JP6097688B2 - 抗he4抗体を検出するための方法、ならびにhe4発現細胞と関連する状態の診断および/または予後判定のための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年8月26日に提出された米国特許仮出願第61/377,387号の出願日の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/377,387号の恩典を主張し得る任意の米国特許出願の目的で、そのより早期に提出された出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、ヒト精巣上体4-ジスルフィドコアタンパク質(「HE4」)発現腫瘍と関連する癌のリスクがあるかまたは患っている対象の、リスク、診断、および/または予後を評価するための組成物および方法、とりわけ、卵巣腫瘍細胞などのHE4発現細胞の存在の指標としての使用のため、および/または、1つもしくは複数のHE4発現腫瘍と関連する癌について処置を受けている患者の臨床状態を確定するために、抗HE4抗体を測定する方法に関連する。
卵巣癌(OvC)は、西洋社会において2番目に頻繁な、かつ最も致命的な婦人科悪性腫瘍である。大部分の症例は、進行期に診断され、これが、35%を超えない5年の全生存率を有する不良な予後に反映される。卵巣癌は、症候が曖昧でありかつ非特異的であるため、不釣り合いなほど致死的である。卵巣癌は、腹腔内の天然に存在する体液中に悪性細胞を落とす。これらの細胞は次に、この体液中に浮遊し、かつ、子宮、膀胱、腸、および腸壁の裏打ち(網)を含む他の腹腔(腹膜)構造上に頻繁に移植性転移する可能性を有する。これらの細胞は、癌が疑われる前でも、新たな腫瘍増殖を形成し始め得る。この疾患を呈する患者の60%より多くが、卵巣を超えて既に広がっている第III期または第IV期の疾患を既に有し、これらの患者の75%より多くが、卵巣癌についての化学療法の最近の改善にもかからず、疾患により死亡する。しかしながら、診断が疾患の初期になされたら、5年生存率は90%〜98%に達し得る。
上記の通り、一つの局面において、ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を検出するための方法であって、ヒト対象から取得された生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量を確定する段階を含み、生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量がヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を示す方法が、提供される。いくつかの態様において、ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在は、対象が卵巣癌を患っているか、または卵巣腫瘍を発症するリスクがあることを示す。
[本発明1001]
ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を検出するための方法であって、ヒト対象から取得された生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量を確定する段階を含み、該生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量が、該ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を示す、方法。
[本発明1002]
前記生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量が、該生物学的試料を、SEQ ID NO:1の少なくとも20個の隣接したヌクレオチドを含む配列に少なくとも90%同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させることにより確定される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
確定された抗HE4抗体の量を参照標準と比較する段階をさらに含み、該参照標準より多い検出された抗HE4抗体の量が、前記ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を示す、本発明1001の方法。
[本発明1004]
抗HE4抗体を有する対象が卵巣癌を有するかどうかを確定するために、少なくとも1種の追加的な診断アッセイを行う段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
ポリペプチドの抗HE4抗体への結合が、放射性核種、蛍光体、アビジン分子とビオチン分子との間の結合事象、ストレプトアビジン分子とビオチン分子との間の結合事象、および酵素反応の産物からなる群より選択されるシグナルを検出することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記生物学的試料における抗HE4抗体の量が、ELISAアッセイを用いて確定される、本発明1002の方法。
[本発明1007]
前記ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在が、該対象が卵巣癌を患っているかまたは発症するリスクがあることを示す、本発明1003の方法。
[本発明1008]
前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、腹水、尿、唾液、涙、胸水、痰、膣液、および医学的手技中に取得された洗液からなる群より選択される生物学的体液である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記ヒト対象が、HE4発現腫瘍細胞と関連する癌について治療的処置を受けている、本発明1001の方法。
[本発明1010]
以下の段階を含む、HE4発現腫瘍について治療的処置を受けているヒト癌患者の処置の有効性をモニタリングするための方法:
(a)HE4発現腫瘍細胞と関連する癌について治療的処置を受けているヒト患者から、生物学的試料を提供する段階;
(b)前記生物学的試料を、SEQ ID NO:Tの少なくとも20個の隣接したヌクレオチドを含む配列に少なくとも90%同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させることにより、該生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量を確定する段階;および
(c)抗HE4抗体の確定された存在または量を、抗体参照標準と比較する段階であって、該参照標準より多い抗HE4抗体の量が、癌についての治療的処置に対する正の応答を示す、段階。
[本発明1011]
前記参照標準が、健常な対照となる対象から取得された生物学的試料から確定される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記参照標準が、癌についての処置の前に前記患者から取得された生物学的試料から確定される、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記抗体が、SEQ ID NO:2の少なくとも10個の隣接したアミノ酸を含む配列に少なくとも95%同一である配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、本発明1010の方法。
[本発明1014]
前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、腹水、尿、唾液、涙、胸水、痰、膣液、および医学的手技中に取得された洗液からなる群より選択される生物学的体液である、本発明1010の方法。
[本発明1015]
抗HE4抗体の量が、ETISAアッセイを用いて確定される、本発明1010の方法。
[本発明1016]
前記生物学的試料における可溶性HE4関連ペプチド(SHRP)の存在または量を確定する段階をさらに含み、該生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量が、可溶性HE4関連ペプチドの存在または量との組み合わせで、ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を示す、本発明1001または1010の方法。
[本発明1017]
前記生物学的試料が、血清である、本発明1001または1010の方法。
[本発明1018]
前記処置が、化学療法剤、放射線処置、抗体療法、癌ワクチン療法、遺伝子治療、または幹細胞移植の少なくとも1種の投与を含む、本発明1010の方法。
[本発明1019]
前記処置が、HE4を発現する腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を含む、本発明1010の方法。
[本発明1020]
ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を検出するためのキットであって、ヒト対象から取得された生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量の検出に特異的な試薬、および、抗HE4抗体の検出された存在または量の参照標準との比較のための印刷された指示書を含む、キット。
[本発明1021]
前記参照標準が、特異的な数値的閾値、同時評価のための陰性対照試料、および、検出された抗HE4抗体の量を前記対象におけるHE4発現細胞の存在の可能性と相関させる統計的情報からなる群より選択される、本発明1020のキット。
[本発明1022]
前記抗HE4抗体の検出に特異的な試薬が、SEQ ID NO:1の少なくとも20個の隣接したヌクレオチドを含む配列に少なくとも90%同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、本発明1020のキット。
[本発明1023]
前記抗HE4抗体の検出に特異的な試薬が、SEQ ID NO:2の少なくとも10個の隣接したアミノ酸を含む配列に少なくとも95%同一である配列を含むポリペプチドを含む、本発明1020のキット。
[本発明1024]
ポリペプチドが、固体支持体に付着されている、本発明1020のキット。
本明細書において具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の当業者に対して有すると考えられるものと同一の意味を有する。
第I期‐1個または両方の卵巣に限局している
IA‐1個の卵巣に関わる;無傷の被膜;卵巣表面上に腫瘍が無い;腹水または腹膜洗液中に悪性細胞が無い
IB‐両方の卵巣に関わる;無傷の被膜;卵巣表面上に腫瘍が無い;陰性の洗液
IC‐以下のいずれかを伴う、卵巣に限局した腫瘍:破裂した被膜、卵巣表面上の腫瘍、陽性の洗液
第II期‐骨盤への進展または移植性転移
IIA‐子宮または卵管上への進展または移植性転移;陰性の洗液
IIB‐他の骨盤構造上への進展または移植性転移;陰性の洗液
IIC‐陽性の腹膜洗液を伴う、骨盤への進展または移植性転移
第III期‐骨盤の外側への顕微鏡的な腹膜への移植性転移;または骨盤に限局しているが小腸もしくは網への進展を伴う
IIIA‐骨盤を超える顕微鏡的な腹膜転移
IIIB‐サイズが2 cm未満の骨盤を超える肉眼的な腹膜転移
IIIC‐>2 cmの骨盤を超える腹膜転移またはリンパ節転移、注:大動脈周囲リンパ節転移は所属リンパ節とみなされる
第IV期‐遠隔転移--肝臓中、または腹腔の外側へ
本実施例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞における組み換えヒト精巣上体タンパク質4(HE4)タンパク質の産生および精製を記載する。
HE4-CIHDpaプラスミドの構築
組み換えHE4タンパク質(SEQ ID NO:2)を、以下のように作製した。
フォワードセンスプライマー:
を設計し、クローニングのために適切な遺伝子の5'端にAge I制限酵素認識部位を導入した。
リバースアンチセンスプライマー:
を設計し、クローニングのために適切な遺伝子の3'端にSbf I制限酵素認識部位を導入した。
ジヒドロ葉酸還元酵素を欠損した(DHFR-)チャイニーズハムスター卵巣(CHO-DG44)細胞を、37℃で、無血清CHO培地(Hyclone, Logan, Utah; SH30333)、5%CO2において増殖させた。50万個または100万個のCHO-DG44細胞を、ウェル当たり500μlの無血清培地を有する24ウェルプレートの各ウェルに播種し、上述の条件で一晩インキュベーションした。1μgまたは5μgの、エンドトキシンを含まないHE4-CIHDpaプラスミドを、100μl Opti-MEM無血清培地において2μl Lipofectamine(商標)2000(Invitrogen)と混合した。20分間インキュベーションした後、DNA-Lipofectamine(商標)複合体を、CHO-DG44細胞を含有する各ウェル中に添加した。細胞を次に、ヒポキサンチンおよびチミジン(「HT」)を補給したHyQ PF-CHO培地中に移し、トランスフェクタントを選択するためにHT補給物を含まないHyQ PF-CHO培地に移す前に、2日間回復させた。選択培地において28日後、1μgプラスミドをトランスフェクションした100万個の細胞は増殖し、>95%の細胞生存率で回復した。
HE4-CIHDpaプラスミドをトランスフェクションしたCHO細胞由来の培養上清におけるHE4タンパク質の産生を、参照により本明細書に組み入れられるHellstrom I., et al., Cancer Research 63:3695-3700 (2003)に記載されるように、二重決定基(サンドイッチ)ELISAアッセイに基づき、Fujirebio Diagnostics, Inc.により販売されている市販のキットを用いて評価した。
組み換えHE4タンパク質を、以下のように親和性クロマトグラフィーにより、HE4-CIHDpaプラスミドをトランスフェクションしたCHO細胞の高産生株から精製した。
これらの結果は、CHO細胞由来の組み換えヒトHE4タンパク質のクローニング、発現、および精製の成功を実証する。
本実施例は、ヒト血清中に天然に存在するヒト抗HE4抗体を検出することができるELISAアッセイの開発の成功を記載する。
抗HE4抗体を検出するためのELISAアッセイの開発:
血清中の抗HE4抗体の量を検出/測定するためのELISAアッセイを、以下のように開発した。0.6μg/mLの精製した組み換えヒトHE4タンパク質(実施例1に記載されるように産生された)を、ELISAアッセイプレートのウェル上に一晩コーティングした。バックグラウンドのための対照として、対応するウェルをコーティングしないままにした。3%BSA/PBSで2時間ブロッキングした後、1:20および1:40の希釈のヒト血清または血漿(下記に記載されるように取得された)を、ELISAアッセイプレート上のウェルのすべてに添加した。試料および試薬両方のすべての希釈は、3%BSA/PBSにおいて行った。
天然に存在する抗HE4抗体の存在について試験するために、大部分が進行した(第III〜IV期)疾患を有する10人の卵巣癌患者、および1人の健常な女性対象から血漿試料を取得し、抗HE4 ELISAアッセイにおいて試験する予備的研究を行った。ヒト血漿試料を、1:20および1:40希釈でELISAプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベーションした。ウェルをPBS-Tween 20で洗浄し、次に、1:1000希釈したHRP結合マウス抗ヒトIgG抗体(Invitrogen, Carlsbad, California)を各ウェルに添加して、1時間室温でインキュベーションした。プレートを再びPBS-Tween 20で洗浄した後、SureBlue(商標)TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL)を各ウェルに添加して、15分間室温でインキュベーションし、その後、TMB停止液(KPL)を添加することにより相互作用を終結させた。450ナノメートルでの光学密度(OD)を、DynaTech MR 5000プレートリーダー(DynaTech Laboratories, Inc.)を用いて測定した。
ヒト血清試料由来の抗HE4抗体の存在/量を試験するELISAアッセイの結果を、図1に呈する。図1に示されるように、卵巣癌を有する10人の患者のうちの1人(対象He213)は、両方の希釈についてOD450≧1.0を有し、従って、抗HE4抗体の存在を示す。患者He213由来の血漿は(抗HE4抗体について陽性であった血漿と共に)、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,270,960号に記載されるようなHE4抗原の存在を検出するアッセイを用いたHE4抗原の存在について、陰性であることが見出された(データは示されていない)。しかしながら、患者He213の腫瘍に由来する培養腫瘍細胞は、HE4抗原を発現することが示された(データは示されていない)。
本実施例に記載される結果は、ヒト血清中に天然に存在するヒト抗HE4抗体を検出することができるELISAアッセイの開発の成功を実証する。結果はまた、卵巣癌を有する対象における抗HE4抗体の存在も実証する。メソテリアン(mesothelian)に対する抗体についての本発明者らの以前の研究に基づいて(Hellstrom I. et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17(6):1520-1526 (2008)を参照されたい)、処置(外科手術、化学療法、放射線、および/または免疫療法を介した)を受けているか、または受けたことがある卵巣癌患者において同定されるHE4に対する抗体の存在、またはその力価の増加は、単独で、または、HE4抗原の減少した量(処置の開始時のベースライン量と比較した際)もしくは循環していないHE4抗原の知見との組み合わせで、癌療法が腫瘍に損傷を与えるのに有効であると示すであろうことが期待される。処置を受けている卵巣癌患者におけるHE4に対する抗HE4抗体の力価の減少、または検出できない抗HE4抗体は、単独で、または、循環するHE4抗原の増加した量(処置の開始時のベースライン量と比較した際)との組み合わせで、癌療法が腫瘍に損傷を与えるのに無効であると示し、および/または再発を示すであろうことがさらに期待される。
本実施例は、HE4に対する抗体の存在/量を検出するために開発されたELISAアッセイ(実施例2に記載される)を使用して、3人の卵巣癌を有する患者、および20人の健常な対照となる女性対象由来の血清中に存在する抗HE4抗体の量を決定した研究を記載する。
卵巣癌患者から取得された血清試料
下記の表2に示されるように、3人の初期(I/II)の卵巣癌を有する患者、および20人の健常なヒト女性対象(そのうち4人を下記の表2に示す)由来の血清試料を、Fred Hutchinson Cancer Research Center(Seattle, Washington)で取得した。血清を対象から抜き取り、実施例2に記載されるような方法を用いてアッセイした。
上述のように取得された血清を、実施例2に記載されるELISA法を用いて、1:20および1:40希釈でアッセイした。結果を、下記の表2に要約する。
ファージ融合タンパク質として提示されるHE4断片との反応性
ヒト抗HE4抗体のエピトープ特異性を、ファージELISAにおいて、ファージコートタンパク質pVIIIとの融合タンパク質として発現されたHE4断片に対して抗HE4反応性を提示するヒト試料の反応性を試験することにより、確定した。
OvCar-3細胞から単離したmRNAより調製したcDNAが、ファージ提示ベクターf88-4におけるクローニングのための、HE4ドメインをコードする遺伝子部分のPCR増幅用の鋳型として働いた。表3に列挙されるPCRプライマーペアを、図xに示されるコード領域の増幅のために構築した。5'端に、pVIIIシグナルペプチドおよびpVIII成熟コートタンパク質との融合におけるクローニングのために、HindIIIおよびPstIの制限部位を挿入した。
配列を検証したファージクローンを、増幅し、精製し、PEG/NaClで濃縮して、直接ファージELISAアッセイにおけるコーティング抗原としての使用のためにPBSにおいて、あるいは、サンドイッチファージELISAにおける抗原としてPBS中1%BSAにおいて希釈した。
Claims (7)
- ヒト対象が第I/II期の卵巣癌のリスクがあるかどうかを決定するための方法であって、ヒト対象から取得された生物学的試料におけるヒト抗HE4抗体の存在または量を決定する段階を含み、該生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量が、該ヒト対象が第I/II期の卵巣癌のリスクがあることを示す、方法。
- 前記生物学的試料における抗HE4抗体の存在または量が、該生物学的試料を、SEQ ID NO:1の少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含む配列に少なくとも90%同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させることにより決定される、請求項1記載の方法。
- 抗HE4抗体の決定された量を参照標準と比較する段階をさらに含み、該参照標準より多い検出された抗HE4抗体の量が、前記ヒト対象におけるHE4発現細胞の存在を示す、請求項1記載の方法。
- 抗HE4抗体を有する対象が第I/II期の卵巣癌のリスクがあるかどうかを決定するために、少なくとも1種の追加的な診断アッセイを行う段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドの抗HE4抗体への結合が、放射性核種、蛍光体、アビジン分子とビオチン分子との間の結合事象、ストレプトアビジン分子とビオチン分子との間の結合事象、および酵素反応の産物からなる群より選択されるシグナルを検出することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記生物学的試料における抗HE4抗体の量が、ELISAアッセイを用いて決定される、請求項2記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、腹水、尿、唾液、涙、胸水、痰、膣液、および医学的手技中に取得された洗液からなる群より選択される生物学的体液である、請求項1記載の方法。
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