JP6266848B2

JP6266848B2 - スイカスプラウト由来物質を主成分とする加工食品と医薬組成物

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Publication number: JP6266848B2
Application number: JP2017527000A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　智広; 智広伊藤; 利治橋詰
Original assignee: HAGIHARA FARM PRODUCTION INSTITUTE CO.,LTD.; Kinki University
Current assignee: HAGIHARA FARM PRODUCTION INSTITUTE CO.,LTD.; Kinki University
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2018-01-24
Anticipated expiration: 2037-01-27
Also published as: US10758583B2; US20190343909A1; CN108601756B; WO2017131175A1; JPWO2017131175A1; CN108601756A

Description

本発明は、スイカスプラウト由来物質による、加工食品および医薬組成物に関するものである。

近年、もやし、カイワレ大根、アルファルファ、ブロッコリースプラウト、豆苗、紅タデなど様々なスプラウトの機能性研究が盛んに行われている。例えば、スプラウトには、発芽後ビタミンＣの産生が抗酸化能に強く寄与することが報告されている。

また、特許文献１には、ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための健康食品、生のダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する癌を予防するための健康飲料、及びダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための医薬組成物が開示されている。

また、特許文献２にはゴボウスプラウト中に含まれるアルクチゲニンが癌幹細胞の発生を抑制することが開示されている。

特開２００５−２０６４９５号公報特開２０１４−２２４０８５号公報

特許文献が示すように、スプラウトはこれまで知られていた抗酸化作用の他、抗癌作用を示すことがわかってきた。癌の治療には、外科治療の他、化学治療が行われている。現在では、分子標的剤と呼ばれる細胞中の信号伝達経路に作用する薬剤が開発されている。しかし、その副作用は患者にとっては負担が軽いとはいえない。したがって、副作用が少なく、癌細胞の増殖抑制効果の大きな物質は、健康食品や医薬組成物として依然として要望されている。

スプラウトのような天然物から抽出した物質は、作用機序は不明な場合が多いが、これまでの食経験から副作用は少ないものが期待できる。しかし、特許文献のスプラウト由来物質は、癌細胞への特異的な抑制作用があるとは報告されていない。

本発明の発明者は、スプラウト由来の物質の効果を調べるなかで、スイカスプラウト由来の物質が癌細胞の増殖を特異的に抑制することができることを見出し、加工食品および医薬組成物の発明を完成するに至った。

より具体的に本発明に係る医薬組成物は、スイカスプラウトのヘキサン抽出画分を主成分とする癌細胞増殖阻害剤である。

また、本発明に係る加工食品は、スイカスプラウトのヘキサン抽出画分を主成分として含むものである。

スイカスプラウトを非極性溶媒で抽出したものは、癌細胞（特にヒト白血病細胞）の増殖を特異的に阻害し、健常細胞にはほとんど影響を与えない。また、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分の中でもフィトールおよびルテインが特に大きな寄与を示すことがわかった。よって、フィトール若しくはルテインの少なくも一方を主成分とする加工食品や医薬組成物（癌細胞増殖阻害剤）は、癌の予防若しくは、治療薬として有効である。

スイカスプラウトの抽出の経緯を示す図である。ヘキサン画分をさらに単離する抽出経緯を示す図である。スイカスプラウトエタノール溶出物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を示すグラフである。スイカスプラウトエタノール溶出物の各種溶媒を用いた細分画物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を示すグラフである。ヘキサン溶出物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を示すグラフである。スイカスプラウト−ヘキサン溶出物処理によるＪｕｒｋａｔ細胞の細胞周期への影響を示すグラフである。スイカスプラウトエタノール溶出物の各種溶媒を用いた単離物質によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を示すグラフである。スイカスプラウト−ヘキサン溶出物処理による正常リンパ細胞の増殖への影響を示すグラフである。フィトールで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＳ期の細胞から抽出したタンパク質であるＣｙｃｌｉｎＡをウエスタンブロット法で検出した結果である。

以下に本発明に係る実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

本発明に係る加工食品および医薬組成物には、主成分として、フィトール若しくはルテインの少なくとも一方が主成分として用いられる。また、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分を主成分としてもよい。後述する実施例で示すように、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分が癌細胞の増殖を特異的に阻害する効果を有し、非極性溶媒抽出画分の中でも、フィトールと、ルテインがその効果に大きく影響していたからである。

なお、本明細書において、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分と、フィトールと、ルテインおよびこれらの誘導体をまとめて示す際には、「本発明の効果成分」と呼ぶ。また、本発明の効果成分が有する「癌細胞の増殖を特異的に阻害する効果」を「本発明の効果成分の有する効果」と呼ぶ。

本明細書において、「主成分」とは、加工食品や医薬組成物において、本発明の効果成分の有する効果が認められる程度の量が含まれていればよい。つまり、本発明の効果成分の有する効果以外の効果を有する成分が含まれていてもよい。

＜スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分＞
本発明において、スイカとは、学名Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓｌａｎａｔｕｓである、ウリ科のツル性一年草をいう。野生種であってもよい。また、品種改良されたものであってもよい。特に、「祭ばやし７７７」や「春のだんらん」といった品種が好適に利用できる。

スイカスプラウトとはスイカの種を発芽させた新芽をいう。特に播種後１０〜２０日のものが望ましい。この発芽に際しては、日光には当てず、発芽後日光を当てて育成させる。発芽のためには、水以外のものは使用しないが、発芽後は窒素、リン酸、カリ等の養分を含む液肥を施用する。発芽温度は２５℃〜３０℃が適している。なお、スプラウトとして収穫し、凍結乾燥したものを用いても良い。

採取したスプラウトは、根、茎、葉と全ての部分が利用できる。特に葉の部分には、本発明に係る加工食品若しくは医薬組成物の有効成分と考えられるフィトールおよびルテインが多い。

抽出方法としては、エタノール抽出、水抽出を経た材料を非極性溶媒で抽出することで得られる。利用できる非極性溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトンといったケトン類、ジエチルエーテル等のエーテル類、ヘキサン、ペンタンといった脂肪族炭化水素などが好適に利用できる。なかでも、ヘキサンは好適に利用できる。

抽出方法は、材料を洗浄、破砕する前処理工程と、破砕した材料を非極性抽出溶媒中に浸漬させ抽出液を得る工程と、抽出液を濾過する工程を経て得ることができる。濾過液をさらに乾燥する工程を加えてもよい。

後述する実施例で示すように、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分の中で、癌細胞の増殖抑制効果を有するのは、フィトールとルテインであった。これらの物質は、これらの物質だけではなく、誘導体の状態であっても、本発明の効果成分の有する効果を発揮する。

例えば、フィタン酸（Ｃ_２０Ｈ_４０Ｏ_２；ＣＡＳ登録番号：１４７２１−６６−５）はフィトールの誘導体といってもよい。また、フィトールやルテインの水酸基をメチル化又はメトキシ化したものも本発明の効果成分の有する効果を発揮すると考えられる。

したがって、スイカスプラウトから本発明の効果成分を抽出する方法においても濾過した状態のもの若しくは乾燥した状態から抽出物全体に対して、誘導体を得る工程が加わってもよい。

＜フィトールとルテイン＞
フィトール（Ｃ_２０Ｈ_４０Ｏ；ＣＡＳ登録番号：７５４１−４９−３）とルテイン（Ｃ_４０Ｈ_５６Ｏ_２；ＣＡＳ登録番号１２７−４０−２）を、それぞれ（１）式、（２）式に示す。

後述する実施例で示すように、スイカスプラウトの非極性溶媒抽出画分において、癌細胞の増殖を特異的に阻害する効果を有するのは、これら２つの物質であり、特にフィトールの発揮する効果は高い。また、これらの誘導体も同様の効果を示すと考えられ、本発明の効果成分に含まれる。

＜加工食品＞
本発明に係る加工食品は、本発明の効果成分が主成分として含まれる。加工食品としての形態としては、飴、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム等といった一般加工食品だけでなく、軟エキス剤、乾燥エキス剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤といったエキス剤や、アルコール飲料を含んでもよい。

＜医薬組成物＞
本発明に係る医薬組成物は、本発明の効果成分が主成分として含まれる。薬剤の形態としては、カプセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等を含む。

これらの製剤は、常法に従って主成分に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、希釈剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化される。また、本発明の医薬組成物は、本発明の効果成分に加えて、他の薬理活性成分を含んでいてもよい。

固形の製剤は、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、糖衣錠等であり、有効成分としての本発明の効果成分と、希釈剤（例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉等）、滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等）、結合剤（例えば澱粉類、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、離散剤（例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩等）、飽和剤、着色料、甘味料、湿潤剤（例えばレシチン、ポリソルベート、硫酸ラウリル塩等）等を含有することができる。これらは、既知の方法、例えば混合、粒状化、錠剤化、糖衣化等の方法により製剤化することができる。

液状の製剤は、例えばシロップ、溶液、乳濁液及び懸濁液の形態とすることができる。懸濁液及び乳濁液は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等を含有することができる。

１．供試サンプルの調製
スイカＣＳ種スプラウト３ｋｇ（湿重量）を粉砕し、この粉砕物にエタノールを５Ｌ加え、攪拌しながら常温にてエタノール溶出物を調製した。この操作を三度繰り返した。溶出液は、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮乾固した。

エタノール溶出物（ＥｔＯＨＦｒ．）のＪｕｒｋａｔ細胞増殖抑制能を評価後、さらにこのエタノール溶出物を蒸留水にて再溶解後、ヘキサン（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃＦｒ．）、ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨＦｒ．）を用いて順に溶媒分配法により各溶出画分および蒸留水溶解物（ＷａｔｅｒＦｒ．）を調製した。図１に抽出の経過図を示す。

２．細胞培養
ヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（つくば市、茨城県）より入手した。１０％牛胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ、Ｋ．Ｋ．、ＭＡ、ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬスプレトマイシン（共にＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業株式会社、大阪市、大阪府）により３７℃、９５％空気−５％ＣＯ_２環境下で培養した。

３．スイカスプラウトエタノール溶液により抽出した各画分および単離物質によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２４ウェルマルチプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓＫ．Ｋ．）に５００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。播種後、スイカスプラウトエタノール溶出物（ＥｔＯＨＦｒ．）を終濃度が１０、２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍＬになるように、ヘキサン（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃＦｒ．）、ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨＦｒ．）および蒸留水溶解物（ＷａｔｅｒＦｒ．）を終濃度が２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ処理し、培養した。サンプル処理２４、４８、７２時間後に細胞をトライパンブルー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、血球計算盤を用いて生細胞を計数した。

４．細胞周期解析
Ｊｕｒｋａｔ細胞を（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整済み）６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３ｍＬ播種し、２時間の前培養を行った。２時間の前培養後、終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにヘキサン画分を添加し、培養した。培養１２、２４、４８および７２時間後に細胞を回収し、ＰＢＳにて２度洗浄後、７０％エタノールを加え−２０℃にて一晩固定した。

翌日、固定した細胞を３００×ｇにて遠心後、細胞ペレットをＰＢＳにて２度洗浄した。洗浄終了後、Ｍｕｓｅ（登録商標）ＣｅｌｌｃｙｃｌｅＫｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に含まれているｃｅｌｌｓｔａｉｎｉｎｇｒｅａｇｅｎｔを２００μＬ加え、室温遮光環境下で３０分染色した。その後、Ｍｕｓｅ（登録商標）ＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞周期解析を行った。

５．スイカスプラウトエタノール溶液により抽出したヘキサン画分によるヒト正常リンパ球細胞への影響
ヒト正常リンパ球細胞はヒト末梢血をＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅＰＬＵＳ，ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅＵＫＬｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）により調製した。１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、９６ウェルマルチプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓＫ．Ｋ．）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。播種後、スイカスプラウトヘキサン溶出物を終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように処理し、培養した。サンプル処理４８時間後に細胞をトライパンブルー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、血球計算盤を用いて生細胞を計数した。

６．効果成分の単離
ヘキサン溶解物の中の効果成分を単離した。図２に経過図を示す。図１で示したヘキサン溶解物（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）１０ｇをシリカゲルクロマトグラフィーに供し、ヘキサン（Ｈｅｘ）：ジクロロメタン（ＤＣＭ）＝１：１、１：２、ジクロロメタン、ジクロロメタン：酢酸エチル＝５：１で溶出し、６つの画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．６）に分けた。図２中では、ＳｉＯ_２ＣＣ（Ｈｅｘ／ＤＣＭ＝１／１→１／２→ＤＣＭ→ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ＝５／１）と示した。「ＳｉＯ_２ＣＣ」はシリカゲルクロマトグラフィーのことである。

６つの画分については、それぞれにＪｕｒｋｅｔ細胞に対する効果を確認し、効果のあった４画分（Ｆｒ．２、Ｆｒ．３、Ｆｒ．５、Ｆｒ．６）を選んだ。その各画分を、さらに各種シリカゲルクロマトグラフィーに供し、４つの化合物（Ｐｈｙｔｏｌ、Ｌｕｔｅｉｎ、２２−ＤｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌおよびＬｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ）を単離した。

より具体的には、第２画分Ｆｒ．２をさらにヘキサン（Ｈｅｘ）：クロロホルム（ＣＨＣｌ_３）＝１：１で分離し、フィトール（Ｐｈｙｔｏｌ）を得た。また、第３画分は、ヘキサン（Ｈｅｘ）：アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）＝１０：１で分離し、２２−デヒドロコレステロール（２２−Ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を得た。

また、第５画分は、ヘキサン（Ｈｅｘ）：クロロホルム（ＣＨＣｌ_３）＝１：２で分離し、ルテイン（Ｌｕｔｅｉｎ）を得た。また、第６画分は、最初にヘキサン（Ｈｅｘ）：酢酸ブチル（ＥｔＯＡｃ）＝１：４で分離し、さらに、ヘキサン（Ｈｅｘ）：アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）＝１０：３の溶液でリノレン酸（Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ）を得た。

７．スイカスプラウトエタノール溶液により抽出したヘキサン画分による各種ヒトガン細胞の増殖への影響
ヒト子宮頸ガン細胞株ＨｅＬａ細胞、ヒト肺胞基底上皮腺ガン細胞Ａ５４９細胞、ヒト胃がん細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ヒト子肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、９６ウェルマルチプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓＫ．Ｋ．）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。播種後、終濃度が２．５、５、１０、２５、５０、１００、２００μｇ／ｍＬになるように、ヘキサン溶出物（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）を添加し、培養した。

サンプル処理２４、４８、７２時間後に細胞培養液を除去し、１０％のＷＳＴ−１試薬を新鮮な培地に置き換え（Ｔａｋａｒａｂｉｏ，草津、滋賀）、４５分間培養した。４５分後、培地５０μＬを新しい９６ウェルマルチプレートに移し、５０μＬの蒸留水を加えて、４４０ｎｍにおける吸光度（Ａ_４４０）を測定した。生細胞数（％）を以下の式で求めた。
生細胞数（％）＝｛（ヘキサン処理したガン細胞のＡ_４４０）／（無処理のガン細胞のＡ_４４０）｝×１００

＜実験結果＞
［スイカスプラウトエタノール溶出物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響］
Ｊｕｒｋａｔ細胞にスイカスプラウトエタノール溶出物（ＥｔＯＨＦｒ．）を終濃度が１０、２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍＬになるように処理した。結果を図３に示す。横軸は処理時間（時間）であり、縦軸は生存細胞数（１０^５×ｃｅｌｌ／ｍＬ）である。処理４８時間後から３００μｇ／ｍＬ処理細胞群（符号３００）において無処理群（符号０００）と比較して有意に増殖が抑制されることを確認した。

［スイカスプラウトエタノール溶出物の各種溶媒を用いた細分画物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響］
エタノール溶出物を濃縮乾固したものを蒸留水にて再溶解後、ヘキサン（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）（図４（ｂ））、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃＦｒ．）（図４（ｃ））、ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨＦｒ．）（図４（ｄ））を用いて溶媒分配法により各溶解物および蒸留水再溶解物（ＷａｔｅｒＦｒ．）（図４（ａ））を調製した。なお、これらの溶解物は抽出画分と呼んでもよい。

いずれのグラフも横軸は処理時間（時間）であり、縦軸は、生存細胞数（１０^５×ｃｅｌｌ／ｍＬ）である。これらを用いてＪｕｒｋａｔ細胞に終濃度が２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるように処理し、２４、４８、７２時間後に細胞を計数した。その結果、ヘキサン溶出画分（ＨｅｘａｎｅＦｒ．）（図４（ｂ））に顕著な増殖抑制能を確認した。具体的にはコントロール（符号０００）に対して、ヘキサン溶出画分を２４μｇ／ｍＬ以上入れた場合は、細胞数が増殖しなかった。他の分画物（図４（ａ）、（ｃ）、（ｄ））ではＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制はほとんど見られなかった。

［ヘキサン溶解物によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響］
ヘキサン抽出画分にＪｕｒｋａｔ細胞に対する強い増殖抑制効果が見られたので、ヘキサン抽出画分の濃度を下げてＪｕｒｋａｔ細胞に対する増殖抑制効果を調べた。その結果を、図５に示す。図５は、横軸が処理時間（時間）であり、縦軸は、生存細胞数（１０^５×ｃｅｌｌ／ｍＬ）である。

グラフ中の線はそれぞれヘキサン溶解物の濃度が２．５μｇ／ｍＬ（符号２．５）、５μｇ／ｍＬ（符号５）、１０μｇ／ｍＬ（符号１０）、２５μｇ／ｍＬ（符号２５）、コントロール（符号０００）である。

図５を参照して、ヘキサン抽出画分は処理濃度依存的にＪｕｒｋａｔ細胞の増殖を抑制した。１０μｇ／ｍＬ処理（符号１０）では２５μｇ／ｍＬ処理（符号２５）細胞と同様に４８時間後にはＪｕｒｋａｔ細胞はほぼ全滅した。

［スイカスプラウト−ヘキサン溶解物処理によるＪｕｒｋａｔ細胞の細胞周期への影響］
ヘキサン抽出画分処理によるＪｕｒｋａｔ細胞の細胞周期への影響を検討した。結果を図６に示す。図６（ａ）は、Ｓｕｂ−Ｇ_１期、図６（ｂ）はＧ_０／Ｇ_１期、図６（ｃ）はＳ期、図６（ｄ）はＧ_２／Ｍ期である。各グラフは横軸が処理時間（時間）であり、縦軸は細胞数（全数）に対する計測比率（％）である。

その結果、興味深いことに、処理時間経が進むにつれてＧ_２／Ｍ期の細胞数が減少し、Ｓ期の細胞数が増加した。この結果から、ヘキサン抽出画分処理はＪｕｒｋａｔ細胞の細胞周期をＳ期で停止させることで増殖を阻害していることが示された。

また、ヘキサン抽出画分で処理をしたＪｕｒｋａｔ細胞をヘキスト染色、プロピジュウムイオダイド染色し、検鏡したが、核やミトコンドリアの崩壊はほとんど見られなかった。また、抽出したＤＮＡの分解もほとんど起こっておらず、ネクローシスやアポトーシスによるものではないと考えられた。以上のことから、スイカスプラウトのヘキサン抽出画分には、Ｓ期細胞周期停止を誘導する作用があることがわかった。

［スイカスプラウトエタノール溶出物の各種溶媒を用いた単離物質によるヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響］
ＨｅｘａｎｅＦｒ．（ヘキサン抽出画分）を分取ＨＰＬＣにより単離したところ、主たる成分として、フィトール（ｐｈｙｔｏｌ）、ルテイン（ｌｕｔｅｉｎ）、２２デヒドロコレステロール（２２−ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびリノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ）を検出した。これらの成分を用いてＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制効果を検討した。それぞれの成分で終濃度が１０、２５、５０μＭになるようにＪｕｒｋａｔ細胞を処理し、２４、４８、７２時間後に細胞を計数した。

結果を図７に示す。図７（ａ）は、フィトールであり、図７（ｂ）は、ルテインであり、図７（ｃ）は２２デヒドロコレステロールであり、図７（ｄ）はリノレン酸である。各グラフは、横軸は処理時間（時間）であり、縦軸は生存細胞数（１０^５×ｃｅｌｌ／ｍＬ）である。終濃度が１０μＭは符号（１０）、２５μＭは符号（２５）、５０μＭは符号（５０）、コントロールは符号（０００）で示した。

図７を参照して、ｐｈｙｔｏｌ（図７（ａ））およびｌｕｔｅｉｎ（図７（ｂ））に顕著な増殖抑制能を確認した。一方、２２−ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（図７（ｃ））およびｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ（図７（ｄ））ではＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制はほとんど見られなかった。このｐｈｙｔｏｌおよびｌｕｔｅｉｎのＪｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制のＩＣ_５０値を求めたところ、それぞれ１２．８μＭおよび２２．６μＭであった。

次に、ＨｅｘａｎｅＦｒ．（ヘキサン抽出画分）が正常リンパ球に及ぼす影響を調べた。正常リンパ球に終濃度１０μｇ／ｍＬになるように処理をし、処理後７２時間での細胞増殖抑制効果を検討した。結果を図８に示す。横軸は処理液の種類（ＣＳＨｅｘａｎｅＦｒ．と無処理）であり、縦軸は細胞増加率（％）である。これは無処理の細胞増加数に対するパーセントで表示した。ヘキサン溶出物処理の場合（ＣＳＨｅｘａｎｅＦｒ．）は、無処理の場合とほぼ同じだけ細胞増殖が観察された。この結果、ヘキサン抽出画分は、正常細胞に対しては、増殖抑制効果を及ぼさないことが確認された。

［スイカスプラウト−ヘキサン溶解物処理による各種ガン細胞の増殖への影響］
ＷＳＴ−１法により各種ガン細胞の増殖抑制効果を検討したところ、表１のようにＩＣ_５０値を得た。ガン細胞に対する感受性は多少差が見られたが、いずれのガン細胞に対しても有効な効果を示すことが示唆された。

次に、フィトールおよびルテインの、Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖の抑制についてさらに調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖抑制の原因は、細胞分裂におけるＳ期細胞周期停止を誘導することにあることは、図６および図７に示した通りである。そこでさらに、フィトールがＳ期細胞周期停止を誘導する原因について調べた。具体的には、Ｓ期における細胞周期を調節する分子のタンパク発現についてウエスタンブロット法により検討した。

その結果、ＤＮＡの複製に関与するＣｙｃｌｉｎＡの発現量が低下していることが分った。ＣｙｃｌｉｎＡの発現低下は，Ｓ期からＧ２期への移行を停止させる。そのため、ｐｈｙｔｏｌ処理によるこのＣｙｃｌｉｎＡの発現低下がＳ期停止を導いたものと考えられた。

図９（ａ）は、フィトールで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＳ期の細胞から抽出したタンパク質であるＣｙｃｌｉｎＡをウエスタンブロット法で検出した結果である。フィトール処理の有り（Ｐｈｙｔｏｌ（＋））、無（（Ｐｈｔｏｌ（−））に対して、ＣｙｃｌｉｎＡとβ―Ａｃｔｉｎの結果である。

また、図９（ｂ）は、画像解析ソフトｉｍａｇｅＪで図９（ａ）のウエスタンブロットの結果のバッグラウンド補正を行い、デンシトメトリー解析後、β−ａｃｔｉｎのバンド密度に対するｃｙｃｌｉｎＡのバンド密度の比率を求めたものである。データはｐｈｙｔｏｌ（−）の値を１としたときのｐｈｙｔｏｌ（＋）の値で評価し、平均＋標準誤差（ｎ＝５）で示した。ｐｈｙｔｏｌ（−）と（＋）比較はＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により検定した（ｐ＜０．０１）。

図９（ａ）を参照して、β−Ａｃｔｉｎは、内在性コントロールの意味で測定している。β―Ａｃｔｉｎはフィトール処理の有無に関わらず、同じ濃さで検出されていた。一方、ＣｙｃｌｉｎＡについては、フィトールで処理していない場合（Ｐｈｙｔｏｌ（−））は、フィトールで処理した場合（Ｐｈｙｔｏｌ（＋））よりも濃い影で観測された。したがって、フィトール処理を行ったものは、ＣｙｃｌｉｎＡの発現が抑制されていることがわかった。

以上のことから、フィトールは、癌細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞のＣｙｃｌｉｎＡの発現を抑制し、そのためＳ期細胞周期停止を誘導していることがわかった。一方、フィトールは、図８から正常細胞については、増殖抑制効果を有しない。したがって、フィトールは、癌細胞だけを選択的に抑制する機能を有していることが分かった。

以上のように、スイカスプラウトのヘキサン抽出画分は様々な癌細胞の増殖を抑制する効果があった。また、その効果の主たる成分は、フィトールとルテインであることがわかった。また、これらの成分（スイカスプラウトのヘキサン抽出画分を含む）は、正常細胞に対しては細胞増殖を抑制する効果はない。つまり、本発明の効果成分は癌細胞の増殖を特異的に抑制する効果を有する。これは副作用の少ない抗癌用医薬組成物を提供できることを意味する。

本発明の効果成分は、癌予防若しくはがん治療効果を有する加工食品や医薬組成物として好適に利用できる。

Claims

スイカスプラウトのヘキサン抽出画分を主成分とする癌細胞増殖阻害剤。
スイカスプラウトのヘキサン抽出画分を主成分とする加工食品。
スイカスプラウトを洗浄、破砕する前処理工程と、
破砕した前記スイカスプラウトを非極性抽出溶媒に浸漬させ抽出液を得る工程と、
抽出液を濾過する工程を含むことを特徴とする癌細胞増殖阻害剤の製造方法。
前記抽出液を得る工程は、
破砕した前記スイカスプラウトをエタノールに溶出させる工程と、
前記エタノールの溶出物をさらに蒸留水で再溶解させる工程と、
前記蒸留水の溶解物をヘキサンに溶解させる工程を含むことを特徴とする請求項３に記載された癌細胞増殖阻害剤の製造方法。
スイカスプラウトを洗浄、破砕する前処理工程と、
破砕した前記スイカスプラウトを非極性抽出溶媒に浸漬させ抽出液を得る工程と、
抽出液を濾過する工程を含むことを特徴とする加工食品の製造方法。
前記抽出液を得る工程は、
破砕した前記スイカスプラウトをエタノールに溶出させる工程と、
前記エタノールの溶出物をさらに蒸留水で再溶解させる工程と、
前記蒸留水の溶解物をヘキサンに溶解させる工程を含むことを特徴とする請求項５に記載された加工食品の製造方法。