【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、切傷、擦傷等の傷口、火傷による創
面、手術創面、体表面に生じた潰瘍、抜歯窩など
の創傷部の治療に用いられる創傷部治療材料に関
し、さらに詳しくは長期間有効に創傷部における
安定化フイブリンの生成を促進しうる創傷部保護
材料に関する。
切傷、擦傷などの傷口、手術創面、抜歯窩など
の創傷部に適用される治療用材料として、トロン
ビンを含有させたゼラチンスポンジ（米国特許
2558395号、特公昭31−4644号）、変性ゼラチンス
ポンジの片面にトロンビンを含有する未変形ゼラ
チンスポンジ層を積層したもの（特公昭49−
46898号）などが公知である。ゼラチンに含まれ
るトロンビンは、創傷部のフイブリノーゲンに作
用してフイプリン塊を形成させることにより止血
を行なうのであるが、トロンビンにより生成する
フイブリンは非安定化フイブリンと呼ばれ、酸、
尿素などに溶解し、プラスミン分解を受けやすい
ため、創傷部の治癒が著しく遅れることが多い。
本出願人は、長期間有効に創傷面における安定
化フイブリンの生成を促進しうる創傷部治療用材
料を得るべく検討を重ねた結果、トロンビンと血
液凝固第因子（以下Ｆと略記する。）の
両者を共存させて固定化することにより長期間に
わたりフイブリノーゲンより非安定化フイブリン
を経て安定化フイブリンを生成させることができ
ることを見い出し、先に提案した（特開昭55−
58163号）。この創傷部治療用材料によれば、非安
定化フイブリンにトロンビンの存在下にFXが
作用することによりフイブリン分子間に架橋が形
成されて安定化フイブリンが生成し、この安定化
フイブリンが創傷治ゆに必要な場を提供するとと
もに、FXが線維芽細泡の増殖を助長するので
創傷部を有効に治ゆすることができる。しかも、
この創傷部治療用材料においてはトロンビン及び
FXが固定化されているので、その安定化フイ
ブリン形成能力は一応、長期間にわたりかなり高
度に維持される。しかしながら、かかる創傷部治
療用材料の安定化フイブリン形成能力は経時的に
徐々に低下することが判明した。
本発明者らは、かかる状況に鑑み、上記の創傷
部治療用材料よりも安定化フイブリン形成能力
（以下活性度という。）がさらに高められ、かつそ
の活性度の経時的な低下が少ない創傷部治療材料
を提供することを目的として引続き検討を重ねた
結果、FXとトロンビンをそれぞれ別々の構造
物に固定化し、そのようにして得られた構造物同
志を重ね合せた積層物の方が、FXとトロンビ
ンの両者を共に固定化した構造物よりも活性度が
高く、しかも経時的な活性度の低下が少ないこと
を見い出し本発明に到達したものである。
すなわち本発明は、モノフイラメント、繊維集
合体、フイルム、スポンジなどの形状を有する構
造物からなる創傷部治療用材料において、トロン
ビンが固定化されている構造物と血液凝固第
因子や固定化されている構造物とが積層されてい
ることを特徴とする長期間有効に創傷部における
安定化フイブリンの生成を促進しうる創傷部治療
用材料である。
本発明における創傷部治療用材料とは、モノフ
イラメント、綿、紙、不織布、織物、編物などの
繊維集合体、フイルム、スポンジなどの形状を有
する構造物からなる治療用材料をいう。
本発明における構造物としては、柔いこと、体
液によつて膨潤し、創傷部と密着しうることなど
からスポンジが好ましい。
本発明において構造物を構成する素材として
は、たとえばセルローズ、セルロース誘導体、蛋
白質、合成ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリア
ミド、ポリオレフイン、ジエンのポリマー、塩素
化ポリオレフイン、Ｎ−ビニル化合物の重合体、
芳香族ビニル化合物の重合体、ポリビニルアルコ
ール及びその誘導体、不飽和アルデヒドの重合
体、不飽和カルボン酸の重合体、不飽和カルボン
酸エステルの重合体、不飽和カルボン酸無水物の
重合体、不飽和ニトリルの重合体、不飽和カルボ
ン酸アミドの重合体、ポリエーテル、シリコン樹
脂、ポリウレタン、天然ゴムなどの特開昭55−
58163号公報に開示されているものを用いること
ができる。これらのなかでも創傷部に適応した
後、これを除去する必要がないという利点から、
たとえばコラーゲン、ゼラチン、ポリグリコール
酸、ポリ乳酸、グリコール酸−乳酸共重合体、ポ
リグルタミン酸、アミロース、コハク酸アミロー
スなどの酸化アミロースなどの生体吸収物質、と
くにゼラチン、コハク酸アミロースが好ましく用
いられる。
本発明の創傷部治療用材料においては、上記の
ごとき構造物が少なくとも２層積層されているこ
とが必要であり、さらに詳しくはトロンビンが固
定化されている構造物とFXが固定化されてい
る構造物とが積層されていることが必要である。
積層数は２層以上であれば何層でもよいが、製造
面及び効果の面よりみて２層又は３層が好まし
い。とくに、FXが固定化された構造物の両側
にトロンビンが固定化された構造物を積層した３
層構造のものが効果が優れているので好ましい。
本発明に用いるトロンビンは、フイブリノーゲ
ンをフイブリンに転化することができる蛋白分解
酵素である。トロンビンは、人、牛、豚などの血
液より分解されるが、人の創傷部に適用する場合
には人トロンビンを用いるのが好ましい。
本発明に用いるFXはフイブリン安定化因子
と呼ばれ、非安定化フイブリンに直接作用し、フ
イブリン分子間のイソペプチド結合の生成に関与
する因子である。FXは人、牛などの血液ある
いは胎盤より分離されるが、人の創傷部に適用す
る場合には人由来のFXを用いるものが好まし
い。
トロンビン又はFXモノフイラメント、繊維
集合体、フイルム、スポンジなどの形状を有する
構造物に結合させるか、又は吸着させることによ
り固定化することができる。トロンビン又はFX
を創傷部治療用材料を構成する構造物に結合さ
せるには、たとえば共有結合法や、イオン結合法
を採用することができるし、また吸着させるに
は、同じく物理的吸着法や包括法を採用すること
ができる。包括法はトロンビン又はFXをゲル
の微細な格子の中に包み込んで脱離できないよう
にする方法であり、とくにコラーゲン、ゼラチ
ン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸
−乳酸共重合体、ポリグルタミン酸、アミロース
などの吸収性物質に固定化する場合に適してい
る。固定化に際しては特開昭55−58163号公報に
記載の方法などの公知の方法を採用することがで
きる。
本発明の創傷部治療用材料を製造するには、前
記のごとき構造物にトロンビン又はFXを固定
化したのち、好ましくは凍結乾燥して溶媒等を十
分除去し、ついで得られたそれぞれの固定化物を
積層すればよい。固定化物を積層するには公知の
いかなる方法を採用してもよいが、接着剤を用い
てたとえば点接着、面接着などを行なう方法が好
ましく採用できる。また、本発明の創傷部治療用
材料を製造するには上記のごとき方法のほかに、
まず構造物に加工する前に素材のそのものにトロ
ンビン又はFXを固定化し、しかるのちトロン
ビン又はFXが固定化された素材を構造物に加
工し、次いでこれらの構造物を積層することによ
つても製造することができる。
本発明の創傷部治療用材料の製造に際しては、
FXの活性化に関与するカルシウムイオンを固
定化することができる。さらに、本発明の創傷部
治療用材料の製造に際しては、必要に応じてトロ
ンビン又はFXとともに、殺菌剤、抗生物質、
ホルモンなどの医薬品、アルブミン、α1−アンチ
プラスミン、α2−マクログロブリンなどのプロテ
ア−ゼインヒビター、セルロプラスミン、ハプト
グロブリン、コールドインソルグロブリンなどの
血しようたん白、フアイブロネクチンなどを構造
物に固定化することができる。アンチプラスミン
はフイブリン溶解酵素であるプラスミンの阻害剤
であり、したがつてプラスミンを阻害することに
よりフイブリン溶解活性（すなわち線溶活性）を
抑制する。したがつてトロンビン又はFXとと
もにアンチプラスミンが固定化された創傷部治療
用材料は、線溶活性を抑性することによりフイブ
リンの生成を促進することができる。アンチプラ
スミンとしては、たとえばウシの肺臓より抽出さ
れるアプロチニン、微成物の培養液から分離され
るペプスタチン、ロイペプシン、アンチパイン、
キモスタチンなどの天然物質、ε−アミノカプロ
ン酸、トラネキサム酸、メシル酸ガベキサートが
あげられるが、特にε−アミノカプロン酸、トラ
ネキサム酸が好適に用いられる。
本発明の創傷部治療用材料は著しく優れた活性
度を有し、しかも保存中や使用中における活性度
の低下が少ないという特徴を有する。したがつ
て、本発明の創傷部治療用材料は、切傷、擦傷な
どの傷口、手術創面、抜歯窩などの創傷部に適用
され長期間有効に創傷部の早期治ゆ、縫合不全の
防止などに著しい効果を発現する。
次に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説
明する。なお、トロンビンとしては、株式会社ミ
ドリ十字の人血漿トロンビンをFXとしてはベ
ーリングベルケ社の胎盤由来のFX濃縮乾燥製
剤を用いた。FX製剤は１バイアルあたり新鮮
人血漿250mlに相当するFX活性を有し、トロン
ビン製剤は１バイアルあたり新鮮人血漿500mlに
相当するトロンビン活性を有する。
また、FXの活性度測定は次のようにして行
なつた。すなわち、創傷部治療用材料を所定の大
きさの立方体に裁断し、同容積の生理食塩水で37
℃にて15分インキユベートし、固定化物を抽出
し、抽出液より希釈比1/1、1/5、1/10、1/20、1/
４０、の希釈系列を作成し、おのおのその50μず
つを採取し、その採取液に0.025mol／に調整
した塩化カルシウム水溶液と1.9wt％に調整した
カオリン水懸濁液（カオリン：石律製薬製Extra
Pure）との等容量混合溶液100μを加え、フイ
ブリノーゲン（ヒユーマンプラズマ、ミドリ十字
(株)製）の1.3wt％生理食塩水溶液10μを加え、
ついで得られた混合液を37℃にて10分間インキユ
ベートした後、5w／ｖ％モノクロル酢酸生理食
塩水溶液を３ml添加し37℃にて２分間インキユベ
ートしたときに生成する不溶性クロケツトを観察
し不溶性クロケツトの存在する希釈比の逆数をも
つて活性度とした。
実施例１、比較例１
山之内製薬株式会社製のゼラチンスポンジ（５
cm×2.5cm×0.5cm）１枚をFX水溶液（FX１
バイアルを水５mlに溶解）に、他の１枚をトロン
ビン水溶液（トロンビン１バイアルを水５mlに溶
解）に室温にて５分間浸漬した後、20時間−30℃
にて凍結乾燥した。乾燥された２枚のスポンジ
を、濃厚ゼラチン水溶液を１枚のスポンジの片面
にはけぬりし、２枚を重ねることにより張り合わ
せた。その後、再び−30℃にて凍結乾燥を５時間
行なつた。得られた材料は二つに分け、一方を７
℃の空気中に、他のものを７℃の乾燥窒素中に保
存した。
比較のために上記のものと同じゼラチンスポン
ジ１枚をFXとトロンビンの混合水溶液（FX
１／２バイアルを３mlの水に、トロンビン1/2バイア
ルを２mlの水に溶解した後、両者を混合したも
の）に室温にて５分間浸漬した後、20時間−30℃
にて凍結乾燥した。得られた材料は上記の場合と
同様に７℃の空気中と７℃の乾燥窒素中に保存し
た。
実施例１と比較例１で得られた材料は１cm立方
に裁断し、活性度テストに供した。結果は表１の
通りであつた。なお、両材料共に単位体積あたり
に固定化されたFXとトロンビンの量は等しか
つた。
The present invention relates to a wound treatment material used to treat wounds such as cuts, abrasions, burns, surgical wounds, ulcers on the body surface, and tooth extraction sockets. The present invention relates to a wound protection material that can promote the production of stabilized fibrin in the wound area. Gelatin sponge containing thrombin (U.S. patent
No. 2558395, Special Publication No. 4644 of 1972), a layer of undeformed gelatin sponge containing thrombin laminated on one side of a modified gelatin sponge (Special Publication of Japanese Patent Publication No. 49 of Showa 49).
No. 46898) and the like are publicly known. Thrombin contained in gelatin acts on fibrinogen in the wound area to form a fibrin clot to stop bleeding, but the fibrin produced by thrombin is called non-stabilized fibrin and is
Because it dissolves in urea and is susceptible to plasmin degradation, wound healing is often significantly delayed. As a result of repeated studies to obtain a wound treatment material that can effectively promote the production of stabilized fibrin on the wound surface for a long period of time, the present applicant has discovered that thrombin and blood coagulation factor (hereinafter abbreviated as F) It was discovered that by coexisting and immobilizing both fibrinogen, stabilized fibrin can be generated from non-stabilized fibrin over a long period of time, and this was proposed earlier (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1987-1999).
No. 58163). According to this wound treatment material, when FX acts on non-stabilized fibrin in the presence of thrombin, crosslinks are formed between fibrin molecules and stabilized fibrin is produced, and this stabilized fibrin is used for wound healing. In addition to providing the necessary space for fibroblasts to grow, FX also promotes the proliferation of fibroblast bubbles, allowing the wound to heal effectively. Moreover,
This wound treatment material contains thrombin and
Since FX is immobilized, its ability to form stabilized fibrin is maintained at a fairly high level over a long period of time. However, it has been found that the ability of such wound treatment materials to form stabilized fibrin gradually declines over time. In view of this situation, the present inventors have discovered that the stabilizing fibrin forming ability (hereinafter referred to as activity) is even higher than that of the above-mentioned wound treatment materials, and that the activity is less likely to decrease over time. As a result of continued studies aimed at providing therapeutic materials, we found that FX and thrombin were immobilized in separate structures, and a laminate made by stacking the resulting structures on top of each other showed that FX The present invention was achieved based on the discovery that the activity is higher than that of a structure in which both 1 and 3 and thrombin are immobilized, and that the activity decreases less over time. That is, the present invention provides a material for wound treatment comprising a structure having a shape such as a monofilament, a fiber aggregate, a film, or a sponge, in which a structure in which thrombin is immobilized and a blood coagulation factor or The present invention is a wound treatment material that can effectively promote the production of stabilizing fibrin in a wound for a long period of time, and is characterized in that it has a laminated structure with a wound structure. The wound treatment material in the present invention refers to a treatment material made of a structure having a shape such as a fiber aggregate such as monofilament, cotton, paper, nonwoven fabric, woven fabric, or knitted fabric, film, or sponge. As the structure in the present invention, a sponge is preferable because it is soft, swells with body fluids, and can come into close contact with a wound. Examples of materials constituting the structure in the present invention include cellulose, cellulose derivatives, proteins, synthetic polyamino acids, polyesters, polyamides, polyolefins, diene polymers, chlorinated polyolefins, N-vinyl compound polymers,
Polymers of aromatic vinyl compounds, polyvinyl alcohol and its derivatives, polymers of unsaturated aldehydes, polymers of unsaturated carboxylic acids, polymers of unsaturated carboxylic acid esters, polymers of unsaturated carboxylic acid anhydrides, unsaturated 1981- JP-A-1998-1, which contains nitrile polymers, unsaturated carboxylic acid amide polymers, polyethers, silicone resins, polyurethanes, natural rubber, etc.
The material disclosed in Japanese Patent No. 58163 can be used. Among these, it has the advantage that it does not need to be removed after adapting to the wound area.
For example, bioabsorbable substances such as collagen, gelatin, polyglycolic acid, polylactic acid, glycolic acid-lactic acid copolymer, polyglutamic acid, amylose, oxidized amylose such as amylose succinate, and especially gelatin and amylose succinate are preferably used. In the wound treatment material of the present invention, it is necessary that at least two layers of the above structures are laminated, and more specifically, a structure in which thrombin is immobilized and a structure in which FX is immobilized. It is necessary that the structures are laminated.
The number of laminated layers may be any number as long as it is two or more layers, but two or three layers are preferable from the viewpoint of manufacturing and effectiveness. In particular, a structure in which thrombin is immobilized is laminated on both sides of a structure in which FX is immobilized.
A layered structure is preferable because it has excellent effects. Thrombin used in the present invention is a proteolytic enzyme that can convert fibrinogen to fibrin. Thrombin is degraded from blood of humans, cows, pigs, etc., but when applied to human wounds, it is preferable to use human thrombin. FX used in the present invention is called a fibrin stabilizing factor, and is a factor that directly acts on non-stabilized fibrin and is involved in the generation of isopeptide bonds between fibrin molecules. FX is isolated from blood or placenta of humans, cows, etc., but when applied to human wounds, it is preferable to use FX derived from humans. Immobilization can be achieved by binding or adsorption to a structure having the shape of thrombin or FX monofilament, fiber aggregate, film, sponge, or the like. Thrombin or FX
For example, a covalent bonding method or an ionic bonding method can be used to bond the material to the structure constituting the wound treatment material, and a physical adsorption method or an entrapment method can be used for adsorption. can do. The entrapment method is a method in which thrombin or FX is wrapped in a fine lattice of gel so that it cannot be released, and it is particularly suitable for collagen, gelatin, polyglycolic acid, polylactic acid, glycolic acid-lactic acid copolymer, polyglutamic acid, Suitable for immobilization on absorbent substances such as amylose. For immobilization, known methods such as the method described in JP-A-55-58163 can be employed. In order to produce the wound treatment material of the present invention, thrombin or FX is immobilized on the above-mentioned structure, preferably freeze-dried to sufficiently remove the solvent, and then each of the immobilized products obtained is All you have to do is laminate them. Although any known method may be used to laminate the immobilized materials, it is preferable to use a method using an adhesive such as point adhesion or surface adhesion. In addition to the above-mentioned methods, the wound treatment material of the present invention can be produced by
First, thrombin or FX is immobilized on the material itself before processing it into a structure, and then the material on which thrombin or FX is immobilized is processed into a structure, and then these structures are laminated. can be manufactured. When manufacturing the wound treatment material of the present invention,
Calcium ions involved in FX activation can be immobilized. Furthermore, when manufacturing the wound treatment material of the present invention, in addition to thrombin or FX, bactericidal agents, antibiotics,
Pharmaceuticals such as hormones, protease inhibitors such as albumin, α 1 -antiplasmin, and α 2 -macroglobulin, blood proteins such as ceruloplasmin, haptoglobulin, and cold insol globulin, and phaibronectin are used as structures. Can be immobilized. Antiplasmin is an inhibitor of the fibrinolytic enzyme plasmin, and thus suppresses fibrinolytic activity (ie, fibrinolytic activity) by inhibiting plasmin. Therefore, a wound treatment material in which antiplasmin is immobilized together with thrombin or FX can promote fibrin production by suppressing fibrinolytic activity. Antiplasmin includes, for example, aprotinin extracted from bovine lungs, pepstatin, leupepsin, antipain isolated from microorganism culture solutions,
Examples include natural substances such as chymostatin, ε-aminocaproic acid, tranexamic acid, and gabexate mesylate, and ε-aminocaproic acid and tranexamic acid are particularly preferably used. The material for treating wounds of the present invention has a remarkable degree of activity, and is characterized in that the degree of activity decreases little during storage and use. Therefore, the wound treatment material of the present invention can be applied to wounds such as cuts and abrasions, surgical wounds, tooth extraction sockets, etc., and can be effectively used for long-term healing of wounds, prevention of suture failure, etc. Demonstrates remarkable effects. EXAMPLES Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. As the thrombin, human plasma thrombin manufactured by Midori Juji Co., Ltd. was used, and as the FX, a placenta-derived FX concentrated dry preparation manufactured by Bering Berke was used. The FX formulation has an FX activity equivalent to 250 ml of fresh human plasma per vial, and the thrombin formulation has a thrombin activity equivalent to 500 ml of fresh human plasma per vial. Furthermore, the activity of FX was measured as follows. In other words, cut the wound treatment material into cubes of a predetermined size, and add the same volume of physiological saline to the cube.
Incubate at ℃ for 15 minutes, extract the immobilized material, and dilute the extract with dilution ratios of 1/1, 1/5, 1/10, 1/20, 1/
Create a dilution series of 40, collect 50μ of each, and add to the sample solution a calcium chloride aqueous solution adjusted to 0.025 mol/Kaolin aqueous suspension adjusted to 1.9 wt% (Kaolin: Seki Ritsu Seiyaku Extra
Add 100μ of an equal volume mixed solution of fibrinogen (Hymann Plasma, Green Cross).
Add 10μ of 1.3wt% physiological saline solution (manufactured by Co., Ltd.),
After incubating the resulting mixture at 37°C for 10 minutes, 3 ml of 5w/v% monochloroacetic acid saline solution was added and incubated at 37°C for 2 minutes to observe the insoluble croquettes. The reciprocal of the existing dilution ratio was taken as the activity. Example 1, Comparative Example 1 Gelatin sponge (5
cm x 2.5cm x 0.5cm) with FX aqueous solution (FX1
One vial was dissolved in 5 ml of water), and the other was immersed in an aqueous thrombin solution (1 vial of thrombin dissolved in 5 ml of water) for 5 minutes at room temperature, and then incubated at -30°C for 20 hours.
It was freeze-dried. The two dried sponges were pasted together by applying a concentrated aqueous gelatin solution to one side of the sponge and stacking the two sponges together. Thereafter, freeze-drying was performed again at -30°C for 5 hours. Divide the obtained material into two, and divide one into 7
One was stored in air at 7°C, the other in dry nitrogen at 7°C. For comparison, one sheet of the same gelatin sponge as above was treated with a mixed aqueous solution of FX and thrombin (FX
After dissolving 1/2 vial in 3 ml of water and 1/2 vial of thrombin in 2 ml of water, then immersing them in a mixture of both at room temperature for 5 minutes, the mixture was incubated at -30°C for 20 hours.
It was freeze-dried. The resulting material was stored in air at 7°C and in dry nitrogen at 7°C as in the above case. The materials obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were cut into 1 cm cubes and subjected to an activity test. The results were as shown in Table 1. In addition, the amounts of FX and thrombin immobilized per unit volume were equal for both materials.
【表】
表１の結果から明らかなように実施例のものは
比較例のものに比べて調整直後の活性度が著しく
優れており、しかも保存安定にも優れている。と
くに空気中に保存した場合には実施例のものが優
れた安定性を示すのに対し、比較例のものでは、
その低下が大きい。
実施例２、比較例２
ゼラチンスポンジの代わりに、ポテトより分離
精製されたでんぷんを水酸化ナトリウム水溶液中
で無水コハク酸と反応させ、生成した沈殿をロ
過、透析し、凍結乾燥、架橋を行なつて得たコハ
ク酸アミローススポンジ（５cm×2.5cm×0.5cm）
を用いた他は実施例１、比較例１と全く同様にし
て材料を得、得られた材料について実施例１と同
じ活性度テストを行なつた。
得られた結果は実施例１、比較例１と同様の傾
向を示し、調製直後の活性度は、実施例２が40以
上であるのに対し比較例２は活性度10であり、ま
た保存安定性も実施例２のものの方が著しく優れ
ていた。[Table] As is clear from the results in Table 1, the products of the Examples have significantly superior activity immediately after preparation, and are also excellent in storage stability, compared to those of the Comparative Examples. Particularly when stored in air, the examples show excellent stability, whereas the comparative examples show excellent stability.
The decline is significant. Example 2, Comparative Example 2 Instead of gelatin sponge, starch separated and purified from potatoes was reacted with succinic anhydride in an aqueous sodium hydroxide solution, and the resulting precipitate was filtered, dialyzed, freeze-dried, and cross-linked. Succinic acid amylose sponge obtained over time (5cm x 2.5cm x 0.5cm)
A material was obtained in exactly the same manner as in Example 1 and Comparative Example 1, except that the following was used, and the same activity test as in Example 1 was conducted on the obtained material. The obtained results showed the same tendency as Example 1 and Comparative Example 1, and the activity immediately after preparation was 40 or more in Example 2, while Comparative Example 2 had an activity of 10, and was storage stable. The properties of Example 2 were also significantly superior.