JP7477914B2 - 不死化豚胎子小腸マクロファージ - Google Patents

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Description

本発明は、不死化豚小腸マクロファージ及び該マクロファージの製造方法に関する。本発明はまた、前記マクロファージを用いた、豚感染ウイルス又はワクチンの製造方法に関する。さらに本発明は、前記マクロファージを用いた、豚感染ウイルスを検出する方法又は豚感染ウイルスに対する中和抗体を検出する方法に関する。
養豚において、下痢は家畜の死亡及び発育遅延要因の一つであり、安定かつ効率的な豚肉生産における重大な問題である。下痢は、病原体の感染、栄養、宿主のストレスなど様々な要因が単独あるいは相互に関連して発生する。自然免疫担当細胞である小腸マクロファージは、宿主免疫の作動と終息に大きな役割を担っており、その応答は下痢の重篤度や病原体の排泄量に大きな影響を及ぼす。また、栄養の変化やそれに伴う腸内細菌叢とその代謝産物の変化によっても下痢を伴う腸炎が発生し、その病態の一端を小腸マクロファージの応答が担うことも明らかにされつつある。
これらのことから、豚における下痢の病態解明と予防法開発の基盤ツールとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの小腸マクロファージの免疫学的応答解析系が必要であると考えられる。一方で、現在までに継代可能な豚小腸マクロファージの細胞株は樹立されておらず、前記解析系を構築する上でも、その作製が求められていた。
Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ Ｔ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．、２０１７年８月、２１；４：１３２．
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、継代可能な豚小腸マクロファージの細胞株を提供することを目的とする。
本発明者らは、従前、豚（６日齢）の腎臓からマクロファージを単離し、それを不死化することに成功している（非特許文献１）。そこで、豚（約１ヶ月齢）の小腸についても、マクロファージを単離し、それを不死化することを試みた。しかしながら、抗生物質及び抗真菌薬を含む培地を用いても、微生物のコンタミネーションが激しく、豚の小腸からマクロファージを単離することが叶わなかった。
そこで、先ずは、豚小腸からのマクロファージ初代培養を可能にすべく、鋭意検討及び研究を重ねた。その結果、胎子の小腸であれば、前記のようなコンタミネーションを生じさせることはなく、小腸マクロファージの単離培養が可能であることを見出した。
そして、このようにして得られた豚小腸マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を導入し、形質転換したところ、得られた細胞は、少なくとも６０回以上の分裂が可能であることが明らかになった。また、当該不死化細胞は、マーカー分子の発現及びマクロファージとしての機能（細菌由来成分に応答しての、細胞内シグナル伝達分子の活性化及び炎症性サイトカイン産生の誘導）を維持していることも明らかになった。
さらに、このようにして得られた不死化豚胎子小腸マクロファージについて、アフリカ豚熱ウイルス（ＡＳＦＶ）に対する感受性試験を行った。その結果、当該細胞は、細胞変性効果（ＣＰＥ）試験、血球吸着（ＨＡＤ）試験の両方においても、ＡＳＦＶを検出できることが明らかになった。さらに、試験した全てのＡＳＦＶ株に対して感受性を有し、これらウイルス株の増殖も可能であることが明らかになった。また、その感受性は、驚くべきことに、初代培養豚肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）と比較して桁違いに高かった（ＣＰＥ試験ではＰＡＭに比べ１００～１００００倍、ＨＡＤ試験ではＰＡＭに比べ１０～１００倍高かった）。さらに、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス及び豚サーコウイルス２型に関しても各々、感受性試験を行った。その結果、前記不死化豚胎子小腸マクロファージは、ＡＳＦＶ同様に、これらウイルスに対しても高い感受性を示すことが確認された。
本発明は、このように、不死化豚小腸マクロファージの作製に初めて成功したこと、及び作製された不死化豚胎子小腸マクロファージは、ウイルスに対して高い感染感受性を有していることを見出したことに基づくものであり、具体的には、以下のとおりである。
＜１＞ 豚胎子の小腸マクロファージを不死化した細胞。
＜２＞ 豚胎子の小腸マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ逆転写酵素からなる群から選択される少なくとも１のタンパク質を発現させて成る、＜１＞に記載の細胞。
＜３＞ 前記発現は、前記タンパク質をコードするレンチウイルスからの発現である、＜２＞に記載の細胞。
＜４＞ 前記テロメラーゼ逆転写酵素が豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素である、＜２＞又は＜３＞に記載の細胞。
＜５＞ 前記豚胎子は胎齢３０～１１４日の豚胎子である、＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の細胞。
＜６＞ 豚胎子の小腸マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ逆転写酵素からなる群から選択される少なくとも１のタンパク質を発現させる工程を含む、不死化豚小腸マクロファージの製造方法。
＜７＞ 前記工程は、前記タンパク質をコードするレンチウイルスを、前記豚胎子の小腸マクロファージに導入し、当該タンパク質を発現させる工程である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 前記テロメラーゼ逆転写酵素が豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素である、＜６＞又は＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 前記豚胎子は胎齢３０～１１４日の豚胎子である、＜６＞～＜８＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜１０＞ ＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の細胞と、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記細胞において増殖する工程を含む、豚感染ウイルスの製造方法。
＜１１＞ ＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の細胞と、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記細胞において増殖する工程、
増殖した豚感染ウイルスを単離する工程、及び
単離した豚感染ウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、豚感染ウイルスを含むワクチンの製造方法。
＜１２＞ 前記豚感染ウイルスが、アフリカ豚熱ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚ロタウイルス、豚サーコウイルス、及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスからなる群から選択される少なくとも１のウイルスである、＜１０＞又は＜１１＞に記載の製造方法。
＜１３＞ 豚感染ウイルス由来遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の細胞。
＜１４＞ 前記豚感染ウイルスが、アフリカ豚熱ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚ロタウイルス、豚サーコウイルス、及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスからなる群から選択される少なくとも１のウイルスである、＜１３＞に記載の細胞。
＜１５＞ 豚感染ウイルスを検出する方法であって、下記工程を含む方法
被検試料存在下にて、＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞を培養する工程、
当該細胞における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び
当該レポーター遺伝子の発現が検出された場合に、前記被検試料は豚感染ウイルスを含有していると判定する工程。
＜１６＞ 豚感染ウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、下記工程を含む方法
被検豚から単離された生体試料の存在下、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の細胞と豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記細胞にて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、＜１＞～＜５＞のうちのいずれか一項に記載の細胞にて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程。
＜１７＞ 前記豚感染ウイルスが、アフリカ豚熱ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚ロタウイルス、豚サーコウイルス、及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスからなる群から選択される少なくとも１のウイルスである、＜１５＞又は＜１６＞に記載の方法。
本発明によれば、継代可能な豚胎子小腸マクロファージの細胞株を提供することが可能となる。また、当該不死化豚胎子小腸マクロファージは、ウイルスに対して高い感染感受性を有するため、様々なウイルスを増殖させることが可能となり、当該ウイルスに対するワクチンの製造、開発が可能となる。また、感染感受性の高さから、前記ウイルスを検出（検査、診断）することも可能となる。
豚胎子の小腸組織片を、酵素処理して播種し、培養してから２２日目に広がってきた接着性の初代培養細胞（豚胎子小腸初代培養細胞）を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２００μｍを表す。 豚胎子小腸初代培養細胞を剥がし播き直して形成された、細胞シート上に弱く接着して増殖する球状の細胞（マクロファージ、ＰＩＭ）を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは１００μｍを表す。 播き直して培養した後の豚胎子小腸初代培養細胞を、免疫染色にて分析した結果を示す写真である。図中、一番上の左側は、筋繊維芽細胞マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を染色した結果を示し、一番上の右側は、間充織細胞マーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎを染色した結果を示す。真ん中は上皮マーカーであるサイトケラチンを染色した結果を示す（左側はサイトケラチン１８（ＣＫ１８）、右側はサイトケラチン１９（ＣＫ１９）を染色した結果を各々示す）。一番下の左側は、マクロファージマーカーであるＣＤ１７２ａを染色した結果を示し、一番下の右側は、マクロファージマーカーであるＣＤ２０４を染色した結果を示す。スケールバーは４００μｍを表す。また、カラー表示下、茶色は抗体染色を表し、青紫色は核染色を表す。 ＰＩＭを、免疫染色にて分析した結果を示す写真である。一番上の左側は、マクロファージマーカーであるＩｂａ１を染色した結果を示し、一番上の右側は、マクロファージマーカーであるＣＤ１７２ａを染色した結果を示し、真ん中の左側は、マクロファージマーカーであるＣＤ２０４を染色した結果を示す。真ん中の右側は、間充織細胞マーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎを染色した結果を示す。一番下は上皮マーカーであるサイトケラチンを染色した結果を示す（左側はＣＫ１８、右側はＣＫ１９を染色した結果を各々示す）。スケールバーは４００μｍを表す。また、カラー表示下、茶色は抗体染色を表し、青紫色は核染色を表す。 豚胎子の小腸から単離して不死化したマクロファージ（ＩＰＩＭ）を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。図中のスケールバーは１００μｍを表す。 ＩＰＩＭの細胞増殖性を試験した結果を示す、グラフである。 ＩＰＩＭを、免疫染色にて分析した結果を示す写真である。上部は、左側より順に、マクロファージマーカーであるＩｂａ１を、マクロファージマーカーであるＣＤ１７２ａを、マクロファージマーカーであるＣＤ２０４を、マクロファージを含む抗原提示細胞のマーカーであるＭＨＣ－ＩＩを、各々染色した結果を示す。下部は、左側より順に、マクロファージマーカーであるＣＤ１６を、Ｍ２型マクロファージマーカーであるＣＤ１６３を、Ｍ１型マクロファージマーカーであるＣＤ１６９を、豚マクロファージマーカーであるＣＤ２０３ａを、各々染色した結果を示す。図中のスケールバーは２００μｍを表す。また、カラー表示下、茶色は抗体染色を表し、青紫色は核染色を表す。 ＩＰＩＭは、細菌由来成分（ムラミルジペプチド：ＭＤＰ、リポ多糖：ＬＰＳ）に応答して細胞内シグナル伝達分子を活性化（ｐ３８ＭＡＰキナーゼをリン酸化）させることを示す、写真である。 ＩＰＩＭは、細菌由来成分（ＭＤＰ、ＬＰＳ）に応答して炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β）の産生を誘導することを示す、写真である。 ＩＰＩＭに、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｒｍｅｎｉａ０７株）を接種して２日後に観察し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を検出した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネル「非感染」は、ＡＳＦＶ株非接種の陰性対照の結果を示す。 赤血球存在下、ＩＰＩＭに、Ａｒｍｅｎｉａ０７株を接種して２日後に観察し、血球吸着（ＨＡＤ）を検出した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネル「非感染」は、ＡＳＦＶ株非接種の陰性対照の結果を示す。 ＩＰＩＭに、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を接種して、３日目に間接蛍光抗体法によりウイルス抗原を検出し、また７日目にＣＰＥを検出した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネル「非接種」は、ＰＲＲＳＶ株非接種の陰性対照の結果を示す。 ＩＰＩＭにおけるＰＲＲＳＶ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の経時変化を解析した結果を示すグラフである。 ＩＰＩＭにおける豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）遺伝子量の経時変化を解析した結果を示すグラフである。
本発明は、豚胎子の小腸マクロファージを不死化した細胞（不死化豚胎子小腸マクロファージ）に関する。
本発明において、「不死化豚胎子小腸マクロファージ」は、豚（哺乳綱鯨偶蹄目イノシシ科の動物）の胎子の小腸に存在するマクロファージが不死化した細胞を意味する。「豚胎子」とは、豚母体中の出産前の個体を意味し、好ましくは胎齢３０～１１４日の豚であり、小腸組織形成における成熟の観点から、より好ましくは９０～１１４日の豚である。
マクロファージを採取する「小腸」としては、特に制限はなく、例えば、回腸、空腸、十二指腸が挙げられるが、免疫細胞が集中するリンパ組織の発達の観点から、好ましくは回腸である。
不死化される「豚小腸マクロファージ」は、豚小腸に存在する、卵黄嚢、胎子肝由来のマクロファージあるいは単球から分化して成るマクロファージであり、活性型マクロファージ（炎症性のＭ１型マクロファージ、抗炎症性のＭ２型マクロファージ）であってもよく、休止型マクロファージであってもよい。かかるマクロファージは、例えば、後述の実施例に示すとおり、豚胎子から採取した小腸から、被膜を除去する。次いで、単離した小腸組織を細切りにし、緩衝液で洗浄し、酵素処理に供した後、培養する。その培養過程において生じる、単層の細胞シートに緩く接着しているマクロファージ様細胞を、単離することによって調製することができる。
なお、細切りにした小腸組織の洗浄に用いる緩衝液としては、特に制限はなく、例えば、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、りん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液（ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。
前記酵素処理は、組織から細胞を分離、分散し得る限り、用いる酵素については、特に制限はなく、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ Ｉ等）、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ又はプロナーゼが挙げられるが、好ましくは、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びＤＮａｓｅ Ｉの組み合わせである。また、処理する温度、時間としても制限はなく、用いる酵素の種類、細胞の分離・分散の程度に応じて、適宜調整し得る。
酵素処理によって分散した細胞の培養に用いる培地としては、小腸マクロファージを維持できる限り、特に制限はないが、公知の基礎培地を基に周知慣用の培地添加物を適宜添加することによって調製することができる。「基礎培地」としては、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（高グルコース）、ＤＭＥＭ培地（低グルコース）、ＲＰＭＩ １６０培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ハムＦ１２培地、ＫＳＯＭ培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、フィッシャーズ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、ＭＥＭ Ｚｉｎｃオプション改善培地、ＩＭＤＭ培地、メヂィウム１９９培地、及びこれら任意の混合培地が挙げられる。「培地添加物」としては、例えば、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン等）、抗真菌薬（ピマリシン、アンホテリシンＢ等）、機能性タンパク質（インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン等）、還元剤（モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ－アセチルシステイン等）、脂肪酸以外の脂質（コレステロール等）、アミノ酸（アラニン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸等）、ペプチド（グルタチオン、還元型グルタチオン等）、ヌクレオチド等（ヌクレオシド、シチジン、アデノシン５’－一リン酸、ヒポキサンチン、チミジン等）、金属塩（硝酸鉄（III）、硫酸鉄（II）、硫酸銅、硫酸亜鉛等）、無機塩類（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素等）、炭素源（グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等）、ビタミン、無機化合物（亜セレン酸）、有機化合物（パラアミノ安息香酸、エタノールアミン、コルチコステロン、プロゲステロン、リポ酸、プトレシン、ピルビン酸、乳酸、トリヨードチロニン等）、緩衝化合物（ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム等）、ｐＨ指示薬（フェノールレッド等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、かかる培地を用いた培養条件は、特に制限はないが、培養温度としては、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。
そして、このような培養条件下で、酵素処理によって分散した小腸組織由来の細胞を培養することにより、先ず小腸初代培養細胞を得ることができる。当該細胞が得られる培養時間としては特に制限はないが、通常１週間～１ヶ月間、好ましくは２～３週間である。
次いで、得られた小腸初代培養細胞を、酵素処理に供し、培養器から剥がし、分散させ、播き直す。ここでの酵素処理も上述の酵素を用いて行なうことができるが、好ましくは、プロテアーゼ（非コラーゲン性タンパク質に対する分解活性を少なくとも有する酵素）、コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅの組み合わせ（例えば、製品名：Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）である。
そして、播き直し後の培養にて、筋繊維芽細胞様細胞から構成される細胞シートと、その上に弱く接着し増殖する球状の細胞（豚小腸マクロファージ）とからなる、混合培養系が構築される。当該培養系が構築される培養時間としては特に制限はないが、通常数日（２～４日）～数週（２～３週）間であり、好ましくは１～２週間である。
このようにして得られる豚胎子の小腸マクロファージを、不死化する方法については特に制限はないが、不死化遺伝子を少なくとも１種導入することにより行うことができる。不死化遺伝子としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０Ｔ抗原）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、Ｍｙｃ、Ｒａｓが挙げられるが、ＳＶ４０Ｔ抗原及びＴＥＲＴを導入することが好ましく、豚マクロファージの不死化効率を高めるという観点から、ＳＶ４０Ｔ抗原及び豚由来のＴＥＲＴを導入することがより好ましい。
不死化遺伝子の導入は、当該遺伝子をコードするベクターを用いることによって行うことができる。ベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。
ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス等のレトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。これらベクターにおいて、豚マクロファージへの遺伝子導入効率を高めるという観点から、レトロウイルスベクターが好ましく、レンチウイルスがより好ましい。
本発明に係るベクターには、不死化遺伝子の他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列、複製開始点や複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、５’キャップ構造、シャイン・ダルガノ配列、コザック配列等を含む５’非翻訳領域、ポリアデニレーションシグナル、ＡＵリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント等を含む３’非翻訳領域、他のタンパク質をコードするヌクレオチド等を含んでいてもよい。
不死化遺伝子は、プロモーターの下流に作動可能に配置することで、各ポリヌクレオチドを効率よく転写することが可能となる。かかる「プロモーター」としては、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」としては、例えば、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挙げることができる。
また、複数種の不死化遺伝子を導入する場合には、これら遺伝子を、単一のベクターに組み込んでもよく、各々別々のベクターに組み込んでもよいが、発現効率を高めるという観点から、別々のベクターに組み込むことが望ましい。また、単一のベクターに組み込む際には、例えば、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド配列等を該ベクターに挿入することにより、ポリシストロニックに複数種の不死化遺伝子を発現させることが可能となる。
前記ベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。また、本発明のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ－８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐが挙げられる。さらに、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。また、このようにして調製されたウイルス粒子は、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ法、Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ法、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ法等によって細胞に導入することができる。
なお、かかる遺伝子導入及びその後の維持培養は、上述の豚胎子小腸の初代培養のための培地及びそれを用いた培養条件によって行なうことが出来る。また、このように不死化遺伝子を導入して樹立される不死化豚胎子小腸マクロファージは、少なくとも１カ月以上の増殖性を示し、好ましくは２カ月以上の増殖性を示し、より好ましくは３カ月以上の増殖性を示す。不死化豚腎臓マクロファージの倍加時間は、少なくとも４日間であり、好ましくは２日間であり、より好ましくは１日間である。また、不死化豚胎子小腸マクロファージはマクロファージの特性を維持していることが好ましく、例えば、マクロファージ特異的遺伝子である、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１６、Ｉｂａ－１、ＣＤ２０４（ＭＳＲ－Ａ）及びＣＤ２０３ａのうちの少なくとも１の遺伝子が発現しており、好ましくは２以上の遺伝子が発現しており、より好ましくは３以上の遺伝子が発現しており、さらに好ましくは４以上の遺伝子が発現しており、特に好ましくはこれら全ての遺伝子が発現している。さらに、不死化豚胎子小腸マクロファージは、特定のマクロファージ亜集団のマーカー遺伝子であるＣＤ１６３及びＣＤ１６９、並びに抗原提示細胞マーカー遺伝子であるＭＨＣ－ＩＩのうちの少なくとも１の遺伝子が発現していてもよい。また、本発明に係る不死化豚胎子小腸マクロファージは、マクロファージの特性として、貪食作用、ＬＰＳ刺激による炎症性サイトカインの産生及びインフラマソーム活性に伴うＩＬ－１β成熟化のうちの少なくとも１の機能を保持しており、好ましくは２以上の機能を保持している。
なお、初代培養の豚マクロファージとは異なり、密に展開して（シート状になって）増殖する。したがって、当該マクロファージは、形態の変化を検出し易いため、後述の感染細胞の変性を指標とするアフリカ豚熱ウイルスの感染試験（ＣＰＥ試験、ＨＡＤ試験等）においても、有用である。
（豚感染ウイルス）
本発明において、「豚感染ウイルス（豚に感染するウイルス）」は、少なくとも豚に感染し得るウイルスであればよく、ＤＮＡウイルス（二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、ｓｓ及びｄｓＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウイルス）であってもよく、ＲＮＡウイルス（一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルス（プラス鎖ＲＮＡウイルス又はマイナス鎖ＲＮＡウイルス）、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルス）であってもよい。
豚感染ウイルスとしては、例えば、アフリカ豚熱ウイルス（ＡＳＦＶ）、豚流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、豚ロタウイルス、豚サーコウイルス（ＰＣＶ２）、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスが挙げられる。なお、日本において、２０２０年２月５日に、家畜伝染病予防法で定める「アフリカ豚コレラ」の名称は「アフリカ豚熱」に改正されている。
（豚感染ウイルスの製造方法）
本発明の豚感染ウイルスの製造方法（増殖方法、増幅方法）は、不死化豚胎子小腸マクロファージと、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚胎子小腸マクロファージにおいて増殖する工程を含む、方法である。
不死化豚胎子小腸マクロファージに接触させる豚感染ウイルスについては、上述のとおりであるが、単離された当該ウイルス自体のみならず、前記ウイルスを含み得る試料であってもよい。かかる「試料」としては、豚由来の組織、細胞、それらの培養物、洗浄液、若しくは抽出物、又は豚の飼育環境（飼育施設等）の採取物、洗浄液若しくはそれらの培養物が挙げられる。
「接触」は、不死化豚胎子小腸マクロファージを培養する培地に、豚感染ウイルスを添加することによって、通常行われる。かかる「培地」としては、特に制限はないが、上述の豚胎子小腸の初代培養のための培地が挙げられる。
豚感染ウイルスの「増殖」は、当該ウイルスが接触し、感染した不死化豚胎子小腸マクロファージを培養することによって行うことができる。培養温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。豚感染ウイルスと接触させてからの培養期間としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０日間、好ましくは２～７日間、より好ましくは３～５日間である。
豚感染ウイルスが増殖したかどうかは、当業者であれば公知の方法により判断することができる。かかる方法としては、例えば、後述の実施例に示すような、細胞変性効果（ＣＰＥ）を指標とするＣＰＥ試験、さらには、ＣＰＥに伴う細胞内ＡＴＰ枯渇の程度を検出する方法（例えば、プロメガ社が提供するＶｉｒａｌ ＴｏｘＧｌｏアッセイ）が挙げられる。また、豚感染ウイルスに由来する遺伝子又はその発現を検出する方法も利用することができる。ここで、遺伝子の発現は、転写レベル（ＲＮＡレベル）であっても翻訳レベル（タンパク質レベル）であってもよい。遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ）又はＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、シーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング又はサザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法が挙げられる。また、所謂次世代シークエンシング法においてリード数をカウントすることにより、遺伝子又はＲＮＡレベルを定量的に検出することができる。また、タンパク質を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、抗体アレイ、イムノブロッティング、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）や、質量分析法が挙げられる。
（ワクチンの製造方法）
本発明の豚感染ウイルスを含むワクチンの製造方法は、不死化豚胎子小腸マクロファージと、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚胎子小腸マクロファージにおいて増殖する工程、
増殖した豚感染ウイルスを単離する工程、及び
単離した豚感染ウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、方法である。
当該ウイルスを前記不死化豚胎子小腸マクロファージにおいて増殖する工程については上述のとおりである。増殖した豚感染ウイルスの「単離」とは、前記不死化豚胎子小腸マクロファージ及び／又は当該細胞の培養培地からの分離、精製及び／又は濃縮を意味する。前記ウイルスの単離方法としては、例えば、培養培地のろ過、細胞の破砕（超音波処理、低張液処理、凍結融解等）、遠心分離（超遠心法、密度勾配遠心法等）、濃縮（硫酸アンモニウム、樹脂カラム、ポリエチレングリコール塩析等）が挙げられる。
このようにして単離された豚感染ウイルスは、そのままワクチン（所謂、生ワクチン）として用いてもよく、弱毒化生形態（所謂、生弱毒化ウイルス）で用いてよく、不活化形態でワクチンとして用いてもよい。さらに、免疫原性を有する限り、これら単離された豚感染ウイルスの一部（タンパク質、ポリペプチド、糖、糖タンパク質、脂質、核酸等）をワクチンとして用いてもよい。
生弱毒化ウイルスは、野外から分離されたウイルスと比較して低減した毒性レベルを有するウイルスである。弱毒化ウイルスは、公知の方法、例えば、突然変異誘発物質の存在下での増殖、インビトロでの連続（長期間）継代による培養細胞への馴化、自然生育環境から逸脱した条件下（例えば、高温条件下）での増殖に豚感染ウイルスを供することによって得ることができる。また、ゲノム編集、遺伝子改変技術等を用いて、ウイルスの特定遺伝子を欠損又は組み換えることによっても、生弱毒化ウイルスを得ることができる。
ウイルスの不活化も、当業者であれば、公知の方法を用いて行うことができる。かかる不活化の方法としては、ホルムアルデヒド処理、ＵＶ照射、Ｘ線照射、電子線照射、ガンマ線照射、アルキル化処理、エチレン－イミン処理、チメロサール処理、β－プロピオラクトン処理、グルタルアルデヒド処理が挙げられる。
単離した豚感染ウイルスに混合する「薬理学上許容される担体」としては、例えば、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤が挙げられる。「薬理学上許容される媒体」としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液が挙げられる。これら担体及び媒体は、当業者であれば、ワクチンの剤型、使用方法に応じて、当該分野に用いられる公知の物を適宜又は組み合わせて選択して用いることができる。また、ワクチンの形態としては、特に制限はなく、例えば、懸濁液の形態であってもよく、凍結乾燥された形態であってもよい。
ワクチン効果を増強するという観点から、更にアジュバントを混合してもよい。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムゲルアジュバント等の無機物質、微生物若しくは微生物由来物質（ＢＣＧ、ムラミルジペプチド、百日せき菌、百日せきトキシン、コレラトキシン等）、界面活性作用物質（サポニン、デオキシコール酸等）、油性物質（鉱油、植物油、動物油等）のエマルジョン、ミョウバン等が挙げられる。
（豚感染ウイルスの検出方法）
本発明は、豚感染ウイルス由来遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する、不死化豚胎子小腸マクロファージを提供する。
また、被検試料存在下にて、前記ＤＮＡを有する不死化豚胎子小腸マクロファージを培養する工程、当該不死化豚胎子小腸マクロファージにおける前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び当該レポーター遺伝子の発現が検出された場合に、前記被検試料は豚感染ウイルスを含有していると判定する工程を含む、豚感染ウイルスを検出する方法をも提供する。
前記ＤＮＡが導入される「不死化豚胎子小腸マクロファージ」については上述のとおりである。また、前記ＤＮＡは、上述の「不死化遺伝子」において説明したベクターの形態であってもよい。さらに、前記ＤＮＡの不死化豚胎子小腸マクロファージへの導入も、上述の「不死化遺伝子」に関する説明において列挙した方法を用い、当業者であれば行なうことができる。
前記ＤＮＡにおける「豚感染ウイルス由来遺伝子のプロモーター領域」としては、豚感染ウイルスに由来し、当該ウイルスの感染・増殖に応じてその下流にある遺伝子の発現を活性化できる領域であれば特に制限はなく、最初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ）、初期遺伝子（ｅａｒｌｙ）、後初期遺伝子（ｌａｔｅ）、後期遺伝子（ｖｅｒｙ－ｌａｔｅ）のいずれの遺伝子であってもよい。
用いる豚感染ウイルス由来遺伝子については、当業者であれば適宜公知の情報を参照しながら選択することができる。例えば、ＡＳＦＶ由来遺伝子については、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｎｏｍｙ 国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）第９版、２０１２年、１５５～１５７ページ 表１に記載の「ＡＳＦＶがコードするタンパク質の機能」リスト等を参照しながら選択することができるが、ｐ７２、Ｕ１０４Ｌ、ＣＤ２ｖ、ＤＮＡポリメラーゼ又はｐ３０遺伝子のプロモーター領域が好適に用いられる（Ｐｏｒｔｕｇａｌ ＲＳ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０１７年８月、５０８巻、７０～８０ページ 参照のほど）。
前記プロモーター領域の下流に機能的（作動可能的）に結合される「レポーター遺伝子」としては特に制限はなく、公知のものが適宜用いられる。例えば、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、具体的には、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）遺伝子等が挙げられる。発光タンパク質・酵素遺伝子としては、具体的には、エクオリン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。発色酵素遺伝子としては、具体的には、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ＳＥＡＰ遺伝子等が挙げられる。
そして、本発明の検出方法においては、これらレポーター遺伝子の発現に応じて生じる、蛍光、発光、発色等を指標として、不死化豚胎子小腸マクロファージの豚感染ウイルスの感染の有無、ひいては被検試料における豚感染ウイルスの存在を検出することができる。
なお、被検試料としては、豚感染ウイルスが存在し得る試料であれば特に制限はなく、例えば、豚由来の組織、細胞、それらの培養物、洗浄液、若しくは抽出物、又は豚の飼育環境（飼育施設等）の洗浄液若しくはその培養物が挙げられる。
また、本発明の検出方法における培養に用いられる「培地」としては、特に制限はないが、上述の豚胎子小腸の初代培養のための培地が挙げられる。培養の温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４２℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。被検試料存在下、レポーター遺伝子の発現を検出する迄の培養期間としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０日間、好ましくは２～７日間、より好ましくは２～５日間である。
（中和抗体の検出方法）
本発明の豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法は、
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚胎子小腸マクロファージと豚に感染するウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚胎子小腸マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚胎子小腸マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程を、含む方法である。
本発明にかかる「中和抗体」とは、豚感染ウイルスの感染又は増殖を抑制する抗体を意味する。また、かかる抗体は、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスを含む。また、「被検豚」については、豚感染ウイルスの感染経験を問わず、豚であれば特に制限はない。被検豚から単離された「生体試料」としては、豚由来の試料（例えば、血液（血清、血漿等）、粘液（唾液、鼻汁、乳汁、消化管分泌液等）、及びそれらから精製された抗体）が挙げられる。
「接触」については上述のとおりである。増殖の条件に関し、培養温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。生体試料存在下又は非存在下における培養期間としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０日間、好ましくは２～７日間、より好ましくは３～５日間である。また、増殖したウイルスは、上述のとおり、ＣＰＥ試験等や、豚感染ウイルスに由来する遺伝子又はその発現を検出することにより、検出することができる。このように、本発明の検出方法においては、ウイルス数自体のみならず、ウイルス数を反映する前記遺伝子（ゲノムＤＮＡ量等）又はその発現レベルを指標として、中和抗体の存在の有無を判定してもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜豚胎子からの豚小腸マクロファージの単離＞
豚胎子（胎齢１０８日程度）より小腸（回腸部位）を約５ｃｍ採取し、癒着している皮膜を切除後、縦方向に切り半分に開いた。小腸組織をハサミで十分に細切し、コニカルチューブに移してダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した後、コラゲナーゼ／ディスパーゼ／ＤＮａｓｅ Ｉを含むＤＰＢＳに浸し３７℃で１時間酵素処理した。ピペッティングで組織を分散し、ＤＰＢＳで洗浄した後、増殖培地（ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ：１０％ 牛胎子血清、１０μｇ／ｍＬ インスリン、２５μＭ モノチオグリセロール、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５μｇ／ｍＬ ピマリシン（製品名：Ｆｕｎｇｉｎ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含む）に懸濁し、Ｔ７５フラスコに播種した。
なお、当初、豚（約１ヶ月齢）より採取した小腸を、前記同様に処理して、初代培養を試みた。しかしながら、前記のような抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）及び抗真菌薬（ピマリシン）を含む培地を用いても、培養を開始してから２～３日後には、激しい微生物のコンタミネーションが生じ、初代培養を行なうことができなかった。
一方、豚胎子より採取した小腸に関しては、そのようなコンタミネーションを抑制することができ、初代培養を行なうことが出来た。そして、約３週間後に接着し広がってきた初代培養細胞（図１Ａ）を、細胞分離／分散用溶液（製品名：Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で剥がして回収し、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播き直した。
約１週間で細胞シートが形成され、その上に弱く接着し増殖する球状の細胞が出現した（図１Ｂ）。免疫染色の結果、細胞シートはα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）陽性の筋繊維芽細胞様細胞で構成されており、その上にマクロファージマーカー（ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０４）陽性細胞が増殖する混合培養系が構築されていることが確認された。なお、上皮細胞マーカー（サイトケラチン１８及び１９（ＣＫ１８、ＣＫ１９））は陰性であった。（図２Ａ）。
また、培養上清から細胞を回収し、スミロン浮遊培養用シャーレに付着する細胞を分離して免疫染色した結果、マクロファージマーカー（Ｉｂａ１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０４）陽性細胞が単離されていることがわかった。なお、上皮細胞マーカー（ＣＫ１８、ＣＫ１９）は陰性であった（図２Ｂ）。さらに、回収した細胞では、初代培養マクロファージの特徴として知られる多核巨細胞の形成も確認された（図２Ｂ）。よって、この手法により豚小腸マクロファージ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ＰＩＭ）を得ることができた。なお、前記マーカーの検出は、下記免疫染色にて行った。
（免疫染色）
細胞を８ウエルチャンバースライドに播種し一定期間培養後、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（Ｎａｃａｌａｉ社製）に浸し固定した。ＰＢＳＴで洗浄後１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液で処理し、過酸化水素溶液（ＤＡＫＯ社製）及びブロッキング剤（製品名：ブロッキングワンヒスト、Ｎａｃａｌａｉ社製）でブロッキングしたのち、一次抗体［ａｎｔｉ－αＳＭＡ（Ｐｒｏｇｅｎ社製）、ａｎｔｉ－Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（Ｐｒｏｇｅｎ社製）、ａｎｔｉ－ＣＫ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ａｎｔｉ－ＣＫ１９（Ｐｒｏｇｅｎ社製）、ａｎｔｉ－ＣＤ１７２ａ（ＶＭＲＤ社製）、ａｎｔｉ－ＣＤ２０４（ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ，Ｉｎｃ．製）、Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ社製）、ａｎｔｉ－ＭＨＣ－ＩＩ（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ａｎｔｉ－ＣＤ１６３（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ａｎｔｉ－ＣＤ１６９（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ａｎｔｉ－ＣＤ２０３ａ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）］を１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、免疫組織染色用検出システム（製品名：ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）システム、ＤＡＫＯ社製）を用いてジアミノベンジジン染色した。さらに、マイヤーヘマトキシリン溶液（Ｗａｋｏ社製）で核を染色した。
＜豚胎子小腸マクロファージ不死化細胞の作製＞
単離したＰＩＭは増殖しない。そこで、増殖能を付与するためにＰＩＭの不死化を試みた。具体的には先ず、ＰＩＭをスミロン浮遊培養用シャーレに播種し、翌日に２種類の不死化遺伝子（ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）遺伝子と豚テロメラーゼ逆転写酵素（ｐＴＥＲＴ）遺伝子）を個別に導入した組換えレンチウイルス粒子を含む溶液に２時間暴露した。なお、組換えレンチウイルス粒子は、非特許文献１に記載のとおり、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子及びｐＴＥＲＴ遺伝子を各々コードするｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α ｎｅｏベクターを、パッケージングベクターと共に、レンチウイルスパッケージング用細胞株（製品名：Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）に導入することにより、調製した。そして、約１週間後に再度同じレンチウイルス粒子にＰＩＭを暴露し、培養を継続した。
その結果、約１ヶ月後に、継代培養可能な不死化ＰＩＭ（Ｉｍｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ＰＩＭ：ＩＰＩＭ）の獲得に成功し、凍結保存した（図３Ａ）。また、このＩＰＩＭ細胞についての増殖能を、下記に示す試験にて評価した結果、図３Ｂに示すとおり、少なくとも６０回以上分裂可能であることが明らかになった。
（細胞増殖試験）
ＩＰＩＭ細胞（１×１０６個）を９０ｍｍ浮遊培養用ディッシュ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に播種し、３～５日ごとにＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）ではがして継代培養した。細胞を回収した際に、ＴＣ１０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて細胞数を計測した。
さらに、ＰＩＭ同様に、上述の免疫染色によって解析した結果、ＩＰＩＭ細胞における各種マクロファージマーカーは陽性であった（図４）。具体的には、Ｍ１型及びＭ２型に共通するマクロファージマーカーである、Ｉｂａ１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０４、ＣＤ１６及びＣＤ２０３ａは、ほぼ１００％のＩＰＩＭ細胞にて陽性であった。また、特定のマクロファージ亜集団のマーカー（Ｍ２型マクロファージマーカー：ＣＤ１６３、Ｍ１型マクロファージマーカー：ＣＤ１６９）や抗原提示細胞マーカー（ＭＨＣ－ＩＩ）に関しては、個々の細胞の状態に応じて、ある程度の割合で陽性となるＩＰＩＭ細胞が認められた。
また、下記に示す方法にて、マクロファージとしての機能を評価した結果、ＩＰＩＭ細胞は、細菌由来成分（ムラミルジペプチド：ＭＤＰ、リポ多糖：ＬＰＳ）に応答して細胞内シグナル伝達分子を活性化（ｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化）し（図５Ａ）、さらに炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β）の産生を誘導することができた（図５Ｂ）。
（マクロファージ機能評価試験）
ＩＰＩＭ細胞を２４穴浮遊培養用プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に１穴あたり３×１０5個播種した。翌日、培地を、細菌由来成分（ＭＤＰ又はＬＰＳ）を図５Ａ及び５Ｂに示す各濃度にて含む無血清ＤＭＥＭ（４００μＬ）に置換し細胞を刺激した。さらに２４時間後、培養上清を回収するとともに、溶解緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤を含む５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ７．５）を用いて細胞の溶解液を調製した。培養上清（３００μＬ）はトリクロロ酢酸／アセトン沈殿法でタンパク質成分を濃縮した。培養上清及び細胞溶解液に含まれるタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（メルク社製）に電気的に転写した。転写されたＰＶＤＦ膜については、一次抗体［ａｎｔｉ－リン酸化ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ａｎｔｉ－ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ａｎｔｉ－ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）］を用いたウエスタンブロット法により目的タンパク質を検出した。
このように、ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子及びテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を導入し、不死化した豚胎子の小腸マクロファージ（ＩＰＩＭ細胞）は、高い増殖性を示す一方で、マーカータンパク質の発現のみならず、その機能も維持していることが明らかとなった。
＜アフリカ豚熱ウイルス感受性試験＞
次に、ＩＰＩＭ細胞のウイルス感受性を、アフリカ豚熱ウイルス（ＡＳＦＶ）を対象とし、以下に示す方法にて評価した。
（用いたＡＳＦＶ株について）
欧州・中国流行株Ａｒｍｅｎｉａ０７（遺伝子型：ＩＩ型）、軟ダニより分離された株Ｋｅｎｙａ０５／Ｔｋ－１（遺伝子型：Ｉ型）及びＡＳＦＶ標準株Ｅｓｐａｎａ７５（遺伝子型：Ｉ型）の３つのＡＳＦＶ野外発生分離株は、国際獣疫局（ＯＩＥ）のＡＳＦリファレンスラボラトリーであるＣｏｍｐｌｕｔｅｎｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎより導入した。各ウイルス株の発生年号及び発生地等の情報は、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｐｉｎｅｒｏ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１３）（Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄａｒｙ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．６０（２０１３）４８～５８）を参照のほど。Ｖｅｒｏ細胞馴化株 Ｌｉｓｂｏｎ６０／Ｖは、Ｐｌｕｍ Ｉｓｌａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＰＩＡＤＣ），Ａｍｅｒｉｃａより導入した。Ａｒｍｅｎｉａ０７、Ｋｅｎｙａ０５／Ｔｋ－１及びＥｓｐａｎａ７５株はＰＡＭ細胞を用い、Ｌｉｓｂｏｎ６０／Ｖ株はＶｅｒｏ細胞を用いて増殖培養し、これを接種ウイルス試料とした。接種ウイルス試料は分注し、－８０℃で保存した。
（用いた細胞について）
豚肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞は、既報（Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ ＡＬ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０１１年１２月、Ｃｈａｐｔｅｒ ２６、ＵＮＩＴ ２６．１４、１～２６ページ）に従い、豚の肺より回収した。アフリカミドリザルの腎臓由来不死化細胞株であるＶｅｒｏ（ＣＣＬ－８１）細胞、ＣＯＳ－１（ＣＲＬ－１６５０）細胞及び豚肺胞マクロファージ由来不死化細胞株３Ｄ４／２１（ＣＲＬ－２８４３）細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より導入した。イノシシの肺由来株化細胞 ＷＳＬ細胞は、フリードリヒ・レフラー研究所（ＦＬＩ、ドイツ）より譲り受けたものを用いた。
（ウイルス感受性試験）
細胞のウイルスに対する感受性は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を指標としたＣＰＥ試験又はＡＳＦＶ感染細胞で特異に認められる血球吸着（ＨＡＤ）反応を指標としたＨＡＤ試験により判断した。具体的には先ず、９６穴プレートに１穴あたり、ＰＡＭ細胞を１×１０５個になるよう、Ｖｅｒｏ細胞及びＣＯＳ－１細胞を各々１．５×１０４個になるよう、ＷＳＬ細胞及び３Ｄ４／２１細胞を２×１０４個になるよう、又は、ＩＰＩＭ細胞を３×１０４個になるよう播種した。そして、各々の培地中で１～２日間前培養した後、同培地で１０倍（１０－１）から１００億倍（１０－１０）まで１０倍段階希釈したウイルス液２５μＬをそれぞれ８穴ずつ接種し、ＣＰＥ検出用プレートを調製した。さらに、当該プレートに、ＰＢＳに懸濁した０．７５％豚赤血球懸濁液２０μＬを添加し、ＨＡＤ検出用プレートとして調製した。そして、ＣＰＥ検出用プレート、ＨＡＤ検出用プレート共に３７℃、５％ＣＯ２環境下で７日間培養し、観察した。
その結果、表１に示すとおり、ＰＡＭ細胞及びＩＰＩＭ細胞においては、接種した全てのウイルス株でＣＰＥが検出された。一方、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＷＳＬ細胞及び３Ｄ４／２１細胞では、野外株３株にＣＰＥは認められず、細胞馴化株のＬｉｓｂｏｎ６０／Ｖのみに認められた（表１）。このように、ＩＰＩＭ細胞は、ＰＡＭ細胞と同様にＣＰＥ試験（図６Ａ）だけではなく、ＨＡＤ試験（図６Ｂ）にも利用できることが明らかになった。
次に、ＰＡＭ細胞とＩＰＩＭ細胞の両細胞についてウイルスが分離できる希釈限界（ウイルス検出限界）を評価した。その結果、表２に示すとおり、ＣＰＥ試験では、ＰＡＭ細胞に比べＩＰＩＭ細胞の検出限界濃度は１００～１００００倍低かった。ＨＡＤ試験でも、ＰＡＭ細胞に比べＩＰＩＭ細胞の検出限界濃度は１０～１００倍低かった（表３）。すなわち、ＩＰＩＭ細胞は、ＡＳＦＶに対する感受性が、ＰＡＭ細胞に比べ高いことが明らかになった。
＜豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス又は豚サーコウイルスについての感受性試験＞
次に、ＩＰＩＭ細胞のウイルス感受性を、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）又は豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）を対象とし、以下に示す方法にて評価した。
（用いたウイルス株について）
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は国内分離株であるＥＤＲＤ－１株を用い、豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は国内分離株であるＹａｍａｇａｔａ株を用いた。
（ＰＲＲＳＶ感受性試験）
ＩＰＩＭ細胞を９６穴浮遊培養用プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に１穴あたり１×１０５個／０．１ｍＬ培地で播種した。３日後、細胞培養液を吸引除去した後、ウイルス保存原液を１０倍から１０，０００倍まで１０倍階段希釈したウイルス液を１穴あたり０．１ｍＬ接種し、間接蛍光抗体法によるウイルス抗原検出用プレートを作製した。ウイルス接種後３日目に細胞培養液を吸引除去した後、氷冷８０％アセトンで細胞を固定し、抗ＰＲＲＳウイルスモノクローナル抗体（クローン：ＳＲ３０－Ａ）を用いた間接蛍光抗体法によりＰＲＲＳウイルス抗原の検出を行った。得られた結果を図７の上部に示す。
また、ウイルス増殖を観察するため、ＩＰＩＭ細胞を６穴浮遊培養用プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に１穴あたり３×１０６個／３ｍＬ培地で播種した。３日後、細胞培養液を吸引除去した後、保存原液を１００倍希釈したウイルス液を１穴あたり０．５ｍＬ接種しウイルスを細胞に１時間吸着させた。１時間後にウイルスを含む培地を除去し、１穴あたり２ｍＬの培地で細胞を洗浄後、５ｍＬの新しい培地を添加し５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。接種後１、２、３、５、７日目にＣＰＥを観察するとともに培養上清を０．５ｍＬ回収した。回収した培養上清は１０倍から１０，０００，０００倍まで１０倍階段希釈した後、１穴あたり１×１０５個／０．１ｍＬ培地で播種して３日間培養したＩＰＩＭ細胞に１穴あたり０．１ｍＬ（１希釈当たり４穴ずつ）接種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で７日間培養してＣＰＥを観察した。接種７日目の観察結果を図７の下部に示す。さらに、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）はＢｅｈｒｅｎｓ－Ｋａｒｂｅｒ法に基づき計算した。得られた結果を図８に示す。
（ＰＣＶ２感受性試験）
ＩＰＩＭ細胞を１穴あたり２×１０５個／１８０μＬ培地で懸濁したのち２０μＬのウイルス保存原液と混和し、１穴あたり２００μＬの細胞・ウイルス混和液を４８穴浮遊培養用プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）に播種した。播種後２時間目にウイルスを含む培地を除去し、１穴あたり０．５ｍＬの培地で細胞を洗浄後、２００μＬの新しい培地を添加し５％炭酸ガス存在下３７℃で培養した。培地添加直後の培養上清と細胞をまとめて回収し、接種後２時間目のサンプルとした。その後、２日目、４日目及び６日目にも培養上清と細胞をまとめて回収した。回収したサンプルから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＤＮＡを最終５０μＬ溶液として抽出し、その内２μＬ分のＤＮＡを用いて、ＰＣＶ２カプシド遺伝子を標的とした定量的ＰＣＲを実施した。得られた結果は、ウイルス接種後２時間目のウイルス遺伝子量を１とした相対値にて、図９に示す。
ＩＰＩＭ細胞のＰＲＲＳＶ感受性に関しては、図７に示すとおり、ＰＲＲＳＶはＩＰＩＭ細胞に感受性を示し、接種後３日目にはウイルス抗原が細胞質内で検出可能となり、接種後７日目には明確なＣＰＥが観察された。さらに、図８に示すとおり、ＰＲＲＳＶ接種ＩＰＩＭ細胞培養上清中のウイルス感染価は接種後２～３日でピークに達し、約１０万倍近く増加した。感染価は接種後７日目まで大幅に低下することなく維持される傾向が認められた。
また、ＩＰＩＭ細胞のＰＣＶ２感受性に関しては、図９に示すとおり、ウイルス接種後のＩＰＩＭ細胞の倍加に伴い、ＰＣＶ２遺伝子量も倍加する傾向が認められた。
これらのことから、ＩＰＩＭ細胞は、ＰＲＲＳＶとＰＣＶ２の野外株に対しても感受性を有することが確認された。
以上説明したように、本発明によれば、豚小腸マクロファージの不死化細胞を提供することが可能となる。また、当該不死化細胞は、豚感染ウイルスに対して高い感染感受性を有するため、様々な豚感染ウイルス株を増殖させることが可能となり、当該ウイルスに対するワクチンの製造、開発が可能となる。また、感染感受性の高さから、豚感染ウイルスを検出（検査、診断）することも可能となる。

Claims (6)

  1. 豚胎子の小腸マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素を発現させる工程を含む、不死化豚小腸マクロファージの製造方法。
  2. 前記工程は、前記ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを、前記豚胎子の小腸マクロファージに導入し、当該ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素を発現させる工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記豚胎子は胎齢３０～１１４日の豚胎子である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法により、不死化豚小腸マクロファージを製造する工程、及び
    当該不死化豚小腸マクロファージと、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚小腸マクロファージにおいて増殖する工程
    を含む、豚感染ウイルスの製造方法。
  5. 請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法により、不死化豚小腸マクロファージを製造する工程、
    当該不死化豚小腸マクロファージと、豚感染ウイルスとを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚小腸マクロファージにおいて増殖する工程、
    増殖した豚感染ウイルスを単離する工程、及び
    単離した豚感染ウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
    を含む、豚感染ウイルスを含むワクチンの製造方法。
  6. 前記豚感染ウイルスが、アフリカ豚熱ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚ロタウイルス、豚サーコウイルス、及び豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスからなる群から選択される少なくとも１のウイルスである、請求項４又は５に記載の製造方法。
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