JP7606654B2 - マクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンド、及びこれを用いたマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法 - Google Patents

マクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンド、及びこれを用いたマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法 Download PDF

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Description

本発明は、マクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンド、及び当該ナノリガンドを用いたマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法に関し、具体的には、当該ナノリガンドを用いマクロファージの細胞付着や再生性分極化の遠隔制御を行う方法に関する。
マクロファージは、先天免疫を担当する主要な細胞である。ほとんどは体中に定着性細胞として存在するが、一部、血液で単球として存在するものもある。当該単球は、樹状細胞やマクロファージに分化することができる。ほとんどのマクロファージは定着性であり、主に肺胞マクロファージ、Fミクログリア、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞などが挙げられる。これらの細胞は体中に分布しながら、抗原が侵入すると捕食するか、或いは毒素を分泌して抗原を破壊し、リンパ球に抗原を伝達して免疫反応を引き起こす。血中の単球は敵が傷に侵入すると、好中球のように血管外に出て、マクロファージに分化して細菌を除去する。また、マクロファージは体内複数の場所を移動して食作用をする遊走性（Ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）と指定された臓器に固定されて食作用をする定着性（Ｆｉｘｅｄ ｆｏｒｍ）に分けられる。定着性マクロファージとしては、肝臓のクーパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ）、肺胞のマクロファージ、結合組織の構造（Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）、脳の小膠細胞（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）などが挙げられる。
このように、マクロファージのＭ２分極化による再生成効果及びＭ１分極化による抗炎症性効果を効率的に制御するための方法として、リガンドの提示による体内技術が開示されている。しかしながら、従来の体内におけるナノリガンド提示はほぼ静的で、たとえ動的であってもリアルタイムの遠隔制御による
マクロスケールのナノリガンド密度の可逆的変化を引き起こせないという短所があった。
韓国公開特許第２０１８－００１７７０４号公報
本発明が解決しようとする課題は、基板と静電的に結合して移動できるナノリガンドを提供し、当該ナノリガンドを用いて、リアルタイムの遠隔制御により巨視的なナノリガンド密度の可逆的変化を引き起こし、マクロファージの細胞付着や再生性分極化を促進する方法を提供することである。
本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアと、コアを包み込むように設けられ、インテグリン付着性リガンドペプチドを含むコーティング層と、を含み、
インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、マクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドを提供する。
更に本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、リンカーが結合されたコアをインテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、上述したマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドの製造方法を提供する。
更に、本発明は、上述したマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドを含む溶液に、表面が活性化された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造するステップと、ナノリガンド提示基板に培養液を処理した後、外部の磁場を印加し、マクロファージの細胞付着・再生性分極化を調整するステップと、を含む、マクロファージの細胞付着・再生を促進する方法を提供する。
本発明によるマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドは、磁性ナノ粒子を含むコア上に負に荷電されたリガンドをコーティングしたもので、基板との静電結合により基板上で容易に移動（スライド）できる。
更に、本発明によるマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法は、当該ナノリガンドを含む基板に磁場を印加することにより、ナノリガンドのスライドを時間的・空間的に制御するに留まらず、可逆的な制御をも可能とし、磁場ベースの時空間的制御により体外・体内でのマクロファージの細胞付着や表現型の分極を効率的に調整することができる。
本発明の一実施例によるマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンド、及びこれを用いたマクロファージの細胞付着・再生方法を示した模式図である。 本発明の一実施例によるマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法を図式化した図である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）である（スケールバー：２０ｎｍ）。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの特性を示したもの。（ａ）は、サイズ分布を有する磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とアミノ－シリカ被覆ＭＮＰの動的光散乱画像、（ｂ）は、代表的なアミノ－シリカ被覆ＭＮＰの高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（Ｈｉｇｈ－ａｎｇｌｅ ａｎｎｕｌａｒ ｄａｒｋ－ｆｉｅｌｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）画像である（スケールバー：２０ｎｍ）。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのフーリエ変換赤外スペクトル画像である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの振動サンプル磁力計ヒステリシス（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ）である。 本発明の一実施例による基板とスライド可能なナノリガンドの静電結合（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を図式化した画像である。 本発明の一実施例にマイクロスケールとナノスケールのナノリガンドのスライドに対するＩｎ ｓｉｔｕ可逆的時空間操作（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）を撮像した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、並びに原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。（ａ）及び（ｂ）は、正に荷電された基板とナノリガンドの画像、（ｃ）及び（ｄ）は、低速度ＳＥＭ撮像（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ＳＥＭ ｉｍａｇｉｎｇ）の結果、（ｅ）は、ＡＦＭ走査によるナノリガンドのスライドにおけるナノスケールの変位を示したものである。 比較例として永久磁石無しで撮影した、Ｉｎ ｓｉｔｕナノリガンドのスライドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。 本発明の一実施例によるスライドナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ制御におけるインテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１）結合の調整に関する。（ａ）基板の「左下」に永久磁石があるスライドナノリガンドの模式図、（ｂ）基板の「磁石」、「中間」、「非磁石」でスライド可能なナノリガンドに結合された後のインテグリンβ１クラスタに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像（スケールバー：５０μｍ）、（ｃ）基板の「磁石」、「中間」、「非磁石」でインテグリンβ１クラスタの染色強度の定量を示したグラフでである。 本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御実験結果を示した図である。（ａ）は、基板の底（「磁石」側）に永久磁石を配置して行った２４時間のマクロファージ培養後、ビンキュリン、アクチン、核の免疫蛍光染色と相応の共焦点顕微鏡画像と共に、基板の底（「磁石」の側）に永久磁石を配置することでスライド可能なナノリガンドを操作している概略図である。（ｂ）は、マクロファージの細胞付着細胞密度、細胞の面積、細胞縦横比の定量を示したグラフである。 比較例によるマクロファージの細胞付着性実験の結果である。（ａ）は、ＲＧＤペプチドリガンド又は磁場がない場合、２４時間のマクロファージ培養の後、ビンキュリン、アクチン、核の免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。（ｂ）は、マクロファージ密度、面積、縦横比の定量を示したグラフである。 本発明の一実施例によるマクロスケールのナノリガンドの調整によりマクロファージの細胞付着性を制御した実験結果である。（ａ）は、基板の底に永久磁石を配置した（「磁場（ＭＦ）」）状態、又は基板から永久磁石を取り除いた（「磁場なし（ＮＭＦ）」）状態で行った１２時間又は２４時間のマクロファージ培養後の、Ｆ－アクチンと核を持つビンキュリンに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。（ｂ）は、基板の「左側」面のマクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるナノリガンドの時間調整による基板の「右側」面におけるマクロファージ密度、面積、縦横比の定量を示したグラフである。 本発明の一実施例によるマクロスケールナノリガンド提示の時間的切り替えに対する（ａ）免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像、（ｂ）マクロファージの密度、細胞の面積、細胞の縦横比を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるナノリガンドの時間調整磁気引力に基づいた表現型の実験結果である。（ａ）は、Ｍ２分極培地で培養されたマクロファージのＭ２表現型マーカ（Ａｒｇｉｎａｓｅ－１及びＹｍ１）、又はＭ１分極培地で培養されたマクロファージのＭ１表現型マーカ（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の定量的遺伝子発現を示したグラフである。（ｂ）～（ｃ）は、培養されたマクロファージのＡｒｇ－１及び核のｉＮＯＳの免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＭ１分極培地（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）におけるマクロファージのＭ２表現型を示したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＭ２分極培地（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）におけるマクロファージのＭ１表現型を示したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力の静電気的引力に対するマクロファージのＭ２表現型実験における免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。 本発明の一実施例によるナノリガンドの自己人材調整実験の、（ａ）免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像、（ｂ）付着性マクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を、或いはＭ２培地で培養した後の面積、縦横比、Ａｒｇ－１の染色強度の計算を示したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力に対する体内での宿主マクロファージの細胞付着性・炎症性Ｍ１表現型に関する実験の結果である。（ａ）は、体内でスライド可能なナノリガンドの磁気制御の凡その模式図である。（ｂ）は、基板の「磁石」側と「非磁石」側に付着した細胞のｉＮＯＳ、Ｆ－アクチン、核の免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。（ｃ）は、体内の付着細胞のＭ１表現型マーカ（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の遺伝子発現プロファイル（ｎ＝３）、密度、細胞の面積、細胞縦横比（ｎ＝３０）の計算を示したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドに関する宿主好中球の体内付着実験の結果である。（ａ）は、基板上にＩＬ－４及びＩＬ－１３を皮下注入して２４時間後、スライド可能なナノリガンドを表す基板の「磁石側」と「非磁石側」に付着された宿主細胞のＮＩＭＰ－Ｒ１４、Ｆ－アクチン、核に関する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。（ｂ）は、体内に付着されたＮＩＭＰ－Ｒ１４陽性宿主好中球の密度の定量を示したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）に対する体内での宿主マクロファージの細胞付着性・再生性Ｍ２表現型に関する実験の結果を図示したものである。（ａ）は、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を注入した基板を皮下移植注して２４時間後、スライド可能なナノリガンドを有する基板の「磁石」側とと「非磁石」側に付着された宿主細胞のＡｒｇ－１、Ｆ－アクチン、核に関する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。（ｂ）は、体内の付着細胞のＭ２表現型マーカ（Ａｒｇ－１及びＹｍ１）の遺伝子発現プロファイル（ｎ＝３）、密度、細胞の面積、細胞縦横比（ｎ＝３０）の計算を示したグラフである。図４ｂに図示された（ｃ）ＲＯＣＫ信号阻害（Ｙ２７６３２を有する）の下、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比と、（ｄ）ミオシンII形成阻害（ブレビスタチンを有する）の細胞面積を計算したグラフである。
以下、本発明をより具体的に説明するために、本発明による好ましい実施例を、添付の図面を参照しながらより詳しく説明する。ただし本発明は、本願で説明している実施例に限られず、他の形態で具体化されてもよい。
マクロファージは、リモデリングされ続けた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と相互作用を取り成し、これによって体内で空間的且つ時間的に異質なマクロスケールのナノリガンド分布を引き起こす。本発明によりマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドは、マクロスケールのナノリガンド分布を空間的且つ時間的に変化させることで可逆的な遠隔制御を可能にして細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングを模倣し、時間的且つ空間的な宿主反応（ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の制御のためのマクロファージの細胞付着や分極を調整することができる。本発明のナノリガンドは、負に荷電されたスライドナノリガンドと正に荷電された基板との静電相互作用を介して結合し、高分子リンカーと負に荷電されたＲＧＤリガンドコーティング磁性コアナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｏｒｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を用いて、ナノリガンドのスライドの可能性を最適化した。マクロスケールのナノリガンド密度を時空間的且つ可逆的に変化させる外部磁場の下、マクロスケールとＩｎ ｓｉｔｕナノスケールのナノリガンドスライドの特徴を確認した。更に、本発明は、体内で宿主マクロファージの細胞付着や分極表現型を調整するために、スライド可能なナノリガンドを磁気的に引き寄せ、マクロスケールのナノリガンド密度で、新規のＩｎ ｓｉｔｕ操作を提示する。具体的には、スライド可能なナノリガンドの時間制御を施された磁気引力は、マクロファージの炎症性Ｍ１表現型を抑制する一方、再生性Ｍ２表現型を刺激する。また、本発明のスライド可能なナノリガンドの磁気引力は、マクロファージ内付着構造の組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を促進し、Ｍ２表現型の分極を刺激する。これにより、本発明によるナノリガンドは、マクロスケールのナノリガンド密度の遠隔、時空間的且つ可逆的な制御により体内インプラント（ｉｍｐｌａｎｔ）の免疫調整組織再生成反応の時空間的調整を可能にする。
本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアと、コアを包み込むように設けられ、インテグリン付着性リガンドペプチドを含むコーティング層と、を含み、インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、マクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドを提供する。
図１は、本発明によるマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンド、及びこれを用いたマクロファージの細胞付着・再生方法を示した模式図である。
図１から、本発明のナノリガンドは磁性ナノ粒子を含むコアと、コアを包み込むように設けられ、インテグリン付着性リガンドペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むコーティング層と、を含み、インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されたインテグリンペプチドであることがわかる。具体的には、コア上に結合されたインテグリン付着性リガンドペプチドは、コアをミセル構造のように取り囲んでもよい。これにより、ナノリガンドの表面電荷は、負電荷を帯びることができる。例えば、スライド可能なナノリガンドは、超常磁性コア酸化鉄ナノ粒子をまず合成し、当該超常磁性コアナノ粒子を官能性アミノシリカシェルで官能基化した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーでコーティングして負に荷電したインテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ、ＣＣＤＲＧＤ）をグラフトさせることで、ナノリガンドのスライド性を向上できる。
また、図３は、本発明によるマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像であり、ナノリガンドのサイズを把握できる。具体的には、ナノリガンドは３０～６０ｎｍの直径を有してもよい。ナノリガンドの直径が３０ｎｍ未満の場合、ナノリガンドの移動を制御しづらく、６０ｎｍを超えるの場合、マクロファージの細胞付着効率が低下してしまう。より具体的には、当該ナノリガンドは、直径が３０～５０ｎｍ、或いは３５～４５ｎｍであってもよい。
磁性ナノ粒子は、磁性を帯びるナノ粒子であれば特に限定されない。例えば、ナノリガンドは５～３０ｎｍの直径を有してもよい。磁性ナノ粒子の直径が５ｎｍ未満の場合、粒子の大きさが小さすぎて損失（ｌｏｓｓ）が多く、効率が低下してしまう。３０ｎｍを超える場合、ナノリガンドの直径が大きいため、マイクロファージの細胞付着効率が低下する問題が生じ得る。より具体的には、当該磁性ナノ粒子は、直径が５～１５ｎｍ、１５～２０ｎｍ、或いは１０～２０ｎｍであってもよい。上記のような磁性ナノ粒子を含むことにより、本発明のナノリガンドは、磁場を用いて、マクロファージの細胞付着や再生性分極化を促進することができる。
また、磁性ナノ粒子は、シリカ表面に結合されていてもよい。具体的には、磁性ナノ粒子は、アミノ－シリカが表面に結合されていてもよい。シリカの種類は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）と（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）のうちいずれか一つ以上であってもよい。
例えば、本発明のナノリガンドは、コアとコーティング層との間をリンカーで連結した構造であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール系リンカーは、マレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。上記のようなリンカーを含むことで、コアとコーティング層との結合力を高め、ナノリガンドの耐久性を向上させることができる。
当該コーティング層は、コア、又はコアに結合されたリンカーに結合されてもよく、コアを取り囲んでもよい。具体的には、コーティング層は、インテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含み、当該インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されてもよく、負に荷電されたチオール化インテグリン付着性リガンドペプチドを含んでもよい。上記のように負に荷電されたインテグリン付着性リガンドペプチドを含むことで、本発明のナノリガンドの表面は負に荷電され、これにより、基板との静電結合によって基板上での移動が自由となる。これらの特徴により、当該ナノリガンドは、「スライド可能なナノリガンド」とも呼ばれ、基板上でのナノリガンドのスライドを介してマクロファージの細胞付着や再生性分極化を促進させることができる。
更に本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、
コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、
リンカーが結合されたコアをインテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、上述のマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドの製造方法を提供する。
当該コアを用意するステップでは、磁性ナノ粒子をシラン溶液と撹拌してシランがコーティングされたコアを形成してもよい。具体的には、コアを用意するステップは、磁性ナノ粒子をアミノ－シラン溶液と撹拌してアミノ－シランがコーティングされたコアを形成してもよい。シラン溶液に含まれているシランの種類は、シリカの種類は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）と（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）のうちいずれか一つ以上であってもよい。
具体的には、リンカーが結合されたコアを製造するステップは、当該コアと、リンカーを含む懸濁液を、暗条件下で１０時間～２０時間、或いは１０時間～１５時間攪拌して行ってもよい。これにより、リンカーが結合されたコアが得られる。このとき、永久磁石を用いながら溶媒で２回以上洗浄し、リンカーが結合されたコアを得てもよい。当該溶媒は、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか１つ以上を含んでもよい。
当該リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール系リンカーは、マレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。上記のようなリンカーをコアに結合させることで、コアとコーティング層との結合力を高め、ナノリガンドの耐久性を向上させることができる。
更に、第２の懸濁液と混合するステップは、リンカーと結合されたコアをインテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む懸濁液に暗条件下で１０時間～２０時間、或いは１０時間～１５時間撹拌することで行ってもよい。この時、永久磁石を用いながら溶媒で洗浄し、負に荷電されたインテグリン付着性リガンドペプチドが結合された磁性ナノ粒子（ナノリガンド）を得ることができる。当該溶媒は、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか１つ以上を含んでもよい。
ここで、インテグリン付着性リガンドペプチドと攪拌するプロセスにより、コア上にコーティング層を形成してもよい。具体的には、上記のインテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されていてもよく、負に荷電されたチオール化インテグリン付着性リガンドペプチドであってもよい。上記のように負に荷電されたインテグリン付着性リガンドペプチドでコア上にコーティング層を形成することで、本発明のナノリガンドの表面は負に荷電され、これにより、基板との静電結合によって基板上での移動が自由となる。これらの特徴により、当該ナノリガンドは、「スライド可能なナノリガンド」とも呼ばれ、基板上でのナノリガンドのスライドを介してマクロファージの細胞付着と再生を促進させることができる。
更に、本発明は、上述したマクロファージの細胞付着・再生促進用ナノリガンドを含む溶液に、表面が正に荷電された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造するステップと、ナノリガンド提示基板に培養液を処理した後、外部の磁場を印加し、マクロファージの細胞付着・再生性分極化を調整するステップと、を含む、マクロファージの細胞付着・再生を促進する方法を提供する。
図１及び図２は、本発明の一実施例によるマクロファージの細胞付着・再生を促進する方法を図式化した図である。図１及び図２に図示されているように、正に荷電された基板上に表面が負に荷電されたナノリガンドを静電結合し、磁場を印加することで、磁場が印加される部分においてマクロファージの細胞付着を促進する一方、炎症性Ｍ１表現型が抑制しながら再生性Ｍ２表現型は活性化することができる。具体的には、基板とナノリガンドが静電結合によって結合されているため、磁場が印加されている位置に応じてナノリガンドが移動（スライド）し、これにより、磁場が印加される部分においてナノリガンドの密度を調整して、所望の部位にマクロファージの細胞付着や再生性分極化を促進させることができるという利点がある。
具体的には、ナノリガンド提示基板を製造するステップは、基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して基板の表面を正に荷電させるステップと、正に荷電された基板に対して室温で超音波を以って処理を施すステップと、を含んでもよい。
当該基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップでは、塩酸と硫酸のうちいずれか１つ以上を含む酸性溶液に３０分～２時間、或いは３０分～１時間浸漬させてもよい。これにより、当該基板の表面に水酸化基を結合させ、アミノ基との結合が容易になるよう、基板の表面活性化を効果的に行うことができる。
当該基板の表面を活性化させるステップは、暗条件下で、アミノシラン溶液に基板を担持し、基板の表面が正電荷を帯びるように活性化させてもよい。アミノシラン溶液は、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含んでもよい。このとき、基板の表面を活性化させるということは、基板の表面を正に帯電させるということであり、具体的には、基板上にアミン基を結合させて活性化させることができる。上記のようにアミノシラン溶液に浸漬して、基板の表面を活性化させ、基板の表面を正に帯電させると、当該基板は、ナノリガンドと静電気の引力により結合することができる。
また、超音波を以って処理を施すステップでは、ナノリガンドを含む溶液に表面が正に荷電された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造してもよい。具体的には、ナノリガンドを含む溶液に、表面が正に荷電された基板を精製水の中に入れて超音波処理を施し、室温で３０分～２時間、或いは３０分～１時間、担持して行った。
マイクロファージの細胞付着・再生性分極化を調整するステップは、体内及び体外にナノリガンド提示基板を位置させた後、１００～７００ｍＴの磁場を１２時間～４８時間印加して行ってもよい。具体的には、マクロファージの細胞付着・再生性分極化を調整するステップは、体内又は体外にナノリガンド提示基板を位置させた後、１００～６００ｍＴ、２００～６００ｍＴ、或いは３００～５５０ｍＴの磁場を１２時間～３６時間、２４時間～２６時間、或いは１２時間～２４時間、印加して行ってもよい。上記のように、ナノリガンド提示基板に磁場を印加することにより、基板上に位置するナノリガンドのマクロファージの細胞付着を促進させ、付着されたマクロファージの炎症性Ｍ１表現型の分極は抑制し、再生性Ｍ２表現型の分極は促進することができる。
また、マクロファージの細胞付着・再生性分極化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を変えて行ってもよい。具体的には、１００～６００ｍＴ、２００～６００ｍＴ、或いは３００～５５０ｍＴの磁場を印加しながら、基板に印加される磁場の位置を変え、マクロファージの細胞付着や再生性分極化を空間的に制御してもよい。例えば、基板の一部分に磁場を印加して基板上のナノリガンドの密度を調整し、基板上の任意の部分のみマクロファージの細胞付着を促進させ、付着されたマクロファージの炎症性Ｍ１表現型の分極は抑制し、再作性Ｍ２表現型の分極は促進してもよい。
また、マクロファージの細胞付着・表現型を調整するステップは、基板の下端に印加される磁場の位置を変えて行ってもよい。具体的には、１００～６００ｍＴ、２００～６００ｍＴ、或いは３００～５５０ｍＴの磁場を印加しながら基板に印加される磁場の位置を時間に応じて変え、マクロファージの細胞付着や表現型を時間的且つ空間的に制御してもよい。より具体的には、基板の各部分ごとに磁場を個別的に印加して基板上に位置するナノリガンドの密度を時間に応じて調整し、基板上の各部分のマクロファージの細胞付着や再生性Ｍ２分極の促進の程度を調整してもよい。例えば、基板の左側には、１２時間～２４時間磁場を印加し、基板の右側には、２４時間～３６時間磁場を印加した場合には、基板の左側と右側にて付着又は再生性Ｍ２分極を起こしたマクロファージの量が異なり得る。
以下、本発明の実施例を説明する。しかしながら下記の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の請求の範囲が下記の実施例に限られる訳ではない。
［製造例］
製造例１
スライド可能なナノリガンド（ｓｌｉｄａｂｌｅ ｎａｎｏ－ｌｉｇａｎｄ）の製造
１）磁性コアの製造（ＭＮＰ）
スライド可能なナノリガンドの磁気制御のために、スライド可能なナノリガンドの磁性コアを下記のように製造した。エタノール約８０ｍＬ、脱イオン水（ＤＩ）６０ ｍＬ、ヘプタン１４０ ｍＬをまず混合した。この混合物に、不活性環境下で１２０ｍｍｏｌのオレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）と４０ｍｍｏｌの塩化鉄（III）六水和物（ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）をエタノール８０ｍＬ、脱イオン水（ＤＩ）６０ｍＬ及びヘプタン１４０ｍＬの溶媒混合物に７０℃で４時間溶解させた。オレ酸鉄を含むヘプタン層を回収し、脱イオン水で洗浄した。ヘプタンを蒸発させて乾燥させたオレ酸鉄を回収し、ここにオレイン酸２０ｍｍｏｌと１－オクタデセン２００ｇを乾燥オレ酸鉄約４０ｍｍｏｌに添加した。この溶液を１００℃で５分間攪拌した。続いて、温度を３２０℃まで上げ、約３０分間維持した。上記の混合物溶液を大気下で懸濁させ、室温に冷却した後、永久磁石を用いてエタノールで３回洗浄し、ナノ粒子を回収した。この磁性コアナノ粒子（ＭＮＰ）を保存するために、溶液を使用時までヘプタンに保存した。
２）磁気コアのアミノシリカの官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）（アミノシリカコーティングＭＮＰ）
磁性コアナノ粒子に、スライド可能なナノリガンドのナノアセンブリのため、アミノシリカシェルでコーティングを施した。磁性コアナノ粒子（３０ｍｇ）をシクロヘキサン（２５ｍＬ）に分散させた。上記の懸濁液にトリトン－Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）（５ｍＬ）、１－ヘキサノール（５ｍＬ）、ＮＨ４ＯＨ（０．５ｍＬ）、脱イオン水（１ｍＬ）を順次添加して３０分間攪拌した。エマルジョンを安定化させた後、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、１２．５μＬ）を徐々に混合し、１０分間攪拌した。アミノ官能基化のために（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、６．２５ｍＬ）を混合し、一晩撹拌した。アミノ官能基化の後、アミノシリカシェルでコーティングされたＭＮＰをそれぞれ３回ずつ、アセトン及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄し、磁石を用いて回収した。
３）スライド可能なナノリガンドの製造
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを用いて、ナノリガンドのスライド特性を向上させ、荷電されたＲＧＤペプチドリガンドを表面がアミノシリカシェルでコーティングされたＭＮＰにグラフトした。ＰＥＧリンカーは、スライド可能なナノリガンドのナノアセンブリからの細胞吸収を防止するために使用された。ＤＭＦ（１ｍＬ）中、アミノシリカでコーティングされたＭＮＰを使用し、５ｍｇのマレイミド－ ポリ（エチレングリコール）－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ；Ｍｎ＝５０００Ｄａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ）を溶解させた。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２μＬ）を添加し、一晩撹拌した後、ＤＭＦで３回、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で３回洗浄し、永久磁石を使用して回収した。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中、ＰＥＧ－アミノシリカでコーティングされたＭＮＰを添加し、負に荷電されたチオール化ＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、０．５ ｍｇ）を溶解させた。二硫化物結合の形成を防止するために、ＤＩＰＥＡ（２μｌ）とトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＣＥＰ、１０ｍＭ）をこの懸濁液に添加し、一晩、暗条件の下で攪拌した。懸濁液をＤＭＳＯで洗浄し、静電相互作用を介して結合する基板が結合される前に、永久磁石を使用して回収した。
比較製造例１
負に帯電されたチオール化ＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加していないことを除いて、製造例１と同様の方法で「Ｎｏ ＲＧＤ」ナノリガンドを製造した。
［実施例］
実施例１
スライド可能なナノリガンド、並びに当該ナノリガンドと基板との組み合わせ
上記の製造例で製造したスライド可能なナノリガンドを基板に可逆的に結合させるために、培養グレードガラスカバースリップ（ｃｕｌｔｕｒｅ－ｇｒａｄｅ ｇｌａｓｓ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ、２２ ｍｍ ｘ ２２ ｍｍ）を使用した。基板を３０分間塩酸とメタノールの１：１混合物に浸漬させ、表面の有機汚染物を除去されたことを確認した後、脱イオン水で３回洗浄した。これを硫酸で１時間浸漬させ、脱イオン水で洗浄した。基板を暗条件の下で１時間ＡＰＴＥＳとエタノールの１：１混合物に浸漬させ、基板をアミノ化させた。次いで基板をエタノールで３回洗浄し、１００℃で１時間乾燥させた。静電相互作用を促進するために、１ｍＬのＤＭＳＯにおいて、負に荷電されたスライド可能なナノリガンド（ＲＧＤ－ＰＥＧ－アミノシリカシェルでコーティングされた磁性ナノ粒子）をＤＭＳＯ（１：２０）で希釈し、超音波処理を施し、正に荷電されたアミノ化基板と１時間培養した。基板を脱イオン水で洗浄し、スライド可能なナノリガンドが存在する基板を得た。
［実験例］
実験例１
本発明によるスライド可能なナノリガンドの形態を確認するため、スライド可能なナノリガンドを対象に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、動的光散乱・高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）分析を行い、その結果図３及び図４に示した。
また、スライド可能なナノリガンドの性質及び化学的結合特性を確認するため、スライド可能なナノリガンドを対象にフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）と振動サンプル磁力測定を行い、その結果を図５及び図６に示すた。
具体的には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）実験は、スライド可能なナノリガンドのサイズや形の特性を確認するため、Ｔｅｃｎａｉ ２０（ＦＥＩ、ＵＳＡ）を用いて、ＴＥＭ撮像を行った。
また、高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）は、代表的なスライド可能なナノリガンドのサイズや形状の特性を確認するためのもので、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ撮像は１ｎｍのプローブサイズ、２０μｍコンデンサ開口（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ａｐｅｒｔｕｒｅ） 、Ｚ比のための８０－１５０ｍｒａｄ収集角度を有するＪＥＯＬ ２１００Ｆを使用して行われた。
更に、動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、スライドナノリガンドの組立工程でサイズ分布プロファイル（流体力学的直径、ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を定量するために、ＤＬＳ測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を行った。
また、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、スライド可能なナノリガンドの化学的結合特性を確認するため、ＧＸ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＵＳＡ）を用いて行われた。化学的結合特性の変化の分析を経たサンプルを分析する前に、凍結乾燥させ、ＫＢｒペレットで密度高くパッキングした。
振動サンプル磁気測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）は、ナノリガンドの超常磁性の特性を確認するために、スライド可能なナノリガンドの磁性ナノ粒子コアは、印加された磁場の下、室温でＶＳＭ測定（ＥＶ９；Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｅ）に適用された。対応する磁気モーメント（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｏｍｅｎｔ）は、スライド可能なナノリガンドで磁性コアに乾燥重量に正規化した後、ヒステリシスループ（ｈｙｔｅｒｅｓｉｓ ｌｏｏｐ）に表示された。
図３は、スライド可能なナノリガンドの透過型電子顕微鏡画像でもあり、スケールバーは２０ｎｍである。図４の（ａ）は、サイズ分布を有する磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とアミノ－シリカコーティングＭＮＰの動的光散乱の結果の画像であり、（ｂ）は、アミノ－シリカコーティングＭＮＰの高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）画像で、スケールバーは２０ｎｍである。
図３によると、超常磁性コア（１６±２ｎｍ）とスライド可能なナノリガンドコアシェル（４２±５ｎｍ）を含むスライド可能なナノリガンドの球体は、均一な形状を示している。また、図４によると、動的光散乱によって決定されたように、１５±４ｎｍの超常磁性コアと４１±５ｎｍのスライド可能なナノリガンドコアシェルの均一な直径で、ＴＥＭ及び高角散乱環状暗視野走査ＴＥＭ （ｈｉｇｈ－ａｎｇｌｅ ａｎｎｕｌａｒ ｄａｒｋ－ｆｉｅｌｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ＴＥＭ、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）画像と一致した。
図５は、一実施例によるスライド可能なナノリガンドのフーリエ変換赤外スペクトル画像である。具体的には、ＭＮＰ、シリカコーティングＭＮＰ、ＲＧＤリガンド提示ＰＥＧグラフトシリカ被覆ＭＮＰ（ＲＧＤ－ＰＥＧ－シリカコーティングＭＮＰ、スライド可能なナノリガンドに相当）のフーリエ変換赤外スペクトル画像である。図６は、スライド可能なナノリガンドの振動サンプルの磁力計ヒステリシスである。
図５によると、スライド可能なナノリガンドの製造過程における化学結合の変化は、ＦＴＩＲで知ることができる。具体的には、Ｆｅ－Ｏ結合は、超常磁性酸化鉄コアナノ粒子にて６９９ｃｍ－１の吸収ピーク値で検出された。Ｓｉ－Ｏ結合は、シリカシェルから１１６８ ｃｍ－１の吸収ピーク値で検出された。スライド可能なナノリガンドでは、ＰＥＧリンカー（Ｍｎ＝５０００Ｄａ）は、先行技術で証明されているように、スライド特性を向上させるに留まらず、細胞による吸収を抑制し、ＣＤＤＲＧＤは１１５２ｃｍ－１の吸収ピークでＣ＝Ｏ結合を、１６３５ｃｍ－１の吸収ピークでアミド（ａｍｉｄｅ）結合を表した。このようなＴＩＲ分析から、スライド可能なナノリガンドの組み立てが成功的であることが確認された。
図６において、２０ｅｍｕ／ｇのＭｓで超常磁性を確認した。これにより、本発明によるスライド可能なナノリガンドは、超常磁性特性を以って可逆的スライドが可能である。この特性は、時間的且つ可逆的にナノリガンドのスライドの磁気制御に非常に重要である。
実験例２
本発明によるスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ可逆的・時空間的制御を実証するために、スライド可能なナノリガンドを対象に走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）イメージングを行い、その結果を図８及び図９に示した。
図７は、基板上におけるスライド可能なナノリガンドの静電結合を図式化した画像である。図７によると、磁性ナノ粒子（コア）はＰＥＧ化され、その磁性ナノ粒子上に、負に荷電されたＲＧＤペプチドリガンド（ＣＤＤＲＧＤ）でコーティングしてスライド可能なナノリガンドを形成し、これを、静電気的相互作用を介して正に荷電された基板に結合した。具体的には、図７に図示されているように、本発明は、静電的にマクロスケールのナノリガンドの提示を制御するために、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ時空間的制御のための正に荷電された基板にスライド可能なリガンドを結合させた。ナノリガンドと基板との静電結合によりナノリガンドが可逆的なスライドを可能にした。
ここで、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、静電気的相互作用を介して正に荷電された基板に結合された負に荷電されたスライド可能なナノリガンドを確認するためのものであり、電界放出ＳＥＭ撮像（ＦＥ－ＳＥＭ、ＦＥＩ、Ｑｕａｎｔａ２５０ＦＥＧ）は、乾燥された白金コーティング基板上で行った。基板と結合されたスライド可能ナノリガンドの密度は相違する画像１０個を用いてＩｍａｇｅ Ｊで測定された。マクロスケールのナノリガンド密度の可逆的且つ時空間的操作の特徴を確認するために、ＳＥＭ撮像も行われた。永久磁石（１５０ｍＴ）の位置は、基板の左下から右下に切り替え、１２時間ごとに左下に更に切り替えた。マクロスケールのナノリガンド密度での対応する変化はＩｍａｇｅ Ｊを用いて計算されており、その結果を図８に図示した。
また、Ｉｎ ｓｉｔｕ磁気原子間力顕微鏡（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＡＦＭ）は、基板上にスライド可能なナノリガンドの３Ｄ撮像、並びにスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕナノスケールの動きの特徴の確認を
目的とし、ＡＦＭ撮像（Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＸＥ－ １００ Ｓｙｓｔｅｍ）を２５℃にて大気モードのＡＣで行った。バネ定数（ｓｐｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ、５－３Ｎ／ｍ）と共振周波数（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ、９６～１７５ ｋＨｚ）を有するＡＦＭカンチレバー（ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ）（Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ、ＳＳＳ－ＳＥＩＨＲ－２０）を使用した。基板の近傍において磁石のない静的シリアル撮像を、スライド可能なナノリガンドの磁石介在変位を検査するため、基板の同スキャン領域において行った。Ｉｎ ｓｉｔｕ磁気撮像のために、まず撮像を行って、永久磁石を基板の底やスキャン領域の反対側に配置し、Ｉｎ ｓｉｔｕナノスケールのナノリガンドスライドを特徴づけられるよう、同スキャン領域における撮像を行った。その結果は、図８及び図９に示した。
図８は、マクロスケールとナノスケールのナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ可逆的時空間操作（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）の画像である。図８ａ～ｂによると、正に荷電されたアミノ官能基化基板は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と３Ｄ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって表されるように、ナノリガンドは、基板の表面にランダム且つ均一に結合されている。また、マクロなナノリガンドの密度は、２０±３ナノリガンド粒子／μｍ２と計算された。上記のような密度を有することにより、ナノリガンドの摺動性（モビリティ）を効果的に制御することができ、ナノリガンドの凝集を誘発しないことが分かる。従って、本発明のナノリガンドは、基板上に可逆的なスライド（移動）が可能で、マクロファージの細胞付着や表現型を時空間的且つ可逆的に制御することができる。
図８ｃ～ｄは時空間的制御実験のＳＥＭ撮像の結果であり、磁気制御を用いたマクロスケールのナノリガンドの密度を調整してスライド性を制御できることが分かる。具体的には、ＳＥＭ撮像において、永久磁石を基板の左下に位置させてスライド可能なナノリガンドを左に引き付けた後、右側に切り替え、それぞれ１２時間ごとに左側に戻した。低速度ＳＥＭ撮像（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ＳＥＭ ｉｍａｇｉｎｇ）は、右側に比べ、左側のナノリガンド密度は、１２時間後に８１％と高く、２４時間後３１％に低く、３６時間後８２％と著しく高かった。
図８ｅは時空間的制御実験の比較例として、スキャン領域における外部の磁場の有無に係らず、同一のスキャン領域で行った連続のＩｎ ｓｉｔｕ磁気ＡＦＭスキャンによるＩｎ ｓｉｔｕ磁気ＡＦＭ画像であり、ナノリガンドのスライドのナノスケールの変位を図示した。図８ｅにおいて、スライド可能ナノリガンドを表す基板の下端（走査領域の反対面）に磁石を配置して磁場を発生させた。磁石がない状態では明確に識別されたが、ナノスケールのナノリガンドスライドを示す磁石がある場合、スキャン領域から消えた。
図９は、比較例の実験であって、同一のスキャンにおいて磁石の不在下で撮影した、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。図９によると、二つの異なる画像でスライド可能なナノリガンドに沿って黒い点線が描かれる。スケールバーは５０μｍであった。基板の近傍において、磁石がない状態での繰り返し可能且つ安定した撮像を特徴としており、スライド可能なナノリガンドの動きが基板の同領域で連続スキャンしたとき、４ｎｍくらい変位したので、無視してもよいことを確認した。
これにより、本発明によるナノリガンドは、磁場を用いて、マクロスケールのナノリガンドの密度を時空間的且つ可逆的に変化させ、ナノリガンドのスライドを可逆的に制御することができることが分かった。
実験例３
本発明によるスライド可能なナノリガンドを用いたマクロファージの細胞付着や再生を促進する方法で、マクロスケールのナノリガンドの密度を調整することがマクロファージの細胞付着調整に及ぼす影響を確認するために、次のような実験を行った。
スライド可能なナノリガンドのインテグリンβ１の結合実験を、次のように行った。スライド可能なナノリガンドの基板を用いてインテグリンβ１のスライド可能なナノリガンドの結合効率を定量化した。基板の左下に永久磁石を配置することにより、約１２時間、４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、インテグリンβ１（５０μｇ／ｍＬ）に浸漬させた。処理済みの基板を、インテグリンβ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する免疫蛍光染色と、その後の共焦点撮像とにより、Ｉｎ ｓｉｔｕスライド可能なナノリガンドと結合されたインテグリンβ１を定量化して、その結果を図１０に図示した。
図１０は、スライドナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ制御におけるインテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１）結合の時間的調整に関する。（ａ）は、基板の「左下」に永久磁石があるスライドナノリガンドの模式図、（ｂ）基板の「左側」、「中間」、「右側」でスライドナノリガンドに結合されたインテグリンβ１クラスタに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。スケールバーは５０μｍで、これらのクラスタは緑色の矢印で示される。（ｃ）は、基板の「磁石側」、「中間」、「非磁石側」でインテグリンβ１クラスタの染色強度の定量を示す。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１１は、本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御実験結果を示した画像で、スライド可能なナノリガンドの磁気的引力によりマクロスケールのリガンドの密度を調整することで、マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の付着を促進している。（ａ）は、基板の底（「磁石」側）に永久磁石を配置して行った２４時間のマクロファージ培養後、ビンキュリン、アクチン、核の免疫蛍光染色と相応の共焦点顕微鏡画像と共に、基板の底（「磁石」の側）に永久磁石を配置することでスライド可能なナノリガンドを操作している概略図である。付着性マクロファージの画像は、基板の「磁石側」、「中間」、「非磁石側」の中心（模式図で赤点線の枠）で撮影された。スケールバーは２０μｍである。制御群は、「Ｎｏ ＲＧＤ」群と「Ｎｏ ｍａｇｎｅｔ」群を含んでいる。（ｂ）は、マクロファージの細胞付着細胞密度、細胞の面積、細胞縦横比の定量を示したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的有意性は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１２は比較零によるマクロファージの細胞付着性実験の結果であり、（ａ）は、ＲＧＤペプチドリガンド又は磁場がない場合、２４時間のマクロファージ培養の後、ビンキュリン、アクチン、核の免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。付着性マクロファージの画像は、基板の「左側」、「中間」、「右側」の中心で撮影した。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、マクロファージ密度、面積、縦横比の定量を示したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１０ａは、インテグリンβ１の結紮がＩｎ ｓｉｔｕスライド可能なナノリガンドによって操作できるか否かを調査したもので、スライド可能なナノリガンド提示基板を１２時間インテグリンβ１と共に培養する一方、永久磁石を、基板の下に（「磁石側」）に位置させた。図１０ｂ～ｃによると、免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像は、ナノリガンドに対するインテグリンβ１の結合効率が非常に高いことを明らかにし、基板の中間（ｍｅｄｉｕｍ）や非磁気側と比べ、基板の磁石に向かってそれぞれ３０％と５５％ずつ引き寄せられた。インテグリン結紮がマクロファージの細胞付着を容易にするため、これらの結果は、マクロファージがスライド可能なナノリガンドに強く付着され得ることを意味し、これは磁石の方に向かって移動して、磁石側のマクロスケールのナノリガンド密度を上昇させる。更に、本発明は、マクロスケールのＩｎ ｓｉｔｕナノリガンド密度の制御下にマクロファージの細胞付着性を調べた。
図１１ａによると、培養中に基板の下（「磁石」側）に磁石を配置し、基板の「磁石側」、「中間」、「非磁石側」の中心から撮像されたマクロファージの細胞付着を観察した。また、スライド可能なナノリガンドを表す基板や磁石がない（「Ｎｏ ｍａｇｎｅｔ」）、或いは結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＲＧＤペプチドリガンドのないナノ粒子が存在する基板（「Ｎｏ ＲＧＤ」）で制御実験を行った。
その結果、マクロファージが著しいアクチンフィラメントアセンブリとして、相当高い密度や、細胞領域と基板の「中間」と「非磁石側」に付着されたものよりも長い形態のビンキュリン発現により、基板の「磁石側」より強固に付着された（図１１ａ～ｂ）。定量的には、「磁石側」の付着性マクロファージの密度は、「中間」や「非磁石側」に比べ、それぞれ５９％と８２％ずつ高かった。同様に、「磁石側」の付着性マクロファージの面積は、「中間」や「非磁石側」に比べ、それぞれ５７％と６０％ずつ高かった。更に、付着性マクロファージの縦横比（延長形状係数、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｈａｐｅ ｆａｃｔｏｒ）は、「中間」や「非磁石側」に比べ、「磁石側」の方がそれぞれ５４％と５０％ずつ高かった。
図１２ａ～ｂによると、ナノリガンド介在制御に基づいたマクロファージの細胞付着の調整は、基板の「左側」、「中間」、「右側」で同様の付着性マクロファージ密度と面積を示す「Ｎｏ ＲＧＤ」群と「Ｎｏ ｍａｇｎｅｔ」群に対して非効率である。「Ｎｏ ＲＧＤ」群は、最小限のマクロファージの細胞付着を示し、効果的なブロックを示した。これらの結果から、Ｉｎ ｓｉｔｕスライド可能なナノリガンドの磁気引力でマクロスケールのナノリガンド密度を増加させることが、マクロファージのインテグリン結紮介在付着を効率的に促進することが分かる。
実験例４
本発明によるナノリガンドのマクロスケールの密度調整がマクロファージの可逆的な付着を制御しているか否かに関する実験を下記のように行った。
マクロファージは、ＥＣＭでの動的付着や分極を見せ、これは、空間的且つ時間的に変化するマクロスケールリガンド分布で連続的にリモデリングされる。したがって、空間的、時間的、可逆的に変化するマクロスケールのナノリガンド分布の遠隔制御は、マクロファージの細胞付着を調整するＥＣＭリモデリングを模倣することができる。そのため、本発明は、スライド可能なナノリガンドを引き寄せることでマクロスケールのナノリガンド提示の時間切り替えマクロファージの細胞付着を変更できるか否かの実験を行い、図１３～図１５に示した。
図１３は、マクロスケールのナノリガンドの調整によりマクロファージの細胞付着性を制御した実験結果である。（ａ）は、基板の底に永久磁石を配置した（「磁場（ＭＦ）」）状態、又は基板から永久磁石を取り除いた（「磁場なし（ＮＭＦ）」）状態で行った１２時間又は２４時間のマクロファージ培養後の、Ｆ－アクチンと核を持つビンキュリンに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。「ＭＦ」又は「ＮＭＦ」は、２４時間の培養期間中に適用されるか、或いは１２時間後に交互に適用された。付着性マクロファージの画像は、基板の「左側」又は「右側」の中心で撮影した。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、基板の「左側」面のマクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を計算したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的有意性は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１４は、図１３の実験において、基板の「右側」面におけるマクロファージ密度、面積、縦横比の定量を示したグラフである。永久磁石は、１２時間又は２４時間、マクロファージが培養される一方、基板の「左側」の底に配置され（「磁場（ＭＦ）」）、或いは、基板から取り除かれる（「磁場なし（ＮＭＦ）」）。「ＭＦ」又は「ＮＭＦ」は、２４時間の培養期間中に適用されるか、或いは１２時間後に交互に適用された。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１５は、対向する面の間で、永久磁石の位置を基板の「左側」の底、「右側」の底、「左側」の底の順で１２時間ごとに切り替えて行った、基板の「左側」及び「右側」における１２時間、２４時間、３６時間のマクロファージの培養の後、ビンキュリン、アクチン、核に対する（ａ）免疫蛍光染色の時間分解共焦点顕微鏡画像である。スライド可能なナノリガンドは、基板の「左側」及び「右側」の中心（模式図で赤点線の枠）で撮影された。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、基板の「左側」面のマクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を計算したものである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的有意性は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１３によると、永久磁石を２４時間、基板の左下に（磁場、Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ、「ＭＦ」）に置き続けた。２４時間、基板の近傍に磁石のない群も配置しておいた（磁場なし、Ｎｏ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ、「ＮＭＦ」）。更に、本発明は、初期の１２時間は磁石が近傍に配置されなかったが、１２時間後、基板の左側に磁石が配置された群（「ＮＭＦ－ＭＦ」）を含む。２４時間後、「ＭＦ」群は、「ＮＭＦ」群より左側（磁石側）から著しく大きいマクロファージ付着、特に高い付着細胞の面積が６３％、縦横比が６６％ずつ高かった（図１３ａ～ｂ）。この傾向は、磁石のない状態につき、１２時間の時点で低レベルのマクロファージの細胞付着を示す「ＮＭＦ－ＭＦ」群に反映されたが、スライド可能なナノリガンドの左側（磁石）での磁気介在引力から２４時間後、著しいマクロファージの細胞付着が観察された。このスライド可能なナノリガンドは、磁石（左）側に引き寄せられれば、「ＭＦ－ＮＭＦ」群で２４時間後、マクロファージ付着性を維持することにより、既に証明されたように、１２時間後に磁石を取り外した後でも、残っていると思われる。このようなナノリガンドスライドの劇的な時間制御切り替えは、左側（磁石側）におけるマクロファージの細胞付着の調整には効果的であったが、図１４によると、右側（非磁石側）におけるマクロファージ付着は効果的に調整できない。よって、ナノリガンドスライドの磁石介在Ｉｎ ｓｉｔｕ制御を確認できる。
更に、本発明は、マクロファージの可逆的な付着における、ナノリガンドスライドの時空間的調整（ｔｕｎｉｎｇ）の効果について実験を行った。図１５によると、スライド可能なナノリガンドを左側へ１２時間引き寄せるように、基板の左下に永久磁石を配置した。次いで、磁石を１２時間、基板の右下に位置づけ、１２時間左下に置いた。左側と右側における、時間分解マクロファージ付着性を調べた（図１５ａ）。図１５によると、ナノリガンドスライドの時間的調整は、可逆的なマクロファージの細胞付着性を制御する。１２時間の時点で、基板の左側は、右側と比べ、付着性マクロファージの面積が６０％、縦横比が４４％で、相当増加したことが分かった（図１５ａ～ｂ）。２４時間の時点で、基板の右側は、左側と比べ、付着性マクロファージの面積と縦横比がそれぞれ６７％と７０％ずつ高くなった。３６時間後、可逆的に、基板の左側は、右側よりも高い付着性マクロファージの密度、細胞の面積、縦横比を示し、をそれぞれ５１％、６７％、６８％ずつ増加した。従って、マクロスケールのナノリガンド分布の遠隔・時空間的調整は、マクロファージの細胞付着の可逆的調整で強力な制御を示す。
実験例５
本発明によるスライド可能なナノリガンドが、時間制御調整（ｔｕｎｉｎｇ）により、マクロファージの細胞付着依存分極を調整できることを確認するために、次のように実験を行った。その結果を図１６～２０に図示した。
動的ＥＣＭリモデリングは、時間的に、様々な異種リガンド分布を示し、これは、それらの機能的分極表現型を調整するマクロファージの細胞付着構造の開発を調整し、インプラントの宿主反応を空間的且つ時間的に調整する。細胞骨格のアクチンアセンブリと延長された形態の付着構造を生成するマクロファージが、再生性Ｍ２表現型として機能的に活性化されることは周知の事実である。既存の報告は、以前の発見がマクロスケールのナノリガンド提示の時間的調整がマクロファージの細胞付着依存性分極を変更できることを示唆する。
図１６の（ａ）は、基板の「左側」に位置した磁石で行った、基板の「左側」及び「右側」において３６時間Ｍ２分極培地で培養されたマクロファージのＭ２表現型マーカ（Ａｒｇｉｎａｓｅ－１及びＹｍ１）、又はＭ１分極培地で培養されたマクロファージのＭ１表現型マーカ（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の定量的遺伝子発現を示したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）と表される。（ｂ）～（ｃ）は、板の底に永久磁石を配置した（「磁場（ＭＦ）」）状態、或いは配置しない（「磁場なし（ＮＭＦ）」）状態で培養されたマクロファージのＡｒｇ－１と核のｉＮＯＳに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。「ＭＦ」又は「ＮＭＦ」は３６時間の培養期間中に適用されるか、１２時間後に適用された。分極されたマクロファージの画像は、基板の「左側」又は「右側」の中心から撮影した。スケールバーは２０μｍである。異なるアルファベットの文字は、統計的有意性を示す。
図１７は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＭ１分極培地（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）におけるマクロファージのＭ２表現型を示したグラフである。Ｍ１分極培地（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）におけるスライド可能なナノリガンドの下で、マクロファージのＭ２表現型の制御は効率的ではなかった。基板の「左側」の底に配置（「磁石側」）された永久磁石に露出され、３６時間、基板の「左側」及び「右側」にてＭ１分極培地で培養されたマクロファージのＭ２マーカ（Ａｒｇｉｎａｓｅ－１及びＹｍ１）の定量的遺伝子発現を示した。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）と表される。
図１８は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＭ２分極培地（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）におけるマクロファージのＭ１表現型を示したグラフである。マクロファージのＭ１表現型の制御は、Ｍ２分極培地でスライド可能なナノリガンドの下では非効率であった。基板の「左側」の底に配置（「磁石側」）された永久磁石に露出され、３６時間、基板の「左側」及び「右側」にてＭ１分極培地で培養されたマクロファージのＭ１マーカ（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の遺伝子プロファイルを示す。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）と表される。
図１９は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力の電気的引力に対するマクロファージのＭ２表現型実験の結果である。スライド可能なナノリガンドの磁気的引力は、マクロファージの細胞付着構造が生成されたとき、ＲＯＣＫ２の発現を促進してＭ２表現型を促進する。基板の「左側」の底に配置（「磁石側」）された永久磁石に露出され、基板の「磁石側」及び「非磁石側」にて３６時間、基礎培地又はＭ２分極培地でマクロファージを培養した後、ＲＯＣＫ２と核に対する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像を図示する。スケールバーは２０μｍである。
図２０は、本発明の一実施例によるナノリガンドの自己人材調整実験の、（ａ）免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像、（ｂ）付着性マクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を、或いはＭ２培地で培養した後の面積、縦横比、Ａｒｇ－１の染色強度の計算を示したグラフである。具体的には、スライド可能なナノリガンド引力の磁気的操作は、Ｍ２表現型を刺激するマクロファージの細胞付着構造の組み立てを促進する。（ａ）基板の底に位置する（「磁石」側）の磁石で実験を行った結果、基板の「磁石側」と「非磁気側」の表現型は、ＲＯＣＫ信号阻害（５０μＭＹ２７６３２同様）、ＲＯＣＫ信号形成阻害（１０μＭブレビスタチン同様）、或いはアクチン重合阻害（２μｇ／ｍＬサイトカラシンＤ同様）の下、３６時間Ｍ２分極培地でのマクロファージを培養した後、アクチンと核のＡｒｇ－１に対する、更には、３６時間基礎培地でのマクロファージを培養した後、アクチンと核に対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、基板の「磁石」側と「非磁石」側にて基礎培地を培養した後、付着性マクロファージの密度、細胞の面積、細胞縦横比を、或いは、Ｍ２培地で培養した後の面積、縦横比、Ａｒｇ－１の染色強度の計算を示したものである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的有意性は、異なるアルファベット文字で表示される。
図１６によると、スライド可能なナノリガンドの時間調整磁気的引力はＭ２表現型を刺激しながら、マクロファージのＭ１表現型を抑制する。スライド可能なナノリガンドの時間制御操作において、マクロファージの表現型提示につき、スライド可能なナノリガンドが存在する基板を検査して、上記の基板は、基板の左下に永久磁石を３６時間連続して配置する（「ＭＦ」群）、或いは、３６時間連続して基板の近傍から取り除き（「ＮＭＦ」分）、１２時間ごとに「ＮＭＦ」から「ＭＦ」に切り替えた。Ｍ１分極培地でマクロファージを培養した後、遺伝子発現プロファイルは、「ＭＦ」群では、Ｍ１マーカｉＮＯＳ（誘導性酸化窒素シンタアゼ、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）とＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）の発現が右側（非磁気側）より左側（磁石側）でそれぞれ１９２％と２３１％ずつ、著しく低かった（図１６ａ）。それに対して、「ＭＦ」群でＭ２分極培地を用いて培養した後、Ｍ２マーカＡｒｇ－１（ａｒｇｉｎａｓａｅ－１）とＹｍ１（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ３）の発現は、右側（非磁気側）より左側（磁石側）で、それぞれ７１５％と３８３％ずつ、著しく増加した。図１７及び図１８によると、「ＭＦ」群では、Ｍ２分極培地での培養後のＭ１マーカ、又はＭ１分極培地培養後のＭ２マーカの発現は、左側と右側で変わりなく、これはマクロファージ分極を調整するためのナノリガンドスライドの磁気制御を有する分極性溶解刺激の必要条件である。
図１６ｂ～ｃから、免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像が、遺伝子発現プロファイルの発見を図示していることが分かる。「ＭＦ」群では、ｉＮＯＳ蛍光はＭ１分極バッジ培養後、相当低かった、Ａｒｇ－１免疫蛍光は、右側（非磁石側）と比べ、左側（磁石側）でＭ２分極培地に培養した後、より高かった。このような傾向は更に、Ｍ１分極培地での培養の後、低いｉＮＯＳ免疫蛍光を示すが、これは磁石側でＭ２分極培地により培養した後、高いＡｒｇ－１免疫蛍光を示す「ＮＭＦ－ＭＦ」群で一致しており、これはＭ２分極を活性化させるため、任意の規定された時間にスライド可能なナノリガンドが磁石の上で引き寄せられ得ることを示唆している。「ＮＭＦ」群では、両方のｉＮＯＳとＡｒｇ－１免疫蛍光での有意な差が観察されなかった。これにより、磁気側に行き渡る（ｐｅｒｖａｓｉｖｅ）付着構造の開発を向上させたスライド可能なナノリガンドの磁気引力は、炎症性Ｍ１分極を抑制しつつ、マクロファージを再生性Ｍ２表現型に分極したことがわかる。
次に、マクロファージから付着構造の組み立てで、スライド可能なナノリガンドの磁気引力によってＭ２表現型への偏光を容易にする方法について実験を行った。図１９によると、細長い形状、アクチン骨格構造の器官及び収縮性、ＲＯＣＫを含むマクロファージの細胞付着構造はＭ２表現型を介在する。基礎培地とＭ２分極培地の培養では、マクロファージは、非磁気側より磁石側で、相当高いＲＯＣＫ２免疫蛍光を示した。特に、図２０によると、Ｍ２分極培地に培養する間、Ｙ２７６３２によるＲＯＣＫ信号阻害は付着性マクロファージの面積と縦横比をそれぞれ３２％と３３％ずつ低減し、更には、Ａｒｇ－１免疫蛍光を磁石側で２９％ほど、著しく減少させた。一貫的に、Ｍ２分極培地に培養中にブレビスタチンによるＲＯＣＫ信号形成阻害の下、付着性マクロファージの面積、縦横比、Ａｒｇ－１免疫蛍光が磁石側でそれぞれ３３％、３１％、２９％ずつ減少した。付着性マクロファージの面積、縦横比、Ａｒｇ－１免疫蛍光の減少は、サイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｄによるアクチン重合阻害によっても明確に観察された。非磁気側で、ＲＯＣＫ、ミオシンIIアクチン重合の阻害は、Ｍ２表現型の付着構造と生産に大きな変化をもたらしていない。これにより、スライド可能なナノリガンドは、磁気制御によりＭ２表現型の発生を促進する過程で、マクロファージの細胞付着構造の組み立てを効果的に促進することが分かる。
実験例６
本発明によるスライド可能なナノリガンドはＩｎ ｓｉｔｕ制御により体内宿主マクロファージの細胞付着及び表現型を空間的に調整することを確認するために、下記のような実験を行い、その結果を図２１～図２３に図示した。
材料インプラントは、宿主反応を誘発してインプランドの宿主反応を誘導するために、マクロファージの細胞付着性と機能表現型を制御することが最も重要である。時空間的、可逆的、マクロスケールのナノリガンド変異の遠隔制御は、インプランドの宿主反応を空間的に調整するために、動的且つ異種のＥＣＭリモデリングを模倣することができる。特に、マクロファージの細胞付着や再生性・抗炎症性Ｍ２表現型の生産を調整し、炎症を抑えながら組織の修復を介在するのは非常に有利である。このため、本発明は、インプラントの再生性・抗炎症性免疫反応を空間的に多様な調整し、付着性マクロファージの細胞付着構造アセンブリを介在するＭ２表現型の体内翻訳を探求した。最近、ＵＶ光によるマクロファージの細胞付着の空間的に不均一な調整が可能であることが明らかになった。しかしながら、本発明では、マクロファージの細胞付着のみならず、付着性マクロファージの機能表現型を調整するため、磁場を用いて組織透過性と細胞互換性を活用した。
図２１は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力に対する体内での宿主マクロファージの細胞付着性・炎症性Ｍ１表現型に関する実験の結果である。（ａ）は、体内でスライド可能なナノリガンドの磁気制御の凡その模式図である。皮下移植後のスライド可能なナノリガンド気質を持つ基板上にＩＬ－４とＩＬ－１３の両方を注入した。（ｂ）は、基板の「磁石」側と「非磁石」側に付着した細胞のｉＮＯＳ、Ｆ－アクチン、核の２４時間後の免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像である。永久磁石を２４時間、基板の底（「磁石側」）に置き続けた。細胞の画像は、基板の「磁石側」又は「非磁石側」の中心で撮影された。スケールバーは２０μｍである。（ｃ）は、体内の付着細胞のＭ１表現型マーカ（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の遺伝子発現プロファイル（ｎ＝３）、密度、細胞の面積、細胞縦横比（ｎ＝３０）の計算を示したグラフである。データは、平均±標準誤差と表される。異なるアルファベットの文字は、統計的有意性を示す。
図２２は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドに関する宿主好中球の体内付着実験の結果である。（ａ）は、基板上にＩＬ－４及びＩＬ－１３を皮下注入して２４時間後、スライド可能なナノリガンドを表す基板の「磁石側」と「非磁石」側に付着された宿主細胞のＮＩＭＰ－Ｒ１４、Ｆ－アクチン、核に関する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。永久磁石を２４時間、基板の底（「磁石側」）に置き続けた。細胞の画像は、基板の「左側」又は「右側」の中心で撮影した。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、体内に付着されたＮＩＭＰ－Ｒ１４陽性宿主好中球の密度の定量を示したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。異なるアルファベットの文字は、統計的に有意な差を示す。
図２３は、本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）に対する体内での宿主マクロファージの細胞付着性・再生性Ｍ２表現型に関する実験の結果を図示したものである。（ａ）は、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を注入した基板を皮下移植注して２４時間後、スライド可能なナノリガンドを有する基板の「磁石」側とと「非磁石」側に付着された宿主細胞のＡｒｇ－１、Ｆ－アクチン、核に関する免疫蛍光染色の共焦点顕微鏡画像である。永久磁石は、基板の底（「磁石側」）に連続的に位置づけられた。細胞の画像は、基板の「磁石」側、又は「非磁石」側の中心から撮影された。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、体内の付着細胞のＭ２表現型マーカ（Ａｒｇ－１及びＹｍ１）の遺伝子発現プロファイル（ｎ＝３）、密度、細胞の面積、細胞縦横比（ｎ＝３０）の計算を示したグラフである。図４ｂに図示された（ｃ）ＲＯＣＫ信号阻害（Ｙ２７６３２を有する）の下、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比と、（ｄ）ＲＯＣＫ信号形成阻害（ブレビスタチンを有する）の細胞面積を計算したグラフである。データは、平均±標準誤差と表される。異なるアルファベットの文字は、統計的有意性を示す。
図２１によると、ナノリガンド提示基板をｂａｌｂ／ｃマウスに皮下移植した。移植後、Ｍ２分極溶解性因子（インターロイキン－４及び－１３）を基板に注入した（図２１ａ）。永久磁石をマウスの腹部側から見て基板の底（「磁石側」）に付着て、基板の磁石側を向けるナノリガンドのスライドを促進させた。上記の基板は、免疫蛍光の共焦点撮像と遺伝子発現解析のために、２４時間後に回収した。ｉＮＯＳ及びＦ－アクチンの免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像は、明確な同一位置化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、磁石側が非磁気側より優勢であることを示した（図２１ｂ）。同時に、磁気側でマクロファージの密度、面積、縦横比（それぞれ６７％、３６％、５３％）が著しく高い付着構造の優れた発達が観察され、これは非磁気側より宿主マクロファージでｉＮＯＳとＴＮＦの両方の発現がそれぞれ３３％と６０％ずつ、著しく低くなることを促進させた（図２１ｂ～ｃ）。
図２２によると、宿主マクロファージのみならず宿主好中球も急性炎症の期間においてＮＩＭＰ－Ｒ１４免疫蛍光により観察された。同時に、図２３ａによると、Ａｒｇ－１とＦ－アクチンに対する免疫蛍光の共焦点顕微鏡画像は、Ｆ－アクチンによって付着構造の非常に明確な組み立てを示し、これは、非磁気側より磁石側の方で、遥かに多い再生性Ａｒｇ－１発現と同一位置化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を表す結果をもたらした。図２３ａ～ｂによると、非磁石側と比べ、磁石側の宿主マクロファージでＡｒｇ－１及びＹｍ１（再生Ｍ２マーカー）の両方が、２７％と６０％ずつ高く発現している。これにより、、スライド可能なナノリガンドの磁気引力による遠隔制御は、宿主マクロファージの再生性Ｍ２表現型を促進する一方、空間的に調整された方式で体内における炎症性Ｍ１表現型を抑制することが分かる。早期急性炎症と再生反応の厳しい制御が、インプラントの長期宿主反応に影響を及ぼすことが知られている。
深部の内部組織で組織の修復を促進し、炎症や繊維カプセルの形成を抑制することにおいて、磁場を介在した時空間的、可逆的、長期的調整に関する実験を行い、臨床環境でインプラントの免疫調整が可能であることを確認した。
上記の実験例では、ナノリガンドスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御の下、培養物からのマクロファージの細胞付着性と表現型につき、次のように実験を行った。インビトロナノリガンドスライドがマクロファージの細胞付着性や表現型に及ぼす影響を調べた。ナノリガンドが存在する基板を１時間ＵＶ光で滅菌した。滅菌された基板は、マクロファージの非ナノリガンド（ｎｏｎ－ｎａｎｏ－ｌｉｇａｎｄ）特異的付着を最小限に抑えるため、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。５０ｋｃｅｌｌｓ／ｃｍ２のマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７、ｐａｓｓａｇｅ５、ＡＴＣＣ）を、処理済みの基板にプレーティングした。マクロファージを、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化されたウシ胎児血清、及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンが３７℃・５％ＣＯ２で充填された、高グルコースＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ）を含む基礎培地で培養した。細胞を基板の底（「磁石側」又は「左側」）に配置された磁石（２７０ｍＴ）を適用し、様々な側の中心（磁石側、中間、非磁気側）で、付着性を調べた。ＲＧＤペプチドリガンド又はナノリガンドのないナノ粒子、或いは磁石を適用していないナノリガンドが存在する基板を対照群として用いた。スライド可能なナノリガンドの時間的操作の下、マクロファージの細胞付着性基板の底に永久磁石を配置する（「磁場（ＭＦ）」）、或いは基板から永久磁石を取り除く（「磁場なし（ＮＭＦ）」）ことによる、ナノリガンドが存在する基板で検査された。永久磁石の時間的切り替えは、二つの対向面の間で基板の「左側」の底から「右側」の底に動かし、次いで「左側」の底に戻るように行った。スライド可能なナノリガンドの時間制御操作の下、マクロファージの分極表現型は、基板の底に永久磁石を配置する（「磁場（ＭＦ）」）状態、或いは基板から永久磁石を取り除いた（「磁場なし（ＮＭＦ）」）状態に依存しているため、「ＮＭＦ」と「ＭＦ」を切り替えるナノリガンドが存在する基板を使用して検査した。Ｍ１分極培地はリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍＬ）と組換えインターフェロン－ガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ）（ＩＦＮ－γ、１０ｎｇ／ｍＬ）を充填した基礎培地を含む。Ｍ２分極培地はインターロイキン－４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）（ＩＬ－４、２０ｎｇ／ｍＬ）とインターロイキン－１３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３）（ＩＬ－１３、２０ｎｇ／ｍＬ）を充填した基礎培地を含む。マクロファージの細胞付着構造アセンブリ介在Ｍ２表現型は、ＲＯＣＫ信号阻害（５０μＭＹ２７６３２同様）、ＲＯＣＫ信号形成阻害（１０μＭブレビスタチン同様）、或いはアクチン重合阻害（２μｇ／ｍＬサイトカラシンＤ同様）の下、基板の底（「磁石側」）に配置された磁石に適用させた後、検査を行った。
更に、免疫蛍光及び共焦点撮像により、Ｉｎ ｓｉｔｕスライド可能なナノリガンドの下で、マクロファージの細胞付着性の分析につき、次にように実験を行った。
マクロファージ培養物は、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド溶液に１０分間浸漬させた後、ＰＢＳで洗浄した。培養物をＰＢＳ中の３％ＰＳＡと０．１％トリトン－Ｘのブロック緩衝液で３０分間培養した。培養物をインテグリンβ１、ビンキュリン、ｉＮＯＳ、アルギナーゼ－１（Ａｒｇｉｎａｓｅ－１）、ＲＯＣＫ２、ＮＩＭＰ－Ｒ１４に対する１次抗体として溶液に４℃で一晩浸漬し、ＰＢＳで洗浄した。培養物を、室温で３０分間２次抗体、ファロイジン、ＤＡＰＩを混合した溶液に、室温で３０分間浸漬させた後、ＰＢＳで洗浄した。培養物を顕微鏡スライドに取り付け、全ての比較群に対して同じ露出条件を適用して共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで検査を行った。共焦点顕微鏡画像を使用して、マクロファージの細胞付着性を定量化した。インテグリンβ１の結合強度をヒストグラム機能で計算した。付着性マクロファージの密度は、ＤＡＰＩ染色核を集計することにより計算された。付着性マクロファージの面積及び縦横比は、以前にも報告されているように、Ｆ－アクチン染色を分析することにより計算された。
更に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を有するＩｎ ｓｉｔｕスライド可能なナノリガンドにおけるマクロファージ分極分析は、次のように行われた。
マクロファージをＭ１又はＭ２分極培地で培養し、サンプル当たり１ｍＬのトリゾルで採集した。基板を２つ（磁石側と非 磁気側）に分けた。各サンプルについて、９００ｎｇの抽出されたＲＮＡを、大容量ＲＮＡ－の－ｃＤＮＡキットを用いてｃＤＮＡに逆転写させた。Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ分析法に用いられるｃＤＮＡにより、リアルタイムＰＣＲ反応（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。ＧＡＰＤＨ発現に対する正規化の後、標的遺伝子（ｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、Ａｒｇｉｎａｓｅ－１、Ｙｍ１）の相対的なフォールディング発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｏｌｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ）が提示された。
更に、宿主の食細胞の付着性や表現型を調整するためのナノリガンドスライドの体内の遠隔制御につき、次のように実験を行った。宿主マクロファージの細胞付着性及び表現型に対する体内ナノリガンドスライドの効果を調べるため、ナノリガンド提示シリコン基板を皮下移植に用いた。高麗大学校の動物管理・使用委員会の承認を受けた約８週齢ｂａｌｂ／ｃマウスを実現動物として使用した。２ｍＬのアルファキサロン（ａｌｆａｘａｎ）と１ｍＬのロムポン（ｒｏｍｐｕｎ）の混合物を腹腔内注射で投与した。マウスの背面を約２．５ｃｍの長さで切開した。注入後、ＩＬ－４（５０ｎｇ）とＩＬ－１３（５０ｎｇ）を基板上に注入した。基板に対するマウスマクロファージの細胞付着性をテストした。基板の底（腹部側）に取り付けられた永久磁石（「磁石側」）は、磁石に向かってのナノリガンドのスライドを促進させた。移植後２４時間が経過した時点で、免疫蛍光及びＲＴ－ＰＣＲの共焦点撮像のために基板を回収した。

Claims (12)

  1. 磁性ナノ粒子を含むコアと、
    前記コアを包み込むように設けられ、インテグリン付着性リガンドペプチドを含むコーティング層と、
    を含むマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンドであって、
    前記インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電され、それによって、当該ナノリガンドは、正に荷電された基板と静電気的相互作用を介して結合して、前記基板上でスライド可能であり、磁場を印加して当該ナノリガンドをスライドさせることにより当該ナノリガンドの密度を制御することによって、マクロファージの付着及び再生を促進することを特徴とする、マクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンド。
  2. 前記磁性ナノ粒子は、シリカが表面に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンド。
  3. 前記コアとコーティング層を接続するリンカーを更に含み、
    前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである、請求項１に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンド。
  4. 前記ナノリガンドは、直径が３０ｎｍ～６０ｎｍであり、前記磁性ナノ粒子は、直径が５ｎｍ～３０ｎｍである、請求項１に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンド。
  5. 前記インテグリン付着性リガンドペプチドは、負に荷電されたチオール化インテグリン付着性リガンドペプチドを含み、
    前記ナノリガンドの表面は負に荷電されている、請求項１に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンド。
  6. 磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、
    コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、
    前記リンカーが結合されたコアをインテグリン付着性リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、
    を含む、請求項１～５のうちいずれか１項に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンドの製造方法。
  7. 請求項１～５のうちいずれか１項に記載のマクロファージの細胞付着及び再生促進用のスライド可能なナノリガンドを含む溶液に、表面が正に荷電された基板を担持して、負に荷電されたインテグリン付着性リガンドペプチドを含む前記ナノリガンドが前記基板と静電気的相互作用を介して結合したナノリガンド提示基板を製造するステップと、
    体外で前記ナノリガンド提示基板に培養液を処理した後、外部の磁場を印加して前記ナノリガンド提示基板上の前記ナノリガンドをスライドさせることにより前記ナノリガンドの密度を制御することによって、マクロファージの細胞付着及び再生性分極化を調整するステップと、
    を含む、マクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
  8. 前記ナノリガンド提示基板を製造するステップは、
    基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、
    浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して前記基板の表面が正に荷電させるステップと、
    正に荷電された基板を室温で超音波を利用して処理するステップと、
    を含む、請求項７に記載のマクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
  9. 前記表面が正に荷電された基板は、アミノシラン溶液に基板を担持して前記基板の表面が正電荷を帯びるように活性化させることを特徴とする、請求項７に記載のマクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
  10. 前記マクロファージの細胞付着及び再生性分極化を調整するステップは、体外に前記ナノリガンド提示基板を位置させた後、１００～７００ｍＴの磁場を１２時間～４８時間印加して行う、請求項７に記載のマクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
  11. 前記マクロファージの細胞付着及び再生性分極化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を変化させて行う、請求項７に記載のマクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
  12. 前記マクロファージの細胞付着及び再生性分極化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を経時変化させて行う、請求項７に記載のマクロファージの細胞付着及び再生を促進する方法。
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