JPH01265895A - 細胞分化誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は新しい生理活性を示すポリペプチド配列により
表記する。

Ａ２°−デオキシアデニル酸 Ｃ２°−デオキシシチジル酸 Ｃ２°−デオキシアデル酸 Ｔ　　　　　２’−チミジル酸 特に断わらない限り、配列の左から右への方向は５°か
ら３°への方向を示すものとする。

また、ポリペプチドは以下の略号の配列により表記する
。

Ａｌａ　　　アラニン Ａｒｇ　　　アルギニン Ａｓｎ　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　システィン Ｇｉｎ　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　グリシン Ｈｉｓ　　　ヒスチジン ｌｉｅ　　　イソロイシン Ｌｅｕ　　　ロイシン Ｌｙｓ　　　リジン Ｍｅｔ　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　プロリン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｔ４．トリプトファン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｖａｌ　　　バリン ［従来の技術］ 免疫反応をつかさどる細胞群の中で、近年マクロファー
ジ（以下、Ｍφと略記する）が注目されてきた。Ｍφは
、貧食作用による抗原の処理を始めとして、生体の防御
機構の中で、中心的な役割を演じている。また、細胞外
からの刺激に応じて、Ｍφは、インターロイキン−１、
癌壊死因子、コロニー形成刺激因子など、多種の重要な
生理活性物質を産生じている。

血液細胞は、造血幹細胞より、増殖分化を繰り返し、機
能細胞へと成熟する。この分化成熟の過程で増殖能をも
ち、腫瘍化したものが白血病細胞である。該腫瘍細胞に
作用し正常な機能性細胞へ性の物質、特にヒト由来の蛋
白性の物質が期待を集め、近年活発に研究がなされてい
る。ヒト末梢血リンパ球をレクチンで刺激することによ
り、分化誘導物質が生成されることが報告されてた［ジ
ャーナル　オブ　ナショナル　カンサー　インステイチ
ュー）；　Ｊ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

６７、１２２５．　（１９８１）およびカンサーリサー
チ；　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、　４２．３９２
８　（１９８２）］。これらの報告において、ヒト末梢
血リンパ球から得られた細胞分化誘導物質は、セファデ
ックスＧ−７５（ファルマシア社、スウェーデン）を用
いたゲルろ過分画法によって分子量２５．０００と４０
，０００の蛋白性物質であるとの記載に止まっている。

特開昭６０−２８９３４に示された細胞分化誘導物質は
、分子量　４５．０００〜６０、０００または１００，
０００　、等電点５〜７の物質であり、トリプシンに感
受性を示し、熱に不安定な物質である。一方、ヒ）Ｔリ
ンパ球性白血病細胞の培養上清中に見いだされた細胞分
化誘導物質は、アクリルアミドゲル電気泳動法によって
、分子量・　ｚ−末ｍ血リンパ球およびヒトＴリンパ球
性白血病細胞から生成される細胞分化誘導活性は、その
活性をもたらす物質の性質が不明確であり、熱や蛋白質
分解酵素に強い感受性を示す不安定な物質であった。

また、これら物質の分化誘導活性は弱く、ビタミンＡ誘
導体などが共存しないと、白血病細胞に分化を充分に誘
導することができなかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記先行知見を認識し、Ｍφ系の細胞よ
り、安定性、細胞分化誘導活性ともに優れた蛋白性の生
理活性物質を発見すべく、鋭意検討を続けてきた。その
結果、ヒトのＭφ前駆細胞に作用して、単独で、Ｍφへ
と分化を誘導する活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞
分化誘導物質を見いだした。そして、遺伝子操作技術に
より、該遺伝子構造を解明した。該遺伝子を用いること
により、微生物または形質転換細胞を使用した該物質の
高効率生産が可能である。

［発明の内容］ −すなわち本発明とは、 ・：１ 七。

二下記式（Ａ）で示されるアミノ酸配列からなる細胞分
化誘導活性であり、 Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　
Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　　Ａｈａ　　Ｖａｌ　　
ＴｈｒＣｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｕ　　Ａｈａ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙ
ｒ　　ＡｌａＣｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　ｌｉｅ　
　Ｈｉｓ　　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　（Ａ）
このアミノ酸配列に対応する塩基配列を有しまたは含む
ＤＮＡ。

および下記式（１）で示される塩基配列を有しまたは含
むＤＮＡ。

（５’）−ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＣＣＡＧＡ　Ａ
ＣＡ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴＡＣＴ　ＴＧＣ
，ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＧＴＴ　
ＴＧＣＡＴＴ　ＴＡＣＧＣＣＴＧＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　
ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＡ−（３°）（■）さら
に特許請求の範囲第２項または第３項記載のいずれかの
ＤＮＡを組み込んだベクターについてであり、ベクター
がプラスミドである特許請求の範囲第４項記載のベクタ
ーに関するものである。

本発明において細胞分化誘導物質とは、本来、ヒト由来
のＭφ様細胞が産生ずる物質であって試験管内で少なく
ともマウスＭ−１細胞を分化させ、貧食能を誘起する能
力を有するものである。

、勺　　　・　　ｒの活生爪１〜 細胞分化誘導物質の活性の測定は、試験管内で発明者ら
が用いる方法は、林の方法［トキシフロシーフォーラム
、７，５０（１９８４）］を改良したものであり、増殖
期にあるＭ−１細胞５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（培地
：　イーグルＭＥＭ＋２培量ビタミン・アミノ酸＋ｌＯ
％牛脂児血清）浮遊液に細胞分化誘導物質溶液（試験液
）を混じ、その１ｍｌを１０ｍ１ガラス管にとり、横に
倒して、炭酸ガス培養器中で、３７°Ｃて２日間培養後
、遠心処理（１１０００ｒｐ、　１０分間）を施し、上
澄み液を捨て、血清を含まない培養液１ｍｌを加えて再
び細胞を懸濁し、２μｌ／ｍｌの濃度のポリスチレン・
ラテックス粒子（１，００４μｍ：積木化学社製）を加
え攪はんした後、さらに４時間培養する。該細胞をＰＢ
３１ｍｌでよく洗浄、遠心し、細胞外のラテックス粒子
を除去する。この操作を２回繰り返したのち、遠心管の
底に沈殿した細胞をピペットで吸い上げ、スライドガラ
ス上に１滴落と子。これに０，５％エオシン液１滴を加
え、カバーガラスをのせ、顕微鏡で観察する。赤く染色
される死細胞を除き、生細胞のみについて、ラテックス
粒子を貧食した細胞と弗素食細胞とを計数し、貧食細胞
の比率を求める。試験液を適宜希釈して、上記の測定を
行い、貧食細胞の比率が１０％になるのに必要な、細胞
分化誘導物質の試料の希釈率の逆数をもって、本発明に
おける細胞分化誘導物質の活性量を１単位（Ｕ）／ｍｌ
と定義する。

また場合により、一定量の培養液に対する貧食細胞の出
現率（％）で表示する場合もある。以下、本発明におけ
る細胞分化誘導物質の活性量は、この貧食能測定法によ
って測定した単位で示される。

ヒ　ト　、　胞　　　し　・　　　　　　　の　°　　
云　　　取′与ヒト細胞分化誘導物質の遺伝子は次の工
程により得られる。

１、　ヒト細胞分化誘導物質のメツセンジャーリボ核酸
（以下、ｍＲＮＡと略記する）を取得する材料としては
、通常ヒト末梢血由来単球が用いられる。また、好まし
くは増殖可能なヒト骨髄性白血病細胞株、例えば急性骨
髄性白血病細胞株ＨＬ　−６０，急性骨髄性白血病細胞
株ＭＬ−１，組織法性リンパ腫Ｕ−９３７，急性単球性
白血病細胞株ＴＨＰ−ｌ等が用いられる。さらに好まし
くは細胞分化誘導物質を高濃度に生産するヒト急性単球
性白血病細胞株ＴＩＰ−１を細胞培養し、ホルボールエ
ステルおよびビタミンＡ酸により刺激し、さらに蛋白質
合成阻害剤（シクロへキシミド）を添加し、１４時間培
養を行った状態の細胞が用いられる。以下該条件にて調
製した細胞を用いる場合について詳細を示す。

２、　該細胞から、常法に従いリボ核酸（以下、ＲＮＡ
と略記する）を抽出する。

３　　さらに常法に従いＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラムに対する吸着性画分であるｍＲＮＡを得る。

ここに得られたｍＲＮＡ画分か目的とする細胞分化誘導
物質をコードする　ｍＲＮＡを含むことを確認するため
に該ｍＲＮＡ画分を蛋白質に翻訳させてその生理活性を
調べる。例えば該ｍＲＮＡ画分をアフリカッメガエル（
狂匹匹辷旦肛口）の卵母細胞に注入し蛋白質に翻訳させ
、その蛋白質の細胞分化誘導活性を確認する。

４、　ここで得られたｍＲＮＡを鋳型とし、零度ベクタ
ー（ファルマシア社製）を用い、オカヤマーバーグ（Ｏ
ｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法に従い組み換え体プラ
スミドを合成する。

５、　得られた組み換え体プラスミドを、例えばハナハ
ン（Ｄ、　ｌ１ａｎａｈａｎ）らの方法［ジーン；Ｇｅ
ｎｅ、　１０．６３（１９８０）参照］に準じて例えば
大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）に代表される宿主に導入して
形質転換させ、アンピシリン耐性株を選択してｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。

このｃＤＮＡライブラリーから白血病細胞に対して細胞
分化誘導作用を有する　ヒト由来の生理活性物質をコー
ドするｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミドを
含む形質転換体を得るために、次の方法を用いる。例え
ば、ツマらの方法［ネイチ（−−；　Ｎａｔｕｒｅ、３
１９，６４０．（１９８６）参照］に準じて、組み換え
体プラスミドを含む形質転換体を、例えば４集団に分割
し、各々よりＷｉｌｋｊｅらの方法［ヌクレイツク　ア
シッズ　リサーチ；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、４，８５９（１９７９）コに従いプラスミドを調
製する。次にそれぞれのプラスミトヲ制限酵素エックス
ビーニーＩ　、ＸｌυＩ、ｆｆニア。

ニーエル■、ジＵ」−１ピーエステイ−Ｉ：ｂ１上等で
消化し、直鎖状にした後エスピー６　アールエヌエー　
ポリメラーゼ；ＳＦ３　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
を作用させることにより、ｍＲＮＡを合成する。ｍＲＮ
Ａを精製した後、アフリカッメガエル（狂」１肝１ａｅ
ｖｊｓ）の卵母細胞に注入し蛋白質に翻訳させ、その蛋
白質が細胞分化誘導活性を示すことを確認する。活性が
確認された形質転換体の集団および制限酵素について、
さらに該形質転換体の　１集団を１２果団に分割し、同
様にして細胞分化誘導活性を示す集団を決定する。この
操作を繰り返すことで、白血病細胞に対して細胞分化誘
導作用を有する　ヒト由来の生理活性物質をコードする
ｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミドを含む形
質転換体を得ることができる。

７　このようにして得られたいくつかのクローン化ＤＮ
Ａ断片について例えばマキサム−ギルバート（Ｍａｘａ
ｍ−Ｇｉ　Ｉｂｅｒｔ）法［プロシーデインゲス　オブ
ザ　ナショナルアカデミ−オブ　サイエンスシーズ　オ
ブ　ザ　ユナイテッド　ステイツオブ　アメリカ；　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、？４゜５
６０（１９７７）］またはＭ１３ファージを用いるジデ
オキシ法［Ｓａｎｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４．５４６３（１９７７）、　　　Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　１０１．２０（１９８３）］に従って塩基配列を解
析し、前記式（Ｉ）で示される塩基配列を含むｃＤＮＡ
を選び出すことにより、細胞分化誘導物質のアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有するク
ローン化ｃＤＮＡを最終的に得ることができる。

８、　ここで得られたプラスミドのプロモータ＼一部分
を、ＳＦ３からＳＶ４０初期プロモーターに変えること
により、動物細胞であるＣＯ３で発現させることもでき
る。

以上により、細胞分化誘導物質の遺伝子を取得する過程
を示したが、本発明は以上に限定されるものではない。

アミノ酸配列が前記式（Ａ）の配列であれば、塩基配列
の一部または全部が変わっても、また有機化学的に合成
された人工のＤＮＡに置き換えても良い。さらに、遺伝
子から翻訳されるペプチドに限定されるものではなく、
有機化学的に合成された人工のペプチドでも良い。

このようにして得られた細胞分化誘導物質の遺伝子を、
正しく転写、翻訳が行われるような配列においてプロモ
ーター等の５゛領域の遺伝子配列に接続し、細菌または
高等生物細胞中で複製可能なベクターと接続した組み換
え遺伝子を得、この組み換え遺伝子によって細菌または
高等生物細胞を形質転換し、この形質転換体を増殖させ
、細胞分化誘導物質遺伝子を発現させることにより細胞
分化誘導物質を得ることができる。

宿主として大腸菌を用いる場合は、好ましくはＥ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２株の変異株、例えばＩＩＢＩＯＩ（ＡＴＣ
Ｃ３３６９４はなく、　ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，
ｐＢＲ３２７，ｐＵＣ８゜ｐｕｃ　　９．ｐＭＢ　　９
（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ　　８（ＡＴＣＣ３７
０７４）。

ｐＫＣ７（ＡＴＣＣ３７０８４）等のプラスミドあるい
はλ９ｔ、λＢ１　　シャロン４Ａのようなλファージ
、Ｍ１３ファージなどが用いられる。

大腸菌の菌体中に細胞分化誘導物質を産生させるために
、大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーター
が使用される。このようなブロモ−クーとして、好まし
くは、ラクトース分解酵素（ＬＡＣ）のプロモーターお
よびそのＵｖづ変異、ペニシラーゼ（ＢＬＡ）、トリプ
トファン合成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λファー
ジのｐｔプロモーターあるいはトリプトファン合成酵素
と、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであるＴＡ
Ｃプロモーター等が用いられる。

枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ　１７０株（ＡＴＣＣ
３３６０８）、　　ＢＲ１５１株　（ＡＴＣＣ３３６７
７）、　　Ｍｌ　　１１２株（ＡＴＣＣ３３７１２＞な
どが用いられ、ベクターとしてはｐｃｉ９４（ＡＴＣＣ
３７０３４）、　ｐｌＪ１３１１０　（ＡＴＣＣ３７０
１５）、　ｐＳＡ　２１００（ＡＴＣＣ３７０１４）、
　ｐＥ　１９４などのプラスミドが用いら旦゛１４゜ 枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素（ＣＡＴ）ヤペニシラ
ーセ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモーター
が用いられる。

酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ＋５ｅａ
ｅのＲＨ２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、　ＳＨＹ　
１株（ＡＴＣＣ４４７６９）、　ＳＨＹ　３１□株（Ａ
ＴＣＣ４４７７１）、　Ｄ　１３１Ａ株、４８３株、８
３０株などが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ　
１３　（ＡＴＣＣ３７１１５）、　ＹＥｐ　６．　ＹＲ
ｐ　７．　Ｙｌｐ　５などのプラスミドが用いられる。

酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）
、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、チトクロームＢ
（ＣＯＢ）、　ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）
、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる。高
等動物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、Ｃ
ＯＳ細胞、　　マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ１６１６
）なとか用いられ、そのベクターとしては３Ｖ４０、ラ
ンポリオーマウィルス等を用いることが１□できる。

以上詳細に説明した本発明の細胞分化誘導物質を、医薬
品製造の常套手段、例えば加熱処理、ろ過滅菌、凍結乾
燥、分注等の処理を適宜族して製剤化することにより、
従来にない新しい医薬品を得ることができる。

次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。なお以下
の記載において、　「％」は特に記載しない限り容量パ
ーセント（７７７％）を表わす。また特に記載がない限
り、培養は　３７°Ｃ１湿度９０〜１００％、５％炭酸
ガス含有空気中で行なった。

実施例 （１）ヒト　　】：　、　Ｍ　７１　　をコード　るｍ
ＲＮＡの　　１ヒト急性単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１
細胞を、１０％の牛胎児血清、５０単位／ｍｌのペニシ
リン及び　５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地にて、細胞密度６Ｘ１０５個／
ｍｌ　となるように、細胞浮遊液を調製し、その溶液を
　５００　ｍｌスピンナーボトル（ヘルコ社製）に植え
込み、分化誘導剤として、１２−０−テトラデカノイル
ホルホールー１３−アセテート（ＴＰＡ）を０．１　ｕ
　ｇ／ｍｌ’、　　ビタミンＡｉ（ＲＡ）を１Ｍｇ／ｍ
ｌ、　　さらに蛋白質合成阻害剤（シクロへキシミド）
１Ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７°Ｃ１５％炭酸
ガス含有空気中で　１４時間培養した。その後、細胞を
回収し冷ＰＢＳ　（−）で洗浄後、０５％ラウロイルザ
ルコシン酸ナトリウム、　　　５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム及び０．１Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む６Ｍ
グアニジルチオシアネート液に溶解した。このホモジネ
ートを０．１Ｍ　ＥＤＴＡ含有５．７Ｍ塩化セシウム水
溶液上に重層し、超遠心分離機（５Ｗ４１Ｔｉローター
、ベックマン）を用い、３０．００Ｏｒｐｍで１２時間
遠心し全ＲＮＡ画分をペレ７）として得た。これを５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、　　１％ＳＤＳを含む１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解した後、クロロホ
ルム−ｌ−ブタノールで抽出、エタノール沈澱として回
収した。ＴＨＰ−１細胞５ｘｌＯ”個より全ＲＮＡとし
て１１．６ｍｇが得られた。

この全ＲＮＡを滅菌蒸留水に溶解し、６８°Ｃで２分間
加熱した後急冷し、０．５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　　０．１％ＳＤＳを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）　　（以下、ローディング緩衝
液という）になるよう溶液を添加する。このＲＮＡ溶液
をあらかじめローディング緩衝液で平衡化したオリゴ（
ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着したポリ（Ａ）ｍ
ＲＮＡを１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　０．０５％ＳＤＳを含
む１０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）で
溶出することにより３．２９Ｊμｇのポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａを得た。

このポリ（Ａ）ｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵母細
胞に注入し、その１０個を１００μｌのパース培養液［
Ｇｕｒｄｏｎ、Ｊ、Ｂ、、　　Ｊ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅ
ｘｐ、Ｍｏｒｐｈｏｌ、、２０．４０１（１９６８）］
中、２２℃で４８時間培養し、ホモジナイズした後、そ
の遠心分離上清液の細胞分化誘導活性を測定した。該ｍ
ＲＮＡ　１ｇｇより６％の活性を取得した。

（２）ｌす人ｑ」し戊 （１）項で得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを鋳型としてＯ
ｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法［モレキュラー　アンド
　セルラー　バイオロジー；　Ｍｏ１ｅｃ、　ｃｅｌｌ
、　Ｂｉｏｌ、、ｉ。

−１９＝ ２８０（１９８３）］に準じてｃＤＮＡを合成し、零度
ベクターに組み込んだ。該ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ　（５ｕ
　ｇ）を５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｌ（Ｌ　５）
緩衝液２０μｌに溶解し、ベクタープライマー４μｍ（
２μｇ）を添加し３７°Ｃで５分間放置した。

さらに８ｍＭ　ＭｇＣｌ２．３０ｍＭ　ＫＣｌ、　１ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、　７５０単位／ｍｌ　ＲＮａｓｉｎ、　２
ｍＭ　ｄＧＴＰ、　２ｍＭ　ｄＡＴＰ、　２ｍＭ　ｄＴ
ＴＰ、　２ｍＭｄＣＴＰ、　　０．１７℃Ｍα−”’Ｐ
−ｄＣＴＰ（比活性、　　３．　ｏｏｏｃｉ／ｍｍｏｌ
ｅ）、　１３０単位逆転写酵素、になるように５０＋ｎ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）溶液を１６μｌ添
加し、４２℃で１時間反応させた後、ＥＤＴＡ、　　Ｓ
ＤＳを添加して反応を止めた。フェノール／クロロホル
ム混液で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃
度２．５Ｍになるように添加し、エタノール沈澱により
ＤＮＡ−ｍＲＮＡの複合・体を回収した。

（３）オリゴ（ｄＣテール付付加ＤＮＡの・製（２）項
で得られたＤＮＡ−ｍＲＮＡの複合体を下記組成の反応
緩衝液２０μｍに溶解させ、３７℃で５分間反応させ、
オリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。

反応緩衝液組成： １４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、　　３０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−２Ｏ− ＨＣＩ　（ｐＨ６，８）　、　　１ｍＭＣｏＣｌ２．　
　Ｏ，１１１１Ｍジチオスレイ　トール、　　ｘｏｔｔ
　ｇ／ｍｌポリ（Ａ）、　　７０℃ＭｄＣＴＰ。

２５０μＣｊ／ｍｌα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（８００Ｃｉ
／ｍｍｏｌｅ）、　　３Ｏ単位末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ。

反応後、ＥＤＴＡ−３ＤＳで反応を止め、フェノール−
クロロホルム抽出、エタノール沈澱で回収した。

（４）　　　　　旧ｎｄＩＩＩによる （３）項で得られたオリゴ（ｄＣ）付加ｃＤＮＡを、３
０μｍの滅菌蒸留水に溶解した後、１Ｏ単位の制限酵素
エイチアイエヌディ−ｍ　（Ｂｉｎｄｍ　）により３７
℃で２時間消化した。反応後、ＥＤＴＡ−３ＤＳで反応
を止め、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
澱で回収した。

（５）リンカ−ＤＮＡによる環ヒ 、（４）項で得られたオリゴ（ｄＣ）付加ｃＤＮＡを１
ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５）緩衝液（以下、ＴＥ液という。’）　１０
．５μｌに溶解し、そのうち５μｌを０．１Ｍ　ＮａＣ
１存在下で０．２μｇのオリゴ（ｄＧ）テールの付加し
たリンカ−と、６５°Ｃで５分、４２℃で１時間反応さ
せ、アニーリングを行った。反応終了後、下記組成の反
応緩衝液に溶解させ、１２°Ｃで一晩反応させた。

反応緩衝液： ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｌ＋７．５）、　　
４ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　１０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
，Ｏ，ＩＭ　ＫＣＩ、　　０．１ｍＭβ−Ｎ　ＡＤ。

５０、ｃｚ　ｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、　
　１．５７ｚ　ｇ／ｍｌ　　Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡリガー
ゼ。

（６）１１１Ｍ頃１ （５）項の反応液ニ４０ｔｔＭ　ｄＧＴＰ、　　４０℃
Ｍ　ｄＡＴＰ、　　４０１１　Ｍ　ｄＴＴＰ、　　４０
℃Ｍ　ｄＣＴＰ、　　０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ、　　１
Ｏ単位／ｍｌ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅＨ，４，５
単位／　ｍｌ　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＮＡリガーゼ、１ｇ
単位／　ｍｌ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼを
添加し、１２°Ｃで１時間、室温で１時間反応させた。

（７）【１五■ （６）項で得られたプラスミドＤＮＡ溶液１６０μｌを
、８０μｍの０．４Ｍ　ＭｇＣｌ２−０．ＩＭ　ＣａＣ
ｌ２と８ｏｏμｌのコンピテント細胞（ＨＢＩＯＩ）に
混合し、０°Ｃで２０分間、４２℃で２分間、室温で１
０分間処理した後、８ｍｌのし一プロ、、２（組成：　
１リットル当りバタトトリプトン１０ｇ。

酵母エキス５ｇ、　　Ｎ　ａ　Ｃ１５ｇ、　　グルコー
ス　Ｉｇ、　　ｐ）１７．５）を加え、３７°Ｃて１時
間振とうしながら培養した。

培養後２０００ｒｐｍで５分間遠心した。沈澱を４００
μ１４７）Ｌ−フロスに懸濁した後、５０μｇ／ｍ　］
のアンピンリンを含むＬ−グロス　８００ｍ１に植え込
み、３７°Ｃで一晩培養した。このようにして、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。

（８）ｃＤＮＡライフ゛ラリ−からの　　　　し−ゞ　
生の■ （７）項で得られた菌体を４グループに分け、ｉｔ’　
ｉ　Ｉ　ｋ　ｉｅらの方法［ヌクレイツク　アシッズ　
リサーチ；　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、７，８５９（１９７９）］に従いプラスミドを調製し
た。それぞれのプラスミド１０μｇを制限酵素ニスニー
エルＩ　（Ｓａｌ　Ｉ　）で消化し、ツマらの方法［不
イチ＋　−；　Ｎａｔｕｒｅ、３１９，６４０゜（１９
８６）参照］に準じて、ｍＲＮＡを合成した。すなわち
、３μｇのシリ」□消化済みＤＮＡを、下記組成の反応
緩衝液５０μｌに溶解させ、４０　’Ｃで１時間反応さ
せた。

反応緩衝液： ４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　　６
ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　２ｍＭスペルミジ７．　０．５ｍ
Ｍ　ＡＴＰ、　　０．５ｍＭ　ＣＴＰ。

０．５ｍＭ　　ＵＴＰ、　　０．５ｍＭ　　ＧＴＰ、　
　０．１ｍｇ／ｍｌ　　ＢＳＡ、　　　１０ｍＭ　ジチ
オスレイトール、　　１ｍＭ　ｍ７−ＧｐｐｐＧ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）、５０単位ＲＮａｓｅインヒビタ
ー、８単位ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼ。

反応終了後、エタノール沈澱によりｍＲＮＡを回収し、
５μｌの滅菌蒸留水に溶解した。このｍＲＮＡ水溶液を
５０ｎｌずつアフリカッメガエルの卵母細胞にマイクロ
インジェクションにより注入し、その１０個をパース培
養液１００μｍ中、２２°Ｃで４０時間培養し、ホモジ
ナイズした後、その遠心分離上清液の細胞分化誘導活性
を測定した。対照区が０．２％に対し、Ｎｏ、　３のグ
ループでは０９％の活性を示した。

（９）クローニング 次にＮｏ、　３のプラスミドを用い、（７）項の方法に
準じて形質転換を行い、１５のグループに分割した。

それぞれのグループよりプラスミドＤＮＡを調製し、（
８）項と同様にｍＲＮＡを合成し、アフリカッメガエル
の卵母細胞にマイクロインジェクションし、細胞分化誘
導活性を測定した。対照区が６％に対し、Ｎｏ、３−１
５のグループでは１９％の活性を示した。

さらにＮｏ！−１５の形質転換体を１６のグループに分
割し、それぞれよりプラスミドＤＮＡを調製し、同様に
細胞分化誘導活性を測定した。対照区が９％に対し、Ｎ
ｏ、　３−１５−９のグループでは３６％の活性を示し
た。

Ｎｏ、　３−１５−９を１２のグループに分割し、それ
ぞれよりプラスミドＤＮＡを調製し、同様に細胞分化誘
導活性を測定した。対照区が０．６％に対し、Ｎｏ、　
３−１５−９−７のグループでは１７％の活性を示した
。

最終段階として、Ｎｏ、３−１５−９−７のグループの
形質転換体各々よりプラスミドＤＮＡを調製し、同様に
細胞分化誘導活性を測定した。対照区が１．４％に対し
、Ｎｏ、　３−１５−９−７−７では３．６％の活性を
示した。

（ｌＯ）クローンヒｃＤＮＡの塩基配列の決定（９）項
で選択された形質転換体Ｎｏ、　３−１５−９−７−７
をＬ−ブロスて培養し、その菌体から、Ｗｉｌｋｉｅら
の方法［ヌクレイツク　アシノズ　リサーチ；Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ヱ、　８５９　（１９
７９）］に従いプラスミドを調製した。このプラスミド
ＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ１ｉＩで消化し、分離精製して
クローン化ＤＮＡを得このＤＮＡ断片の塩基配列は、Ｍ
１３ファージを用いるジデオキシ法で決定した。

クローニングベクターとして旧３ｍｐ１８　［Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製］を用い、Ｍ１３シークエンシングキッ
ト［宝酒造（株）製コをＴＡＫＡＲＡ　７−ＤＥＡＺＡ
シークエンスキット説明書に従って塩基配列を決定した
。

その塩基配列及びその塩基配列に対応するアミノ酸配列
を下記第１表に示す。

第１表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式（Ａ）で示されるアミノ酸配列からなる細胞
   分化誘導物質。 【アミノ酸配列があります】（Ａ） ２、特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列に対応す
   る塩基配列を有しまたは含むＤＮＡ。 ３、下記式（ I ）で示される塩基配列を有しまたは含
   むＤＮＡ。 （５´）【アミノ酸配列があります】 −（３´）（ I ） ４、特許請求の範囲第２項または第３項記載のいずれか
   のＤＮＡを組み込んだベクター。５、ベクターがプラス
   ミドである特許請求の範囲第４項記載のベクター。