JP6265446B1 - Seaweed saccharification method and alcohol production method - Google Patents
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Abstract
【課題】海藻の糖化方法を提供し、さらに製造した糖からのアルコールの製造方法を提供し、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図る。【解決手段】海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により海藻から還元糖を製造する方法である。また、海藻の糖化方法により得られる糖から、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株によりアルコールを製造し、海藻を有効に利用することができる。【選択図】図７The present invention provides a method for saccharifying seaweed, and further provides a method for producing alcohol from the produced sugar, thereby effectively utilizing seaweed, which is a proliferating organic resource. A method for saccharification of seaweed is a method for producing reducing sugar from seaweed using Fusarium oxysporum. Moreover, alcohol can be manufactured from the saccharide | sugar obtained by the saccharification method of a seaweed, and it is contained in the Enterobacter genus and the accession number is NITE P-02290, and seaweed can be utilized effectively. [Selection] Figure 7
Description
本発明は、海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法に関する。また、海藻の糖化方法により得られる糖を原料とするアルコールの製造方法に関する。 The present invention relates to a seaweed saccharification method for producing reducing sugar from seaweed. Further, the present invention relates to a method for producing alcohol using sugar obtained by a saccharification method of seaweed as a raw material.
寒天は、紅藻類の１種であるテングサ等に含まれる粘液質を乾燥して製造する多糖類である。寒天は、冷水に入れ、加熱した後、３８℃以下に保持すると、１％以下の濃度でもゲル化する。また、ゲル化すると、８５℃以上に加熱しないと溶けない性質があるため、口の中に入れても溶けない。また、寒天は、海洋性細菌と腸内細菌の一部を除き、消化し利用できる微生物はないとされ、１９世紀のロベルト・コッホ以来、微生物培養の培地の固化剤（ゲル化剤）として利用されている。したがって、テングサ等の紅藻類を再生可能な有機資源として有効利用するために、糖化方法等に関する新しい技術が必要である。 Agar is a polysaccharide that is produced by drying mucus contained in tengusa, a kind of red algae. Agar is gelled even at a concentration of 1% or less when it is kept in 38 ° C. or less after being put in cold water and heated. Moreover, since it has a property which does not melt unless it heats to 85 degreeC or more, it will not melt even if it puts in a mouth. In addition, agar is considered to have no microorganisms that can be digested and used except for some marine and enteric bacteria, and has been used as a solidifying agent (gelling agent) for microbial culture media since the 19th century Robert Koch. Has been. Therefore, in order to effectively use red algae such as proboscis as a renewable organic resource, a new technique relating to a saccharification method is required.
アオサは、緑藻類の１種であり、近年、国内外の沿岸部における海水の富栄養化により異常繁殖し、沿岸部に堆積して景観を悪化し、腐敗して悪臭を放ち、グリーンタイドと呼ばれ、環境問題になっている。アオサが異常繁殖する理由の１つは、高い増殖率にあり、アオサの１種であるミナミアオノリの日間成長率は１１２％であるため、１週間で２倍以上に成長する。したがって、アオサ等の緑藻類の有効な利用方法を確立することにより、環境問題を解消し、高い成長率に基づき有望な有機資源として利用する必要がある。 Aosa is a kind of green algae that has recently grown abnormally due to the eutrophication of seawater in coastal areas in Japan and overseas, depositing on the coastal area, deteriorating the landscape, rotting and giving off a bad odor, called green tide It has become an environmental problem. One of the reasons for abnormal breeding of Aosa is the high growth rate, and the daily growth rate of Minamiaoriori, a kind of Aosa, is 112%, so it grows more than twice a week. Therefore, it is necessary to solve environmental problems by establishing an effective utilization method of green algae such as seaweed and to use it as a promising organic resource based on a high growth rate.
緑藻類の利用に関しては、たとえば海洋性細菌によるアオサの分解に関する研究が知られている（非特許文献１参照）。アオサの細胞壁には、Ulvanと呼ばれる多糖類が含まれ、含有量は乾燥重量で８〜２９％である。非特許文献１によれば、ミナミアオサ(Ulva ohnoi)から精製したUlvanを使用し、ミナミアオサに付着していたブドウガイ(Haloa japonica)に由来するUlvan分解細菌(Glaciecola sp.と推定)を単離している。このUlvan分解細菌による分解酵素は、ミナミアオサ由来のUlvanを二糖類にまで分解可能であることが開示されている。 Regarding the use of green algae, for example, research on the degradation of blue grass by marine bacteria is known (see Non-Patent Document 1). The cell wall of Aosa contains a polysaccharide called Ulvan, and its content is 8 to 29% by dry weight. According to Non-Patent Literature 1, Ulvan purified from Ulva ohnoi is used, and Ulvan-degrading bacteria (presumed to be Glacicolacola sp.) Derived from grapevine (Haloa japonica) attached to Minamiaosa are isolated. . It is disclosed that the degradation enzyme by this Ulvan-degrading bacterium can degrade Ulvan derived from Minamiosa to disaccharides.
本発明は、テングサ等の紅藻類や、アオサ等の緑藻類を含む海藻から還元糖を製造する海藻の糖化方法を提供し、さらに製造した糖からのアルコールの製造方法を提供し、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用方法を提供することを課題とする。 The present invention provides a method for saccharification of seaweed for producing reducing sugar from seaweed containing red algae such as Propaganda and green algae such as Aosa, and further provides a method for producing alcohol from the produced sugar, which can grow organically. It is an object to provide an effective utilization method of seaweed that is a resource.
本発明の海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により海藻から還元糖を製造する方法であり、増殖可能な有機資源である海藻を有効に利用することが可能である。フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）として、受託番号がNITE P-02291の菌株を利用する。また海藻は、緑藻類又はテングサであり、環境問題の解消に寄与する。 The method for saccharifying seaweed of the present invention is a method for producing reducing sugar from seaweed using Fusarium oxysporum, and it is possible to effectively use seaweed that is a proliferating organic resource. As Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum), accession number is order to make use of strains of NITE P-02291. The seaweed is a green algae or a common prickly grass that contributes to the resolution of environmental problems.
本発明の海藻の糖化方法は、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、その海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、抽出した酵素液により海藻から還元糖を製造する。かかる方法において、高い還元糖濃度が得られる点で、つぎの各態様が好ましい。すなわち、酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、酵素液と海藻とを滅菌する態様が好適である。また、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、ｐＨを、４以上、６以下に調製し、温度を、１５℃以上、５０℃以下に調製する態様が好ましい。 The seaweed saccharification method of the present invention comprises inoculating and cultivating Fusarium oxysporum on seaweed, extracting the Fusarium oxysporum enzyme solution from the seaweed, and reducing the seaweed with the extracted enzyme solution. We manufacture the sugar. In this method, the following embodiments are preferable in that a high reducing sugar concentration can be obtained. That is, an embodiment in which the enzyme solution and the seaweed are sterilized before the reducing sugar is produced from the seaweed with the enzyme solution is preferable. Moreover, the process which manufactures reducing sugar from a seaweed with an enzyme solution has a preferable aspect which adjusts pH to 4-6, and adjusts temperature to 15 to 50 degreeC.
さらに、還元糖収率を高める点で、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻と、酵素液により還元糖を製造する海藻とが、同一の属に分類される態様が好適である。また、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻を粉砕し、粉砕した海藻からフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出すると、高い還元糖濃度が得られる。一方、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、糖化前の海藻を粉砕し、粉砕した海藻に酵素液を加えた後、還元糖を製造すると、還元糖の収量を高めることができる。 Furthermore, from the viewpoint of increasing the yield of reducing sugar, an embodiment in which seaweed inoculated with Fusarium oxysporum and seaweed that produces reducing sugar with an enzyme solution are classified into the same genus is preferable. In addition, when Fusarium oxysporum is inoculated into seaweed and cultured, the seaweed in which the fungus is cultured is crushed, and the enzyme solution of Fusarium oxysporum is extracted from the crushed seaweed. can get. On the other hand, in the process of producing reducing sugar from seaweed with an enzyme solution, the yield of reducing sugar can be increased by producing reducing sugar after pulverizing seaweed before saccharification and adding the enzyme solution to the crushed seaweed .
本発明のアルコールの製造方法は、海藻の糖化方法により得られる糖を基質として、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株により、アルコールを製造するアルコールの製造方法であり、海藻を有効に利用することができる。 Method for producing an alcohol of the present invention, a sugar obtained by the saccharification method seaweed as a substrate, are included in the Enterobacter (Enterobacter) genus, accession number Ri by the strain NITE P-02,290, an alcohol to produce an alcohol This is a production method, and seaweed can be used effectively.
本発明によれば、海藻から還元糖を製造することができる。また、製造した糖からアルコールを製造することができる。したがって、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。 According to the present invention, reducing sugar can be produced from seaweed. Moreover, alcohol can be manufactured from the manufactured sugar. Therefore, effective utilization of seaweed, which is an organic resource that can be propagated, can be achieved.
（海藻を糖化する菌株のスクリーニング）
蒸留水を寒天で固化した培地に、大阪府大阪市内で採取した土壌の懸濁液を塗布し、寒天だけで生育する種類を分離し、寒天上で生育能力が高い菌株（菌株名F-engei）を選抜した。菌株（F-engei）は、固化した寒天を溶解し、アオサやヒトエグサ上で旺盛に生育した。寒天の原料であるテングサ（Gelidiaceae）は、紅藻綱テングサ目テングサ科に分類される紅藻類である。一方、アオサ（Ulva Linnaeus）は、アオサ藻綱アオサ目アオサ科アオサ属の緑藻類に分類され、また、ヒトエグサ（Monostroma nitidum）は、アオサ藻綱ヒビミドロ目ヒトエグサ科ヒトエグサ属の緑藻類に分類される。したがって、菌株（F-engei）は、紅藻類や緑藻類を含む海藻を分解する。
(Screening for strains that saccharify seaweed)
A suspension of soil collected in Osaka City, Osaka Prefecture, is applied to a medium obtained by solidifying distilled water with agar to isolate the types that grow on agar alone. engei) was selected. The strain (F-engei) dissolved solidified agar and grew vigorously on blue sea urchin and human rush. Tengesa (Gelidiaceae), which is a raw material for agar, is a red algae classified into the red algae Proboscisaceae. On the other hand, Aosa (Ulva Linnaeus) is classified as a green alga belonging to the genus Aosa, Aosaaceae, Aosaaceae, and Monoostroma nitidum is classified as a green algae belonging to the genus Aostida. Therefore, the strain (F-engei) degrades seaweed including red algae and green algae.
テングサの構成成分であるアガロースは、D-ガラクトースとL-ガラクトースとが結合した二糖を繰り返し単位とする多糖類である。また、アオサの細胞壁を構成するUlvanは、L-ラムノースと、D-グルクロン酸又はD-キシロース等とが結合した二糖を繰り返し単位とする多糖類である。このような構造の共通性により、菌株（F-engei）は、紅藻類や緑藻類を分解して、麦芽糖等の二糖類や単糖類からなる還元糖を生成するものと推認される。 Agarose, which is a constituent of Tengusa, is a polysaccharide having a repeating unit of a disaccharide in which D-galactose and L-galactose are bound. Ulvan, which constitutes the cell wall of Aosa, is a polysaccharide having repeating units of disaccharides in which L-rhamnose and D-glucuronic acid or D-xylose are bound. It is presumed that the strain (F-engei) decomposes red algae and green algae to produce a reducing sugar composed of disaccharides such as maltose and monosaccharides due to the commonality of such structures.
菌株（F-engei）は、18S rDNAと5.8S rDNA間のスペーサー領域における塩基配列を解析した結果、相同性９９％で、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）に分類される糸状菌であった。塩基配列の解析方法は、菌株（F-engei）からDNAを抽出し、得られた抽出液をテンプレートとしてPCR増幅を行う。PCR増幅では、ダイターミネーター法を使用し、ITSIF/ITSIRプライマーセットを添加して行う。増幅後、PCR液をアガロースゲルのウエルに添加し、電気泳動し、DNAの塩基配列情報を取得する。シークエンサーとしては、ABI社のPRISM310を使用することができる。また、取得した塩基配列は、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）のBLAST検索により照合することができる。 As a result of analyzing the nucleotide sequence in the spacer region between 18S rDNA and 5.8S rDNA, the strain (F-engei) was a filamentous fungus with 99% homology and classified as Fusarium oxysporum. In the base sequence analysis method, DNA is extracted from a strain (F-engei), and PCR amplification is performed using the obtained extract as a template. PCR amplification is performed using the dye terminator method and adding the ITSIF / ITSIR primer set. After amplification, the PCR solution is added to a well of an agarose gel and electrophoresed to obtain DNA base sequence information. ABI PRISM310 can be used as a sequencer. Moreover, the acquired base sequence can be collated by a BLAST search of DDBJ (DNA Data Bank of Japan).
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）（以下、「F-engei菌」ともいう。）は、菌糸が細く、分生子を形成し、貧栄養条件下で寒天を溶解する。好ましい培養条件としては、ツァペックドックス寒天培地であり、培地の組成を表１に示す。滅菌は１２０℃、１５分間とし、滅菌前の培地のpHは５．７が好適である。また、培養方法としては、好気性の静置培養で、３０℃、２週間が好ましい。 Fusarium oxysporum (strain name F-engei) (hereinafter also referred to as "F-engei bacterium") has a thin hypha, forms conidia, and dissolves agar under oligotrophic conditions. A preferable culture condition is a Czapedocox agar medium, and the composition of the medium is shown in Table 1. Sterilization is performed at 120 ° C. for 15 minutes, and the pH of the medium before sterilization is preferably 5.7. The culture method is aerobic stationary culture, preferably 30 ° C. for 2 weeks.
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）は、受託番号NITE P-02291として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）に寄託している。 Fusarium oxysporum (strain name F-engei) has been deposited with the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number NITE P-02291.
フザリウム属に分類される種は、百数十種程度知られているが、将来的には、５００種程度の種になると言われている。また、フザリウム属の菌は、植物に対して病原性を示すものが多く、たとえば、ジャガイモの乾腐病、エンドウの根腐病、穀類の赤かび病がある。フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）についても同様に農業上の病害が大きく、タマネギの乾腐病やウリの萎凋病等が知られている。このように、フザリウム属の菌は、そのほとんどが陸性植物に対する病害性がある。これに対して、本発明のフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）は、海洋性植物である海藻から還元糖を製造するため、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。 About hundreds of species classified into the genus Fusarium are known, but in the future, it is said that there will be about 500 species. In addition, many fungi of the genus Fusarium are pathogenic to plants, such as dry rot of potato, root rot of peas, and red mold of cereals. Similarly, Fusarium oxysporum has a large agricultural disease, and onion dry rot and cucumber wilt are known. As described above, most of the fungi belonging to the genus Fusarium are pathogenic to land plants. On the other hand, since Fusarium oxysporum of the present invention produces reducing sugar from seaweed, which is a marine plant, it is possible to effectively use seaweed, which is a proliferating organic resource.
（フザリウム・オキシスポルムの酵素液の作製）
アオサ（兵庫県西宮市内の海岸で採取）（以下、「アオサ」ともいう。）と、三重県産のヒトエグサ（市販品）（以下、「ヒトエグサ」ともいう。）について、各々乾燥重量１ｇ相当を分取し、蒸留水に入れ、１２１℃で１５分間、オートクレーブで殺菌した。その後、これらを培地として、F-engei菌を接種し、２５℃で１ヶ月間培養した。培養の結果、アオサ培地においても、またヒトエグサ培地においても、糸状菌が繁茂していた。培養後、蒸留水１００ｍＬを入れたビーカーに移し、ガラス棒で５分間撹拌した後、濾過し、濾液を酵素液として利用した。アオサ培地から得られた酵素液を、「アオサ抽出カビ酵素液」という。また、ヒトエグサ培地から得られた酵素液を、「ヒトエグサ抽出カビ酵素液」という。酵素液は、作製後、−２０℃で凍結保存した。
(Preparation of enzyme solution of Fusarium oxysporum)
Aosa (collected on the coast of Nishinomiya City, Hyogo Prefecture) (hereinafter also referred to as “Aosa”) and Megumi's human egusa (commercially available) (hereinafter also referred to as “human egusa”) each have a dry weight equivalent to 1 g. Was put in distilled water and sterilized by autoclave at 121 ° C. for 15 minutes. Thereafter, F-engei bacteria were inoculated as a medium and cultured at 25 ° C. for 1 month. As a result of the cultivation, filamentous fungi were proliferating both in the Aosa medium and in the human egg medium. After culturing, it was transferred to a beaker containing 100 mL of distilled water, stirred for 5 minutes with a glass rod, filtered, and the filtrate was used as an enzyme solution. The enzyme solution obtained from the Aosa medium is referred to as “Aosa extract mold enzyme solution”. In addition, the enzyme solution obtained from the human rush medium is referred to as “human rush extract fungus enzyme solution”. The enzyme solution was stored frozen at −20 ° C. after preparation.
（実施例１）
ヒトエグサ１ｇに、蒸留水３０ｍＬと、ヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、反応液した。この反応液を、４０℃１５０ｒｐｍで、０〜５時間振とうしながら、１時間毎にサンプリングし、サンプルは５℃で保管した。還元糖の定量は、ソモギーネルソン法により行い、紫外可視分光光度計で吸光度を計測し、ブドウ糖液により検量線を作成し、各サンプルの還元糖濃度を測定した。以下の実施例においても、同様の方法により還元糖濃度を測定した。なお、比較例１として、ヒトエグサを入れずに、蒸留水３０ｍＬと、ヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加えただけのサンプルについても、同様に還元糖濃度を測定した。
Example 1
To 1 g of human rusha, 30 mL of distilled water and 10 mL of human rush extract fungus enzyme solution were added and reacted. The reaction solution was sampled every hour while shaking at 40 ° C. and 150 rpm for 0 to 5 hours, and the sample was stored at 5 ° C. The quantification of reducing sugar was performed by the Somogie Nelson method, the absorbance was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer, a calibration curve was created with a glucose solution, and the reducing sugar concentration of each sample was measured. Also in the following examples, the reducing sugar concentration was measured by the same method. In addition, as Comparative Example 1, a reducing sugar concentration was measured in the same manner for a sample in which 30 mL of distilled water and 10 mL of a human rush extract fungus enzyme solution were added without adding human rush.
図１は、本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜５時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。図１に示すように、処理時間が５時間までのときは、処理時間が増加するに従い、生成する還元糖が増加した。なお、比較例１（図示していない。）では、還元糖は生成しなかった。 FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the saccharification time (0 to 5 hours) of human rusha and the concentration of reducing sugar produced in the present invention. As shown in FIG. 1, when the treatment time was up to 5 hours, the reducing sugar produced increased as the treatment time increased. In Comparative Example 1 (not shown), no reducing sugar was produced.
したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）により、海藻から還元糖を製造でき、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）として、菌株（F-engei）（受託番号NITE P-02291）を利用できる。また、たとえば、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）（菌株名F-engei）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻から、F-engei菌の酵素液を抽出し、酵素液により海藻から還元糖を製造することができる。一方、海藻として、緑藻類（例：ヒトエグサ）を使用して還元糖の製造が可能である。 Therefore, reducing sugar can be produced from seaweed by Fusarium oxysporum, and a strain (F-engei) (accession number NITE P-02291) can be used as Fusarium oxysporum. In addition, for example, Fusarium oxysporum (strain name F-engei) is inoculated into seaweed and cultured, and the enzyme solution of F-engei is extracted from the seaweed from which the fungus has been cultured. Reducing sugar can be produced. On the other hand, it is possible to produce reducing sugars using green algae (eg, human rush) as seaweeds.
（実施例２）
実施例１と同様に調製した反応液を使用し、４０℃１５０ｒｐｍで、０時間、１時間、２４時間、４８時間振とうしたときのサンプルを採取した。サンプルは５℃で保管し、実施例１と同様の方法で、各サンプルの還元糖濃度を測定した。
(Example 2)
A reaction solution prepared in the same manner as in Example 1 was used, and samples were shaken at 40 ° C. and 150 rpm for 0 hour, 1 hour, 24 hours, and 48 hours. Samples were stored at 5 ° C., and the reducing sugar concentration of each sample was measured in the same manner as in Example 1.
図２は、本発明におけるヒトエグサの糖化時間（０〜４８時間）と生成する還元糖濃度との関係を示す図である。図２に示すように、糖化処理により還元糖は生成したが、処理を開始してから２４時間を経過すると、還元糖の濃度が大きく低下した。 FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the saccharification time (0 to 48 hours) of human rush and the concentration of reducing sugar produced in the present invention. As shown in FIG. 2, reducing sugar was produced by the saccharification treatment, but the concentration of the reducing sugar was greatly reduced after 24 hours from the start of the treatment.
（実施例３）
ヒトエグサ抽出カビ酵素液を＃２２μｍ径のミリポアフィルターにより濾過滅菌した。また、ヒトエグサ１ｇと蒸留水３０ｍＬをフラスコに入れ、オートクレーブで滅菌した。つぎに、滅菌したヒトエグサの入ったフラスコに、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、反応液とした。反応液は、５℃、１５℃と３０℃で、２週間静置し、還元糖濃度を測定した。また、比較のために、滅菌したヒトエグサに、ヒトエグサ抽出カビ酵素液を加えず、そのまま２５℃で２週間静置し、同様に還元糖濃度を測定した（control）。
(Example 3)
The human eggplant extract mold enzyme solution was sterilized by filtration through a Millipore filter having a diameter of # 22 μm. Further, 1 g of human rush and 30 mL of distilled water were placed in a flask and sterilized by an autoclave. Next, 10 mL of a filtered filter-sterilized human rush extract fungus enzyme solution was added to a flask containing sterilized human rush to prepare a reaction solution. The reaction solution was allowed to stand at 5 ° C., 15 ° C. and 30 ° C. for 2 weeks, and the reducing sugar concentration was measured. For comparison, the sterilized human rush was not added with the human rush extract fungus enzyme solution, but was allowed to stand at 25 ° C. for 2 weeks, and the reducing sugar concentration was similarly measured (control).
図３は、本発明において、酵素液と海藻を滅菌した後、酵素液により海藻から還元糖を製造するときの温度（５℃〜３０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。図３に示すように、無菌環境下における２週間の糖化により、３０℃条件下で還元糖濃度１．９０ｇ/Ｌが得られた。還元糖濃度１．９０ｇ/Ｌは、実施例１における最大値（５ｈ：０．３０ｇ/Ｌ）の約６倍の濃度であり、実施例２における最大値（１ｈ：０．２３ｇ/Ｌ）の約８倍に相当する濃度である。また、５℃〜３０℃の範囲では、温度が高くなるにつれて還元糖濃度が上昇した。 FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the temperature (5 ° C. to 30 ° C.) and the reducing sugar concentration when reducing sugar is produced from seaweed using the enzyme solution after the enzyme solution and seaweed are sterilized in the present invention. As shown in FIG. 3, a reducing sugar concentration of 1.90 g / L was obtained under 30 ° C. conditions by saccharification for 2 weeks in a sterile environment. The reducing sugar concentration of 1.90 g / L is about 6 times the maximum value in Example 1 (5h: 0.30 g / L), and the maximum value in Example 2 (1h: 0.23 g / L). The concentration corresponds to about 8 times. Moreover, in the range of 5 ° C. to 30 ° C., the reducing sugar concentration increased as the temperature increased.
実施例２（図２）においては、糖化時間の経過により還元糖濃度が低下する現象を確認したが、実施例３（図３）において、海藻と酵素液を滅菌することにより、還元糖の減少を回避し、高濃度の還元糖を得ることができた。これは、還元糖を消費する微生物を滅菌により除去した結果であると推認される。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する前に、酵素液と海藻とを滅菌する態様は、還元糖の収量を高める点で、好ましい。 In Example 2 (FIG. 2), it was confirmed that the reducing sugar concentration decreased with the passage of saccharification time. In Example 3 (FIG. 3), the reduction of reducing sugar was achieved by sterilizing seaweed and enzyme solution. And a high concentration of reducing sugar could be obtained. This is presumed to be the result of sterilizing removal of microorganisms that consume reducing sugars. Therefore, an embodiment in which the enzyme solution and the seaweed are sterilized before producing the reducing sugar from the seaweed with the enzyme solution is preferable in terms of increasing the yield of the reducing sugar.
（実施例４）
実施例３と同様に、ヒトエグサについて調製した反応液を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃と７０℃の環境下で、５時間静置し、還元糖濃度を測定した。
Example 4
In the same manner as in Example 3, the reaction solution prepared for human rush was allowed to stand for 5 hours in an environment of 30 ° C., 40 ° C., 50 ° C., 60 ° C. and 70 ° C., and the reducing sugar concentration was measured.
図４は、本発明における処理温度（３０℃〜７０℃）と還元糖濃度との関係を示す図である。図４に示すように、３０℃〜７０℃の条件では、５０℃、４０℃、３０℃と処理温度が下降するにつれて、還元糖濃度が上昇した。一方、図３に示すように、５℃〜３０℃の条件では、５℃、１５℃、３０℃と処理温度が上昇するにつれて、還元糖濃度が上昇した。したがって、図３と図４の結果を合わせて考察すると、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、高い還元糖濃度が得られる点で、処理温度の下限値は、１５℃以上が好ましく、３０℃以上がより好ましい。また、同様の観点から、処理温度の上限値は、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。 FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the treatment temperature (30 ° C. to 70 ° C.) and the reducing sugar concentration in the present invention. As shown in FIG. 4, under the conditions of 30 ° C. to 70 ° C., the reducing sugar concentration increased as the treatment temperature decreased to 50 ° C., 40 ° C., and 30 ° C. On the other hand, as shown in FIG. 3, under the conditions of 5 ° C. to 30 ° C., the reducing sugar concentration increased as the treatment temperature increased to 5 ° C., 15 ° C., and 30 ° C. Therefore, considering the results of FIG. 3 and FIG. 4 together, the lower limit of the treatment temperature is preferably 15 ° C. or higher in the step of producing reducing sugar from seaweed with an enzyme solution, because a high reducing sugar concentration can be obtained. 30 ° C. or higher is more preferable. From the same viewpoint, the upper limit of the treatment temperature is preferably 50 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or lower.
（実施例５）
ヒトエグサ１ｇと蒸留水３０ｍＬとを混合し、オートクレーブで滅菌した後、ｐＨを測定すると、ｐＨ４．５であった。そこで、ｐＨ４．５を基準として、１ＮのＨＣｌと、１ＮのＮａＯＨにより、−２（ｐＨ２．５）、−１（ｐＨ３．５）、±０（ｐＨ４.５）、＋１（ｐＨ５.５）、＋２（ｐＨ６．５）に調製した。その後、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液１０ｍＬを加え、３０℃１５０ｒｐｍで３日間処理した。
(Example 5)
When 1 g of human rusha and 30 mL of distilled water were mixed and sterilized by autoclaving, the pH was measured to be 4.5. Therefore, with pH 4.5 as a reference, -N2 (pH2.5), -1 (pH3.5), ± 0 (pH4.5), +1 (pH5.5) with 1N HCl and 1N NaOH, It was adjusted to +2 (pH 6.5). Thereafter, 10 mL of a filter solution-sterilized human rush extract mold enzyme solution was added, and the mixture was treated at 30 ° C. and 150 rpm for 3 days.
図５は、本発明における糖化時のｐＨと還元糖濃度との関係を示す図である。図５に示すように、ｐＨ２.５とｐＨ３．５とでは、同程度の還元糖濃度であったが、ｐＨ３．５からｐＨ４．５に変化すると、還元糖濃度は急に上昇し、ほぼ飽和に達した。一方、ｐＨ５．５からｐＨ６．５に変化すると、ｐＨ５．５で飽和に達していた還元糖濃度は、ほぼ０にまで下降した。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程は、高い還元糖濃度が得られる点で、ｐＨの下限値は、４以上が好ましく、４．５以上がより好ましい。また、同様の観点から、ｐＨの上限値は、６．０以下が好ましく、５．７以下がより好ましく、５．５以下が特に好ましい。 FIG. 5 is a graph showing the relationship between pH during saccharification and reducing sugar concentration in the present invention. As shown in FIG. 5, the reducing sugar concentrations at pH 2.5 and pH 3.5 were similar, but when the pH was changed from pH 3.5 to pH 4.5, the reducing sugar concentration suddenly increased and was almost saturated. Reached. On the other hand, when the pH changed from pH 5.5 to pH 6.5, the reducing sugar concentration that had reached saturation at pH 5.5 decreased to almost zero. Therefore, in the step of producing reducing sugar from seaweed with an enzyme solution, the lower limit of pH is preferably 4 or more, and more preferably 4.5 or more, in that a high reducing sugar concentration can be obtained. From the same viewpoint, the upper limit of pH is preferably 6.0 or less, more preferably 5.7 or less, and particularly preferably 5.5 or less.
（実施例６）
アオサ１ｇを蒸留水３０ｍＬに加え、１ＮのＨＣｌによりｐＨ５．０に調製し、オートクレーブで滅菌した。つぎに、濾過滅菌したアオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルと、濾過滅菌したヒトエグサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルと、酵素液を加えないサンプルとを作製した。その後、３０℃１５０ｒｐｍで３日間振とうした。実験は、３回反復して実施し、計測値の標準誤差を算出した。
(Example 6)
1 g of Aosa was added to 30 mL of distilled water, adjusted to pH 5.0 with 1N HCl, and sterilized with an autoclave. Next, a sample added with 5 mL of filter-sterilized mushroom extract mold enzyme solution, a sample added with filter-sterilized human rush extract mold enzyme solution 5 mL, and a sample added with no enzyme solution were prepared. Thereafter, the mixture was shaken at 30 ° C. and 150 rpm for 3 days. The experiment was repeated three times, and the standard error of the measured values was calculated.
図６は、本発明における酵素液生成時の海藻の種類と還元糖濃度との関係を示す図である。アオサにアオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「アオサ＋アオサ酵素液」と表示する。また、アオサにヒトエグサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「アオサ＋ヒトエグサ酵素液」と表示する。一方、アオサに酵素液を加えなかったサンプルは、「アオサ（酵素液なし）」と表示する。図６に示すように、アオサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液でアオサを糖化する場合の方が、ヒトエグサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液でアオサを糖化する場合に比べて、明らかに高濃度の還元糖が得られた。したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を接種する海藻は、その酵素液により還元糖を製造する海藻と同一の属に分類される態様が、高い還元糖濃度を得る点で、好ましい。 FIG. 6 is a diagram showing the relationship between the type of seaweed and the reducing sugar concentration when the enzyme solution is generated in the present invention. A sample obtained by adding Aosa extract mold enzyme solution to Aosa is indicated as “Aosa + Aosa enzyme solution”. In addition, a sample obtained by adding a human rush extract fungus enzyme solution to Aosa is denoted as “Aosa + human rush enzyme solution”. On the other hand, a sample in which no enzyme solution is added to Aosa is displayed as “Aosa (no enzyme solution)”. As shown in FIG. 6, in the case of inoculating F-engei bacteria on Aosa and saccharifying Aosa with the produced enzyme solution, inoculating F-engei bacteria on human eggplant and saccharifying Aosa with the produced enzyme solution. Compared to the case, a clearly high concentration of reducing sugar was obtained. Therefore, an embodiment in which seaweed inoculated with Fusarium oxysporum is classified into the same genus as seaweed that produces reducing sugar by the enzyme solution is preferable in terms of obtaining a high reducing sugar concentration.
ヒトエグサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液は、アオサにF-engei菌を接種し、生成した酵素液と比較して、アオサを糖化する効率が低い。この結果は、ヒトエグサとアオサとでは、構成する多糖類が相違し、F-engei菌は、海藻の種類に応じて、それぞれの海藻の分解に適した酵素を生成していることによるものと推認される。したがって、同一の酵素により、ヒトエグサとアオサを分解しているのではなく、基質特異性の異なる別の酵素により糖化が進行しているものと推認される。なお、アオサに酵素液を加えなかったサンプルでは、還元糖は確認できなかった。 The enzyme solution produced by inoculating human exothera with F-engei bacteria has a lower efficiency in saccharifying Aosa compared to the enzyme solution produced by inoculating Aosa with F-engei bacteria. This result is presumed to be due to the difference in the constituent polysaccharides between human rush and Aosa, and that F-engei bacteria produce enzymes suitable for the degradation of each seaweed according to the type of seaweed. Is done. Therefore, it is presumed that saccharification is progressing by another enzyme having different substrate specificity, instead of decomposing human rush and Aosa by the same enzyme. In addition, reducing sugar was not confirmed in the sample in which the enzyme solution was not added to Aosa.
（実施例７）
アオサ培地に、F-engei菌を接種し、２５℃で１ヶ月間培養し、糸状菌が繁茂したアオサを粉砕した後、濾過して、酵素液を調製した。この酵素液を、「粉砕アオサ抽出カビ酵素液」という。一方、糖化前のアオサをホモジナイザーで粉砕した。この糖化前の基質を、「粉砕アオサ」という。つぎに、粉砕アオサ１ｇを蒸留水３０ｍＬに加え、１ＮのＨＣｌによりｐＨ５．０に調製し、オートクレーブで滅菌した。その後、粉砕アオサに、濾過滅菌した粉砕アオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルを作製した。また、粉砕アオサに、濾過滅菌したアオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加えたサンプルを作製した。その後、３０℃１５０ｒｐｍで３日間振とうした。実験は、３回反復して実施し、計測値の標準誤差を算出した。
(Example 7)
The Aosa medium was inoculated with F-engei bacteria and cultured at 25 ° C. for 1 month, and after crushing Aosa where filamentous fungi had flourished, it was filtered to prepare an enzyme solution. This enzyme solution is referred to as “ground pulverized extract extract fungus enzyme solution”. On the other hand, Aosa before saccharification was pulverized with a homogenizer. This substrate before saccharification is referred to as “milled Aosa”. Next, 1 g of pulverized Aosa was added to 30 mL of distilled water, adjusted to pH 5.0 with 1N HCl, and sterilized with an autoclave. Thereafter, a sample was prepared by adding 5 mL of pulverized Aosa extract fungus enzyme solution sterilized by filtration to pulverized Aosa. In addition, a sample was prepared by adding 5 mL of a filtered extract-sterilized mushroom extract mold enzyme solution. Thereafter, the mixture was shaken at 30 ° C. and 150 rpm for 3 days. The experiment was repeated three times, and the standard error of the measured values was calculated.
なお、アオサを全量糖化したときに生成する糖量を調べるために、乾燥アオサ１ｇに、３％硫酸１５ｍＬを加え、１２１℃１時間オートクレーブで加熱した後、蒸留水３０ｍＬを加え、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ５．０に調製した。 In addition, in order to examine the amount of sugar produced when saccharifying the whole amount of Aosa, add 15 mL of 3% sulfuric acid to 1 g of dry Aosa, heat at 121 ° C. for 1 hour in an autoclave, add 30 mL of distilled water, and add 10N NaOH. The pH was adjusted to 5.0.
図７は、本発明における酵素抽出時の粉砕処理及び基質である海藻の粉砕処理が還元糖濃度に及ぼす影響を表した図である。アオサ＋アオサ酵素液の還元糖濃度は、実施例６におけるデータを利用した。また、粉砕アオサに、粉砕アオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「粉砕アオサ＋粉砕アオサ酵素液」と表示する。一方、粉砕アオサに、アオサ抽出カビ酵素液を加えたサンプルは、「粉砕アオサ＋アオサ酵素液」と表示する。 FIG. 7 is a diagram showing the influence of the pulverization process during enzyme extraction and the pulverization process of seaweed as a substrate on the reducing sugar concentration in the present invention. The data in Example 6 was used for the reducing sugar concentration of Aosa + Aosa enzyme solution. A sample obtained by adding a pulverized Aosa extract mold enzyme solution to the pulverized Aosa is indicated as “Crushed Aosa + Crushed Aosa enzyme solution”. On the other hand, a sample obtained by adding Aosa extract mold enzyme solution to pulverized Aosa is indicated as “Crushed Aosa + Aosa enzyme solution”.
図７に示すように、粉砕アオサ酵素液を使用すると、アオサ酵素液を使用した場合に比べて、還元糖濃度が高められた。したがって、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、菌を培養した海藻を粉砕し、粉砕した海藻から、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出する態様が、還元糖濃度を高める点で好ましい。また、図７に示すように、糖化処理をする基質として、粉砕アオサを使用すると、未粉砕のアオサを使用した場合に比べて、還元糖濃度が高められた。したがって、酵素液により海藻から還元糖を製造する工程において、粉砕した海藻を基質として使用する態様が、還元糖濃度を高める点で好ましい。本明細書において、粉砕とは、固体材料に外力を加えて、元の大きさよりも小さくすることをいい、粗砕、中砕、微粉砕等が含まれる。 As shown in FIG. 7, when the ground Aosa enzyme solution was used, the reducing sugar concentration was increased as compared to the case where the Aosa enzyme solution was used. Therefore, the mode of inoculating seaweed with Fusarium oxysporum, cultivating the seaweed in which the fungus was cultured, pulverizing the seaweed, and extracting the enzyme solution of Fusarium oxysporum from the ground seaweed is a reducing sugar. This is preferable in terms of increasing the concentration. Moreover, as shown in FIG. 7, when pulverized Aosa was used as a substrate for saccharification treatment, the reducing sugar concentration was increased as compared with the case where unmilled Aosa was used. Therefore, the aspect of using ground seaweed as a substrate in the step of producing reducing sugar from seaweed with an enzyme solution is preferable in terms of increasing the reducing sugar concentration. In this specification, pulverization refers to applying an external force to a solid material to make it smaller than the original size, and includes crushing, intermediate crushing, fine crushing, and the like.
図８は、本発明の糖化方法により得られる還元糖濃度と、硫酸により得られる還元糖濃度とを比較した図である。アオサを硫酸で処理したサンプルは、「アオサ＋硫酸」と表示する。図８に示すように、３％硫酸を加え、１２１℃で１時間の処理により得られる還元糖濃度は、粉砕アオサと粉砕アオサ抽出カビ酵素液を３日間、糖化処理して得られる還元糖濃度の約３倍であった。しかし、硫酸による糖化の場合、糖化液（反応液）を中和するために、大量のアルカリが必要であり、中和後、糖化液には大量の塩が含有するから、この糖化液を利用するには、イオン交換処理等が必須となる。したがって、本発明の糖化方法は、糖化液から大量の塩を除去する必要がなく、また加熱処理等に伴う諸経費が不要である点で、有利である。 FIG. 8 is a diagram comparing the reducing sugar concentration obtained by the saccharification method of the present invention and the reducing sugar concentration obtained by sulfuric acid. A sample of Aosa treated with sulfuric acid is labeled “Aosa + sulfuric acid”. As shown in FIG. 8, the reducing sugar concentration obtained by adding 3% sulfuric acid and treating at 121 ° C. for 1 hour is the reducing sugar concentration obtained by saccharifying the ground Aosa and the ground Aosa extract mold enzyme solution for 3 days. It was about 3 times. However, in the case of saccharification with sulfuric acid, a large amount of alkali is required to neutralize the saccharified solution (reaction solution). After neutralization, the saccharified solution contains a large amount of salt. In order to achieve this, an ion exchange process or the like is essential. Therefore, the saccharification method of the present invention is advantageous in that it is not necessary to remove a large amount of salt from the saccharified solution and the overhead associated with the heat treatment is unnecessary.
アオサの糖化により得られる還元糖の種類を確認するために、アオサを硫酸で処理した糖化液について、高速液体クロマトグラフィー（HPLC : high performance liquid chromatography）で解析した。HPLCは、島津製作所製の示差屈折計RID-10A、カラムオーブンCTO-20AC、コントロールユニットDGU-20A5Rを備えるものを使用した。カラムはShim-Pack SPR-Ca、移動相には水を使用した。カラム温度８０℃、ポンプ流量０．６ｍＬ／分、LC終了時間２０分、注入量１５μＬで分析した。その結果、麦芽糖とブドウ糖が検出され、麦芽糖が主体であった。このため、アオサ糖化液からアルコールを製造する微生物のスクリーニングでは、麦芽糖液による集積培養を行った。 In order to confirm the type of reducing sugar obtained by saccharification of Aosa, the saccharified solution obtained by treating Aosa with sulfuric acid was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). A HPLC equipped with a differential refractometer RID-10A manufactured by Shimadzu Corporation, a column oven CTO-20AC, and a control unit DGU-20A5R was used. The column used was Shim-Pack SPR-Ca and the mobile phase was water. The analysis was performed at a column temperature of 80 ° C., a pump flow rate of 0.6 mL / min, an LC end time of 20 minutes, and an injection volume of 15 μL. As a result, maltose and glucose were detected, and maltose was mainly used. For this reason, in the screening of microorganisms that produce alcohol from Aosa saccharified solution, accumulation culture with maltose solution was performed.
（実施例８）
粉砕アオサ６ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルと、粉砕アオサ１２ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルとを、オートクレーブで滅菌した。その後、濾過滅菌した粉砕アオサ抽出カビ酵素液５ｍＬを加え、３０℃で８日間、往復振とう培養し、反応液を濾過した。粉砕アオサ６ｇのサンプルは、十分に振とうされ、１００ｍＬの濾液が得られた。一方、粉砕アオサ１２ｇのサンプルは、膨潤したアオサにより十分に振とうされず、９０ｍＬの濾液が得られた。つぎに、濾液の還元糖濃度を測定した。また、屈折糖度計により糖度（Brix%）を測定した。なお、controlとして、粉砕アオサを蒸留水に加えた状態での還元糖濃度と糖度（Brix%）を測定した。
(Example 8)
A sample obtained by adding 6 g of pulverized Aosa to 300 mL of distilled water and a sample obtained by adding 12 g of pulverized Aosa to 300 mL of distilled water were sterilized by an autoclave. Thereafter, 5 mL of a pulverized Aasa extract fungus enzyme solution sterilized by filtration was added, and the mixture was shaken and reciprocated at 30 ° C. for 8 days, and the reaction solution was filtered. A sample of 6 g of ground Aosa was shaken well and 100 mL of filtrate was obtained. On the other hand, the sample of 12 g of ground Aosa was not shaken sufficiently by the swollen Aosa, and 90 mL of filtrate was obtained. Next, the reducing sugar concentration of the filtrate was measured. In addition, the sugar content (Brix%) was measured with a refractometer. As a control, the reducing sugar concentration and sugar content (Brix%) in a state where pulverized seaweed was added to distilled water were measured.
図９は、本発明の海藻の糖化方法により得られる還元糖濃度を示す図である。粉砕アオサ６ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルは、「６ｇ／３００ｍＬ（８日目）」と表示する。また、粉砕アオサ１２ｇを蒸留水３００ｍＬに加えたサンプルは、「１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）」と表示する。図９に示すように、controlでは、還元糖は検出されなかったが、６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、還元糖濃度は、６．４７±０．３４ｇ／Ｌであった。また、１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、基質であるアオサが多いにもかかわらず、振とうが不十分であったため、還元糖濃度は、０．９３±０．１３ｇ／Ｌであった。 FIG. 9 is a diagram showing the reducing sugar concentration obtained by the seaweed saccharification method of the present invention. A sample obtained by adding 6 g of pulverized seaweed to 300 mL of distilled water is indicated as “6 g / 300 mL (8th day)”. In addition, a sample obtained by adding 12 g of pulverized Aosa to 300 mL of distilled water is indicated as “12 g / 300 mL (8th day)”. As shown in FIG. 9, no reducing sugar was detected in the control, but in the 6 g / 300 mL (day 8) sample, the reducing sugar concentration was 6.47 ± 0.34 g / L. In addition, in the sample of 12 g / 300 mL (day 8), although the shaking was insufficient despite the large amount of substrate as the substrate, the reducing sugar concentration was 0.93 ± 0.13 g / L. It was.
一方、屈折糖度計による糖度（Brix%）は、controlでは０％であり、６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは１％であり、１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、基質（アオサ）の量に比例して、２％であった。還元糖濃度と糖度（Brix%）の結果により、基質（アオサ）と酵素液との接触が不十分な場合でも、基質に含まれる多糖類の分解は進行し、還元糖に至る前までの分解は進行していることが推認された。 On the other hand, the sugar content (Brix%) by the refractometer is 0% in the control, 1% in the 6 g / 300 mL (8th day) sample, and in the 12 g / 300 mL (8th day) sample, the substrate ( It was 2% in proportion to the amount of Aosa). Depending on the results of reducing sugar concentration and sugar content (Brix%), even if the contact between the substrate (Aosa) and the enzyme solution is insufficient, the degradation of the polysaccharide contained in the substrate proceeds, and the degradation before reaching the reducing sugar Was inferred to be progressing.
糖化時の振とうが十分に行われた６ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、濾液１００ｍＬ（還元糖濃度６．４７ｇ／Ｌ）が得られたことから、還元糖量は、ブドウ糖に換算して、
１００ｍＬ×（６．４７ｇ／１０００ｍＬ）≒０．６５ｇ
であり、基質（アオサ）は６ｇであるから、アオサのF-engei菌による還元糖変換効率は、
０．６５ｇ÷６ｇ×１００≒１１％
である。
In the sample of 6 g / 300 mL (8th day) with sufficient shaking during saccharification, 100 mL of filtrate (reducing sugar concentration 6.47 g / L) was obtained, so the amount of reducing sugar was converted to glucose. do it,
100 mL × (6.47 g / 1000 mL) ≈0.65 g
Since the substrate (Aosa) is 6g, the reducing sugar conversion efficiency of Aosa by F-engei bacteria is
0.65g ÷ 6g × 100 ≒ 11%
It is.
一方、糖度（Brix%）１％の濾液（１００ｍＬ）が得られたから、非還元糖を含む可溶性糖総量は、
１００ｍＬ×０．０１＝１ｇ
であり、基質は６ｇであるから、アオサのF-engei菌による可溶性糖変換効率は、
１ｇ÷６ｇ×１００≒１７％
である。
On the other hand, since a filtrate (100 mL) having a sugar content (Brix%) of 1% was obtained, the total amount of soluble sugars including non-reducing sugars was
100mL × 0.01 = 1g
Since the substrate is 6 g, the soluble sugar conversion efficiency by Aosa F-engei bacteria is
1g ÷ 6g × 100 ≒ 17%
It is.
同様に、糖化時の振とうが不十分であった１２ｇ／３００ｍＬ（８日目）のサンプルでは、糖度（Brix%）２％の濾液（９０ｍＬ）が得られたから、非還元糖を含む可溶性糖総量は、
９０ｍＬ×０．０２＝１．８ｇ
であり、基質は１２ｇであるから、アオサのF-engei菌による可溶性糖変換効率は、
１．８ｇ÷１２ｇ×１００＝１５％
である。
Similarly, a 12 g / 300 mL (day 8) sample with insufficient shaking during saccharification gave a filtrate (90 mL) with a sugar content (Brix%) of 2%, so soluble sugar containing non-reducing sugar The total amount is
90mL × 0.02 = 1.8g
Since the substrate is 12 g, the soluble sugar conversion efficiency by Aosa F-engei bacteria is
1.8g ÷ 12g × 100 = 15%
It is.
（海藻の糖化液からアルコールを製造する菌株のスクリーニング）
兵庫県高砂市の海岸で採取した変色したアオサを分離源とし、酢酸を１００ｍＬ当たり１滴加えた１０％麦芽糖液を用いた培地で集積培養し、気泡の発生した培地から培養液を採取し、ＹＭ平板培地に塗抹した。塗抹して形成された微生物群は、６種類（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）であった。
(Screening of strains producing alcohol from saccharified seaweed)
Collected and cultured in a medium using 10% maltose solution with 1% per 100 mL of acetic acid as a separation source collected from the discolored seaweed collected at the coast of Takasago City, Hyogo Prefecture, and collected the culture from the medium in which bubbles were generated. A YM plate medium was smeared. There were 6 types of microorganism groups (A, B, C, D, E, F) formed by smearing.
つぎに、硫酸によりアオサを糖化して得られた糖液、ショ糖液、ブドウ糖液、麦芽糖液に、ペプトンと酵母エキスを加え、BTB液を添加した培地を用意した。その後、これらの糖液に６種類の微生物群（Ａ〜Ｆ）を接種し、培養し、すべての糖液でガスが発生し、BTBが黄色に変色した微生物群Ｆを選抜した。後述する実施例９において、微生物群Ｆは糖液からアルコールを生成しており、BTBが黄色に変色したことから、発生しているガスは、アルコール発酵により生じるCO2である。つぎに、微生物群Ｆから、希釈と塗抹を繰り返し、アンピシリンを添加した培地により選択分離をした。微生物群Ｆには、酵母と細菌が含まれ、細菌より菌株（菌株名 E-engei）を選抜した。 Next, a medium in which peptone and yeast extract were added to the sugar solution, sucrose solution, glucose solution, and maltose solution obtained by saccharifying Aosa with sulfuric acid, and the BTB solution was added was prepared. Thereafter, six types of microorganism groups (A to F) were inoculated into these sugar solutions, cultured, and microorganism groups F in which gas was generated in all the sugar solutions and BTB was turned yellow were selected. In Example 9, which will be described later, the microorganism group F generates alcohol from the sugar solution, and since BTB has turned yellow, the generated gas is CO 2 generated by alcohol fermentation. Next, dilution and smearing were repeated from the microorganism group F, and selective separation was performed using a medium supplemented with ampicillin. The microorganism group F includes yeast and bacteria, and a strain (strain name E-engei) was selected from the bacteria.
菌株（E-engei）は、16S rDNA領域の塩基配列を解析した結果、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる細菌であった。塩基配列の解析方法は、まず、菌株（E-engei）からDNAを抽出し、得られた抽出液をPCRのテンプレートDNAとした。塩基配列は、ダイターミネーター法によるダイレクトシーケンス法で解析した。PCRには、DNA合成酵素として、ライフサイエンス社のAmpliTaq Goldを使用し、プライマーには800F/1500Rプライマーセットを使用した。PCR増幅後、アガロースゲル電気泳動でDNA配列を確認した。 As a result of analyzing the base sequence of the 16S rDNA region, the strain (E-engei) was a bacterium belonging to the genus Enterobacter. First, DNA was extracted from a strain (E-engei), and the resulting extract was used as PCR template DNA. The base sequence was analyzed by the direct sequence method using the dye terminator method. For PCR, AmpliTaq Gold from Life Science was used as a DNA synthase, and 800F / 1500R primer set was used as a primer. After PCR amplification, the DNA sequence was confirmed by agarose gel electrophoresis.
増幅は、フォワードプライマーが強く表れたため、これを用いて蛍光標識を行った。蛍光標識後の塩基配列の解析は、ABI社のPRISM310により行った。また、得られた塩基配列の相同性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のBLAST検索により評価した。 In amplification, the forward primer appeared strongly, and this was used for fluorescent labeling. Analysis of the base sequence after fluorescent labeling was performed with PRISM310 of ABI. In addition, the homology of the obtained base sequence was evaluated by BLAST search of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
PCR増幅により得られた16S rDNA領域のDNAは、ゲノムDNAによると思われるもの１本と、プラスミドによると思われるもの２本とがあり、いずれも同じ位置に見られた。このうち、703bpの塩基配列をもとに相同性を評価した結果を表２に示す。菌株（E-engei）は、混合微生物ではないため、表２に示すいずれかの種であり、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる細菌である。 The DNA of the 16S rDNA region obtained by PCR amplification had one that was thought to be due to genomic DNA and two that were likely to be due to plasmid, both of which were found at the same position. Table 2 shows the results of homology evaluation based on the 703 bp nucleotide sequence. Since the strain (E-engei) is not a mixed microorganism, it is one of the species shown in Table 2 and is a bacterium belonging to the genus Enterobacter.
エンテロバクター（Enterobacter）属（菌株名 E-engei）（以下、「E-engei菌」ともいう。）は、短桿菌であり、アルコールを生成する。好ましい培養条件としては、ブイヨン培地であり、培地の組成を表３に示す。滅菌は、１２０℃、１５分間とし、滅菌前の培地のｐＨは７が好適である。また、培養方法としては、好気性の振とう培養で、３０℃、１８時間が好ましい。 Enterobacter genus (strain name E-engei) (hereinafter also referred to as "E-engei bacterium") is a short gonococcus and produces alcohol. A preferable culture condition is a bouillon medium, and the composition of the medium is shown in Table 3. Sterilization is performed at 120 ° C. for 15 minutes, and the pH of the medium before sterilization is preferably 7. As a culture method, aerobic shaking culture is preferable at 30 ° C. for 18 hours.
エンテロバクター（Enterobacter）属（菌株名 E-engei）は、受託番号NITE P-02290として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）に寄託している。 The genus Enterobacter (strain name E-engei) is deposited with the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number NITE P-02290.
（実施例９）
ブドウ糖液（３％）、ショ糖液（２％）、ショ糖液（３％）、麦芽糖液（３％）、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（２Brix%）、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（３Brix%）を作製した。つぎに、これらの糖液に、酵母エキスを全量の０．４５％となるように配合し、ペプトンを全量の０．７５％となるように配合した。各糖液は、１０ｍＬずつ試験管に分注し、ダーラム管を入れた後、オートクレーブで滅菌した。
Example 9
Glucose solution (3%), sucrose solution (2%), sucrose solution (3%), maltose solution (3%), saccharification solution (2Brix%) saccharified with Aosa extract mold enzyme solution using Aosa as substrate As a substrate, a saccharified solution (3 Brix%) was prepared by saccharification with a millet extract fungus enzyme solution. Next, yeast extract was blended with these sugar solutions so that the total amount was 0.45%, and peptone was blended so that the total amount was 0.75%. Each sugar solution was dispensed 10 mL at a time into a test tube, and after a Durham tube was added, it was sterilized by an autoclave.
市販のドライイースト（Saccharomyces cerevisiae）から分離した酵母（以下、「市販酵母」という。）と、微生物群Ｆは、ＹＭ液体培地でコロニーを形成させた後、１白金耳分のコロニーを１０ｍＬの生理食塩水に懸濁し、その１ｍＬを各試験管に加え、３０℃で４日間静置した後、培養液中のアルコールを測定した。また、比較のため、エチルアルコール（０．０１％、０．１％、１％）を同様に測定した。アルコールの測定は、試料に、アルコール脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を添加する。アルコールは、アルデヒドとなり、NAD+はNADHとなる。つぎに、フェナジンメトサルフェートとニトラテトラゾリウムブルー（NTB）を添加すると、NTBは、NADHにより青紫色を呈するジホルマザンに還元されるため、生成するジホルマザンの５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、アルコール濃度を測定する。 Yeast isolated from commercially available dry yeast (Saccharomyces cerevisiae) (hereinafter referred to as “commercial yeast”) and microorganism group F were formed into colonies with a YM liquid medium, and then 1 mL of the colony of one platinum loop was physiologically treated. After suspending in saline, 1 mL of the suspension was added to each test tube and allowed to stand at 30 ° C. for 4 days, and then the alcohol in the culture was measured. For comparison, ethyl alcohol (0.01%, 0.1%, 1%) was measured in the same manner. For alcohol measurement, alcohol dehydrogenase and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) are added to the sample. Alcohol becomes an aldehyde and NAD + becomes NADH. Next, when phenazine methosulfate and nitratotetrazolium blue (NTB) are added, NTB is reduced to diformazan which exhibits a blue-purple color by NADH. Therefore, the alcohol concentration is measured by measuring the absorbance at 570 nm of the generated diformazan. To do.
３０℃で４日間培養した結果、市販酵母は、ブドウ糖液と麦芽糖液ではガスが発生したが、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液では、ガスが発生しなかった。一方、微生物群Ｆは、すべての糖液でガスが発生した。図１０は、本発明におけるアルコールの発生量を表す図である。図１０には、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化した糖化液（３Brix%）（「アオサ糖液３％」と表示する。）、ブドウ糖液（３％）と麦芽糖液（３％）の各糖液からのアルコールの発生量を吸光度で示す。また、比較のため、エチルアルコール（０．０１％、０．１％、１％）の測定結果を表示する。 As a result of culturing at 30 ° C. for 4 days, in the commercial yeast, gas was generated in the glucose solution and the maltose solution, but no gas was generated in the saccharified solution obtained by saccharification with Aosa extract fungus enzyme solution. On the other hand, in the microbial group F, gas was generated in all the sugar solutions. FIG. 10 is a diagram showing the amount of alcohol generated in the present invention. FIG. 10 shows a saccharified solution (3Brix%) (shown as “Aosa sugar solution 3%”), glucose solution (3%) and maltose solution (3%) saccharified with Aosa extract mold enzyme solution using Aosa as a substrate. The amount of alcohol generated from each sugar solution is shown as absorbance. For comparison, the measurement results of ethyl alcohol (0.01%, 0.1%, 1%) are displayed.
図１０に示すように、すべての糖液において、微生物群Ｆによるアルコールの発生量は、市販酵母によるアルコールの発生量を大きく上回り、市販酵母では資化できないアオサ糖液からもアルコールを製造した。また、微生物群Ｆは、アオサ糖液３％から、エチルアルコール１．０％〜０．１％の水準で、アルコールを生成した。 As shown in FIG. 10, in all sugar solutions, the amount of alcohol produced by the microorganism group F greatly exceeded the amount of alcohol produced by commercially available yeast, and alcohol was also produced from Aosa sugar solution that could not be assimilated by commercially available yeast. Microorganism group F produced alcohol at a level of 1.0% to 0.1% ethyl alcohol from 3% of Aosa sugar solution.
つぎに、微生物群Ｆには、酵母と細菌が含まれているため、いずれの作用により、アルコールが生成しているかを確認した。麦芽糖液（３％）に、全量の０．４５％となるように酵母エキスを加え、さらに全量の０．７５％となるようにペプトンを添加し、１０ｍＬずつ試験管に分注し、ダーラム管と５％BTB液０．１５ｍＬを入れ、オートクレーブで滅菌した。つぎに、微生物群Ｆから分離した酵母と細菌について、ＹＭ液体培地でコロニーを形成させ、１白金耳分のコロニーを１０ｍＬの生理食塩水に懸濁した後、１ｍＬを糖液の入った試験管に加え、３０℃で４日間静置した。 Next, since microorganism group F contains yeast and bacteria, it was confirmed which action produced alcohol. Add yeast extract to the maltose solution (3%) to 0.45% of the total amount, add peptone to 0.75% of the total amount, and dispense 10 mL each into a test tube. And 0.15 mL of 5% BTB solution were added and sterilized with an autoclave. Next, for the yeast and bacteria separated from the microorganism group F, colonies are formed in YM liquid medium, and 1 platinum loop colony is suspended in 10 mL of physiological saline, and then 1 mL of a test tube containing a sugar solution. And left at 4O 0 C for 4 days.
３０℃で４日間の培養の結果、酵母の糖液ではガスが発生せず、BTBは黄色に変色しなかったが、細菌の糖液では、ガスが発生し、BTBが黄色に変色したため、微生物群Ｆに含まれる細菌（E-engei菌）により、アルコールが生成したことが確認できた。すなわち、エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれる菌株E-engei（受託番号NITE P-02290）は、アオサを基質としてアオサ抽出カビ酵素液により糖化して得られる糖からアルコールを製造することができる。 As a result of culturing at 30 ° C for 4 days, no gas was generated in the yeast sugar solution and BTB did not turn yellow, but in the bacterial sugar solution, gas was generated and BTB turned yellow. It was confirmed that alcohol was produced by bacteria (E-engei bacteria) included in group F. That is, the strain E-engei (Accession No. NITE P-02290) included in the genus Enterobacter can produce alcohol from sugar obtained by saccharification with Aosa extract fungal enzyme solution using Aosa as a substrate.
海藻から還元糖を製造することができる。また、製造した糖からアルコールを製造することができる。したがって、増殖可能な有機資源である海藻の有効利用を図ることができる。 Reducing sugar can be produced from seaweed. Moreover, alcohol can be manufactured from the manufactured sugar. Therefore, effective utilization of seaweed, which is an organic resource that can be propagated, can be achieved.
Claims (8)
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）は、受託番号がNITE P-02291の菌株であり、
前記海藻は、緑藻類又はテングサであり、
前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）を海藻に接種して培養し、
該海藻から前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出し、
該酵素液により海藻から還元糖を製造する
海藻の糖化方法。 A method for saccharifying seaweed by producing reducing sugar from seaweed with Fusarium oxysporum ,
The Fusarium oxysporum is a strain with an accession number of NITE P-02291,
The seaweed is a green algae or agus.
Inoculating seaweed with the Fusarium oxysporum,
Extracting the enzyme solution of Fusarium oxysporum from the seaweed,
Production of reducing sugar from seaweed with the enzyme solution
A method for saccharification of seaweed .
菌を培養した海藻を粉砕し、
粉砕した海藻から、前記フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）の酵素液を抽出する
請求項１〜５のいずれかに記載の海藻の糖化方法。 Inoculating seaweed with the Fusarium oxysporum,
Crush the seaweed in which the fungus was cultured,
The method for saccharifying seaweed according to any one of claims 1 to 5 , wherein the enzyme solution of Fusarium oxysporum is extracted from the ground seaweed.
糖化前の海藻を粉砕し、
粉砕した海藻に前記酵素液を加えた後、
還元糖を製造する
請求項１〜６のいずれかに記載の海藻の糖化方法。 In the process of producing reducing sugars from seaweed by the enzyme solution,
Crush the seaweed before saccharification,
After adding the enzyme solution to crushed seaweed,
Manufactures reducing sugar
Saccharification method of seaweed according to 請 Motomeko 1 to 6 one of the.
エンテロバクター（Enterobacter）属に含まれ、受託番号がNITE P-02290の菌株により、アルコールを製造する
アルコールの製造方法。 A sugar obtained by the saccharification method of seaweed according to any one of claims 1 to 7 , as a substrate ,
Enterobacter (Enterobacter) is included in the genus, accession number is Ri by the strains of NITE P-02290, the production of alcohol
Method of manufacturing the A alcohol.
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