JP6453734B2 - Sensitizer for immunostaining, sensitizer kit for immunostaining, and immunostaining method - Google Patents
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Description
本発明は、免疫染色用増感剤、免疫染色用増感剤キット、及び免疫染色方法に関する。 The present invention relates to an immunostaining sensitizer, an immunostaining sensitizer kit, and an immunostaining method.
免疫染色は、組織標本に含まれるタンパク質を、抗原抗体反応により検出する手法である。免疫染色は免疫組織化学ともいう。免疫染色は、標的タンパク質の発現の程度を組織学的な情報と併せて取得できる有用な方法であることから、生命科学分野において広く用いられている。
免疫染色の対象となる組織標本としては、生体試料を固定した固定標本が用いられるのが通常である。生体試料に対して固定を行うことにより、試料を取得した際の細胞状態を、長期間にわたって保存可能となる。
しかし、生体試料に対して固定を行うことにより、免疫染色の感度が低下する場合が知られている。例えば、ホルマリンを用いて生体試料を固定した場合、固定によりタンパク質に架橋が生じて抗原部分がマスキングされるなど、抗原抗体反応が生じ難い状態になることがある。そこで、試料に対して抗原抗体反応が生じやすい状態にする処理が行われており、抗原賦活化や賦活化処理等と呼ばれている。
Immunostaining is a technique for detecting a protein contained in a tissue specimen by an antigen-antibody reaction. Immunostaining is also called immunohistochemistry. Immunostaining is a widely used method in the life science field because it is a useful method for obtaining the degree of expression of a target protein together with histological information.
As a tissue specimen to be subjected to immunostaining, a fixed specimen in which a biological sample is fixed is usually used. By fixing the biological sample, the cell state when the sample is obtained can be stored for a long period of time.
However, it is known that the sensitivity of immunostaining is reduced by fixing the biological sample. For example, when a biological sample is immobilized using formalin, the antigen-antibody reaction may be difficult to occur, for example, the protein may be cross-linked by the immobilization to mask the antigen portion. Therefore, a process for making an antigen-antibody reaction easily occur on a sample is performed, which is called antigen activation, activation process, or the like.
最も一般的な賦活化処理として、タンパク質分解酵素処理と、加熱処理が挙げられる。その他の賦活化処理に関するものとして、特許文献１には、賦活化処理に用いられる、ＣＣＡを含む抗原賦活剤が開示されている。また、特許文献２には、陰イオン性界面活性剤で標本を処理する目的抗原物質の賦活化方法が開示されている。 The most common activation treatment includes proteolytic enzyme treatment and heat treatment. As another activation process, Patent Document 1 discloses an antigen activator containing CCA that is used for the activation process. Patent Document 2 discloses a method for activating a target antigenic substance in which a specimen is treated with an anionic surfactant.
しかし、免疫染色の染色性を向上させることについて、上記技術には改良の余地がある。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、免疫染色において試料の染色性を向上可能な、免疫染色用増感剤、免疫染色用増感剤キット、及び免疫染色方法の提供を課題とする。
However, there is room for improvement in the above technique for improving the staining of immunostaining.
The present invention has been made in view of such circumstances, and provides a sensitizer for immunostaining, a sensitizer kit for immunostaining, and an immunostaining method capable of improving the dyeability of a sample in immunostaining. Let it be an issue.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、免疫染色の際に特定の界面活性剤及び還元剤を含む免疫染色用増感剤を用いることで、免疫染色の染色性を向上可能であることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have improved the staining property of immunostaining by using an immunostaining sensitizer containing a specific surfactant and reducing agent during immunostaining. I found it possible.
すなわち本発明は、下記の特徴を有する免疫染色用増感剤、免疫染色用増感剤キット、及び免疫染色方法を提供するものである。 That is, the present invention provides a sensitizer for immunostaining, a sensitizer kit for immunostaining, and an immunostaining method having the following characteristics.
（１） 組織切片の免疫染色に用いられる免疫染色用増感剤であって、陰イオン界面活性剤及び還元剤を含み、前記陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、前記還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンであり、
前記ドデシル硫酸ナトリウムを０．１〜３０（ｗ／ｖ）％の割合で含み、前記トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを０．０６〜２０ｍｏｌ／ｌの割合で含む、免疫染色用増感剤。
（２） 前記（１）に記載の免疫染色用増感剤を用いる免疫染色方法であって、
前記組織切片の抗原に抗体を反応させる前に、前記免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることを含む、免疫染色方法。
（３） 前記組織切片に対して加熱処理することを含む、前記（２）に記載の免疫染色方法。
（４） 前記加熱処理の後に、前記免疫染色用増感剤を組織切片に接触させる、前記（３）に記載の免疫染色方法。
(1) A sensitizer for immunostaining used for immunostaining of tissue sections, comprising an anionic surfactant and a reducing agent, wherein the anionic surfactant is sodium dodecyl sulfate, and the reducing agent is tris (2-carboxyethyl) phosphine ,
A sensitizer for immunostaining comprising the sodium dodecyl sulfate in a proportion of 0.1 to 30 (w / v)% and the tris (2-carboxyethyl) phosphine in a proportion of 0.06 to 20 mol / l .
( 2 ) An immunostaining method using the sensitizer for immunostaining according to (1) ,
An immunostaining method comprising contacting the tissue section with a sensitizer for immunostaining before reacting an antibody with an antigen of the tissue section.
( 3 ) The immunostaining method according to ( 2 ), comprising heat-treating the tissue section.
( 4 ) The immunostaining method according to ( 3 ), wherein the sensitizer for immunostaining is brought into contact with a tissue section after the heat treatment.
本発明によれば、免疫染色の染色性を向上可能である。 According to the present invention, the staining of immunostaining can be improved.
＜免疫染色用増感剤＞
本実施形態の免疫染色用増感剤は、
組織切片の免疫染色に用いられる免疫染色用増感剤であって、陰イオン界面活性剤及び還元剤を含み、前記還元剤がホスフィン及びチオール化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である。本明細書中、免疫染色用増感剤を「増感剤」と略すことがある。
<Sensitizer for immunostaining>
The sensitizer for immunostaining of this embodiment is
A sensitizer for immunostaining used for immunostaining of tissue sections, comprising an anionic surfactant and a reducing agent, wherein the reducing agent is at least one selected from the group consisting of phosphine and thiol compounds. In the present specification, a sensitizer for immunostaining may be abbreviated as “sensitizer”.
陰イオン界面活性剤の種類については特に制限されない。陰イオン界面活性剤としては、例えば、脂肪酸塩、モノアルキル硫酸塩、モノアルキルリン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。陰イオン界面活性剤としては、上記のなかではモノアルキル硫酸塩が好ましい。モノアルキル硫酸塩のアルキル基の炭素数は、例えば、８〜２０であってもよく、１０〜１５であってもよい。モノアルキル硫酸塩としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム等のドデシル硫酸塩を例示でき、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。陰イオン界面活性剤は、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。 There are no particular restrictions on the type of anionic surfactant. Examples of the anionic surfactant include fatty acid salts, monoalkyl sulfates, monoalkyl phosphates, and alkylbenzene sulfonates. Among the above, the anionic surfactant is preferably a monoalkyl sulfate. The number of carbon atoms of the alkyl group of the monoalkyl sulfate may be, for example, 8 to 20, or 10 to 15. Examples of the monoalkyl sulfate include dodecyl sulfate such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and lithium dodecyl sulfate, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferable. Two or more anionic surfactants may be used in combination.
本実施形態の増感剤が含有する還元剤は、ホスフィン及びチオール化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
本明細書中において、ホスフィンとは、一般式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｐ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素原子又は一価の有機基を表す。］で表される有機リン化合物であり、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）等を例示できる。なかでも、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が好ましく、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）であってもよい。
本明細書中において、チオール化合物とは、分子内にチオール基を有する化合物であり、２−メルカプトエタノール（β−メルカプトエタノール、β−ＭＥ）、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びジチオエリトリトール（ＤＴＥ）等を例示できる。
還元剤は、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
The reducing agent contained in the sensitizer of the present embodiment is at least one selected from the group consisting of phosphine and thiol compounds.
In this specification, phosphine represents a general formula R 1 R 2 R 3 P [wherein R 1 , R 2 , R 3 represent a hydrogen atom or a monovalent organic group. ], And examples thereof include tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) and tributylphosphine (TBP). Among these, tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) is preferable, and tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) may be tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP-HCl). .
In the present specification, the thiol compound is a compound having a thiol group in the molecule, such as 2-mercaptoethanol (β-mercaptoethanol, β-ME), 2-mercaptoethanolamine, dithiothreitol (DTT), And dithioerythritol (DTE).
You may use a reducing agent in combination of 2 or more types.
増感剤中の陰イオン界面活性剤の濃度は、０．１〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲であることが好ましく、０．３〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲であることがより好ましく、１〜１５（ｗ／ｖ）％の範囲であることがさらに好ましく、１〜３．５（ｗ／ｖ）％の範囲であることが特に好ましい。増感剤中の陰イオン界面活性剤の濃度が上記範囲であることにより、免疫染色の染色性をより効果的に向上させることができる。 The concentration of the anionic surfactant in the sensitizer is preferably in the range of 0.1 to 30 (w / v)%, and preferably in the range of 0.3 to 20 (w / v)%. More preferably, it is in the range of 1 to 15 (w / v)%, more preferably in the range of 1 to 3.5 (w / v)%. When the concentration of the anionic surfactant in the sensitizer is in the above range, the staining of immunostaining can be improved more effectively.
増感剤中の還元剤の濃度は、０．０００１〜２０ｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましい。
還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びジチオエリトリトール（ＤＴＥ）からなる群から選択される少なくとも一種の化合物である場合、増感剤中の当該還元剤の濃度は、０．０００１〜１０ｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましく、０．００１〜１ｍｏｌ／ｌの範囲であることがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌの範囲であることがより好ましく、０．０３〜０．０８ｍｏｌ／ｌの範囲であることがさらに好ましい。
還元剤が、２−メルカプトエタノール及び／又は２−メルカプトエタノールアミンである場合、増感剤中の当該還元剤の濃度は、０．０１〜２０ｍｏｌ／ｌの範囲であることが好ましく、０．１〜１５ｍｏｌ／ｌの範囲であることがより好ましく、２〜４ｍｏｌ／ｌの範囲であることが特に好ましい。
The concentration of the reducing agent in the sensitizer is preferably in the range of 0.0001 to 20 mol / l.
When the reducing agent is at least one compound selected from the group consisting of tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), tributylphosphine (TBP), dithiothreitol (DTT), and dithioerythritol (DTE), The concentration of the reducing agent in the sensitizer is preferably in the range of 0.0001 to 10 mol / l, more preferably in the range of 0.001 to 1 mol / l, and 0.01 to 0.1 mol. / L is more preferable, and 0.03 to 0.08 mol / l is more preferable.
When the reducing agent is 2-mercaptoethanol and / or 2-mercaptoethanolamine, the concentration of the reducing agent in the sensitizer is preferably in the range of 0.01 to 20 mol / l, 0.1 More preferably, it is in the range of ˜15 mol / l, particularly preferably in the range of 2-4 mol / l.
増感剤中の陰イオン界面活性剤と還元剤との組み合わせは、ドデシル硫酸塩とチオール化合物との組み合わせのなかでは、ドデシル硫酸ナトリウムとジチオトレイトール（ＤＴＴ）との組み合わせがより好ましい。 The combination of the anionic surfactant and the reducing agent in the sensitizer is more preferably a combination of sodium dodecyl sulfate and dithiothreitol (DTT) among the combinations of dodecyl sulfate and thiol compounds.
増感剤中の陰イオン界面活性剤と還元剤との組み合わせは、ドデシル硫酸塩とホスフィンとの組み合わせが好ましく、なかでもドデシル硫酸ナトリウムとトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンとの組み合わせが特に好ましい。 The combination of the anionic surfactant and the reducing agent in the sensitizer is preferably a combination of dodecyl sulfate and phosphine, and particularly preferably a combination of sodium dodecyl sulfate and tris (2-carboxyethyl) phosphine.
増感剤は、加熱処理された後の組織切片に対して、使用されることが好ましい。増感剤の使用方法の詳細については後述するが、加熱処理された後の組織切片に用いることで、増感剤の抗原賦活化作用が、より効果的に発揮される。したがって、本実施形態の増感剤は、加熱処理後用の免疫染色用増感剤として好適に用いることができる。 The sensitizer is preferably used for tissue sections after heat treatment. Although details of the method of using the sensitizer will be described later, the antigen activation action of the sensitizer is more effectively exhibited by using the tissue section after the heat treatment. Therefore, the sensitizer of this embodiment can be suitably used as a sensitizer for immunostaining after heat treatment.
上記に示す陰イオン界面活性剤及び還元剤を含む増感剤は、還元剤を含まず陰イオン界面活性剤を含む増感剤と比べて、より免疫染色の染色性を向上させることができる。同様に、上記に示す陰イオン界面活性剤及び還元剤を含む増感剤は、陰イオン界面活性剤を含まず還元剤を含む増感剤と比べて、より免疫染色の染色性を向上させることができる。 The sensitizer containing an anionic surfactant and a reducing agent as described above can improve the staining of immunostaining more than a sensitizer containing no anionic surfactant and no reducing agent. Similarly, a sensitizer containing an anionic surfactant and a reducing agent as described above can improve the staining of immunostaining more than a sensitizer containing no reducing agent and an anionic surfactant. Can do.
本実施形態の増感剤によれば、組織切片の免疫染色の染色性を向上させることができ、標的タンパク質の発現が容易に判別可能となる。したがって、より高い精度での診断や治療薬の選択が可能となり、医療分野等への多大な貢献が期待できる。 According to the sensitizer of this embodiment, the staining property of the immunostaining of the tissue section can be improved, and the expression of the target protein can be easily discriminated. Therefore, diagnosis and therapeutic drugs can be selected with higher accuracy, and a great contribution to the medical field and the like can be expected.
＜免疫染色用増感剤キット＞
本実施形態の免疫染色用増感剤キットは、陰イオン界面活性剤と、還元剤と、を備え、前記還元剤がホスフィン及びチオール化合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
<Sensitizer kit for immunostaining>
The sensitizer kit for immunostaining according to the present embodiment includes an anionic surfactant and a reducing agent, and the reducing agent is at least one selected from the group consisting of phosphine and thiol compounds.
陰イオン界面活性剤としては、上記免疫染色用増感剤で示したものと同一のものを用いることができる。還元剤としては、上記免疫染色用増感剤で示したものと同一のものを用いることができる。 As the anionic surfactant, the same ones as those shown in the above-mentioned immunostaining sensitizer can be used. As the reducing agent, the same ones as shown in the sensitizer for immunostaining can be used.
本実施形態の免疫染色用増感剤キットは、陰イオン界面活性剤及び還元剤を備えているので、簡便に免疫染色用増感剤を調製することができ、免疫染色の染色性を向上させることができる。したがって、より高い精度での診断や治療薬の選択が可能となり、医療分野等への多大な貢献が期待できる。 Since the sensitizer kit for immunostaining according to the present embodiment includes an anionic surfactant and a reducing agent, a sensitizer for immunostaining can be easily prepared, and the staining property of immunostaining is improved. be able to. Therefore, diagnosis and therapeutic drugs can be selected with higher accuracy, and a great contribution to the medical field and the like can be expected.
また免疫染色をより簡便にするという観点から、本実施形態の免疫染色用増感剤キットは、免疫染色に必要な試薬類、器具類等を更に備えていてもよい。免疫染色に必要な試薬類としては、例えば、抗体、抗体希釈液、発色基質等が挙げられる。免疫染色に必要な器具としては、例えば、マイクロチューブ、スライドグラス、カバーガラス等が挙げられる。
このように、免疫染色に用いられる試薬類、器具類等をキット化することにより、後述する免疫染色方法を、より簡便に行うことができる。
Moreover, from the viewpoint of making immunostaining easier, the sensitizer kit for immunostaining according to the present embodiment may further include reagents and instruments necessary for immunostaining. Examples of reagents necessary for immunostaining include antibodies, antibody dilutions, and chromogenic substrates. Examples of instruments necessary for immunostaining include microtubes, slide glasses, cover glasses, and the like.
Thus, the immunostaining method mentioned later can be performed more simply by making reagents, instruments, etc. used for immunostaining into a kit.
＜免疫染色方法＞
本実施形態の免疫染色方法は、免疫染色用増感剤を用いる免疫染色方法であって、
前記組織切片の抗原に抗体を反応させる前に、前記免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることを含む。
以下、本実施形態の免疫染色方法について、パラフィン包埋切片を使用する場合を例に、詳細に説明する。
<Immunostaining method>
The immunostaining method of the present embodiment is an immunostaining method using a sensitizer for immunostaining,
Contacting the tissue section with the sensitizer for immunostaining before reacting the antibody with the antigen of the tissue section.
Hereinafter, the immunostaining method of the present embodiment will be described in detail by taking the case of using a paraffin-embedded section as an example.
（組織切片の作製）
先ず免疫染色方法に用いる組織切片を用意する。組織切片は、患者から採取された組織を、固定剤に浸漬して固定し、固定後の組織を脱水処理し、パラフィン包埋したものを薄切して得ることができる。
固定剤は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液等の、アルデヒド基を有する化合物の溶液を用いることが好ましい。固定化液には、緩衝液やｐＨ調製剤、アルコール等のその他の成分を含有することができる。
脱水処理及びパラフィン包埋は、例えば、固定後の組織を７０％エタノール、８０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノールに順次浸してエタノール置換した後、キシレン置換し、パラフィンに浸してパラフィン包埋して成形し、組織が包埋されたパラフィンブロックを得る。
次に、パラフィンブロックをミクロトーム等で適当な厚さに薄切して組織切片を得る。組織切片の厚みは適宜定めればよいが、通常２〜１０μｍ程度、好ましくは３〜６μｍ程度である。組織切片は、スライドグラス上に付着させて用いられてもよい。
(Tissue section preparation)
First, a tissue section used for the immunostaining method is prepared. The tissue section can be obtained by immersing a tissue collected from a patient in a fixing agent, fixing the tissue, dehydrating the tissue after fixation, and slicing paraffin-embedded tissue.
The fixing agent is preferably a solution of a compound having an aldehyde group, such as a formaldehyde solution or a paraformaldehyde solution. The immobilization solution may contain other components such as a buffer solution, a pH adjuster, and alcohol.
Dehydration treatment and paraffin embedding are performed, for example, by immersing the tissue after fixation in 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, and 100% ethanol in order, replacing with xylene, substituting with xylene, and immersing in paraffin To obtain a paraffin block in which the tissue is embedded.
Next, the paraffin block is sliced to an appropriate thickness with a microtome or the like to obtain a tissue section. The thickness of the tissue section may be appropriately determined, but is usually about 2 to 10 μm, preferably about 3 to 6 μm. The tissue section may be used while attached on a slide glass.
（脱パラフィン）
スライドグラス上に付着させた組織切片を、スライドグラスごとキシレンに浸し、脱パラフィン操作を行い、次いで、脱パラフィン操作後の組織切片を、スライドグラスごと例えば、９５％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、洗浄バッファーに順次浸して洗浄する。
(Deparaffinization)
The tissue section attached on the slide glass is immersed in xylene together with the slide glass and subjected to deparaffinization operation, and then the tissue section after the deparaffinization operation is combined with the slide glass, for example, 95% ethanol, 80% ethanol, 70% Wash by immersing in ethanol and washing buffer sequentially.
（賦活化処理−増感剤処理）
本実施形態の免疫染色方法は、上記実施形態の免疫染色用増感剤を用いる免疫染色方法であって、前記組織切片の抗原に抗体を反応させる前に、前記免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることを含む。本明細書中において、免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることを「増感剤処理」ということがある。増感剤処理は、賦活化処理の一種として行うことができる。
(Activation treatment-Sensitizer treatment)
The immunostaining method of the present embodiment is an immunostaining method using the sensitizing agent for immunostaining of the above embodiment, wherein the sensitizing agent for immunostaining is treated with tissue before reacting the antibody with the antigen of the tissue section. Including contacting the section. In the present specification, bringing a sensitizer for immunostaining into contact with a tissue section is sometimes referred to as “sensitizer treatment”. The sensitizer treatment can be performed as a kind of activation treatment.
増感剤を組織切片に接触させる方法は、例えば、スライドグラス上の組織切片の上に増感剤を滴下する方法や、スライドグラス上の組織切片の上に増感剤を塗布する方法や、組織切片を組織切片が付着したスライドグラスごと増感剤中に浸漬させる方法が挙げられる。 The method of bringing the sensitizer into contact with the tissue section is, for example, a method of dropping the sensitizer on the tissue section on the slide glass, a method of applying the sensitizer on the tissue section on the slide glass, A method of immersing the tissue section in a sensitizer together with the slide glass to which the tissue section is attached is mentioned.
増感剤を組織切片に接触させる時間は、例えば１〜６０分程度、好ましくは５〜３０分程度である。組織切片に接触させる増感剤の温度は、例えば０〜３０℃程度、好ましくは１５〜２５℃程度である。 The time for which the sensitizer is brought into contact with the tissue slice is, for example, about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 30 minutes. The temperature of the sensitizer brought into contact with the tissue section is, for example, about 0 to 30 ° C, preferably about 15 to 25 ° C.
上記免疫染色用増感剤キットを用いて増感剤を調製する場合、組織切片に接触させる前に、予め陰イオン界面活性剤と還元剤とを混合して調製された増感剤を、組織切片に接触させてもよい。別の方法として、組織切片上で増感剤を調製してもよい。組織切片上で増感剤を調製する場合、陰イオン界面活性剤と還元剤の混合方法は制限されるものではなく、例えば、先ず陰イオン界面活性剤を組織切片に滴下した後、この陰イオン界面活性剤に対し還元剤を滴下することで、組織切片上で増感剤を調製してもよい。別法としては、陰イオン界面活性剤と還元剤とを同時に組織切片に滴下してもよく、或いは、先ず還元剤を組織切片上に滴下した後、この還元剤に対し陰イオン界面活性剤を滴下してもよい。 When preparing a sensitizer using the above-described sensitizer kit for immunostaining, a sensitizer prepared by mixing an anionic surfactant and a reducing agent in advance before contacting a tissue section is treated with a tissue. The section may be contacted. Alternatively, sensitizers may be prepared on tissue sections. When preparing a sensitizer on a tissue section, the method of mixing an anionic surfactant and a reducing agent is not limited. For example, after an anionic surfactant is first dropped on a tissue section, the anion is added. A sensitizer may be prepared on the tissue slice by dropping a reducing agent on the surfactant. Alternatively, the anionic surfactant and the reducing agent may be dripped onto the tissue slice at the same time, or first the reducing agent is dropped onto the tissue slice and then an anionic surfactant is added to the reducing agent. It may be dripped.
本実施形態の免疫染色方法によれば、増感剤処理により、組織切片の抗原を賦活化させ、免疫染色の染色性を向上させることができる。 According to the immunostaining method of this embodiment, the antigen of a tissue section can be activated and the staining property of immunostaining can be improved by the sensitizer treatment.
（賦活化処理−加熱処理）
賦活化処理として、増感剤処理に加えて、その他の賦活化処理法を併用してもよい。本実施形態の免疫染色方法は、組織切片に対して加熱処理することを含むことが好ましい。加熱処理は、賦活化処理の一種として行うことができる。当該加熱処理は、後述の免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることより先に行うことが好ましい。加熱方法は、オートクレーブ法、マクロウェーブ法、温浴法等が挙げられ、これらに限定されない。加熱処理温度は、例えば、８０℃〜１２１℃で行ってもよく、９０℃〜１２１℃で行ってもよい。加熱時間は５〜６０分程度で行うことができ、加熱温度等に応じて適宜定めればよい。
増感剤処理と加熱処理とを両方とも実施する場合、増感剤処理と加熱処理とを行う順序は制限されるものではなく、例えば増感剤処理と加熱処理とを同時に行ってもよく、増感剤処理の後に加熱処理を行ってもよいが、加熱処理の後に増感剤処理を行うことがより好ましい。先ず加熱処理を行うことで、組織切片の増感剤に対する反応効率が高まると考えられ、より効果的に抗原賦活化を行うことができる。
(Activation treatment-Heat treatment)
As the activation treatment, other activation treatment methods may be used in combination with the sensitizer treatment. The immunostaining method of this embodiment preferably includes heat-treating a tissue section. The heat treatment can be performed as a kind of activation treatment. The heat treatment is preferably performed prior to bringing the immunostaining sensitizer described below into contact with the tissue section. Examples of the heating method include, but are not limited to, an autoclave method, a macro wave method, a warm bath method, and the like. The heat treatment temperature may be, for example, 80 ° C. to 121 ° C. or 90 ° C. to 121 ° C. The heating time can be performed in about 5 to 60 minutes, and may be appropriately determined according to the heating temperature or the like.
When performing both the sensitizer treatment and the heat treatment, the order of performing the sensitizer treatment and the heat treatment is not limited, for example, the sensitizer treatment and the heat treatment may be performed simultaneously, Heat treatment may be performed after the sensitizer treatment, but it is more preferable to perform the sensitizer treatment after the heat treatment. First, the heat treatment is considered to increase the reaction efficiency of the tissue slice with respect to the sensitizer, and antigen activation can be performed more effectively.
（賦活化処理−その他）
また、その他の賦活化処理法として、タンパク質分解酵素処理やｐＨ調整が挙げられ、増感剤処理に加えて、さらにこれらの賦活化処理法を併用してもよい。
タンパク質分解酵素処理は、組織切片にタンパク質分解酵素を反応させる処理である。用いられるタンパク質分解酵素としては、トリプシン、ペプシン、プロテイナーゼＫ等が挙げられる。タンパク質分解酵素は、一種以上を組み合わせて用いることができる。タンパク質分解酵素の使用条件は、使用する酵素の反応特性を考慮して適宜定めればよく、例えば、タンパク質分解酵素を溶かしたバッファーを、３７℃で１０〜４０分程度組織切片に接触させることが挙げられる。
(Activation treatment-other)
Other activation treatment methods include proteolytic enzyme treatment and pH adjustment. In addition to the sensitizer treatment, these activation treatment methods may be used in combination.
Proteolytic enzyme treatment is a treatment in which a proteolytic enzyme is reacted with a tissue section. Examples of the proteolytic enzyme used include trypsin, pepsin, proteinase K and the like. Proteolytic enzymes can be used in combination of one or more. The conditions for using the proteolytic enzyme may be appropriately determined in consideration of the reaction characteristics of the enzyme used. For example, a buffer in which the proteolytic enzyme is dissolved may be brought into contact with a tissue section at 37 ° C. for about 10 to 40 minutes. Can be mentioned.
（抗体反応）
次いで、賦活化処理された賦活化処理後の組織切片の抗原に抗体を反応させる抗体反応を行う。本実施形態に示す抗体反応は、ブロッキング、一次抗体反応、二次抗体反応の工程を含む。
(Antibody reaction)
Next, an antibody reaction is performed in which the antibody reacts with the antigen of the tissue section after the activation process that has been activated. The antibody reaction shown in this embodiment includes the steps of blocking, primary antibody reaction, and secondary antibody reaction.
まず、賦活化処理後の組織切片に対し、ブロッキング剤によるブロッキングを行い、抗体の非特異的吸着を防止する。ブロッキング剤は公知であり、当分野において通常用いられるものを使用可能である。ブロッキング剤としては、例えば、正常動物血清、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等が挙げられる。 First, the tissue section after the activation treatment is blocked with a blocking agent to prevent nonspecific adsorption of antibodies. Blocking agents are known and those usually used in the art can be used. Examples of the blocking agent include normal animal serum, skim milk, bovine serum albumin (BSA), and casein.
一次抗体は、組織切片が有する検出対象の抗原を、認識する抗体である。抗体は一次構造を認識するものであってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
例えば、ブロッキング後の組織切片に対して一次抗体を含む液を滴下し、組織切片上の抗原と一次抗体を接触させて、一次抗体反応を行ってもよい。
The primary antibody is an antibody that recognizes an antigen to be detected in a tissue section. The antibody may recognize a primary structure, may be a monoclonal antibody, or may be a polyclonal antibody.
For example, a primary antibody reaction may be performed by dropping a liquid containing a primary antibody onto a tissue section after blocking, and bringing the antigen on the tissue section into contact with the primary antibody.
二次抗体は、上記一次抗体を認識する抗体である。二次抗体は適当な標識物質で標識されていることが好ましい。標識物質を直接又は間接的に検出することで、組織切片上の検出対象の抗原の存在を検出（染色）可能である。
染色方法は当分野において通常用いられるものを使用可能である。二次抗体を酵素標識する方法、蛍光標識する方法、ＲＩ標識する方法等を採用可能であり、標識により生産されたシグナルを検出可能である。
The secondary antibody is an antibody that recognizes the primary antibody. The secondary antibody is preferably labeled with an appropriate labeling substance. By detecting the labeling substance directly or indirectly, the presence of the antigen to be detected on the tissue section can be detected (stained).
As the staining method, those commonly used in this field can be used. A method of labeling a secondary antibody with an enzyme, a method of labeling with fluorescence, a method of labeling with RI, and the like can be adopted, and a signal produced by the label can be detected.
本実施形態の免疫染色方法によれば、増感剤処理により、組織切片の抗原を賦活化させ、免疫染色の染色性を向上させることができる。したがって、より高い精度での診断や治療薬の選択が可能となり、医療分野等への多大な貢献が期待できる。 According to the immunostaining method of this embodiment, the antigen of a tissue section can be activated and the staining property of immunostaining can be improved by the sensitizer treatment. Therefore, diagnosis and therapeutic drugs can be selected with higher accuracy, and a great contribution to the medical field and the like can be expected.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、単位Ｍは、ｍｏｌ／Ｌを表す。
EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
The unit M represents mol / L.
＜実験１＞
（実施例１−１）
肺腺癌患者から取得した腺癌組織を、固定剤（１０％ホルマリン）に、室温（２０〜２５℃）２４時間〜１週間程度浸漬させ、組織の固定を行った。定法により組織のパラフィンブロックを得た後、該パラフィンブロックをミクロトームにより薄切し、組織切片を得た。得られた組織切片は、スライドグラス上に付着させた。組織切片に対する以下の操作は、組織切片をスライドグラス上に付着させた状態で行った。
<Experiment 1>
(Example 1-1)
An adenocarcinoma tissue obtained from a lung adenocarcinoma patient was immersed in a fixative (10% formalin) for 24 hours to 1 week at room temperature (20 to 25 ° C.) to fix the tissue. After obtaining a paraffin block of tissue by a conventional method, the paraffin block was sliced with a microtome to obtain a tissue section. The obtained tissue section was attached on a slide glass. The following operations on the tissue sections were performed with the tissue sections attached on a slide glass.
組織切片を、キシレンに１０分浸した後、各数秒程度の時間で、１００％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノールに順次浸漬させ、その後、水で軽く流水水洗した。
スライドグラスの水分を切り、組織切片の上に、３（ｖ／ｖ）％過酸化水素を６〜８滴滴下して組織切片全体を覆い、湿箱中に室温で１０分静置した後、水で軽く流水水洗した。
After immersing the tissue section in xylene for 10 minutes, each tissue is immersed in 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol in order for several seconds each, and then lightly washed with water. did.
After the moisture of the slide glass was cut, 6-8 drops of 3 (v / v)% hydrogen peroxide was dropped on the tissue section to cover the entire tissue section, and allowed to stand in a wet box at room temperature for 10 minutes. It was washed with water.
クエン酸緩衝液（組成：０．０１Ｍ クエン酸緩衝液，ｐＨ６．０）１０ｍＬを超純水で２００ｍＬにメスアップしたものに、さらにＴｗｅｅｎ２０を２００μＬ加え、スターラーで撹拌し、熱処理用バッファーを調製した。染色バットに上記の熱処理用バッファーを入れ、その染色バットに、染色かごにセットした組織切片を入れて、組織切片を熱処理用バッファーに浸漬させ、これを１２１℃１０分間オートクレーブした。オートクレーブの後、扇風機を用い、室温程度にまで組織切片を冷却させた。次いで、ＴＢＳに５分間浸漬させた。 To 200 mL of citrate buffer (composition: 0.01 M citrate buffer, pH 6.0) made up to 200 mL with ultrapure water, 200 μL of Tween 20 was further added and stirred with a stirrer to prepare a heat treatment buffer. . The heat treatment buffer was placed in a staining vat, and the tissue section set in the staining basket was placed in the staining vat, and the tissue section was immersed in the heat treatment buffer, and this was autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes. After autoclaving, the tissue section was cooled to about room temperature using a fan. Subsequently, it was immersed in TBS for 5 minutes.
次いで、増感剤処理を行った。以下の組成で調整した増感剤を、組織切片上に１００μｌ／１切片の量でのせ、湿箱中に室温で１０分静置した。その後、ＴＢＳに５分間×３回浸漬させた。
・２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ …１０μＬ（２％（ｗ／ｖ））
・１００％β−ＭＥ …５μＬ（５％（ｗ／ｖ））
・０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８） …８５μＬ
Next, a sensitizer treatment was performed. A sensitizer prepared with the following composition was placed on a tissue section in an amount of 100 μl / 1 section, and left in a wet box at room temperature for 10 minutes. Then, it was immersed in TBS for 5 minutes × 3 times.
20% (w / v) SDS: 10 μL (2% (w / v))
100% β-ME 5 μL (5% (w / v))
・ 0.1M Tris HCl (pH 6.8): 85 μL
スライドグラスの水分を切り、組織切片の上に、２（ｖ／ｖ）％正常ブタ血清を滴下して組織切片全体を覆い、湿箱中に室温で１０分静置した。 The slide glass was drained, and 2 (v / v)% normal porcine serum was dropped on the tissue section to cover the entire tissue section, and left in a wet box at room temperature for 10 minutes.
余分な正常ブタ血清をふき取り、希釈した一次抗体［抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ７（ＣＫ７）抗体（Ｄａｋｏ社製：型番Ｍ７０１８）］を上記の正常ブタ血清で１０００倍程度に希釈したものを、組織切片上に１００μＬ／１切片の量でのせ、室温で２時間静置した。その後、ＴＢＳに５分間×３回浸漬させた。 Excess normal porcine serum was wiped off and diluted with a normal antibody [anti-Cytokeratin 7 (CK7) antibody (Dako: Model No. M7018)] diluted about 1000 times with the normal porcine serum, 100 μL on the tissue section. / The amount of one section was placed and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Then, it was immersed in TBS for 5 minutes × 3 times.
スライドグラスの水分を切り、組織切片の上に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋ ＤｕａｌＬｉｎｋ（Ｄａｋｏ社製：型番Ｋ４０６１）を１滴たらし、切片上に広げ、室温で３０分静置した。その後、ＴＢＳに５分間×３回浸漬させた。 The slide glass was drained, and one drop of ENVISION + DualLink (manufactured by Dako: Model No. K4061) was dropped on the tissue section, spread on the section, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, it was immersed in TBS for 5 minutes × 3 times.
スライドグラスの水分を切り、組織切片の上に、基質溶液Ｓｔａｂｌｅ ＤＡＢ（ファルマ社製：型番ＦＡ０１１８Ｌ）を１００μｌ／１切片の量でのせ、室温で２〜５分間反応させた。染色比較物間の反応条件は同一とした。その後、ＴＢＳに浸漬させ、水で水洗した。 The slide glass was drained, and the substrate solution Stable DAB (Pharmacia: Model No. FA0118L) was placed on the tissue section in an amount of 100 μl / 1 section and allowed to react at room temperature for 2 to 5 minutes. The reaction conditions between the staining comparison products were the same. Then, it was immersed in TBS and washed with water.
組織切片をマイヤーヘマトキシリン溶液に浸漬させ、２０秒程度反応させた後、水により水洗し、定法により飽和炭酸リチウムで色出しした。
その後、脱水エタノール系列及びキシレンに順次浸漬させた後、封入剤を用いて封入した。
免疫染色の結果を、顕微鏡を用いて観察したところ、増感剤を未使用の場合よりも良好な染色結果が得られた（図１）。
The tissue section was immersed in Mayer's hematoxylin solution, allowed to react for about 20 seconds, washed with water, and colored with saturated lithium carbonate by a conventional method.
Then, after sequentially immersing in a dehydrated ethanol series and xylene, it was encapsulated using an encapsulant.
When the results of immunostaining were observed with a microscope, better staining results were obtained than when no sensitizer was used (FIG. 1).
（実施例１−２〜１−４）
実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤について、以下の表１に示す割合で調整した増感剤を用いた以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。
その結果、実施例１−１と同様に、増感剤を未使用の場合よりも良好な染色結果が得られた。
(Examples 1-2 to 1-4)
In Example 1-1, immunostaining was performed in the same manner as in Example 1-1, except that the anionic surfactant and the reducing agent were sensitizers adjusted at the ratios shown in Table 1 below. It was.
As a result, similar to Example 1-1, better staining results were obtained than when the sensitizer was not used.
＜実験２＞
（比較例２−１、参考例２−１〜２−４）
増感剤中の陰イオン界面活性剤の効果について検討した。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表２に示す割合で調整した増感剤を用いた以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。比較例２−１では、増感剤のコントロールとして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を用いた。
<Experiment 2>
(Comparative Example 2-1, Reference Examples 2-1 to 2-4)
The effect of an anionic surfactant in the sensitizer was investigated.
In Example 1-1, immunostaining was performed in the same manner as Example 1-1, except that a sensitizer in which the anionic surfactant and the reducing agent were mixed at the ratio shown in Table 2 below was used. Went. In Comparative Example 2-1, 0.1 M Tris HCl (pH 6.8) was used as a sensitizer control.
その結果、比較例２−１に比べて、ＳＤＳを少しでも含む増感剤で増感剤処理を行った参考例２−１〜参考例２−４では、いずれにおいても染色強度が増大した。参考例２−１（０．５％（ｗ／ｖ））に比べて、参考例２−２（２％（ｗ／ｖ））では、より強い染色強度が認められた。参考例２−２（２％（ｗ／ｖ））よりもＳＤＳの濃度の高い、参考例２−３（５％（ｗ／ｖ））と参考例２−４（１０％（ｗ／ｖ））では、参考例２−２（２％（ｗ／ｖ））と比べて染色性に大きな差は認められなかった。
比較例２−１及び参考例２−２の、免疫染色の結果を図２に示す。
As a result, as compared with Comparative Example 2-1, in each of Reference Example 2-1 to Reference Example 2-4 in which sensitizer treatment was performed with a sensitizer containing even a small amount of SDS, the staining intensity increased. A stronger staining intensity was observed in Reference Example 2-2 (2% (w / v)) than in Reference Example 2-1 (0.5% (w / v)). Reference Example 2-3 (5% (w / v)) and Reference Example 2-4 (10% (w / v)) having a higher SDS concentration than Reference Example 2-2 (2% (w / v)) ), No significant difference was observed in dyeability as compared with Reference Example 2-2 (2% (w / v)).
The results of immunostaining in Comparative Example 2-1 and Reference Example 2-2 are shown in FIG.
＜実験３＞
（比較例３−１〜３−３、参考例３−１〜３−３）
増感剤中の還元剤の効果について検討した。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表３に示す割合で調整した増感剤を用いた以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。比較例３−１、比較例３−２、比較例３−３では、増感剤のコントロールとして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を用いた。
<Experiment 3>
(Comparative Examples 3-1 to 3-3, Reference Examples 3-1 to 3-3)
The effect of the reducing agent in the sensitizer was examined.
In Example 1-1, immunostaining was performed in the same manner as Example 1-1, except that a sensitizer in which the anionic surfactant and the reducing agent were mixed at the ratio shown in Table 3 below was used. Went. In Comparative Example 3-1, Comparative Example 3-2, and Comparative Example 3-3, 0.1 M Tris HCl (pH 6.8) was used as a sensitizer control.
比較例３−１及び参考例３−１の、免疫染色の結果を図３に示す。
還元剤を含まない増感剤を用いた比較例３−１に比べて、２．８６Ｍのβ−ＭＥを含む増感剤を用いた参考例３−１では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining of Comparative Example 3-1 and Reference Example 3-1 are shown in FIG.
Compared to Comparative Example 3-1 using a sensitizer containing no reducing agent, Reference Example 3-1 using a sensitizer containing 2.86M β-ME showed stronger staining.
比較例３−２及び参考例３−２の、免疫染色の結果を図３に示す。
還元剤を含まない増感剤を用いた比較例３−２に比べて、４０ｍＭのＤＴＴを含む増感剤を用いた参考例３−２では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining in Comparative Example 3-2 and Reference Example 3-2 are shown in FIG.
Compared to Comparative Example 3-2 using a sensitizer containing no reducing agent, Reference Example 3-2 using a sensitizer containing 40 mM DTT showed stronger staining.
比較例３−３及び参考例３−３の、免疫染色の結果を図３に示す。
還元剤を含まない増感剤を用いた比較例３−３に比べて、８０ｍＭのＴＣＥＰを含む増感剤を用いた参考例３−３では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining of Comparative Example 3-3 and Reference Example 3-3 are shown in FIG.
Compared to Comparative Example 3-3 using a sensitizer containing no reducing agent, Reference Example 3-3 using a sensitizer containing 80 mM TCEP showed stronger staining.
＜実験４＞
（実施例４−１〜４−３、参考例４−１〜４−３）
増感剤中、還元剤を含むが陰イオン界面活性剤を含まない場合と、還元剤及び界面活性剤を含む場合とで、染色強度の比較を行った。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表４に示す割合で調整した増感剤を用いた以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。
<Experiment 4>
(Examples 4-1 to 4-3, Reference examples 4-1 to 4-3)
The dyeing intensity was compared between the case where the sensitizer contained a reducing agent but no anionic surfactant and the case containing a reducing agent and a surfactant.
In Example 1-1, immunostaining was performed in the same manner as Example 1-1, except that a sensitizer prepared by adjusting the ratio of the anionic surfactant and the reducing agent at the ratio shown in Table 4 below was used. Went.
参考例４−１及び実施例４−１の、免疫染色の結果を図４に示す。
２．８６Ｍのβ−ＭＥを含む増感剤を用いた参考例４−１に比べて、２．８６Ｍのβ−ＭＥ及び２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む増感剤を用いた実施例４−１では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining in Reference Example 4-1 and Example 4-1 are shown in FIG.
Implementation with sensitizer containing 2.86M β-ME and 2% (w / v) SDS compared to Reference Example 4-1 using sensitizer containing 2.86M β-ME In Example 4-1, stronger staining was observed.
参考例４−２及び実施例４−２の、免疫染色の結果を図４に示す。
４０ｍＭのＤＴＴを含む増感剤を用いた参考例４−２に比べて、４０ｍＭのＤＴＴ及び２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む増感剤を用いた実施例４−２では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining in Reference Example 4-2 and Example 4-2 are shown in FIG.
Compared to Reference Example 4-2 using a sensitizer containing 40 mM DTT, Example 4-2 using a sensitizer containing 40 mM DTT and 2% (w / v) SDS was stronger. Staining was observed.
参考例４−３及び実施例４−３の、免疫染色の結果を図４に示す。
８０ｍＭのＴＣＥＰを含む増感剤を用いた参考例４−３に比べて、８０ｍＭのＴＣＥＰ及び２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む増感剤を用いた実施例４−３では、より強い染色が認められた。
The results of immunostaining in Reference Example 4-3 and Example 4-3 are shown in FIG.
Compared to Reference Example 4-3 using a sensitizer containing 80 mM TCEP, Example 4-3 using a sensitizer containing 80 mM TCEP and 2% (w / v) SDS is stronger. Staining was observed.
＜実験５＞
（実施例５−１〜５−６）
増感剤中、界面活性剤と組み合わせるβ−ＭＥの至適濃度について検討した。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表５に示す割合で調整した増感剤を用いたこと、及び一次抗体に、発明者らの研究室で肺腺癌組織をマウスに免疫して作製した抗ＭＵＣ５Ｂ抗体（培養上清）を原液で用いたこと以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。
<Experiment 5>
(Examples 5-1 to 5-6)
In the sensitizer, the optimum concentration of β-ME combined with the surfactant was examined.
In the above Example 1-1, the use of a sensitizer prepared by adjusting the ratio of an anionic surfactant and a reducing agent at the ratios shown in Table 5 below, and the primary antibody, lungs in the inventors' laboratory Immunostaining was performed in the same manner as in Example 1-1, except that anti-MUC5B antibody (culture supernatant) prepared by immunizing mice with adenocarcinoma tissue was used as the stock solution.
実施例５−１〜実施例５−６の、免疫染色の結果を図５に示す。また図６の画像は、図５に示す画像を、画像処理ソフト（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ バージョン １１．０）を用いて、グレースケールに変換後、５０％のグレー値のレベルが中間（１２８）を超えるピクセルをホワイトに、それに満たないものをブラックに変換することで２階調化したものである。
図７のグラフは、図６の各画像の中央部の囲み内の領域について、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ １．４８ｖ）を用いてシグナル（黒い部分）の積算値を算出し、積算値を各囲み内の領域面積で除算した結果である。図７に示されるように、２．８６Ｍのβ−ＭＥを使用した実施例５−４が、その他の濃度のβ−ＭＥを用いた実施例に比べ、染色強度が最大となった。
The results of immunostaining of Example 5-1 to Example 5-6 are shown in FIG. 6 is converted to gray scale using the image processing software (Adobe Photoshop Elements version 11.0) and the gray level of 50% exceeds the middle (128). Pixels are converted into two gradations by converting the pixel to white and the pixel that is less than that to black.
The graph of FIG. 7 calculates the integrated value of the signal (black portion) using image analysis software (ImageJ 1.48v) for the area in the central box of each image of FIG. It is the result of dividing by the area area. As shown in FIG. 7, Example 5-4 using 2.86M β-ME exhibited the maximum staining intensity as compared with Examples using other concentrations of β-ME.
＜実験６＞
（実施例６−１〜６−４）
増感剤中、界面活性剤と組み合わせるＤＴＴの至適濃度について検討した。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表６に示す割合で調整した増感剤を用いたこと、及び一次抗体に、発明者らの研究室で肺腺癌組織をマウスに免疫して作製した抗ＭＵＣ５Ｂ抗体（培養上清）を原液で用いたこと以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。
<Experiment 6>
(Examples 6-1 to 6-4)
In the sensitizer, the optimum concentration of DTT combined with the surfactant was examined.
In Example 1-1, the sensitizer prepared by adjusting the ratio of the anionic surfactant and the reducing agent at the ratio shown in Table 6 below was used, and the primary antibody was used in the lungs of the inventors in the laboratory. Immunostaining was performed in the same manner as in Example 1-1, except that anti-MUC5B antibody (culture supernatant) prepared by immunizing mice with adenocarcinoma tissue was used as the stock solution.
実施例６−１〜実施例６−４の、免疫染色の結果を図８に示す。また上記実験５と同様にして、図８を処理した画像を図９に示す。
図１０のグラフは、図９の各画像の中央部の囲み内の領域について、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ １．４８ｖ）を用いてシグナル（黒い部分）の積算値を算出し、積算値を各囲み内の領域面積で除算した結果である。図１０に示されるように、４０ｍＭのＤＴＴを使用した実施例６−４が、その他の濃度のＤＴＴを用いた実施例に比べ、染色強度が最大となった。
The results of immunostaining of Example 6-1 to Example 6-4 are shown in FIG. Further, the image obtained by processing FIG. 8 in the same manner as in Experiment 5 is shown in FIG.
The graph of FIG. 10 calculates the integrated value of the signal (black part) using image analysis software (ImageJ 1.48v) for the area in the central box of each image of FIG. It is the result of dividing by the area area. As shown in FIG. 10, Example 6-4 using 40 mM DTT had the maximum staining intensity compared to Examples using other concentrations of DTT.
＜実験７＞
（実施例７−１〜７−６）
増感剤中、界面活性剤と組み合わせるＴＣＥＰの至適濃度について検討した。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表７に示す割合で調整した増感剤を用いたこと、及び一次抗体に、発明者らの研究室で肺腺癌組織をマウスに免疫して作製した抗ＭＵＣ５Ｂ抗体（培養上清）を原液で用いたこと以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。
<Experiment 7>
(Examples 7-1 to 7-6)
In the sensitizer, the optimum concentration of TCEP to be combined with the surfactant was examined.
In Example 1-1, the sensitizer prepared by adjusting the ratio of the anionic surfactant and the reducing agent at the ratio shown in Table 7 below was used, and the primary antibody was used in the lungs of the inventors' laboratory. Immunostaining was performed in the same manner as in Example 1-1, except that anti-MUC5B antibody (culture supernatant) prepared by immunizing mice with adenocarcinoma tissue was used as the stock solution.
実施例７−１〜実施例７−６の、免疫染色の結果を図１１に示す。また上記実験５と同様にして、図１１を処理した画像を図１２に示す。
図１３のグラフは、図１２の各画像の中央部の囲み内の領域について、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ １．４８ｖ）を用いてシグナル（黒い部分）の積算値を算出し、積算値を各囲み内の領域面積で除算した結果である。図１３に示されるように、６０ｍＭまでは濃度増加に伴い染色強度も増大していくが、８０ｍＭでは微増となった。８０ｍＭのＴＣＥＰを使用した実施例７−６が、その他の濃度のＴＣＥＰを用いた実施例に比べ、染色強度が最大となった。
The results of immunostaining of Example 7-1 to Example 7-6 are shown in FIG. Further, FIG. 12 shows an image obtained by processing FIG. 11 in the same manner as in Experiment 5 described above.
The graph of FIG. 13 calculates the integrated value of the signal (black part) using image analysis software (ImageJ 1.48v) for the area in the central box of each image of FIG. It is the result of dividing by the area area. As shown in FIG. 13, the staining intensity increased with increasing concentration up to 60 mM, but slightly increased at 80 mM. Examples 7-6 using 80 mM TCEP had the highest staining intensity compared to Examples using other concentrations of TCEP.
＜実験８＞
（比較例８−１、実施例８−１〜８−３）
ＳＤＳに組み合わせる各種還元剤について、上記で検討した至適条件における染色強度の比較を行った。
上記実施例１−１において、陰イオン界面活性剤及び還元剤の配合を以下の表８に示す割合で調整した増感剤を用いた以外は、実施例１−１と同様にして、免疫染色を行った。比較例８−１では、増感剤のコントロールとして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を用いた。
<Experiment 8>
(Comparative Example 8-1, Examples 8-1 to 8-3)
For various reducing agents combined with SDS, the staining intensity was compared under the optimum conditions examined above.
In Example 1-1, immunostaining was performed in the same manner as Example 1-1 except that a sensitizer in which the anionic surfactant and the reducing agent were mixed at the ratio shown in Table 8 below was used. Went. In Comparative Example 8-1, 0.1 M Tris HCl (pH 6.8) was used as a sensitizer control.
比較例８−１及び実施例８−１〜実施例８−３の、免疫染色の結果を図１４に示す。また上記実験５と同様にして、図１４を処理した画像を図１５に示す。
図１６のグラフは、図１５の各画像の中央部の囲み内の領域について、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ １．４８ｖ）を用いてシグナル（黒い部分）の積算値を算出し、積算値を各囲み内の領域面積で除算した結果である。図１６に示されるように、β−ＭＥを還元剤として使用した実施例８−１と、ＤＴＴを還元剤として使用した実施例８−２に比べ、ＴＣＥＰを還元剤として使用した実施例８−３で、染色強度が最大となった。
The results of immunostaining of Comparative Example 8-1 and Example 8-1 to Example 8-3 are shown in FIG. Further, FIG. 15 shows an image obtained by processing FIG. 14 in the same manner as in Experiment 5 described above.
In the graph of FIG. 16, the integrated value of the signal (black part) is calculated using image analysis software (ImageJ 1.48v) for the area in the central box of each image of FIG. It is the result of dividing by the area area. As shown in FIG. 16, compared to Example 8-1 using β-ME as a reducing agent and Example 8-2 using DTT as a reducing agent, Example 8- using TCEP as a reducing agent. 3, the staining intensity was maximized.
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
本発明の免疫染色用増感剤及び免疫染色用増感剤キットによれば、例えば、通常の免疫染色法の一次抗体反応前に、免疫染色用増感剤を反応させるという簡便な作業を行うことで、染色性が大幅に向上する。本発明の免疫染色用増感剤、免疫染色用増感剤キット、及びそれを用いた免疫染色方法は、一例として分子標的治療薬選択や研究などへの適用可能である。 According to the sensitizer for immunostaining and the sensitizer kit for immunostaining of the present invention, for example, before the primary antibody reaction of a normal immunostaining method, a simple work of reacting the sensitizer for immunostaining is performed. As a result, the dyeability is greatly improved. The sensitizer for immunostaining, the sensitizer kit for immunostaining, and the immunostaining method using the same of the present invention can be applied to molecular target therapeutic drug selection and research, for example.
Claims (4)
前記ドデシル硫酸ナトリウムを０．１〜３０（ｗ／ｖ）％の割合で含み、前記トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを０．０６〜２０ｍｏｌ／ｌの割合で含む、免疫染色用増感剤。 A sensitizer for immunostaining used for immunostaining of tissue sections, comprising an anionic surfactant and a reducing agent, wherein the anionic surfactant is sodium dodecyl sulfate, and the reducing agent is tris (2- Carboxyethyl) phosphine ,
A sensitizer for immunostaining comprising the sodium dodecyl sulfate in a proportion of 0.1 to 30 (w / v)% and the tris (2-carboxyethyl) phosphine in a proportion of 0.06 to 20 mol / l .
前記組織切片の抗原に抗体を反応させる前に、前記免疫染色用増感剤を組織切片に接触させることを含む、免疫染色方法。 An immunostaining method using the sensitizer for immunostaining according to claim 1 ,
An immunostaining method comprising contacting the tissue section with a sensitizer for immunostaining before reacting an antibody with an antigen of the tissue section.
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