JP7207658B2 - 白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体およびその製造方法に関する。
白金は、化学的に安定な性質を有し、化学反応を促進する触媒性能に優れるため、金属空気電池や燃料電池の電極、自動車等の排ガス処理など、様々な用途に利用されている。
例えば、金属空気電池や燃料電池の電極（カソード電極）における酸素還元反応（oxygen reduction reaction：ＯＲＲ）を促進する触媒として、従来、カーボンナノチューブやカーボンブラック等の炭素材料の担体に白金粒子を担持させた複合体（以下、Ｐｔ／Ｃ複合体またはＰｔ／Ｃ触媒ともいう。）が使用されている。しかしながら、白金が有する触媒活性をより効果的に引き出すことが求められており、また、発電装置全体のコストを削減することに対する要請もある。
Zhou, B. et al., Platinum Nanostructures via Self-Assembly of an Amyloid-like Peptide: A Novel Electrocatalyst for the Oxygen Reduction, Nanoscale 2013, 5 (7), 2669-2673.
本発明は、上記の事情に鑑み、Ｐｔ／Ｃ複合体を上回る酸素還元触媒性能を有する材料を提供することを目的とする。
本発明者等は、白金粒子を担持させる担体として、ペプチドを用いることを着想した。ペプチドは、アミノ酸配列を設計して人工的に合成することができ、自己組織化によってナノスケールの構造体を形成させることができるという特徴がある。また、官能基の種類・配置等を選択したり、任意の官能基を導入した人工のアミノ酸を用いたりすることも可能である。一方、ペプチドは導電性に乏しいため、従来、金属粒子の担体としては不向きであると考えられていた。
非特許文献１では、表面が正に帯電するように設計されたペプチド線維（peptide fibril）を担体として用い、その表面に、負に帯電した白金ナノ粒子を担持させる、静電的相互作用を利用した触媒の作製方法が提案されている。非特許文献１に記載の作製方法によれば、白金ナノ粒子がペプチド線維の壁部（wall）や端部（end）に結合し、ペプチド線維の表面に多くの白金ナノ粒子が分散した構造体が得られるとされている。しかしながら、実際に非特許文献１で得られた複合体の、触媒としての質量活性は１６．３８μＡ／μｇであり、実用に耐えるものとは言い難い。
これに対して、本発明者等は、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子（Platinum nanoparticle：ＰｔＮＰ）の分散形態について鋭意検討した結果、白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）と、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、およびペプチド鎖を構成するアミノ酸の側鎖のアミノ基の窒素原子（Ｎ）とを結合させ（Ｐｔ－Ｎ結合）、さらにこのＰｔ－Ｎ結合の量を制御することが、白金の酸素還元触媒性能を最大限引き出すことに有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］βシート構造を有するペプチド担体と白金ナノ粒子を含み、前記ペプチド担体に前記白金ナノ粒子が担持されており、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が４０％以上である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体。
［２］前記ピーク総面積値に対する前記白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が、白金を伴わないアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合よりも大きい、［１］に記載の複合体。
［３］金属二次電池または燃料電池の電極用触媒である、［１］または［２］に記載の複合体。
［４］前記電極用触媒は、カソード電極用触媒である、［３］に記載の複合体。
［１］βシート構造を有するペプチド担体と白金ナノ粒子を含み、前記ペプチド担体に前記白金ナノ粒子が担持されており、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が４０％以上である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体。
［２］前記ピーク総面積値に対する前記白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が、白金を伴わないアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合よりも大きい、［１］に記載の複合体。
［３］金属二次電池または燃料電池の電極用触媒である、［１］または［２］に記載の複合体。
［４］前記電極用触媒は、カソード電極用触媒である、［３］に記載の複合体。
［５］白金ナノ粒子からなる分散液を提供するステップと、前記分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理するステップと、を包含し、前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、９％以上１４％以下である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法。
［６］前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、１０．５％以上１３％以下である、［５］に記載の複合体の製造方法。
［７］フーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルから求められる前記ペプチド担体のβシート構造の割合が７０％以上である、［５］または［６］に記載の複合体の製造方法。
［８］金属二次電池または燃料電池の電極用触媒の製造方法である、［５］～［７］のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
［９］前記電極用触媒の製造方法は、カソード電極用触媒の製造方法である、［８］に記載の複合体の製造方法。
［６］前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、１０．５％以上１３％以下である、［５］に記載の複合体の製造方法。
［７］フーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルから求められる前記ペプチド担体のβシート構造の割合が７０％以上である、［５］または［６］に記載の複合体の製造方法。
［８］金属二次電池または燃料電池の電極用触媒の製造方法である、［５］～［７］のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
［９］前記電極用触媒の製造方法は、カソード電極用触媒の製造方法である、［８］に記載の複合体の製造方法。
本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体は、βシート構造を有するペプチド担体の、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、およびペプチド鎖を構成するアミノ酸の側鎖のアミノ基の窒素原子に対して白金が結合したＰｔ－Ｎ結合が形成されており、このＰｔ－Ｎ結合の量が制御された状態で、白金ナノ粒子がペプチド担体に分散担持されているので、従来のＰｔ／Ｃ複合体を上回る酸素還元触媒性能を発揮する。このような複合体は、金属二次電池や燃料電池の電極（カソード電極）における酸素還元反応（ＯＲＲ）を促進する触媒として、好適に使用することができる。
本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法は、白金ナノ粒子からなる分散液を提供するステップと、前記分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理するステップと、を包含し、前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、９％以上１４％以下である。白金ナノ粒子の分散液に含まれる白金ナノ粒子は、その表面に界面活性剤等の保護剤（コーティング剤）を有さないので、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を従来技術より劇的に小さくすることができ、これにより、ペプチド担体に白金ナノ粒子が効果的に分散担持された複合体を得ることができる。また、このようにして製造された白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体は、Ｐｔ－Ｎ結合を形成した白金ナノ粒子の表面に対して酸素分子（Ｏ２）が直接作用することができるので、白金の酸素還元触媒性能がより効率的に引き出される。
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。
〔白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体〕
本発明の一実施形態に係る白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（以下、単に「本実施形態の複合体」ともいう。）は、βシート構造を有するペプチド担体と白金ナノ粒子を含み、前記ペプチド担体に前記白金ナノ粒子が担持されており、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が４０％以上である。
本発明の一実施形態に係る白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（以下、単に「本実施形態の複合体」ともいう。）は、βシート構造を有するペプチド担体と白金ナノ粒子を含み、前記ペプチド担体に前記白金ナノ粒子が担持されており、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が４０％以上である。
本実施形態の複合体において、ＸＰＳ測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が上記所定の条件を満たすことは、βシート構造を有するペプチド担体の、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、およびペプチド鎖を構成するアミノ酸の側鎖のアミノ基の窒素原子（Ｎ）に対して白金（Ｐｔ）が結合したＰｔ－Ｎ結合が形成されており、このＰｔ－Ｎ結合の量が制御された状態で、白金ナノ粒子がペプチド担体に分散担持されていることを意味する。
より具体的には、本実施形態の複合体では、白金と窒素原子との間でＰｔ－Ｎ結合が形成されていることにより、白金と結合した窒素原子の電子状態、ならびに、ペプチド担体のβシート構造において当該窒素原子に近接するペプチド鎖のアミド基および／またはアミノ基の窒素原子の電子状態が、白金が担持されていないときのそれとは変化している。
本実施形態の複合体のＸＰＳ測定で得られるＮ １ｓスペクトルの波形を解析すると、以下の４種類のピークが得られる。
Ｎ１：アミドおよびアミンに由来するピーク
Ｎ２：プロトン化したアミンに由来するピーク
Ｎ３：白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク
Ｎ４：白金と結合し、かつプロトン化したアミンに由来するピーク
Ｎ１：アミドおよびアミンに由来するピーク
Ｎ２：プロトン化したアミンに由来するピーク
Ｎ３：白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク
Ｎ４：白金と結合し、かつプロトン化したアミンに由来するピーク
これらのうち、Ｎ１ピークおよびＮ２ピークは、白金ナノ粒子が担持されていないペプチド担体のＸＰＳ測定で得られるＮ １ｓスペクトルにおいて確認されるピークである。すなわち、Ｎ１ピークにおけるアミンは、白金を伴わない（白金と結合していない）アミンである。
Ｎ３ピークおよびＮ４ピークは、それぞれ、白金ナノ粒子がペプチド担体に分散担持される際に形成された白金と窒素原子との結合（Ｐｔ－Ｎ結合）に伴って生じるケミカルシフトにより、本実施形態の複合体において見られる特徴的なピークである。
Ｎ３ピークおよびＮ４ピークは、それぞれ、白金ナノ粒子がペプチド担体に分散担持される際に形成された白金と窒素原子との結合（Ｐｔ－Ｎ結合）に伴って生じるケミカルシフトにより、本実施形態の複合体において見られる特徴的なピークである。
本実施形態の複合体は、これらのＮ１～Ｎ４のピーク総面積値に対する、Ｎ３のピーク面積値の割合が、上記所定の条件を満たす。これにより、本実施形態の複合体は、ペプチド担体に白金ナノ粒子が効果的に分散担持された複合体であり、従来のＰｔ／Ｃ複合体を上回る酸素還元触媒性能を発揮する。
これに対して、非特許文献１によれば、非特許文献１に記載の、白金ナノ粒子とペプチド線維との複合体では、ＸＰＳ測定で得られるＮ １ｓスペクトルの波形を解析すると、アミノ基に由来するピーク、および、ペプチド線維中のアミド基に由来するピークの２種類のピークが得られるとされている（非特許文献１の図２（Ｂ）参照）。従って、本実施形態の複合体は、ペプチドを担体として用いて白金ナノ粒子を担持させた従来の材料とは構造的特徴が異なるものである。
本発明の好ましい実施形態では、上記Ｎ１～Ｎ４のピーク総面積値に対するＮ３のピーク面積値の割合が、Ｎ１のピーク面積値の割合よりも大きい。
Ｎ３のピーク面積値の割合が、Ｎ１のピーク面積値の割合よりも大きいことは、白金ナノ粒子が担持される前のペプチド担体の、ペプチド鎖のアミノ基の窒素原子のうち、５０％を超える窒素原子に対して白金が結合し、Ｐｔ－Ｎ結合が形成されていること、ならびに／あるいは、白金と窒素原子との間でＰｔ－Ｎ結合が形成されることにより、白金と結合した窒素原子の電子状態、および、ペプチド担体のβシート構造において当該窒素原子に近接するペプチド鎖のアミド基および／またはアミノ基の窒素原子のうち、５０％を超える窒素原子の電子状態が、白金が担持されていないときのそれとは変化していることを意味する。
従って、上記所定の条件を満たす本実施形態の複合体は、ペプチド担体に白金ナノ粒子がより効果的に分散担持された複合体であり、従来のＰｔ／Ｃ複合体をより上回る酸素還元触媒性能を発揮する。
本実施形態の複合体において、上記のＮ１～Ｎ４のピーク総面積値に対する、Ｎ３のピーク面積値の割合の上限値は、特に制限されないが、後述する実施例の結果に基づけば、５０％以下の値であっても、従来のＰｔ／Ｃ複合体を上回る酸素還元触媒性能を発揮し得る。
また、後述する本実施形態の複合体の製造方法に関し、使用するペプチド担体のアミノ酸配列や官能基の種類・配置等を考慮して、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を適切に調節することによって、Ｎ３のピーク面積値の割合が５０％を上回る複合体が得られ得る。この場合において、Ｎ３のピーク面積値の割合が７０％以下であれば、Ｐｔ－Ｎ結合を形成したＰｔの表面に、酸素分子（Ｏ２）が直接的かつ効果的に作用することができると推測される。
また、後述する本実施形態の複合体の製造方法に関し、使用するペプチド担体のアミノ酸配列や官能基の種類・配置等を考慮して、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を適切に調節することによって、Ｎ３のピーク面積値の割合が５０％を上回る複合体が得られ得る。この場合において、Ｎ３のピーク面積値の割合が７０％以下であれば、Ｐｔ－Ｎ結合を形成したＰｔの表面に、酸素分子（Ｏ２）が直接的かつ効果的に作用することができると推測される。
なお、本実施形態の複合体のＸＰＳ測定で使用する機器や測定手法は、特に限定されず、後述する実施例に記載のものをはじめ、当該分野で通常用いられるものを適用することができる。
次に、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法を説明する。
〔白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法〕
図１は、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法を示すフローチャートである。
図１は、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法を示すフローチャートである。
本発明の一実施形態に係る白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法（以下、単に「本実施形態の複合体の製造方法」ともいう。）は、
白金ナノ粒子からなる分散液を提供するステップ（Ｓ１１０）と、
前記分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理するステップ（Ｓ１２０）と、
を包含し、
前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、９％以上１４％以下である。
白金ナノ粒子からなる分散液を提供するステップ（Ｓ１１０）と、
前記分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理するステップ（Ｓ１２０）と、
を包含し、
前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、９％以上１４％以下である。
ステップＳ１１０：白金ナノ粒子からなる分散液を提供する。
従来、白金ナノ粒子を溶媒中に分散、懸濁させる場合、クエン酸、アスコルビン酸、ポリアクリル酸ナトリウム等の重合体で粒子表面をコーティングすることで凝集を抑制し、白金ナノ粒子を分散安定化することが必要であった。実際に、非特許文献１に記載の触媒の作製方法では、白金ナノ粒子として、クエン酸によって安定化されたものが使用されている。
これに対して、本実施形態の複合体の製造方法では、白金ナノ粒子の分散液に含まれる白金ナノ粒子は、その表面に界面活性剤等の保護剤（コーティング剤）を有さない。このような白金ナノ粒子からなる分散液の調製方法としては、例えば、パルスレーザーアブレーション法が挙げられるが、これに限定されない。
これに対して、本実施形態の複合体の製造方法では、白金ナノ粒子の分散液に含まれる白金ナノ粒子は、その表面に界面活性剤等の保護剤（コーティング剤）を有さない。このような白金ナノ粒子からなる分散液の調製方法としては、例えば、パルスレーザーアブレーション法が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において、白金ナノ粒子からなる分散液とは、溶媒中に、白金ナノ粒子の表面を保護もしくはコーティングする目的で添加された物質を含まないことを意味し、白金ナノ粒子を作製する過程で不可避的に白金ナノ粒子の表面に付着し得る物質、および／または、溶媒中に白金ナノ粒子が分散した分散液を調製する過程で不可避的に混入し得る物質が含まれていてもよい。
分散液の溶媒は、特に限定されないが、例えば、純水等のプロトン性の極性溶媒、および、アセトン等の非プロトン性の極性溶媒を挙げることができる。
分散液中の白金ナノ粒子の濃度は、特に限定されない。本実施形態の複合体の製造方法では、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が上記所定の範囲であるので、例えば金属二次電池や燃料電池の電極（カソード電極）用の触媒として利用する際の白金の使用量を低減することができ、製造コストの面で有利である。
一方、非特許文献１には、ペプチド線維と白金ナノ粒子の割合を１：２．５（ｗ／ｗ）とする作製方法が記載されており、担体に対する白金の使用量が多いことが懸念される。また、後述するように、触媒性能の面でも、本発明の複合体よりも劣る。
一方、非特許文献１には、ペプチド線維と白金ナノ粒子の割合を１：２．５（ｗ／ｗ）とする作製方法が記載されており、担体に対する白金の使用量が多いことが懸念される。また、後述するように、触媒性能の面でも、本発明の複合体よりも劣る。
ステップＳ１２０：白金ナノ粒子からなる分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理する。
担体として使用するペプチドは、上記所定の条件を満たすものであれば特に制限されないが、ペプチドの二次構造解析において、βシート構造の割合が７０％以上であることが好ましい。ペプチド担体のβシート構造の割合が７０％以上であると、白金ナノ粒子が効果的に分散担持されやすく、複合体がより優れた酸素還元触媒性能を発揮する。
ペプチド担体のβシート構造の割合は、フーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルから、βシート、αヘリックス、およびランダムコイルに由来するピーク面積比を算出することによって求めることができる。
ステップＳ１２０において、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比は、９％以上１４％以下である。これにより、Ｐｔ－Ｎ結合量が４０％以上である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体を作製することができる。
好ましい実施形態では、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比は、１０．５％以上１３％以下である。これにより、白金ナノ粒子が担持される前のペプチド担体の、ペプチド鎖を構成するアミノ酸の側鎖のアミノ基の窒素原子のうち、５０％を超える窒素原子に対して白金が結合してＰｔ－Ｎ結合が形成された、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体を作製することができる。
ペプチド担体のアミノ酸配列は、主として、自己組織化によってβシート構造が形成されやすいことを考慮して設計される。また、白金ナノ粒子を担持させた際にＰｔ－Ｎ結合を形成させる観点から、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも１つ以上含めることとする。
ペプチド鎖を構成するアミノ酸は、ヒトのタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸であってもよく、任意の官能基が修飾された人工の（非天然の）アミノ酸が含まれていてもよい。
例えば、「ＫＬＶＦＦ」のアミノ酸配列は、アミロイドβペプチドのコア配列であることが知られており、また、リシン（Ｋ）はアミノ基を側鎖に有することから、本実施形態の複合体の製造方法に用いるペプチド担体のアミノ酸配列（の一部）として好適である。
ペプチド担体のペプチド鎖の長さ（ペプチド鎖を構成するアミノ酸の数）は、特に制限されないが、βシート構造を効率的に形成させる観点から、ペンタペプチド、またはそれ以上（例えば、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド等）であることが好ましい。
なお、後述する実施例で用いたペプチド担体は、ヘプタペプチドであり、上記の「ＫＬＶＦＦ」のＮ末端側に、疎水性のアラニン（Ａ）を２つ配置することによって、βシート構造の形成能を高めたものである。
なお、後述する実施例で用いたペプチド担体は、ヘプタペプチドであり、上記の「ＫＬＶＦＦ」のＮ末端側に、疎水性のアラニン（Ａ）を２つ配置することによって、βシート構造の形成能を高めたものである。
このようにして作製される本実施形態の複合体は、例えば、金属二次電池または燃料電池の電極用触媒として適しており、特に、カソード電極用触媒として好適である。
本明細書において、金属二次電池とは、負極活物質に金属、正極活物質に酸素や二酸化炭素などの外部ガスを用いるものをいう。負極活物質の金属としては、例えば、リチウム、亜鉛、ナトリウム、アルミニウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、カリウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。金属二次電池の具体例としては、例えば、リチウム空気電池、亜鉛－空気電池、ナトリウム－空気電池、アルミニウム－空気電池、マグネシウム－空気電池、カルシウム－空気電池、鉄－空気電池、カリウム－空気電池、リチウム－二酸化炭素電池などが挙げられるがこれらに限定されない。正極活物質の酸素としては、純酸素、大気酸素、あるいは任意の酸素分圧のガスを含むものを用いることができる。
次に具体的な実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明がこれら実施例に限定されないことに留意されたい。
本実施例では、特に明記しない限り、使用した試薬、溶媒等は、各供給元から提供されたものをそのまま使用した。
［ペプチド担体の合成］
Ｎ末端からＣ末端の順に「ＡＡＫＬＶＦＦ」のアミノ酸配列を有するヘプタペプチド（ＮＨ２－ＡＡＫＬＶＦＦ－ＣＯＯＨ）を、保護基としてＦｍｏｃ基を用いる固相合成法により合成した。合成手順は、Krysmannらによって報告された、ペプチド（ＮＨ２－ＫＬＶＦＦ－ＣＯＯＨ）の合成手順（Krysmann, M. J. et al., Self-Assembly and Hydrogelation of an Amyloid Peptide Fragment. Biochemistry 2008, 47 (16), 4597-4605.）と同様とした。
Ｎ末端からＣ末端の順に「ＡＡＫＬＶＦＦ」のアミノ酸配列を有するヘプタペプチド（ＮＨ２－ＡＡＫＬＶＦＦ－ＣＯＯＨ）を、保護基としてＦｍｏｃ基を用いる固相合成法により合成した。合成手順は、Krysmannらによって報告された、ペプチド（ＮＨ２－ＫＬＶＦＦ－ＣＯＯＨ）の合成手順（Krysmann, M. J. et al., Self-Assembly and Hydrogelation of an Amyloid Peptide Fragment. Biochemistry 2008, 47 (16), 4597-4605.）と同様とした。
生成物を、１Ｈ ＮＭＲ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法、逆相ＨＰＬＣ分析法により分析し、目的のペプチドが得られたことを確認した。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＡＬ３００ ＮＭＲ分光計（プロトン共鳴周波数：３００ＭＨｚ）を用いて取得した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ ＡＸＩＭＡ（登録商標）－ＣＦＲ－ｐｌｕｓを用い、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＣＡ）を用いた。
逆相ＨＰＬＣ分析は、ＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓを用い、以下の装置構成および条件とした。
・ＵＶ－ＶＩＳ可変波長検出器：ＵＶ－２０７０ Ｐｌｕｓ
・逆相カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）－ＩＩ ５Ｃ１８ ＡＲ（２５０×４．６ｍｍ）
・溶離液：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ混合溶媒（６３／３５ ｖ／ｖ）、ＣＦ３ＣＯ２Ｈを０．０５％添加
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
なお、ＨＰＬＣ分析に供したサンプルは、９５％を超える純度であることが確認された。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＡＬ３００ ＮＭＲ分光計（プロトン共鳴周波数：３００ＭＨｚ）を用いて取得した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ ＡＸＩＭＡ（登録商標）－ＣＦＲ－ｐｌｕｓを用い、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸（ＣＣＡ）を用いた。
逆相ＨＰＬＣ分析は、ＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓを用い、以下の装置構成および条件とした。
・ＵＶ－ＶＩＳ可変波長検出器：ＵＶ－２０７０ Ｐｌｕｓ
・逆相カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）－ＩＩ ５Ｃ１８ ＡＲ（２５０×４．６ｍｍ）
・溶離液：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ混合溶媒（６３／３５ ｖ／ｖ）、ＣＦ３ＣＯ２Ｈを０．０５％添加
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
なお、ＨＰＬＣ分析に供したサンプルは、９５％を超える純度であることが確認された。
図２（ａ）に、ヘプタペプチドの分子構造を示す。なお、ペプチド鎖のＮ末端のアラニン（Ａ）のアミノ基、およびリシン（Ｋ）の側鎖のアミノ基は、中性の水溶液中では正に帯電する。
次に、得られたペプチド（ＮＨ２－ＡＡＫＬＶＦＦ－ＣＯＯＨ）を、以下の手順で自己組織化させた。
１００ｍｇのペプチドを、１０ｍＬの脱イオン水に溶解させた。２５℃で５日間静置すると、溶液は、透明な上澄層と白色の沈降層の２層を形成した。上澄層を別のバイアルに移し、２５℃でさらに５日間静置した。得られた白色の沈降層（懸濁液）をエバポレーターで乾燥させて、白色粉末を得た。
１００ｍｇのペプチドを、１０ｍＬの脱イオン水に溶解させた。２５℃で５日間静置すると、溶液は、透明な上澄層と白色の沈降層の２層を形成した。上澄層を別のバイアルに移し、２５℃でさらに５日間静置した。得られた白色の沈降層（懸濁液）をエバポレーターで乾燥させて、白色粉末を得た。
得られた白色粉末を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した（日立ハイテクノロジーズ Ｈ７６５０、加速電圧：８０ｋＶ）。その結果、ペプチドは、幅が数十ｎｍ～数百ｎｍ、長さが数μｍの、シート状の形態を有していた（図３（ａ）、図中のスケールバーは２００ｎｍである。）。
また、自己組織化させる前と後のサンプルについて、フーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）分析を行った（ＪＡＳＣＯ ＦＴ／ＩＲ－４２００、ＡＴＲ測定用アタッチメント：ＰＲ０４５０－Ｓ）。その結果、ＦＴ－ＩＲスペクトルにおける、１，６３５ｃｍ－１（βシート）、１，６５３ｃｍ－１（αヘリックス）、１，６７１ｃｍ－１（ランダムコイル）のピーク面積の割合から、上記の自己組織化処理により、ペプチド中のβシートの割合が２８％から７７％に増加したことが確認された。
また、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルでは、アミドおよびアミンに由来するピーク（３９９．８ｅＶ）、および、プロトン化したアミンに由来するピーク（４０１．５ｅＶ）が確認された（図５（ａ））。
Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析には、ＪＥＯＬ ＪＰＳ－９０１０ＴＲ（Ｎａｎｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、モノクロＸ線源（Ａｌ Ｋα：ｈｖ＝１４８６．６ｅＶ）にて、ベース圧力は１０－９Ｔｏｒｒとした。
Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析には、ＪＥＯＬ ＪＰＳ－９０１０ＴＲ（Ｎａｎｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、モノクロＸ線源（Ａｌ Ｋα：ｈｖ＝１４８６．６ｅＶ）にて、ベース圧力は１０－９Ｔｏｒｒとした。
図２（ｂ）は、上記の自己組織化処理後の、ペプチド担体のβシート構造を示す模式図である。なお、以下では、自己組織化処理後のペプチド担体を、「βＰ」と称する場合がある。
図２（ｂ）に示すβＰ（２００）において、符号２１０で示す帯状の図形はペプチド鎖を示し、矢印の方向は、Ｎ末端からＣ末端の方向を示す。各ペプチド鎖のＮ末端から延びる線の先端の球状の図形（２２０）、および、Ｎ末端から一定の間隔をおいた位置から延びる線の先端の球状の図形（２３０）は、アミノ基を示す。
図２（ｂ）に示すように、本実施例で作製したβＰのβシートは、隣り合うペプチド鎖の向きが反対の逆平行型の構造であると考えられる。
図２（ｂ）に示すβＰ（２００）において、符号２１０で示す帯状の図形はペプチド鎖を示し、矢印の方向は、Ｎ末端からＣ末端の方向を示す。各ペプチド鎖のＮ末端から延びる線の先端の球状の図形（２２０）、および、Ｎ末端から一定の間隔をおいた位置から延びる線の先端の球状の図形（２３０）は、アミノ基を示す。
図２（ｂ）に示すように、本実施例で作製したβＰのβシートは、隣り合うペプチド鎖の向きが反対の逆平行型の構造であると考えられる。
［白金ナノ粒子の作製］
アルミニウム製のフロースルーチャンバーにセットした、超純水（２５℃での抵抗値１８．２ＭΩｃｍ）中のＰｔターゲット（９９．９５％、ＡＧＯＳＩ）に対してパルスレーザーを照射するパルスレーザーアブレーション法により、白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）を作製した。
レーザー源としては、Ｎｄ：ＹＡＧナノ秒レーザー（Ｒｏｆｉｎ－Ｓｉｎａｒ ＲＳ－Ｍａｒｋｅｒ １００Ｄ、パルス間隔４０ｎｓ）を用い、照射条件は、基本波：１０６４ｎｍ、繰返し周波数：５ｋＨｚ、パルスエネルギー：６．４ｍＪとした。
レーザー源から照射されるレーザービームを、Ｆシータレンズ（焦点距離６３ｍｍ）で集光し、スキャンシステム（Ｓｃａｎｌａｂ）を用いてＰｔターゲットに対してらせん状に当たるように調節した。
アルミニウム製のフロースルーチャンバーにセットした、超純水（２５℃での抵抗値１８．２ＭΩｃｍ）中のＰｔターゲット（９９．９５％、ＡＧＯＳＩ）に対してパルスレーザーを照射するパルスレーザーアブレーション法により、白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）を作製した。
レーザー源としては、Ｎｄ：ＹＡＧナノ秒レーザー（Ｒｏｆｉｎ－Ｓｉｎａｒ ＲＳ－Ｍａｒｋｅｒ １００Ｄ、パルス間隔４０ｎｓ）を用い、照射条件は、基本波：１０６４ｎｍ、繰返し周波数：５ｋＨｚ、パルスエネルギー：６．４ｍＪとした。
レーザー源から照射されるレーザービームを、Ｆシータレンズ（焦点距離６３ｍｍ）で集光し、スキャンシステム（Ｓｃａｎｌａｂ）を用いてＰｔターゲットに対してらせん状に当たるように調節した。
マイクロ天秤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍ２３５Ｓ）を用いてアブレーション前後のターゲットの質量を測定した結果、得られたコロイド溶液中の白金ナノ粒子の濃度は、１１０μｇ／ｍＬであった。
また、ディスク遠心式粒子径分布測定装置（ＣＰＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＣ ２４０００、ショ糖溶液による密度勾配形成、標準物質：ポリ塩化ビニル（直径０．２３７μｍ）、回転速度：２４，０００ｒｐｍ）による粒径分布測定（Analytical Disc Centrifugation：ＡＤＣ）の結果、得られた白金ナノ粒子の平均粒径は６ｎｍであった。
［白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の作製］
以下の手順に従って、白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）の分散液の量（濃度）を一定にし、添加するペプチド担体（βＰ）の粉末の量を変化させることにより、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を５％、７．５％、１０％、１２．５％、および１５％とした５種類の複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）を作製した。
以下の手順に従って、白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）の分散液の量（濃度）を一定にし、添加するペプチド担体（βＰ）の粉末の量を変化させることにより、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を５％、７．５％、１０％、１２．５％、および１５％とした５種類の複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）を作製した。
＜例１＞
１．０ｍＬのＰｔＮＰの水分散液（１１０μｇ／ｍＬ）に、自己組織化させたペプチド担体（ＡＡＫＬＶＦＦ）を２．０ｍｇ添加し、数分間超音波分散させることによって、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ５／βＰ」とも称する。）を作製した。
１．０ｍＬのＰｔＮＰの水分散液（１１０μｇ／ｍＬ）に、自己組織化させたペプチド担体（ＡＡＫＬＶＦＦ）を２．０ｍｇ添加し、数分間超音波分散させることによって、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ５／βＰ」とも称する。）を作製した。
＜例２＞
添加するペプチド担体の量を１．３ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が７．５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ７．５／βＰ」とも称する。）を作製した。
添加するペプチド担体の量を１．３ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が７．５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ７．５／βＰ」とも称する。）を作製した。
＜例３＞
添加するペプチド担体の量を１．０ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１０％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１０／βＰ」とも称する。）を作製した。
添加するペプチド担体の量を１．０ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１０％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１０／βＰ」とも称する。）を作製した。
＜例４＞
添加するペプチド担体の量を０．８ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１２．５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１２．５／βＰ」とも称する。）を作製した。
添加するペプチド担体の量を０．８ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１２．５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１２．５／βＰ」とも称する。）を作製した。
＜例５＞
添加するペプチド担体の量を０．６ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１５／βＰ」とも称する。）を作製した。
添加するペプチド担体の量を０．６ｍｇとしたこと以外は例１と同様の手順により、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比が１５％の複合体（以下、「ＰｔＮＰ１５／βＰ」とも称する。）を作製した。
図３（ｂ）～図３（ｆ）は、それぞれ、例１～例５の複合体のＴＥＭ像である。なお、図中のスケールバーは、図３（ｂ）、（ｄ）では２００ｎｍであり、図３（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）では１００ｎｍである。
図３（ｂ）のＴＥＭ像より、ＰｔＮＰ５／βＰは、ＰｔＮＰを担持させる前のβＰ（図３（ａ））と同様に、シート状の形態を有することが確認された。
また、図３（ｃ）～図３（ｅ）のＴＥＭ像より、βＰに対するＰｔＮＰの質量比が７．５％、１０％、１２．５％と増加するにつれて、より多くのＰｔＮＰが、良好な分散状態でβＰに担持されている様子が確認された。
また、図３（ｃ）～図３（ｅ）のＴＥＭ像より、βＰに対するＰｔＮＰの質量比が７．５％、１０％、１２．５％と増加するにつれて、より多くのＰｔＮＰが、良好な分散状態でβＰに担持されている様子が確認された。
この様子を模式的に示したものが図４である。
図４に示すように、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）（４００）は、βＰ（２００）にＰｔＮＰ（３００）が担持されており、βＰ（２００）のＮ末端のアミノ基（２２０）および／または側鎖のアミノ基（２３０）の窒素原子とＰｔとによりＰｔ－Ｎ結合が形成されており、このＰｔ－Ｎ結合の量が制御された状態で、ＰｔＮＰがβＰに分散担持されている。
図４に示すように、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）（４００）は、βＰ（２００）にＰｔＮＰ（３００）が担持されており、βＰ（２００）のＮ末端のアミノ基（２２０）および／または側鎖のアミノ基（２３０）の窒素原子とＰｔとによりＰｔ－Ｎ結合が形成されており、このＰｔ－Ｎ結合の量が制御された状態で、ＰｔＮＰがβＰに分散担持されている。
一方、βＰに対するＰｔＮＰの質量比が１５％であるＰｔＮＰ１５／βＰのＴＥＭ像（図３（ｆ））では、βＰとＰｔＮＰが凝集体を形成している様子が見られた。また、ＴＥＭグリッドの別の箇所では、ＰｔＮＰを担持していないペプチドが部分的に分離して集合体を形成している様子が見られた（図示せず）。
図５（ａ）～図５（ｆ）は、それぞれ、βＰ、および、例１～例５の複合体について、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルである。
図５（ｂ）に示すＰｔＮＰ５／βＰのＮ １ｓスペクトルでは、ＰｔＮＰを担持させる前のβＰ（図５（ａ））で見られた３９９．８ｅＶのピーク（アミドおよびアミンに由来するピーク：Ｎ１）および４０１．５ｅＶのピーク（プロトン化したアミンに由来するピーク：Ｎ２）に加え、３９９．２ｅＶおよび４００．９ｅＶにおいて、新たな２つのピークが確認された。
これらの新たなピークが見られた結合エネルギーの値は、それぞれ、ＰｔＮＰの担持前の値から－０．６ｅＶシフトしており（３９９．２－３９９．８＝－０．６ ； ４００．９－４０１．５＝－０．６）、これは、ＰｔがβＰの窒素原子（Ｎ）に結合することによって生じた分極（Ｐｔδ＋－Ｎδ－）に起因するものであると考えられる。
これらの新たなピークが見られた結合エネルギーの値は、それぞれ、ＰｔＮＰの担持前の値から－０．６ｅＶシフトしており（３９９．２－３９９．８＝－０．６ ； ４００．９－４０１．５＝－０．６）、これは、ＰｔがβＰの窒素原子（Ｎ）に結合することによって生じた分極（Ｐｔδ＋－Ｎδ－）に起因するものであると考えられる。
図６（ａ）および図６（ｂ）は、それぞれ、原料の白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）および例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）の、ＸＰＳ測定で得られたＰｔ ４ｆスペクトルである。
図６（ａ）に示すように、原料のＰｔＮＰでは、Ｐｔ ４ｆ７／２ピークが、７１．１ｅＶ（Ｐｔ０）および７２．４ｅＶ（Ｐｔ２＋Ｏ）に確認された。一方、例４の複合体では、これらのピークがポジティブシフトし、それぞれ、７１．６ｅＶ（Ｐｔ０）および７２．９ｅＶ（Ｐｔ２＋Ｏ）に確認された。
図６（ａ）に示すように、原料のＰｔＮＰでは、Ｐｔ ４ｆ７／２ピークが、７１．１ｅＶ（Ｐｔ０）および７２．４ｅＶ（Ｐｔ２＋Ｏ）に確認された。一方、例４の複合体では、これらのピークがポジティブシフトし、それぞれ、７１．６ｅＶ（Ｐｔ０）および７２．９ｅＶ（Ｐｔ２＋Ｏ）に確認された。
従って、本実施例で作製した複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）では、ＸＰＳのＮ １ｓスペクトルにおける３９９．２ｅＶのピークが、上述した白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク（Ｎ３）に対応し、４００．９ｅＶのピークが、白金と結合し、かつプロトン化したアミンに由来するピーク（Ｎ４）に対応すると考えられる。
そして、３９９．２ｅＶ、３９９．８ｅＶ、４００．９ｅＶ、および４０１．５ｅＶにおける各ピーク面積の合計値に対する、３９９．２ｅＶにおけるピーク面積の割合を計算することによって、複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の割合を評価することができる。
そして、３９９．２ｅＶ、３９９．８ｅＶ、４００．９ｅＶ、および４０１．５ｅＶにおける各ピーク面積の合計値に対する、３９９．２ｅＶにおけるピーク面積の割合を計算することによって、複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の割合を評価することができる。
以下の表１は、各サンプルのＸＰＳのＮ １ｓスペクトルにおける、上記４つの結合エネルギーにおけるピーク面積の割合をまとめたものである。
ピーク面積の計算には、カーブフィッティングおよびデータ解析用のソフトウェア（Ｆｉｔｙｋ）を用い、ガウシアン関数によるデコンボリューション処理を行った後、各ピーク面積値を算出した。
なお、表１中、「Amide and Amine」、「Protonated Amine」、「Amide and Amine Bound with Pt」、および「Protonated Amine Bound with Pt」との記載は、それぞれ、上記のＮ１～Ｎ４の各ピークに対応するピークであることを意味する。
ピーク面積の計算には、カーブフィッティングおよびデータ解析用のソフトウェア（Ｆｉｔｙｋ）を用い、ガウシアン関数によるデコンボリューション処理を行った後、各ピーク面積値を算出した。
なお、表１中、「Amide and Amine」、「Protonated Amine」、「Amide and Amine Bound with Pt」、および「Protonated Amine Bound with Pt」との記載は、それぞれ、上記のＮ１～Ｎ４の各ピークに対応するピークであることを意味する。
表１の結果より、ＰｔＮＰ１０／βＰおよびＰｔＮＰ１２．５／βＰでは、ＸＰＳのＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、Ｎ３（３９９．２ｅＶ）のピーク面積値の割合が４０％以上であることが確認された。また、ＰｔＮＰ１２．５／βＰでは、Ｎ３（３９９．２ｅＶ）のピーク面積値の割合が、Ｎ１（３９９．８ｅＶ）のピーク面積値の割合を上回っていた。
［複合体のＯＲＲ活性評価］
（サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定）
上記の通り作製した例１～例５の複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）と、比較のために作製した以下の例６の複合体（ＰｔＮＰ／Ｃ）とのそれぞれについて、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定を行い、酸素還元反応（ＯＲＲ）の活性評価を行った。
（サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定）
上記の通り作製した例１～例５の複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）と、比較のために作製した以下の例６の複合体（ＰｔＮＰ／Ｃ）とのそれぞれについて、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定を行い、酸素還元反応（ＯＲＲ）の活性評価を行った。
＜例６＞
ペプチド担体の代わりに０．５５ｍｇのカーボンブラック（Ｖｕｌｃａｎ（登録商標））を用いたこと以外は上記例１と同様の手順により、炭素担体に対して質量比２０％の白金ナノ粒子を担持させた複合体（以下、「ＰｔＮＰ２０／Ｃ」と称する。）を作製した。
ペプチド担体の代わりに０．５５ｍｇのカーボンブラック（Ｖｕｌｃａｎ（登録商標））を用いたこと以外は上記例１と同様の手順により、炭素担体に対して質量比２０％の白金ナノ粒子を担持させた複合体（以下、「ＰｔＮＰ２０／Ｃ」と称する。）を作製した。
ＣＶ測定では、グラッシーカーボン製の電極（直径１．６ｍｍ）を作用電極とし、参照電極および対電極には、それぞれ、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）および白金線を用いて３電極式セルを組み立て、酸素飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液（中性条件）を溶媒に用い、掃引速度を０．１Ｖ／ｓとして、ＢＡＳ ＡＬＳ－７１０Ｄ電気化学アナライザーを使用して測定を行った。
図７は、例１～例４の複合体について得られたサイクリックボルタモグラムをひとつのグラフにまとめたものである。
図７に示すように、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）および例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）は、例１の複合体（ＰｔＮＰ５／βＰ）および例２の複合体（ＰｔＮＰ７．５／βＰ）と比較して、還元電位および応答電流強度の点で優れたＯＲＲ活性を示した。
図７に示すように、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）および例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）は、例１の複合体（ＰｔＮＰ５／βＰ）および例２の複合体（ＰｔＮＰ７．５／βＰ）と比較して、還元電位および応答電流強度の点で優れたＯＲＲ活性を示した。
また、図７のグラフの内側に挿入したグラフに示されるように、複合体における上記のＰｔ－Ｎ結合の割合（図５、表１；ＸＰＳのＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対するＮ３のピーク面積値の割合）が増加するにつれて、サイクリックボルタモグラムから得られる立ち上がり電位（onset potential：Ｅonset）の値がほぼ線形的に増加することが分かった。
このことは、ＰｔＮＰとβＰとの複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の形成が、複合体のＯＲＲ活性と密接に関係する重要なファクターであることを示唆している。
このことは、ＰｔＮＰとβＰとの複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の形成が、複合体のＯＲＲ活性と密接に関係する重要なファクターであることを示唆している。
コントロール実験として、上記の通り作製した白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）のみ（ペプチド担体に担持させなかったもの）について、同様にＣＶ測定を行った結果、ＰｔＮＰのみではほとんどＯＲＲ活性を示さなかった。
また、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件では、０．７Ｖの電位においてバックグラウンドの還元電流のピークが見られた（図８（ａ））。この還元電流のピークは、ＰｔＮＰにおける白金酸化物の還元に起因するものであると考えられ、この現象は、白金電極を用いた場合に見られる典型的な電気化学的挙動であることが知られている。また、このようなＰｔＮＰの酸化分解によって、ＰｔＮＰの表面に高抵抗層が形成され得るため、望ましくない。
また、例６の複合体（ＰｔＮＰ２０／Ｃ）についてＣＶ測定を行った結果、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件において、上記のコントロールと同様に、望ましくないバックグラウンドの還元電流のピークが見られた（図８（ｂ））。
これらの結果とは対照的に、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）では、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件においても、上述したようなバックグラウンドの還元電流のピークは見られなかった（図８（ｃ））。
また、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件では、０．７Ｖの電位においてバックグラウンドの還元電流のピークが見られた（図８（ａ））。この還元電流のピークは、ＰｔＮＰにおける白金酸化物の還元に起因するものであると考えられ、この現象は、白金電極を用いた場合に見られる典型的な電気化学的挙動であることが知られている。また、このようなＰｔＮＰの酸化分解によって、ＰｔＮＰの表面に高抵抗層が形成され得るため、望ましくない。
また、例６の複合体（ＰｔＮＰ２０／Ｃ）についてＣＶ測定を行った結果、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件において、上記のコントロールと同様に、望ましくないバックグラウンドの還元電流のピークが見られた（図８（ｂ））。
これらの結果とは対照的に、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）では、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件においても、上述したようなバックグラウンドの還元電流のピークは見られなかった（図８（ｃ））。
以上の結果から、図７に示した、酸素飽和した溶媒を用いて得られた例１～例４の複合体のサイクリックボルタモグラムにおけるピークは、酸素還元反応に由来するものであることが確認された。
一方、例５の複合体（ＰｔＮＰ１５／βＰ）では、アルゴン飽和した１．０Ｍ ＫＮＯ３溶液を溶媒に用いた測定条件において、還元電流のピークが見られ、このことは、複合体中に、βＰのアミノ基の窒素原子に結合していない状態のＰｔＮＰが存在することを示していると考えられる（図８（ｄ））。
（リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定）
次に、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）と、比較のために用意した市販のＰｔ／Ｃ触媒とのそれぞれについて、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行い、酸素還元反応（ＯＲＲ）の活性評価を行った。
市販のＰｔ／Ｃ触媒としては、シグマアルドリッチ社の製品（２０ｗｔ％ Ｐｔ）を使用した。なお、以下では、このＰｔ／Ｃ触媒を、「２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ」と称することもある。
次に、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）と、比較のために用意した市販のＰｔ／Ｃ触媒とのそれぞれについて、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行い、酸素還元反応（ＯＲＲ）の活性評価を行った。
市販のＰｔ／Ｃ触媒としては、シグマアルドリッチ社の製品（２０ｗｔ％ Ｐｔ）を使用した。なお、以下では、このＰｔ／Ｃ触媒を、「２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ」と称することもある。
ＬＳＶ測定では、グラッシーカーボン製の電極（直径３ｍｍ）を作用電極とし、回転ディスク電極（ＲＤＥ）装置を用いて回転速度を１６００ｒｐｍに設定し、ＢＡＳ ＡＬＳ－７１０Ｄ電気化学アナライザーを使用して測定を行った。
なお、市販のＰｔ／Ｃ触媒の測定用インクは、標準的な調製方法に従って、１．０ｍＬの溶媒（ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ＝３／２ ｖ／ｖ）と４０μＬのナフィオン（登録商標）とを混合した分散液に、５．０ｍｇのＰｔ／Ｃ触媒を添加し、超音波分散させることによって調製した。
なお、市販のＰｔ／Ｃ触媒の測定用インクは、標準的な調製方法に従って、１．０ｍＬの溶媒（ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ＝３／２ ｖ／ｖ）と４０μＬのナフィオン（登録商標）とを混合した分散液に、５．０ｍｇのＰｔ／Ｃ触媒を添加し、超音波分散させることによって調製した。
図９（ａ）は、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）、および市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）について得られたＲＤＥ分極曲線である。
市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）では、質量活性（ｉｍ）、立ち上がり電位（Ｅｏｎｓｅｔ）、半波電位（Ｅ１／２）は、それぞれ、４３６Ａ／ｇ、０．９５Ｖ、０．７６Ｖであり、これらの値は、これまでに報告された、中性条件下でのＰｔ／Ｃ触媒の特性値とほぼ一致していた。
これに対して、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）では、立ち上がり電位（Ｅｏｎｓｅｔ）、半波電位（Ｅ１／２）は、それぞれ、０．９８Ｖ、０．８２Ｖであり、市販のＰｔ／Ｃ触媒の値を有意に上回った。
また、質量活性（ｉｍ）は４２２Ａ／ｇであり、市販のＰｔ／Ｃ触媒に匹敵する値であったことに加え、非特許文献１に記載の触媒で得られた値（１６．３８Ａ／ｇ）と比べて２５倍を超える値であった。
市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）では、質量活性（ｉｍ）、立ち上がり電位（Ｅｏｎｓｅｔ）、半波電位（Ｅ１／２）は、それぞれ、４３６Ａ／ｇ、０．９５Ｖ、０．７６Ｖであり、これらの値は、これまでに報告された、中性条件下でのＰｔ／Ｃ触媒の特性値とほぼ一致していた。
これに対して、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）では、立ち上がり電位（Ｅｏｎｓｅｔ）、半波電位（Ｅ１／２）は、それぞれ、０．９８Ｖ、０．８２Ｖであり、市販のＰｔ／Ｃ触媒の値を有意に上回った。
また、質量活性（ｉｍ）は４２２Ａ／ｇであり、市販のＰｔ／Ｃ触媒に匹敵する値であったことに加え、非特許文献１に記載の触媒で得られた値（１６．３８Ａ／ｇ）と比べて２５倍を超える値であった。
この結果から、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）では、Ｐｔ－Ｎ結合を形成した白金の表面に対して酸素分子（Ｏ２）が直接作用することができ、これにより、白金の酸素還元触媒性能がより効率的に引き出されることが示唆された。
次に、回転ディスク電極（ＲＤＥ）装置の回転速度を、１２００ｒｐｍ、１６００ｒｐｍ、２０００ｒｐｍ、および２５００ｒｐｍに設定し、各々の条件下でＬＳＶ測定を行い、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体が作用する酸素還元の反応機構を解析した。
図９（ｂ）は、例３の複合体（ＰｔＮＰ１０／βＰ）、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）、および市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）について得られた、Ｋｏｕｔｅｃｋｙ－Ｌｅｖｉｃｈ（Ｋ－Ｌ）プロットである。
いずれのＫ－Ｌプロットも直線性を示していることから、ＯＲＲが一次反応であることが確認された。
また、得られたＫ－Ｌプロットから、０．５Ｖでの電子移動数（ｎ）を評価すると、例３および例４の複合体では３．９、市販のＰｔ／Ｃ触媒では３．８となった。このことから、４電子の移動を伴う完全な酸化還元反応（Ｏ２ ＋ ４ｅ－ → ２Ｏ２－）が生じていることが示された。
いずれのＫ－Ｌプロットも直線性を示していることから、ＯＲＲが一次反応であることが確認された。
また、得られたＫ－Ｌプロットから、０．５Ｖでの電子移動数（ｎ）を評価すると、例３および例４の複合体では３．９、市販のＰｔ／Ｃ触媒では３．８となった。このことから、４電子の移動を伴う完全な酸化還元反応（Ｏ２ ＋ ４ｅ－ → ２Ｏ２－）が生じていることが示された。
また、図９（ｃ）に示すターフェルプロットの結果から、ターフェル勾配（α）および交換電流密度（ＩＥ）を比較すると、市販のＰｔ／Ｃ触媒では、α＝６９．１ｍＶ/ｄｅｃ、ＩＥ＝３．６×１０－８Ａ／ｃｍであるのに対し、例４の複合体では、α＝５６．１ｍＶ/ｄｅｃ、ＩＥ＝５．２×１０－８Ａ／ｃｍであり、例４の複合体の方がターフェル勾配（α）の値がより小さく、交換電流密度（ＩＥ）はより大きい値であった。
また、例３の複合体では、α＝７４．７ｍＶ/ｄｅｃ、ＩＥ＝３．２×１０－８Ａ／ｃｍであり、いずれも市販のＰｔ／Ｃ触媒に匹敵する値が得られた。
また、例３の複合体では、α＝７４．７ｍＶ/ｄｅｃ、ＩＥ＝３．２×１０－８Ａ／ｃｍであり、いずれも市販のＰｔ／Ｃ触媒に匹敵する値が得られた。
加えて、図９（ｄ）に示すように、例４の複合体は、電圧の掃引を１０００回繰り返した後（１．２Ｖから０．４Ｖ、作動時間３時間）も、ＴＥＭ像において特段外観上の変化は見られず、質量活性（ｉｍ）の値も、当初の値の８９％以上の値を保持していた（０．６５Ｖにおいて４２２Ａ／ｇから３７７Ａ／ｇ（活性保持率約８９．３％））。
また、例３の複合体について同様の条件で電圧の掃引を１０００回繰り返した結果、質量活性（ｉｍ）の値は、当初の値の８０％以上の値を保持していた（０．６５Ｖにおいて３４９Ａ／ｇから２８３Ａ／ｇ（活性保持率約８１．１％））。
また、例３の複合体について同様の条件で電圧の掃引を１０００回繰り返した結果、質量活性（ｉｍ）の値は、当初の値の８０％以上の値を保持していた（０．６５Ｖにおいて３４９Ａ／ｇから２８３Ａ／ｇ（活性保持率約８１．１％））。
これらの活性保持率の値は、市販のＰｔ／Ｃ触媒での値と比べてやや劣るものの、本発明の複合体が実用に耐え得るものであることを示唆している。また、ＰｔＮＰとβＰとの複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の割合が、ＯＲＲの安定性に寄与していると考えられる。
また、Ｐｔ／Ｃ複合体の別の例として、白金ナノ粒子とグラファイトカーボンナノファイバー（ＧＮＦ）担体との複合体（Ｐｔ／ＧＮＦ）と比べた場合、例４の複合体および例３の複合体について得られた上記の質量活性（ｉｍ）の値（それぞれ、４２２Ａ／ｇおよび３４９Ａ／ｇ）は、いずれも、これまでに報告された値（１９５Ａ／ｇ）を有意に上回っている（Gimnez-Lopez M. et al., Extremely Stable Platinum-Amorphous Carbon Electrocatalyst within Hollow Graphitized Carbon Nanofibers for the Oxygen Reduction Reaction. Ad. Mater. 2016, 28, 9103-9108参照）。
また、Ｐｔ／Ｃ複合体の別の例として、白金ナノ粒子とグラファイトカーボンナノファイバー（ＧＮＦ）担体との複合体（Ｐｔ／ＧＮＦ）と比べた場合、例４の複合体および例３の複合体について得られた上記の質量活性（ｉｍ）の値（それぞれ、４２２Ａ／ｇおよび３４９Ａ／ｇ）は、いずれも、これまでに報告された値（１９５Ａ／ｇ）を有意に上回っている（Gimnez-Lopez M. et al., Extremely Stable Platinum-Amorphous Carbon Electrocatalyst within Hollow Graphitized Carbon Nanofibers for the Oxygen Reduction Reaction. Ad. Mater. 2016, 28, 9103-9108参照）。
（電気化学インピーダンス測定）
次に、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）および市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）について、ポテンショスタット（Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ社、ＶＳＰ－３００）を用いて電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定を行い、電極（カソード電極）の抵抗値の評価を行った。
電気化学インピーダンス測定は、図１０（ｃ）の模式図に示した構成を有する等価回路を用いて行った。測定結果は、市販のプログラム（Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ社、ＥＣ－Ｌａｂ（登録商標）１０．３６）を用いてフィティングした。
次に、例４の複合体（ＰｔＮＰ１２．５／βＰ）および市販のＰｔ／Ｃ触媒（２０ｗｔ％ Ｐｔ／Ｃ）について、ポテンショスタット（Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ社、ＶＳＰ－３００）を用いて電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定を行い、電極（カソード電極）の抵抗値の評価を行った。
電気化学インピーダンス測定は、図１０（ｃ）の模式図に示した構成を有する等価回路を用いて行った。測定結果は、市販のプログラム（Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ社、ＥＣ－Ｌａｂ（登録商標）１０．３６）を用いてフィティングした。
図１０（ａ）は、例４の複合体および市販のＰｔ／Ｃ触媒について得られたナイキスト線図である。各プロットについて、白丸印は市販のＰｔ／Ｃ触媒、白四角印は例４の複合体、白菱形印は上述した条件で電圧の掃引を１０００回繰り返した後の例４の複合体である。
図１０（ａ）に示すように、例４の複合体では５５Ωの抵抗値が得られ、市販のＰｔ／Ｃ触媒での値（３２Ω）に匹敵する結果が得られた。
なお、比較のために、ＰｔＮＰと複合化していないβＰについて同様の測定を行ったところ、図１０（ｂ）に示すようなナイキスト線図（白三角印）が得られ、抵抗値は１０１１Ωであった。
また、電圧の掃引を１０００回繰り返した後の例４の複合体（図１０（ａ）の白菱形印）では、７６Ωの抵抗値が得られたことから、例４の複合体は、良好な電気化学的安定性を有していることが確認された。
図１０（ａ）に示すように、例４の複合体では５５Ωの抵抗値が得られ、市販のＰｔ／Ｃ触媒での値（３２Ω）に匹敵する結果が得られた。
なお、比較のために、ＰｔＮＰと複合化していないβＰについて同様の測定を行ったところ、図１０（ｂ）に示すようなナイキスト線図（白三角印）が得られ、抵抗値は１０１１Ωであった。
また、電圧の掃引を１０００回繰り返した後の例４の複合体（図１０（ａ）の白菱形印）では、７６Ωの抵抗値が得られたことから、例４の複合体は、良好な電気化学的安定性を有していることが確認された。
βＰ単独での抵抗値が高いこと（図１０（ｂ））に加え、上述したように、ＰｔＮＰのみ（ペプチド担体に担持させなかったもの）のＣＶ測定においてＰｔＮＰの酸化分解が見られたこと、そして、Ｐｔ－Ｎ結合の割合が増加するにつれて白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）の半波電位（Ｅ１／２）の値がポジティブシフトすること（図７参照）から、ＰｔＮＰとβＰとの複合体におけるＰｔ－Ｎ結合の形成が、複合体のＯＲＲ活性および安定性に重要な役割を果たしていることが示された。
また、例４の複合体について、上記のＥＩＳ測定で得られたデータから計算された電気二重層容量（Ｃｄｌ）の値は、４１．７μＦであり、これまでに報告されたＰｔ／Ｃ触媒の値（６４．８μＦ）（Yang, W. et al., Air Cathode Catalysts of Microbial Fuel Cell by Nitrogen-Doped Carbon Aerogels. ACS Sustain. Chem. Eng. 2019, 7 (4), 3917-3924参照）に匹敵し、電気化学活性比表面積（ＥＣＳＡ）との直接的な関係性が確認された。
また、例４の複合体について、上記のＥＩＳ測定で得られたデータから計算された電気二重層容量（Ｃｄｌ）の値は、４１．７μＦであり、これまでに報告されたＰｔ／Ｃ触媒の値（６４．８μＦ）（Yang, W. et al., Air Cathode Catalysts of Microbial Fuel Cell by Nitrogen-Doped Carbon Aerogels. ACS Sustain. Chem. Eng. 2019, 7 (4), 3917-3924参照）に匹敵し、電気化学活性比表面積（ＥＣＳＡ）との直接的な関係性が確認された。
本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体は、従来のＰｔ／Ｃ複合体を上回る酸素還元触媒性能を発揮するものである。このような複合体は、金属二次電池や燃料電池の電極（カソード電極）における酸素還元反応（ＯＲＲ）を促進する触媒として、好適に使用することができる。
また、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法によれば、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を従来技術より劇的に小さくすることができるので、製造コストの面で有利である。
また、本発明の白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法によれば、ペプチド担体に対する白金ナノ粒子の質量比を従来技術より劇的に小さくすることができるので、製造コストの面で有利である。
２００ ペプチド担体（自己組織化処理後のペプチド担体：βＰ）
２１０ ペプチド鎖
２２０、２３０ アミノ基
３００ 白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）
４００ 白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）
２１０ ペプチド鎖
２２０、２３０ アミノ基
３００ 白金ナノ粒子（ＰｔＮＰ）
４００ 白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体（ＰｔＮＰ／βＰ）
Claims (9)
- βシート構造を有するペプチド担体と白金ナノ粒子を含み、
前記ペプチド担体に前記白金ナノ粒子が担持されており、
Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）測定で得られたＮ １ｓスペクトルから求められるピーク総面積値に対する、白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が４０％以上である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体。 - 前記ピーク総面積値に対する前記白金と結合したアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合が、白金を伴わないアミドおよびアミンに由来するピーク面積値の割合よりも大きい、請求項１に記載の複合体。
- 金属二次電池または燃料電池の電極用触媒である、請求項１または２に記載の複合体。
- 前記電極用触媒は、カソード電極用触媒である、請求項３に記載の複合体。
- 白金ナノ粒子からなる分散液を提供するステップと、
前記分散液に、βシート構造を有し、かつ少なくとも１つ以上のアミノ基を側鎖に有するペプチド担体を添加し、分散処理するステップと、
を包含し、
前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、９％以上１４％以下である、白金ナノ粒子とペプチド担体との複合体の製造方法。 - 前記ペプチド担体に対する前記白金ナノ粒子の質量比が、１０．５％以上１３％以下である、請求項５に記載の複合体の製造方法。
- フーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）スペクトルから求められる前記ペプチド担体のβシート構造の割合が７０％以上である、請求項５または６に記載の複合体の製造方法。
- 金属二次電池または燃料電池の電極用触媒の製造方法である、請求項５～７のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
- 前記電極用触媒の製造方法は、カソード電極用触媒の製造方法である、請求項８に記載の複合体の製造方法。
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Non-Patent Citations (5)
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| MIZUTARU, Tsukasa, et al.，Peptide Cross-linkers: Immobilization of Platinum Nanoparticles Highly Dispersed on Graphene Oxide Nanosheets with Enhanced Photocatalytic Activities，ACS Applied Materials Interfaces，米国，American Chemical Society，2017年03月02日，9，9996-10002，doi:10.1021/acsami.6b16765 |
| ZHOU, Binbin, et al.，Platinum nanostructures via self-assembly of an amyloid-like peptide: a novel electrocatalyst for the oxygen reduction，Nanoscale，英国，Royal Society of Chemistry，2013年02月22日，5，2669-2673，doi:10.1039/c3nr33998j |
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