JP6474727B2 - 抗菌薬の標的としての鞭毛及びニードル複合体（インジェクトソーム）のループ - Google Patents

抗菌薬の標的としての鞭毛及びニードル複合体（インジェクトソーム）のループ Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、病原性細菌のＩＩＩ型分泌装置、より具体的にはニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法に関する。
発明の背景
細菌の鞭毛は、運動性細胞小器官として多くの細菌によって使用される、大きく複雑な構造である。それは３つの主な部分構造からなる：基部体、フック、及び繊維。大半の鞭毛タンパク質は最初は細胞内に局在し、病原性ＩＩＩ型分泌装置に進化的かつ構造的に関連した鞭毛特異的分泌装置によって細胞膜を横断して移動する（非特許文献１及び２）。鞭毛のＩＩＩ型分泌装置によるタンパク質の輸送は、高度に調節されている。分泌装置はまず、フックが適切な長さに達するまでロッド／フック型タンパク質を輸送する。その後、分泌装置は、フック型輸送から繊維型輸送へと基質特異性を切り替える（非特許文献３及び４）。サルモネラでは、基質特異性スイッチは、２つのタンパク質：ＦｌｉＫ及びＦｌｈＢによって制御されている（非特許文献５〜７）。
ＦｌｈＢは、鞭毛のＩＩＩ型分泌装置の不可欠な膜タンパク質である。それは以下の２つのドメインからなる：４つの膜貫通ヘリックスを有すると推定される疎水性Ｎ末端部分（ＦｌｈＢＴＭ）、及び、Ｃ末端細胞質ドメイン（ＦｌｈＢＣ）（非特許文献８）。２つのドメインは、可動性リンカーによって接続されている。このリンカーはＦｌｈＢタンパク質の高度に保存されている部分であり、ＩＩＩ型分泌装置（ＴＴＳＳ）にとって不可欠である。リンカー領域の欠失又は点突然変異は、分泌を完全に消失させるか又はかなり減少させる（非特許文献９及び１０）。サルモネラＦｌｈＢの野生型細胞質ドメインは、高度に保存されているＮＰＴＨ配列内のアミノ酸残基Ａｓｎ２６９とＰｒｏ２７０との間で自己触媒的切断を受ける（非特許文献１１）。この自己切断は、切り替えプロセスにとって不可欠である（非特許文献９及び１２）。Ａｓｎ２６９からＡｌａへの突然変異は切断を妨げ、輸送装置をフック型特異的状態にロックする。
ＦｌｈＢＣは、ＴＴＳＳの以下のいくつかの可溶性成分と相互作用することが示されている：ＦｌｉＨ、ＦｌｉＩ、ＦｌｉＪ（非特許文献１３）、膜タンパク質ＦｌｈＡの細胞質部分（非特許文献１４）、及びフック長制御タンパク質ＦｌｉＫ（非特許文献１５及び１６）。ＦｌｈＢとＦｌｉＫの相互作用は、基質特異性切り替えプロセスにとって重要であることが示唆されている（非特許文献１７）。ｆｌｉＫ遺伝子を欠失した細胞は、繊維が全く付着していない、「ポリフック」と呼ばれる、異常に長いフックを産生する（非特許文献６）。
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発明の目的
ニードルＴＴＳＳ由来のＦｌｈＢパラログの細胞質ドメインのいくつかの構造が公開されている（非特許文献１０、及び１８〜２０）。しかしながら、鞭毛の分泌装置由来のＦｌｈＢに関する構造的な情報は全く入手できない。従って、本発明の目的の一つは、２つの生物：サルモネラ・チフィムリウム及びアクイフェックス・エオリカスに由来する鞭毛のＦｌｈＢの細胞質ドメインの結晶構造を明らかにすることである。
鞭毛分泌装置のＦｌｈＢＣと宿主細胞の細胞質への毒素の分泌のために多くの病原性細菌によって利用されるニードルＩＩＩ型分泌装置のＦｌｈＢＣとの間の構造的関係に基づき、本発明の目的はまた、ＦｌｈＢＣの構造情報を使用して病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物を同定するための方法を提供することである。
発明の要約
本発明の最も重要な所見は、ＦｌｈＢＣの球状ドメインにおける大きな非保存ループの可動性が、分泌装置全体の機能にとって必要であるということである。ループの欠失又はより可動性の低いプロリン残基へのループの突然変異は、ＦｌｈＢＣをより堅くし、そうして分泌を消失させるか又はかなり減少させる。鞭毛タンパク質とニードルタンパク質との間の類似性を考慮すると、このループは、病原菌に対する新規な薬物の創製のための有望な標的であり得、以下の本発明が完成した。
本発明の１つの態様において、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法が提供され、該方法は、
候補化合物を、サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢのＣ末端細胞質ドメイン（ＦｌｈＢＣ）又はそのパラログのＣ末端細胞質ドメインと接触させる工程、
該候補化合物と、細胞質ドメインのループ領域又はその周囲との相互作用を分析する工程、及び
該ループ領域、又はＦｌｈＢ若しくは該パラログの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを接続するリンカーの可動性を減少させる化合物を選択する工程
を含み、選択された化合物は、病原性細菌による毒素の分泌を阻害することが示される。
好ましい実施態様において、本発明の方法における病原性細菌は、サルモネラ・チフィムリウム、アクイフェックス・エオリカス、ペスト菌、シゲラ・フレックスネリ、腸管出血性大腸菌、緑膿菌、及び腸炎ビブリオからなる群より選択される。
特定の実施態様において、サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢのパラログは、大腸菌由来のＥｓｃＵ、ペスト菌由来のＹｓｃＵ、サルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａＳ、及びシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０である。
他の特定の実施態様において、本発明の方法におけるＦｌｈＢ又はそのパラログの細胞質ドメインのループ領域は、サルモネラ番号付けにおいて、アミノ酸残基ＥＮＫＭＳ２８１−２８５からなる。
他の特定の実施態様において、本発明の方法における病原性細菌による毒素の分泌を阻害する化合物は、ＦｌｈＢ若しくはそのパラログの細胞質ドメインのループ領域、又はそのフランキング領域に結合することができ、該フランキング領域は、サルモネラ番号付けにおいて、保存されているアミノ酸残基Ｔｙｒ２７９及びＰｒｏ２８７を含む。
他の特定の実施態様において、本発明の方法における、該化合物と、ＦｌｈＢ若しくはそのパラログの細胞質ドメインのループ領域又はその周辺との相互作用は、該化合物が、サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢ及びそのΔ（２８１−２８５）突然変異タンパク質に異なって(differentially)結合するか否かで決定される。
他の特定の実施態様において、本発明の方法における病原性細菌による毒素の分泌を阻害する化合物は、抗体若しくはそのフラグメント、アプタマー又は低分子化合物である。
本発明の別の態様において、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法が提供され、該方法は、
ｉ）サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢ又はそのパラログと、ＦｌｈＢ又は該パラログの細胞質ドメインのループ領域と該候補化合物との間の水素結合により、相互作用することのできる候補化合物を選択する工程、
ｉｉ）該候補化合物を、鞭毛及びニードルＩＩＩ型分泌装置を有する細菌と接触させる工程、及び
ｉｉｉ）細菌からのタンパク質の分泌及び／又は細菌の鞭毛による運動性を減少させる化合物を選択する工程
を含み、選択された化合物は、病原性細菌による毒素の分泌を阻害することが示される。
１つの実施態様において、本発明の方法における、ＦｌｈＢ膜タンパク質又はそのパラログの細胞質ドメインのループ領域と、該候補化合物との間の水素結合は、サルモネラ番号付けにおけるアミノ酸残基ＥＮＫＭＳ２８１−２８５の少なくとも１つの側鎖を介して形成される。
本発明の別の態様において、本発明の方法によって同定された化合物が提供される。
本発明の別の態様において、同定された本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害するための医薬組成物が提供される。
１つの実施態様において、本発明の医薬組成物の化合物は、
７−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−１，３−ジメチル−３，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン、
５−（３，４，５−トリメトキシベンジル）ピリミジン−２，４−ジアミン、
及びその薬学的に許容される塩
の群から選択される。
本発明の別の態様において、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌によって引き起こされた疾患を処置する方法、該方法は、
該細菌を、本発明の医薬組成物と接触させること、及び
病原性細菌による毒素の分泌を阻害すること
を含む。
本発明の別の態様において、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害するための方法が提供され、該方法は、
該細菌を本発明の医薬組成物と接触させること、及び
病原性細菌による毒素の分泌を阻害すること
を含む。
本発明の別の態様において、宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害するための本発明の組成物の使用が提供される。
サルモネラＦｌｈＢＣの結晶における分子のパッキング。（ａ）非対称分子及び対称の分子が、それぞれ、緑色及び灰色で提示されている。ナトリウムイオンが赤紫色の球体として示され、亜鉛イオンが青色の球体として示されている。（ｂ）亜鉛結合部位の回転させた拡大図（図１ａにおける黒色のボックス）。Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図が、５σの等高線レベルで灰色で提示され、Ｚｎ原子を含まずに計算された。 サルモネラＦｌｈＢＣの結晶における分子のパッキング。（ａ）非対称分子及び対称の分子が、それぞれ、緑色及び灰色で提示されている。ナトリウムイオンが赤紫色の球体として示され、亜鉛イオンが青色の球体として示されている。（ｂ）亜鉛結合部位の回転させた拡大図（図１ａにおける黒色のボックス）。Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図が、５σの等高線レベルで灰色で提示され、Ｚｎ原子を含まずに計算された。 鞭毛ＦｌｈＢＣの構造。（ａ）サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣの結晶構造のリボン表示。（ｂ）サルモネラＦｌｈＢＣの表面上にマッピングされた静電気ポテンシャル。静電気は、ＡＰＢＳソフトウェア（Baker, N.A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M.J., McCammon, J.A. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10037-10041）を使用して計算され、±５ｋＴ/ｅでプロットされた。（ｃ）進化的に保存されているＦｌｈＢＣの残基。図は、ＣｏｎＳｕｒｆ（http://consurf.tau.ac.il/) (Ashkenazy et al., 2010)を用いて準備された。残基は、２００個の異なるＦｌｈＢタンパク質のアミノ酸配列における保存に従って着色されている。矢印は、β１とβ２との間の自己切断部位の位置を記す。 鞭毛ＦｌｈＢＣの構造。（ａ）サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣの結晶構造のリボン表示。（ｂ）サルモネラＦｌｈＢＣの表面上にマッピングされた静電気ポテンシャル。静電気は、ＡＰＢＳソフトウェア（Baker, N.A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M.J., McCammon, J.A. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10037-10041）を使用して計算され、±５ｋＴ/ｅでプロットされた。（ｃ）進化的に保存されているＦｌｈＢＣの残基。図は、ＣｏｎＳｕｒｆ（http://consurf.tau.ac.il/) (Ashkenazy et al., 2010)を用いて準備された。残基は、２００個の異なるＦｌｈＢタンパク質のアミノ酸配列における保存に従って着色されている。矢印は、β１とβ２との間の自己切断部位の位置を記す。 鞭毛ＦｌｈＢＣの構造。（ａ）サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣの結晶構造のリボン表示。（ｂ）サルモネラＦｌｈＢＣの表面上にマッピングされた静電気ポテンシャル。静電気は、ＡＰＢＳソフトウェア（Baker, N.A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M.J., McCammon, J.A. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10037-10041）を使用して計算され、±５ｋＴ/ｅでプロットされた。（ｃ）進化的に保存されているＦｌｈＢＣの残基。図は、ＣｏｎＳｕｒｆ（http://consurf.tau.ac.il/) (Ashkenazy et al., 2010)を用いて準備された。残基は、２００個の異なるＦｌｈＢタンパク質のアミノ酸配列における保存に従って着色されている。矢印は、β１とβ２との間の自己切断部位の位置を記す。 鞭毛ＦｌｈＢＣ及びそのニードルＩＩＩ型分泌装置由来のパラログの比較。サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢＣ（Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ）（スイスプロットアクセッション番号Ｐ４０７２７）と、アクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢＣ（Ａｑｕ ＦｌｈＢＣ）（Ｏ６７８１３）、大腸菌由来のＥｓｃＵＣ（Ｑ７ＤＢ５９）、ペスト菌由来のＹｓｃＵＣ（Ｐ６９９８６）、チフス菌由来のＳｐａＳＣ（Ｐ４０７０２）、及びシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０Ｃ（Ｑ６ＸＶＷ１）の多重配列アラインメント。同一残基は赤色でボックスで囲まれており；類似残基は赤色に着色されている。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I.M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G. (2007). Bioinformatics, 23, 2947-2948; Goujon, M., McWilliam, H., Li, W., Valentin, F., Squizzato, S., Paern, J., Lopez, R. (2010). Nucleic Acids Res. 38, W695-699）を用いて実施された。（ｂ）サルモネラＦｌｈＢＣ（青色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｂ０Ｚ）、アクイフェックスＦｌｈＢＣ（赤色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｂ１Ｓ）、ＥｓｃＵＣ（オレンジ色）（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＺＯ）、ＹｓｃＵＣ（灰色）（ＰＤＢ ＩＤ：２ＪＬＩ）、ＳｐａＳＣ（緑色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｃ０１）、及びＳｐａ４０Ｃ（紫色）（ＰＤＢ ＩＤ：２ＶＴ１）の重ね合わせのステレオ図。 鞭毛ＦｌｈＢＣ及びそのニードルＩＩＩ型分泌装置由来のパラログの比較。サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢＣ（Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ）（スイスプロットアクセッション番号Ｐ４０７２７）と、アクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢＣ（Ａｑｕ ＦｌｈＢＣ）（Ｏ６７８１３）、大腸菌由来のＥｓｃＵＣ（Ｑ７ＤＢ５９）、ペスト菌由来のＹｓｃＵＣ（Ｐ６９９８６）、チフス菌由来のＳｐａＳＣ（Ｐ４０７０２）、及びシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０Ｃ（Ｑ６ＸＶＷ１）の多重配列アラインメント。同一残基は赤色でボックスで囲まれており；類似残基は赤色に着色されている。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I.M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G. (2007). Bioinformatics, 23, 2947-2948; Goujon, M., McWilliam, H., Li, W., Valentin, F., Squizzato, S., Paern, J., Lopez, R. (2010). Nucleic Acids Res. 38, W695-699）を用いて実施された。（ｂ）サルモネラＦｌｈＢＣ（青色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｂ０Ｚ）、アクイフェックスＦｌｈＢＣ（赤色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｂ１Ｓ）、ＥｓｃＵＣ（オレンジ色）（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＺＯ）、ＹｓｃＵＣ（灰色）（ＰＤＢ ＩＤ：２ＪＬＩ）、ＳｐａＳＣ（緑色）（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｃ０１）、及びＳｐａ４０Ｃ（紫色）（ＰＤＢ ＩＤ：２ＶＴ１）の重ね合わせのステレオ図。 タンパク質の機能に対する、サルモネラＦｌｈＢの領域ＥＮＫＭＳ２８１−２８５の突然変異の効果。（ａ）サルモネラＦｌｈＢＣのリボン表示；該領域は黒色である。（ｂ）ΔｆｌｈＢサルモネラＭＬＭ５０株を補完する、改変されたＥＮＫＭＳ領域を有するＦｌｈＢ変異体の能力。運動性は、３０３Ｋで５時間、半固体寒天プレート上で実施された。ＦｌｈＢ産物は、１）なし、空ベクター、２）野生型ＦｌｈＢ、３）ＦｌｈＢΔ（２８１−２８５）、４）ＦｌｈＢ ＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び５）ＦｌｈＢ ＰＰＰＰＰ２８１−２８５であった。（ｃ）種々のＦｌｈＢ変異体を産生しているＭＫＭ５０サルモネラ株に由来する完全細胞及び培養上清画分に対する、抗ＦｌｇＥ抗体及び抗ＦｌｉＣ抗体を使用したイムノブロット。 タンパク質の機能に対する、サルモネラＦｌｈＢの領域ＥＮＫＭＳ２８１−２８５の突然変異の効果。（ａ）サルモネラＦｌｈＢＣのリボン表示；該領域は黒色である。（ｂ）ΔｆｌｈＢサルモネラＭＬＭ５０株を補完する、改変されたＥＮＫＭＳ領域を有するＦｌｈＢ変異体の能力。運動性は、３０３Ｋで５時間、半固体寒天プレート上で実施された。ＦｌｈＢ産物は、１）なし、空ベクター、２）野生型ＦｌｈＢ、３）ＦｌｈＢΔ（２８１−２８５）、４）ＦｌｈＢ ＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び５）ＦｌｈＢ ＰＰＰＰＰ２８１−２８５であった。（ｃ）種々のＦｌｈＢ変異体を産生しているＭＫＭ５０サルモネラ株に由来する完全細胞及び培養上清画分に対する、抗ＦｌｇＥ抗体及び抗ＦｌｉＣ抗体を使用したイムノブロット。 タンパク質の機能に対する、サルモネラＦｌｈＢの領域ＥＮＫＭＳ２８１−２８５の突然変異の効果。（ａ）サルモネラＦｌｈＢＣのリボン表示；該領域は黒色である。（ｂ）ΔｆｌｈＢサルモネラＭＬＭ５０株を補完する、改変されたＥＮＫＭＳ領域を有するＦｌｈＢ変異体の能力。運動性は、３０３Ｋで５時間、半固体寒天プレート上で実施された。ＦｌｈＢ産物は、１）なし、空ベクター、２）野生型ＦｌｈＢ、３）ＦｌｈＢΔ（２８１−２８５）、４）ＦｌｈＢ ＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び５）ＦｌｈＢ ＰＰＰＰＰ２８１−２８５であった。（ｃ）種々のＦｌｈＢ変異体を産生しているＭＫＭ５０サルモネラ株に由来する完全細胞及び培養上清画分に対する、抗ＦｌｇＥ抗体及び抗ＦｌｉＣ抗体を使用したイムノブロット。 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで観察されたサルモネラＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスの可動性。（ａ）表２のＭＤ分析に使用された重要な残基及びベクトル。残基２２９−２３８、２３８−２５６、２５６−２６４、２６５−２６９及び２３８−２６４を接続しているベクトルは、それぞれＶ１−Ｖ５と定義される。（ｂ−ｅ）（ｂ）野生型ＦｌｈＢＣ、（ｃ）ＦｌｈＢＣΔ（２８１−２８５）、（ｄ）ＦｌｈＢＣＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び（ｅ）ＦｌｈＢＣＰＰＰＰＰ２８１−２８５について球状ドメインを重ね合わせた場合のＭＤの最中のＮ末端αヘリックスの構造変化。各場合について、Ｄ、θ１４及びχ５の最大値及び最小値に基づいて６つのスナップ写真を選択した（その定義については表２参照）。 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで観察されたサルモネラＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスの可動性。（ａ）表２のＭＤ分析に使用された重要な残基及びベクトル。残基２２９−２３８、２３８−２５６、２５６−２６４、２６５−２６９及び２３８−２６４を接続しているベクトルは、それぞれＶ１−Ｖ５と定義される。（ｂ−ｅ）（ｂ）野生型ＦｌｈＢＣ、（ｃ）ＦｌｈＢＣΔ（２８１−２８５）、（ｄ）ＦｌｈＢＣＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び（ｅ）ＦｌｈＢＣＰＰＰＰＰ２８１−２８５について球状ドメインを重ね合わせた場合のＭＤの最中のＮ末端αヘリックスの構造変化。各場合について、Ｄ、θ１４及びχ５の最大値及び最小値に基づいて６つのスナップ写真を選択した（その定義については表２参照）。 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで観察されたサルモネラＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスの可動性。（ａ）表２のＭＤ分析に使用された重要な残基及びベクトル。残基２２９−２３８、２３８−２５６、２５６−２６４、２６５−２６９及び２３８−２６４を接続しているベクトルは、それぞれＶ１−Ｖ５と定義される。（ｂ−ｅ）（ｂ）野生型ＦｌｈＢＣ、（ｃ）ＦｌｈＢＣΔ（２８１−２８５）、（ｄ）ＦｌｈＢＣＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び（ｅ）ＦｌｈＢＣＰＰＰＰＰ２８１−２８５について球状ドメインを重ね合わせた場合のＭＤの最中のＮ末端αヘリックスの構造変化。各場合について、Ｄ、θ１４及びχ５の最大値及び最小値に基づいて６つのスナップ写真を選択した（その定義については表２参照）。 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで観察されたサルモネラＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスの可動性。（ａ）表２のＭＤ分析に使用された重要な残基及びベクトル。残基２２９−２３８、２３８−２５６、２５６−２６４、２６５−２６９及び２３８−２６４を接続しているベクトルは、それぞれＶ１−Ｖ５と定義される。（ｂ−ｅ）（ｂ）野生型ＦｌｈＢＣ、（ｃ）ＦｌｈＢＣΔ（２８１−２８５）、（ｄ）ＦｌｈＢＣＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び（ｅ）ＦｌｈＢＣＰＰＰＰＰ２８１−２８５について球状ドメインを重ね合わせた場合のＭＤの最中のＮ末端αヘリックスの構造変化。各場合について、Ｄ、θ１４及びχ５の最大値及び最小値に基づいて６つのスナップ写真を選択した（その定義については表２参照）。 分子動力学（ＭＤ）シミュレーションで観察されたサルモネラＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスの可動性。（ａ）表２のＭＤ分析に使用された重要な残基及びベクトル。残基２２９−２３８、２３８−２５６、２５６−２６４、２６５−２６９及び２３８−２６４を接続しているベクトルは、それぞれＶ１−Ｖ５と定義される。（ｂ−ｅ）（ｂ）野生型ＦｌｈＢＣ、（ｃ）ＦｌｈＢＣΔ（２８１−２８５）、（ｄ）ＦｌｈＢＣＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及び（ｅ）ＦｌｈＢＣＰＰＰＰＰ２８１−２８５について球状ドメインを重ね合わせた場合のＭＤの最中のＮ末端αヘリックスの構造変化。各場合について、Ｄ、θ１４及びχ５の最大値及び最小値に基づいて６つのスナップ写真を選択した（その定義については表２参照）。 候補化合物の存在下における細菌増殖。縦軸は、６００nmにおける光学密度（ＯＤ６００）を示す。横軸は、測定された時点を示す（２、４、６、８及び１０時間後）。 ＦｌｇＤ分泌に対する、スクリーニングされた化合物の阻害効果。（ａ）及び（ｂ）スクリーニングされた化合物と共に８時間インキュベートされたサルモネラ・チフィムリウムＳＪＷ１１０３株の懸濁液のウェスタンブロット。 ＦｌｇＤ分泌に対する、スクリーニングされた化合物の阻害効果。（ａ）及び（ｂ）スクリーニングされた化合物と共に８時間インキュベートされたサルモネラ・チフィムリウムＳＪＷ１１０３株の懸濁液のウェスタンブロット。
発明の詳細な説明
本発明をより詳細に以下に記載する前に、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール及び試薬は変更され得るので、本発明はこれに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書に使用された用語は、特定の実施態様を記載する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。特記しない限り、本明細書に使用された全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書に引用された全ての参考文献のその全体が参照により組み入れられる。
本明細書に使用される「ＦｌｈＢＣ」という用語は、鞭毛のＩＩＩ型分泌装置の不可欠な膜タンパク質であるＦｌｈＢのＣ末端細胞質ドメインを指す。本発明の文脈においては、サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢが好ましい。サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢ及びそのＦｌｈＢＣは、例えば、非特許文献１１に記載されている。サルモネラ・チフィムリウムのＦｌｈＢのアミノ酸配列の典型例が、スイスプロットアクセッション番号Ｐ４０７２７（配列番号１）に提供されている。本発明の目的のために、「ＦｌｈＢ」という用語はまた、サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢの変異体がその生理学的活性及びその結晶化特性を維持する限り、サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢの変異体も指す。このような変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列を有し得る。ＦｌｈＢＣのアミノ酸配列は、上記に定義されたＦｌｈＢから容易に決定される。好ましくは、ＦｌｈＢＣのアミノ酸配列は、配列番号１の２１９位から３８３位のアミノ酸又はその変異体である。
サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢのパラログもまた、本発明に包含される。より具体的には、該パラログは、アクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢ（典型的なアミノ酸配列は、スイスプロットアクセッション番号Ｏ６７８１３（配列番号２）に提供されている）、大腸菌由来のＥｓｃＵ（典型的なアミノ酸配列はスイスプロットアクセッション番号Ｑ７ＤＢ５９（配列番号３）に提供されている）、ペスト菌由来のＹｓｃＵ（典型的なアミノ酸配列はスイスプロットアクセッション番号Ｐ６９９８６（配列番号４）に提供されている）、サルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａｓ（典型的なアミノ酸配列は、スイスプロットアクセッション番号Ｐ４０７０２（配列番号５）に提供されている）、及びシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０（典型的なアミノ酸配列はスイスプロットアクセッション番号Ｑ６ＸＶＷ１（配列番号６）に提供されている）が挙げられるがこれらに限定されない。パラログの細胞質ドメインは、このようなパラログの完全長アミノ酸配列から容易に決定される。
本明細書において使用される「病原性細菌」という用語は、ニードルＩＩＩ型分泌装置を有する任意の細菌を指す。このような細菌は、ＡＢ毒素をはじめとする毒素を分泌し得る。病原性細菌の例としては、サルモネラ・チフィムリウム、アクイフェックス・エオリカス、ペスト菌、シゲラ・フレックスネリ、腸管出血性大腸菌、緑膿菌、及び腸炎ビブリオが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のＦｌｈＢＣ又はそのパラログのループ領域は、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログにおけるβ２ストランドとβ３ストランドとを接続している長い可動性のループを構成する、連続アミノ酸残基を指す。ループの長さは、２つのβストランドを単に接続するのに必要な長さよりも長い。このループ領域は、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログの結晶から得られた構造情報を使用して決定され得る。これに関して、例示的な結晶は、Ｐ４２２１２空間群及びＣ２群にそれぞれ属する、サルモネラ・チフィムリウムのＦｌｈＢＣから結晶化されたもの、並びに、ＦｌｈＢＣアクイフェックス・エオリカスから結晶化されたものである。このような結晶の結晶情報は表１及び２に示されている。上記の結晶から得られた構造情報の原子座標及び構造因子は、ＰＤＢに、サルモネラ・チフィムリウム及びアクイフェックス・エオリカスについてそれぞれアクセッションコード３Ｂ０Ｚ及び３Ｂ１Ｓで寄託されている。好ましいループ領域は、サルモネラ番号付けのアミノ酸残基ＥＮＫＭＳ２８１−２８５からなる。
本発明のＦｌｈＢＣ又はそのパラログのループ領域は、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログのＮ末端αヘリックスの可動性に影響を及ぼし得る。ＦｌｈＢＣ又はそのパラログの「可動性」は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。１つの実施態様において、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログの可動性は、本明細書の以下の実施例に開示されているように、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログの構造情報を使用して、分子動力学シミュレーション（ＭＤＳ）によって決定され得る。別の実施態様において、ＦｌｈＢＣ又はそのパラログの可動性の変化は、実施例に開示されているような分泌アッセイ又は運動性アッセイによって調べられ得る。分泌アッセイにおける細菌の分泌活性の減少は、ＦｌｈＢＣの可動性の減少を示す。同様に運動性アッセイにおいて、細菌の運動活性の減少は、ＦｌｈＢＣの可動性の減少を示す。
本明細書において使用されるループ領域の「フランキング領域」という用語は、ループ領域のＮ末端又はＣ末端にフランキングしたいくつかのアミノ酸配列を含む領域を指す。フランキング領域の長さは、１〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは５〜１０アミノ酸長であり得る。好ましくは、フランキング領域は、サルモネラ番号付けにおける、保存されているアミノ酸残基Ｔｙｒ２７９及びＰｒｏ２８７を含む。
上記に示されているように、本発明は、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法を提供し、該方法は、
候補化合物を、サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢ又はそのパラログのＣ末端細胞質ドメイン（ＦｌｈＢＣ）と接触させる工程、
該候補化合物と、細胞質ドメイン（ＦｌｈＢＣ）のループ領域又はその周辺との相互作用を分析する工程、
該ループ領域、又はＦｌｈＢの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを接続するリンカーの可動性を減少させる化合物を選択する工程
を含み、選択された化合物は、病原性細菌による毒素の分泌を阻害することが示される。
候補化合物をＦｌｈＢＣ又はそのパラログと接触させるために、候補化合物及びＦｌｈＢＣ又はそのパラログを同じ場所に存在させることを可能とする、当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる。候補化合物を、固体中で、溶液中で、又は大気中でＦｌｈＢＣと接触させることができる。接触工程はまた、本明細書において以下に詳細に記載されているようにインシリコで(in silico)実施されてもよい。
候補化合物と、ＦｌｈＢＣ若しくはそのパラログのループ領域又はその周辺との相互作用を分析するために。本発明に従って、候補化合物とＦｌｈＢＣ又はそのパラログとの間の相互作用のしかたの決定を可能とする当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる。このような技術としては、Ｂｉａｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。接触工程はまた、本明細書において以下に詳細に記載されているようにインシリコで実施されてもよい。
ループ領域、又はＦｌｈＢの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを接続するリンカーの可動性を減少させる化合物を選択するために、ＦｌｈＢＣの可動性の決定を可能とする当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる。実施例に開示されたＭＤＳアッセイ、分泌アッセイ、及び運動性アッセイをこの工程のために使用することができる。
本発明の方法の各工程について、本明細書において開示されたＦｌｈＢＣの構造情報を使用する、当技術分野において公知のインシリコ技術も使用することもできる。例えば、コンピューターモデリングを、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、ＨＯＯＫ、又はＡＵＴＯＤＯＣＫなどのドッキングプログラムを使用して実施することができる（Dunbrack, et al. (1997) Folding & Design 2:27-42）。あるいは、ＧＲＩＤ（Molecular Discovery Ltd., UK）ソフトウェアパッケージを使用して、化学プローブアプローチを実施することができる。これらの技術は、ＦｌｈＢＣ若しくはそのパラログのループ領域又はその周辺との強い親和性を有する化合物のシミュレーションを可能とする。
あるいは、フラグメントベースドリードディスカバリー（ＦＢＬＤ）法（Rees D.C., Congreve M., Murray C.W., Carr R. (2004). Nature Reviews Drug Discovery 3, 660-672）を、本発明のためのインシリコ技術として使用することができる。この方法は、市販されている化合物の「フラグメント情報」及び目的のタンパク質の構造情報を使用した、コンピュータースクリーニング法である。この方法で主に考慮される力は、水素結合であり得る。ＦＢＬＤ法の詳細は、本明細書の以下の実施例に説明されるだろう。
本発明においてスクリーニングしようとする候補化合物は、任意の化学実体（chemicalentity）であり得る。候補化合物としては、抗体、そのフラグメント、アプタマー及び低分子化合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。
上記のスクリーニング法によって同定された化合物も、本発明に包含される。選択された市販されている化合物の例が、以下の表に列挙されている：
同定された化合物は、医薬組成物へと製剤化され得る。
医薬組成物の生産は、同定された化合物及び／又はその薬学的に許容される塩を、場合により他の治療上価値ある物質と組み合わせて、適切な無毒性で不活性の治療上適合する固体又は液体の担体材料、及び所望であれば、通常の薬学的アジュバントと一緒に、ガレノス投与剤形とすることにより、当業者によく知られた方法で行なわれ得る。
適切な担体材料は、無機担体材料だけでなく、また有機担体材料でもある。従って、例えば、乳糖、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩は、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、及び硬ゼラチンカプセル剤のための担体材料として使用され得る。軟ゼラチンカプセル剤に適した担体材料は、例えば、植物油、ワックス、脂肪、並びに半固体及び液体のポリオールである（しかしながら、活性成分の性質次第では、軟ゼラチンカプセル剤の場合には担体が必要とされない事もあり得る）。液剤及びシロップ剤の製造のための適切な担体材料は、例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖などである。注射液のための適切な担体材料は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール及び植物油である。坐剤のための適切な担体材料は、例えば、天然油又は硬化油、ワックス、脂肪、及び半液体又は液体のポリオールである。局所製剤のための適切な担体材料は、グリセリド、半合成及び合成グリセリド、水素添加油、液体ワックス、流動パラフィン、液体脂肪族アルコール、ステロール、ポリエチレングリコール、及びセルロース誘導体である。
通常の安定化剤、保存剤、湿潤剤及び乳化剤、粘度改善剤、芳香改善剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝物質、可溶化剤、着色剤及びマスキング剤、並びに抗酸化剤が、薬学的アジュバントとして考慮される。
投与量は、幅広い範囲内で変化し得、勿論、各々の特定の症例において個々の必要条件に合わせられる。一般的に、経口投与の場合、１人あたり同定された化合物約１０〜１０００mgの１日投与量が適切であるが、上記の上限は必要であれば超えてもよい。
同定された化合物又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌によって引き起こされた疾患を治療又は予防するために使用され得る。該疾患としては、胃痛、下痢、悪心、嘔吐及び痙攣が挙げられ得るがこれらに限定されない。医薬組成物はまた、病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害するために使用され得る。
治療又は予防は、典型的には、処置の必要な被験体に、本発明のスクリーニング法において同定された化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む。大半の場合において、これはヒトであるが、農業用動物、例えば家畜及び家禽、並びにコンパニオン・アニマル、例えばイヌ、ネコ及びウマの治療も、本明細書において明示的に包含されている。化合物の投与量又は有効量の選択は、処置される疾患の少なくとも１つの兆候又は症状を予防、低減又は逆転するという望ましい転帰を有するものである。
本発明は、以下の非制限的な実施例によってより詳細に記載される。
実施例
実施例１：材料及び方法
１．１． 構造の決定
サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣの精製、結晶化及びデータ収集の詳細は記載された（Meshcheryakov, V.A. and Samatey, F.A. (2011). Acta Cryst. F67, 808-811; Meshcheryakov, V.A., Yoon, Y.-H. and Samatey, F.A. (2011). Acta Cryst. F67, 280-282）。両方の構造が、プログラムＳＨＥＬＸＤ（Sheldrick, G.M. (2008). Acta Cryst. A64, 112-122）を使用して多波長異常分散（ＭＡＤ）法によって解析された。初期タンパク質モデルは、ＣＣＰ４パッケージ（Winn, M.D., Ballard, C.C., Cowtan, K.D., Dodson, E.J., Emsley, P., Evans, P.R., Keegan, R.M., Krissinel, E.B., Leslie, A.G.W., McCoy, A., McNicholas, S.J., Murshudov, G.N., Pannu, N.S., Potterton, E.A., Powell, H.R., Read, R.J., Vagin, A., Wilson, K.S. (2011) Acta Cryst. D67, 235-242）のＢｕｃｃａｎｅｅｒ（Cowtan, K. (2006). Acta Cryst. D62, 1002-1011）を用いて自動的に構築された。モデルは、Ｒｅｆｍａｃ５を用いての精密化（Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D., Long, F., Vagin, A.A. (2011) Acta Cryst. D67, 355-367）及びＣＯＯＴでのマニュアルモデル構築（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G., Cowtan, K. (2010). Acta Cryst. D66, 486-501）の反復組合せを通して精密化された。サルモネラＦｌｈＢＣの場合、ＴＬＳ精密化は、１つのＦｌｈＢＣ分子につき２つのＴＬＳグループを用いて最終段階で実施された（残基２２９−２６９及び２７０−３５３）（Painter, J. and Merritt, E.A. (2006) Acta Cryst. D62, 439-450）。構造図はＰｙＭＯＬ（http://www.pymol.org）で作成した。
１．２． ＤＮＡ操作及び運動性アッセイ
プラスミドｐＭＭ２６によって担持されるサルモネラ・チフィムリウムｆｌｈＢの突然変異は（非特許文献１１）、以前に記載されているように実施された（Wang, W., Malcolm, B.A. (1999). BioTechniques, 26, 680-682）。運動性アッセイのために、新しく形質転換されたサルモネラ細胞を、０．３５％（ｗ/ｖ）寒天を含有する軟トリプトン寒天に直接コロニーとして接種し、３０３Ｋでインキュベートした。
１．３． 完全細胞及び培養上清画分の調製、並びにイムノブロット
適切なプラスミドを担持するサルモネラ細胞ＭＫＭ５０（ΔｆｌｈＢ株）（非特許文献９）を、光学密度ＯＤ６００が１．４〜１．５に到達するまで、１００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で３１０Ｋでインキュベートした。一定量の細胞を含有する培養液のアリコートを遠心分離にかけた。細胞ペレットを、等容量のＳＤＳローディング緩衝液に懸濁した。培養上清中のタンパク質を、１０％トリクロロ酢酸によって沈殿させ、ＳＤＳローディング緩衝液中に懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質を、抗ＦｌｇＥ抗体及び抗ＦｌｉＣ抗体を用いて、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（登録商標）発色免疫検出キット（Invitrogen）を使用して検出した。
１．４． 分子動力学シミュレーション
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを、ＳＣＵＢＡ（Simulation Codes for hUge Biomolecular Assembly）プログラムパッケージ（Ishida, H., Higuchi, M., Yonetani, Y., Kano, T., Joti, Y., Kitao, A., Go, N. (2006）. Annual Report of the Earth Simulator Center, 237-239)を使用して実施した。ＡＭＢＥＲ ｆｆ９９ＳＢ力場（Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. (2006) Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 65, 712-725）をタンパク質用に使用した。シミュレーションされる系は、初期段階で、ＦｌｈＢＣ分子から少なくとも１２Å離れた周期的境界において、１００mM ＫＣｌを含むＳＰＣ／Ｅ水分子（Berendsen, H. J.C., Grigera, J.R., Straatsma, T.P. (1987). J. Phys. Chem. 91, 6269-6271）を用いて溶媒和された。エネルギー最小化及び０．２７ナノ秒のＭＤシミュレーションにより、系の温度及び圧力を位置拘束して３００Ｋ及び１気圧に調整した後、４０ナノ秒のＭＤシミュレーションを、拘束なしにカノニカル分布で実施した。最後の２０ナノ秒の軌道は分析のために使用した。実空間非結合エネルギーのシフトフォース(shifted-force)のカットオフ距離は１２Åに設定され、粒子-粒子・粒子-格子(particle-particle-particle-mesh) (PPPM)法(Deserno, M., Holm, C. (1998). J. Chem. Phys. 109, 7678-7693)が、フーリエ空間における静電気エネルギー計算のために使用された。運動方程式の積分が、カノニカル分布でのマルチ時間ステップ法ＸＯＲＥＳＰＡ（Martyna, G.J., Tuckerman, M.E., Tobias, D.J., Klein, M.L. (1996). Mol. Phys. 87, 1117-1157）を使用して実施された。速いエネルギー項（結合及び角度）、中程度のエネルギー項（ねじれ及び実空間非結合）並びに遅いエネルギー項（フーリエ空間非結合）の積分は、それぞれ０．５、１．０及び２．０フェムト秒毎に実施された。
１．５． アクセッション番号
原子座標及び構造因子が、ＰＤＢに、サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣについて、それぞれアクセッションコード３Ｂ０Ｚ及び３Ｂ１Ｓで登録されている。ここに報告された構造は、インタラクティブ３Ｄでhttp://Proteopedia.Org/w/Samateyで説明されている。
結果
実施例２：鞭毛ＦｌｈＢＣ構造の記載
サルモネラ（Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ）及びアクイフェックス（Ａｑｕ ＦｌｈＢＣ）ＦｌｈＢＣの構造を、セレノメチオニン誘導体を使用して多波長異常分散（ＭＡＤ）法によって解いた（Meshcheryakov et al., 2011; Meshcheryakov and Samatey, 2011）（表１）。
Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ及びＡｑｕ ＦｌｈＢＣ結晶は、異なる空間群、それぞれ、Ｐ４２２１２及びＣ２に属していた。Ａｑｕ ＦｌｈＢＣ結晶の場合、非対称単位中に３つのタンパク質分子が存在した。非対称単位中の３つの分子は非常に類似し、ペアワイズな重ね合わせについてのＲＭＳＤは０．４０〜０．７６Åの範囲であった。各分子は、Ａｓｎ２６３の後のタンパク質分解的切断から生じた２つのポリペプチド鎖から構成されていた。全ての分子について、Ｎ末端の残基２１３−２３１に電子密度は見られず；分子によっては、Ｃ末端の２〜６残基は構造が欠如していた(disordered)。
Ｓａｌ ＦｌｈＢＣの場合、最終モデルは、結晶化タンパク質の２１９−３８３の中の残基２２９−３５３を含んでおり、Ａｓｎ２６９の後に切断があった。残基２１９−２２８及び３５４−３８３について電子密度は見られなかった。サルモネラＦｌｈＢＣのモデルは、２つのＺｎイオン及び２つのＮａイオンを含んでいた（図１ａ）。これらの原子は全て、結晶格子における分子間相互作用を媒介していた。Ｚｎ２＋を結晶化溶液に加えたが、これは十分に回折する結晶を得るために必要であった。結晶学的パッキングの分析は、亜鉛イオンの１つが、３つの対称なＳａｌＦｈＢＣ分子に由来する３つのグルタミン酸残基：Ｇｌｕ２３０、Ｇｌｕ２５８及びＧｌｕ３０７に配位していたことを示した（図１ｂ）。この相互作用は、サルモネラＦｌｈＢＣの最も可動性が高い部分の１つであるＮ末端ヘリックスα１を（以下参照）、２つの対称分子間に固定させる。
サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣ構造の両方が、非常に類似した折り畳みを示し、１０２個のＣα原子についてのＲＭＳＤは１．０３Åであった（図２ａ）。鞭毛ＦｌｈＢＣは、４本のα−ヘリックスによって囲まれた、４本鎖β−シート１つから構成された、球状ドメインからなっていた。球状ドメインに先行して、ＦｌｈＢの細胞質球状部分を膜貫通ドメインに接続する長いＮ末端α−ヘリックス（α１）が存在していた。α１ヘリックスは、サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣ結晶の両方において結晶コンタクトに関与し、これは、球状ドメインに対するその配向に影響を及ぼし得る。しかしながら、これらの結晶コンタクトは異なっていた。Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ結晶では、α１は、主に、隣接する分子のα１及びα２に接触していたが、Ａｑｕ ＦｌｈＢＣ結晶では、α１は、主に、α４、及びβ１とβ２との間の切断部位と接触していた。
Ｓａｌ ＦｌｈＢＣとＡｑｕ ＦｌｈＢＣの間の主な差異は、Ｎ末端領域である。Ｓａｌ ＦｌｈＢＣのモデルでは、ヘリックスα１がより長く、かつ、よく保存されている残基Ｇｌｙ２３６において屈曲(kink)を有していた。しかしながら、Ａｑｕ ＦｌｈＢＣにおいては、結晶化タンパク質には構造が欠如したセグメント２１３−２３１に２残基だけ入り込んだ位置に高度に保存されているＧｌｙ２３０が存在するのにもかかわらず、モデルには欠けているので、Ａｑｕ ＦｌｈＢＣに屈曲を有するより長いヘリックスが存在する可能性が排除されたわけではない。屈曲は結晶パッキングに起因し得るが、本発明者らのデータは、この保存されているグリシン残基の周辺でのリンカーが可動性である可能性を示した。このような可動性の重要性は、ニードルＴＴＳＳのＦｌｈＢパラログであるＥｓｃＵについて以前に示されている。ＥｓｃＵにおけるＧｌｙ２２９（ＳａｌＦｌｈＢのＧｌｙ２３６に相当する）からより可動性の低いプロリンへの突然変異は、分泌を完全に消失させた（非特許文献１０）。
保存されているＮＰＴＨ自己切断部位は、ストランドβ１とストランドβ２の間の表面上に露出していた。サルモネラ及びアクイフェックスＦｌｈＢＣの両方が、ＰＴＨ領域の異なるコンフォメーションを示し、これはその可動性を示唆した。これは、ニードルパラログとは非常に異なっていた。全ての公知のパラログ構造において、ＰＴＨ領域は同じ配向を有し、そしてこれは周辺の残基との接触によって安定化されている（非特許文献１０；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。鞭毛ＦｌｈＢＣにおけるＰＴＨ部位のより大きな可動性が、何らかの機能的な意味を有するかどうかを述べることはさしあたり困難であった。Ｓａｌ ＦｌｈＢＣにおいては、ＰＴＨ領域は、球状ドメイン中の隣接残基及びリンカーα−ヘリックスのＣ末端部分と一緒に、正に荷電した溝状構造を形成していた（図２ｂ）。類似の正に荷電した溝状構造がＡｑｕ ＦｌｈＢＣにも存在していた。このような溝状構造は、鞭毛分泌装置によって分泌されるタンパク質の認識部位である可能性があり得る。ＦｌｈＢの自己切断は、ＩＩＩ型分泌装置の他の構成部分のための相互作用部位を作ると示唆されている（非特許文献１０；非特許文献１８）。特に、ＦｌｈＢの切断されたＮＰＴＨループへのＦｌｉＫの結合を記述したモデルが存在する（非特許文献２１）。しかしながら、ＦｌｈＢタンパク質の最もよく保存されている部分の１つであったリンカーヘリックス（図２ｃ）もまた、分泌タンパク質の認識に関与しているかもしれない。なぜなら、ＦｌｈＢのこの領域における欠失又は点突然変異は、分泌を完全に遮断するからである（非特許文献９；非特許文献１０）。
実施例３：ニードルパラログ構造との比較
低い配列同一性にも関わらず（図３ａ）、鞭毛ＦｌｈＢＣの全体的な構造は、ニードル分泌装置のパラログの構造と非常に類似していた：ＥｓｃＵＣ、ＳｐａＳＣ、ＹｓｃＵＣ、及びＳｐａ４０Ｃ（図３ｂ）。これらのタンパク質間の明白な差異は、Ｎ末端膜貫通ドメインと球状細胞質ドメインとの間のリンカー領域であった。全てのタンパク質が、そのＮ末端部分のコンフォメーションに大きな差異を示し、このことは、該分子のこの領域の可動性を示す。本発明者らの構造では、Ｓａｌ ＦｌｈＢＣの残基２１９−２２８及びＡｑｕ ＦｌｈＢＣの残基２１３−２３１については電子密度が観察されなかったが、これはＦｌｈＢＣのこの部分の可動性と矛盾がない。しかしながら、リンカーの残りの残基は、明確な構造を持つα−ヘリックスを形成し、これはＳａｌ ＦｌｈＢＣの場合には、Ｇｌｙ２３６位において屈曲していた。ニードルパラログとは対照的に、より安定なリンカーヘリックスを有するということは鞭毛ＦｌｈＢの一般的な特性かもしれない。
ＦｌｈＢファミリーのタンパク質は、主にＣ末端における差異のために、長さに大きなばらつきを示す。例えば、サルモネラＦｌｈＢは、３３アミノ酸だけアクイフェックスタンパク質より長い。しかしながら、これらの追加の残基（残基３５４−３８３）は、電子密度マップには見えず、このことはそれらが折り畳まれていないことを示唆する。ＳａｌＦｌｈＢにおけるこの領域は、プロリン残基に富むので、何らかの安定な構造を形成しそうにない。ＦｌｈＢの伸張されたＣ末端部分の機能は不明であるが、運動性にとっては不要である（非特許文献５）。サルモネラＦｌｈＢのＣ末端の切断短縮は、ΔｆｌｉＫの表現型を部分的に抑制し得るから（非特許文献５及び７）、それは分泌の調節に関与しているようである。しかしながら、切断短縮は、野生型ｆｌｉＫバックグラウンドにおいてほとんど作用を及ぼさないから（非特許文献７）、ＦｌｉＫとは直接相互作用しなさそうである。
実施例４：ＴＴＳＳ機能に対する、サルモネラＦｌｈＢの残基２８１−２８５の突然変異の効果
２本のストランドβ２及びβ３は、長い可動性ループによって接続されていた。このループは、ＦｌｈＢファミリー内で保存されていなかったが、それは、高度に保存されている残基であるＴｙｒ２７９及びＰｒｏ２８７（サルモネラ番号付けにおいて）によってフランキングされている。ループの長さは、２本のβストランドを単に接続するのに必要な長さよりも長かったが、このことから本発明者らはこれは機能的重要性があり得ると考えた。この仮説を調べるために、サルモネラＦｌｈＢの３つの突然変異体を作成した。第一の突然変異体では、ループの残基２８１−２８５を欠失させた（図４ａ）。第二及び第三の突然変異体では、残基２８１−２８５をそれぞれＡｌａ又はＰｒｏ残基によって置換した。その後、軟寒天プレート上でのスウォーミングアッセイ(swarming assay)を実施することにより、突然変異したＦｌｈＢを含有するサルモネラ細胞が依然として運動性であるかどうかを調べた。ループの欠失は、運動性を完全に消失させたことが観察された（図４ｂ）。同時に、Ａｌａ残基による置換は運動性に対して効果を及ぼさず、Ｐｒｏによる置換は運動性を低下させた。これらの運動性の変化が、輸送活性の変化のためであるかどうかを調べるために、フックタンパク質ＦｌｇＥ及び繊維タンパク質ＦｌｉＣの分泌を、突然変異したＦｌｈＢを含有する鞭毛分泌装置によって分析した（図４ｃ）。運動性は、ＦｌｇＥ及びＦｌｉＣの分泌と相関することが観察された。ＦｌｈＢのループ（２８１−２８５）が欠失した場合には、ＦｌｇＥもＦｌｉＣも分泌されず、プロリンによる置換は、両方のタンパク質の分泌を減少させた。野生型ＦｌｈＢ及びＡｌａ置換についての分泌の差異は観察されなかった。
実施例５：分子動力学シミュレーション
ＦｌｈＢＣ分子に対するループ突然変異の効果をさらに調べるために、野生型Ｓａｌ ＦｌｈＢＣ並びにΔ（２８１−２８５）、ＡＡＡＡＡ２８１−２８５、及びＰＰＰＰＰ２８１−２８５突然変異体のＭＤシミュレーションを実施した。ＭＤの最中に、全ての場合において球状ドメインは比較的堅固であるが、野生型ＦｌｈＢＣのＮ末端αヘリックスは非常に可動性であり、突然変異体においては可動性がより低くなることが観察された（図５ｂ−ｅ）。Ｇｌｙ２３６−Ｐｒｏ２３８の周囲の屈曲に加えて（図２ａ）、ＭＤの最中にＭｅｔ２５６の付近に大きな屈曲が観察された。Ｎ末端α−ヘリックスの可動性を特徴付けるために、距離Ｄ、角度θ１２、θ２３、θ３４、θ１４並びにねじれ角χ３及びχ５が定められた（図５ａ及び表２の説明を参照）。
顕著な構造的差異が、ねじれ角χ３によって実証され、これは球状ドメインに対するＮ末端αヘリックスのＶ２領域の方向を決定する。χ３値は、野生型ＦｌｈＢＣ及びＡＡＡＡＡ２８１−２８５突然変異体については正であったが、Δ（２８１−２８５）及びＰＰＰＰＰ２８１−２８５突然変異体については負であり、これは、図５ｂ〜ｅに示される構造的な差異と一致した。後者の突然変異はサルモネラの運動性を減少させたので、この構造変化は、何等かの機能的効果を有し得る。別の顕著な差異は、ＰＰＰＰＰ２８１−２８５突然変異体におけるθ１２、θ２３、θ１４、χ３及びχ５の揺らぎの減少として見られ、このことは、Ｎ末端αヘリックスの大きな構造変化及び可動性の減少を示す。
実施例６：サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢＣのループ領域と相互作用する候補化合物のインシリコのスクリーニング
ＦｌｈＢＣと相互作用する候補化合物を、フラグメントベースドリードディスカバリー（ＦＢＬＤ）法（日本のファルマデザイン株式会社によって提供）を使用することによってインシリコでスクリーニングした。この方法は、標的タンパク質と、公知の化合物の部分（本明細書において以後、スキャホールド(Scaffold)と呼ぶ）との間の相互作用をインシリコで分析する。
６．１ スキャホールドデータベースの構築（スキャホールドＤＢ）
スキャホールドの情報は、以下の手順によって作成された。まず、３４５，０９９種の市販されている化合物（キシダ化学株式会社によって取り扱われている）を、薬らしさ(drug-like)、回避すべき構造、及び分子量の観点から選択した。第二に、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）のリガンド情報を、ＰＤＢのリガンド情報を整理しているLigand Expo (http://ligand-expo.rcsb.org/)から入手した。その後、ＬＩＧＰＬＯＴ相互作用分析（http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LIGPLOT/）を実施して、タンパク質の主鎖／側鎖の原子とリガンドの原子との間の水素結合の情報を、タンパク質−リガンド相互作用情報として入手した。上記の市販されている化合物の情報をクエリーとして、及びタンパク質−リガンド相互作用情報をデータベースとして使用して、ＯＥＣｈｅｍＴＫ（OpenEye: http://www.eyesopen.com/oechem-tk/によって提供）（これは部分構造をスクリーニングすることができる）を実施して、リガンドの部分構造を模倣し得る候補化合物の情報を入手した。その後、Small Molecule Subgraph Detector (SMSD: http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/)を使用して、候補化合物の情報をＰＤＢリガンドに重ね合わせた。ＳＭＳＤの結果及び上記のタンパク質−リガンド相互作用情報の結果を比較及び検討することによって、８８９種の化合物が最終的にスキャホールドＤＢとして抽出された。
６．２ ＦｌｈＢＣの構造情報を使用してのループ領域周辺のアミノ酸を認識するスキャホールドの決定
サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢＣのループ領域のアミノ酸配列ＥＮＫＭＳの中で、ＥＮＫＳの残基が水素結合に関与していた。従って、これらのＥＮＫＳ残基と水素結合によって結合する化合物を、スキャホールドＤＢから選択した。選択された化合物を、StarDrop (Optibrium: http://www.optibrium.com/stardrop/によって提供)によって計算された分配係数及び溶解度の観点から順位付けした。
さらに、Ａｑｕ ＦｌｈＢＣエオリカスのループ領域のアミノ酸配列ＰＥＫＤＫは、Ａｑｕ ＦｌｈＢＣの構造情報においてループの内側に向かって配向するアスパラギン残基を含んでいるので、アスパラギン残基と水素結合によって結合する化合物もまた、スキャホールドＤＢから選択された。選択された化合物を、ＭＯＥのＡＳＥＤｏｃｋ（Chemical Computing Group: http://www.optibrium.com/stardrop/によって提供）を使用してドッキングシミュレーションによって順位付けした。結果として、２３７回の化合物が最終的に選択された。
実施例７：スクリーニングされた化合物の阻害活性の検証
毒素の分泌に対する、上記の選択された化合物の阻害活性を評価するために、以下のアッセイを以前記載されている通りに実施した（非特許文献２２）。
７．１． 細菌増殖アッセイ
まず、細菌培養の生存能力に対する候補化合物の効果を、ＦｌｈＢＣの可動性に対するその効果を分析する前に、試験した。２３７種の化合物中８０種の化合物を、順位付けに従ってキシダ化学株式会社から購入した。サルモネラ・チフィムリウムＳＪＷ１１０３株を、３０３ＫでＬＢ培地中で増殖させた。一晩培養した培養液を、新たなＬＢ培地中に、６００nmにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．１となるように希釈した。ＤＭＳＯ中に可溶化した１００mM候補化合物又は対照としてのＤＭＳＯ単独の各５μlを、５０mlの容量のポリプロピレンコニカルチューブ中の１０mlＬＢ培地に加えた。各化学物質の存在下における細胞の増殖曲線を得るために、０．２mlの培養液の容量を、２時間毎に取り出し（２、４、６、８及び１０時間後）、１mlのＬＢを用いて希釈し、ＯＤ６００の吸光度を測定した。結果として、８０種全ての化合物が、深刻な増殖不全には至らなかった（図６）。２種の化合物（化合物４７及び化合物６４）が僅かな増殖の遅延を示したが、その僅かな遅延は、その後の実験にとって影響はないと判断された。
７．２． 分泌アッセイ
その後、種々のＩＩＩ型分泌表現型に対する選択された化合物の効果を評価した。上記の増殖アッセイにおいて８．０時間培養した細胞懸濁液１mlを、１３，２００rpm（１６，１００ｇ）で１０分間遠心分離にかけた。上清画分（０．９ml）を新しいチューブに分画化し、１００％トリクロロ酢酸と十分に混合した。画分を氷上で少なくとも１時間維持して、分泌タンパク質を沈降させた。１５，４００rpmで３０分間遠心分離した後、沈降した上清画分を、１Ｍトリス塩基０．０２mlに再懸濁し、使用するまで−３０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のための試料を、５×ＳＤＳローディング緩衝液を加え、その後９５℃で５分間加熱することによって調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Bio-radから購入した予製ゲルを使用して２００Ｖの条件で３０分間実施された。ＰＶＤＦメンブランへのエレクトロブロットは、InvitrogenのｉＢｌｏｔを用いて実施され、メンブランを発色免疫検出キット（Invitrogen）を用いて、鞭毛タンパク質のＦｌｇＤに対して特別に作成された抗体（大阪大学の難波啓一教授からの）を使用して展開した。画像を、ChemDoc（Bio-rad）を用いてグレースケールカラーとしてデジタル化した。カレイドスコープ（Bio-rad）を分子マーカーとして使用した。結果として、７−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−１，３−ジメチル−３，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン（化合物４７：ジフィリンとしても知られる）及び５−（３，４，５−トリメトキシベンジル）ピリミジン−２，４−ジアミン（化合物６４：トリメトプリムとしても知られる）は、ＴＴＳＳによって分泌される典型的なタンパク質（非特許文献１１及び非特許文献１３）であるＦｌｇＤの分泌を阻害することが実証された（図７ａ及び７ｂ）。該化合物のこの阻害活性は、ＦｌｈＢＣの可動性の阻害に対する該化合物の効果を示唆した。

Claims (8)

  1. ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    候補化合物を、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＦｌｈＢ、アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）由来のＦｌｈＢ、大腸菌（Escherichia coli）由来のＥｓｃＵ、ペスト菌（Yersinia pestis）由来のＹｓｃＵ、サルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａＳ、及びシゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）由来のＳｐａ４０からなる群から選択される膜タンパク質のＣ末端細胞質ドメインと接触させる工程、
    該候補化合物と、それぞれ、配列番号１であるサルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢのアミノ酸残基ＥＮＫＭＳ ２８１−２８５ 、配列番号２であるアクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢのアミノ酸残基ＰＥＫＤＫ ２７５−２７９ 、配列番号３である大腸菌由来のＥｓｃＵのアミノ酸残基ＬＧＥＴＰ ２７４−２７８ 、配列番号４であるペスト菌由来のＹｓｃＵのアミノ酸残基ＲＧＥＴＰ ２７５−２７９ 、配列番号５であるサルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａＳのアミノ酸残基ＰＥＬＭＰ ２７０−２７４ 、又は配列番号６であるシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０のアミノ酸残基ＰＥＩＡＰ ２６９−２７３ からなる、ループ領域との相互作用を分析する工程、及び
    該ループ領域、又は該膜タンパク質の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを接続するリンカーの可動性を減少させる化合物を選択する工程
    を含み、選択された化合物は、病原性細菌による毒素の分泌を阻害することが示される、該方法。
  2. 病原性細菌が、サルモネラ・チフィムリウム、アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）、ペスト菌（Yersinia pestis）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、腸管出血性大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、及び腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 該化合物と、該膜タンパク質の細胞質ドメインのループ領域との相互作用が、それぞれ、該化合物がサルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＦｌｈＢ及びそのΔ（２８１−２８５）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、アクイフェックス・エオリカス由来の膜タンパク質ＦｌｈＢ及びそのΔ（２７５−２７９）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、大腸菌由来の膜タンパク質ＥｓｃＵ及びそのΔ（２７４−２７８）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、ペスト菌由来の膜タンパク質ＹｓｃＵ及びそのΔ（２７５−２７９）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、サルモネラ・チフィムリウム由来の膜タンパク質ＳｐａＳ及びそのΔ（２７０−２７４）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、又はシゲラ・フレックスネリ由来の膜タンパク質Ｓｐａ４０及びそのΔ（２６９−２７３）突然変異タンパク質に異なって結合するか否か、で決定される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 病原性細菌による毒素の分泌を阻害する化合物が、抗体若しくはそのフラグメント、アプタマー又は低分子化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞の細胞質への毒素の分泌を阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ｉ）サルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢ、アクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢ、大腸菌由来のＥｓｃＵ、ペスト菌由来のＹｓｃＵ、サルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａＳ、及びシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０からなる群から選択される膜タンパク質と、該膜タンパク質の細胞質ドメインの、それぞれ、配列番号１であるサルモネラ・チフィムリウム由来のＦｌｈＢのアミノ酸残基ＥＮＫＭＳ ２８１−２８５ 、配列番号２であるアクイフェックス・エオリカス由来のＦｌｈＢのアミノ酸残基ＰＥＫＤＫ ２７５−２７９ 、配列番号３である大腸菌由来のＥｓｃＵのアミノ酸残基ＬＧＥＴＰ ２７４−２７８ 、配列番号４であるペスト菌由来のＹｓｃＵのアミノ酸残基ＲＧＥＴＰ ２７５−２７９ 、配列番号５であるサルモネラ・チフィムリウム由来のＳｐａＳのアミノ酸残基ＰＥＬＭＰ ２７０−２７４ 、又は配列番号６であるシゲラ・フレックスネリ由来のＳｐａ４０のアミノ酸残基ＰＥＩＡＰ ２６９−２７３ からなる、ループ領域と該候補化合物との間の、該ループ領域の少なくとも１つの側鎖を介して形成される水素結合により、相互作用することのできる候補化合物を選択する工程、
    ｉｉ）該候補化合物を、鞭毛及びニードルＩＩＩ型分泌装置を有する細菌と接触させる工程、及び
    ｉｉｉ）細菌からのタンパク質の分泌及び／又は細菌の鞭毛による運動性を低下させる化合物を選択する工程
    を含み、選択された化合物は、病原性細菌による毒素の分泌を阻害することが示される、該方法。
  6. ７−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−１，３−ジメチル−３，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン又はその薬学的に許容される塩を含む、宿主細胞の細胞質へ
    の毒素の分泌を阻害するための医薬組成物。
  7. ニードルＩＩＩ型分泌装置を使用する病原性細菌による宿主細胞（ヒトの細胞を除く）の細胞質への毒素の分泌を阻害するための方法であって、
    該細菌を、請求項６に記載の医薬組成物と接触させること、及び
    病原性細菌による毒素の分泌を阻害すること
    を含む、該方法。
  8. 宿主細胞（ヒトの細胞を除く）の細胞質への毒素の分泌を阻害するための、請求項６に記載の化合物の使用。
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