
：０から成っていた。このほかに、１５；０．１７：０
、１９：０も微量検出された。

これらの分析結果からして、本分離菌は、３−ＯＨ・１
０：Ｏｌ　３−０１１−１２：Ｏを含むことから、Ｉｔ
、０ｙａｉｚｕ及びに、Ｋｏｍａｇａｔａ（Ｊ、Ｇｅｎ
、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋２９．１７４０（
１９８３）　）のＧｒｏｕρ１に属することが確認され
た。

このグループには、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ、
プチダ（Ｐ、ｐｕｔｉｄａ）、Ｐ、オーレオファシェン
ス（Ｐ、ａｕｒｅｏｆａｃｉｃｎｓ）、Ｐ、クロロラフ
イス（Ｐ、ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、Ｐ、フローレ
ンセンス（Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　、Ｐ、ス゛
ン゛ンエリ（Ｐ。

５ｔｕｔｚｅｒｉ）　、及びＰ、メンドシーナ（Ｐ、ｍ
ｅｎｄｏｃｉｎａ）等が包含されている。

そして、２−０１１・１２−〇を検出すること、２−０
１１・１６；０が検出されていないこと、Δ１９が著量
検出されることなどから、上記Ｇｒｏｕｐ　１の中で最
も類似した菌体脂肪酸パターンを示した菌種は、Ｐ、エ
ルギノーサであった。ＤＮＡのＧ−Ｃ含量は、本分離菌
の菌体よりＤＮＡを抽出し、Ｔｍ法で測定したところ、
Ｇ−Ｃ含量は６６．３モル％であった。これをＰ、エル
ギノーザのＣ−Ｃ含量−６７，２−６８，０モル％と比
べるとやや低く、Ｐ、プチダのＧ−Ｃ含量＝６２．５モ
ル％とは明らかに異なっていた。また、前記したように
シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエン生産菌としてはＰ、プチダが既知であるので、こ
れら２種の菌と本分離菌との菌学的性質を比較して、第
１表の結果を得た。

（木頁以下余白） 第１表 これらの結果から明らかなように、本分離菌は、Ｐ、プ
チダとは明確に区別され、最も類似した菌は、Ｐ、エル
ギノーザである。しかしながら、本分離菌は、特に、ゼ
ラチンの加水分解、マンニトール、マロン酸等に対する
挙動がＰ、エルギノーザと異なっており、Ｇ−Ｃ含量も
Ｐ、エルギノーザと比べて、やや低い値を示し、菌体が
僅かにピンク色を呈するなど微妙な相違点も認められる
ことから、Ｐ、エルギノーザの新変種とし、本分離菌は
Ｐ、エルギノーザの新変種であると同定するにいたった
。

そこで本分離菌を、シュードモナス・エルギノーサＢ−
２０３４と命名した。この微生物は、微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ−Ｐ　１０４４４として寄託されている
。

本微生物は、芳香族化合物の資化能を有しく第２表）、
該芳香族化合物を対応するシス−ジヒドロキシ誘導体に
転換することができる。この反応は、ベンゼンを例とし
て挙げると次式の通りである。

但し、十：陽１生　　−：陰性 ｄ：藺生のものも＋Ｗ生のものも存在 Ｏ１＋ ＸＨ，Ｘ　　　　　　　０１１ 本発明において使用しうる微生物は、前記分離菌はもと
より、公知の菌及びこれらに紫外線照射、ｘ　線［射、
ニトロソグアニジン等による薬剤処理によるもの、遺伝
子工学的方法による等の通常の変異手段により変異させ
た菌株をも含有するものである。

（本頁以下余白） 本発明は上記した反応式を利用するものであり、その詳
細な反応メカニズムは更に今後の研究をまたねばならな
いが、本微生物が、ベンゼンジオキシゲナーゼを産生じ
、この酵素の作用によってベンゼンがシス−１，２−ジ
ヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンに転換され
るものと認められる。

すなわち、本発明によって、本微生物を用いてベンゼン
からシス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，
５−ジエンに製造することが可能となったのである。シ
ス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジ
エンは、両ＯＨ基が相互にシス関係にある１、２−ジヒ
ドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンである。以下
、本発明による１、２−ジヒドロキシ−シクロヘキサン
−３，５−ジエンの製造方法をベンゼンを原料として説
明する。

なお原料物質としては第２表に記載したようにトルエン
、エチルベンゼン、ビフェニル、安息香酸、ｏ−）ルイ
ル酸、ｍ−）ルイル酸、Ｐ−）ルイル酸、フェノール、
０−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、カ
テコール、プロトカテキュ酸、４−メチルカテコール、
ｍ−キシレン、アントラセン、デカヒドロナフタレン、
０−フタル酸、ｍ−フタル酸、１，２．４−　）リメチ
ルベンゼン、ｐ−フタル酸、２，３−ジメチルナフタレ
ン等ナフタレン、０−キシレン以外の広範囲の芳香族化
合物を使用することができ、そして、これら芳香族化合
物に対応するシス−ジヒドロキシ誘導体を製造すること
ができる。

本発明に使用する微生物用の培地としては、無機塩類を
含む培地が適宜使用され、栄養ブロス（ＮＢ培地）　、
Ｍ５６ミニマム培地、Ｍ９ミニマム培地等が好適に使用
される。これらの内、生育用培地として良く用いられる
Ｍ５６最小限培地の組成は、第３表に示すとおりであり
、Ｍ９最小限培地の組成は第４表に示すとおりである。

（本頁以下余白） 第３表 ＮａＪＰＯ４Ｈ１２８ｚＯ Ｋ＋１□ＰＯ４ （ＮＨ，）ＺＳＯ４ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ Ｃａ（ＮＯ：１）ｚ １１．７ｇ ２．７ｇ １．０ｇ ００ｍｇ ５ｍｇ 第４表 ＮａｚＨＰＯａ Ｈ２ＰＯ４ Ｈ４ＣＩ ＩＭ門ｇｓＯ４ ａＣＩ ＩＭ　　ＣａＣＩｚ ６．０ｇ ３．０ｇ １．０ｇ ｍ１ ０．５ｇ ０　、１　ａｌｌ この培地は、液体培養に使用できるほか、例えば寒天を
１．５％程度添加すれば固体培養にも使用することがで
きる。このようにして本微生物を培養しながら、ベンゼ
ンを供給して本発明を実施する。なお、本発明において
は原料の芳香族化合物に微生物入れ自体（すなわち、菌
体）のみならず該微生物の処理物を使用しても目的の生
産物を得ることができる。そして、この処理物としては
該微生物の菌体の摩砕物、該微生物の抽出物、該微生物
から分離された粗酵素、精製酵素環核微生物から誘導さ
れる全てのものが含まれる。

ベンゼンとしては、ベンゼンの蒸気をリアクタ空間内に
供給したり培地中に直接バブリングさせたりして、適宜
供給する。ただし、ベンゼンの供給は通常約３０％以下
、好適には２０〜３０％程度に維持するのが良い。

ベンゼン蒸気を供給するには、例えば活性炭、シリカゲ
ル、アルミナ、粘土鉱物等多孔質体にベンゼン又はその
渾気を充分に吸収せしめておき、これをリアクタ内に収
容せしめればよい。また連続反応の場合にはベンゼン蒸
気の濃度を調節した空気等の気体を連続的に供給してや
ればよい。

ベンゼンを顆粒状活性炭から供給する場合には、冷ベン
ゼン上に空気を循環させながら平衡に達するまでベンゼ
ンを活性炭に吸収せしめる。通常は、活性炭重量の１７
４〜１７３程度加えてやればよい。

例えば、このベンゼン−空気混合物を活性炭ペレット床
に数日間循環供給すれば上記平衡が得られる。

使用するに先立ち、このペレットを密封容器内に入れ、
またプレート培養の場合には、ペトリ皿の蓋にスプーン
１杯分のペレットを付加した。プラスチック製のディス
ポーザブルプレートを使用すれば、過剰のベンゼンをこ
のプレートが吸収してくれるので反応がスムーズに進行
し、便利である。

液体培養の場合には、反応容器に紙、綿等の栓をし、そ
の上に該ペレットを置き、その上をアルミホイル等で包
んでシールする。約２５〜３５°Ｃ１好適には３０°Ｃ
前後にコントロールしながらインキュベートを続ける。

なお、試薬類は市販品が適宜自由に使用できる。インキ
ュベーション期間は、通常２４〜３６時間である。

目的物質の蓄積は、スペクトロフォトメトリーまたはＨ
ＰＬＣ分析等によって確認し、所定量蓄積を確認した後
は、抽出、濃縮、その他常法によって目的物質を分離採
取し、必要あれば更に精製して、目的とするシス−１，
２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンを高
純度で得る。

〔実験例〕

フラスコ培養による、シス−Ｌ　２−ジヒドロキシ−シ
クロヘキサ−３，５−ジエンの製造実験。エタノールを
炭素源として含むＭ−９液体培地を使い、活性炭に吸着
させたベンゼンを徐々に供給することによってシス−１
，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの
生産を行った。前培養細胞を集菌後、２００ｄの０．５
％エタノールを含むＭ　　９培地（５００ｍｆｆｉ容エ
ーレンマイヤーフラスコ使用）に菌を０Ｄ＝１．５０　
（０，７８ｇ／　ｌ　）の濃度になるように懸濁し３０
″Ｃで培養した。活性炭に吸着されたベンゼンはグラス
フィルターの付いた濾過器の中に７割程入れ、残りの上
部には綿栓をして、培養フラスコの口に装着し、その上
をアルミホイルでカバーした。

炭素源としてのエタノールは培養６時間後に１．０ｍ！
追加した。活性炭から放出されるベンゼンは空気と混合
されてフラスコの口から徐々に振盪した培地に供給した
。培養２４時間後シス−Ｌ　２−ジヒドロキシ−シクロ
ヘキサ−３，５−ジエンのＨ積Ｍｌは３．５　ｇ／　ｌ
であった。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

但し、本発明はこの実施例により限定されるものではな
い。

実施例−１ Ｍ５６ｔ９地３０２にエタノールを２％添加して、これ
に菌を６００ｎｍ　００で１．０になるように接種して
菌体の前培養を実施した。３０°Ｃで１８時間培養後、
ベンゼンを２００μｌ／ｌ添加し、エタノールを２％追
加して、さらに１０時間培養後６００ｎｍ　００が３．
５（菌体乾燥量＝１．８ｇ／４）になった所で細胞を回
収した。

シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３１５−
ジエンの生産は、３２のＭ５６培地に前培養で得た菌体
を１℃当り、乾燥量で１８ｇとなるように投入し、ｐＨ
７，２，３０゛Ｃのジャーファーメンタ−による攪拌培
養で実施した。ベンゼンの供給は連続供給装置（空気と
ベンゼン蒸気の混合比を電磁弁で調節）を使って、空気
に含まれるベンゼン濃度が３０％になるように設定し、
流量は１．５１！／ｍｉｎに保った。培養２７時間で培
養液中のシス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−
３，５−ジエンの濃度は１８．５ｇ／　ｌであった。

実施例−２ 実施例−１の前培養操作を繰り返し、培養菌体２、Ｏｇ
　（乾燥量）／！を得た。

シス−１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３゜５−
ジエンは、エタノールの存在下でベンゼンを供給しなが
ら実施した。Ｍ９培地４２を使用して、前培養菌体を１
３ｇ／　Ｅとなるように投入し、３０°Ｃのジャーファ
ーメンタ−で攪拌培養した。エタノールは培養当初２％
添加し、ベンゼンと空気の割合が２０　：　８０の混合
期待を１．　ＯＬ／ｍｉｎで供給しながら１０時間培養
を続けた後、ベンゼン、空気の供給下でエタノールを２
．０　ｇ／　ｌの割合で連続添加してさらに４８時間培
養を続けた。５８時間の培養で、培養液中のシス−１，
２−ジヒドロキシーシクロヘギサ−３，５−ジエンの濃
度は、２５．５ｇ／　４２に達していた。

実施例−３ 実施例−２の生産方法を繰り返したが、ベンゼンの代わ
りにトルエン及びエチルベンゼンをそれれぞれ別々に用
いた。

これらの基質を使って培養した培養上澄液には、トルエ
ンからはシス−１，２−ジヒドロキシ−３−メチル−シ
クロヘキサ−３，５−ジエンを２２．０ｇ／　ｌ、エチ
ルベンゼンからはシス−１，２−ジヒドロキシ−３−エ
チル−シクロヘキサ−３，５−ジエンを２０．５ｇ／ｆ
、それぞれを含んでいた。

〔発明の効果〕

本発明によればシュードモナス・エルギノーサの新変種
を用いることにより芳香族化合物をシス−ジヒドロキシ
誘導体を製造する新規なルートが確立され、その結果、
該誘導体の工業的生産ひいては該誘導体を原料とするＰ
ＰＰ等エンジニアリングプラスチックスの工業的生産に
も大いに貢献するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュードモナス・エルギノーサに属し芳香族化合物をシ
   ス−ジヒドロキシ誘導体に変換する能力を有する微生物
   の菌体又はその処理物を芳香族化合物に作用させて対応
   する化合物のシス−ジヒドロキシ誘導体を製造すること
   を特徴とする芳香族化合物のシス−ジヒドロキシ誘導体
   の製造方法。