JP6072201B1

JP6072201B1 - アセチルコリンエステラーゼ阻害剤及びその用途

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Publication number: JP6072201B1
Application number: JP2015223954A
Authority: JP
Inventors: 宮澤　三雄; 三雄宮澤
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2035-11-16
Also published as: JP2017088578A

Abstract

【課題】植物の精油に含まれる成分を有効成分とする新規なＡＣｈＥ阻害剤及びその用途を提供すること。【解決手段】本発明は、４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アセチルコリンエステラーゼ(以下、「ＡＣｈＥ」とも表記する)阻害剤、及びその用途に関する。

近年、高齢化社会が進展し、老人性痴呆患者の増加、その中でもアルツハイマー型痴呆患者が増加している。このアルツハイマー型痴呆症は、その原因は未解明であるが、患者の脳内の神経伝達物質であるアセチルコリンのレベルの低下が認められるため、コリン作動性神経の機能低下が原因の一つであると考えられている（非特許文献１）。そのため、アルツハイマー型痴呆症に対しては、アセチルコリンの濃度を高めてコリン作動性神経の機能低下を防ぐことを目的とする治療方法が主流となっている。

アセチルコリンは、アセチルコリントランスフェラーゼによって合成され、アセチルコリンエステラーゼにより分解されることにより一定の濃度に保たれている。そのため、アセチルコリンエステラーゼの活性を阻害してアセチルコリンの分解を抑制してアセチルコリンの減少を抑える方法である。この方法では、症状を完全に治療することはできないものの、症状を改善したり、症状の進行を遅らせることができることが分かっている。

ところで、植物の精油の香りは、抗菌作用、心理作用及び生体リズムの調節作用を示すことが知られており、植物の香りによって心と体を癒すアロマセラピー(芳香療法)が注目されている。

近年、ハッカ、ラベンダー又はグレープフルーツの精油といった植物の香気成分が、その芳香だけでなくＡＣｈＥ阻害活性を示すことが報告されている。また、イチョウ葉エキスが、脳機能障害改善作用やアルツハイマー型痴呆症の症状の改善作用を有するともいわれている（非特許文献２等）。

このような天然由来の成分が、アルツハイマー型痴呆症の治療と関連づけられるＡＣｈＥ阻害活性を有することが確認されたことは非常に興味深いものである。

一方、ヒノキ、スギ等の木は、その木特有の香りを有しており、例えば、ヒノキの精油にはピレン、カジノール、ヒノキオール等のテルペン類が含まれている。また、ヒノキの心材は、抗かび又は抗菌作用があることが知られている。しかし、ヒノキ、スギ等の精油成分が、ＡＣｈＥ阻害活性を有することは、これまでに報告例はない。

Weinstock M.: Neurodegeneration, 4, pp.349-356, 1995 FOOD Style 21 2001.5 p67-72

本発明は、植物の精油に含まれる成分を有効成分とする新規なＡＣｈＥ阻害剤及びその用途を提供することを目的とする。

本発明者は、スギ、ヒノキ等の精油成分が、ＡＣｈＥ阻害活性を示すことを見出し、さらにこれに検討を加えて、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤等を提供する。

項１．４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。

項２．ヒバエン、クリプトメリジオール、及びアビエタトリエンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、上記項１に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。

項３．上記項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性痴呆症の治療又は予防薬。

項４．上記項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する脳機能障害改善薬。

項５．上記項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型痴呆症の治療又は予防薬。

４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールは、ＡＣｈＥ阻害活性を有していることから、ＡＣｈＥ阻害剤として用いることができ、脳機能障害改善薬、老人性痴呆症（特に、アルツハイマー型痴呆症）の治療又は予防薬として有用である。

本発明のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に含まれる化合物の構造式である。実施例１における各化合物のＡＣｈＥ阻害活性試験の結果を示す図である。実施例１におけるアビエタロリエンのＡＣｈＥ阻害活性試験から導かれるDixon plotの結果を示す図である。実施例１におけるクリプトメリジオールのＡＣｈＥ阻害活性試験から導かれるDixon plotの結果を示す図である。実施例１におけるヒバエンのＡＣｈＥ阻害活性試験から導かれるDixon plotの結果を示す図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のＡＣｈＥ阻害剤は、４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。これらの化合物は、１種単独で又は２種以上を混合して用いることができる。上記化合物の構造式を図１に示す。

上記した化合物の中でも、ＡＣｈＥ阻害活性の観点から、ヒバエン、クリプトメリジオール、及びアビエタトリエンが好ましく、ヒバエン及びクリプトメリジオールがより好ましい。

上記した化合物は、種々の植物の精油成分として知られていることから、安全かつ入手が容易である。本発明のＡＣｈＥ阻害剤は、上記した化合物を含む精油をも包含する。精油に含まれる化合物は、上記した化合物を単独で包含するものであってもよいし、２種以上を含有するものであってもよい。例えば、ヒバコン、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン及びアビエタトリエンはヒノキ等の植物から単離することができる。ヒノキとして、例えば、和歌山県の熊野ヒノキが挙げられる。また、クリプトメリジオール及び１３−ｅｐｉ−ドラブラジエンはスギ等の植物から単離することができる。スギとして、例えば、和歌山県の熊野スギが挙げられる。

上記の化合物を含む植物からの精油は、公知の方法を用いて抽出することができる。その抽出方法は、該当する植物をそのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供するのが好ましい。

植物として、スギ又はヒノキを用いる場合、精油の抽出方法としては、精油成分の沸点が低いことから、水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法、油脂吸収法、揮発性溶剤抽出法、超臨界流体抽出法等の公知の方法が用いられる。中でも、水蒸気蒸留法が好ましく採用される。

上記した方法によって植物から精油を得た後、本発明では得られた抽出液をそのままＡＣｈＥ阻害剤として用いることが可能である。或いは、必要に応じて、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、精油を得ることができる。

更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、ＡＣｈＥ阻害活性のある画分又は化合物を取り出して、ＡＣｈＥ阻害剤とすることができる。溶出溶媒は、公知のものを用いればよいが、沸点が低い無極性有機溶媒を主成分とするのが好適である。これにより、少量の精油で優れた活性を発揮させることができる。

４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールは、後述する実施例で示すように、ＡＣｈＥ阻害活性を有している。これらの中でも、ヒバエン、クリプトメリジオール、及びアビエタトリエンは、強いＡＣｈＥ阻害活性を有している。

上記の化合物は、ＡＣｈＥ阻害活性を有するため、広くＡＣｈＥ阻害剤として用いることができる。

４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有するＡＣｈＥ阻害剤を、例えば、医薬品として用いる場合、哺乳動物（特に、ヒト）における老人性痴呆症の予防又は治療薬、特にアルツハイマー型痴呆症の予防又は治療薬として用いられる。また、脳機能障害の改善薬としても有効である。

ＡＣｈＥ阻害剤は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。

製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。

本発明の医薬製剤を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明にかかる医薬の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて、製剤学的な有効量を適宜選ぶことができる。

また、本発明のＡＣｈＥ阻害剤は、ＡＣｈＥ阻害活性を有するとともに、心地よい芳香性を有するため、例えば、入浴剤、石鹸、芳香剤、アロマテラピー用エッセンシャルオイル、皮膚洗浄剤、消臭剤、ペットのための精神安定剤、マスキング剤等として、或いはそれらに含有させて用いることができる。本発明のＡＣｈＥ阻害剤は、各製品に対し、通常０．００１〜１００重量％程度（好ましくは、０．１〜１０重量％程度）含有していればよい。空中拡散させて用いる場合は、高濃度、例えば５０〜１００重量％程度のものであってもよい。

上記の化合物を、かかる用途に用いた場合には、ストレスの多い現代社会において、精油の香りによるリラクゼーション作用により、心身の癒し効果が発揮される。さらに、上記の化合物は、ＡＣｈＥ阻害活性を有するため、高齢者、病人などが日常生活する環境で用いることにより、老人性痴呆症を改善させたり、老人の日常生活能力機能を向上させたりすることも可能である。

特に、上記の化合物を、アロマテラピー用エッセンシャルオイルとして用いた場合、他の天然植物精油と混合して用いることもできる。また、該アロマテラピー用エッセンシャルオイルを所定の場所に撒布して、吸入し得る形態で使用することもできる。撒布場所としては、例えば、家庭の部屋内、ホテルの部屋、会議室、病室の他、人の集まる催し物会場、休憩広場、各種リラクゼーション施設等に撒布することができる。中でも、老人性痴呆症の患者が生活する病院、施設などで用いることにより、痴呆症の改善効果が期待される。

また、上記の化合物は、例えば、清涼飲料、乳製品（加工乳、ヨーグルト）、菓子類（ゼリー、チョコレート、ビスケット、ガム、錠菓）等の各種飲食品に配合することもできる。その配合量はとくに限定はないが、通常０．０１〜１０重量％程度であればよい。

次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。

実施例１
エチルアニソール及び（Ｅ）−ネロリドールは、いずれも東京化成工業株式会社製のものを使用した。

ヒバエン、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン及びアビエタトリエンは、和歌山県新宮市熊野地方の山林に自生しているヒノキの枝葉を採取し、水蒸気蒸留することにより得られたヒノキ精油から、分取ＧＣシステムに連結された分取キャピラリーガスクロマトグラフィー（ｐｃＧＣ）で精製することにより単離した。

クリプトメリジオール及び１３−ｅｐｉ−ドラブラジエンは、和歌山県新宮市熊野地方の山林に自生しているスギの枝葉を採取し、水蒸気蒸留することにより得られたスギ精油から、分取ＧＣシステムに連結された分取キャピラリーガスクロマトグラフィー（ｐｃＧＣ）で精製することにより単離した。

なお、ｐｃＧＣには、ガスクロマトグラフィー(6890N, Agilent Technologies, Santa Clara, U.S.A.)、水素炎イオン化検出器(FID, Agilent Technologies)、及びガーステルフラクションコレクター(PFC, Gerstel, Muhlhelm, Germany)を用いた。ｐｃＧＣは、５％フェニルメチルポリシロキサン−溶融シリカキャピラリーカラム（HP-5MS, 30 m x 0.32 mm I.D., 0.5 mm, Agilent Technologies）を使用し、キャリアーガスとしてヘリウムガス（２ｍｌ／分）を用いて行った。注入量は１μｌであり、カラムオーブン温度を４０℃〜２３０℃まで４℃／分で昇温して分取した。

（１）ＡＣｈＥ阻害活性試験
ＡＣｈＥ阻害活性試験は、Bruehmannらによって以前報告された９６ウェルのマイクロプレート法(Bruehmann, C.; Marston, A.; Hostettmann, K.; Carrupt, P-A.; Testa, B. Screening of Non-Alkaloidal Natural Compounds as Acetylcholinesterase Inhibitors. Chem. Biodiver. 2004, 1, 819-829)を改良した方法で行った。以下、簡単に説明する。ウェルに２０μｌのＡＣｈＥ溶液（０．０１Ｍリン酸緩衝液中に０．０３７ｕｎｉｔ／ｍＬ、ｐＨ７．４）、２００μｌの発色剤（５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾイックアシッド；ＤＴＮＢ）（０．１Ｍリン酸緩衝液中に０．１５ｍＭ、ｐＨ７．４）、及び２０μｌの阻害剤（表１に記載の化合物）メタノール溶液を添加した。コントロールウェルには、阻害剤の代わりにメタノールを加えた。各ウェル中の内容物を混合し、室温で、１５分間プレインキュベーションした後、３０μｌの基質（アセチルチオコリンアイオダイド；ＡＴＣ）水溶液（最終濃度：０．０５−０．２５ｍＭ）を加え、１５分間インキュベーションした。その後、ＡＣｈＥによる基質の加水分解反応により生じる黄色に呈色するアニオン（ＴＮＢ）の４０５ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダを用いて測定した。ＡＣｈＥ活性の阻害（パーセント）は式：
Ｉ（％）＝｛（Ａ_{コントロール}−Ａ_試料）／Ａ_{コントロール}｝×１００
（式中、「Ａ_試料」は試料（阻害剤）を含む反応混合物の吸光度であり、「Ａ_{コントロール}」は反応コントロール混合物の吸光度を示す）を用いて計算した。なお、（＋）−プレゴンはポジティブコントロールとして用いた。各サンプルについて少なくとも３回測定を行い、その平均値を示した。その結果を表１及び図２に示す。

なお、ＡＣｈＥは、シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Corporation）製のヒト赤血球のＡＣｈＥを用いた。ＤＴＮＢ及びＡＴＣは、東京化成工業株式会社（Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (TCI)）製を用いた。

試験を行った４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールは、いずれもＡＣｈＥ阻害を示した（図２）。

ヒバエン、クリプトメリジオール、及びアビエタトリエンは、より強い活性を示し、ＩＣ_５０値はそれぞれ８８．７±１．２μＭ、９２．５±０．５μＭ及び１４４．４±０．９μＭであった（表１及び図２）。ポジティブコントロールである（＋）−プレゴンのＩＣ_５０値が１３６μＭであることから、ヒバエン及びクリプトメリジオールは、（＋）−プレゴンよりも強い活性を有していることがわかる。

（２）阻害形式の検討
アビエタトリエン、クリプトメリジオール、及びヒバエンの酵素阻害形式を検討した。方法は、速度論法に汎用される、Dixon plot法を用いた。Dixon plot法は、基質濃度を固定し、阻害剤濃度に対し反応速度の逆数をプロットするものである。アビエタトリエンの結果を図３に、クリプトメリジオールの結果を図４に、ヒバエンの結果を図５に示す。図３〜図５の結果は、それぞれの基質濃度に対するDixonプロットが第２象限において交差したことから、アビエタトリエン、クリプトメリジオール、及びヒバエンはいずれも拮抗阻害剤であることを示した。

以上のように、４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、１３−ｅｐｉ−ドラブラジエン、アビエタトリエン、及び（Ｅ）−ネロリドールは、いずれもＡＣｈＥ阻害活性を示した。特に、ヒバエン及びクリプトメリジオールは、ポジティブコントロールよりも強い活性を示した。また、アビエタトリエン、クリプトメリジオール、及びヒバエンは拮抗型の阻害形式であることが明らかとなった。

Claims

４−エチルアニソール、クリプトメリジオール、イソピマラ−９（１１）９，１５−ジエン、ヒバエン、及び１３−ｅｐｉ−ドラブラジエンからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
ヒバエン、及びクリプトメリジオールからなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、請求項１に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
請求項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する老人性痴呆症の治療又は予防薬。
請求項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有する脳機能障害改善薬。
請求項１又は２に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含有するアルツハイマー型痴呆症の治療又は予防薬。