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JP6148033B2 - Cellulose fine particles containing a fluorescent dye compound - Google Patents

Cellulose fine particles containing a fluorescent dye compound

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JP6148033B2
JP6148033B2 JP2013033758A JP2013033758A JP6148033B2 JP 6148033 B2 JP6148033 B2 JP 6148033B2 JP 2013033758 A JP2013033758 A JP 2013033758A JP 2013033758 A JP2013033758 A JP 2013033758A JP 6148033 B2 JP6148033 B2 JP 6148033B2
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武志 松瀬
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旭化成株式会社
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本発明は、蛍光色素化合物を含むセルロース微粒子とその分散体、及びそれを用いた診断薬に関する。 The present invention, cellulose fine particle and the dispersion containing a fluorescent dye compound, and a diagnostic agent using the same.

従来、抗原−抗体による特異的反応を利用して特定の抗原又は抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法の一つとして、試料中の被検出物質を、微粒子に担持した抗体又は抗原と免疫反応により特異的に結合させ、該結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が、簡便な測定法であり特に目視判定が可能である点から、一般に用いられている。 Conventionally, antigen - as one of immunoassays for detecting a detection target substance comprising a certain antigen or antibody by utilizing the specific reaction with antibodies, the substance to be detected in a sample, an antibody or antigen supported on microparticles immunoreactive specifically bound by, aggregation method for measuring the aggregation state of the fine particles caused by the coupling have terms are possible and are particularly visual determination simple measuring method, generally used. また、他の免疫測定法として、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、免疫蛍光測定法なども広く用いられている。 As another immunoassay, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, also widely used, such as immunofluorescence. また、被検出物質に免疫学的に結合する物質を用い、免疫反応とクロマトグラフィーの原理を組み合わせて、被検出物質を目視判定で検出する方法は、免疫クロマトグラフ法又はイムノクロマトグラフ法と呼ばれ、近年、広く用いられてきている。 Further, using immunological binding substance to the substance to be detected, by combining the principles of immune reactions and chromatography, a method of detecting visually determined material to be detected is referred to as immune chromatography or immunochromatography , in recent years, it has been widely used.

イムノクロマトグラフ法とは、被検出物質である抗原(又は抗体)に対する抗体(又は抗原)をクロマトグラフ媒体に固定化して、クロマトグラフ媒体上に反応部位を作製したものを固定相とし、上記被検出物質と結合可能な抗体(又は抗原)を担持した検出用微粒子と、上記被検出物を含む試料とを接触させつつ〔この接触により抗体感作(又は抗原感作)検出用微粒子上の該抗体(又は該抗原)と、試料中の抗原(又は抗体)とが反応して、検出用微粒子−感作に用いられた抗体(又は抗原)−試料中の抗原(又は抗体)とからなる複合体が生成する〕、上記クロマトグラフ媒体上を移動させることにより、前記試料を前記反応部位に接触させる測定法である。 The immunochromatography, an antibody (or antigen) against the antigen (or antibody) to be detected substance immobilized on the chromatographic medium, a disk produced reactive sites on the chromatographic medium to the stationary phase, the sensed and detecting particles carrying a substance capable of binding an antibody (or antigen), while contacting the sample containing the object to be detected [antibody-sensitized this contact (or antigen sensitization) antibody on the detection particles (or the antigen) and antigen in the sample (or antibodies) react, detecting particles - was used for sensitization antibody (or antigen) - complex consisting the antigen in the sample (or antibody) There generates], by moving over the chromatographic medium, a measuring method of contacting the sample to the reaction site. これにより、前記反応部位において、前記複合体が、前記固定化抗体(又は固定化抗原)に結合されて、検出用微粒子が捕捉されるので、この検出用微粒子の捕捉の有無を目視判定することにより試料中の被検出物質の存在を判定することができる。 Thus, in the reaction site, the complex, the are bound to the immobilized antibody (or immobilized antigens), since the detection particles are captured, to visually determine the presence or absence of capture of the detection particles it is possible to determine the presence of a substance to be detected in a sample by. この原理を利用した診断薬キットを、イムノクロマトキットという。 The diagnostic kit utilizing this principle, that the immunochromatography kit.

上記のイムノクロマトキットや凝集法において、検出用微粒子として、目視判定を容易にするために、有色の微粒子がしばしば利用されている。 In immunochromatography kit or aggregation method described above, as a detection particle, in order to facilitate visual judgment, colored fine particles are often utilized. このような検出用微粒子としては、その粒径や調製条件によって自然呈色するコロイド状金属微粒子や、合成高分子よりなるラテックス微粒子を着色した微粒子や、着色剤とともにモノマーを重合する方法で得られる着色ラテックス微粒子などが知られている。 Such detection particulate, colloidal and fine metal particles naturally colored by the particle size and conditions of preparation, microparticles and colored latex particles consisting of synthetic polymers, obtained by the method of polymerizing a monomer with a colorant such as colored latex particles are known. また、以下の特許文献1において、本発明者らは、セルロース微粒子を原料とした発色性の高い着色微粒子を報告している。 Further, in Patent Document 1 below, the present inventors have reported a high coloring fine particles chromogenic that the cellulose particles as a raw material. しかしながら、これらの微粒子は、退色しやすい、発色性の限界などの問題があり、更なる性能の向上が望まれている。 However, these particles are liable to fade, there are problems such as coloring of the limits, a further improvement in performance is desired. そこで、近年、新たな検出用微粒子として、蛍光ナノ微粒子が注目を集めている。 In recent years, as a new detection microparticles, fluorescent nanoparticles have attracted attention.

蛍光ナノ微粒子を用いた生体分子の検出、定量等に利用する蛍光試薬は発色性が高く、高感度試薬として用いられている。 Detection of biomolecules using fluorescence nanoparticles, fluorescent reagent for use in quantifying the like have high coloring properties, is used as a highly sensitive reagent. 例えば、以下の特許文献2には、スチレンとアクリル酸を重合させることで得られるラテックス微粒子に、蛍光色素化合物を導入した蛍光ラテックス微粒子が開示されている。 For example, Patent Document 2 below, the latex particles obtained by the polymerization of styrene and acrylic acid, the fluorescent latex particles is disclosed by introducing a fluorescent dye compound.
また、以下の特許文献3には、蛍光色素化合物とシランカップリング剤、シラン化合物を合成することで、蛍光色素化合物を含む蛍光シリカ微粒子が得られることが記載されている。 Further, Patent Document 3 below, a fluorescent dye compound and a silane coupling agent, to synthesize a silane compound, it is described that the fluorescent silica particles containing a fluorescent dye compound is obtained.

しかしながら、これらの蛍光ナノ微粒子は、蛍光色素化合物の導入量が少ないため、イムノクロマトキットで満足される発色性が得られておらず、また、粒子の保存中に粒子同士の凝集が起こってしまい、イムノクロマトキットで展開させたときに目詰まりや擬陽性を発生させてしまうといった問題点があった。 However, these fluorescent nanoparticles, because a small amount of introduction of fluorescent dye compound, not been obtained coloring property to be satisfied by the immunochromatography kit, also causes happening aggregation of particles during storage of the particles, there was a problem that would be generated clogging and false positives when was developed in the immunochromatographic kit.

WO2011/062157A1 WO2011 / 062157A1 特開2011−59003号公報 JP 2011-59003 JP 特開2011−252819号公報 JP 2011-252819 JP 特開平10−206428号公報 JP 10-206428 discloses

上記の従来技術の問題点に鑑み、本願発明が解決しようとする課題は、発色性が高く、粒子の分散安定性が良い蛍光セルロース微粒子を提供することである。 In view of the above problems, an object of the present invention is to provide a high coloring property is that the dispersion stability of the particles to provide a good fluorescence cellulose fine particles. また、これを診断薬、特に、ラテラルフローに適用することにより、イムノクロマトキットの高感度化を達成することである。 The diagnostic agent of this, in particular, by applying a lateral flow, to achieve a sensitivity of immunochromatography kit.

本発明者は、前記課題を達成すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、特定の形状及び粒径範囲のセルロース微粒子が、特定範囲の含有量で蛍光色素化合物を含有する場合に、該微粒子の分散安定性が向上し、更にイムノクロマトキットの高感度化が達成されることを見出し、かかる知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。 The present inventors, the problems intensive studies to achieve the result of repeated experiments, the cellulose fine particles of a particular shape and particle size range, if they contain a fluorescent dye compound at a content in a specific range, the fine particles dispersion stability is improved, further found that sensitivity of the immunochromatography kit is achieved, based on these findings, and have reached to complete the present invention.

すなわち、本発明は以下のとおりのものである。 That is, the present invention is of the following.
[1]蛍光色素化合物を含有率0.01%以上95%以下で含み、平均粒径が9nm以上700nm以下であり、CV値が30%以下であり、かつ、長径/短径の平均値が10未満であり、かつ、平均重合度が30以上700以下であることを特徴とする蛍光セルロース微粒子。 [1] includes a fluorescent dye compound is 95% or less content of 0.01% or more, average particle diameter is at 9nm than 700nm or less, and a CV value of 30% or less, and the average value of the major axis / minor axis less than 10 der is, and fluorescent cellulose fine particles having an average degree of polymerization, characterized in der Rukoto 30 or more 700 or less.

[2]セルロース以外の成分が化学結合又は物理吸着を介して担持されている、前記[1]に記載の蛍光セルロ−ス微粒子。 [2] the components other than the cellulose is carried through a chemical bond or physical adsorption, fluorescence cellulose according to the above [1] - scan microparticles.

[3]前記セルロース以外の成分が、他の成分と特異的に相互作用する物質である、前記[2]に記載の蛍光セルロース微粒子。 [3] components other than the cellulose, is another component which specifically interact with agents, fluorescent cellulose fine particles according to [2].

[4]前記セルロース以外の成分が生体材料である、前記[2]又は[3]に記載の蛍光セルロ−ス微粒子。 [4] components other than the cellulose is a biological material, a fluorescent cellulose according to [2] or [3] - scan microparticles.

[5]前記生体材料が、抗原又は抗体である、前記[4]に記載の蛍光セルロース微粒子。 [5] the biological material is an antigen or antibody, fluorescent cellulose fine particles according to [4].

[6]前記[1]〜[5]のいずれかに記載の蛍光セルロース微粒子を含む診断薬。 [6] a diagnostic agent containing a fluorescent cellulose fine particles according to any one of [1] to [5].

[7]前記セルロース以外の成分が検査対象物質と特異的に相互作用する物質である、前記[2]〜[4]のいずれかに記載の蛍光セルロース微粒子を含む、前記[6]に記載の診断薬。 [7] The components other than cellulose as a test substance which specifically interact with material comprising said fluorescent cellulose fine particles according to any one of [2] to [4], according to [6] diagnostic agents.

[8]免疫診断用の前記[6]又は[7]に記載の診断薬。 [8] the diagnostic agent according to the for immunodiagnostics [6] or [7].

[9]前記[6]〜[8]のいずれかに記載の診断薬と検体とを混合し、該検体中の検査対象物質を検出するステップを含む、インビトロ検体検出方法。 [9] The mixing a diagnostic agent and the specimen according to any one of [6] to [8], comprising the steps of detecting a test object substance in the specimen in vitro analyte detection methods.

[10]前記[6]〜[8]のいずれかに記載の診断薬を含む、イムノクロマト法による検出用のイムノクロマトキット。 [10] comprises a diagnostic agent according to any one of [6] to [8], immunochromatography kit for detection by immunochromatographic.

[11]前記[1]〜[5]のいずれかに記載の蛍光セルロース微粒子が液体に分散している分散液。 [11] The [1] ~ dispersion fluorescent cellulose fine particles are dispersed in a liquid according to any one of [5].

[12]前記[1]〜[5]のいずれかに記載の蛍光セルロース微粒子が固体表面に固定されているか又は固体中に分散されている成型体。 [12] The [1] to [5] molded bodies are dispersed or in solid state fluorescence cellulose fine particles according is fixed to a solid surface in any one of.

本発明の蛍光セルロース微粒子は、保存状態での粒子の分散安定性が良く、かかる蛍光セルロース微粒子をイムノクロマトキットに使用すると、高感度化が達成できる。 Fluorescence cellulose fine particles of the present invention has good dispersion stability of the particles in storage conditions, the use of such a fluorescent cellulose fine particles in immunochromatography kit, a high sensitivity can be achieved.

以下、本発明について、詳細に説明する。 The present invention will be described in detail.
本発明の蛍光セルロース微粒子は、蛍光色素化合物を含む。 Fluorescence cellulose fine particles of the present invention includes a fluorescent dye compound. 「含む」態様としては、物理的な包含や吸着、化学的な結合のいずれでも構わない。 The "comprising" manner, physical inclusion or adsorption may be either chemical bonds. 例えば、セルロースを、良溶媒に溶解し、凝固液と混合して微粒子を製造する際、凝固液に蛍光色素化合物を分散させておくと、物理的に蛍光色素化合物を含んだセルロース微粒子を製造することができる。 For example, cellulose is dissolved in a good solvent, when producing the particulates are mixed with coagulating liquid and allowed to disperse a fluorescent dye compound in a coagulation liquid, to produce a physically cellulose particles containing a fluorescent dye compound be able to. 一方、化学的に結合させる場合には、セルロースを微粒子状に成形した後に、セルロースの水酸基又はその一部を反応させて、蛍光色素化合物と共有結合させる方法や、予め蛍光色素化合物で結合させたセルロースを微粒子状に成形する等、任意の方法で作製することができる。 On the other hand, in the case of chemically bonding, after forming the cellulose particulate, by reacting a hydroxyl group or a part of cellulose, and methods of covalently attaching a fluorescent dye compound, it was bound in advance with a fluorescent dye compound etc. for molding the cellulose particulate can be produced by any method. 安定性の観点から、セルロース微粒子と蛍光色素化合物が化学結合する方法が好ましい。 From the viewpoint of stability, the cellulose particles and fluorescent dye compound is a method of chemical bond.

蛍光色素化合物の種類は特に限定されるものではないが、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、エステル基、カルボキシル基、マレイミド基、イソシアナ−ト基、イソチオシアナート基、シアノ基、ハロゲン基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基等の活性置換基を有するフルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、シアニン類の蛍光を発する化合物が挙げられる。 The type is not particularly limited fluorescent dye compounds, for example, N- hydroxysuccinimide ester group, an ester group, a carboxyl group, a maleimide group, Isoshiana - DOO group, isothiocyanate group, a cyano group, a halogen group, aldehyde group, p-nitrophenyl group, diethoxymethyl group, fluoresceins, having an active substituent such as an epoxy group, rhodamines, coumarins, include compounds fluoresce cyanines. 蛍光色素化合物としては、具体的には、フルオレン、フルオレン−9−酢酸、フルオレン−2カルボキシアルデヒド、9−フルオレン−1−カルボン酸、9−フルオレン−4−カルボン酸、9−フルオレンオキシム、炭酸9−フルオレメチルスクシンイミジル、9−フルオレトリフェニルホスホニウムブロミド、5−アミノフルオレセイン、ジソジウム8−アミノ−1,3,6−ナフタレントリスルホネ−ト水和物、スルホロ−ダミンB、エチジウムブロミド、6−アミノフルオレセイン、ロ−ダミンB、ロ−ダミン6G、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸アンモニウム、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸マグネシウム、2,3−ナフタレンジアルデヒド、カルセイン The fluorescent dye compound, specifically, fluorene, fluorene-9-acetic acid, fluorene -2-carboxaldehyde, 9-fluorene-1-carboxylic acid, 9-fluorene-4-carboxylic acid, 9-fluorene oxime, carbonate 9 - fluorenylmethyl methyl succinimidyl, 9-fluorenyl bromide, 5-amino-fluorescein, disodium 8-amino-1,3,6-naphthalene tricarboxylic sulfonates - DOO hydrate, Suruhoro - rhodamine B, ethidium bromide, 6-amino-fluorescein, Russia - rhodamine B, B - rhodamine 6G, 8-anilino-1-ammonium-naphthalenesulfonic acid, 8-anilino-1-naphthalene sodium sulfonate, 8-anilino-1-magnesium-naphthalenesulfonic acid, 2,3-naphthalene dicarboxylic aldehyde, calcein トリウム、カルセイン、クマリン102、クマリン314、クマリン343、AMCA、5−カルボキシフルオレセイン水和物、6−カルボキシフルオレセイン水和物、フルオレセインクロリド、2',7'−ジクロロフルオレセイン、2',7'−ジクロロフルオレセインナトリウム、2,3−ジアミノナフタレン、ジミジウムブロミド、2,3−ジフェニルマレK、フルオレセイン、ウラニン、フルオレセインジアセタート、クマリン−3−カルボン酸、7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸、4−ジメチルアミノアゾベンゼン−4'−カルボン酸、7−メトキシクマリン−3−カルボン酸、ピナシアノールクロリド、ピナシアノールヨージド、ピラニン、N−(1−ピレニル)マレイミド、ローダミン6G、ローダミンB、スルホンフルオレ Thorium, calcein, coumarin 102, coumarin 314, coumarin 343, AMCA, 5-carboxyfluorescein hydrate, 6-carboxyfluorescein hydrate, fluorescein chloride, 2 ', 7'-dichlorofluorescein, 2', 7'-dichloro sodium fluorescein, 2,3-diaminonaphthalene, Jimi ethidium bromide, 2,3-diphenyl Male K, fluorescein, uranine, fluorescein diacetate, coumarin-3-carboxylic acid, 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid, 4- dimethylamino-4'-carboxylic acid, 7-methoxy coumarin-3-carboxylic acid, pinacyanol chloride, pinacyanol iodide, pyranine, N-(1-pyrenyl) maleimide, rhodamine 6G, rhodamine B, sulfonic full me イン、7−メトキシクマリン−3−カルボン酸N−スクシンイミジル、テトラブロモフルオレセインカリウム、アシッドレッド87、2',4',5',7'−テトラブロモ−3,4,5,6−テトラクロロフルオレセイン、9H−フルオレン−2−イルイソシアナート、フルオレセイン5−イソチオシアナート、アシッドレッド92、3,4,5,6−テトラクロロフルオレセイン、テトラヨードフルオレセイン、エリスロシンB、5−(6−)カルボキシテトラメチルローダミン−NHSエステル、DYLIGHT−405−NHSエステル、DY550−NHSエステル、DY630−NHSエステル、DY−631、DY−633、DY−635、DY−636、DY−650、DY−651ーNHSエステル、DY−777ーNHSエ Inn, 7-methoxy-coumarin-3-carboxylic acid N- succinimidyl, tetrabromofluorescein potassium, Acid Red 87,2 ', 4', 5 ', 7'-tetrabromo-3,4,5,6-tetrachloro-fluorescein, 9H- fluoren-2-yl isocyanate, fluorescein 5-isothiocyanate, acid Red 92,3,4,5,6- tetrachlorofluorescein, tetraiodofluorescein, erythrosine B, 5- (6-) carboxytetramethylrhodamine -NHS ester, DYLIGHT-405-NHS ester, DY550-NHS ester, DY630-NHS ester, DY-631, DY-633, DY-635, DY-636, DY-650, DY-651 over NHS ester, Dy- 777 over NHS et テル(以上、Dy〜は、Dyomics社製)BODYIPY650/665、ROX、TAMRA、CFSE、Cyto350、Cyto405、Cyto415、Cyto488、Cyto500LSS、Cyto505、Cyto510SS、Cyto514LSS、Cyto520LSS、Cyto532、Cyto546S、Cyto555、Cyto590、Cyto610、Cyto610、Cyto633、Cyto647、Cyto670、Cyto680、Cyto700、Cyto750、Cyto770、Cyto780、Cyto800(以上、Cyto〜は、Cytodaiagnostics社製)が挙げられる。 Ether (above, Dy is, Dyomics Co.) BODYIPY650 / 665, ROX, TAMRA, CFSE, Cyto350, Cyto405, Cyto415, Cyto488, Cyto500LSS, Cyto505, Cyto510SS, Cyto514LSS, Cyto520LSS, Cyto532, Cyto546S, Cyto555, Cyto590, Cyto610, Cyto610, Cyto633, Cyto647, Cyto670, Cyto680, Cyto700, Cyto750, Cyto770, Cyto780, Cyto800 (or, Cyto~ is manufactured Cytodaiagnostics Corporation). これら蛍光色素化合物の蛍光波長としては、検出時に水や蛋白質の波長と重ならない400nm以上の範囲が好ましい。 The fluorescent wavelengths of these fluorescent dye compound, 400 nm or more in a range that does not overlap with the wavelength of water and protein preferably upon detection. 波長の上限は特に無く、波長としては高ければ高いほど好ましい。 It is no specific upper limit of the wavelength, preferably higher as the wavelength. より好ましくは500nm以上の範囲の蛍光色素化合物である。 More preferably a fluorescent dye compound in the range of more than 500 nm.

蛍光セルロ−ス微粒子と蛍光色素化合物との間の化学結合としては、セルロースの水酸基を蛍光色素化合物と直接連結させる方法や、スペーサーとして何らかの化合物を介して連結させる方法が挙げられる。 Fluorescent cellulose - The chemical bond between the scan fine particles and fluorescent dye compound, a method of linking the cellulose hydroxyl groups directly with a fluorescent dye compound, and a method of linking through some compound as a spacer. 蛍光色素化合物を多量に含有させる場合、直接連結させるだけでは限界があるが、スペーサーを介することで、多量の導入が可能になる。 Case of incorporating the fluorescent dye compound in a large amount, but only directly linked is limited, that through a spacer, allows a large amount of introduction. スペーサーを用いて連結させる場合、スペーサーの種類は特に限定されるものではないが、例えば、エピクロルヒドリン、2−クロロエタンアミン、11−クロロウンデカンチオール、ホルマリン、シランカップリング剤、エポキシ変性シリコーン系架橋剤、グリオキザール系レジン等の水酸基と反応する部分を2つ以上持つ化合物が挙げられる。 If linking using a spacer, but not the type of the spacer is not particularly limited to, epichlorohydrin, 2-chloroethane amine, 11-chloro undecane thiol, formalin, silane coupling agent, epoxy-modified silicone-based crosslinking agent, compound having two or more moiety that will react with the hydroxyl groups of glyoxal based resin and the like. また、本発明の蛍光セルロース微粒子は、着色されているものでも構わない。 The fluorescent cellulose fine particles of the present invention may be one that is pigmented.

本発明の蛍光セルロース微粒子の、蛍光色素化合物の含有量は0.01%以上95%以下である。 Fluorescence cellulose fine particles of the present invention, the content of the fluorescent dye compound is 95% or less than 0.01%. 0.01%未満であると、イムノクロマトキットの検出用微粒子として十分な発色性が得られない。 If it is less than 0.01% is not obtained sufficient color developability as a detection particle immunochromatographic kit. 他方、95%を超えると、粒子同士の凝集が起こってしまい、イムノクロマトキットで展開させると目詰まりを起こして使用ができなくなる。 On the other hand, when it exceeds 95%, will happening aggregation of particles, can not be used caused a when the deployed clogging immunochromatographic kit. 従来の蛍光ナノ粒子は、蛍光色素化合物を0.001%以上0.01%未満の範囲で含んでいるものが多いが、この範囲では、イムノクロマトキットとして、十分な感度は発現しない。 Conventional fluorescent nanoparticles, but many of them contain a fluorescent dye compound in a range of less than 0.01% 0.001% or more, in this range, as immunochromatography kit, sufficient sensitivity is not expressed. 本発明の蛍光セルロ−ス微粒子は、蛍光色素化合物の含有量が0.01%以上0.03%の辺りから、イムノクロマトキットの好適な高感度を達成できる。 Fluorescence cellulose of the present invention - scan particulates content of the fluorescent dye compound is from around 0.03% to 0.01%, can achieve a suitable highly sensitive immunochromatographic kit. 好ましい下限値は、0.04%以上、より好ましくは0.05%である。 A preferable lower limit value is 0.04% or more, more preferably 0.05%. また、好ましい上限値は、90%で、より好ましくは85%である。 Also preferred upper limit is 90%, more preferably 85%.

本発明における蛍光セルロース微粒子の原料は文字通りセルロースである。 Raw fluorescence cellulose fine particles in the present invention are literally cellulose. ここで、セルロース以外の原料を用いると、蛍光色素化合物導入時に、化学的な反応性の問題点から、十分な量の蛍光色素化合物を導入することができない。 Here, the use of materials other than cellulose, when a fluorescent dye compound introduced from the chemical reactivity of the problem, it is not possible to introduce a sufficient amount of a fluorescent dye compound. 例えば、特許文献4には、ラテックス粒子に着色剤を12%を超えて含ませると、イムノクロマトキットの細孔部に詰まるおそれが大きくなると記載されている。 For example, Patent Document 4, the inclusion of colorant exceeds 12% latex particles is described as a possibility that clogging in the pores of the immunochromatographic kit increases. もともとラテックスに、染料や蛍光化学物質を多量に導入することは困難を極めるが、もし多量に導入できたとしても、表面の構造が崩れて、真球度が極端に悪くなったりするため、染料や化学物質を多量に導入するためには、ラテックスは好ましくない。 Originally latex introducing a dye or fluorescent chemicals in large quantities is extremely difficult, but even possible if large amount of introduction, collapsed structure of the surface, since the sphericity may become extremely poor, dyes in order to introduce and chemicals in large quantities, the latex is not preferable. これに反し、セルロースは、染料や化学物質を多量に含有していても、構造を保つことが、特許文献1から示唆されている。 Contrary to this, cellulose, also the dyes and chemicals contained in a large amount, to keep the structure, has been suggested from US Pat. 従って、水酸基を豊富に有するセルロースであるからこそ、高い反応性及び高い含有量を達成することができる。 Therefore, precisely because a cellulose having abundant hydroxyl groups, it is possible to achieve a high reactivity and a high content. そのため、イムノクロマト用の検出用微粒子の素材としては、セルロースが適している。 Therefore, as the material of the detection particle for immunochromatography, cellulose is suitable. また、蛍光色素化合物の含有量は、蛍光色素化合物処理前後の重量変化から算出できる。 The content of the fluorescent dye compound, can be calculated from the weight change before and after the fluorescent dye compound treatment. 処理後の回収できた粒子の重量と処理前のセルロース微粒子の絶乾後の重量を用いて、蛍光色素化合物成分の割合を算出する。 Using weight after absolute dry cellulose particles of weight before and process could be recovered after processing particles, it calculates the ratio of fluorescent dye compound component.

また、処理前のセルロース微粒子の重量が不明である場合、蛍光セルロース微粒子をセルラーゼ処理、酸処理又は塩基処理をして重合度を低下させる。 Further, if the weight of the cellulose fine particles before the treatment is unknown, cellulase treatment fluorescent cellulose particles, to lower the degree of polymerization by an acid treatment or base treatment. その後、サンプルを重水に溶解させ、FT-NMRで13 C-NMRにより測定を行い、置換度を算出する。 Thereafter, the sample was dissolved in heavy water, it was measured by 13 C-NMR in FT-NMR, and calculates the degree of substitution. その置換度から、蛍光色素化合物の含有量を算出してもよい。 From the substitution degree may be calculated content of the fluorescent dye compound. その際、使用するセルラーゼ、酸、塩基としては、いずれかに限定されるものではないが、例えば、セルラーゼとしては、オノズカRS(ヤクルト薬品工業社製)、Cellsoft(ノボ・ノルディクス社製)、メイセラーゼ(明治製菓社製)、酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、塩基としては、アルカリが挙げられる。 At that time, cellulase used, acid, as the base, but it is not limited to any, for example, as a cellulase, (manufactured by Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) ONOZUKA RS, Cellsoft (Novo Norudikusu Inc.), meicelase (manufactured by Meiji Seika Kaisha, Ltd.), as the acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, as the bases include alkali. また、処理前のセルロース微粒子の重量が不明であり、かつ蛍光色素化合物が窒素原子を含有している場合には、窒素元素含有率を窒素定量装置CHNコーダーで、発光分析法により測定し、測定した窒素元素含有率から、含まれている蛍光色素化合物の含有量を算出してもよい。 The weight of the pre-treated cellulose particles is unknown, and when the fluorescent dye compound contains nitrogen atoms, the nitrogen element content in nitrogen quantification device CHN coder, were measured by emission spectrometry, measurement from the nitrogen element content may be calculated content of the fluorescent dye compound that contains.

本発明におけるセルロース微粒子の粒径とは、セルロース微粒子が液体に分散したセルロース微粒子分散液を、粒子粒度分布測定装置を用いて測定することによって得たものを指す。 The particle diameter of the cellulose fine particles in the present invention refers to those cellulose particles of the cellulose fine particle dispersion liquid dispersed in a liquid, was obtained by measuring using a particle size distribution measuring apparatus. 「平均粒径」とは、測定値の体積平均メジアン径の値を指す。 The "average particle size" refers to the value of volume average median diameter of the measured values. 粒度分布測定装置には各種の測定原理を応用したものがあるが、本発明では、動的光散乱法による粒度分布測定装置を用いる。 The particle size distribution measuring apparatus is an application of the various measurement principles, but in the present invention, a particle size distribution measuring apparatus by dynamic light scattering method. 後述するように、実施例では日機装社製の「ナノトラック粒度分布測定装置UPA−EX150」を用いた。 As described below, using a "Nanotrac particle size distribution measuring apparatus UPA-EX150" manufactured by Nikkiso Co., Ltd. in the embodiment. また、得られた体積換算粒径分布の標準偏差を平均粒径で割った値がCV値(Coefficient of Variationの略)であり、蛍光セルロ−ス微粒子の均一性を表す指標として用いられる。 The value of the standard deviation divided by the average grain size expressed in terms of volume particle size distribution obtained is CV value (abbreviation of Coefficient of Variation), fluorescent cellulose - used as an index representing the uniformity of the scan microparticles.

本発明における蛍光セルロ−ス微粒子の平均粒径は9nm以上700nm以下である。 Fluorescence cellulose in the present invention - an average particle size of the scan fine is 9nm or 700nm or less. 平均粒径がこの範囲であれば長期保存による沈降が生じにくく、イムノクロマトキットにも適する。 Average particle size is less likely to occur precipitation with long-term storage if this range, also suitable for immunochromatography kit. 診断薬として用いる場合は20nm以上700nm以下であることが好ましい。 It is preferable when used as a diagnostic agent is 20nm or more 700nm or less. 平均粒径が20nm以下になると、粒子同士が凝集して、イムノクロマトキットに使用した時に目詰まりを起こしてしまったり、イムノクロマトキットに使用した時に感度が出なかったりする。 When the average particle diameter is 20nm or less, and aggregated particles each other, or worse clogged when used in immunochromatography kit, or not out sensitivity when used in immunochromatography kit. また、700nmを超えると、イムノクロマトキットで展開した時、展開膜中で、目詰まりを起こしてしまう。 In addition, if more than 700nm, when deployed in the immunochromatography kit, in the developing membrane, it would cause clogging. 凝集しない分散安定性と、目詰まりをしない展開性を両立するための平均粒径の下限値は、より好ましくは30nm、更に好ましくは40nmである。 The lower limit of the average particle size to achieve both dispersion stability without aggregation, the deployable without clogging is more preferably 30 nm, more preferably from 40 nm. また、上限値は、好ましくは500nmであり、更に好ましくは400nmである。 The upper limit is preferably 500 nm, more preferably from 400 nm. ただし、イムノクロマトキットとしての感度を向上させるために、2種類以上の平均粒径の蛍光セルロ−スナノ微粒子を混合して用いても構わない。 However, in order to improve the sensitivity as immunochromatography kit fluorescence cellulose having an average particle size of 2 or more - it may be used by mixing Sunano microparticles.

本発明における蛍光セルロース微粒子とは、上記電子顕微鏡による蛍光セルロース微粒子の画像解析において、蛍光セルロース微粒子の短径と長径の比(長径/短径)が充分に小さいものを指す。 The fluorescent cellulose fine particles in the present invention, refers to those in the image analysis of fluorescent cellulose particles by the electron microscope, is sufficiently small minor axis and major axis of the ratio of fluorescence cellulose fine (major axis / minor axis). この比が大きすぎる棒状、繊維状または網目状のものは蛍光セルロ−ス微粒子には含まれない。 Rod-like this ratio is too large, those of fibrous or reticulated fluorescent cellulose - not included in the scan microparticles. イムノクロマトキット用の蛍光セルロース微粒子としての機能を発揮するためには蛍光セルロース微粒子100個の平均値の長径/短径=10.0未満である。 To function as a fluorescent cellulose fine particles of the immunochromatographic kit is major axis / minor axis = less than 10.0 100 mean fluorescence cellulose fine particles. この長径/短径が、10を超えると、イムノクロマトキットに使用したときに、展開せず、目詰まりを起こしたり、擬陽性を発生させる。 The major axis / minor axis is more than 10, when used in immunochromatography kit, without expanding, or clogged, to generate false positives. 真球度が高いと、高感度で検出し易くなる。 A high sphericity, easily detected with high sensitivity. 蛍光セルロース微粒子100個の長径/短径の平均値は、好ましくは5.0以下、より好ましくは3.0以下、更に好ましくは2.0以下である。 Average of 100 major axis / minor axis fluorescent cellulose fine particles is preferably 5.0 or less, more preferably 3.0 or less, more preferably 2.0 or less. この値が小さいほど蛍光セルロース微粒子の形状は真球状に近くなる。 The smaller the value the shape of the fluorescent cellulose fine becomes close to a spherical shape.

本発明における蛍光セルロース微粒子のCV値は30%以下である。 CV value of the fluorescence cellulose fine particles in the present invention is 30% or less. CV値が30%を超えると、検査対象物の量と粒径変化の不安定性が無視できなくなり、測定の正確性に悪影響が出る。 When the CV value exceeds 30% can not be ignored is the instability of the amount and particle diameter change of the inspection object, adversely affected the accuracy of the measurement. 好ましくは25%以下であり、更に好ましくは20%以下である。 Preferably 25% or less, more preferably 20% or less. CV値を低くすることは可能であるが、生産性の観点から、低すぎるのは好ましくない。 It is possible to lower the CV values, from the viewpoint of productivity, too low is not preferable. より好ましくはCV値が1%以上であり、更に好ましくは3%以上である。 More preferably CV value is 1% or more, more preferably 3% or more.

本発明における蛍光セルロース微粒子は、化学結合又は物理吸着を介して、セルロース以外の成分を担持させて利用することもできる。 Fluorescence cellulose fine particles in the present invention, via a chemical bond or physical adsorption, may also be utilized by supporting the components other than cellulose. 化学結合又は物理吸着の一例としては、共有結合、イオン結合、配位結合、金属結合、水素結合、親水結合、疎水結合、ファンデルワールス結合などが挙げられるがそれらに限定されるものではない。 An example of a chemical bond or physical adsorption, covalent bond, ionic bond, coordinate bond, metallic bond, hydrogen bond, hydrophilic bond, hydrophobic bond, do not the like Van der Waals bond and the like are limited to. 上記のような様々な力によって蛍光セルロース微粒子に、セルロース以外の成分を担持させることにより、蛍光セルロース微粒子にはない機能を持った微粒子を調製することが可能である。 Fluorescent cellulose fine particles by a variety of forces such as described above, by supporting a component other than cellulose, it is possible to prepare microparticles having a non fluorescent cellulose fine features. セルロースに蛍光色素を導入していないセルロース微粒子でも、セルロース以外の成分を担持させることは可能だが、置換基の種類を任意に変えることで、より様々な種類の成分を担持させることができる。 Even cellulose fine particles that do not introduce a fluorescent dye to the cellulose, but possible to carry the components other than cellulose, it arbitrarily changed the type of the substituent, it can be supported more different types of components.

本発明における蛍光セルロース微粒子に担持させる「セルロース以外の成分」とは、蛍光セルロ−ス微粒子以外の様々な物質を指し、その種類は特に限定されない。 The is supported on a fluorescent cellulose fine "component other than cellulose" in the present invention, a fluorescent cellulose - refers to various substances other than scan microparticles, and the kind thereof is not particularly limited. それらの一例としては、界面活性剤、無機微粒子、有機微粒子、生体材料、染料、イオン性物質、水溶性低分子、水溶性高分子、ブロッキング剤、等が挙げられるがそれらに限定されるものではない。 An example thereof, a surfactant, inorganic particles, organic particles, biomaterials, dyes, ionic substances, water-soluble low molecular, water soluble polymer, the blocking agent, in which it and the like is limited to the Absent. 本発明における蛍光セルロ−ス微粒子に担持させる「生体材料」とは、生体から得られる様々な材料を指し、その種類は特に限定されない。 Fluorescence cellulose in the present invention - the term "biological material" to be carried on the scan particulates, refers to a variety of material obtained from a living body, and the kind thereof is not particularly limited. それらの一例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブロイン、へパリン、ヒアルロン酸、デンプン、キチン、キトサン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂肪酸、テルペノイド、カロテノイド、テトラピロ−ル、補因子、ステロイド、フラボノイド、アルカノイド、ポリケチド、配糖体、酵素、抗体、抗原、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロースなどが挙げられる。 Examples thereof include collagen, gelatin, fibroin, heparin, hyaluronic acid, starch, chitin, chitosan, amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, carbohydrates, fatty acids, terpenoids, carotenoids, Tetorapiro - Le, cofactors, steroids, flavonoids , alkaloids, polyketide, glycoside, enzyme, antibody, antigen, carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, methyl cellulose and the like can be mentioned. それらを蛍光セルロース微粒子に担持させることで、蛍光セルロース微粒子の生体適合性の向上、各種バイオアッセイや診断薬としての利用等が可能となる。 Be to carrying them to the fluorescence cellulose fine particles, the improvement of biocompatible fluorescent cellulose particles, use such as various types of bioassays or diagnostic agent becomes possible.

本発明においては、蛍光セルロ−ス微粒子に、検査対象物質と特異的に結合する物質を担持させることにより、蛍光セルロ−ス微粒子を診断薬として用いることが可能となる。 In the present invention, a fluorescent cellulose - to scan fine particles, by supporting a test object substance and the substance specifically binding to a fluorescent cellulose - it is possible to use the scan fine particles as diagnostic agents.
本発明における検査対象物質とは、免疫血清検査、血液検査、細胞検査、遺伝子検査等の検査などにおける測定対象を指し、その種類は特に限定されない。 The test object substance in the present invention, immune serum test, blood test, cytoscopy, refers to the measurement object in such tests genetic testing or the like, the kind thereof is not particularly limited. 例えば、癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、TDM、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。 For example, a cancer marker, hormone, infection, autoimmunity, plasma protein, TDM, coagulation and fibrinolysis, amino acid, peptide, protein, gene, cell, and the like. より具体的には、CEA、AFP、フェリチリン、β2マイクロ、PSA、CA19−9、CA125、BFP、エラスターゼ1、ペプシノーゲン1・2、便潜血、尿中β2マイクロ、PIVKA−2、尿中BTA、インスリン、E3、HCG、HPL、LH、HCV抗原、HBs抗原、HBs抗体、HBc抗体、HBe抗原、HBe抗体、HTLV−1抗体、HIV抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ASO、A型インフルエンザ抗原、A型インフルエンザ抗体、B型インフルエンザ抗原、B型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、カンジダ抗原、CD菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、 More specifically, CEA, AFP, Ferichirin, .beta.2 micro, PSA, CA19-9, CA125, BFP, elastase 1, pepsinogen 1 · 2, fecal occult blood, urinary .beta.2 micro, PIVKA-2, urinary BTA, insulin , E3, HCG, HPL, LH, HCV antigen, HBs antigen, HBs antibody, HBc antibody, HBe antigen, HBe antibody, HTLV-1 antibody, HIV antibody, toxoplasma antibody, syphilis, ASO, A-type influenza antigen, A-type influenza antibody, B-type influenza antigen, B-type influenza antibody, rotavirus antigen, adenovirus antigen, rotavirus, adenovirus antigen, A group A streptococci, B streptococci, Candida antigen, CD fungi, crypto rocker scan antigen, cholera, meningitis bacteria antigen, granules bacteria elastase, Helicobacter pylori antibody, O157抗体、O157抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、MRSA、RF、総IgE、LEテスト、CRP、IgG,A,M、IgD、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、C3・C4、SAA、LP(a)、α1−AC、α1−M、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、APRスコア、FDP、Dダイマー、プラスミノーゲン、AT3、α2PI、PIC、PAI−1、プロテインC、凝固第X3因子、IV型コラーゲン、ヒアルロン酸、GHbA1c、各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種DNA、各種細胞等が挙げられる。 O157 antibody, O157 antigen, Leptospira antibody, Aspergillus antigen, MRSA, RF, total IgE, LE test, CRP, IgG, A, M, IgD, transferrin, urinary albumin, urinary transferrin, myoglobin, C3 · C4, SAA, LP (a), α1-AC, α1-M, haptoglobin, micro transferrin, APR score, FDP, D-dimer, plasminogen, AT3, α2PI, PIC, PAI-1, protein C, coagulation X3 factor, IV type collagen, hyaluronic acid, GHbA1c, various antigens, various antibodies, various viruses, various strains, various amino acids, various peptides, various proteins, various DNA, various cells, and the like.

本発明における検査対象物質と特異的に相互作用する物質とは、上記検査対象物質に対し、選択的に吸着や結合を行う物質を指し、その種類は特に限定されない。 The test object substance which specifically interact with materials in the present invention, with respect to the inspection target substance refers to a substance for selective adsorption and binding, the kind thereof is not particularly limited. 例えば、抗原、抗体、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、塩基配列等が挙げられる。 For example, antigens, antibodies, amino acids, peptides, proteins, nucleotide sequences, and the like. 特に、抗体を用いた場合は免疫血清検査における各種抗原の存在を検出することが可能になる。 Particularly, in the case of using the antibodies it is possible to detect the presence of various antigens in the immune serum test. 例えば、抗体を用いる場合であれば、その由来も特に限定されず、また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。 For example, in the case of using the antibodies, their origin is not particularly limited, and may be used either polyclonal antibodies, monoclonal antibodies. さらにそれら担持物質の結合方式も特に限定されるものではなく、物理吸着又は化学結合のいずれであってもよい。 Further coupling method thereof bearing material is also not particularly limited, and may be either physical adsorption or chemical bond. 担持させる際の手間を考えると物理吸着のほうが好ましく、担持後の安定性から考えると化学結合のほうが好ましい。 Towards the physical adsorption is preferred considering the labor at the time of carrying, considering the stability after carrying more chemical bond.

本発明において蛍光セルロース微粒子を診断薬として用いる際に、様々な溶液中に蛍光セルロース微粒子を分散させて用いることができるが、好ましくはPH=5.0以上11.0以下の緩衝液中に分散させた分散液が好ましい。 When used as a diagnostic agent fluorescence cellulose fine particles in the present invention, various although the solution fluorescence cellulose particles may be used by dispersing, preferably dispersed in a buffer solution of PH = 5.0 to 11.0 or less dispersion is preferred. 蛍光セルロース微粒を分散させる溶液としては、純水、有機溶媒を使用ができる。 The solution for dispersing the fluorescent cellulose fine, pure water, an organic solvent can be used. 例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、MES緩衝液、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられる。 For example, phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, borate buffer, citrate buffer, MES buffer, methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran and the like. 緩衝液の濃度は、特に限定されるものではなく、一般的に緩衝液として用いられる様々な濃度のものを用いることができる。 The concentration of the buffer is not particularly limited, and may be a generally different concentrations to be used as buffer. また、分散液中の蛍光セルロ−ス微粒子濃度も特に限定されるものではなく、検査対象物質の種類、性質、濃度、などに応じて適宜調整して使用することが可能である。 The fluorescent cellulose in the dispersion - scan particle concentration is also not particularly limited, the kind of inspection target substance, nature, concentration, it is possible to use appropriately adjusted to depending on. 分散液中の蛍光セルロ−ス微粒子濃度は、低すぎると視認性が悪く、高感度化が達成できないので、0.001以上、より好ましくは0.002%以上が好ましい。 Fluorescence cellulose in the dispersion - scan particulate concentration, visibility too low poor, since high sensitivity can not be achieved, less than 0.001, more preferably 0.002% or more. 一方、濃度が高すぎると、凝集してしまい展開不良が発生し、高感度が望めないので10%以下程度が好ましく、より好ましくは1.0%以下である。 On the other hand, if the concentration is too high, agglomeration and will expand failure occur, preferably about 10% or less because not be expected high sensitivity, more preferably 1.0% or less.

本発明において蛍光セルロース微粒子を診断薬として用いる際に、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために様々な増感剤を用いても構わない。 When using fluorescent cellulose fine as a diagnostic agent in the present invention, it may be used various sensitizers for promoting improvement and antigen-antibody reaction measurement sensitivity. また、検体中に存在する他の物質によって引き起こされる非特異吸着を抑制するためにブロッキング剤などを用いても構わない。 Further, the like may be used blocking agents to inhibit non-specific adsorption caused by other substances present in the sample.
本発明における蛍光セルロース微粒子は、診断薬のように任意の液体中に分散させて用いることもできるが、その他任意の固体中に分散させて用いることや、固体表面に微粒子を固定化させて用いること等も可能である。 Fluorescence cellulose fine particles in the present invention can also be used dispersed in any liquid as diagnostic agents, it or used dispersed in any other solid, used the fine particles are immobilized on a solid surface ancient city, etc. is also possible. また蛍光セルロース微粒子を着色することにより、粒子の視認性を向上させたり、検出感度を向上させたりすることも可能である。 Further, by coloring the fluorescent cellulose particles, or to improve the visibility of the particles, it is possible or to improve the detection sensitivity.

本発明における蛍光セルロース微粒子の素材の製造方法は特に限定されない。 Material production method of a fluorescent cellulose fine particles in the present invention is not particularly limited. 湿式粉砕等による力学的な手法用いて、分級して所望の平均粒径の微粒子を得てもよいが、本発明ではセルロースをその良溶媒に溶解し、水、有機溶媒、アンモニア等を混合した凝固液を用いることでセルロース微粒子を調製している。 Using mechanical method by wet grinding or the like, classified to be obtained fine particles of the desired average particle size, but in the present invention by dissolving cellulose in the good solvent, and mixed water, organic solvent, ammonia, etc. and preparing a cellulose fine particles by using a coagulating liquid. この方法を用いることにより得られるセルロ−ス微粒子の粒径を凝固液の組成によって調整することが可能となる。 It is obtained by using this method cellulose - it is possible to adjust the particle size of the scan fine by the composition of the coagulating liquid. 本発明の蛍光セルロース微粒子の素材の製造方法を限定することを意図しないが、以下、製造方法1と2として例示する。 Are not intended to limit the manufacturing method of the material of the fluorescent cellulose fine particles of the present invention will now be exemplified as the manufacturing method 1 and 2.

[製造方法1:セルロース微粒子の作製] [Production Method 1: Preparation of Cellulose fine particles]
セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。 Dissolving cellulose linters in a good solvent for cellulose. 本発明では良溶媒として公知の方法で調整した銅アンモニア溶液を用いる。 In the present invention using a cuprammonium solution prepared by a known method as a good solvent. そして凝固液としては有機溶媒+水+アンモニア混合系を主に用いる。 The main use of organic solvent + water + ammonia mixed system as the coagulating liquid. この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロ−ス溶液を加えて凝固を行う。 While stirring the coagulating solution, the cuprammonium cellulose had been prepared - performing coagulation by adding a scan solution. さらに硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロ−ス微粒子を含有したスラリーを得ることができる。 Further neutralized with sulfuric acid, by performing the playback, an object of the cellulose - it is possible to obtain a slurry containing scan microparticles. この際スラリーは再生に用いた酸の残留により酸性であり、さらに中和で発生したアンモニウム塩などの不純物を含んでいるため、セルロース微粒子と媒体からなるセルロース分散液へと精製する操作が必要となる。 The residual acid using this time the slurry to watch an acidic, because it contains impurities such as more ammonium salts generated by the neutralization, require purification operations into cellulose dispersion of cellulose particles and medium Become. 本発明ではこの精製操作として遠心分離−デカンテーション−分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。 In the present invention a centrifugal separator as this purification operation - decantation - using repetition of the process of dilution with a dispersion medium liquid. この際に用いる分散媒液体の種類も特に限定されず、目的に応じて前出の様々な親水性の溶媒を用いることが可能である。 Type of the dispersion medium liquid used in this case is not particularly limited, it is possible to use various hydrophilic solvents supra depending on the purpose. 得られたセルロース微粒子分散液中のセルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。 Cellulose fine particles of the obtained cellulose fine particle dispersion, because in some cases to agglomerate in the course of purification, in this case, it is possible to perform the distributed processing due to shear. 本発明では剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。 In the present invention using a high-pressure homogenizer as a means of providing the shear. このようにして得られたセルロース微粒子分散体を粒度分布測定装置を用いて、平均粒径及びCV値を測定する。 Thus the cellulose fine particle dispersion obtained by using a particle size distribution measuring apparatus, measuring the average particle diameter and CV value. 得られたセルロース微粒子分散体は必要に応じて界面活性剤を添加して用いることもできる。 The obtained cellulose fine particle dispersion may also be used by adding a surfactant as necessary. セルロース微粒子分散液はそのままの状態でネバードライのまま用いることも可能であり、必要に応じて乾燥を行うことでセルロース微粒子に調製することができる。 Cellulose fine particle liquid dispersion is also possible to use remain never dry as it is, can be prepared in the cellulose fine particles by performing drying if necessary. 得られたセルロース微粒子を、電子顕微鏡を用いて観察し、その画像から真球度及び凝集定数を測定する。 The obtained cellulose fine particles were observed using an electron microscope, to measure the sphericity and aggregation constant of the image. さらにセルロース微粒子をカドキセン溶液に溶解させ、その粘度から平均重合度を測定する。 Furthermore dissolved cellulose fine particles in cadoxen solution, measuring the average degree of polymerization from its viscosity. ここで、蛍光セルロース微粒子製造に適したセルロース微粒子の平均重合度は、30以上700以下である。 The average degree of polymerization of the cellulose fine particles suitable for fluorescent cellulose fine preparation is 30 or more 700 or less. ここで、平均重合度が30未満であると、粒子の均一性がなくなってしまうため、CV値が上昇してしまい、イムノクロマトキットに使用したときに、品質が安定しない。 Here, the average polymerization degree is less than 30, since there would be no uniformity of the particles will be CV value increases, when used in immunochromatography kit, the quality is not stable. 一方、平均重合度が700を超えると、蛍光色素化合物を物理的に包含させ、また、化学結合させようとしてもセルロ−スの結晶性結晶化度が高いため、目的の導入量まで蛍光色素化合物を含有させることができない。 On the other hand, when the average polymerization degree exceeds 700, the fluorescent dye compound physically included, also cellulose in an attempt to chemically bond - due to high scan crystallinity crystallinity of the fluorescent dye compound to the introduced amount of interest It can not be contained. よって、本発明の蛍光セルロース微粒子は、染色する前のセルロース微粒子の重合度と、平均粒径を本発明の範囲にコントロールすることによって、はじめてイムノクロマトキットに好適な蛍光セルロース微粒子を製造することができる。 Therefore, fluorescence cellulose fine particles of the present invention, the polymerization degree of the front of the cellulose particles to be dyed, by controlling the average particle size in the range of the present invention, it is possible for the first time produce suitable fluorescent cellulose fine particles in immunochromatography kit . 蛍光セルロース微粒子を製造するためには、セルロース微粒子の平均重合度の下限値は好ましくは35以上、より好ましくは40以上である。 To produce the fluorescent cellulose fine particles, the lower limit of the average polymerization degree of the cellulose fine particles preferably 35 or more, more preferably 40 or more. また好ましい上限値は650、より好ましくは600である。 The upper limit is preferably 650, more preferably 600.

[製造方法2:蛍光セルロ−ス微粒子の作製] [Production Method 2: fluorescent cellulose - Preparation of the scan fine particles]
上記製造方法1で作製したセルロース微粒子を、有機溶媒に添加し、分散させる。 The cellulose particles produced by the above production method 1, was added to the organic solvent, it is dispersed. このセルロース微粒子は、着色されたものでも構わない。 The cellulose fine particles may be those that are colored. また、ここで、有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、シクロヘキサン、シクロペンタン、テトラヒドルフラン、トルエン、ヘキサン、水等が挙げられ、蛍光色素化合物の種類に応じて1種類又は2種類以上の混合液として用いることができる。 Further, Examples of the organic solvents, such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, butanol, pentanol, hexanol, diethyl ether, isopropyl ether, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, ethyl acetate, methyl acetate, methyl ethyl ketone, cyclohexane, cyclopentane, tetrahydroborate furan, toluene, hexane, water and the like, can be used as one or more kinds of mixed liquid according to the type of fluorescent dye compound. また、本発明の蛍光セルロース微粒子の原料となるセルロース微粒子は、セルロースII結晶型をとっているため、結晶化度が低く、それによって、従来のラテックス粒子やシリカ粒子の蛍光色素導入量よりも大幅に増量することができる。 The cellulose particles as a raw material for fluorescent cellulose fine particles of the present invention, since the taking of cellulose II crystal form, crystallinity is low, thereby significantly than fluorescent dye introduction amount of conventional latex particles and silica particles it can be increased to. また、蛍光色素導入量を増やすために、セルロースを物理的もしくは化学的に改質して、アミノ基やチオール基を導入してから、蛍光色素化合物と反応させてもよい。 Further, in order to increase the fluorescent dye introduced amount, cellulose physical or chemically reformed, since the introduction of the amino group or a thiol group may be reacted with a fluorescent dye compound.

このセルロース微粒子を含んだ溶液に、蛍光色素化合物を添加してから、適宜、添加剤を加えたり、pHを調整したり、加温、冷却したりする。 The solution containing the cellulose particles, after the addition of a fluorescent dye compound, suitably, or adding an additive, to adjust the pH, heating, or cooling. スラリーは反応に用いた蛍光色素化合物等の未反応物や副生成物が残留しており、蛍光セルロース微粒子と媒体を精製する操作が必要となる。 The slurry is unreacted substances and by-products of fluorescent dye compounds used in the reaction may remain, it is necessary to operate to purify the fluorescent cellulose fine and medium. 本発明ではこの精製操作として遠心分離−デカンテーション−分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。 In the present invention a centrifugal separator as this purification operation - decantation - using repetition of the process of dilution with a dispersion medium liquid. この際に用いる分散媒液体の種類も特に限定されず、目的に応じて前記した様々な親水性又は親油性の溶媒又は溶液を用いることができる。 Type of the dispersion medium liquid used in this case is not particularly limited, a solvent may be used or a solution of various hydrophilic or lipophilic and the according to the purpose.
以上のような工程を経て、本発明の蛍光セルロース微粒子を製造することができる。 Through the steps described above, it is possible to produce a fluorescent cellulose fine particles of the present invention.

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものでない。 Hereinafter is a description of specifics of the present invention to examples, the present invention is not in any way limited by the examples. なお、実施例中の主な測定値は以下の方法で測定した。 The main measurements in the examples were measured by the following method.

<平均粒径(nm)の測定及びCV値(%)の算出方法> <Method of calculating the measurement and the CV value of the average particle diameter (nm) (%)>
処理前のセルロース微粒子及び蛍光セルロース微粒子の分散液を、日機装株式会社製粒度分布計マイクロトラックを用いて、粒度分布測定を実施し、平均粒径を測定した。 The dispersion of the cellulose particles and fluorescent cellulose fine particles before the treatment, by using a Nikkiso Microtrac manufactured by particle size distribution analyzer, Inc., conducted a particle size distribution measurement was determined an average particle size. 尚、CV値は下記式(1)により算出する。 Incidentally, CV value is calculated by the following equation (1). また、測定は、測定時間30秒で、積算回数99回で実施した。 The measurement is a measurement time of 30 seconds was carried out at accumulated number 99 times.
CV値(%)=(粒度分布測定装置より求めた体積粒度分布における標準偏差)/(粒度分布測定装置より求めた体積平均メジアン径)×100 式(1) CV value (%) = (standard deviation in particle size distribution measuring apparatus from the obtained volume particle size distribution) / (volume average obtained from a particle size distribution measuring apparatus median diameter) × 100 Equation (1)

<平均重合度の測定及び算出方法> <Measurement and calculation method of the average degree of polymerization of>
セルロース微粒子をカドキセンに溶解した希薄セルロース溶液の比粘度をウベローデ型粘度計で測定し、その極限粘度数[η]から以下の粘度式(2)と換算式(3)により算出した値を平均重合度として採用した(参考文献:Eur.Polym.J.,1, 1 (1996))。 The specific viscosity of a dilute cellulose solution prepared by dissolving the cellulose fine particles in cadoxen is measured by a Ubbelohde viscometer, average polymerization the calculated value by the intrinsic viscosity [eta] following viscosity equation (2) and conversion formula (3) It was adopted as a degree (reference:. Eur.Polym.J, 1, 1 (1996)).
極限粘度数[η]=3.85×10 −2 ×M 0.76式(2) Intrinsic viscosity [η] = 3.85 × 10 -2 × M W 0.76 Equation (2)
平均重合度(DP)=M /162 式(3) Average degree of polymerization (DP) = M W / 162 Equation (3)

<蛍光色素化合物の含有量> <Content of the fluorescent dye compound>
蛍光セルロース微粒子に対する蛍光色素化合物成分の割合は、蛍光色素化合物処理前後の重量変化から算出できる。 The proportion of a fluorescent dye compound component relative fluorescence cellulose fine particles can be calculated from the weight change before and after the fluorescent dye compound treatment. 処理後の回収できた粒子の重量と処理前のセルロース微粒子の絶乾後の重量を用いて、以下の式(4)から蛍光色素化合物成分の割合を算出した。 Using weight after absolute dry cellulose particles of weight before and process could be recovered after processing particles was calculated the ratio of fluorescent dye compound component from the following equation (4).
蛍光色素化合物含有量(%)=1−{(処理前のセルロース微粒子の重量)/(蛍光色素化合物処理後の蛍光セルロース微粒子の重量)}×100 式(4) Fluorescent dye compound content (%) = 1 - {(weight before treatment Cellulose particles) / (fluorescence weight of a fluorescent cellulose fine particles after the dye compound treatment)} × 100 Formula (4)

(処理前のセルロース微粒子の重量が不明である場合) (If the weight of the pretreated cellulose fine particles is unknown)
蛍光セルロース微粒子をセルラーゼ処理、酸処理又は塩基処理をしてから、サンプルを重水に溶解させ3〜5wt%重水溶液を調製し、FT-NMRで13 C-NMR(Avance 400MHz)により測定を行い、置換度を算出する。 Fluorescence cellulose fine particles after the cellulase treatment, acid treatment or base treatment, the samples were prepared 3~5Wt% deuterium oxide solution was dissolved in heavy water, was measured by 13 C-NMR in FT-NMR (Avance 400MHz), to calculate the degree of substitution. 置換度はセルロースのC1のピーク面積を基準とし、蛍光色素化合物のピーク面積から算出する。 The substitution degree with respect to the peak area of ​​C1 cellulose, calculated from the peak area of ​​the fluorescent dye compound. その置換度と蛍光色素化合物の分子量から、蛍光色素化合物の含有量を算出する。 From the molecular weight of the degree of substitution and a fluorescent dye compound, to calculate the content of the fluorescent dye compound.

(処理前のセルロース微粒子の重量が不明であり、かつ蛍光色素化合物が窒素原子を含有している場合) (Weight of the pre-treated cellulose particles is unknown, and if the fluorescent dye compound contains a nitrogen atom)
窒素元素含有率を、窒素定量装置CHNコーダー(ヤナコ分析工業社製)を用いて下記測定条件で発光分析法により測定する。 Nitrogen element content is measured by emission spectrometry in the following measurement conditions using nitrogen quantification device CHN coder (manufactured by Yanako Analytical Industry Co., Ltd.). 測定した窒素元素含有率から、含まれている蛍光色素化合物の含有量を算出する。 From the measured nitrogen element content to calculate the content of the fluorescent dye compound that contains.
測定方式:自己積分方式 キャリアーガス:ヘリウム 助燃ガス:高純度酸素 助燃方式:ヘリウム、酸素混合方式 Measurement method: Self integration method Carrier gas: helium supporting gas: high-purity oxygen co 燃方 formula: helium, oxygen mixing method

<イムノクロマト評価の感度の判定方法> <Method of determining the sensitivity of Immunochromato evaluation>
発色の判定方法は、イムノクロマトキットのメンブレンを露出させ、レーザーダイオードを用いて励起を行い、フォトダイオードで蛍光を受光することでメンブレンの蛍光プロファイルを取得した。 Method of determining the color development to expose the membrane immunochromatography kit performs excited using laser diodes were obtained membrane fluorescence profiles by receiving fluorescence photodiode. 得られた蛍光プロファイルからテストライン、コントロールラインの感度を評価した。 The resulting test line from the fluorescence profile was assessed the sensitivity of the control line. 評価基準として、テストラインにて、発色が認められない場合を(−)、発色が認められる場合を(+)とした。 As evaluation criteria, at the test line, a case in which color is not observed (-), was a case where the color is recognized as (+).

[実施例1] [Example 1]
セルロース濃度0.37wt%、銅濃度0.13wt%、アンモニア濃度1.00wt%の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。 Cellulose concentration 0.37 wt%, copper concentration 0.13 wt%, to prepare ammonia concentration 1.00 wt% of cuprammonium cellulose solution. さらにテトラヒドロフラン濃度87.5wt%、水濃度12.5wt%、の凝固液を調製した。 Further tetrahydrofuran concentration 87.5wt%, water concentration 12.5 wt%, and the coagulation liquid preparation.
マグネティックスターラーを用い凝固液5000gをゆっくり攪拌しながら、これに、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液500gを添加した。 While slowly stirring the coagulating solution 5000g using a magnetic stirrer, to which was added cuprammonium cellulose solution 500g which had been prepared. 5秒程度攪拌を継続した後10wt%の硫酸1000gを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー6500gを得た。 5 seconds to stir the 10 wt% sulfuric acid 1000g was continued for adding neutralizing performs reproduction to obtain a slurry 6500g containing cellulose particles.

得られたスラリーを10000rpmの速度で10分間遠心分離した。 The resulting slurry was centrifuged for 10 minutes at 10000rpm speed. 沈殿物をデカンテーションにより取り出し、超純水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。 The precipitate was taken out by decantation, and stirred by injecting ultrapure water, and centrifuged again. PHが6.0〜7.0になるまでこの操作を数回繰り返し、その後高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液150gを得た。 PH repeats this operation several times until the 6.0 to 7.0, then subjected to dispersion treatment by a high-pressure homogenizer, to obtain a cellulose fine particle dispersion 150 g. 凍結乾燥により、乾燥したセルロース微粒子を得た。 Lyophilization provided the dried cellulose particles. 得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、205nmであった。 Results of average particle size of the obtained cellulose fine particles were measured, it was 205 nm. また、そのCV値は18%であった。 In addition, the CV value was 18%. 得られたセルロース微粒子分散液を、遠心分離して脱水した後、メタルコンタクト法による凍結乾燥を行った。 The obtained cellulose fine particle dispersion liquid, was dehydrated by centrifugation, followed by freeze-drying by a metal contact method. なお、このときのセルロース微粒子の重合は200、長径/短径は1.9だった。 Incidentally, the polymerization of the cellulose fine particles in this case 200, major axis / minor axis was 1.9.

ナス型ガラスフラスコに、分散媒体としてテトラヒドロフラン50gを加え、DY−651−NHSエステル(Dyomics社製)を1.0g添加して、30℃、マグネットスターラーで、攪拌した。 Eggplant type glass flask, tetrahydrofuran 50g added as a dispersion medium, DY-651-NHS ester (Dyomics Co., Ltd.) was added 1.0 g, 30 ° C., with magnetic stirrer, and stirred. そこに、乾燥させたセルロース微粒子0.50gを加え、トリエチルアミン(東京化成工業社製)を1.0ml添加した。 There, the cellulose particles 0.50g of dried addition, triethylamine (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added 1.0ml. そのまま攪拌を行い、2時間後に攪拌を終了し、遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈を数回繰り返し、PHを6.0〜7.0とし、さらに高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、蛍光セルロース微粒子分散液100gを得た。 It performs stirring, to exit the stirring after 2 hours, using a centrifuge, decanting - repeated several times dilution with deionized water, the PH and 6.0 to 7.0, further dispersion treatment by a high-pressure homogenizer It was carried out to obtain a fluorescent cellulose fine particle dispersion liquid 100g. 得られた蛍光セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、208nmだった。 Results of average particle size of the obtained fluorescent cellulose particles was measured, it was 208 nm. また、そのCV値は19%で、長径/短径は1.5であった。 Also, the CV value was 19%, the major axis / minor axis was 1.5. 処理後の蛍光セルロース微粒子の蛍光色素の含有率は1.0%だった。 The content of the fluorescent dye of a fluorescent cellulose fine particles after the treatment was 1.0%. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例2〜6] [Example 2-6]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の平均粒径を、変化させて処理した以外は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, the average particle diameter of the cellulose fine, except treated with varying, in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例7〜10] [Example 7-10]
蛍光色素化合物処理時に、蛍光色素化合物の添加量を、変化させて処理する以外は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, the amount of fluorescent dye compound, except that the processing is changed, in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例11〜12] [Example 11 to 12]
実施例1で得た蛍光色素化合物導入前のセルロース微粒子を、ナス型ガラスフラスコに、分散媒体としてテトラヒドロフラン50gと10wt%水酸化ナトリウム水溶液を1.0g加えて、2−クロロエタンアミン又は11−クロロウンデカンチオールを1.0g添加して、ガラス製還流管を取り付け、水道水を還流させ冷却しながら、マグネットスターラーで、60℃、3時間攪拌した。 A fluorescent dye compound before introduction of the cellulose fine particles obtained in Example 1, an eggplant type glass flask was added 1.0g of tetrahydrofuran 50g and 10 wt% sodium hydroxide aqueous solution as a dispersion medium, 2- chloroethane amines or 11-chloro undecane the thiol was added 1.0 g, fitted with a glass reflux tube, while cooling to reflux tap water, with magnetic stirrer, 60 ° C., and stirred for 3 hours. この後、遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈、洗浄を行った。 Thereafter, using a centrifuge, decanting - diluted with deionized water, followed by washing. その後の洗浄、分散処理は実施例1と同様に実施し、改質したセルロース微粒子を得た。 Subsequent washing, dispersion treatment is carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a modified cellulose particles. その後は、実施例1と同様の方法で、蛍光色素化合物を導入し、蛍光セルロース微粒子を製造した。 Thereafter, in the same manner as in Example 1, by introducing a fluorescent dye compound, it was prepared a fluorescent cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例13] Example 13
蛍光色素化合物処理時、ナス型ガラスフラスコに、分散媒体としてテトラヒドロフランを加え、DY−651−NHSエステルを10gとγ−アミノプロピルトリエトキシシラン10g添加して、ガラス製還流管を取り付け、水道水を還流させ冷却しながら、マグネットスターラーで、60℃、3時間攪拌した。 When fluorescent dye compound treatment, the eggplant type glass flask, tetrahydrofuran was added as a dispersion medium, DY-651-NHS ester 10g and γ- aminopropyltriethoxysilane 10g was added, fitted with a glass reflux tube, tap water reflux cooling, with magnetic stirrer, 60 ° C., and stirred for 3 hours. そこに、乾燥処理後のセルロース微粒子0.50gと、トリエチルアミン(東京化成工業社製)を1.0ml添加し、2時間攪拌を行った。 In there, and the cellulose particles 0.50g after drying treatment, triethylamine (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added 1.0ml, was carried out for 2 hours with stirring. その混合分散液を、遠心分離で、溶媒を取り除いた後、ナスフラスコをオーブンに入れて、120℃で5分間熱処理を行った。 The mixed dispersion, by centrifugation, after removal of the solvent, the recovery flask placed in an oven and subjected to 5 minutes heat treatment at 120 ° C.. この後、遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈、洗浄を行った。 Thereafter, using a centrifuge, decanting - diluted with deionized water, followed by washing. その後の洗浄、分散処理は実施例1と同様に実施した。 Subsequent washing, dispersion treatment was performed in the same manner as in Example 1. 得られた蛍光セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、280nmで、長径/短径は1.2であり、CV値は19%であった。 The average particle diameter results of measurement of the resulting fluorescence cellulose particles, at 280 nm, major axis / minor axis is 1.2, CV value was 19%. 処理後の蛍光セルロース微粒子の蛍光色素の含有率は20%であった。 The content of the fluorescent dye of a fluorescent cellulose fine particles after the treatment was 20%. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例14] [Example 14]
蛍光色素化合物処理時に、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの量を変化させて処理した他は、実施例13と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, other treated with varying amounts of γ- aminopropyltriethoxysilane, in the same manner as in Example 13, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例15〜19] [Example 15 to 19]
蛍光色素化合物処理時に、蛍光色素化合物の種類を変えて処理した他は、実施例11と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, addition of processing by changing the kinds of fluorescent dye compound, in the same manner as in Example 11, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[実施例20〜24] [Example 20 to 24]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の重合度を変化させて処理した他は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, other treated with varying degree of polymerization of the cellulose fine particles in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例1と2] [Comparative Example 1 and 2]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の平均粒径を本発明の範囲外に変えて処理した他は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, addition of processing an average particle size of the cellulose fine particles is changed outside the scope of the present invention, in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例3] [Comparative Example 3]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の平均粒径を本発明の範囲外に変えて処理した他は、実施例13と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, addition of processing an average particle size of the cellulose fine particles is changed outside the scope of the present invention, in the same manner as in Example 13, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例4と5] [Comparative Example 4 and 5]
蛍光色素化合物処理時に、蛍光色素化合物の添加量を本発明の範囲外に変えて処理した他は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, addition of processing the amount of fluorescent dye compound instead of outside the scope of the present invention, in the same manner as in Example 1, it was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例6] [Comparative Example 6]
蛍光色素化合物処理時に、蛍光色素化合物の添加量を本発明の範囲外に変えて処理した他は、実施例13と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, addition of processing the amount of fluorescent dye compound instead of outside the scope of the present invention, in the same manner as in Example 13, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例7と8] Comparative Example 7 and 8]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の重合度を変化させて処理した他は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, other treated with varying degree of polymerization of the cellulose fine particles in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 得られた粒子は、CV値(%)と蛍光色素化合物含有量(%)のいずれかに関して、本発明の範囲外のものとなった。 The resulting particles, CV value (%) and a fluorescent dye compound content with respect to any one of (%) became outside the scope of the present invention. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例9] [Comparative Example 9]
蛍光色素化合物処理時に、セルロース微粒子の重合度を変化させて処理した他は、実施例13と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 When fluorescent dye compound treatment, other treated with varying degree of polymerization of the cellulose fine particles in the same manner as in Example 13, was produced fluorescence cellulose fine particles. 得られた粒子は、蛍光色素化合物含有量(%)に関して本発明の範囲外のものとなった。 The resulting particles became outside the scope of the present invention with respect to a fluorescent dye compound content (%). 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[比較例10と11] [Comparative Example 10 and 11]
セルロース微粒子の長径/短径が10以上のものを用いて、蛍光セルロース微粒子を製造した他は、実施例1と同様の方法で、蛍光セルロース微粒子の製造を行った。 Major axis / minor axis of the cellulose particles are used as more than 10, except that to produce a fluorescent cellulose fine particles in the same manner as in Example 1, was produced fluorescence cellulose fine particles. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below.

[蛍光セルロース微粒子の分散安定性試験] [Dispersion stability test of a fluorescent cellulose fine particles]
実施例1〜24、及び比較例1〜11で得た蛍光セルロース微粒子を純水に分散させ1.0wt%に調整したものを、ポリプロピレン製のスクリュー管に25℃で、暗所に3ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間、保存したもののCV値をそれぞれ測定し、分散安定性試験を実施した。 Those adjusted Examples 1 to 24, and a fluorescent cellulose fine particles obtained in Comparative Examples 1 to 11 in pure water was dispersed in 1.0 wt%, at 25 ° C. in a screw tube made of polypropylene, 3 months in the dark , 6 months, 12 months, saved although the CV value were measured, respectively, dispersing was carried out stability tests. 結果を以下の表1に示す。 The results shown in Table 1 below. 表1に示す結果から、実施例1〜24で得た蛍光セルロース微粒子は、比較例1〜11で得たもの比較して、分散安定性が概ね良好であることが分かる。 From the results shown in Table 1, the fluorescent cellulose fine particles obtained in Examples 1 to 24, compared those obtained in Comparative Examples 1 to 11, it can be seen the dispersion stability is generally good.

[蛍光セルロース微粒子を用いて作製したイムノクロマトキットにおける発色強度試験] [Color strength test in immunochromatographic kit prepared by using the fluorescent cellulose fine particles]
得られた蛍光粒子を用いて、イムノクロマトキットを作製、発色強度を評価した。 The resulting fluorescent particles using, prepared immunochromatography kit was evaluated color intensity.
以下、イムノクロマトキットの作製について説明する。 The following describes the preparation of immunochromatography kit.
濃度5mg/mlの蛍光セルロース微粒子(実施例1〜24、比較例1〜11)の分散液100μL(分散媒:蒸留水)及び50mM KH 2 PO 4 (pH7.0)390μLをマイクロチューブに加えて軽く撹拌した。 Concentration 5 mg / ml of the fluorescent cellulose fine (Examples 1 to 24 and Comparative Examples 1 to 11) Dispersion 100μL of: added (dispersion medium distilled water) and 50 mM KH 2 PO 4 and (pH 7.0) 390MyuL microtubes lightly stirred. 前記マイクロチューブに抗hCG抗体(Anti−hCG clone codes/5008,Medix Biochemica社製)10μL(5.8mg/mL)を加え、室温で10分間緩やかに混合し、抗hCG抗体を前記蛍光セルロース微粒子に吸着させた。 The anti-hCG antibody in a microtube (Anti-hCG clone codes / 5008, Medix Biochemica Co.) 10 [mu] L of (5.8 mg / mL) was added, and mixed at room temperature with gentle 10 minutes, the anti-hCG antibody to the fluorescent cellulose particles It was adsorbed.
混合液を12000×gで15分間遠心分離し、上清を取り除いた。 The mixture was centrifuged for 15 minutes at 12000 × g, the supernatant was removed. ここに保存用バッファー(20mM Tris−HCl(pH 8.2)、0.05% PEG20,000、150mM NaCl、1%BSA、0.1%NaN 3 )を1mL加え、再度遠心分離し、上清を取り除いた。 Storage buffer here (20mM Tris-HCl (pH 8.2 ), 0.05% PEG20,000,150mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN 3) and 1mL was added, then centrifuged again, the supernatant It was removed. ここに蒸留水500μLと塗布バッファー(20mM Tris−HCl(pH8.2)、0.05%PEG(分子量20,000)、5%スクロース)を500μL加え、粒子を分散させ、蛍光セルロース微粒子/生体分子の複合粒子のコロイドを得た(0.5mg/mL×1mL)。 Distilled water 500 [mu] L and the coating buffer here (20mM Tris-HCl (pH8.2), 0.05% PEG (molecular weight 20,000), 5% sucrose) was added 500 [mu] L, to disperse the particles, fluorescent cellulose fine / biomolecule to obtain a colloidal composite particles (0.5mg / mL × 1mL).
上記複合粒子のコロイド0.8mLをGlass Fiber Conjugate Pad(GFCP、MILLIPORE社製)(8×150mm)に均一に塗布した。 The composite particles of the colloid 0.8mL a Glass Fiber Conjugate Pad was uniformly applied to the (GFCP, manufactured by MILLIPORE Corp.) (8 × 150mm). デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、複合粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。 At room temperature in a desiccator and vacuum dried overnight to produce a conjugate pad comprising the composite particles.

以下、抗体固定化メンブレンの作製方法を説明する。 Hereinafter, a method of manufacturing the antibody immobilized membrane.
メンブレン(丈25mm、商品名:Hi−Flow Plus120 メンブレン、MILLIPORE社製)の中央付近(端から約12mm)に、幅約1mmのテストラインとして、抗hCG抗体(alpha subunit of FSH(LH),clone code/6601、Medix Biochemica社製)を1mg/mL含有する溶液((50mM KH 2 PO 4 ,pH7.0)+5%スクロース)を0.75μL/cmの塗布量で塗布した。 Membrane (length 25mm, trade name: Hi-Flow Plus120 membrane, manufactured by MILLIPORE Corp.) near the center (about 12mm from the edge) of, as a test line having a width of about 1mm, anti-hCG antibodies (alpha subunit of FSH (LH), clone code / 6601, Medix Biochemica Co.) 1 mg / mL containing to solution ((50mM KH 2 PO 4, pH7.0) to + 5% sucrose) was applied at a coverage of from 0.75μL / cm.
次いで、幅約1mmのコントロールラインとして、抗マウスIgG抗体(Anti Mouse IgG、Dako社製)を1mg/mL含有する溶液((50mM KH 2 PO 4 ,pH7.0)シュガー・フリー)を0.75μL/cmの塗布量で塗布し、50℃で30分乾燥させた。 Then, as the control line having a width of about 1 mm, anti-mouse IgG antibody (Anti Mouse IgG, manufactured by Dako Co.) solution which contained 1 mg / mL of ((50mM KH 2 PO 4, pH7.0) Sugar Free) 0.75MyuL / was applied at a coverage of cm, and dried for 30 minutes at 50 ° C.. なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は4mmとした。 It should be noted that the distance between the test line and the control line was set to 4mm. 次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー(組成:100mMホウ酸(pH8.5)、1重量%カゼイン)中に室温で30分浸した。 Next, the entire membrane blocking buffer as a blocking treatment (composition: 100 mM borate (pH 8.5), 1 wt% casein) were immersed for 30 minutes at room temperature while.
前記メンブレンをメンブレン洗浄/安定バッファー(組成:10mM KH 2 PO 4 (pH7.5)、1重量%スクロース、0.1%コール酸ナトリウム)に移し室温で30分以上静置した。 It said membrane membrane washing / stabilizing buffer: was allowed to stand for 30 minutes or more at room temperature and transferred to the (composition 10mM KH 2 PO 4 (pH7.5) , 1 wt% sucrose, 0.1% sodium cholate). メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、抗体固定化メンブレンを作製した。 Pulling the membrane, and dried overnight at room temperature and placed on a paper towel to produce a antibody-immobilized membrane.

サンプルパッド(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)、MILLIPORE社製)、前記コンジュゲートパッド、前記抗体固定化メンブレン、及び吸収パッド(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)、MILLIPORE社製)をバッキングシート(商品名AR9020,Adhesives Research社製)上でこの順に組み立て、5mm幅、長さ60mmのストリップ状に切断し、テストストリップを得た。 Sample pad (Glass Fiber Conjugate Pad (GFCP), manufactured by MILLIPORE), the conjugate pad, the antibody immobilized membrane, and an absorbent pad (Cellulose Fiber Sample Pad (CFSP), MILLIPORE Corp.) a backing sheet (trade name AR9020 , assembled in this order on Adhesives Ltd. Research Corporation), 5 mm wide, and cut into a length of 60mm strip of, to obtain a test strip.
なお、各構成部材は、各々その両端を隣接する部材と2mm程度重ね合わせて貼付した所定濃度のリコンビナントhCG(ロート製薬社製)を、作製したテストストリップのサンプルパッド部分に100μL滴下し、20分間放置後、テストストリップのサンプルパッドとコンジュゲートパッドを剥がし、メンブレンを露出させ、レーザーダイオードを用いて励起を行いフォトダイオードで蛍光を受光することでメンブレンの蛍光プロファイルを取得した。 Incidentally, the components, each recombinant hCG having a predetermined concentration was applied to both ends superposed approximately adjacent member and 2 mm (ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.), and 100μL dropped into sample pad portion of the test strip was prepared, 20 minutes after standing, peeled sample pad and conjugate pad of the test strip to expose the membrane were obtained membrane fluorescence profiles by receiving fluorescence photodiode performs excited using laser diodes. 得られた蛍光プロファイルからテストライン、コントロールラインの蛍光強度を陽性(+)又は陰性(−)で評価した。 The resulting test line from the fluorescence profile, the fluorescence intensity of the control line positive (+) or negative - were evaluated by (). 結果を以下の表2に示す。 The results shown in Table 2 below.

[蛍光セルロース微粒子を用いて作製したイムノクロマトキットにおける3ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間保存した後の発色強度試験] [3 months in immunochromatography kit manufactured using the fluorescent cellulose fine, 6 months, color strength test after storage for 12 months]
前記したイムノクロマトキットを作製方法と同様の方法で、濃度0.005mIU/mlのリコンビナントhCGで、イムノクロマトキットを作製し、3ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間保存した後の発色強度試験を実施した。 The immunochromatographic kit described above for producing the same method, at a concentration 0.005mIU / ml of recombinant hCG, produced the immunochromatography kit, 3 months, 6 months, carried out 12 months saved color strength test after did. 結果を以下の表2に示す。 The results shown in Table 2 below.

表2に示す結果から、実施例1〜24の蛍光セルロース微粒子についてはいずれも、イムノクロマトキットの展開粒子として高い感度及び分散安定性を示すことが分かる。 From the results shown in Table 2, both for fluorescence cellulose fine particles of Examples 1 to 24, it can be seen that high sensitivity and dispersion stability as a developing particle immunochromatographic kit.
これに反し、比較例1では、イムノクロマトキット作製直後は高感度であったものの、平均粒径が小さすぎるため、6ヶ月保存した辺りから、凝集してしまい、検出できなかった。 Contrary to this, in Comparative Example 1, although the immunochromatography kit immediately after production was high sensitivity, since the average particle diameter is too small, from around stored for 6 months, will aggregate, can not be detected.
比較例2と3では、粒子径が大きいために、展開膜中で目詰まりを起こしてしまい、抗原を検出することができなかった。 In Comparative Example 2 and 3, because of the large particle diameter, will clogged in developing membrane, it was not possible to detect the antigen.
比較例4と5では、蛍光色素化合物の含有量が少なすぎたため、ほとんど発色せず、十分な感度が得られなかった。 In Comparative Example 4 and 5, since the content of the fluorescent dye compound was too low, little color, sufficient sensitivity can not be obtained.
比較例6では、蛍光色素化合物を導入した直後から、凝集が発生してしまい、イムノクロマトキットに使用した時に、ほとんど展開しなかった。 In Comparative Example 6, immediately after the introduction of a fluorescent dye compound, aggregation ends up occurring, when used in immunochromatography kit, hardly expanded.
比較例7では、製造直後、目標とする感度は達成していたものの、分散安定性が悪く、3ヵ月後には、保存前に検出できていた0.002mIU/mlの抗原濃度でも発色しなかった。 In Comparative Example 7, immediately after production, although the sensitivity of the target was achieved, the dispersion stability is poor, and after 3 months, color was not developed at the antigen concentration of 0.002mIU / ml had detectable before storage .
比較例8と9は、蛍光色素化合物の含有量が少なすぎるため、十分な感度を達成できなかった。 Comparative Example 8 and 9, since the content of the fluorescent dye compound is too small, could not achieve sufficient sensitivity.
比較例10では、擬陽性が発生した。 In Comparative Example 10, false positives occurred.
比較例11では、展開直後にすぐ目詰まりを起こしてしまっており、展開不良が起こっていた。 In Comparative Example 11, and ended up causing an immediate clogging immediately after deployment, it was going bad deployment.

本発明の蛍光セルロース微粒子及びそれを用いたイムノクロマトキットは、生体試料中に含まれる被検出物質を高感度に検出でき、かつ、保存安定性が高いため、臨床検査等における免疫測定法に好適に利用可能である。 Fluorescent cellulose particles and immunochromatographic kit using the same of the present invention, the target substance contained in a biological sample can be detected with high sensitivity and has high storage stability, preferably in immunoassays in clinical tests, etc. it is available.

Claims (12)

  1. 蛍光色素化合物を含有率0.01%以上95%以下で含み、平均粒径が9nm以上700nm以下であり、CV値が30%以下であり、かつ、長径/短径の平均値が10未満でり、かつ、平均重合度が30以上700以下であることを特徴とする蛍光セルロース微粒子。 Includes a fluorescent dye compound at 95% or less rate of 0.01% or more containing, average particle size is at 9nm than 700nm or less, and a CV value of 30% or less, and an average value of the major axis / minor axis is less than 10 Ri and fluorescence cellulose fine particles, wherein the average polymerization degree is 30 or more 700 or less.
  2. セルロース以外の成分が化学結合又は物理吸着を介して担持されている、請求項1に記載の蛍光セルロース微粒子。 Components other than the cellulose is carried through a chemical bond or physical adsorption, fluorescence cellulose fine particles according to claim 1.
  3. 前記セルロース以外の成分が、他の成分と特異的に相互作用する物質である、請求項2に記載の蛍光セルロース微粒子。 The components other than cellulose, is another component which specifically interact with agents, fluorescent cellulose fine particles according to claim 2.
  4. 前記セルロース以外の成分が生体材料である、請求項2又は3に記載の蛍光セルロース微粒子。 Components other than the cellulose is a biological material, a fluorescent cellulose fine particles according to claim 2 or 3.
  5. 前記生体材料が、抗原又は抗体である、請求項4に記載の蛍光セルロース微粒子。 Wherein the biological material is an antigen or an antibody, a fluorescent cellulose fine particles according to claim 4.
  6. 請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光セルロース微粒子を含む診断薬。 Diagnostic agent comprising a fluorescent cellulose fine particles according to any one of claims 1 to 5.
  7. 前記セルロース以外の成分が検査対象物質と特異的に相互作用する物質である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の蛍光セルロース微粒子を含む、請求項6に記載の診断薬。 The components other than cellulose as a test substance which specifically interact with agents, including fluorescent cellulose fine particles according to any one of claims 2 to 4, the diagnostic agent of claim 6.
  8. 免疫診断用の請求項6又は7に記載の診断薬。 Diagnostic agent according to claim 6 or 7 for immunodiagnostics.
  9. 請求項6〜8のいずれか1項に記載の診断薬と検体とを混合し、該検体中の検査対象物質を検出するステップを含む、インビトロ検体検出方法。 Mixing a diagnostic agent and the specimen according to any one of claims 6-8, comprising the steps of detecting a test object substance in the specimen in vitro analyte detection methods.
  10. 請求項6〜8のいずれか1項に記載の診断薬を含む、イムノクロマト法による検出用のイムノクロマトキット。 To any one of claims 6-8 comprising a diagnostic agent as claimed, immunochromatography kit for detection by immunochromatographic.
  11. 請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光セルロース微粒子が液体に分散している分散液。 Dispersion fluorescent cellulose fine particles are dispersed in a liquid according to any one of claims 1-5.
  12. 請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光セルロース微粒子が固体表面に固定されているか又は固体中に分散されている成型体。 Molded fluorescence cellulose fine particles according to any one of claims 1 to 5 is dispersed or in the solid is fixed to the solid surface.
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