JP7553216B2 - Ｈｇｆ産生促進剤及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、諸疾患の改善に有効であるＨＧＦ（肝細胞増殖因子：Hepatocytes Growth Factor、以下ＨＧＦと略する）産生促進作用を有するＨＧＦ産生促進剤に関する。更に詳しくは、ハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの混合抽出物及びその製造方法に関する。
ＨＧＦは、初代培養肝細胞の増殖を強く促進する因子として精製されたサイトカインであり、肝臓再生力を支える必要な肝再生因子である。ＨＧＦは分子量が約９万の一本鎖のタンパク質である。
ＨＧＦは、間葉細胞によって分泌され、多機能サイトカインとして、主に上皮由来細胞に対して作用する。ＨＧＦが、細胞増殖促進、細胞死抑制、組織修復、形態形成、血管新生、腫瘍伝播、ウィルス感染の免疫調節、及び心血管代謝活動を担う多様な機能を持っており、様々な疾患を対象に治療応用のための研究開発が進められてきた。
ＨＧＦは多彩な生理機能を有することが知られている。ＨＧＦが、肝臓、心臓、血管、脳、腎臓、消化器、皮膚、肺、及び神経等様々な組織や器官に対して再生又は保護作用を有しており、またこれらの組織や器官における諸疾患の改善にも有効であることが多数報告されている。ＨＧＦタンパク量を増やすことで、健康維持に役立つと期待できるため、現在ＨＧＦを外因的に補充し、様々の疾病の治療に用いられるように試みるなどの取り組みが行われている。また、ＨＧＦ産生促進作用を有している食品や生薬などの研究も進められている。
これまで、ガゴメコンプ由来フコイダン（特許文献１）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びアンジオテンシンII受容体拮抗薬（特許文献２）及び生薬の混合物（特許文献３）が、ＨＧＦ産生促進剤として知られている。一方、冬虫夏草粉砕物及びその抽出成分（特許文献４）、ニガウリ加工物の有効成分（特許文献５）から得られた成分が、ＨＧＦ産生促進活性を有することが分かってきた。また、プロテインキナーゼA（PKA）阻害剤の一種である8-Bromo-cAMPにＨＧＦ産生促進作用が確認され、研究時に陽性対照としてよく使われている（非特許文献１）。
ハス胚芽は、インド原産のハス科多年生水性植物であるハスの実の殻を除いた微小部分である。発芽成長に必要な成分を凝縮していると言われる。ハス胚芽抽出物の薬理作用を明らかにする研究は数多く行われ、抗肥満作用、抗がん作用、抗炎症作用が確認されている。
オタネニンジンは学名がPanax ginseng C.A.Mey.である。ニンジンの有効成分には、非常に高い滋養強壮の効果があり、また記憶過程の改善、抗ストレス、消化管運動亢進、ストレス性胃潰瘍抑制、抗アレルギーなどの作用も報告されている。
タチアワユキセンダングサは、キク科センダングサ属の植物である。過酷な環境でも繁殖能力が高く、非常に強い生命力を持つことが特徴である。日本では、沖縄などのほか、中南米諸国やアフリカ、中国、台湾などにも分布している。昔から伝承薬、民間薬として広く使用されている。
スギナは、シダ植物門トクサ網トクサ目トクサ科トクサ属の植物の1種である。生薬として、古くから伝承されていたが、花粉症対策としての効能があると最近の研究で分かってきた。
ヨモギは、キク科の多年草で、灸のもぐさ、漢方薬の原料としてよく使われている。特有の香りがあり、若い葉は食用され、生薬は止血、干した葉は健胃、下痢、貧血など多くの薬効があるとされる。
ネズミモチは、「女貞子」とも呼ばれ、主に中国で栽培されるモクセイ科の植物である。古くから耳鳴改善、白内障予防、白髪予防、リラックス作用などとして使用されているが、近年骨粗鬆症の予防、抗糖尿病、肝機能改善など研究で知らされてきた。
Y. Takami et al., "Modulation of hepatocyte growth factor induction in human skin fibroblasts by retinoic acid", Biochimica et Biophysica Acta 1743, 2005, p.49-56
ＨＧＦ産生促進に寄与するのが体内物質のみならず、植物などでも促進することができると分かってきている。また、陽性対照である8-Bromo-cAMPは試験・研究の目的のみに使用される試薬であり、ヒトが摂取することは禁じられており、本発明は、安全性が担保されている植物を用いて、高いＨＧＦ産生促進作用を有するＨＧＦ産生促進剤を提供することとなる。
様々な植物のＨＧＦ産生促進作用を検討しているうちに、それらの組み合わせの相乗効果などを鋭意検討した結果、請求項１記載のＨＧＦ産生促進剤に極めて強いＨＧＦ産生促進作用を有していることを見出し、本発明に至った。
すなわち、請求項１の混合抽出物は、ハス胚芽１０ｍｇ～１０ｇ重量部、オタネニンジン１０ｍｇ～１０ｇ重量部、タチアワユキセンダングサ１０ｍｇ～１０ｇ重量部、スギナ１０ｍｇ～１０ｇ重量部、ヨモギ１０ｍｇ～１０ｇ重量部及びネズミモチ１０ｍｇ～１０ｇ重量部の混合抽出物である。
本発明により、高いＨＧＦ産生促進効果を有するＨＧＦ産生促進剤を提供することが可能である。本発明は、細胞などに直接作用し、ＨＧＦ産生促進効果を発揮するものである。十分なＨＧF産生促進効果を発揮し、健康維持に役立つと期待できる。
本発明は、ＨＧＦ産生促進作用を用いる植物、即ちハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの混合抽出物である。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
本発明は、ＨＧＦ産生促進作用をもつ植物、すなわちハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチを含む混合抽出物を用いることが望ましい。
ハス胚芽、中国産でも日本産でも使用することができる。中国産のハス胚芽をそのまま又は乾燥しているものが望ましい。
オタネニンジンは、葉、茎、根などの部分を使用することに問題ないが、根又は茎をそのまま又は乾燥しているものが望ましい。
タチアワユキセンダングサは、日本、中国、台湾、インドなどの産地のタチアワユキセンダングサの葉及び茎をそのまま又は乾燥しているものを使用してもよいが、葉及び茎をそのまま又は乾燥しているもので、かつ日本産が望ましい。
スギナは、葉、茎、根などの部分を使用することに問題ないが、葉及び茎をそのまま又は乾燥しているものが望ましい。
ヨモギは、葉も茎も使用することには問題ないが、葉をそのまま又は乾燥しているものが望ましい。
ネズミモチは、実の部分を使用することに問題ないが、そのまま又は乾燥しているものが望ましい。
ＨＧＦ産生促進作用を調べるのに、上皮細胞や内皮細胞、さらに一部の間葉系細胞（腎尿細管上皮細胞、乳腺上皮細胞、気管支上皮細胞、胆管上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血管内皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞、筋衛星細胞など）も使用することができるが、線維芽細胞を用いて検討することが望ましい。
本発明で用いられる抽出物は、上記した６種類の植物をそのまま又は裁断、混合物を抽出溶媒にて調製することができる。
乾燥粉砕物は、それぞれの植物を乾燥した後粉砕するか、又は細かく切断した後に乾燥することによって調製することが可能である。乾燥方法としては、それぞれの植物の成分を破壊しない範囲であれば特に制限がないが、真空凍結乾燥、熱風乾燥、遠赤外線乾燥、減圧乾燥、マイクロ波減圧乾燥、及び加熱蒸気乾燥等を広く用いることができる。その中でも、成分の安定性が高く担保できる真空乾燥方法を用いることが望ましい。
抽出溶媒には、水、エタノール及びこれらの混合液が安全上望ましいが、抽出溶媒を完全留去して乾燥粉末を作る場合には、メタノールやブタノールなど低級アルキルアルコール、あるいはアセトン、DMSOなどの溶媒を使用することができる。
抽出溶媒を植物又は植物の混合物に対して１～１００倍量、通常、常温～100℃又は常圧下で１～６時間浸漬した後に濾過して抽出物を得ることができるが、抽出溶媒を１０～３０倍、８0～100℃で常圧下で１～３時間という条件が望ましい。
本発明における混合抽出物の各植物の配合は、乾燥重量として、ハス胚芽１０ｍｇ～１００ｇ重量部、オタネニンジン１０ｍｇ～１００ｇ重量部、タチアワユキセンダングサ１０ｍｇ～１００ｇ重量部、スギナ１０ｍｇ～１００ｇ重量部、ヨモギ１０ｍｇ～１００ｇ重量部及びネズミモチ１０ｍｇ～１００ｇ重量部の割合で混合されることができるが、ハス胚芽１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）、オタネニンジン１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）、タチアワユキセンダングサ１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）、スギナ１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）、ヨモギ１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）及びネズミモチ１ｇ～１０ｇ重量部（１，２，３，４，５，６，７，８，９ｇ重量部）の割合で混合されることが望ましい。
このようにして得られる混合抽出物は、後述の実施例で示すように、強いＨＧＦ産生促進作用を有している。
本発明に用いられている植物の混合抽出物は、６種類の植物の組み合わせによって作られている。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
１．調製例
［調製例１：単一植物の抽出物の調製］
表１に示している２２種類の乾燥した状態の植物を細かく裁断してから粉砕した。粉砕したそれぞれの乾燥物を４０ｇに対して水を６００ｍｌ加え、１５倍希釈した。その後、水浴上で１００℃、２時間還流熱水抽出を行った。抽出後、放冷してから濾紙でろ過を行った。ろ過により必要に応じ沈殿物を除き、得られた濾過液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた抽出物を乾燥減量が約４０～６０％くらいになるように調整した。その後、４℃の冷蔵庫にて保存した。
［調製例１：単一植物の抽出物の調製］
表１に示している２２種類の乾燥した状態の植物を細かく裁断してから粉砕した。粉砕したそれぞれの乾燥物を４０ｇに対して水を６００ｍｌ加え、１５倍希釈した。その後、水浴上で１００℃、２時間還流熱水抽出を行った。抽出後、放冷してから濾紙でろ過を行った。ろ過により必要に応じ沈殿物を除き、得られた濾過液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた抽出物を乾燥減量が約４０～６０％くらいになるように調整した。その後、４℃の冷蔵庫にて保存した。
［調製例２：混合植物の抽出物の調製］
エキス１～６（配合の内訳は表２を参照）に用いられている各植物を乾燥した状態にした上で混合し、細かく裁断してから粉砕した。粉砕した各種の混合物を４０ｇに対して水を６００ｍｌ加え、１５倍希釈した。その後、水浴上で１００℃、２時間還流熱水抽出を行った。抽出後、放冷してから濾紙でろ過を行った。ろ過により必要に応じ沈殿物を除き、得られた濾過液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた抽出物を乾燥減量が約４０～６０％になるように調整した。その後、４℃の冷蔵庫にて保存した。
エキス１～６（配合の内訳は表２を参照）に用いられている各植物を乾燥した状態にした上で混合し、細かく裁断してから粉砕した。粉砕した各種の混合物を４０ｇに対して水を６００ｍｌ加え、１５倍希釈した。その後、水浴上で１００℃、２時間還流熱水抽出を行った。抽出後、放冷してから濾紙でろ過を行った。ろ過により必要に応じ沈殿物を除き、得られた濾過液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた抽出物を乾燥減量が約４０～６０％になるように調整した。その後、４℃の冷蔵庫にて保存した。
２．実験操作
後述する実験例で使用した実験操作を説明する。
後述する実験例で使用した実験操作を説明する。
［実験操作１：ヒト皮膚線維芽細胞培養法］
ＨＧＦ産生促進活性を測定するのに、ヒト皮膚線維芽細胞（MRC-5）を用いて測定した。MRC-5の培養は、１０重量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（Cytiva社）を添加したE-MEM（Wako社）培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで実施した。MRC-5細胞は、４.５６×１０４／ｍｌになるように調製し、１２ウェルプレートに播種した。陽性対照としては、8-Bromo-cAMP １ｍＭ（Selleck Chemicals社）を用い、コントロールは１０重量％のＦＢＳを添加したE-MEM培地を用いた。
ＨＧＦ産生促進活性を測定するのに、ヒト皮膚線維芽細胞（MRC-5）を用いて測定した。MRC-5の培養は、１０重量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（Cytiva社）を添加したE-MEM（Wako社）培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで実施した。MRC-5細胞は、４.５６×１０４／ｍｌになるように調製し、１２ウェルプレートに播種した。陽性対照としては、8-Bromo-cAMP １ｍＭ（Selleck Chemicals社）を用い、コントロールは１０重量％のＦＢＳを添加したE-MEM培地を用いた。
［実験操作２：試薬添加、培養上清回収方法］
１２ウェルプレートに細胞を添加して２４時間後に、様々の濃度の調製例１～２の抽出物を含む１０重量％のＦＢＳを添加したE-MEM培地を添加し、さらに培養して２４時間後、培養上清を回収した。
１２ウェルプレートに細胞を添加して２４時間後に、様々の濃度の調製例１～２の抽出物を含む１０重量％のＦＢＳを添加したE-MEM培地を添加し、さらに培養して２４時間後、培養上清を回収した。
３．実験例
［実験例１：培養上清のＨＧＦ量の測定方法］
実験操作２にて回収した培養上清をELISA法でＨＧＦ産生量を測定した。ELISAは市販しているR&D社のELISA Kit(DHG00B)を使用した。得られた値を各培養液中の肝細胞増殖因子量を示し、また陽性対照として8-Bromo-cAMP １ｍＭを用いた。
［実験例１：培養上清のＨＧＦ量の測定方法］
実験操作２にて回収した培養上清をELISA法でＨＧＦ産生量を測定した。ELISAは市販しているR&D社のELISA Kit(DHG00B)を使用した。得られた値を各培養液中の肝細胞増殖因子量を示し、また陽性対照として8-Bromo-cAMP １ｍＭを用いた。
［実験例２：２２種類の植物、６種の混合抽出物がＨＧＦ産生に及ぼす影響］
表１で示しているように、それぞれ単独の抽出物（２２種類）と６種類の混合抽出物のＨＧＦ産生量をELISAで測定した後に、陽性対照8-Bromo-cAMP １ｍＭと同じ産生誘導濃度として算出した。算出値が低ければ低いほど、ＨＧＦ産生誘導活性が高いということである。表３に示しているように、２２種類の植物の中では、高いＨＧＦ産生促進作用を示したのが、ハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの６種類であった。そこで、６種類の植物の混合抽出物（表２のエキス３）のＨＧＦ産生促進活性を測定した結果、それぞれの単独植物の抽出物よりも高いＨＧＦ産生促進活性を示し、ほかの植物の組み合わせにより作られた混合抽出物よりも高いＨＧＦ産生促進活性を有することが分かった（図１）。また、図２に示しているように、エキス３は濃度依存的に顕著なＨＧＦ産生促進効果があった。
表１で示しているように、それぞれ単独の抽出物（２２種類）と６種類の混合抽出物のＨＧＦ産生量をELISAで測定した後に、陽性対照8-Bromo-cAMP １ｍＭと同じ産生誘導濃度として算出した。算出値が低ければ低いほど、ＨＧＦ産生誘導活性が高いということである。表３に示しているように、２２種類の植物の中では、高いＨＧＦ産生促進作用を示したのが、ハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの６種類であった。そこで、６種類の植物の混合抽出物（表２のエキス３）のＨＧＦ産生促進活性を測定した結果、それぞれの単独植物の抽出物よりも高いＨＧＦ産生促進活性を示し、ほかの植物の組み合わせにより作られた混合抽出物よりも高いＨＧＦ産生促進活性を有することが分かった（図１）。また、図２に示しているように、エキス３は濃度依存的に顕著なＨＧＦ産生促進効果があった。
本発明は、６種類の植物の混合抽出物のＨＧＦ産生促進剤は、健康食品、機能性食品又はサプリメントとして有利に利用し、健康維持に役に立つと期待できる。
Claims (3)
- ハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの混合物の抽出物であって、
前記植物は、乾燥重量として、ハス胚芽１０ｍｇ～１０ｇ重量部、オタネニンジン１０ｍｇ～１０ｇ重量部、タチアワユキセンダングサ１０ｍｇ～１０ｇ重量部、スギナ１０ｍｇ～１０ｇ重量部、ヨモギ１０ｍｇ～１０ｇ重量部及びネズミモチ１０ｍｇ～１０ｇ重量部の混合抽出物であることを特徴とするＨＧＦ産生促進剤。 - ハス胚芽、オタネニンジン、タチアワユキセンダングサ、スギナ、ヨモギ及びネズミモチの混合物に対して、指定溶媒を１倍～１００倍量で抽出することを特徴とする請求項１記載のＨＧＦ産生促進剤を製造する製造方法。
- 前記指定溶媒が、水又はエタノールを含む溶媒であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
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