JP6960628B2 - Heat shock protein expression promoter - Google Patents
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Description
本発明は、新たな熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein、Ｈｓｐ）発現促進剤に関する。 The present invention relates to a novel heat shock protein (Hsp) expression promoter.
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり、タンパク質のフォールディングを制御する分子シャペロンとして機能すると考えられている。 Heat shock protein (Hsp) is a protein whose expression increases and protects cells when cells are exposed to stress conditions such as heat, and is thought to function as a molecular chaperone that controls protein folding. ..
一方、特発性肺線維症に代表される肺線維症は、肺組織が長期にわたって傷害され、線維化する症状であり、原因には間質性肺炎、過敏性肺炎などが考えられている難病である。従来、肺線維症の治療法としてはインドリノン誘導体を投与する方法があるが（特許文献１）、重度の下痢や肝機能障害等、重篤な副作用を招く恐れがある。
近年、肺組織の線維化の予防及び治療にはＨｓｐが関与していることが報告されている（非特許文献１）。
したがって、Ｈｓｐ発現促進剤は、肺線維症の予防及び治療に有用であると考えられ、Ｈｓｐの発現を促進し、肺線維症の予防又は治療に有用で、安全性が高く、長期摂取可能な物質の探索が望まれている。
On the other hand, pulmonary fibrosis represented by idiopathic pulmonary fibrosis is a symptom in which lung tissue is injured for a long period of time and becomes fibrotic. be. Conventionally, there is a method of administering an indolinone derivative as a treatment method for pulmonary fibrosis (Patent Document 1), but there is a risk of causing serious side effects such as severe diarrhea and liver dysfunction.
In recent years, it has been reported that Hsp is involved in the prevention and treatment of fibrosis of lung tissue (Non-Patent Document 1).
Therefore, the Hsp expression promoter is considered to be useful for the prevention and treatment of pulmonary fibrosis, promotes the expression of Hsp, is useful for the prevention or treatment of pulmonary fibrosis, is highly safe, and can be taken for a long period of time. The search for substances is desired.
ヒドロキシシナモイル誘導体の１種である１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースは、腎上皮ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラジカル消去効果および当該細胞の酸化的損傷に対する保護効果を有すること（非特許文献２）等が報告されている。
1-Cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose, which is one of the hydroxycinamoyl derivatives, has a radical scavenging effect on renal epithelial LLC-PK1 cells and a protective effect against oxidative damage to the cells (Non-Patent
しかしながら、ヒドロキシシナモイル誘導体がＨｓｐの発現促進作用を有することはこれまでに報告されていない。 However, it has not been reported so far that the hydroxycinamoyl derivative has an Hsp expression promoting action.
本発明の課題は、安全性が高く、長期摂取可能な、新たなＨｓｐ発現促進剤を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a new Hsp expression promoter that is highly safe and can be ingested for a long period of time.
本発明者は、多くの天然物の中からＨｓｐ発現促進剤を見出すべく検討した結果、特定のヒドロキシシナモイル誘導体が優れたＨｓｐ発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。 As a result of studying to find an Hsp expression-promoting agent from many natural products, the present inventor has found that a specific hydroxycinamoyl derivative has an excellent Hsp expression-promoting effect, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。
That is, the present invention relates to the following 1) to 6).
1) A heat shock protein expression promoter containing a hydroxycinamoyl derivative represented by the following general formula (1) as an active ingredient.
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
２）Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする１）の熱ショックタンパク質発現促進剤。
３）次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進用食品。
(In the formula, R1 to R4 represent any of a cinnapoyl group, a ferroyl group and a hydrogen atom, at least one of R1 to R4 is a cinnapoyl group, and at least one of R1 to R4 is a ferroyl group).
2) The heat of 1) containing a hydroxycinamoyl derivative (1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose) in which R1 is a cinnapoyl group, R2 is a ferroyl group, and R3 and R4 are hydrogen atoms as active ingredients. Shock protein expression promoter.
3) A food for promoting heat shock protein expression containing a hydroxycinamoyl derivative represented by the following general formula (1) as an active ingredient.
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
４）Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする３）に記載の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
５）熱ショックタンパク質がＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上である１）若しくは２）の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は３）若しくは４）の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
６）熱ショックタンパク質がＨｓｐ７０である１）若しくは２）の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は３）若しくは４）の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
(In the formula, R1 to R4 represent any of a cinnapoyl group, a ferroyl group and a hydrogen atom, at least one of R1 to R4 is a cinnapoyl group, and at least one of R1 to R4 is a ferroyl group).
4) Described in 3), which comprises a hydroxycinamoyl derivative (1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose) in which R1 is a cinnapoyl group, R2 is a ferroyl group, and R3 and R4 are hydrogen atoms. Heat shock protein expression promoting food.
5) One or more heat shock protein expression promoters selected from the group consisting of Hsp90α, Hsp90β, Hsp70 and Hsp40, or 3) or 4) for promoting heat shock protein expression. Food.
6) The heat shock protein expression promoter of 1) or 2) whose heat shock protein is Hsp70, or the heat shock protein expression promoting food of 3) or 4).
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、ケールやブロッコリーから容易に取得可能であり、長期摂取可能である。したがって、本発明のＨｓｐ発現促進剤は、安全性の高いＨｓｐ発現促進剤として、Ｈｓｐが関与する疾患、例えば肺線維症の予防治療に有用である。 The hydroxycinamoyl derivative of the present invention can be easily obtained from kale or broccoli and can be ingested for a long period of time. Therefore, the Hsp expression promoter of the present invention is useful as a highly safe Hsp expression promoter for the preventive treatment of diseases involving Hsp, for example, pulmonary fibrosis.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は前記一般式（１）で表されるものであり、式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である。本発明において、シナポイル基は下記式（ａ）で表される基であり、フェルロイル基は下記式（ｂ）で表される基である。 The hydroxycinamoyl derivative of the present invention is represented by the general formula (1), in which R1 to R4 represent any of a cinnapoyl group, a ferroyl group and a hydrogen atom, and at least one of R1 to R4. One is a cinnapoyl group, and at least one of R1 to R4 is a ferroyl group. In the present invention, the cinapoil group is a group represented by the following formula (a), and the ferroyl group is a group represented by the following formula (b).
また、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体のうち、Ｈｓｐ発現促進作用の点から、前記一般式（１）において、Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子である化合物（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）が好ましい。１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースは下記式で示される化合物である。 Further, among the hydroxycinamoyl derivatives of the present invention, from the viewpoint of promoting Hsp expression, in the general formula (1), R1 is a cinnapoyl group, R2 is a ferroyl group, and R3 and R4 are hydrogen atoms. The compound (1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose) is preferred. 1-Cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose is a compound represented by the following formula.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、植物体から抽出・精製することにより取得することができる。植物体からの抽出・精製は、例えば、ケール、ブロッコリー、キャベツ等のアブラナ科植物の葉、茎等から溶剤抽出して得られる抽出物を、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を用いて分離・精製することにより得ることができる。以下に、ケールから本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の１つである、１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースの単離例を示す。 The hydroxycinamoyl derivative of the present invention can be obtained by extracting and purifying from a plant. For extraction / purification from plants, for example, an extract obtained by solvent extraction from leaves, stems, etc. of Abrana family plants such as kale, broccoli, cabbage, etc. is subjected to column chromatography, ion exchange chromatography, high-speed liquid chromatography, etc. It can be obtained by separating and purifying using an appropriate separation and purification means such as. The following shows an example of isolation of 1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose, which is one of the hydroxycinamoyl derivatives of the present invention, from kale.
１）ケール葉を細断及び／又は粉砕した後、搾汁処理することにより得られるケール搾汁を熱風乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末化したケール搾汁の粉末にメタノール水溶液を加えて攪拌抽出し、遠心分離してケール抽出物を得る。
２）１）で得られたケール抽出物を、ＯＤＳカラム（例えば、ＩｎｅｒｔＳｅｐ Ｃ１８カラム）に吸着させ、カラムに吸着している画分を６０％メタノールで溶出させ，濃縮乾固して、ポリフェノール画分を得る。
３）２）で得られた濃縮物を５％アセトニトリル−０．２％酢酸に溶解し、分取ＨＰＬＣ（例えば、ＯＤＳカラム（例えばＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム）、移動相（溶離液Ａ：５％アセトニトリル−０．２％酢酸、溶離液Ｂ：９５％アセトニトリル−０．２％酢酸）によるグラジエント溶出）に供して図１Ａに示す５画分（Ｆ１〜Ｆ５）を得、さらにＦ４画分を前記分取ＨＰＬＣと同様の条件のＨＰＬＣに供して図１Ｂに示す８の画分（Ｆ４−１〜Ｆ４−８）を得、Ｆ４−７画分から１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを単離する。
1) After shredding and / or crushing kale leaves, the kale juice obtained by squeezing the kale leaves is pulverized by hot air drying, freeze drying, spray drying, etc., and an aqueous methanol solution is added to the kale juice powder. Extract by stirring and centrifuge to obtain kale extract.
2) The kale extract obtained in 1) is adsorbed on an ODS column (for example, InertSep C18 column), the fraction adsorbed on the column is eluted with 60% methanol, concentrated to dryness, and polyphenol image. Get minutes.
3) The concentrate obtained in 2) is dissolved in 5% acetonitrile-0.2% acetic acid, preparative HPLC (eg, ODS column (eg, Inertsil ODS-3 column)), mobile phase (eluent A: 5%). Acetonitrile-0.2% acetic acid, eluent B: 95% acetonitrile-0.2% acetic acid) was used for gradient elution) to obtain 5 fractions (F1 to F5) shown in FIG. The fractions (F4-1 to F4-8) shown in FIG. 1B were obtained by subjecting to HPLC under the same conditions as the preparative HPLC, and 1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose was simply added from the F4-7 fraction. Release.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、植物体から抽出したものをそのまま用いてもよく、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。なお、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は化学合成によっても得ることができる。また、本発明のＨｓｐ発現促進剤として、ヒドロキシシナモイル誘導体の含量が高いケール等の植物を使用してもよい。これらの植物は植物体全体、または葉、茎、根、花蕾等植物体の一部を使用してもよく、これらをそのまま、あるいは加熱、破砕、搾汁等の処理を行ったものを使用してもよい。また、植物体における本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の含量を指標として、ヒドロキシシナモイル誘導体の含量が高く、Ｈｓｐ発現促進効果が高いケール等の植物新品種の開発を行うことができる。 As the hydroxycinamoyl derivative of the present invention, the one extracted from the plant body may be used as it is, or further, a known separation and purification method may be appropriately combined to increase the purity thereof. Examples of the purification means include organic solvent precipitation, centrifugation, limit filtration membrane, high performance liquid chromatograph, column chromatograph and the like. The hydroxycinamoyl derivative of the present invention can also be obtained by chemical synthesis. Moreover, as the Hsp expression promoter of the present invention, a plant such as kale having a high content of a hydroxycinamoyl derivative may be used. For these plants, the whole plant body or a part of the plant body such as leaves, stems, roots and flower buds may be used, and these plants may be used as they are or after being heated, crushed, squeezed or the like. You may. In addition, using the content of the hydroxycinamoyl derivative of the present invention in the plant as an index, it is possible to develop a new plant variety such as kale, which has a high content of the hydroxycinamoyl derivative and a high Hsp expression promoting effect.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、後記実施例に示すように、Ｈｓｐ７０の発現促進作用を有する。したがって、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、Ｈｓｐ発現促進剤となり、Ｈｓｐ発現促進のために使用できる。
Ｈｓｐには、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０（Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ３２等があり、本発明のＨｓｐ発現促進剤が発現を促進させるＨｓｐは特に限定されるものではないが、Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Ｈｓｐ７０がより好ましい。
Ｈｐｓは、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり、分子シャペロンとして機能するが、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ３２等は、Ｈｓｐの中でも主要な分子種、若しくは主要な分子種のコファクターであり、これらの発現が促進されると、より強いＨｓｐの分子シャペロン機能が期待できる。
肺線維症は、過剰なコラーゲンと他の細胞外マトリックスの蓄積により肺組織が線維化した症状をいう。中でも、特発性肺線維症は、５年生存率が２０〜４０％の予後不良の慢性難治性疾患である。近年、肺組織の線維化の予防および治療には、Ｈｓｐが関与していることが報告されている（非特許文献１）。したがって、Ｈｓｐ発現促進剤は、肺線維症の予防及び治療に有用である。肺線維症は、難病であり、通常、副作用の多いステロイド療法が行われている疾患であることから、安全性が高く、長期間摂取可能なケール又はその加工物により予防及び治療できることは、極めて有益である。
The hydroxycinamoyl derivative of the present invention has an action of promoting the expression of Hsp70, as shown in Examples described later. Therefore, the hydroxycinamoyl derivative of the present invention becomes an Hsp expression promoter and can be used for promoting Hsp expression.
Hsp includes Hsp104, Hsp90 (Hsp90α, Hsp90β), Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp40, Hsp32 and the like. , Hsp90β, Hsp70, Hsp40, one or more selected from the group is preferable, and Hsp70 is more preferable.
HPs is a protein whose expression increases and protects cells when cells are exposed to stress conditions such as heat, and functions as a molecular chaperone. Hsp104, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp40, Hsp32 Etc. are major molecular species of Hsp or cofactors of major molecular species, and when their expression is promoted, a stronger molecular chaperone function of Hsp can be expected.
Pulmonary fibrosis is a condition in which lung tissue becomes fibrotic due to the accumulation of excess collagen and other extracellular matrix. Among them, idiopathic pulmonary fibrosis is a chronic intractable disease with a poor prognosis with a 5-year survival rate of 20 to 40%. In recent years, it has been reported that Hsp is involved in the prevention and treatment of fibrosis of lung tissue (Non-Patent Document 1). Therefore, Hsp expression promoters are useful for the prevention and treatment of pulmonary fibrosis. Since pulmonary fibrosis is an intractable disease and is usually treated with steroid therapy, which has many side effects, it is extremely safe to prevent and treat it with kale or its processed products that can be ingested for a long period of time. It is beneficial.
本発明において、「Ｈｓｐの発現促進」とは、Ｈｓｐ ｍＲＮＡへのＨｓｐ遺伝子の転写を誘導又は促進すること、Ｈｓｐタンパク質へのＨｓｐ ｍＲＮＡの翻訳を誘導又は促進することが挙げられる。 In the present invention, "promotion of Hsp expression" includes inducing or promoting transcription of Hsp gene into Hsp mRNA, and inducing or promoting translation of Hsp mRNA into Hsp protein.
上記のＨｓｐ発現促進剤、Ｈｓｐ発現促進用食品は、Ｈｓｐの発現を促進するため、肺線維症を予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
尚、上記食品には、一般飲食品のほか、Ｈｓｐの発現促進、肺線維症の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品等が包含される。
The above Hsp expression promoters and Hsp expression promoting foods are used as pharmaceuticals, quasi-drugs, supplements or foods for preventing or ameliorating pulmonary fibrosis in order to promote Hsp expression, or to be added to these. Can be a material or formulation of.
In addition to general foods and drinks, the above foods include foods with the concept of promoting Hsp expression, prevention or improvement of pulmonary fibrosis, and labeling that fact as necessary, foods with functional claims, foods for specified health use, etc. Is included.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。 The above-mentioned pharmaceutical products (including quasi-drugs) containing the hydroxycinamoyl derivative of the present invention can be administered in any administration form, but oral administration is preferable. Upon administration, the active ingredient can be mixed with a solid or liquid pharmaceutical non-toxic carrier suitable for administration methods such as oral administration, rectal administration, and injection, and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。 Examples of such a preparation include solids such as tablets, granules, powders and capsules, solutions, suspensions, liquids such as emulsions, lyophilizers and the like. These preparations can be prepared by conventional means on the preparation. Examples of the above-mentioned pharmaceutical non-toxic carrier include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acid, gelatin and albumin. , Water, physiological saline and the like. Further, if necessary, conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, tonicity agents, and excipients can be appropriately added.
また、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を配合した上記食品の形態は、各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
Further, as the form of the above-mentioned food containing the hydroxycinamoyl derivative of the present invention, in addition to various food compositions, the same form (tablets, capsules, syrup, etc.) as the above-mentioned orally-administered preparation can be mentioned.
To prepare various forms of foods, the hydroxycinamoyl derivatives of the invention alone or with other food materials, solvents, softeners, oils, emulsifiers, preservatives, fragrances, stabilizers, colorants, Antioxidants, moisturizers, thickeners and the like can be used in appropriate combinations.
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、製剤全質量の０．００１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１質量％である。 The content of the hydroxycinamoyl derivative of the present invention in the above-mentioned pharmaceutical products (including quasi-drugs) and foods varies depending on the mode of use thereof, but is usually 0.001 to 10% by mass, preferably 0.001 to 10% by mass, based on the total mass of the preparation. 0.1 to 1% by mass.
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体として好ましくは０．０１ｍｇ〜５００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｇ、よりさらに好ましくは０．１〜１ｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
When the hydroxycinamoyl derivative of the present invention is used as a drug or food, or in combination with a drug or food, the dose may vary depending on the patient's condition, weight, gender, age or other factors, but is orally administered. In the case of, the daily dose per adult is usually preferably 0.01 mg to 500 g, more preferably 0.1 mg to 100 g, still more preferably 0.1 to 10 g, as the hydroxycinamoyl derivative of the present invention. Even more preferably 0.1 to 1 g.
Further, although the above-mentioned preparation can be administered according to an arbitrary administration plan, it is preferable to administer it once to several times a day and continuously for several weeks to several months.
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。 Hereinafter, the contents of the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
製造例１ １−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースの取得
（１）ケール搾汁（品種名：ハイクロップ）の粉末（ケール搾汁由来の固形分４０％，以下ケール粉末）を使用した。ケール抽出液の調製として，ケール粉末７ｇを７０％メタノール１４ｍＬに懸濁し，ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ，ＰＴ３１００）を用いて氷上で破砕処理（１２，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）を３回行った。次に，超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ，ＳＬＰｅ ４０，先端部６．３５ｍｍ径）を用いて氷上で超音波抽出を行った。遠心分離（４０００ｇ，４℃，１０分間）の上清を，さらに遠心分離（１５，０００×ｇ，４℃，１５分間）し、得た上清を０．４５μｍフィルターで濾過し，凍結乾燥したものをケール抽出物とした。
Production Example 1 1-Cinapoyl-2-ferloylgen Thiobiose acquisition (1) Kale juice (variety name: high crop) powder (40% solid content derived from kale juice, hereinafter kale powder) was used. To prepare the kale extract, 7 g of kale powder was suspended in 14 mL of 70% methanol, and crushed on ice using a polytron homogenizer (KINEMATICA, PT3100) (12,000 rpm, 1 min) three times. Next, ultrasonic extraction was performed on ice using an ultrasonic homogenizer (BRANSON,
（２）次に，固相抽出によりポリフェノール成分の濃縮を行った。ＩｎｅｒｔＳｅｐ Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス，カラムサイズ２ｇ／１２ｍＬ）をメタノール１２ｍＬでコンディショニングし，水１２ｍＬで平衡化し，（１）で調製したケール抽出物を１０％メタノールで溶解した試料１０ｍＬを加えてカラムに吸着させた。続いて，１０％メタノール６ｍＬでカラム洗浄を行った後，カラムに吸着している画分を６０％メタノール４ｍＬで溶出させ，サンプル濃縮機（バイオメディカルサイエンス，ＭＤ２００）で濃縮乾固した。 (2) Next, the polyphenol component was concentrated by solid-phase extraction. An InertSep C18 column (GL Sciences, column size 2 g / 12 mL) was conditioned with 12 mL of methanol, equilibrated with 12 mL of water, and the kale extract prepared in (1) was adsorbed on the column by adding 10 mL of a sample dissolved in 10% methanol. I let you. Subsequently, the column was washed with 6 mL of 10% methanol, the fraction adsorbed on the column was eluted with 4 mL of 60% methanol, and concentrated to dryness with a sample concentrator (Biomedical Science, MD200).
（３）（２)で得られた濃縮乾燥物を６０％メタノールに溶解し、以下に示す条件で分取ＨＰＬＣに供して図１Ａに示す５画分（Ｆ１〜Ｆ５）を得、さらにＦ４画分を再度ＨＰＬＣに供して図１Ｂに示す８の画分（Ｆ４−１〜Ｆ４−８）を得、Ｆ４−７画分から１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを単離した。なお、Ｆ４画分のＨＰＬＣ条件は（２）で得られた濃縮乾燥物を分画するＨＰＬＣ条件と同一である。
＜分取ＨＰＬＣの条件＞
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム（ジーエルサイエンス，５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）
・インジェクション量：５００μＬ
・流速：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
・移動相：溶離液Ａ（５％アセトニトリル−０．２％酢酸）、溶離液Ｂ（９５％アセトニトリル−０．２％酢酸）
・グラジエント条件：表１の通り
・カラム温度４０℃
・検出：ＵＶ２８０ｎｍ
・カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａｖｐ（島津製作所），ポンプ：ＰＵ−２０８９ Ｐｌｕｓ（日本分光），ＵＶ検出器：ＵＶ−２０７５ Ｐｌｕｓ（日本分光）
(3) The concentrated dry product obtained in (2) was dissolved in 60% methanol and subjected to preparative HPLC under the conditions shown below to obtain 5 fractions (F1 to F5) shown in FIG. 1A, and further F4 fraction. The minutes were subjected to HPLC again to obtain the 8 fractions (F4-1 to F4-8) shown in FIG. 1B, and 1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose was isolated from the F4-7 fraction. The HPLC conditions for the F4 fraction are the same as the HPLC conditions for fractionating the concentrated dry product obtained in (2).
<Conditions for preparative HPLC>
-Column: Inertsil ODS-3 column (GL Sciences, 5 mm, 10 x 250 mm)
・ Injection amount: 500 μL
・ Flow velocity: 5.0 mL / min
Mobile phase: Eluent A (5% acetonitrile-0.2% acetic acid), Eluent B (95% acetonitrile-0.2% acetic acid)
・ Gradient conditions: as shown in Table 1 ・
-Detection: UV280nm
-Column oven: CTO-10Avp (Shimadzu Corporation), Pump: PU-2089 Plus (JASCO Corporation), UV detector: UV-2075 Plus (JASCO Corporation)
＜Ｆ４−７画分から単離された化合物（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）のＮＭＲ及びマススペクトル）＞
1H-NMR(800MHz、DMSO-d6)δ;
7.55 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7’), 7.53 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7 ), 7.27 (1H, s, H-2’), 7.06 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6’), 6.99 (2H, s, H-2, 6), 6.76 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5’), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8’), 5.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, glc-1), 4.91 (1H, dd, J = 9.0, 9.0 Hz, glc-2), 4.20 (1H, d, J = 7.8 Hz, glc-1’), 4.04 (1H, d, J = 10.2 Hz, glc-6a), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.77 (6H, s, -OCH3), 3.65-3.59 (4H, m, glc-3,5, 6b), 3.45 (1H, m, glc-4), 3.13 (1H, dd, J = 8.6, 8.6 Hz, glc-3’), 3.06 (3H, m, glc-4,4’,5’), 2.98 (1H, dd, J = 8.4, 8.3 Hz, glc-2’).
<NMR and mass spectrum of the compound (1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose) isolated from the F4-7 fraction)>
1 1 H-NMR (800MHz, DMSO-d 6 ) δ;
7.55 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7'), 7.53 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7), 7.27 (1H, s, H-2'), 7.06 (1H, d , J = 8.2 Hz, H-6'), 6.99 (2H, s, H-2, 6), 6.76 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8'), 5.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, glc-1), 4.91 (1H, dd, J = 9.0 , 9.0 Hz, glc-2), 4.20 (1H, d, J = 7.8 Hz, glc-1'), 4.04 (1H, d, J = 10.2 Hz, glc-6a), 3.79 (3H, s, -OCH 3 ), 3.77 (6H, s, -OCH 3 ), 3.65-3.59 (4H, m, glc-3,5, 6b), 3.45 (1H, m, glc-4), 3.13 (1H, dd, J = 8.6, 8.6 Hz, glc-3'), 3.06 (3H, m, glc-4,4', 5'), 2.98 (1H, dd, J = 8.4, 8.3 Hz, glc-2').
13C-NMR(200MHz、DMSO-d6)δ;
165.7 (C-9), 165.0 (C-9’), 149.3 (C-4’), 148.1 (C-3,5), 148.1 (C-3’), 147.4 (C-7), 145.5 (C-7’), 138.8 (C-4), 125.5 (C-11), 123.9 (C-1), 123.4 (C-6’), 115.4 (C-5’), 114.0 (C-8’), 113.5 (C-8), 106.6 (C-2’), 103.1 (glc-1’), 91.9 (glc-1), 76.9 (glc-5’), 76.7 (glc-5), 76.4 (glc-3’), 73.4 (glc-3), 72.5 (glc-2’) 70.0 (glc-4’), 69.5 (glc-4), 67.8 (glc-6), 61.0 (glc-6’), 56.1 (OCH3), 55.6 (OCH3).
13 C-NMR (200MHz, DMSO-d 6 ) δ;
165.7 (C-9), 165.0 (C-9'), 149.3 (C-4'), 148.1 (C-3,5), 148.1 (C-3'), 147.4 (C-7), 145.5 (C -7'), 138.8 (C-4), 125.5 (C-11), 123.9 (C-1), 123.4 (C-6'), 115.4 (C-5'), 114.0 (C-8'), 113.5 (C-8), 106.6 (C-2'), 103.1 (glc-1'), 91.9 (glc-1), 76.9 (glc-5'), 76.7 (glc-5), 76.4 (glc-3) '), 73.4 (glc-3), 72.5 (glc-2') 70.0 (glc-4'), 69.5 (glc-4), 67.8 (glc-6), 61.0 (glc-6'), 56.1 (OCH) 3 ), 55.6 (OCH 3 ).
ESI-MS (negative ion mode) m/z 723.2143 （[M-H]-） ESI-MS (negative ion mode) m / z 723.2143 ([MH] - )
実施例１ Ｈｓｐ発現促進作用
（１）ＴＩＧ−１細胞の培養
正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１は，独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＴＩＧ−１細胞は，１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清），５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンを含むＭＥＭ−α培地でＣＯ２インキュベーター（ＳＣＡ−８０ＤＲ，ＡＳＴＥＣ社）を用いて３７℃，５％ＣＯ２下で、終濃度５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように６ｃｍ２シャーレに１．５ｍＬ播種し，２日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを顕微鏡により確認した後，順次実験に使用した。本実験では，集団倍化数（ＰＤＬ）＝２７〜３９のＴＩＧ−１細胞を使用した。
Example 1 Hsp expression promoting action (1) Culture of TIG-1 cells Normal human fibroblasts TIG-1 were purchased from JCRB Cell Bank (Osaka, Japan), National Institutes of Biomedical Innovation. TIG-1 cells were prepared in MEM-α medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), 50 μg / mL streptomycin, 50 units / mL penicillin at 37 ° C., 5% using a CO 2 incubator (SCA-80DR, ASTEC). Under CO 2 , 1.5 mL was seeded in 6 cm 2 petri dishes so as to have a final concentration of 5.0 × 10 4 cells / mL, and cultured for 2 days. After confirming that it became 70-90% confluent by a microscope, it was used in the experiment sequentially. In this experiment, TIG-1 cells with population doubling number (PDL) = 27-39 were used.
（２）遺伝子発現解析
製造例１で得られた１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース（Ｆ４−７画分）を（１）で得られたＴＩＧ−１細胞に終濃度８０μｇ／ｍＬとなるよう６ｃｍ２シャーレに１．５ｍＬ添加し，３７℃，５％ＣＯ２下で２４時間培養した。また、（１）で得られたＴＩＧ−１細胞に１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを添加せずに前記と同様に培養したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。両サンプルの培地を除去し，ＰＢＳで２回洗浄し，１シャーレ当たり１．４ｍＬのＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター社）を加え，ピペッティングにより細胞を回収し，Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後，ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を使ってｃＤＮＡを合成し，これをテンプレートＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲ法によりＨｓｐ７０遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲではＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ ｋｉｔ（Ｋａｐａ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、使用したＨＳＰＡ１（Ｈｓｐ７０）、β−ａｃｔｉｎのプライマーは表２に示した。反応溶液は，テンプレートＤＮＡ含有試料２μＬ，プライマー溶液（５μｍｏｌ／μＬ）各０．４μＬ，ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０μＬ，および滅菌水７．６μＬを用いて全量を２０μＬとした。反応条件は，プレインキュベートを９５℃，１分間行った後，熱変性を９５℃，３０秒間，アニーリングを６０℃，３０秒間，伸長反応を７２℃，１分間で，４０サイクルとした。ハウスキーピング遺伝子のβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡを内部標準遺伝子とし，Ｈｓｐ７０ ｍＲＮＡの発現量をＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｉｎｇｌｅ（タカラバイオ社）で測定し，Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（タカラバイオ社）により比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて解析した。結果を図２に示した。図２においては、ｃｏｎｔｒｏｌのｍＲＮＡ発現量を１とした相対値で示した。
(2) Gene expression analysis The 1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose (F4-7 fraction) obtained in Production Example 1 was applied to the TIG-1 cells obtained in (1) at a final concentration of 80 μg / mL. 1.5 mL was added to a 6 cm 2 petri dish, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Further, the TIG-1 cells obtained in (1) were cultured in the same manner as described above without adding 1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose, and used as a control. The media of both samples were removed, washed twice with PBS, 1.4 mL of Tri Reagent (Molecular Research Center) was added per petri dish, cells were collected by pipetting, total RNA was extracted, and then Revertra Ace. (Registered trademark) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Toyobo) was used to synthesize cDNA, and the expression level of the Hsp70 gene was measured by real-time PCR using this as template DNA. In real-time PCR, KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit (Kapa BioSystems) was used, and the primers of HSPA1 (Hsp70) and β-actin used are shown in Table 2. The total amount of the reaction solution was 20 μL using 2 μL of the template DNA-containing sample, 0.4 μL of each of the primer solution (5 μmol / μL), 10 μL of SYBR Premix Ex Taq, and 7.6 μL of sterile water. The reaction conditions were pre-incubation at 95 ° C. for 1 minute, heat denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 1 minute for 40 cycles. Using β-actin mRNA, which is a housekeeping gene, as an internal standard gene, the expression level of Hsp70 mRNA was measured with Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System (Takara Bio Inc.), and Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System was measured. Analysis was performed by Single Software (Takara Bio Inc.) using the comparative Ct method (ΔΔCt method). The results are shown in FIG. In FIG. 2, it is shown as a relative value with the mRNA expression level of Control as 1.
図２より、Ｆ４−７画分（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）には、Ｈｓｐ７０遺伝子発現量の上昇が認められ、Ｈｓｐ７０発現促進作用を有することが示された。 From FIG. 2, an increase in the expression level of the Hsp70 gene was observed in the F4-7 fraction (1-cinapoyl-2-ferloylgenthiobiose), indicating that it has an Hsp70 expression-promoting effect.
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