JP6989179B2 - 検出信号の自己増幅原理を利用した正確、迅速、便利なシングルステップの疾病の診断方法 - Google Patents
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Description
本背景技術の部分に記載された前記の情報は、本発明の背景の理解を向上させるためであり、これに本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとってはすでに知られている先行技術を形成する情報が含まないことができる。
まず、大腸菌で1)H6−SPAB−HBVC capsid構造の発現ベクター、2)H6−c33c(HCVエピトープ)−HBVC capsid構造の発現ベクター及び3)hFTN(ヒトフェリチン)−511p−c100p−c22p(HCVエピトープ)−H6構造の発現ベクターをそれぞれ発現し、3種類のタンパク質粒子を製造した(図8)。1)番のベクターで製造されるタンパク質粒子は、表面にヘキサ−ヒスチジンとSPABが表出されて、金イオンと抗体のFcドメインと結合する機能をして、2)番及び3)番のベクターは、表面にC型肝炎の特異的エピトープが表出されて、患者のサンプル内HCV特異的抗体と結合すると予想した(図9)。
HCVのC(core)タンパク質は、HCVゲノムRNAを囲む(encapsidation)構造的役割をするだけでなく、宿主細胞の遺伝子転写、成長及び増殖を調節して、肝臓に発展する役割をするもので信じられ、E1及び2タンパク質はタイプ1膜(transmembrane)タンパク質であり、ウイルス外皮タンパク質として細胞の感染時に重要な役割をするものとして知られている。E1タンパク質の場合、中和抗体を誘導していないという点のため、大きな関心を受けなかったが、最近、ベルギーのイノジェネティクス(Innogenetics)社では、治療用ワクチンとして開発し、チンパンジーの実験と1相臨床試験が正常に完了した後、2相臨床試験を進めており、特にアルファインターフェロン利用で効果を見えなかった1b型のHCV感染にも良い効果を示して、かなり刺激的なものと評価されている。
2−1.タンパク質粒子の生合成
大腸菌菌株BL21(DE3)[F−ompThsdSB(rB−mB−)]を実施例1で製造した発現ベクターを使用して、それぞれ形質転換し、アンピシリン−抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を50mLのLuria−Bertani(LB)培地(100mg L−1アンピシリン含有)を含有するフラスコ(250mL Erlenmeyer flasks、37℃、150rpm)で培養した。
実施例2−1で発現された自己組み立てに組換えされた融合タンパク質の粒子を精製するために、下記3つのステップの精製過程を行った。まず、1)組換えタンパク質の融合発現されたヒスチジンとニッケルの結合を利用したNi2+−NTA affinityクロマトグラフィーを行った後、2)組換えタンパク質を濃縮し、濃縮されたタンパク質のバッファを交換する過程を通じてモノマーの自己組み立てを進行し、3)自己組み立てされたタンパク質粒子のみを分離するために、スクロス勾配ultracentifugationを行った。各ステップの詳細な記載は以下の通りである。
組換えタンパク質を精製するために、前記明示された方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを5mL破砕溶液(pH8.0、50mMのsodium phosphate、300mMのNaCl、20mMのimidazole)に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞液を13,000rpmで10分間遠心分離し、その上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をNi2+−NTAカラム(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して、それぞれ分離した(洗浄バッファー:pH8.0、50mMのsodium phosphate、300mMのNaCl、50 mMのimidazole/溶出バッファー:pH8.0、50mMのsodium phosphate、300mMのNaCl、100mMのimidazole)。
Ni2+−NTA affinityクロマトグラフィーを経て溶出した3mlの組換えタンパク質をUltracentrifugal filter(Amicon Ultra10K、Millipore、Billerica、MA)に入れて、5,000rpmでカラム上に1mlの溶液が残るまで遠心分離を行った。タンパク質粒子をTris−HCl(50mMのTris−HCl、500mMのNaCl、pH7.0)バッファー(hFTN粒子の場合には、PBSバッファー(2.7mMのKCl、137mMのNaCl、2mMのKH2PO4、10mMのNa2HPO4、pH7.4))にバッファ交換させることにより、モノマーの自己組み立てを行った。
Tris−HCl(50mM Tris−HCl、500mMのNaCl、pH7.0)バッファーに(hFTN粒子の場合には、PBSバッファー(2.7mMのKCl、137mMのNaCl、2mMのKH2PO4、10mMのNa2HPO4、pH7.4)スクロースを濃度別にそれぞれ添加して60%、50%、40%、30%、20%のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した後、高速遠心分離用チューブ(ultraclear13.2ml tube、Beckman)に各濃度別(60〜20%)スクロース溶液を濃度が高い溶液から2mlずつ盛る。溶液を入れた後、最後に組換えタンパク質溶液を1ml満たした後、24,000rpmで、4℃で16時間高速遠心分離を実施した(Ultracentrifuge L−90k、Beckman)。遠心分離した後、慎重にピペットを用いて、40〜50%スクロース溶液の部分を取って、2)に明示されたようにultracentrifugal filterとTris−HClバッファーを用いて、組換えタンパク質のバッファを交換した。
実施例2で精製した組換えタンパク質の粒子の構造解析のために、透過電子顕微鏡(TEM)で組換えタンパク質粒子を撮影した。まず、染色していない精製したタンパク質サンプルを、炭素コーティングされた銅の電子顕微鏡グリッド(grids)に載せた後、自然乾燥した。タンパク質粒子の染色された画像を得るために、自然乾燥されたサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを2%(w/v)水性ウラニル酢酸溶液と一緒に10分間、室温でインキュベーションし、蒸留水で3〜4回洗浄した。
4−1.抗原検知を通じた疾病の特異的マーカーの検出
急性心筋梗塞(AMI)の場合には、実施例2で製造して、1.25mg/mlと濃度を合わせたH6−SPAB−capsid蛋白質粒子800μLに1mg/mlの濃度を有するGoat anti−TnI polyclonal IgG(cat。no。70−XG82、Fitzgerald、Acton、MA、USA)の抗体を200μL入れ、4℃で12〜16時間混ぜて結合させた。
1)人間C型肝炎ウイルス(HCV)の診断
HCVの場合には、実施例2で製造した1.0mg/mlのH6−SPAB−capsid蛋白質粒子500μLに2.0mg/mlのH6−c33c−capsid蛋白質粒子250μL及び1.0mg/mlのH6hFTN−511p−c100p−c22pタンパク質粒子250μLを入れて、タンパク質粒子の混合溶液を製造した後、ここに0.5%Au3+イオン溶液を500μL入れ、4℃で12〜16時間混ぜて結合させた。
HIVの場合には、前記HCVの場合と実験手順は同じであるが、タンパク質粒子の混合溶液の組成を違うようにした。即ち、1.0mg/mlのH6−SPAB−capsid蛋白質粒子500μLに3.0mg/mlのH6−gp41−capsid蛋白質粒子250μL及び1.0mg/mlのH6−p24−capsid蛋白質粒子250μLを入れて、タンパク質粒子の混合溶液を製造した後、ここに0.5%のAu3+イオン溶液を500μL入れ、4℃で12〜16時間混ぜて結合させた。
HAVの場合には、実施例2で製造した1.0mg/mlのH6−SPAB−capsid蛋白質粒子600μLに2.0mg/mlのhFTN−ep1−H6タンパク質ナノ粒子200μL、2.0mg/mlのhFTN−ep2−H6タンパク質ナノ粒子200μL及び1.0mg/mlのhFTN−ep3−H6タンパク質ナノ粒子200μLを入れて、タンパク質粒子の混合溶液を製造した後、ここに0.5%のAu3+イオン溶液を600μL入れ、4℃で12〜16時間混ぜて結合させた。
AMI患者の血清でELISAとECLIAを通じて対照群実験を行った。ELISAの場合、12.5pg/mlの検出限界を有するキット(Abbexa、U.K.、abx252868)を利用し、ECLIAの場合は、0.16ng/mlの検出限界を有することが確認された(Modular Analytics E170、Roche、Germany)
実施例4で行ったone−step診断実験では、患者の場合、すぐに青に変わることを確認したが、このように変化する原因について確認してみようと、有限差分時間領域法のシミュレーション(FDTD simulation)実験を行った(Lumerical Solutions、ver.8.15.736)。
One−step診断の原理を分析するための対照群実験を行った。金イオンと結合するアミノ酸であるヒスチジンによく結合する既知のNi2+でタンパク質粒子のヒスチジンに付けて進行した対照群の実験を進めて、金イオンとタンパク質粒子のヒスチジンとの結合が、この実験に与える影響を確認し、タンパク質粒子に付いている金イオンだけでなく、溶液内に自由に存在する金イオンの量がある程度以上存在することによりone−step診断実験が円滑に起きたことを実験結果から確認できた(図6、図7)。
1:何の物質の処理なしに、単純にNi2+溶液と患者と健常者の血清及び還元剤LAAを処理して、Ni2+がLAAに会って還元され、色を現わしていることを確認するための実験群
2:他の物質の処理なしに、単純にAu3+(金イオン)溶液と患者と健常者の血清及び還元剤LAAを処理して、色の変化を測定し、患者と健常者の区別なく、金イオンが還元されて、粒子を達成しながら、青に変わることを確認した。
3:タンパク質粒子に金イオンのみ付けたものと患者と健常者の血清および還元剤を処理した結果、自由に動き回る自由金イオンがないので、いずれの場合も色が変化がないことを確認することができた。
4:タンパク質粒子に抗体を付けて、金イオンまで付けた後、患者と健常者の血清及び還元剤を処理した結果、先の3番の場合に抗体がないため、この場合と比較するために抗体に結合させて実験し、その結果、自由金イオンがないので、色の変化が起こらないことを確認した。
5:既存の診断方法そのまま再現した結果として、患者だけで色が変化することを確認することができた。
6:抗体を付けたタンパク質粒子に金イオンがくっつかないように、あらかじめNi2+イオンを処理したタンパク質粒子に自由金イオンが存在するようにして、そこに患者と健常者の血清及び還元剤を処理した結果として、自由金イオンによって還元が起きて色が変化することを確認することができるが、抗体が付いたタンパク質粒子に金イオンがないため、クラスタを形成するのに役立たず、健常者と患者との間の区別がないことを確認することができた。
8−1.本発明のOne−step診断方法の定量分析するかどうかを確認
ヒト血清由来のTnI標準試料(30−AT43、Fitzgerald、Acton、MA、U.S.A.)を3種類の健常者血清にそれぞれspikingし、各健常者血清ごとに異なる濃度(0、2、5、10、20、30ng/ml)の標準血清試料を作製し、この血清を、実施例4の方法を通じて診断開始後、15分(図13のA)、20分(B)、25分(C)と30分(D)の時点で検出信号を576nmでの吸光度で測定した。
1)緑十字医療財団のECLIA診断機器
緑十字医療財団のECLIA診断機器(Roche E−170モデル)を用いて、実施例8−1で作製した標準血清試料(健常者試料A:図14、健常者試料B:図15、健常者試料C:図16)を利用して定量分析するかどうかを確認した。
Elabscience社のELISA診断機器(E−EL−H0144、Elabscience、14780 Memorial Drive、Suite216、Houston、Texas77079、 U.S.A.)を用いて、実施例8−1で作製した標準血清試料(健常者試料A:図17、健常者試料B:18、健常者試料C:図19)を用いて定量分析するかどうかを確認した。
その結果、図17〜図19に開示されているように、ECLIA診断機器分析の結果とは対照的に、すべての血清試料について、実際の濃度よりも低い検出信号が測定され、偏差は少ないが信頼性のある濃度区間がないことを確認した。
Abbexa社の診断機器(abx050255、Abbexa Ltd. Cambridge Science Park、Cambridge、CB40EY、U.K.)を用いて、実施例8−1で作製した標準血清試料(健常者試料A:図20、健常者試料B:図21、健常者試料C:図22)を用いて定量分析するかどうかを確認した。
ALPCO社の診断機器(25−TR1HU−E01、ALPCO26−G Keewaydin Drive、Salem、NH03079、U.S.A.)を用いて、実施例8−1で作製した標準血清試料(健常者試料A:図23、健常者試料B:図24、健常者試料C:図25)を用いて定量分析するかどうかを確認した。
9−1.急性心筋梗塞の診断時に検出限界を確認
健常者血清に0.002〜2ng/mlの濃度範囲の疾患マーカーであるTroponin Iをspikingして、標準血清試料を作製し、これを実施例4の方法で検出限界の測定実験を行った。96 well plate内の試料の色の変化を確認するとともに、576nmでの吸光度を測定した。
健常者血清に0.001〜10ng/mlの濃度範囲の疾患マーカーであるanti−HCV(c33c)IgG standard(LS−C103178、LifeSpan BioSciences、Inc.、Seattle、WA、U.S.A.)をspikingして、標準血清試料を作製し、これを実施例4の方法で検出限界の測定実験を行った。96 well plate内の試料の色の変化を確認するとともに、588nmでの吸光度を測定した。
健常者血清に0.001〜10ng/mlの濃度範囲の疾患マーカーであるanti−HIV(gp41)IgG standard(2509、ImmunoDX、LLC、Woburn、MA、U.S.A.)をspikingして、標準血清試料を作製し、これを実施例4の方法で検出限界の測定実験を行った。96 well plate内の試料の色の変化を確認するとともに、555nmでの吸光度を測定した。
Claims (18)
- 検出信号の自己増幅を利用した疾病の特異的マーカーの検出方法であって、
表面に金イオンを吸着することができるタグ及び疾病の特異的マーカー検出用抗原または抗体が表出されたタンパク質粒子、前記タグに吸着された金イオン及び自由金イオンが存在する事前診断溶液(pre−assay solution)に、前記抗体または抗原に特異的に結合する疾病の特異的抗原または抗体を含有するサンプル及び還元剤を投入して組成された診断溶液(assay solution)内で、抗原−抗体免疫反応及び金イオンの還元による金粒子形成反応を誘導するステップ(a)と、及び
前記抗原−抗体免疫反応で形成されたタンパク質複合体に金粒子が凝集されることによる発色反応で疾病の特異的マーカーの有無を確認するステップ(b)とを含む、前記検出信号の自己増幅を利用した疾病の特異的マーカーの検出方法。 - 検出信号の自己増幅を利用した抗ウイルス抗体の検出方法であって、
表面に金イオンを吸着することができるタグ及び抗ウイルス抗体検出用抗原が表出されたタンパク質粒子、前記タグに吸着された金イオン及び自由金イオンが存在する事前診断溶液内で、前記抗原に特異的に結合する抗ウイルス抗体を含有するサンプル及び還元剤と投入して組成された診断溶液(assay solution)内で、抗原−抗体免疫反応及び金イオンの還元による金粒子形成反応を誘導するステップ(a)と、及び
前記抗原−抗体免疫反応で形成されたタンパク質複合体に金粒子が凝集されることによる発色反応でウイルスの有無を確認するステップ(b)とを含む、前記検出信号の自己増幅を利用した抗ウイルス抗体の検出方法。 - 検出信号の自己増幅を利用した疾病診断のための情報の提供方法であって、
表面に金イオンを吸着することができるタグ及び疾病の特異的マーカー検出用抗原または抗体が表出されたタンパク質粒子、前記タグに吸着された金イオン及び自由金イオンが存在する事前診断溶液に、前記抗体または抗原に特異的に結合する疾病の特異的抗原または抗体を含有するサンプル及び還元剤を投入して組成された診断溶液内で、抗原−抗体免疫反応及び金イオンの還元による金粒子形成反応を誘導するステップ(a)と、及び
前記抗原−抗体免疫反応で形成されたタンパク質複合体に金粒子が凝集されることによる発色反応で疾病の特異的マーカーの有無を確認するステップ(b)とを含む、前記検出信号の自己増幅を利用した疾病診断のための情報の提供方法。 - 前記タグは、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸を含むものであることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記還元剤は、アスコルビン酸、イミダゾール、ピラゾール、ヒスタミン、ヒドロキシルアミン、クエン酸及びナトリウムボロハイドライドからなる群から選択されることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿、唾液、口腔粘膜及びよだれからなる群から選択されることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 事前診断溶液内に存在する前記金イオンの濃度は、1mM〜10mMであることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 診断溶液内に存在する前記還元剤の濃度は、0.005M〜0.1M であることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記サンプルの量は、10μl〜30μlであることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記疾病は、急性心臓病、ヒト免疫不全症、C型肝炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、A型肝炎、脳卒中及び脳出血からなる群から選択されることを特徴とする
請求項1または3に記載の方法。 - 前記発色反応は、少なくとも5分〜10分以内に現れることを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記発色反応は、500−600nmの吸光度を測定して確認することを特徴とする
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記疾病の特異的マーカー検出用抗原または抗体の免疫反応は、前記タンパク質粒子の表面で発生することを特徴とする
請求項1または3に記載の方法。 - 前記タグは、金イオンを吸着して還元剤の存在下で、金粒子の凝集反応を誘導することを特徴とする
請求項1に記載の方法。 - 前記抗原−抗体免疫反応は、前記タンパク質粒子の表面で発生することを特徴とする
請求項2に記載の方法。 - 前記タグは、金イオンを吸着して還元剤の存在下で、金粒子の凝集反応を誘導することを特徴とする
請求項2に記載の方法。 - 前記タンパク質粒子は、フェリチン(ferritin)、フェリチン類似タンパク質(ferritin−like protein)、マグネトソーム(magnetosome)構成タンパク質、ウイルス構成タンパク質(e.g. hepatitis B virus core protein, tobacco mosaic virus)、DPS(DNA binding protein)、及びプロテアソーム(proteasome)からなる群から選択されるタンパク質を含むことを特徴とする
請求項1または3に記載の方法。 - 前記タンパク質粒子は、フェリチン(ferritin)、フェリチン類似タンパク質(ferritin−like protein)、マグネトソーム(magnetosome)構成タンパク質、ウイルス構成タンパク質(e.g. hepatitis B virus core protein, tobacco mosaic virus)、DPS(DNA binding protein)、及びプロテアソーム(proteasome)からなる群から選択されるタンパク質含むことを特徴とする
請求項2に記載の方法。
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