JP6172003B2

JP6172003B2 - 飛行時間型質量分析装置

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Publication number: JP6172003B2
Application number: JP2014057019A
Authority: JP
Inventors: 禎規関谷
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: JP2015179630A

Description

本発明は飛行時間型質量分析装置に関し、さらに詳しくは、サンプルプレート上に付着された多数の試料に対する測定を実行するマトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（以下「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ」と称す）に好適な飛行時間型質量分析装置に関する。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、一般に、平板状であるサンプルプレート上に付着されている試料に対してパルス的にレーザ光を照射し、該試料に含まれる化合物由来のイオンを発生させる。そして、発生した各種イオンに一定の加速エネルギを付与して飛行空間に導入し、それらイオンが一定距離である飛行空間を飛行して検出器に到達するまでの飛行時間をそれぞれ計測する。各イオンの飛行時間はそのイオンの質量電荷比m/zと所定の関係を有する。そこで、この関係を利用して、計測された飛行時間を質量電荷比に換算し、例えば質量電荷比とイオン強度との関係を示すマススペクトルを作成する。多くの場合、試料から生成されたイオンを加速する際に、試料へのレーザ光照射時点から所定の遅延時間が経過した時点でパルス的に加速電圧を印加する、遅延引出し法が用いられる（非特許文献１など参照）。

上述した一般的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、サンプルプレート上の試料表面がイオンの飛行開始地点となる。そのため、例えば周囲温度の変化の影響やサンプルプレートの厚さの不均一性など、様々な要因によってサンプルプレート表面の高さが変わると、飛行距離が微妙に変化してそれが質量電荷比の誤差に繋がる。そこで、目的化合物由来のイオンの質量電荷比を正確に求めるために、理論的な（つまりは正確な）質量電荷比が既知である標準物質を１又は複数含む標準試料（キャリブラントと呼ばれる）を測定した結果に基づいて、目的試料を測定した結果を校正する、キャリブレーションと呼ばれる処理が一般に行われる（特許文献１など参照）。

１枚のサンプルプレートの厚さの不均一性や湾曲（そり）などがある場合、１枚のサンプルプレートの面内でも、その位置によって飛行距離は異なる。このため、サンプルプレート上には、測定対象である目的試料をスポッティングするサンプルウェルのほかに、標準試料をスポッティングするキャリブラントウェルが複数設けられ、或る目的試料の測定結果のキャリブレーションは、該目的試料が形成されているサンプルウェルに最も近いキャリブラントウェルに形成されている標準試料を測定した結果を利用して行われる。こうしたキャリブレーションによって、目的試料を測定して得られた試料成分に対する質量電荷比値は真値に近い値に修正される。

ところで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、サンプルプレートに厚さの不均一性や湾曲などがあった場合に、そのプレート面内の位置によって飛行距離が異なるのみならず、試料表面と試料から生成したイオンを引き出して加速するための電極（引出し電極や加速電極）との間の距離が変化する。そのため、それら電極により形成される加速電場の影響もプレート面内の位置によって異なる。したがって、サンプルプレート上のウェルの位置によって、試料表面からイオンを引き出して加速するための制御パラメータの最適値、例えば遅延引出しの際に印加されるパルス電圧などの最適値が相違する。このことは、或るサンプルウェルにおいて最適化した制御パラメータが、同一サンプルプレート上の別のサンプルウェルでは必ずしも最適値とはならないことを意味する。

一例として、１枚のサンプルプレート上の異なるキャリブラントウェル（ウェル番号＃１７と＃８）に付着されたペプチド混合物のマススペクトルの実測結果を図１８に示す。実測したペプチド混合物に含まれるペプチドは図１７に示した６種類である。いずれのキャリブラントウェルに対しても測定の際の遅延引出しパルス電圧は同一（-1300[V]）である。図１８（ａ）で分かるように、キャリブラントウェル＃１７では、ACTH1-17やACTH18-39などのペプチドの同位体ピークも十分に分離されており、高い質量分解能が達成されている。これは、このときの遅延引出しパルス電圧が最適又はそれに近いためであると推測できる。これに対し、図１８（ｂ）に示すように、キャリブラントウェル＃８では、質量分解能が低いためにACTH1-17やACTH18-39などのペプチドの同位体ピークの分離は悪化している。これは、遅延引出しパルス電圧が適切でないためであると推測できる。

こうしたことから、高い質量分解能のデータを取得するためには、１枚のサンプルプレート内でもウェル毎に最適な制御パラメータを設定する必要があることが分かる。また、図２に示すように、サンプルプレートホルダ５にサンプルプレート７を挿入してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのステージ上にセットする場合でも、サンプルプレート７の保持状態はサンプルプレート７毎に異なる。そのため、サンプルプレート毎にそれぞれ各ウェルについての最適な制御パラメータを見つけ出す必要がある。制御パラメータの最適値を探索する際には、制御パラメータを徐々に変化させつつ質量分析を繰り返してその結果を比較する必要があるため、多数のウェル毎にそれぞれ制御パラメータの最適値を探索するのは非常に煩雑で面倒である。また、こうした作業は分析のスループットを低下させる一因となる。

特開２００５−２９２０９３号公報特開２００９−５２９９４号公報

田中耕一、ほか２名、「遅延引き出し法の基礎」、日本質量分析学会誌、2009年、Vol. 57、No.1、pp.31-36

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、１枚のサンプルプレート上或いは複数のサンプルプレート上の多数の試料を測定する際の制御パラメータの設定に関する作業の手間を軽減しながら、試料毎に最適又はそれに近い制御パラメータでの質量分析を行うことで高い質量分解能を実現することができる飛行時間型質量分析装置を提供することにある。

上記課題を解決するために成された本発明は、サンプルプレート上に用意された試料からイオンを生成するイオン源と、該イオン源で生成されたイオンに対して一定のエネルギを付与して加速する加速部と、加速されたイオンを飛行させ、その飛行中にイオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離部と、その分離されたイオンを検出する検出部と、を具備する飛行時間型質量分析装置において、
a)所定の測定条件の下でサンプルプレート上に用意された標準試料に対する質量分析を実施して得られた所定成分に対する質量電荷比値と同測定条件の下で当該装置による質量分析が可能である基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施して得られた所定成分に対する基準質量電荷比値との差と、サンプルプレートからイオンを引き出すとともに加速する電圧又はサンプルプレートから引き出されたイオンを加速する電圧である加速条件の質量分解能に関する最適値と、の対応関係を示す情報を記憶しておく参照情報記憶部と、
b)測定対象である目的試料が付着された目的サンプルプレートについて、該目的サンプルプレート上で目的試料と異なる位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施するとともに、そのときの前記基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施するべく各部を制御する予備測定制御部と、
c)前記予備測定制御部による制御の下で得られた、前記目的サンプルプレート上の標準試料と前記基準位置にある標準試料とに対する所定成分の質量電荷比値の差を求め、前記参照情報記憶部に格納されている情報を参照して、その質量電荷比値差に対応する加速条件の最適値を取得する最適条件決定部と、
d)前記目的サンプルプレート上に用意されている目的試料に対する質量分析の際の加速条件を、前記最適条件決定部により得られた加速条件の最適値に基づいて決める目的試料測定制御部と、
を備えることを特徴としている。

本発明に係る飛行時間型質量分析装置において、試料（目的試料、標準試料）中の成分をイオン化するイオン化法は、サンプルプレート上に用意された試料中の成分をイオン化する手法であれば特に限定されないが、代表的なイオン化法は上述したＭＡＬＤＩである。そのほか、マトリクスを用いないレーザ脱離イオン化法（ＬＤＩ）、表面支援レーザ脱離イオン化法（ＳＡＬＤＩ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、脱離エレクトロスプレイイオン化法（ＤＥＳＩ）、エレクトロスプレイ支援／レーザ脱離イオン化法（ＥＬＤＩ）などでもよい。

飛行時間型質量分析装置による測定で得られるイオンの質量電荷比値はそのイオンの飛行時間を反映しており、飛行速度が同一であれば、飛行時間は飛行距離に依存する。そのため、サンプルプレート上の異なる位置に用意された同種の試料（例えば同種の標準試料）を同じ測定条件の下で測定すれば、同じ試料成分由来のイオンの質量電荷比値の相違からそのサンプルプレート上の各位置の相対的な高低差についての情報を得ることができる。そこで、本発明に係る飛行時間型質量分析装置では、サンプルプレートを保持するサンプルプレートホルダなどのプレート保持部上の所定位置やサンプルプレートホルダが載置されるステージ上に該サンプルプレートホルダとは別に設けられた専用の設置台などの基準位置にも標準試料を付着させ、これを表面高さの基準点とする。プレート保持部は機械的な加工精度が高いうえに反りなども生じにくく、サンプルプレートが異なってもプレート保持部の上面高さは常に一定であるとみなせるため、基準点として利用することができる。そして、基準位置に用意された標準試料中の所定成分の質量電荷比値と、サンプルプレート上の標準試料中の所定成分の質量電荷比値との差を取得し、この質量電荷比値差と、加速条件の最適値と、の対応関係を示す情報を求めて、これを参照情報記憶部に格納しておく。

なお、ここでいう加速条件の最適値又は加速条件の質量分解能に関する最適値とは、質量分解能が最良又はそれに近い状態となる加速条件である。また、加速条件とは、遅延引出しを行う飛行時間型質量分析装置では、例えば遅延引出しの際にイオンを加速するためにパルス的に引出し電極等に印加されるパルス電圧の値である。

この標準試料中の所定成分に対する質量電荷比値差が同じであれば、表面高さの差も同じである筈である。そのため、サンプルプレート上のいずれの位置においても、或いはたとえ異なるサンプルプレートであっても、上記質量電荷比値差が同じであれば、加速条件の最適値は同じでよい。そこで、目的サンプルプレートを保持するプレート保持部が本装置にセットされたならば、予備測定制御部は各部を制御することにより、その目的サンプルプレート上で目的試料と異なる位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施するとともに、基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施する。そして、最適条件決定部は、その目的サンプルプレート上の標準試料と基準位置に用意された標準試料とに対する所定成分の質量電荷比値の差を計算し、参照情報記憶部に格納されている情報を参照して、その質量電荷比値差に対応する加速条件の最適値を取得する。

さらに目的試料測定制御部は、目的サンプルプレート上に用意されている目的試料に対する質量分析の際の前記加速部における加速条件を、上記最適条件決定部により得られた加速条件の最適値に基づいて決定する。これにより、目的サンプルプレート上に用意されている目的試料について、個別に加速条件の最適値を調べることなく、その目的試料の表面高さに応じた加速条件の最適値を自動的に設定して測定を実行することができる。

極端に反ったものなどを除き、一般的なサンプルプレートでは、該プレート面上で標準試料の位置を中心とした一定の二次元範囲内でプレート表面高さの差が実質的にない（つまりは許容可能な範囲である）とみなすことができる。
そこで、本発明に係る飛行時間型質量分析装置では、上記サンプルプレートは、目的試料を付着させるための複数のサンプルウェルと、該サンプルプレート上で一定の二次元範囲内の複数のサンプルウェルを含むように区画された区画毎に、その中心に配置された標準試料を付着させるためのキャリブラントウェルと、を有し、
上記最適条件決定部は、上記目的サンプルプレート上のキャリブラントウェル毎に加速条件の最適値を求め、
上記目的試料測定制御部は、上記目的サンプルプレートの任意のサンプルウェルに用意されている目的試料に対する質量分析を行う際に、上記最適条件決定部により、該サンプルプレート上でそのサンプルウェルが含まれる区画に配置されているキャリブラントウェルに対して得られた加速条件の最適値を、そのサンプルウェル上の目的試料に対する加速条件の最適値として決定する構成とすることができる。

これにより、サンプルプレート上の各サンプルウェルについては加速条件の最適値を探索するための測定を行うことなく、同サンプルプレート上のキャリブラントウェルについて得られた加速条件の最適値を用いて、全サンプルウェルに対する加速条件の最適値を簡便に設定することができる。

また本発明に係る飛行時間型質量分析装置において、好ましくは、上記参照情報記憶部に格納する情報を作成するために、
e)サンプルプレート上の異なる位置に用意された複数の標準試料に対して、それぞれ、上記加速部の加速条件を変化させつつ質量分析を実施し、その質量分析結果に基づいて、標準試料毎に加速条件の最適値を求める最適加速条件探索部と、
f)サンプルプレート上の異なる位置に用意された複数の標準試料に対して、それぞれ、上記加速部の加速条件を一定として質量分析を実施するとともに、同一加速条件の下で上記基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施し、それら質量分析結果からサンプルプレート上の標準試料毎に基準質量電荷比値との質量電荷比値差を求める質量電荷比値差調査部と、
g)上記最適加速条件探索部により得られた標準試料毎の加速条件の最適値と上記質量電荷比値差調査部により得られた標準試料毎の質量電荷比値差とから、その対応関係を示す情報を求める参照情報作成部と、
を備えるようにするとよい。

この構成によれば、加速条件の最適値と質量電荷比値差との対応関係を示す情報、つまり上記参照情報記憶部に格納される情報を、適宜、そのときの装置状態などを反映した最新の情報に更新することができる。それにより、装置の分解及び再組立てなどによって飛行距離が微妙に変化したような場合でも、最新の参照情報に基づいて、加速のための制御パラメータを適切に定めることができる。

なお、加速条件の最適値と質量電荷比値差との対応関係を示す情報を精度良く求めるには、サンプルプレートの表面高さの変化ができるだけ反映されるような位置に、複数の標準試料が用意されていることが望ましい。即ち、サンプルプレート上で片寄らず、全体に満遍なく分散して複数の標準試料が用意されているようにするとよい。上述した、複数のサンプルウェル毎に区画された、各区画の中心にキャリブラントウェルが配置されているサンプルプレートでは、キャリブラントウェルはサンプルプレート全体に満遍なく分散して配置されているから、それらキャリブラントにそれぞれ標準試料を付着させて、それぞれ質量分析を行うようにすればよい。

本発明に係る飛行時間型質量分析装置によれば、１枚のサンプルプレート上に用意した多数の目的試料、或いは複数のサンプルプレート上にそれぞれ用意した多数の目的試料を測定する際に、サンプルプレートの反りや厚さの不均一性があった場合でも、目的試料毎に最適な又はそれに近い加速条件を簡便に設定することができる。それにより、各目的試料を高い質量分解能で以て測定することができる。また、最適な加速条件を探索するため面倒な測定作業を目的試料毎に行う必要がなくなるので、分析者の手間を軽減することができ、分析を効率化してスループットを向上させることができる。

本発明の一実施例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの要部の構成図。本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで使用されるサンプルプレートホルダにサンプルプレートを装着した状態の外観斜視図。サンプルプレートの一部平面図。サンプルプレートNo.1上のキャリブラントウェルに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図。図４に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.1の表面の湾曲イメージを示す図。図４に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図。サンプルプレートNo.2上のキャリブラントウェルに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図。図７に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.2の表面の湾曲イメージを示す図。図７に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図。サンプルプレートNo.3上のキャリブラントウェルに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図。図１０に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.3の表面の湾曲イメージを示す図。図１０に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図。サンプルプレートNo.1〜No.3上の全てのキャリブラントウェルに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図。本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおいて質量電荷比値差-最適電圧（遅延引出しパルス電圧最適値）情報を取得する際の手順を示すフローチャート。本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおいてキャリブラントウェル毎の最適電圧を探索する際の手順を示すフローチャート。他の実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおけるステージ付近の概略構成図。実測に使用したペプチド混合物に含まれるペプチドとその理論質量を示す図。１枚のサンプルプレート上の異なるキャリブラントウェルに用意されたペプチド混合物に対する実測により得られたマススペクトルを示す図。

以下、本発明の一実施例であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳについて、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの要部の構成図、図２は本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで使用されるサンプルプレートホルダにサンプルプレートを装着した状態の外観斜視図、図３はサンプルプレートの一部平面図である。

平板状であって金属等の導電体からなるサンプルプレート７は、サンプルプレートホルダ５に装着された状態でステージ４上に載置される。ステージ４は、図示しないモータ等を含むステージ駆動部１０により図１中のＸ−Ｙの２軸方向に移動可能である。サンプルプレート７の上面には、マトリクスを用いて調製された多数の目的試料９及び標準試料８が付着されている。測定実行時には、この多数の目的試料９（又は標準試料８）のうちの一つに対し、レーザ照射部１から出射して集光レンズ２、反射鏡３を経たパルス状のレーザ光が照射され、それにより、その試料９又は８に含まれる化合物がイオン化される。レーザ光の照射位置は固定されており、ステージ駆動部１０によりステージ４をそれぞれ適宜移動させることで、サンプルプレート７上の任意の位置の試料９又は８に対してレーザ光を照射し測定を行うことができる。

ステージ４の上方には、レーザ光が照射されることで試料９又は８から発生したイオンをその発生位置の近傍から上方に引き出すとともに加速する電場を形成する引出し電極１１と、引き出されたイオンにさらに加速エネルギを付与するための電場を形成する加速電極１２と、が配設されている。加速電圧発生部１３は、これら電極１１、１２と、ステージ４、サンプルプレートホルダ５を介してサンプルプレート７へとそれぞれ所定の電圧を印加する。加速エネルギを付与されて図１中のＺ軸方向に飛行を開始したイオンは、フライトチューブ１４内に形成された無電場、無磁場の飛行空間１５中を飛行して検出器１６に到達する。飛行空間１５中では質量電荷比が小さいイオンほど大きな飛行速度を有するため、ほぼ同時に飛行を開始した各種のイオンの中で、質量電荷比が小さなイオンから順に検出器１６に到達する。

なお、本実施例のＴＯＦＭＳはイオンを直線的に飛行させるリニアＴＯＦＭＳであるが、イオンの飛行軌道を反転させるリフレクトロンを備えたリフレクトロンＴＯＦＭＳ、或いは、イオンを周回軌道に沿って繰り返し飛行させるマルチターンＴＯＦＭＳなどでもよいことは当然である。

検出器１６は入射したイオンの量に応じた検出信号を出力し、この検出信号はアナログ-デジタル変換器（ＡＤＣ）１７によりデジタルデータに変換されてデータ処理部２０に入力される。データ処理部２０は、m/z差-最適電圧対応情報作成部２１、m/z差-最適電圧対応情報記憶部２２、キャリブラントウェル対応最適電圧決定部２３などの特徴的な機能ブロックを含む。操作部４０及び表示部５０が接続された制御部３０は測定動作を制御するとともにユーザインターフェイスを担うものであり、m/z差-最適電圧対応情報取得制御部３１、最適電圧決定制御部３２、キャリブラントウェル対応最適電圧記憶部３３などの特徴的な機能ブロックを含む。

データ処理部２０や制御部３０の少なくとも一部の機能は、パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアがそのコンピュータ上で動作することにより具現化され、その場合、操作部４０はキーボードやマウス等のポインティングデバイスであり、表示部５０はディスプレイモニタである。

図３に示すように、本実施例で使用されるサンプルプレート７の上面には、試料を滴下する位置を示す目印となる多数のウェルが形成されている。ウェルは窪み（凹部）である場合もあるが、単なる目印の刻印である場合もある。図３に示した例では、格子の交点位置に、測定対象である目的試料（図１中の目的試料９）を付着させるための多数のサンプルウェル７ｂが配置される。また、隣接する４×４＝１６個のサンプルウェル７ｂの中間位置に、キャリブラントが含まれる標準試料（図１中の標準試料８）を付着させるためのキャリブラントウェル７ａが配置されている。即ち、図３中に点線で示す、１６個のサンプルウェル７ｂ毎に、１個のキャリブラントウェル７ａが設けられている（例えば特許文献２など参照）。この点線で囲まれた二次元範囲が本発明における一つの区画に相当する。サンプルプレート７上に形成されているキャリブラントウェル７ａにはそれぞれ、１から始まる連続番号であるウェル番号が付されているが、ここでは、この番号を＃１、＃２、…で示す。

図２に示すように、ステンレス等の導電体からなるサンプルプレートホルダ５は、側方（図２では前方）からサンプルプレート７を挿入するための凹部を有している。サンプルプレートホルダ５は高い寸法精度で以て加工されており、その上面の高さは予め定められた許容誤差内に収まっている。また、サンプルプレートホルダ５の上面には、キャリブラントが含まれる標準試料を付着させる位置を示すためのキャリブラントウェル５ａが設けられている。

サンプルプレート７は厚さが不均一性であったり、反りを有していたりすることがよくある。そうした場合、サンプルプレート７が図２に示したようにサンプルプレートホルダ５に装着された状態であっても、そのサンプルプレート７の上面の高さｈはＸ−Ｙ面内の位置によって、つまりはサンプルウェル７ｂやキャリブラントウェル７ａの位置によって相違する。試料９又は８から生成されたイオンの飛行開始点は該試料９又は８の表面付近であるため、上述したようにサンプルプレート７の上面の高さｈがウェル７ａ、７ｂの位置によって相違すると、試料表面の高さもウェル７ａ、７ｂの位置によって異なり、それにより飛行距離が異なることになる。また、試料表面の高さがウェル７ａ、７ｂの位置によって異なると、試料表面から引出し電極１１や加速電極１２までの距離が相違するため、加速電場の影響が異なる。

上述した飛行距離の相違は主として質量精度の低下に繋がるが、質量電荷比値自体は標準試料に対する測定結果を利用したキャリブレーション（質量校正）により補正可能である。一方、加速電場の影響の相違は質量精度を低下させるのみならず質量分解能や感度の低下にも繋がるが、質量分解能の低下等は上記キャリブレーションでは補正されない。そのため、高い質量分解能を達成するには、各サンプルウェル７ｂに設けられた目的試料９毎に、加速電場が最適になるように制御パラメータ（この場合には、引出し電極１１に印加される遅延引出しパルス電圧）を調整する必要がある。本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは、この制御パラメータの設定を簡便に行うことができる。

次に、本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおける制御パラメータの設定方法の原理を、実測結果を参照しつつ説明する。

上述したように、サンプルプレート７の表面高さが異なると最適な制御パラメータが異なるということは、逆に、サンプルプレート７の表面高さが同じであれば同じ制御パラメータを適用することができることを意味している。当然のことながら、ＴＯＦＭＳでの測定により得られるイオンの質量電荷比値はそのイオンの飛行時間を反映している。したがって、サンプルプレート７の各ウェル７ａ、７ｂに設けられた同種の試料を同一の測定条件（制御パラメータ）の下で測定すれば、該試料由来のイオンの質量電荷比値の相違から各ウェル７ａ、７ｂの相対的な高低差の情報を得ることができる。また、常に一定の高さである基準点が定まれば、１枚のサンプルプレート内だけでなく、異なるサンプルプレート間のウェルの相対的な高低差の情報も得られる。上述したようにサンプルプレートホルダ５の上面の高さの精度は高く、使用するサンプルプレートが入れ替えられてもサンプルプレートホルダ５の上面高さは常に一定である。そこで、ここでは、サンプルプレートホルダ５のキャリブラントウェル５ａ上に付着される標準試料６を表面高さの基準点として用いた。

本願発明者は、基準点として定めたサンプルプレートホルダ５上の標準試料６中の所定成分に対する質量電荷比とサンプルプレート７の各キャリブラントウェル７ａ上の標準試料８中の所定成分に対する質量電荷比との質量電荷比値差と、引出し電極１１に印加される遅延引出しパルス電圧の最適値と、の関係を実測により調べた。
この実測の条件は以下の通りである。
（１）質量分析装置：ＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ飛行時間型質量分析計（島津製作所製）、リニアモード（ポジティブイオンモード）による測定。
（２）サンプルプレート：ステンレス製３８４ウェルプレート（２mm厚）。
（３）サンプル：ペプチド混合物（図１７に示す６種のペプチドを含有）。
（４）マトリクス：α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）。
（５）サンプル調製方法：ペプチド混合物とＣＨＣＡマトリクスとの混合溶液をサンプルプレート７上のキャリブラントウェル７ａ及びサンプルプレートホルダ５上のキャリブラントウェル５ａにそれぞれ滴下して乾固することで調製。

サンプルプレートホルダ５上に形成した上記サンプル、及びサンプルプレート７の２４個のキャリブラントウェル７ａにそれぞれ形成した上記サンプルに対して測定を行い、その測定結果から、含有ペプチドの一つであるGlufibの質量電荷比値を求めた。そして、サンプルプレートホルダ５上のサンプルに対して得られたGlufib質量電荷比値を基準として、その基準値とサンプルプレート７の各キャリブラントウェル７ａ上のサンプルに対して得られたGlufib質量電荷比値との質量電荷比値差を計算した。また、これとは別に、各キャリブラントウェル５ａ、７ａ上のサンプルに対し、制御パラメータの一つである遅延引出しパルス電圧の最適値を調べた。今回の評価では、遅延引出しパルス電圧のみを変化させ（つまり、それ以外の測定条件は一定として）、ペプチド混合物に含まれる各ペプチドイオンにおける同位体ピークが最も適切に分離できる電圧を、遅延引出しパルス電圧の最適値とした。例えば、図１８（ａ）に示した例では、同位体ピークが十分に分離されているので、このときの遅延引出しパルス電圧は最適値であるといえる。

図４は、サンプルプレートNo.1上のキャリブラントウェル７ａに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図である。また、図５は、図４に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.1の表面の湾曲イメージを示す図である。図６は、図４に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図である。図６から、質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値とは高い相関を有している（決定係数Ｒ²＝0.983）ことが分かる。

別の２枚のサンプルプレート（No.2及びNo.3）についても同様のデータを取得した。その結果を、図７〜図１２に示す。図７はサンプルプレートNo.2上のキャリブラントウェル７ａに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図、図８は図７に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.2の表面の湾曲イメージを示す図、図９は図７に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図である。図１０はサンプルプレートNo.3上のキャリブラントウェル７ａに用意されたペプチド混合物に対するGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値の実測結果を示す図、図１１は図１０に示したGlufib質量電荷比値差の実測結果から算出したサンプルプレートNo.3の表面の湾曲イメージを示す図、図１２は図１０に示したGlufib質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との関係を示す図である。これら２枚のサンプルプレートにおいても、サンプルプレートホルダ５上のサンプルを基準とした質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との間に高い相関があることが確認できる。

さらにまた、サンプルプレートNo.1、No.2及びNo.3について求めた、質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値と関係を示すデータを一括してプロットしたのが図１３である。図５、図８、図１１に示したように各サンプルプレートの表面の湾曲状態は相違するものの、質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との相関はサンプルプレート間でも高い（決定係数Ｒ²＝0.9702）ことが、図１３から分かる。これは、例えば或る１枚のサンプルプレートにおいて取得した標準試料における質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との相関関係を、湾曲状態が異なる他のサンプルプレートにも適用可能であることを意味している。

上記実測結果から、或る１枚のサンプルプレートを用いて、サンプルプレートホルダ上とサンプルプレートのウェル上の同一試料に対する質量電荷比値差と遅延引出しパルス電圧最適値との相関情報を取得しておきさえすれば、その相関情報を利用して、任意のサンプルプレートの任意のウェル上の同一試料に対する質量電荷比値から、そのウェルの高さを反映した遅延引出しパルス電圧最適値を推定可能であることが分かる。本発明に係るＴＯＦＭＳは、こうした原理を利用して、サンプルプレート毎、及びウェル毎に遅延引出しパルス電圧最適値を探索するための測定を行うことなく、各ウェルの高さに対応した遅延引出しパルス電圧の最適値を自動的に設定して質量分析を実行できるようにしている。それにより、遅延引出しパルス電圧最適値を探索するための測定に伴う煩雑な作業を省くことができる。

本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、上記のような原理に基づく遅延引出しパルス電圧最適値の設定を行うための機能を有する。以下、具体的に説明する。

任意のサンプルプレート上のウェルに対する遅延引出しパルス電圧最適値を決定するためには、予め、図６、図９、図１２、図１３等に示されている、特定の試料成分についての質量電荷比値差と遅延引出パルス電圧最適値との相関関係を調べ、あとで利用可能な形式でこの相関関係を示す情報を記憶しておく必要がある。図１４はそのための作業の手順を示すフローチャートである。

まず、分析者は、各キャリブラントウェル７ａ上に標準試料８を用意したサンプルプレート７をサンプルプレートホルダ５に装着し、これをステージ４上にセットして所定の操作を操作部４０で行う。この操作に応じて制御部３０のm/z差-最適電圧対応情報取得制御部３１は、キャリブラントウェル７ａ毎に遅延引出パルス電圧最適値（以下、適宜、単に最適電圧という）を探索するための測定を実行するように各部を制御する（ステップＳ１）。

具体的には、任意のキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８が測定位置に来るようにステージ駆動部１０を制御するとともに、引出し電極１１等にパルス的に印加する加速電圧の値を所定範囲で所定ステップ幅で変化させるように加速電圧発生部１３を制御しつつ、測定を繰り返す。データ処理部２０においてm/z差-最適電圧対応情報作成部２１は、一つの標準試料８に対する各測定により得られたデータに基づきそれぞれマススペクトルを作成し、所定成分に対応するピークの分解能を計算し、その分解能が最良となる電圧値を最適電圧として求める。このような測定と処理とを各キャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対してそれぞれ実施することにより、各キャリブラントウェル７ａに対応する最適電圧をそれぞれ求める。また、サンプルプレート７上の標準試料８だけでなく、サンプルプレートホルダ５のキャリブラントウェル５ａ上に用意された標準試料６に対しても同様の測定及び処理を実行し、最適電圧を求める。

次に、引出し電極１１等にパルス的に印加する加速電圧をサンプルプレートホルダ５上の標準試料６に対して得られた最適電圧に固定し、その条件の下でサンプルプレート７の各キャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対する測定、及びサンプルプレートホルダ５上の標準試料６に対する測定を行い、所定成分に対する質量電荷比値をそれぞれ求める。ただし、遅延引出しパルス電圧を含めて同じ測定条件の下で測定を行った結果を上記ステップＳ１において記憶しておけば、新たな測定の全部又は一部を省略することができる。そして、サンプルプレートホルダ５上の標準試料６に対する測定で得られた所定成分の質量電荷比値を基準とし、各キャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対する測定で得られた所定成分の質量電荷比値との差（質量電荷比値差）を計算する（ステップＳ２）。

そして、m/z差-最適電圧対応情報作成部２１は、サンプルプレート７のキャリブラントウェル７ａ毎に、ステップＳ１で得られた最適電圧とステップＳ２で得られた質量電荷比値差とを対応付け、質量電荷比値差と最適電圧との対応関係を示す情報、例えば上述した相関の決定係数Ｒ²を求める。そして、その情報をm/z差-最適電圧対応情報記憶部２２に格納する（ステップＳ３）。

なお、m/z差-最適電圧対応情報を算出するには、必ずしも１枚のサンプルプレート７上の全てのキャリブラントウェル７ａ上に設けられた標準試料８に対する測定結果が必要というわけではない。これは、図６等の結果から明らかであり、１枚のサンプルプレート７上に形成されている多数のキャリブラントウェル７ａのうちの一部を間引いて測定しても構わない。また逆に、１枚のサンプルプレートだけではなく複数のサンプルプレートのキャリブラントウェル上の標準試料に対する測定結果を用いることで、上述したようなm/z差-最適電圧対応情報を求めるようにしてもよい。一般に、キャリブラントウェルの数が多いほど、つまりは相関関係の情報取得に利用する元のデータが多いほど、m/z差-最適電圧対応情報の正確性は一層高まる。

続いて、測定対象であるサンプルプレート７のサンプルウェル７ｂ上に付着された目的試料９に対する測定を行う際の特徴的な動作を、図１５に示すフローチャートに従って説明する。なお、このとき、サンプルプレート７のキャリブラントウェル７ａには、標準試料を付着させておく。
分析者は、測定対象であるサンプルプレート７をサンプルプレートホルダ５に装着し、ステージ４上の所定位置にセットし、所定の操作を操作部４０で行う。この操作を受けて、制御部３０の最適電圧決定制御部３２は、サンプルプレート７の全てのキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対する最適電圧を探索する測定を実施するように各部を制御する。

具体的にはまず、最適電圧決定制御部３２はステージ駆動部１０を制御し、サンプルプレートホルダ５のキャリブラントウェル５ａ上に形成された標準試料６が測定位置に来るようにステージ４を移動させる。そして、レーザ照射部１を駆動し、標準試料６に対してレーザ光を照射して測定を実施する（ステップＳ１１）。なお、このとき、引出し電極１１等に印加する遅延引出しパルス電圧は、サンプルプレートホルダ５のキャリブラントウェル５ａに対して求められた最適電圧に設定される。データ処理部２０のキャリブラントウェル対応最適電圧決定部２３は、このときの測定により得られたマススペクトルに基づき、標準試料中の所定成分の質量電荷比値を取得する。いま、この質量電荷比値をＭstとする（ステップＳ１２）。

次に、最適電圧決定制御部３２は、１枚のサンプルプレート７上の多数のキャリブラントウェル７ａを順番に一つずつ指定するための変数ｎを１にセットする（ステップＳ１３）。そして、ウェル番号が＃ｎ（つまり初めてステップＳ１４を実行する際には＃１）であるキャリブラントウェル７ａが測定位置に来るようにステージ駆動部１０を通してステージ４を移動させる。そのあと、レーザ照射部１を駆動してレーザ光をキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に照射し、それにより生成されたイオンを測定する（ステップＳ１４）。このとき、引出し電極１１等に印加する遅延引出しパルス電圧は、上記ステップＳ１１における測定時と同一である。

データ処理部２０においてキャリブラントウェル対応最適電圧決定部２３は、このときの測定により得られたマススペクトルに基づき、標準試料中の所定成分の質量電荷比値を取得する。いま、この質量電荷比値をＭpとする（ステップＳ１５）。そして、質量電荷比値Ｍpと基準である質量電荷比値Ｍstとの質量電荷比値差ΔＭを計算し（ステップＳ１６）、m/z差-最適電圧対応情報記憶部２２に格納されている情報を参照して、ウェル番号が＃ｎであるキャリブラントウェル７ａにおける質量電荷比値差ΔＭに対応する最適電圧を決定する（ステップＳ１７）。

一つの標準試料８に対する測定結果に基づいて最適電圧が決定されたならば、最適電圧決定制御部３２は、変数ｎがそのサンプルプレート７のキャリブラントウェル７ａの総数であるか否かを判定する（ステップＳ１８）。そして、変数ｎがキャリブラントウェル総数に達していなければ、変数ｎの値をインクリメントして（ステップＳ１９）ステップＳ１４へと戻る。そのあと、ステップＳ１４では、最適電圧決定制御部３２が、次のウェル番号を持つキャリブラントウェル７ａが測定位置に来るようにステージ駆動部１０を通してステージ４を移動させ、そのキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対する測定を実行する。そして、上述したようにステップＳ１５、Ｓ１６、Ｓ１７と進み、m/z差-最適電圧対応情報記憶部２２に格納されている情報を参照して、その標準試料８に対する測定結果に基づき最適電圧を決定する。

上記ステップＳ１４〜Ｓ１９の測定及び処理をサンプルプレート７上のキャリブラントウェル７ａの総数だけ繰り返すことにより、測定対象であるサンプルプレート７の全てのキャリブラントウェル７ａ上に形成された標準試料８に対する最適電圧を決定する。そして、ステップＳ１８においてＹｅｓと判定されたならば、全てのキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対して求められた最適電圧を、ウェル番号に対応付けて、制御部３０のキャリブラントウェル対応最適電圧記憶部３３に格納する（ステップＳ２０）。

以上の処理が終了すると、次いで最適電圧決定制御部３２は、測定対象であるサンプルプレート７の各サンプルウェル７ｂについて、そのサンプルウェル７ｂに対応付けられている（基本的にはサンプルプレート面上で最も直近に位置する）キャリブラントウェル７ａの最適電圧をキャリブラントウェル対応最適電圧記憶部３３から取得する。これは、サンプルプレートが極端に湾曲していない限り、各サンプルウェル７ｂ上の試料の表面高さとそのサンプルウェル７ｂに最も近い位置にあるキャリブラントウェル７ａ上の試料の表面高さとは同一であるとみなせる程度に高さの差が小さいからである。

この例では、上述したように、また図３に示したように、隣接する４×４＝１６個のサンプルウェル７ｂの中央に１個のキャリブラントウェル７ａが配置されている。そこで、例えば図３において、Ｘ方向アドレスがＡ〜Ｄ、Ｙ方向アドレスが１〜４である１６個のサンプルウェル７ｂについては、ウェル番号が＃１であるキャリブラントウェル７ａの最適電圧をキャリブラントウェル対応最適電圧記憶部３３から取得する。そして、サンプルウェル７ｂ毎に、こうして得られた最適電圧がそのサンプルウェル７ｂ上の目的試料９を測定する際の遅延引出しパルス電圧として制御パラメータの一つに自動的に設定され、各サンプルウェル７ｂ上の目的試料９に対する測定が実施される。

このようにして、測定対象であるサンプルプレート７のサンプルウェル７ｂ上の目的試料９については、何ら最適電圧を探索するための測定が実行されることなく、その試料表面の高さに応じた最適電圧が自動的に設定される。

また、測定対象であるサンプルプレートが入れ替えられたときには、サンプルプレートホルダ５に新しく装着されたサンプルプレート７のキャリブラントウェル７ａ上の標準試料８に対する測定だけが実施され、その測定によって求まった各標準試料８における質量電荷比値差から最適電圧が導出される。そして、その新しいサンプルプレート７のサンプルウェル７ｂ上の目的試料９については、新たに導出されたキャリブラントウェル７ａ毎の最適電圧に基づいて最適電圧が決められる。
したがって、多数の目的試料についてそれぞれ最適電圧を探索する必要はなくなり、分析者による測定の手間は軽減される。また、そうした事前の制御パラメータ設定のための測定の回数が大幅に減るために、分析のスループットが向上する。

なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜に変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

例えば上記実施例では、サンプルプレートホルダ５のキャリブラントウェル５ａ上に付着される標準試料６を表面高さの基準点として用いていたが、別の位置に用意された標準試料を基準点とすることもできる。図１６は本発明の他の実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにおけるステージ付近の概略構成図である。この例では、ステージ４上に基準点設定専用の試料設置台６０を設け、その試料設置台６０上に標準試料６を用意している。当然のことながら、ステージ４をＸ−Ｙの２軸方向に適宜に移動させることで試料設置台６０上の標準試料６に対する質量分析を実施することが可能であるから、試料設置台６０上の標準試料６を表面高さの基準点として用いることができる。

また、上記実施例では、試料から生成されたイオンを該試料表面から引き出して加速するための遅延引出しパルス電圧を試料毎に最適化するようにしていたが、遅延引出し法によるイオン加速を行うＴＯＦＭＳに限定されるものではない。また、非特許文献１に記載されているように、一般的な遅延引出し法では、引出し電極に印加されている直流電圧をパルス的に下げることによりイオンを加速するが、サンプルプレートへの印加電圧や加速電極への印加電圧を変化させることでイオンを加速する場合でも、上記説明と同様の方法でそれら電圧の最適値を決めることができる。

また、本発明はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに限るものではなく、サンプルプレートを利用したイオン化法で生成したイオンを質量分析するＴＯＦＭＳ全般に適用可能である。具体的には、ＬＤＩ、ＳＡＬＤＩ、ＳＩＭＳ、ＤＥＳＩ、ＥＬＤＩなどのイオン化法を用いたＴＯＦＭＳにも適用可能であることは明らかである。

１…レーザ照射部
２…集光レンズ
３…反射鏡
４…ステージ
５…サンプルプレートホルダ
５ａ、７ａ…キャリブラントウェル
６、８…標準試料
７…サンプルプレート
７ｂ…サンプルウェル
９…目的試料
１０…ステージ駆動部
１１…引出し電極
１２…加速電極
１３…加速電圧発生部
１４…フライトチューブ
１５…飛行空間
１６…検出器
１７…アナログ-デジタル変換器（ＡＤＣ）
２０…データ処理部
２１…m/z差-最適電圧対応情報作成部
２２…m/z差-最適電圧対応情報記憶部
２３…キャリブラントウェル対応最適電圧決定部
３０…制御部
３１…m/z差-最適電圧対応情報取得制御部
３２…最適電圧決定制御部
３３…キャリブラント対応最適電圧記憶部
４０…操作部
５０…表示部
６０…試料設置台

Claims

プレート保持部により保持されるサンプルプレート上に用意された試料からイオンを生成するイオン源と、該イオン源で生成されたイオンに対して一定のエネルギを付与して加速する加速部と、加速されたイオンを飛行させ、その飛行中にイオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離部と、その分離されたイオンを検出する検出部と、を具備する飛行時間型質量分析装置において、
a)所定の測定条件の下でサンプルプレート上に用意された標準試料に対する質量分析を実施して得られた所定成分に対する質量電荷比値と同測定条件の下で当該装置による質量分析が可能である基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施して得られた所定成分に対する基準質量電荷比値との差と、サンプルプレートからイオンを引き出すとともに加速する電圧又はサンプルプレートから引き出されたイオンを加速する電圧である加速条件の質量分解能に関する最適値と、の対応関係を示す情報を記憶しておく参照情報記憶部と、
b)測定対象である目的試料が付着された目的サンプルプレートについて、該目的サンプルプレート上で目的試料と異なる位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施するとともに、そのときの前記基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施するべく各部を制御する予備測定制御部と、
c)前記予備測定制御部による制御の下で得られた、前記目的サンプルプレート上の標準試料と前記基準位置にある標準試料とに対する所定成分の質量電荷比値の差を求め、前記参照情報記憶部に格納されている情報を参照して、その質量電荷比値差に対応する加速条件の最適値を取得する最適条件決定部と、
d)前記目的サンプルプレート上に用意されている目的試料に対する質量分析の際の加速条件を、前記最適条件決定部により得られた加速条件の最適値に基づいて決める目的試料測定制御部と、
を備えることを特徴とする飛行時間型質量分析装置。
請求項１に記載の飛行時間型質量分析装置であって、
前記サンプルプレートは、目的試料を付着させるための複数のサンプルウェルと、該サンプルプレート上で一定の二次元範囲内の複数のサンプルウェルを含むように区画された区画毎に、その中心に配置された標準試料を付着させるためのキャリブラントウェルと、を有し、
前記最適条件決定部は、前記目的サンプルプレート上のキャリブラントウェル毎に加速条件の最適値を求め、
前記目的試料測定制御部は、前記目的サンプルプレートの任意のサンプルウェルに用意されている目的試料に対する質量分析を行う際に、前記最適条件決定部により、該サンプルプレート上でそのサンプルウェルが含まれる区画に配置されているキャリブラントウェルに対して得られた加速条件の最適値を、そのサンプルウェル上の目的試料に対する加速条件の最適値として決定することを特徴とする飛行時間型質量分析装置。
請求項１又は２に記載の飛行時間型質量分析装置であって、
前記参照情報記憶部に格納する情報を作成するために、
e)サンプルプレート上の異なる位置に用意された複数の標準試料に対して、それぞれ、前記加速部の加速条件を変化させつつ質量分析を実施し、その質量分析結果に基づいて、標準試料毎に加速条件の最適値を求める最適加速条件探索部と、
f)サンプルプレート上の異なる位置に用意された複数の標準試料に対して、それぞれ、前記加速部の加速条件を一定として質量分析を実施するとともに、同一加速条件の下で前記基準位置に用意された標準試料に対する質量分析を実施し、それら質量分析結果からサンプルプレート上の標準試料毎に基準質量電荷比値との質量電荷比値差を求める質量電荷比値差調査部と、
g)前記最適加速条件探索部により得られた標準試料毎の加速条件の最適値と前記質量電荷比値差調査部により得られた標準試料毎の質量電荷比値差とから、その対応関係を示す情報を求める参照情報作成部と、
を備えることを特徴とする飛行時間型質量分析装置。