JP6544768B2 - Fluorescent probe and screening method of striga germination regulator using the same - Google Patents
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Description
本発明は、ストリゴラクトン受容体活性を簡便且つ効率的に測定できる蛍光プローブ、及びそれを用いたストライガ発芽調節物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a fluorescent probe which can measure strigolactone receptor activity simply and efficiently, and to a screening method of a striatal sprout regulator using it.
ストライガ属に属する植物（本明細書において、「ストライガ」と略記することもある）は、トウモロコシ、コメ、マメ類等の主要作物に寄生し、生育不良を引き起こす。その被害は、アフリカ、アジア、オーストラリア、アメリカ等に及んでおり、特にアフリカにおいては、被害額は年間１００億ＵＳドルに上るといわれている。 A plant belonging to the genus Striga (sometimes abbreviated as "striga" in the present specification) infests main crops such as corn, rice, legumes and the like to cause poor growth. The damage extends to Africa, Asia, Australia, the United States, etc., and the amount of damage is said to be as high as US $ 10 billion annually in Africa.
ストライガの種子は、土壌中で長期間に亘って生存することができ、周辺の宿主作物の根から分泌されるストリゴラクトンを感知し、これにより発芽し、宿主作物の根に寄生する。そして、地上に現れたストライガの植物体により生成される種子が、周辺の土壌をまた汚染する。このため、一旦土壌がストライガの種子に汚染されてしまうと、何も対策をしなければ、その土壌ではストライガ被害が続くこととなり、また種子で汚染された土壌範囲も徐々に広がっていくこととなる。 The seeds of Striga are able to survive in soil for a long period of time, sense strigolactones secreted from the roots of surrounding host crops, and thus germinate and infest the roots of host crops. And the seeds produced by the plants of Striga that appeared on the ground contaminate the surrounding soil again. For this reason, once the soil is contaminated with the seeds of strikes, if no measures are taken, the strikes will continue to be damaged in the soil, and the soil range contaminated with the seeds will also gradually expand. Become.
ストライガの対策としては、ストライガの種子に汚染された土壌に、ストライガ発芽を誘導又は抑制する物質（ストライガ発芽調節物質）を施用することが有効であるといわれている。例えば、宿主植物がいない環境下でストライガの発芽を誘導する物質を施用すれば、発芽したストライガは寄生できずに枯死することとなり、これにより土壌を浄化することができる。また、ストライガの発芽を抑制する物質を施用すれば、ストライガに寄生されることなく宿主植物を栽培することが可能となる。そこで、ストライガの発芽をより効率的に誘導又は抑制する物質の開発が求められている。 It is said that it is effective to apply the substance (striga germination control substance) which induces or suppresses striga germination to the soil polluted by the seeds of striga as a countermeasure against striga. For example, by applying a substance that induces germination of the striga under an environment in which there is no host plant, the germinated striga can not infest, and will die, thereby cleaning the soil. In addition, by applying a substance that inhibits the germination of the striga, it becomes possible to grow host plants without being infested by the striga. Therefore, there is a need for the development of substances that induce or inhibit the germination of strikers more efficiently.
ストライガ発芽調節物質を開発する場合は、通常、ストライガの種子に候補物質を作用させ、その発芽誘導率の変化を指標とすることにより、ストライガ発芽調節物質としての有効性を試験する（非特許文献１）。ただ、このような試験は、１つの候補物質の有効性を試験するにも、種子の準備、発芽数の測定等、多くの手間を要し、多数の候補物質をハイスループット処理することが困難である。また、ストライガ種子を使用する場合、該種子を植物防疫所の許可を経て輸入する必要があり、また許可を受けた実験スペースでしか使用できないという問題がある。さらに、発芽を指標に化合物を同定できたとしても、標的タンパク質が明らかでない場合、合理的な設計を通して改良していくことは困難である。 When developing a striga germination regulator, the effectiveness as a striga germination regulator is usually tested by acting a candidate substance on the seeds of the striga and using the change in the rate of induction of germination as an indicator (Non-patent literature) 1). However, such tests also require much time and effort to test the effectiveness of one candidate substance, such as preparation of seeds and measurement of the number of sprouts, and it is difficult to process a large number of candidate substances with high throughput It is. In addition, there is a problem that it is necessary to import the seeds with permission of the plant quarantine station when using strikea seeds, and that they can be used only in a licensed experimental space. Furthermore, even if a compound can be identified using sprouting as an indicator, it is difficult to improve through rational design if the target protein is not clear.
本発明は、ストライガ種子を用いることなく、ストライガ発芽調節物質をより簡便且つより効率的にスクリーニングする方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for screening a striga germination regulator more simply and more efficiently without using a striga seed.
本発明者等は鋭意研究を進めた結果、一般式（１）又は（２）で表わされる化合物を蛍光プローブとして用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、完成されたものである。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problems can be solved by using the compound represented by the general formula (1) or (2) as a fluorescent probe. The present invention has been completed as a result of further studies based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
項１．
一般式（１）又は（２）：
Item 1.
General formula (1) or (2):
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ１及びＲ２が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ３及びＲ４が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ５は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ６は、保護されていてもよい水酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、又は活性エステル基であり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、又はアルキル基であり、
ｎは、０又は１〜３の整数である。］
で表わされる化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物．
項２．
Ｒ１及びＲ２の一方が水素原子であり他方がアルキル基であり、且つＲ３及びＲ４の一方が水素原子であり他方がアルキル基である、項１に記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物．
項３．
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０が水素原子である、項１又は２に記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物．
項４．
ｎが０である、項１〜３のいずれかに記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物．
項５．
項１〜４のいずれかに記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物を含有する、蛍光プローブ．
項６．
ストリゴラクトン受容体活性測定用である、項５に記載の蛍光プローブ．
項７．
工程（ａ）〜（ｃ）を含むストライガ発芽調節物質のスクリーニング方法：
（ａ）被検物質の存在下で、ストリゴラクトン受容体と項５又は６に記載の蛍光プローブとを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記蛍光プローブの分解物の蛍光強度を測定し、該蛍光強度（被検蛍光強度）を、被検物質を接触させない場合の蛍光強度（対照蛍光強度）と比較する工程、
（ｃ）被検蛍光強度と対照蛍光強度とが有意に相違している場合に、被検物質を、ストライガ発芽調節物質として選択する工程．
[In the formula,
R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group,
R 1 and R 2 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 3 and R 4 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 5 is a hydrogen atom or an alkyl group,
R 6 is a hydroxyl group which may be protected, an alkoxy group, a halogen atom, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, a sulfo group, or an active ester group,
R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group,
n is an integer of 0 or 1 to 3. ]
Or a salt, hydrate or solvate thereof.
Item 2.
The compound according to item 1, wherein one of R 1 and R 2 is a hydrogen atom, and the other is an alkyl group, and one of R 3 and R 4 is a hydrogen atom and the other is an alkyl group, or a salt thereof Hydrate or solvate.
Item 3.
The compound according to Item 1 or 2, or a salt, hydrate or solvate thereof, wherein R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom.
Item 4.
The compound according to any one of Items 1 to 3, wherein n is 0, or a salt, a hydrate or a solvate thereof.
Item 5.
A fluorescent probe comprising the compound according to any one of Items 1 to 4, or a salt, hydrate or solvate thereof.
Item 6.
Item 6. The fluorescent probe according to Item 5, which is for measuring strigolactone receptor activity.
Item 7.
Method of screening for a striga germination regulator comprising steps (a) to (c):
(A) contacting the strigolactone receptor with the fluorescent probe according to item 5 or 6 in the presence of a test substance;
(B) After step (a), the fluorescence intensity of the decomposed product of the fluorescent probe is measured, and the fluorescence intensity (analyzed fluorescence intensity) is the fluorescence intensity (control fluorescence intensity) when the analyte is not brought into contact Comparing process,
(C) selecting a test substance as a striga germination regulator when the test fluorescence intensity and the control fluorescence intensity are significantly different.
本発明によれば、一般式（１）又は（２）で表わされる化合物を蛍光プローブとして用いることにより、発芽試験を行う従来の方法に比べて遥かに簡便且つ効率的に、ストライガ発芽調節物質をスクリーニングすることができる。また、発芽試験は許可を受けた実験スペースでしか行うことができないところ、本発明のスクリーニング方法はこのような制約無く実施することができる。さらに、得られたストライガ発芽調節物質について、本発明で初めて見出されたストリゴラクトン受容体との相互作用等の解析、最適化合物の予測等を通じて、より合理的にストライガ発芽調節物質を改良することも可能である。 According to the present invention, by using the compound represented by the general formula (1) or (2) as a fluorescent probe, it is possible to use a striga germination regulator much more simply and efficiently as compared with the conventional method of conducting a germination test. It can be screened. Also, although the germination test can only be performed in a licensed experimental space, the screening method of the present invention can be performed without such limitations. Furthermore, the striga sprout regulators obtained can be rationally improved through analysis of interactions with the strigolactone receptor, etc. which were first found in the present invention, prediction of optimum compounds, etc. It is also possible.
一般式（１）又は（２）で表わされる化合物は、ストリゴラクトン受容体による加水分解を受け、ストリゴラクトンと同様の生理活性を発揮する。そして、該化合物は、この加水分解により特定の蛍光物質を生成する。よって、該化合物を蛍光プローブとして用いることにより、上記スクリーニングのみならず、ストリゴラクトン受容体活性の測定や、該受容体が関連する種々の生命現象の解析（例えば、ストライガ発芽過程におけるストリゴラクトン受容体活性の変化の、時間的、空間的な解析等）が可能となる。 The compounds represented by the general formula (1) or (2) are hydrolyzed by the strigolactone receptor and exert the same physiological activity as strigolactone. And this compound produces | generates a specific fluorescent substance by this hydrolysis. Therefore, by using the compound as a fluorescent probe, not only the above screening but also measurement of strigolactone receptor activity and analysis of various biological phenomena related to the receptor (for example, strigolactone in the striga sprouting process) Temporal, spatial analysis etc. of changes in receptor activity is possible.
１．化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物
一般式（１）又は（２）：
1. Compound, or a salt, hydrate or solvate thereof General formula (1) or (2):
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ１及びＲ２が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ３及びＲ４が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ５は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ６は、保護されていてもよい水酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、又は活性エステル基であり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、又はアルキル基であり、
ｎは、０又は１〜３の整数である。］
で表わされる化合物（本明細書において、「本発明の化合物」と示すこともある。）、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物について説明する。
[In the formula,
R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group,
R 1 and R 2 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 3 and R 4 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 5 is a hydrogen atom or an alkyl group,
R 6 is a hydroxyl group which may be protected, an alkoxy group, a halogen atom, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, a sulfo group, or an active ester group,
R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group,
n is an integer of 0 or 1 to 3. ]
The compound represented by (hereinafter sometimes referred to as “the compound of the present invention”), or a salt, hydrate or solvate thereof is described.
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、Ｒ３及びＲ４は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよい。 R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group, and R 1 and R 2 may be substituted by an alkyl group together with adjacent carbon atoms bonded to each other R 3 and R 4 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group together with adjacent carbon atoms.
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で示されるアルキル基は、直鎖状又は分枝状のいずれでもよいが、直鎖状のものが好ましい。該アルキル基の炭素数は、例えば１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２である。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられる。 The alkyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched, but is preferably linear. The carbon number of the alkyl group is, for example, 1 to 6, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2. As the alkyl group, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n- A hexyl group, 3-methyl pentyl group, etc. are mentioned.
Ｒ１及びＲ２或いはＲ３及びＲ４が形成するベンゼン環を置換していてもよいアルキル基は、上記「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４で示されるアルキル基」と同様である。該ベンゼン環の置換数は、特に制限されないが、例えば０〜３個、好ましくは０〜１個である。 The alkyl group which may substitute the benzene ring formed by R 1 and R 2 or R 3 and R 4 is the same as the above “alkyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 or R 4 ”. . The number of substitution of the benzene ring is not particularly limited, and is, for example, 0 to 3, and preferably 0 to 1.
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の態様としては、ストリゴラクトンの構造により近い（すなわちストリゴラクトン受容体に対してより受容され易い）という観点から、好ましくはＲ１及びＲ２並びにＲ３及びＲ４がアルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成しておらず、より好ましくはＲ１及びＲ２の一方が水素原子であり他方がアルキル基であり、且つＲ３及びＲ４の一方が水素原子であり他方がアルキル基であり、さらに好ましくはＲ１及びＲ３が水素原子であり、且つＲ２及びＲ４がアルキル基である。 As an embodiment of R 1 , R 2 , R 3 and R 4 , in view of being closer to the structure of strigolactone (that is, more easily accepted to the strigolactone receptor), it is preferable to preferably R 1 and R 2 and R 3 and R 4 do not form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, more preferably one of R 1 and R 2 is a hydrogen atom and the other is an alkyl group, and R 3 and One of R 4 is a hydrogen atom and the other is an alkyl group, more preferably R 1 and R 3 are hydrogen atoms, and R 2 and R 4 are alkyl groups.
Ｒ５は、水素原子又はアルキル基である。 R 5 is a hydrogen atom or an alkyl group.
Ｒ５で示されるアルキル基は、直鎖状又は分枝状のいずれでもよいが、直鎖状のものが好ましい。該アルキル基の炭素数は、例えば１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３である。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられる。 The alkyl group represented by R 5 may be linear or branched, but is preferably linear. The carbon number of the alkyl group is, for example, 1 to 6, preferably 1 to 4, and more preferably 1 to 3. As the alkyl group, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n- A hexyl group, 3-methyl pentyl group, etc. are mentioned.
Ｒ５は、本発明の化合物の合成がより容易であるという観点から、アルキル基であることが好ましい。 R 5 is preferably an alkyl group from the viewpoint that synthesis of the compound of the present invention is easier.
Ｒ６は、保護されていてもよい水酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、又は活性エステル基である。 R 6 is a hydroxyl group which may be protected, an alkoxy group, a halogen atom, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, a sulfo group, or an active ester group.
Ｒ６で示される保護されていてもよい水酸基における保護基としては、例えば、メトキシメチル基（ＭＯＭ）等のアルコキシアルキル基、２−テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、アセチル基（Ａｃ）等のアルカノイル基等が挙げられる。 Examples of the protecting group at the optionally protected hydroxyl group represented by R 6 include, for example, alkoxyalkyl groups such as methoxymethyl group (MOM), alkanoyl such as 2-tetrahydropyranyl (THP) group and acetyl group (Ac) And the like.
Ｒ６で示されるアルコキシ基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１〜６（特に１〜３）アルコキシ基が挙げられ、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基等が挙げられる。 The alkoxy group represented by R 6 includes, for example, a linear or branched C1 to 6 (especially 1 to 3) alkoxy group, and specifically, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propyloxy group And isopropyloxy groups.
Ｒ６で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。 The halogen atom represented by R 6, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom.
Ｒ６で示されるアルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基等の直鎖又は分枝鎖の（Ｃ１〜６アルコキシ基）カルボニル基が挙げられる。 Examples of the alkoxycarbonyl group represented by R 6 include linear or branched (C1 groups such as methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, n-propyloxycarbonyl group, isopropyloxycarbonyl group, tert-butyloxycarbonyl group and the like) To 6 alkoxy groups) include carbonyl groups.
Ｒ６で示される活性エステル基としては、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が反応性の高い活性エステルに変換された基であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを用いた活性エステル基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＳｕ：Ｓｕはコハク酸イミド基）、カルボン酸を混合酸無水物にした基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ：ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基）、カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）を用いたイミダゾライド基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｉｍ：Ｉｍは１−イミダゾリル基）等が挙げられる。 The active ester group represented by R 6 is a group in which a carboxyl group (—COOH) is converted into a highly reactive active ester, and, for example, an active ester group using N-hydroxysuccinimide (eg, — C (= O) OSu: Su is a succinimide group), a group in which carboxylic acid is mixed acid anhydride (eg, -C (CO) OC (OO) R: R is a C1 to C6 alkyl group), The imidazolide group (For example, -C (= O) -Im: Im is 1-imidazolyl group) etc. which used carbonyl imidazole (CDI) etc. are mentioned.
ｎは、特に制限されるものではないが、例えば０又は１〜３の整数、好ましくは０又は１、より好ましくは０である。 Although n is not particularly limited, it is, for example, 0 or an integer of 1 to 3, preferably 0 or 1, and more preferably 0.
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、又はアルキル基である。 R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group.
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子が挙げられる。 The halogen atom represented by R 7, R 8, R 9 and R 10, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, with preference given to fluorine atom.
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０で示されるアルキル基は、直鎖状又は分枝状のいずれでもよいが、直鎖状のものが好ましい。該アルキル基の炭素数は、例えば１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２である。該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられる。 The alkyl group represented by R 7 , R 8 , R 9 and R 10 may be linear or branched, but is preferably linear. The carbon number of the alkyl group is, for example, 1 to 6, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2. As the alkyl group, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n- A hexyl group, 3-methyl pentyl group, etc. are mentioned.
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の態様としては、よりストリゴラクトン受容体に受容され易いという観点から、好ましくはＲ７及びＲ９が同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、又はアルキル基であり、且つＲ８及びＲ１０が水素原子であり、より好ましくはＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０が全て水素である。 As an embodiment of R 7 , R 8 , R 9 and R 10 , from the viewpoint of being more easily accepted by the strigolactone receptor, preferably R 7 and R 9 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl And R 8 and R 10 are hydrogen atoms, and more preferably R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are all hydrogen.
本発明の化合物としては、安定性等の観点からは、一般式（２）で表わされる化合物が好ましい。 The compound of the present invention is preferably a compound represented by the general formula (2) from the viewpoint of stability and the like.
本発明の化合物の塩としては、特に制限されるものではなく、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられ、塩基性塩の例としては、ナトリウム、及びカリウムなどのアルカリ金属塩、並びにカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。 The salt of the compound of the present invention is not particularly limited, and any of an acid salt and a basic salt can be adopted. Examples of the acid salt include mineral acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate, acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malate Salts, citrates, methanesulphonates, para-toluenesulphonates and the like, and examples of basic salts include sodium and alkali metal salts such as potassium, and alkaline earths such as calcium salts and magnesium salts Metal salts etc. may be mentioned.
本発明の化合物の溶媒和物としては、一般式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩と、溶媒との溶媒和物である限り特に限定されない。溶媒としては、例えばエタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。 The solvate of the compound of the present invention is not particularly limited as long as it is a solvate of the compound represented by the general formula (1) or (2) or a salt thereof and a solvent. Examples of the solvent include ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
一般式（１）又は（２）で表わされる化合物は、公知の合成法、例えばウィリアムソンのエーテル合成法やウルマンのエーテル合成法に従って又は準じて製造することができる。一例として、以下のスキームで合成することができる。 The compounds represented by the general formula (1) or (2) can be produced according to or according to known synthetic methods, for example, ether synthesis of Williamson or ether synthesis of Ullmann. As an example, it can be synthesized by the following scheme.
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びｎは、前記に同じである。］
工程（Ｉ）では、化合物ａと化合物ｂとを触媒の存在下で反応させる工程により、化合物ｃ（一般式（１）で表わされる化合物）を合成する。工程（ＩＩ）では、化合物ｄと化合物ｂとを触媒の存在下で反応させる工程により、化合物ｅ（一般式（２）で表わされる化合物）を合成する。
[Wherein, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and n are as defined above. ]
In step (I), compound c (the compound represented by general formula (1)) is synthesized by the step of reacting compound a with compound b in the presence of a catalyst. In step (II), compound e (the compound represented by the general formula (2)) is synthesized by the step of reacting compound d with compound b in the presence of a catalyst.
工程（Ｉ）において、化合物ｂの使用量は、選択率及び収率の観点から、化合物ａ １モルに対して、通常、０．２〜２モルが好ましく、０．５〜１．５モルがより好ましい。工程（ＩＩ）において、化合物ｂの使用量は、選択率及び収率の観点から、化合物ｄ １モルに対して、通常、２〜５モルが好ましく、２．５〜４モルがより好ましい。 In the step (I), the amount of the compound b to be used is generally preferably 0.2 to 2 mol, and 0.5 to 1.5 mol per mol of the compound a from the viewpoint of selectivity and yield. More preferable. In the step (II), the amount of compound b to be used is generally preferably 2 to 5 mol, and more preferably 2.5 to 4 mol, per 1 mol of compound d, from the viewpoint of selectivity and yield.
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）で使用する触媒としては、特に限定されるものではないが、選択率、収率及び安全性の観点から、例えば炭酸カリウム、酸化銀（Ｉ）、ピリジン、銅、酸化銅（ＩＩ）、水素化ナトリウム等が挙げられ、好ましくは塩基触媒が挙げられ、より好ましくは炭酸カリウム、酸化銀（Ｉ）、ピリジン等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、また、複数併用してもよい。これらの中でも、工程（Ｉ）で使用する触媒としては炭酸カリウムが好ましく、工程（ＩＩ）で使用する触媒としては酸化銀（Ｉ）及びピリジンの組み合わせが好ましい。 The catalyst used in steps (I) and (II) is not particularly limited, but from the viewpoints of selectivity, yield and safety, for example, potassium carbonate, silver (I) oxide, pyridine, copper, Copper (II) oxide, sodium hydride and the like can be mentioned, preferably a base catalyst, and more preferably potassium carbonate, silver (I) oxide, pyridine and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, potassium carbonate is preferable as a catalyst used in step (I), and a combination of silver oxide (I) and pyridine is preferable as a catalyst used in step (II).
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）において、触媒の使用量は、目的化合物が得られる限りにおいて特に限定されず、工程別、触媒の種類別に適宜設定することができる。例えば、工程（Ｉ）において触媒として炭酸カリウムを用いる場合は、選択率及び収率の観点から、化合物ａ １モルに対して、通常、０．２〜２モルが好ましく、０．５〜１．５モルがより好ましい。別の例として、工程（ＩＩ）において酸化銀を用いる場合は、選択率及び収率の観点から、化合物ｄ １モルに対して、通常、２〜５モルが好ましく、２．５〜４モルがより好ましい。 In the steps (I) and (II), the amount of the catalyst used is not particularly limited as long as the target compound can be obtained, and can be set as appropriate for each process and type of catalyst. For example, when using potassium carbonate as a catalyst in step (I), usually 0.2 to 2 mol is preferable, and 0.5 to 1 to 1 mol per 1 mol of the compound a from the viewpoint of selectivity and yield. 5 moles is more preferred. As another example, in the case of using silver oxide in step (II), usually 2 to 5 mol is preferable and 2.5 to 4 mol is preferable to 1 mol of compound d from the viewpoint of selectivity and yield. More preferable.
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）は、通常、反応溶媒下で行われる。使用できる反応溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトン、トルエン等が挙げられ、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、また、複数併用してもよい。 Steps (I) and (II) are usually performed under a reaction solvent. Examples of the reaction solvent which can be used include N, N-dimethylformamide, acetonitrile, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetone, toluene and the like, preferably N, N-dimethylformamide, acetonitrile and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
これらの反応溶媒（有機溶媒）の使用量は、反応が進行すれば特に限定されるものではないが、通常、化合物ａ又はｄの濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌとなるように調整することが好ましい。 The amount of the reaction solvent (organic solvent) to be used is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but generally, the concentration of the compound a or d is 0.01 to 1 mol / L, preferably 0.05 It is preferable to adjust so as to be 0.5 mol / L.
工程（Ｉ）及び（ＩＩ）の反応温度は、加熱下、室温下、冷却下のいずれでも行うことができ、通常１０〜５０℃程度が好ましい。また、反応は、常圧で実施してもよく、また、必要に応じて、減圧又は加圧条件下で実施することも可能であるが、常圧下で実施することが好ましい。反応時間は、特に制限はなく、反応が十分に進行する時間とすればよい。 The reaction temperature of steps (I) and (II) can be carried out under heating, at room temperature, or under cooling, and usually about 10 to 50 ° C. is preferable. The reaction may be carried out at normal pressure, and if necessary, may be carried out under reduced pressure or pressure, but is preferably carried out at normal pressure. The reaction time is not particularly limited, and may be a time in which the reaction sufficiently proceeds.
反応の進行は、クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することができる。反応終了後、溶媒を留去し、生成物はクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、ＭＳ（ＦＤ−ＭＳ）分析、ＩＲ分析、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ等により同定することができる。 The progress of the reaction can be followed by conventional methods such as chromatography. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and the product can be isolated and purified by a usual method such as chromatography or recrystallization. Further, the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (FD-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR or the like.
また、工程（Ｉ）及び（ＩＩ）で合成される化合物ｃ及びｅは、必要に応じて、活性炭処理、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の通常の精製方法により精製することも可能である。 In addition, the compounds c and e synthesized in the steps (I) and (II) can also be purified by ordinary purification methods such as activated carbon treatment, recrystallization, column chromatography and the like, if necessary.
なお、化合物ａ又はｄが、キサンテン骨格上の水酸基以外の他の水酸基を有する場合、必要に応じてこの他の水酸基を適当な保護基で保護してから、工程（Ｉ）及び（ＩＩ）に供し、反応終了後、該保護基を除去することによって、化合物ｃ又はｅを合成することもできる。 When compound a or d has another hydroxyl group other than the hydroxyl group on the xanthene skeleton, it is necessary to protect the other hydroxyl group with a suitable protecting group, and then proceed to steps (I) and (II). Alternatively, compounds c or e can be synthesized by removing the protective group after completion of the reaction.
２．蛍光プローブ
本発明の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物を含有する、蛍光プローブ（本明細書において、「本発明の蛍光プローブ」と示す場合もある。）について説明する。
2. Fluorescent Probe A fluorescent probe (also referred to herein as "the fluorescent probe of the present invention") containing the compound of the present invention, or a salt, hydrate or solvate thereof is described.
本発明の化合物は、ストリゴラクトン受容体による加水分解を受け、ストリゴラクトンと同様の生理活性を発揮する。そして、本発明の化合物は、この加水分解により特定の蛍光物質を生成する。よって、本発明の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物を蛍光プローブとして用いることにより、ストリゴラクトン受容体活性の測定、該受容体が関連する種々の生命現象の解析（例えば、ストライガ発芽過程におけるストリゴラクトン受容体活性の変化の、時間的、空間的な解析等）等が可能となる。さらには、ストリゴラクトン受容体活性の変化を指標とすることにより、ストリゴラクトン受容体によるストリゴラクトンの加水分解を経て起こる生命現象の調節物質のスクリーニングも可能である。このような生命現象としては、後述のストライガ種子の発芽の他にも、ストリゴラクトンを生成する植物における茎の分枝、根の伸長、発芽等が知られている。 The compounds of the present invention are hydrolyzed by the strigolactone receptor and exert the same physiological activity as strigolactone. And the compound of this invention produces | generates a specific fluorescent substance by this hydrolysis. Therefore, by using the compound of the present invention, or a salt, hydrate or solvate thereof as a fluorescent probe, measurement of strigolactone receptor activity, analysis of various biological phenomena related to the receptor (for example, Temporal and spatial analysis etc. of changes in strigolactone receptor activity in the process of germination of striga are possible. Furthermore, screening of modulators of biological phenomena occurring via hydrolysis of strigolactone by strigolactone receptor is also possible by using changes in strigolactone receptor activity as an indicator. As such a life phenomenon, in addition to the sprouting of striga seeds described later, there are known stem branching, root elongation, germination and the like in a plant that produces strigolactone.
蛍光プローブは、本発明の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物のみからなるものであってもよいが、蛍光プローブとしての活性を損なわない限りにおいて、緩衝剤、溶媒等の他の成分を含有していてもよい。この場合、本発明の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物の濃度は、使用目的によって適宜調節することができ、特に制限されるものではないが、植物体に作用させる場合であれば例えば１×１０−１０ｍоｌ／Ｌ〜１×１０−３ｍоｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−８ｍоｌ／Ｌ〜１×１０−４ｍоｌ／Ｌが挙げられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでストリゴラクトン受容体に作用させる場合であれば例えば１×１０−９ｍоｌ／Ｌ〜１×１０−４ｍоｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−７ｍоｌ／Ｌ〜１×１０−５ｍоｌ／Ｌが挙げられる。 The fluorescent probe may consist only of the compound of the present invention, or a salt, hydrate or solvate thereof, but the buffer, solvent and the like may be used as long as the activity as the fluorescent probe is not impaired. You may contain the component. In this case, the concentration of the compound of the present invention, or a salt, hydrate or solvate thereof can be appropriately adjusted depending on the purpose of use, and is not particularly limited. For example, 1 × 10 −10 mol / L to 1 × 10 −3 mol / L, preferably 1 × 10 −8 mol / L to 1 × 10 −4 mol / L can be mentioned, and in vitro the strigolactone is received In the case of acting on the body, for example, 1 × 10 −9 mol / L to 1 × 10 −4 mol / L, preferably 1 × 10 −7 mol / L to 1 × 10 −5 mol / L can be mentioned.
溶媒としては、特に制限はなく、極性溶媒及び非極性溶媒のいずれも使用できる。 The solvent is not particularly limited, and any of polar and nonpolar solvents can be used.
極性溶媒としては、例えば、エーテル化合物（テトラヒドロフラン、アニソール、１，４−ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル等）、アルコール（メタノール、エタノール、アリルアルコール等）、エステル化合物（酢酸エチル等）、ケトン（アセトン等）、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム）、ジメチルスルホキシド、アミド系溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ−メチルピロリドン等）等が挙げられる。 Examples of polar solvents include ether compounds (tetrahydrofuran, anisole, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether etc.), alcohols (methanol, ethanol, allyl alcohol etc.), ester compounds (ethyl acetate etc.), ketones (acetone etc.) Halogenated hydrocarbons (dichloromethane, chloroform), dimethylsulfoxide, amide solvents (N, N-dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, N-methylpyrrolidone etc.) and the like. .
非極性溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の脂肪族有機溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族溶媒等が挙げられる。 Examples of nonpolar solvents include aliphatic organic solvents such as pentane, hexane, cyclohexane and heptane; and aromatic solvents such as benzene, toluene, xylene and mesitylene.
緩衝剤としては、特に制限はなく、例えばヘペス緩衝剤、トリス緩衝剤、トリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、リン酸系緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。 The buffer is not particularly limited, and examples thereof include Hepes buffer, Tris buffer, Tricine-sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline and the like.
３．ストライガ発芽調節物質のスクリーニング方法
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むストライガ発芽調節物質のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明のスクリーニング方法」と示す場合もある。）について説明する：
（ａ）被検物質の存在下で、ストリゴラクトン受容体と請求項５又は６に記載の蛍光プローブとを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記蛍光プローブの分解物の蛍光強度を測定し、該蛍光強度（被検蛍光強度）を、被検物質を接触させない場合の蛍光強度（対照蛍光強度）と比較する工程、
（ｃ）被検蛍光強度と対照蛍光強度とが有意に相違している場合に、被検物質を、ストライガ発芽調節物質として選択する工程。
3. Screening Method for Striga Germination Regulators A screening method for Striga sprout regulators (sometimes referred to herein as “the screening method of the present invention”) including the following steps (a) to (c) will be described:
(A) contacting the strigolactone receptor with the fluorescent probe according to claim 5 or 6 in the presence of a test substance;
(B) After step (a), the fluorescence intensity of the decomposed product of the fluorescent probe is measured, and the fluorescence intensity (analyzed fluorescence intensity) is the fluorescence intensity (control fluorescence intensity) when the analyte is not brought into contact Comparing process,
(C) A step of selecting a test substance as a striga germination regulator when the test fluorescence intensity and the control fluorescence intensity are significantly different.
ストライガ発芽調節物質とは、ストライガの種子に作用し、該種子の発芽を調節（誘導又は抑制）する物質である。発芽誘導物質は、宿主植物がいない環境下で施用することにより、発芽したストライガは寄生できずに枯死（いわゆる自殺発芽）することとなるので、土壌を浄化することができる。一方、発芽抑制物質を施用すれば、ストライガに寄生されることなく宿主植物を栽培することが可能となる。 A striga germination regulator is a substance that acts on the seeds of striga and regulates (induces or suppresses) the germination of the seeds. By applying the germination inducer in an environment where there is no host plant, the germinated Striga can not parasitize and will die (so-called suicide germination), so the soil can be cleaned. On the other hand, application of a germination inhibitory substance makes it possible to grow host plants without being infested by the striga.
被検物質は、ストライガ発芽調節物質か否かをスクリーニングする対象物質である。被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。 The test substance is a target substance to be screened for whether it is a striker sprout regulator or not. As a test substance, any of naturally occurring compounds or artificially produced compounds can be used widely. Further, not only purified compounds but also compositions prepared by mixing various compounds, and extracts of animals and plants can be used.
ストリゴラクトン受容体は、ストリゴラクトンを受容し、そのエーテル結合部分を加水分解する活性を有する受容体である限り特に限定されない。ストリゴラクトン受容体としては、例えば、シロイヌナズナのストリゴラクトン受容体であるＡｔＤ１４、ストライガ由来ストリゴラクトン受容体等が挙げられる、好ましくはストライガ由来ストリゴラクトン受容体が挙げられる。ストライガ由来ストリゴラクトン受容体は、本発明において初めて見出されたものであり、例えば配列番号２〜１１、好ましくは配列番号２、４〜８、１０、及び１０、より好ましくは５、６、及び８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。 The strigolactone acceptor is not particularly limited as long as it is an acceptor having an activity of accepting strigolactone and hydrolyzing its ether bond. Examples of the strigolactone receptor include AtD14 which is an Arabidopsis strigolactone receptor, Striga-derived strigolactone receptor and the like, preferably Striga-derived strigolactone receptor. Striga-derived strigolactone receptors are found for the first time in the present invention, for example, SEQ ID NOs: 2-11, preferably SEQ ID NOs: 2, 4-8, 10, and 10, more preferably 5, 6, And a protein consisting of the amino acid sequence shown by.
被検物質の存在下で、ストリゴラクトン受容体と本発明の蛍光プローブとを接触させる態様は、これら３成分が接触することができる限り特に限定されない。例えば、これら３成分を適当な溶媒中で混合することが挙げられる。 The mode in which the strigolactone receptor and the fluorescent probe of the present invention are brought into contact in the presence of the test substance is not particularly limited as long as these three components can be brought into contact. For example, mixing these three components in a suitable solvent is mentioned.
接触時間は、ストリゴラクトン受容体により本発明の化合物の加水分解が起こる限りにおいて、特に限定されない。接触時間としては、加水分解により生じる特定の蛍光物質が蛍光検出可能な程度に蓄積される程度の時間が好ましく、例えば５分間〜３時間、好ましくは３０〜９０分間程度が挙げられる。 The contact time is not particularly limited as long as hydrolysis of the compound of the present invention occurs by the strigolactone receptor. The contact time is preferably such a time that a specific fluorescent substance generated by hydrolysis is accumulated to a detectable level, for example, about 5 minutes to 3 hours, preferably about 30 to 90 minutes.
蛍光強度の測定は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。より簡便且つ効率的に実施するという観点からは、上記接触をマイクロプレートのウェル内で行い、蛍光強度の測定を蛍光マイクロプレートリーダーで行うというシステムが好ましい。 The measurement of the fluorescence intensity can be performed according to or according to known methods. From the viewpoint of carrying out more simply and efficiently, a system in which the contact is performed in the wells of the microplate and the measurement of the fluorescence intensity is performed by a fluorescence microplate reader is preferable.
被検物質と接触させない場合とは、工程（ａ）において被検物質と接触させていない以外は、同じ又は同等の処理をした場合である。この場合の蛍光強度も、上記した被検物質と接触させた場合の蛍光強度と同様に測定することができる。 The case where the sample is not in contact with the test substance refers to the case where the same or equivalent treatment is performed except that the test substance is not in contact in the step (a). The fluorescence intensity in this case can also be measured in the same manner as the fluorescence intensity in the case of contact with the above-mentioned test substance.
被検蛍光強度と対照蛍光強度とが有意に相違しているか否かの判断は、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してＰ値を求め、Ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。 Judgment as to whether or not the test fluorescence intensity and the control fluorescence intensity are significantly different may be judged based on a certain standard, for example, a statistical standard. Specifically, there is a method of determining the P value by measuring a plurality of times, and determining that they are significantly different when the P value is equal to or less than a predetermined value, for example, 0.05 or less.
判断の結果、有意に相違している場合は、ストリゴラクトン受容体活性が被検物質により調節（活性化又は抑制）されていること、例えば被検物質が、ストリゴラクトン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能していることを意味する。ストライガの発芽はストリゴラクトンによって制御されていることから、この場合は、被検物質を、ストライガ発芽調節物質として選択することができる。このように選択されたストライガ発芽調節物質は、ヒト造血幹細胞増殖調節物質の候補物質として、２次スクリーニングの被検物質として使用してもよい。 If, as a result of the determination, there is a significant difference, the strigolactone receptor activity is regulated (activated or suppressed) by the test substance, eg, the test substance is an agonist of the strigolactone receptor or It means that it functions as an antagonist. The test substance can be selected as a striatal sprout regulator, in this case, since the strigar sprouting is controlled by strigolactone. The striatal sprouting regulator thus selected may be used as a candidate for human hematopoietic stem cell growth regulator as a test substance for secondary screening.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited by these examples.
合成例１
エチル 2-（6-（（4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル）オキシ）-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（YLG）を合成した。
Synthesis example 1
Ethyl 2- (6-((4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl) oxy) -3-oxo-3H-xanthen-9-yl) benzoate ( YLG ) was synthesized.
エチル 2-（6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（227.0 mg, 0.63 mmol, 1.00 equiv）及びK2CO3（152 mg, 0.69 mmol, 1.10 equiv）をN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）（2.0 mL）に加え、室温で10分間撹拌した。ここに5-ブロモ-3-メチルフラン-2（5H）-オン（136.1 mg, 0.63 mmol, 1.00 equiv）を加え、室温で30分間撹拌した。ここに水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた混合物を、分取薄層クロマトグラフィー（PTLC）（溶媒は、CHCl3／メタノール（MeOH） ＝ 20：1の混合溶媒）で精製し、ジアステレオマーの混合物として黄色固体の目的物（YLG）を得た（140 mg、収率51%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.96-1.26 (m, 6H), 2.04 (s, 6H), 3.98-4.11(m, 4H), 6.40 (s, 2H), 6.44 (s, 2H), 6.54 (dd, J = 10.0, 2.0 Hz, 2H), 6.87-6.97 (m, 6H), 7.04 (brs, 2H), 7.24 (dd, J = 5.2, 2.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.69 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.75 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.27 (d, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 185.8, 170.8, 165.32, 165,27, 160.06, 158.8, 153.5, 149.7, 149.6, 141.8, 134.9, 134.05, 133.97, 132.8, 131.4, 130.73, 130.66, 130.46, 130.35, 129.9, 129.36, 118.7, 117.0, 113.99, 113.86, 106.0, 104.07, 103.96, 97.9, 61.4, 13.74, 13.71, 10.75. HRMS (ESI(+)) m/z = 457.1282 calcd for C27H21O7 [M+H]+, found: .457.1268。
Ethyl 2- (6-hydroxy-3-oxo -3H- xanthene-9-yl) benzoate (227.0 mg, 0.63 mmol, 1.00 equiv) and K 2 CO 3 (152 mg, 0.69 mmol, 1.10 equiv) and N, N -Add to dimethylformamide (DMF) (2.0 mL) and stir at room temperature for 10 minutes. 5-bromo-3-methylfuran-2 (5H) -one (136.1 mg, 0.63 mmol, 1.00 equiv) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Water was added thereto, and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, then dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated under reduced pressure. The resulting mixture is purified by preparative thin layer chromatography (PTLC) (the solvent is a mixed solvent of CHCl 3 / methanol (MeOH) = 20: 1), and the yellow solid is obtained as a mixture of diastereomers ( YLG) was obtained (140 mg, 51% yield).
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 0.96-1.26 (m, 6 H), 2.04 (s, 6 H), 3. 98-4. 11 (m, 4 H), 6. 40 (s, 2 H), 6. 44 (s, 2 H), 6.54 (dd, J = 10.0, 2.0 Hz, 2 H), 6.87-6.97 (m, 6 H), 7.04 (brs, 2 H), 7.24 (dd, J = 5.2, 2.4 Hz, 2 H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7. 69 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7. 75 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 8. 27 (d, J = 7.2 Hz, 2 H). 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 185.8, 170.8, 165.32, 165, 0.06, 158.8, 158.8, 159.7, 149.7, 141.8, 134.9, 134.05, 132.8, 131.4, 130.76, 130.66, 130.46, 130.35, 129.9, 129.76, 118.7, 118.7 , 113.99, 113.86, 106.0, 104.07, 103.96, 67.9, 13.14, 13.71, 10.75. HRMS (ESI (+)) m / z = 457.1282 calcd for C27H21O7 [M + H] + , found: .457.1268.
合成例２〜５
エチル 2-（6-（（3-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル）オキシ）-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（YLG2）、エチル 2-（6-（（3,4-ジメチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル）オキシ）-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（YLG3）、エチル 2-（3-オキソ-6-（（3-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-1-イル）オキシ）-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（YLG4）、及びエチル 2-（3-オキソ-6-（（5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル）オキシ）-3H-キサンテン-9-イル）ベンゾエート（YLG5）を合成した。合成は、5-ブロモ-3-メチルフラン-2（5H）-オンに代えて適当な材料化合物を用いる以外は、合成例１と同様に行った。
Synthesis examples 2 to 5
Ethyl 2- (6-((3-Methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl) oxy) -3-oxo-3H- xanthen -9-yl) benzoate ( YLG2 ), ethyl 2- (6-((3,4-Dimethyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl) oxy) -3-oxo-3H- xanthen -9-yl) benzoate ( YLG3 ), ethyl 2- ( 3-oxo-6-((3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl) oxy) -3H- xanthen -9-yl) benzoate ( YLG4 ), and ethyl 2- (3-oxo-6) -((5-Oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl) oxy) -3H- xanthen -9-yl) benzoate ( YLG5 ) was synthesized. The synthesis was performed in the same manner as in Synthesis Example 1 except that 5-bromo-3-methylfuran-2 (5H) -one was replaced with an appropriate material compound.
＜YLG2＞得られた混合物を、PTLC（溶媒は、CHCl3／MeOH ＝ 20：1の混合溶媒）で精製し、ラセミ体として黄色固体の目的物（YLG2）を得た（収率70%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.97-1.04 (m, 3H), 2.23 (s, 3H), 4.03-4.08 (m, 2H), 6.05 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.55 (dd, J = 5.6, 2.0 Hz, 1H), 6.86-6.98 (m, 3H), 7.25 (dd, J = 5.2, 2.0 Hz, 1H), 7.31 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.6 Hz, 1H)。 <YLG2> The obtained mixture was purified by PTLC (the solvent was a mixed solvent of CHCl 3 / MeOH = 20: 1) to obtain the desired product (YLG2) as a yellow solid as a racemate (yield 70%) . 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 0.97-1.04 (m, 3H), 2.23 (s, 3H), 4.03-4.08 (m, 2H), 6.05 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.45 (s, 1 H), 6.55 (dd, J = 5.6, 2.0 Hz, 1 H), 6.86-6.98 (m, 3 H), 7. 25 (dd, J = 5.2, 2.0 Hz, 1 H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.71 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7. 76 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 8. 28 (d, J = 7.6 Hz, 1 H).
＜YLG3＞得られた混合物を、PTLC（溶媒は、CHCl3／MeOH ＝ 20：1の混合溶媒）で精製し、ラセミ体として黄色固体の目的物（YLG3）を得た（収率52%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.96-1.04 (m, 3H), 1.93 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 4.04-4.08 (m, 2H), 6.18 (s, 1H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 9.6, 2.0 Hz, 1H), 6.86-6.95 (m, 3H), 7.24-7.32 (m, 2H), 7.69 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H)。 <YLG3> The resulting mixture was purified by PTLC (the solvent was a mixed solvent of CHCl 3 / MeOH = 20: 1) to obtain the desired product (YLG3) as a yellow solid as a racemate (yield 52%) . 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 0.96-1.04 (m, 3H), 1.93 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 4.04-4.08 (m, 2H), 6.18 (s, 1H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.55 (dd, J = 9.6, 2.0 Hz, 1 H), 6.86-6.95 (m, 3 H), 7.24-7.32 (m, 2 H), 7.69 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 7.73 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 8. 27 (d, J = 8.0 Hz, 1 H).
＜YLG4＞得られた混合物を、PTLC（溶媒は、CHCl3／MeOH ＝ 20：1の混合溶媒）で精製し、ラセミ体として黄色固体の目的物（YLG4）を得た（収率83%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.98-1.05 (m, 3H), 4.04-4.11 (m, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.55 (dd, J = 9.2 2.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.96-7.01 (m, 3H), 7.34 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.68-7.85 (m, 5H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H)。 <YLG4> The obtained mixture was purified by PTLC (solvent: CHCl 3 / MeOH = 20: 1 mixed solvent) to obtain the desired product (YLG4) as a yellow solid as a racemate (yield 83%) . 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 0.98-1.05 (m, 3 H), 4.04-4. 11 (m, 2 H), 6.45 (s, 1 H), 6.55 (dd, J = 9.2 2.0 Hz, 1 H), 6.89 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 6.96-7.01 (m, 3 H), 7.34 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.68-7.85 (m, 5 H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 1 H).
＜YLG5＞得られた混合物を、PTLC（溶媒は、CHCl3／MeOH ＝ 10：1の混合溶媒）で精製し、ラセミ体として黄色固体の目的物（YLG5）を得た（収率56%）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.97-1.03 (m, 3H), 4.00-4.09 (m, 2H), 6.41 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.52-6.56 (m, 2H), 6.87-6.98 (m, 3H), 7.25 (dd, J = 5.2, 2.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 7.6 Hz, 1H)。 <YLG5> The obtained mixture was purified by PTLC (solvent: CHCl 3 / MeOH = 10: 1 mixed solvent) to obtain the desired product (YLG5) as a yellow solid as a racemate (yield 56%) . 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 0.97-1.03 (m, 3 H), 4.00-4.09 (m, 2 H), 6.41 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.45 (s, 1 H), 6.52- 6.56 (m, 2H), 6.87-6.98 (m, 3H), 7.25 (dd, J = 5.2, 2.4 Hz, 1 H), 7.32 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 6.0 Hz) , 1H), 7.69 (t, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.75 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.27 (d, J = 7.6 Hz, 1 H).
合成例６
（1S）-3'-（（（R）-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル)オキシ）-6'-（（4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イル）オキシ）-3H-スピロ［イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン］-3-オン（YLGW）を合成した。
Synthesis example 6
(1S) -3 '-(((R) -4-methyl-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl) oxy) -6'-((4-methyl-5-oxo-2, 5-Dihydrofuran-2-yl) oxy) -3H-spiro [isobenzofuran-1,9'-xanthene] -3-one ( YLGW ) was synthesized.
2-（6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル）安息香酸（160 mg, 0.50 mmol）、Ag2O（348 mg, 1.50 mmol, 3.00 equiv）、及び触媒量のピリジンをアセトニトリル（3.0 mL）に加え、室温で10分間撹拌した。ここに5-ブロモ-3-メチルフラン-2（5H）-オン（281 mg, 1.50 mmol, 3.00 equiv）を加え、40℃で10時間撹拌した。ここに水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶媒は、CHCl3）で精製し、ジアステレオマーの混合物として黄色油状の目的物（YLGW）を得た（32.8 mg、収率13%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.04 (s, 12H), 6.34 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 6.76-6.84 (m, 8H), 6.87-6.97 (m, 6H), 7.01-7.16 (m, 4H), 7.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.69 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 7.2 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 169.3, 158.0, 153.1, 152.2, 141.9, 135.3, 134.9, 130.1, 129.6, 126.4, 125.3, 124.0, 114.23, 114.10, 114.00, 113.90, 112.85, 112.75, 105.30, 105.08, 104.5, 104.2, 98.50, 98.43, 82.20, 10.76. HRMS (ESI(+)) m/z = 525.1180 calcd for C30H21O9 [M+H]+, found: 525.1162。
2- (6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl) benzoic acid (160 mg, 0.50 mmol), Ag 2 O (348 mg, 1.50 mmol, 3.00 equiv), and catalytic amount of pyridine in acetonitrile The mixture was added to (3.0 mL) and stirred at room temperature for 10 minutes. 5-bromo-3-methylfuran-2 (5H) -one (281 mg, 1.50 mmol, 3.00 equiv) was added thereto, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 10 hours. Water was added thereto, and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, then dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated under reduced pressure. The resulting mixture was purified by flash column chromatography (solvent: CHCl 3 ) to obtain the desired product (YLGW) as a yellow oil as a mixture of diastereomers (32.8 mg, 13% yield).
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 2.04 (s, 12 H), 6.34 (d, J = 6.4 Hz, 4 H), 6.76-6.84 (m, 8 H), 6.87-6.97 (m, 6 H), 7.01- 7.16 (m, 4H), 7.64 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 7.69 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 8.03 (d, J = 7.2 Hz, 2 H). 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 171.0, 169.3, 158.0, 151.9, 135.3, 130.1, 130.1, 129.6, 126.4, 124.0, 124.0, 114.10, 114.00, 113.90, 112.85, 112.75, 105.30, 105.08, 104.2, 104.5, 104.2, 104.2 98.50, 98.43, 82.20, 10.76. HRMS (ESI (+)) m / z = 525.1180 calcd for C30 H 21 O 9 [M + H] + , found: 525.1162.
合成例７
5,5'-（（2',7'-ジフルオロ-3-オキソ-3H-スピロ［イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン］-3',6'-ジイル）ビス（オキシ））ビス（3-メチルフラン-2（5H）-オン）（YLGW-F）を合成した。
Synthesis example 7
5,5 ′-((2 ′, 7′-Difluoro-3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1,9′-xanthene] -3 ′, 6′-diyl) bis (oxy)) bis (3) -Methylfuran- 2 (5H) -one) ( YLGW-F ) was synthesized.
2',7'-ジフルオロ-3',6'-ジヒドロキシ-3H-スピロ［イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン］-3-オン（73.6 mg, 0.20 mmol）、Ag2O（139 mg, 0.60 mmol, 3.00 equiv）、及び触媒量のピリジンをDMF（3.0 mL）に加え、室温で10分間撹拌した。ここに5-ブロモ-3-メチルフラン-2（5H）-オン（106 mg, 0.60 mmol, 3.00 equiv）を加え、室温で20分間撹拌した。ここに水を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。混ぜ合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶媒は、CHCl3）で精製し、ジアステレオマーの混合物として黄色油状の目的物（YLGW-F）を得た（13.2 mg、収率12%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.03 (s, 12H), 6.36 (d, J = 15.6 Hz, 4H), 6.52-6.56 (m, 4H), 7.05 (d, J = 14 Hz, 4H), 7.14-7.20 (m, 2H), 7.26 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 7.65-7.76 (m, 4H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 2H)。
2 ', 7'-difluoro-3', 6'-dihydroxy--3H- spiro [isobenzofuran-1,9'-xanthene] -3-one (73.6 mg, 0.20 mmol), Ag 2 O (139 mg, 0.60 Add mmol, 3.00 equiv) and catalytic amount of pyridine to DMF (3.0 mL) and stir at room temperature for 10 minutes. 5-bromo-3-methylfuran-2 (5H) -one (106 mg, 0.60 mmol, 3.00 equiv) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. Water was added thereto, and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, then dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated under reduced pressure. The resulting mixture was purified by flash column chromatography (solvent: CHCl 3 ) to obtain the desired product (YLGW-F) as a yellow oil as a mixture of diastereomers (13.2 mg, 12% yield).
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 2.03 (s, 12 H), 6.36 (d, J = 15.6 Hz, 4 H), 6.52-6. 56 (m, 4 H), 7.05 (d, J = 14 Hz, 4 H) , 7.14-7.20 (m, 2H), 7.26 (d, J = 6.0 Hz, 4 H), 7.65-7.76 (m, 4 H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 2 H).
実施例１．シロイヌナズナストリゴラクトン受容体による加水分解及び蛍光発光
ストリゴラクトンは、シロイヌナズナ等の植物内において、ストリゴラクトン受容体により加水分解され、それにより植物の生命現象（枝分かれ抑制等）を制御していることが知られている。そこで、上記合成例で合成した化合物（被検化合物）でも、同様の現象が起こるかどうか調べた。被検化合物は、エーテル結合が加水分解されることにより蛍光物質（フルオレセイン誘導体）が生成するようにデザインされている。具体的には次のように行った。
Example 1 Hydrolysis by the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor and fluorescence emission The strigolactone is hydrolyzed by the strigolactone receptor in plants such as Arabidopsis thaliana, thereby controlling plant life phenomena (such as suppression of branching) It is known. Therefore, it was investigated whether the same phenomenon occurred even with the compound (test compound) synthesized in the above synthesis example. The test compound is designed to produce a fluorescent substance (fluorescein derivative) by hydrolysis of the ether bond. Specifically, it went as follows.
＜1-1．In vitro蛍光発光試験＞
シロイヌナズナストリゴラクトン受容体を定法に従って製造した。具体的には、該受容体のcDNAをRT-PCRによって得て、大腸菌内で発現・精製することにより製造した。得られたシロイヌナズナストリゴラクトン受容体（リコンビナントAtD14、1μg）及び被検化合物（YLG、YLG2、YLG3、YLG4、YLG5、YLGW、又はYLGW-F）（終濃度0.2μM、0.4μM、0.6μM、1μM、5μM、又は10μM）を含む反応溶液（100 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.0、0.1％ DMSO）100μLを調製し、96ブラックウェルプレート（Greiner社製）内で反応させた。反応開始後、90分後まで、10分毎に、蛍光検出器（spectraMax i3、Molecular Devices社製）を用いて、励起波長480 nm、検出波長520 nmで蛍光を検出し、蛍光強度を測定した。被検化合物としてYLGを終濃度1μMで用いた場合の蛍光強度の測定結果を図１に示す。さらに、反応開始後60分経過時の蛍光強度の測定結果に基づいて、Linewaver-Burkプロットを作成し、Km値を算出した。被検化合物としてYLGを用いた場合の該プロット図及びKm値を図２に示す。
<1-1. In vitro fluorescence test>
The Arabidopsis thaliana natrigolactone receptor was prepared according to a conventional method. Specifically, cDNA of the receptor was obtained by RT-PCR, and was produced by expression and purification in E. coli. The resulting Arabidopsis thaliana trigolactone receptor (recombinant AtD14, 1 μg) and the test compound (YLG, YLG2, YLG3, YLG4, YLG5, YLGW, or YLGW-F) (final concentration 0.2 μM, 0.4 μM, 0.6 μM, 1 μM) 100 μL of a reaction solution (100 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0, 0.1% DMSO) containing 5 μM, or 10 μM was prepared and reacted in a 96 black well plate (manufactured by Greiner). The fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 480 nm and a detection wavelength of 520 nm using a fluorescence detector (spectraMax i3, manufactured by Molecular Devices) every 10 minutes until 90 minutes after the start of the reaction. . The measurement results of the fluorescence intensity when YLG is used at a final concentration of 1 μM as the test compound are shown in FIG. Furthermore, based on the measurement results of the fluorescence intensity of the 60-minute time lapse after the start of the reaction, to create a Linewaver-Burk plot were calculated K m values. The plot and K m value when YLG is used as a test compound are shown in FIG.
図１及び２に代表的に示されるように、被検化合物と、シロイヌナズナストリゴラクトン受容体とが反応することにより、蛍光物質が生成した。このことから、被検化合物は、ストリゴラクトンと同様に、シロイヌナズナストリゴラクトン受容体により分解され、それにより蛍光物質を生成させていることが示唆された。また、被検化合物の中でもYLGWは安定性が高かった。 As representatively shown in FIGS. 1 and 2, a fluorescent substance was produced by the reaction of the test compound with the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor. From this, it was suggested that the test compound is decomposed by the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor, thereby producing a fluorescent substance, as in the case of strigolactone. Further, among the test compounds, YLGW had high stability.
＜1-2．分解物のLC-MS解析＞
実施例1-1と同様に反応させた後、反応溶液中の成分を、定法に従ってLC-MS（Thermo社製）解析した。被検化合物としてYLGを用いた場合の結果を図３に示す。
<1-2. LC-MS Analysis of Degraded Products>
After reacting in the same manner as in Example 1-1, components in the reaction solution were analyzed by LC-MS (manufactured by Thermo) according to a standard method. The results when YLG is used as a test compound are shown in FIG.
図３に示されるように、YLGとシロイヌナズナストリゴラクトン受容体との反応後（図３の下段）は、YLGのピーク（Retention time 16.78分）がほぼ消失しており、YLGのエーテル結合部分の加水分解によって生じるフルオレセイン誘導体（図中、「Fluorescein」）のピーク（Retention time 15.75分）、及び3-メチル-5-ヒドロキシフラン-2（5H）-オン（図中、「D-ring」）のピーク（Retention time 4.92分）が出現した。このことより、被検化合物は、ストリゴラクトンと同様に、シロイヌナズナストリゴラクトン受容体により分解され、それにより蛍光物質が生成することが明らかとなった。 As shown in FIG. 3, after the reaction between YLG and the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor (lower part in FIG. 3), the peak of YLG (Retention time 16.78 minutes) almost disappears, and the ether-linked portion of YLG is The peak (Retention time 15.75 minutes) of the fluorescein derivative ("Fluorescein" in the figure) produced by hydrolysis, and the 3-methyl-5-hydroxyfuran-2 (5H) -one ("D-ring" in the figure) A peak (Retention time 4.92 minutes) appeared. From this fact, it was revealed that the test compound is decomposed by the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor similarly to strigolactone, thereby producing a fluorescent substance.
＜1-3．ストリゴラクトンによる競合試験＞
被検化合物としてYLGを終濃度1μMで用い、競合化合物として既知の天然又は合成ストリゴラクトン（GR24、5DS、又は4DO）又は活性を有しない既知のストリゴラクトン誘導体（carba-GR24）を終濃度0.01〜10μMで用い、且つ反応開始後60分経過時の蛍光強度を測定する以外は、実施例1-1と同様に行った。さらに、蛍光強度の測定結果に基づいて、競合化合物である各ストリゴラクトンのIC50値を算出した。結果を図４に示す。
<1-3. Competition test with strigolactone>
Final concentration of 1 μM YLG as a test compound and natural or synthetic strigolactone (GR24, 5DS, or 4DO) known as a competitor compound or final strigolactone derivative having no activity (carba-GR24) final concentration The same procedure as in Example 1-1 was performed, except that it was used at 0.01 to 10 μM and the fluorescence intensity was measured 60 minutes after the start of the reaction. Furthermore, based on the measurement result of the fluorescence intensity, the IC 50 value of each strigolactone which is a competing compound was calculated. The results are shown in FIG.
図４に示されるように、既知の天然又は合成ストリゴラクトンを反応系に入れた場合、蛍光強度が減少した。このことから、これらのストリゴラクトンとYLGとは、シロイヌナズナストリゴラクトン受容体上の同一部位を認識していることが示唆された。また、ストリゴラクトン活性を有しないcarba-GR24がYLGと競合していなかったことから、この競合試験は、シロイヌナズナストリゴラクトン受容体の結合特異性を反映していることが示された。 As shown in FIG. 4, when a known natural or synthetic strigolactone was added to the reaction system, the fluorescence intensity decreased. This suggests that these strigolactones and YLG recognize the same site on the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor. In addition, it was shown that this competition test reflects the binding specificity of the Arabidopsis thaliana trigolactone receptor, since carba-GR24 not having strigolactone activity did not compete with YLG.
＜1-4．In vivo 蛍光発光試験＞
シロイヌナズナの野生株又はストリゴラクトン非感受性株（Atd14-1）の根を、1μM YLG水溶液で30分間処理した後、根を蛍光顕微鏡（LSM780-DUO-NLO; Zeiss, Gottingen , Germany）で観察（励起波長480 nm、検出波長520 nm）した。蛍光観察像及び明視野像を図５に示す。
<1-4. In vivo fluorescence test>
After treating the roots of a wild strain or strigolactone insensitive strain (Atd 14-1) of Arabidopsis thaliana with 1 μM YLG aqueous solution for 30 minutes, the roots are observed with a fluorescence microscope (LSM 780-DUO-NLO; Zeiss, Gottingen, Germany) The excitation wavelength was 480 nm and the detection wavelength was 520 nm). The fluorescence observation image and the bright field image are shown in FIG.
図５に示されるように、野生株ではYLG処理により蛍光発光が起こったが、ストリゴラクトン非感受性株では蛍光発光は起こらなかった。また、蛍光発光部位は、ストリゴラクトンが作用することが報告されている部位（側根）と同じであった。 As shown in FIG. 5, in the wild strain, fluorescence was caused by YLG treatment, but in the strigolactone insensitive strain, fluorescence was not caused. In addition, the fluorescence emission site was the same as the site (lateral root) where strigolactone was reported to act.
＜1-5．シロイヌナズナの枝分かれに対する影響の解析＞
0.2 mLチューブを液状のMS寒天で満たし、これを固めた後、チューブの底を除去した。この0.2 mLチューブに、シロイヌナズナの野生株又はストリゴラクトン生合成変異株（max4-1）の種子（滅菌済み）を入れ、4℃で2日間保存した。この0.2 mLチューブを、液体培地（4.3 g/L Murashige and Skoog基本塩、25 mg/L MES、pH5.8（KOH）、1×Gambourgalビタミン）で満たされた15 mLコニカルチューブに入れ、16時間明暗周期下で栽培した。とう立ちし始めたところで、0.2 mLチューブを、YLG（終濃度5μM）又はDMSOを含む液体培地で満たされた新しい15 mLコニカルチューブに移し、2週間栽培した。2 mm長以上の腋生の枝の数を測定し、その平均値及び標準偏差を求めた（n＝3）。その結果、野生株をYLGで処理しない場合の該枝の数は0.5±0.6であり、ストリゴラクトン生合成変異株をYLGで処理しない場合の該枝の数は2.8±0.5であり、ストリゴラクトン生合成変異株をYLGで処理した場合の該枝の数は1.3±0.6であった。このことから、YLGは、ストリゴラクトンの生合成変異による枝分かれ異常（枝分かれ数の増加）を正常に戻す機能を有すること、すなわちシロイヌナズナ内のストリゴラクトンと同様の機能を有することが示唆された。
<1-5. Analysis of the influence on branching of Arabidopsis thaliana>
A 0.2 mL tube was filled with liquid MS agar, which solidified and then the bottom of the tube was removed. In this 0.2 mL tube, seeds (sterilized) of wild strain of Arabidopsis thaliana or a mutant of strigolactone biosynthesis (max4-1) were put and stored at 4 ° C. for 2 days. Place this 0.2 mL tube in a 15 mL conical tube filled with liquid medium (4.3 g / L Murashige and Skoog basic salt, 25 mg / L MES, pH 5.8 (KOH), 1 × Gambourgal vitamin) for 16 hours Cultivated under a light and dark cycle. Once it was ready to go, the 0.2 mL tube was transferred to a fresh 15 mL conical tube filled with liquid medium containing YLG (final concentration 5 μM) or DMSO and grown for 2 weeks. The number of branches of Yayoi 2 mm or more in length was measured, and the mean value and standard deviation were determined (n = 3). As a result, the number of the branches is 0.5 ± 0.6 when the wild strain is not treated with YLG, and the number of the branches when the strigolactone biosynthesis mutant is not treated with YLG is 2.8 ± 0.5. The number of the branches was 1.3 ± 0.6 when the ton biosynthesis mutant was treated with YLG. From this, it was suggested that YLG has a function to restore the branching abnormality (increase in the number of branches) due to the biosynthesis mutation of strigolactone to normal, that is, it has the same function as strigolactone in Arabidopsis thaliana .
実施例２．ストライガ発芽試験
ストライガの種子は、周辺の植物から分泌されるストリゴラクトンを感知して分解し、それに伴い発芽することが知られている。そこで、上記合成例で合成した化合物（被検化合物）でも、同様の現象が起こるかどうか調べた。
Example 2 Striga Germination Test Striga seeds are known to sense and degrade strigolactone secreted from surrounding plants and to germinate accordingly. Therefore, it was investigated whether the same phenomenon occurred even with the compound (test compound) synthesized in the above synthesis example.
定法に従って前処理したストライガの種子を蒸留水に懸濁し、96ウェルプレートに入れた。そこに、合成ストリゴラクトン（GR24）又は被検化合物（YLG又はYLGW）のDMSO溶液を、合成ストリゴラクトン又は被検化合物の終濃度0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、又は10μM、DMSO濃度が0.1％になるように加え、暗所で室温下、2日間保持した後、幼根が出た数を計測した。被検化合物としてYLGを用いた場合について、この計測値を種子数で除して得られた割合（発芽率を示す）を図６に示す。また、被検化合物としてYLGを用い、合成ストリゴラクトン又は被検化合物の終濃度が10μMの場合の明視野像及び蛍光観察像（励起波長480 nm、検出波長520 nm）を図７に示す。 According to a standard method, the seeds of strikers pre-treated were suspended in distilled water and placed in a 96-well plate. Therein, a DMSO solution of synthetic strigolactone (GR24) or a test compound (YLG or YLGW) is added to a final concentration of synthetic strigolactone or a test compound of 0.0001 μM, 0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, or After adding 10 μM and a DMSO concentration of 0.1% and keeping at room temperature in the dark for 2 days, the number of sprouted radicles was counted. The ratio obtained by dividing this measured value by the number of seeds (showing the germination rate) is shown in FIG. 6 for the case where YLG is used as the test compound. Further, FIG. 7 shows a bright field image and a fluorescence observation image (excitation wavelength 480 nm, detection wavelength 520 nm) when YLG is used as a test compound and the final concentration of the synthetic strigolactone or the test compound is 10 μM.
図６及び７に示されるように、被検化合物は、合成ストリゴラクトンと同様に、ストライガ内で分解され、これに伴いストライガの発芽を誘導することが示された。 As shown in FIGS. 6 and 7, the test compound was shown to be degraded in the striga similarly to the synthetic strigolactone, thereby inducing the germination of the striga.
実施例３．ストライガストリゴラクトン受容体の同定、及び該受容体による加水分解及び蛍光発光
＜3-1．ストライガストリゴラクトン受容体の探索＞
ストライガにおけるストリゴラクトン受容体は明らかとなっていない。そこで、ストリゴラクトン産生植物のストリゴラクトン受容体のアミノ酸配列に基づいて、ストライガにおけるストリゴラクトン受容体を探索した結果、12つの受容体候補が見つかった。これらの名称及びアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
Example 3 Identification of Striga trigolactone receptor, and hydrolysis and fluorescence by the receptor <3-1. Search for strike gas trigolactone receptor>
The strigolactone receptor in strikers is unknown. Therefore, as a result of searching for a strigolactone receptor in a striga based on the amino acid sequence of the strigolactone receptor of a strigolactone-producing plant, 12 receptor candidates were found. The names and amino acid sequence SEQ ID NOs are shown in Table 1.
＜3-2．ストライガストリゴラクトン受容体候補タンパク質の調製＞
ストライガ種子から調製したcDNAをテンプレートとして、PCRによりストライガストリゴラクトン受容体候補タンパク質のORFコードDNAを取得した。使用したプライマー名及び塩基配列の配列番号を表２に示す。
<3-2. Preparation of strike gas trigolactone receptor candidate protein>
An ORF-encoding DNA of a Striga trigolactone receptor candidate protein was obtained by PCR using cDNA prepared from Striga seeds as a template. The primer names used and the sequence numbers of the base sequences are shown in Table 2.
該DNAを大腸菌発現ベクター（ShHTL2、3、及び5〜11についてはp15TV-L、ShHTL1及び4についてはpDEST17）に組み込み、大腸菌（BL21-CodonPlus(DE3)、Agilent社製）に導入した。該大腸菌を培養し、目的タンパク質を定法に従ってHisタグ精製した。さらに、目的タンパク質を、AKTAシステムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex 200 increase（GEヘルスケア社製）、Running buffer組成：10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH7.0）で精製した。得られたストリゴラクトン受容体候補タンパク質（ShHTL1〜11及びShD14）を、以下の実施例3-3で用いた。 The DNA was incorporated into E. coli expression vectors (p15TV-L for ShHTL2, 3 and 5-11 and pDEST17 for ShHTL1 and 4) and introduced into E. coli (BL21-CodonPlus (DE3), Agilent). The E. coli was cultured, and the target protein was His tag purified according to a standard method. Furthermore, the target protein was purified by gel filtration chromatography (Superdex 200 increase (manufactured by GE Healthcare) using AKTA system, Running buffer composition: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0). The resulting strigolactone receptor candidate proteins (ShHTL1-11 and ShD14) were used in Example 3-3 below.
＜3-3．In vitro蛍光発光試験、及び競合試験＞
受容体として実施例3-2で調製したストリゴラクトン受容体候補タンパク質を用い、且つ被検化合物としてYLGを用いる以外は実施例1-1及び1-3と同様にしてin vitro蛍光発光試験及び競合試験を行い、YLGの各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するKm値、及び各競合化合物であるストリゴラクトンのIC50値を算出した。
<3-3. In vitro fluorescence test and competition test>
An in vitro fluorescence emission test is carried out in the same manner as in Examples 1-1 and 1-3 except that the strigolactone receptor candidate protein prepared in Example 3-2 is used as the receptor and YLG is used as the test compound. The competition test was performed to calculate the K m value for each strigolactone receptor candidate protein of YLG and the IC 50 value of each competitor compound, strigolactone.
in vitro蛍光発光試験の結果、ストリゴラクトン受容体候補タンパク質の内、ShHTL2〜11を用いた場合について、蛍光が確認された。また、競合試験の結果、ShHTL2〜11を用いた場合について、ストリゴラクトンにより蛍光強度が減少することが確認された。各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するYLGのKm値は、ShHTL2：3.2 ± 0.6μM、ShHTL3：8.3 ± 2.7μM、ShHTL4：2.8 ± 0.5 μM、ShHTL5：1.6 ± 0.2μM、ShHTL6：0.35 ± 0.02μM、ShHTL7：3.8 ± 0.7μM、ShHTL8：1.9 ± 1.2μM、ShHTL9：> 10μM、ShHTL10：3.0 ± 0.3μM、ShHTL11：6.1 ± 0.7μMであった。各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するストリゴラクトン（5DS）のIC50値は、ShHTL2：8.9 ± 1.5 μM、ShHTL3：9.3 ± 1.7μM、ShHTL4：0.30 ± 0.04μM 、ShHTL5：3.6 ± 1.3 μM、ShHTL6：0.19 ± 0.02μM、ShHTL7：0.12 ± 0.01μM、ShHTL8：0.36 ± 0.17μM、ShHTL9：1.2 ± 0.2μM、ShHTL10：0.62 ± 0.04μM、ShHTL11：1.6 ± 0.04μMであった。各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するストリゴラクトン（4DO）のIC50値は、ShHTL2：> 10μM、ShHTL3：5.1 ± 1.2μM、ShHTL4：0.84 ± 0.14μM 、ShHTL5：5.6 ± 1.5 μM、ShHTL6：0.29 ± 0.08μM、ShHTL7：0.11 ± 0.02μM、ShHTL8：0.17 ± 0.02μM、ShHTL9：1.0 ± 0.2μM、ShHTL10：0.25 ± 0.05μM、ShHTL11：4.3 ± 0.7μMであった。各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するストリゴラクトン（ORO）のIC50値は、ShHTL2：> 10μM、ShHTL3：> 10μM、ShHTL4：> 10μM 、ShHTL5：> 10μM μM、ShHTL6：0.058 ± 0.012μM、ShHTL7：1.1 ± 1.4μM ShHTL8：> 10μM、ShHTL9：1.6 ± 0.3μM、ShHTL10：0.39 ± 0.11μM、ShHTL11：4.8 ± 1.1μMであった。各ストリゴラクトン受容体候補タンパク質に対するストリゴラクトン（STR）のIC50値は、ShHTL2：> 10μM、ShHTL3：> 10μM、ShHTL4：5.8 ± 2.0μM 、ShHTL5：> 10μM μM、ShHTL6：0.36 ± 0.09μM、ShHTL7：0.12 ± 0.03μM ShHTL8：0.77 ± 0.13μM、ShHTL9：> 10μM、ShHTL10：> 10μM、ShHTL11：2.0 ± 0.1μMであった。以上より、ShHTL2〜11は、ストライガにおけるストリゴラクトン受容体として機能することが示唆された。 As a result of the in vitro fluorescent light emission test, fluorescence was confirmed in the case of using ShHTL 2 to 11 among strigolactone receptor candidate proteins. In addition, as a result of the competition test, it was confirmed that the strigolactone decreases the fluorescence intensity in the case of using ShHTLs 2 to 11. K m values for YLG for each Strigolactone receptor candidate protein, ShHTL2: 3.2 ± 0.6μM, ShHTL3 : 8.3 ± 2.7μM, ShHTL4: 2.8 ± 0.5 μM, ShHTL5: 1.6 ± 0.2μM, ShHTL6: 0.35 ± 0.02μM , ShHTL 7: 3.8 ± 0.7 μM, ShHTL 8: 1.9 ± 1.2 μM, ShHTL 9:> 10 μM, ShHTL 10: 3.0 ± 0.3 μM, ShHTL 11: 6.1 ± 0.7 μM. The IC 50 values of strigolactone (5DS) against each strigolactone receptor candidate protein are: ShHTL 2: 8.9 ± 1.5 μM, ShHTL 3: 9.3 ± 1.7 μM, ShHTL 4: 0.30 ± 0.04 μM, ShHTL 5: 3.6 ± 1.3 μM, ShHTL 6 : 0.19 ± 0.02 μM, ShHTL 7: 0.12 ± 0.01 μM, ShHTL 8: 0.36 ± 0.17 μM, ShHTL 9: 1.2 ± 0.2 μM, ShHTL 10: 0.62 ± 0.04 μM, ShHTL 11: 1.6 ± 0.04 μM. The IC 50 values of strigolactone (4DO) against each strigolactone receptor candidate protein are: ShHTL2:> 10 μM, ShHTL 3: 5.1 ± 1.2 μM, ShHTL 4: 0.84 ± 0.14 μM, ShHTL 5: 5.6 ± 1.5 μM, ShHTL 6: 0.29 ± 0.08 μM, ShHTL 7: 0.11 ± 0.02 μM, ShHTL 8: 0.17 ± 0.02 μM, ShHTL 9: 1.0 ± 0.2 μM, ShHTL 10: 0.25 ± 0.05 μM, ShHTL 11: 4.3 ± 0.7 μM. The IC 50 values of strigolactone (ORO) for each strigolactone receptor candidate protein are: ShHTL2:> 10 μM, ShHTL3:> 10 μM, ShHTL4:> 10 μM, ShHTL5:> 10 μM μM, ShHTL6: 0.058 ± 0.012 μM, ShHTL7 : 1.1 ± 1.4 μM ShHTL 8:> 10 μM, ShHTL 9: 1.6 ± 0.3 μM, ShHTL 10: 0.39 ± 0.11 μM, ShHTL 11: 4.8 ± 1.1 μM. The IC 50 values of strigolactone (STR) against each strigolactone receptor candidate protein are: ShHTL2:> 10 μM, ShHTL3:> 10 μM, ShHTL4: 5.8 ± 2.0 μM, ShHTL5:> 10 μM μM, ShHTL6: 0.36 ± 0.09 μM , ShHTL 7: 0.12 ± 0.03 μM ShHTL 8: 0.77 ± 0.13 μM, ShHTL 9:> 10 μM, ShHTL 10:> 10 μM, ShHTL 11: 2.0 ± 0.1 μM. From the above, it was suggested that ShHTLs 2 to 11 function as strigolactone receptors in strikers.
Claims (7)
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ１及びＲ２が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ３及びＲ４が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、アルキル基で置換されていてもよいベンゼン環を形成していてもよく、
Ｒ５は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ６は、アルコキシアルキル基若しくはアルカノイル基で保護されていてもよい水酸基、アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＳｕ（式中、Ｓｕはコハク酸イミド基を示す）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。）、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｉｍ（式中、Ｉｍは１−イミダゾリル基を示す。）であり、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、又はアルキル基であり、
ｎは、０又は１〜３の整数である。］
で表わされる化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物。 General formula (1) or (2):
R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group,
R 1 and R 2 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 3 and R 4 may combine with each other to form a benzene ring which may be substituted by an alkyl group, together with adjacent carbon atoms,
R 5 is a hydrogen atom or an alkyl group,
R 6 is a hydroxy group which may be protected by an alkoxyalkyl group or an alkanoyl group, an alkoxy group, a halogen atom, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, a sulfo group, —C (= O) OSu ( In the formula, Su represents a succinimide group), -C (= O) OC (= O) R (wherein R represents a C1-C6 alkyl group), or -C (= O) -Im (Wherein, Im represents a 1-imidazolyl group) ,
R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group,
n is an integer of 0 or 1 to 3. ]
Or a salt, hydrate or solvate thereof.
（ａ）被検物質の存在下で、ストリゴラクトン受容体と請求項５又は６に記載の蛍光プローブとを接触させる工程、 （ｂ）工程（ａ）の後、前記蛍光プローブの分解物の蛍光強度を測定し、該蛍光強度（被検蛍光強度）を、被検物質を接触させない場合の蛍光強度（対照蛍光強度）と比較する工程、
（ｃ）被検蛍光強度と対照蛍光強度とが有意に相違している場合に、被検物質を、ストライガ発芽調節物質として選択する工程。 Method of screening for a striga germination regulator comprising steps (a) to (c):
(A) contacting the strigolactone receptor with the fluorescent probe according to claim 5 or 6 in the presence of a test substance, (b) after the step (a), a decomposition product of the fluorescent probe Measuring the fluorescence intensity and comparing the fluorescence intensity (test fluorescence intensity) with the fluorescence intensity (control fluorescence intensity) when the test substance is not contacted;
(C) A step of selecting a test substance as a striga germination regulator when the test fluorescence intensity and the control fluorescence intensity are significantly different.
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