JP6048932B2 - Polypeptide for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride and use thereof - Google Patents

Polypeptide for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride and use thereof Download PDF

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Description

本発明は、ケイ素化合物を識別するポリペプチドおよびその利用に関するものであり、より詳細には、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドおよびその利用に関するものである。   The present invention relates to polypeptides that identify silicon compounds and uses thereof, and more particularly, to polypeptides that distinguish silicon oxide and silicon nitride and uses thereof.

近年、ナノテクノロジーとバイオテクノロジーが融合した領域にナノバイオテクノロジーという新しい領域が誕生し、急速に発展しつつある。ナノバイオテクノロジーは、例えば、バイオエレクトロニクス素子やバイオセンサの作製、DNAやタンパク質をターゲットにしたバイオチップの開発などに利用されるものであり、ナノバイオテクノロジーに対する期待はきわめて大きい。   In recent years, a new area called nanobiotechnology has been born in the area where nanotechnology and biotechnology are fused, and is rapidly developing. Nanobiotechnology is used, for example, in the production of bioelectronic elements and biosensors, and in the development of biochips targeting DNA and proteins, and expectations for nanobiotechnology are extremely high.

上述のように、ナノバイオテクノロジーでは、バイオエレクトロニクス素子やバイオセンサの技術はきわめて重要であり、DNAチップやプロテインチップが注目されている。これらのチップでは、例えばDNAやタンパク質などの1分子を対象にセンシングを行うことになるため分子のサイズを考えたセンサの作製と制御が不可欠である。そこで、半導体加工技術を利用したバイオセンサの開発が手がけられている。   As described above, in nanobiotechnology, the technology of bioelectronic elements and biosensors is extremely important, and DNA chips and protein chips are attracting attention. In these chips, for example, sensing is performed on one molecule such as DNA or protein, and therefore, it is indispensable to manufacture and control a sensor considering the size of the molecule. Thus, biosensors using semiconductor processing technology are being developed.

具体的には、例えば、シリコンナノワイヤ上に検出対象ウイルスに対する抗体を固定化し、ウイルスが1個でも抗体と結合すれば、電気的に検出することが可能となるような、バイオセンサの開発も進んでいる。   Specifically, for example, the development of a biosensor that can be electrically detected by immobilizing an antibody against a detection target virus on a silicon nanowire and binding at least one virus to the antibody has progressed. It is out.

このように、半導体加工技術を利用したバイオセンサの開発をさらに加速させるためには、シリコンやガラスなどの基板(支持体)上に所望のタンパク質を簡便かつ正確に配置し、固定化させる技術の開発が不可欠であると考えられている。   In this way, in order to further accelerate the development of biosensors using semiconductor processing technology, a technology for simply and accurately arranging and immobilizing a desired protein on a substrate (support) such as silicon or glass. Development is considered essential.

9個のアルギニン残基(ポリアルギニンタグ)を付加したタンパク質が、酵素活性を保ったままガラス表面上やシリカ樹脂に直接吸着できることが報告されている(非特許文献1参照)。非特許文献1に記載のポリアルギニンタグを付加してタンパク質をシリカに吸着させる技術は、長時間のインキュベーションによってタンパク質がシリカ表面から離れてしまい、吸着力に問題がある。   It has been reported that a protein added with nine arginine residues (polyarginine tag) can be directly adsorbed on a glass surface or a silica resin while maintaining enzyme activity (see Non-Patent Document 1). The technique of adding a polyarginine tag described in Non-Patent Document 1 to adsorb proteins to silica has a problem in adsorption force because proteins are separated from the silica surface by long-time incubation.

バイオセンサは、高感度で迅速かつ安価に多項目にわたる検出が可能であることから、脚光を浴びている。その一つとして、抗体や酵素などの生体分子と半導体デバイスとを融合させたナノデバイスが提案されている。半導体デバイスと生体分子を融合したナノデバイス開発においては、デバイス上の目的の位置にタンパク質を精密に配置する技術が必要となる。   Biosensors are in the spotlight because they can detect multiple items with high sensitivity, quickly and inexpensively. As one of them, a nanodevice in which a biomolecule such as an antibody or an enzyme and a semiconductor device are fused is proposed. In the development of nanodevices that fuse semiconductor devices and biomolecules, technology is required to precisely place proteins at the target positions on the devices.

半導体の主流であるシリコンデバイスの主要な表面材料(絶縁膜)として、酸化膜(酸化ケイ素/SiO)および窒化膜(窒化ケイ素/Si)が汎用されている。酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別し得る技術が存在すれば、酸化ケイ素および窒化ケイ素の両方を絶縁膜としてデバイス上にて所望の形状にパターニングしておくことによって、デバイス上の目的の位置にタンパク質をパターニングすることができると考えられる。As main surface materials (insulating films) of silicon devices, which are the mainstream of semiconductors, oxide films (silicon oxide / SiO 2 ) and nitride films (silicon nitride / Si 3 N 4 ) are widely used. If there is a technique capable of distinguishing between silicon oxide and silicon nitride, by patterning both silicon oxide and silicon nitride as an insulating film into a desired shape on the device, a protein can be placed at a target position on the device. It is thought that can be patterned.

本発明者らは、酸化ケイ素含有物質に対して高い吸着力で特異的な結合能を有するタンパク質を利用して、ガラス表面を何ら修飾することなく、ガラス基板上に直接タンパク質を固定化する技術を開発している(特許文献1参照)。本技術は、プロテインチップの作製などに非常に利用価値が高い。また、酸化ケイ素に結合し得るタンパク質が報告されている(非特許文献3参照)。   The present inventors use a protein having a high binding force and a specific binding ability to a silicon oxide-containing substance, and directly immobilize the protein on the glass substrate without modifying the glass surface. (See Patent Document 1). This technology is very useful for producing protein chips. A protein capable of binding to silicon oxide has been reported (see Non-Patent Document 3).

PCT国際公開WO2007/055288パンフレット(2007年5月18日国際公開)PCT International Publication WO2007 / 055288 pamphlet (May 18, 2007 international publication)

Fuchs, S.M. and Raines, R.T. Protein. Sci. 14, 1538-1544 (2005)Fuchs, S.M. and Raines, R.T.Protein. Sci. 14, 1538-1544 (2005) Willett et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7817-7822 (2005)Willett et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7817-7822 (2005) Taniguchi et al. Biotechnol. Bioeng. 96, 1023-1029 (2007)Taniguchi et al. Biotechnol. Bioeng. 96, 1023-1029 (2007)

しかしながら、タンパク質の構成要素であるアミノ酸は、酸化ケイ素および窒化ケイ素に対して同様の結合性を示すことが知られている(例えば、非特許文献2参照)。また、特許文献1および非特許文献3に開示されているタンパク質もまた、酸化ケイ素および窒化ケイ素の両方に対して結合性を示し、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別することができない。   However, it is known that amino acids that are constituents of proteins exhibit similar binding properties to silicon oxide and silicon nitride (see, for example, Non-Patent Document 2). Further, the proteins disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 3 also show binding properties to both silicon oxide and silicon nitride, and cannot distinguish between silicon oxide and silicon nitride.

このように、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別し得るタンパク質は見出されていないばかりか、そのようなタンパク質の存在は示唆もされていない。もちろん、これまでの技術常識に基づけば、そのようなタンパク質を探索すること自体が全く動機付けられていない。   Thus, a protein capable of distinguishing between silicon oxide and silicon nitride has not been found, and the existence of such a protein has not been suggested. Of course, based on the common technical knowledge so far, searching for such proteins is not motivated at all.

本発明の目的は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する技術を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a technique for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride.

本発明者らは、独自の観点に基づいて、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別し得るタンパク質の探索を行い、独自の創意工夫および試行錯誤の結果、所望のタンパク質を見出し、本発明を完成するに至った。上述したように、従来の知られていた知見からは、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別し得るタンパク質の存在すら示唆されていない。もちろん、本発明を完成するに至る手順は、当該分野における技術常識でも技術水準でもない。   The inventors of the present invention search for a protein that can distinguish between silicon oxide and silicon nitride based on a unique viewpoint, find a desired protein as a result of original ingenuity and trial and error, and complete the present invention. It came to. As described above, the conventionally known knowledge does not suggest the existence of a protein capable of distinguishing between silicon oxide and silicon nitride. Of course, the procedure to complete the present invention is neither technical common sense nor technical level in the field.

本発明の組成物は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するために、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドのいずれか一方を含有していることを特徴としている。本発明において、第1ポリペプチドは、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しないポリペプチドであり、以下の(A)〜(C)のいずれかであることが好ましく、第2ポリペプチドは、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しないポリペプチドであり、以下の(D)〜(F)のいずれかであることが好ましい:
(A)配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)(A)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;
(C)(A)に記載のポリペプチドと80%以上の同一性を有するポリペプチド;
(D)配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(E)(D)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;
(F)(D)に記載のポリペプチドと80%以上の同一性を有するポリペプチド。
The composition of the present invention is characterized by containing either one of the first polypeptide and the second polypeptide in order to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. In the present invention, the first polypeptide is a polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride, and is preferably any of the following (A) to (C): The peptide is a polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide, and is preferably any of the following (D) to (F):
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(B) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (A), and which specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride;
(C) a polypeptide having 80% or more identity with the polypeptide according to (A);
(D) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19;
(E) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (D), and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide;
(F) A polypeptide having 80% or more identity with the polypeptide according to (D).

本発明の第1のキットは、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するために、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドの少なくとも一方を備えていることを特徴としており、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための、上記ポリペプチドの使用手順が記載された指示書をさらに備えていることが好ましい。   The first kit of the present invention is characterized by comprising at least one of a first polypeptide and a second polypeptide in order to distinguish between silicon oxide and silicon nitride, and comprises silicon oxide and silicon nitride. It is preferable to further include an instruction describing the procedure for using the polypeptide for identification.

本発明の第2のキットは、上記組成物または第1のキットを製造するために、第1ポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチド、および第2ポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドの少なくとも一方を備えていることを特徴としており、上記組成物または第1のキットを製造するための、上記ポリペプチドの使用手順が記載された指示書をさらに備えていることが好ましい。あるいは、本発明の第2のキットは、上記組成物または第1のキットを製造するために、第1ポリヌクレオチドを含む第1ベクターおよび第2ポリヌクレオチドを含む第2ベクターの少なくとも一方を備えていることを特徴としてとしており、上記組成物または第1のキットを製造するための、上記ポリペプチドの使用手順が記載された指示書をさらに備えていることが好ましい。   In order to produce the above composition or the first kit, the second kit of the present invention comprises at least one of a first polynucleotide encoding the first polypeptide and a second polynucleotide encoding the second polypeptide. It is preferable that the apparatus further comprises an instruction describing the procedure for using the polypeptide for producing the composition or the first kit. Alternatively, the second kit of the present invention comprises at least one of a first vector containing the first polynucleotide and a second vector containing the second polynucleotide in order to produce the composition or the first kit. It is preferable that the apparatus further comprises an instruction describing the procedure for using the polypeptide for producing the composition or the first kit.

本発明の方法は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するために、上述した、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチド、組成物またはキットを用いることを特徴としている。   The method of the present invention is characterized by using the above-described polypeptide, composition or kit having the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride in order to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. .

本発明の基板は、酸化ケイ素および窒化ケイ素の少なくとも一方が所望の形状にて形成されている表面を有し、該酸化ケイ素には、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドが結合しており、該窒化ケイ素には、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドが結合していることを特徴としている。   The substrate of the present invention has a surface on which at least one of silicon oxide and silicon nitride is formed in a desired shape, and the silicon oxide specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. One polypeptide is bound, and the silicon nitride is characterized in that a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide is bound.

本発明の半導体デバイスは、上記基板を具備していることを特徴としている。   A semiconductor device according to the present invention includes the above-described substrate.

本発明の第1ポリペプチドの取得方法は、添加された窒化ケイ素とともにタンパク質溶液をインキュベートする工程、インキュベート後の該溶液から窒化ケイ素を除去する工程、窒化ケイ素を除去したタンパク質溶液を酸化ケイ素とともにインキュベートする工程、回収した酸化ケイ素を洗浄する工程、洗浄後の酸化ケイ素から結合タンパク質を単離する工程を包含することを特徴としており、必要に応じて、窒化ケイ素の添加、および窒化ケイ素とのタンパク質溶液のインキュベートが複数回行われてもよい。   The method for obtaining the first polypeptide of the present invention comprises a step of incubating a protein solution with added silicon nitride, a step of removing silicon nitride from the incubated solution, and incubating the protein solution from which silicon nitride has been removed with silicon oxide. And a step of washing the recovered silicon oxide, and a step of isolating the binding protein from the washed silicon oxide. If necessary, adding silicon nitride, and protein with silicon nitride Incubation of the solution may be performed multiple times.

本発明の第2ポリペプチドの取得方法は、添加された酸化ケイ素とともにタンパク質溶液をインキュベートする工程、インキュベート後の該溶液から酸化ケイ素を除去する工程、酸化ケイ素を除去したタンパク質溶液を窒化ケイ素とともにインキュベートする工程、回収した窒化ケイ素を洗浄する工程、洗浄後の窒化ケイ素から結合タンパク質を単離する工程を包含することを特徴としており、必要に応じて、酸化ケイ素の添加、および酸化ケイ素とのタンパク質溶液のインキュベートが複数回行われてもよい。   The method for obtaining the second polypeptide of the present invention comprises a step of incubating a protein solution with added silicon oxide, a step of removing silicon oxide from the solution after incubation, and incubating the protein solution from which silicon oxide has been removed with silicon nitride. And the step of washing the recovered silicon nitride, and the step of isolating the binding protein from the washed silicon nitride. If necessary, adding silicon oxide and protein with silicon oxide Incubation of the solution may be performed multiple times.

本発明は、酸化ケイ素と窒化ケイ素との識別を可能にするので、半導体の絶縁膜に、窒化ケイ素および酸化ケイ素を形成(パターニング)しておくことによって、絶縁膜上に所望のタンパク質をパターニングすることができ、その結果、基板上に目的のタンパク質を配列させることができ、さらに目的のタンパク質を配列した基板を具備する、高感度なセンシングを実現し得る半導体デバイス(バイオチップ、バイオセンサなど)を作製することができる。また、パターニングされたタンパク質に細胞を特異的に吸着させることによって細胞のパターニングが実現し、目的に応じた細胞培養が容易に可能となり、例えば、神経細胞を人為的にパターニングして生体伝達回路を形成することができる。さらに、本発明に用いられるポリペプチドを接着分子として用いることによって半導体表面材料に応じた位置特異的タンパク質固定化が可能になる。   Since the present invention makes it possible to distinguish between silicon oxide and silicon nitride, patterning a desired protein on the insulating film by forming (patterning) silicon nitride and silicon oxide on the semiconductor insulating film. As a result, the target protein can be arranged on the substrate, and the semiconductor device (biochip, biosensor, etc.) that has a substrate on which the target protein is arranged and can realize highly sensitive sensing Can be produced. In addition, cell patterning is realized by specifically adsorbing cells to the patterned protein, and cell culture according to the purpose can be easily performed. For example, artificially patterning nerve cells to form a biotransmission circuit Can be formed. Furthermore, by using the polypeptide used in the present invention as an adhesion molecule, position-specific protein immobilization according to the semiconductor surface material becomes possible.

酸化ケイ素または窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質を示す図である。It is a figure which shows the protein couple | bonded specifically with a silicon oxide or silicon nitride. 酸化ケイ素または窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質を示す図である。It is a figure which shows the protein couple | bonded specifically with a silicon oxide or silicon nitride. 酸化ケイ素または窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質を示す図である。It is a figure which shows the protein couple | bonded specifically with a silicon oxide or silicon nitride. 酸化ケイ素または窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質の、種々の条件下における結合状態を示す図である。It is a figure which shows the binding state on various conditions of the protein couple | bonded specifically with a silicon oxide or silicon nitride. 酸化ケイ素または窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質を示す図である。It is a figure which shows the protein couple | bonded specifically with a silicon oxide or silicon nitride. リコンビナントタンパク質の、酸化ケイ素に対する結合特異性および結合親和性を示す図である。It is a figure which shows the binding specificity and binding affinity with respect to a silicon oxide of a recombinant protein. リコンビナントタンパク質の、窒化ケイ素に対する結合特異性および結合親和性を示す図である。It is a figure which shows the binding specificity and binding affinity with respect to silicon nitride of recombinant protein.

〔1:ポリペプチドおよびポリヌクレオチド〕
本発明は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチドを提供する。本明細書中において使用される場合、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチドである。第1ポリペプチドは、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しないポリペプチドが意図され、第2ポリペプチドは、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しないポリペプチドが意図される。
[1: Polypeptide and polynucleotide]
The present invention provides polypeptides having the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. As used herein, a first polypeptide and a second polypeptide are polypeptides that have the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. The first polypeptide is intended to be a polypeptide that specifically binds to silicon oxide and not to silicon nitride, and the second polypeptide is intended to be a polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. Is done.

第1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得るが、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しないポリペプチドである限り、配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したポリペプチドであっても、配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと80%以上の同一性を有するポリペプチドであってもよい。   The first polypeptide may preferably be a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, but is a polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. As long as the polypeptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, even if it is a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, SEQ ID NO: 1, 3, 5 or The polypeptide which has 80% or more of identity with the polypeptide which consists of an amino acid sequence shown by 7 may be sufficient.

第2ポリペプチドは、好ましくは、配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得るが、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しないポリペプチドである限り、配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したポリペプチドであっても、配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと80%以上の同一性を有するポリペプチドであってもよい。   The second polypeptide may preferably be a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19, but specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. As long as it is a polypeptide, it may be a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19, It may be a polypeptide having 80% or more identity with a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19.

ポリペプチド(アミノ酸)の観点で用いられる場合、「1または数個」は、当業者が、過度の実験を行うことなく、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法によって欠失、置換もしくは付加し得る程度の数が意図され、1〜30個の範囲内であることが好ましく、20個以下であることがより好ましく、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個であることがさらに好ましく、1、2、3、4または5個であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリペプチドの長さに応じて、用語「1または数個」によって示されるアミノ酸数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得るとともに、過度の実験を行うことなく、「1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド」を作製し得る。また、このようなポリペプチドは、人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されず、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。   When used in terms of a polypeptide (amino acid), “one or several” is deleted by a person skilled in the art by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis without undue experimentation. , A number that can be substituted or added is intended, preferably in the range of 1-30, more preferably 20 or less, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, More preferably 8, 9, or 10, still more preferably 1, 2, 3, 4 or 5. A person skilled in the art can easily understand the range of the number of amino acids indicated by the term “one or several” according to the length of the target polypeptide and perform an excessive experiment. Instead, a “polypeptide in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added” can be produced. Further, such a polypeptide is not limited to a polypeptide having a mutation introduced artificially, and may be a product obtained by isolating and purifying a naturally occurring polypeptide.

本明細書中で使用される場合、目的のポリペプチドについての同一性は、80%以上であることが好ましく、85%以上であることがより好ましく、90%以上であることがさらに好ましく、95%以上であることがなおさらに好ましく、99%以上であることが最も好ましい。   As used herein, identity for the polypeptide of interest is preferably 80% or higher, more preferably 85% or higher, still more preferably 90% or higher, 95 % Or more is more preferable, and 99% or more is most preferable.

本発明のポリペプチドは、付加的なペプチドを含んでいてもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ(His−tag)、Myc、Flag等のエピトープが挙げられる。   The polypeptide of the present invention may contain an additional peptide. Examples of the additional peptide include epitopes such as a polyhistidine tag (His-tag), Myc, and Flag.

本明細書中において使用される場合、第1ポリヌクレオチドは第1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、第2ポリヌクレオチドは第2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。   As used herein, the first polynucleotide is intended to be a polynucleotide encoding a first polypeptide, and the second polynucleotide is intended to be a polynucleotide encoding a second polypeptide.

第1ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号2、4、6または8に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり得るが、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しないポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、配列番号2、4、6または8に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて1または数個のヌクレオチドが欠失、置換または付加したポリヌクレオチドであっても、
配列番号2、4、6または8に示されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであっても、配列番号2、4、6または8に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
The first polynucleotide may preferably be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, but encodes a polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. A polynucleotide having one or several nucleotides deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8,
Even a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 is shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. It may be a polynucleotide having 80% identity or more with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence.

第2ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号10、12、14、16、18または20に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり得るが、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しないポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、配列番号10、12、14、16、18または20に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて1または数個のヌクレオチドが欠失、置換または付加したポリヌクレオチドであっても、配列番号10、12、14、16、18または20に示されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであっても、配列番号10、12、14、16、18または20に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。   The second polynucleotide may preferably be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, or 20, but specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. As long as it is a polynucleotide encoding a polypeptide, a polynucleotide in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 or 20 Even if it is a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 or 20, Shown on 10, 12, 14, 16, 18 or 20 It may be a polynucleotide with a polynucleotide having 80% or more identity consisting of the nucleotide sequence.

ポリヌクレオチド(塩基)の観点で用いられる場合、「1または数個」は、1〜100個の範囲内であることが好ましく、1〜50個の範囲内であることがより好ましく、1〜30個の範囲内であることがさらに好ましく、1〜15個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリヌクレオチドの長さに応じて、用語「1または数個」によって示される塩基数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。   When used in terms of polynucleotide (base), “one or several” is preferably in the range of 1 to 100, more preferably in the range of 1 to 50, and 1 to 30. More preferably, it is in the range of 1 to 15, and still more preferably in the range of 1 to 15. A person skilled in the art can easily understand the extent of the range of the number of bases indicated by the term “one or several” depending on the length of the target polynucleotide.

本明細書中で使用される場合、目的のポリヌクレオチドについての同一性は、80%以上であることが好ましく、85%以上であることがより好ましく、90%以上であることがさらに好ましく、95%以上であることがなおさらに好ましく、99%以上であることが最も好ましい。   As used herein, identity for the polynucleotide of interest is preferably 80% or higher, more preferably 85% or higher, even more preferably 90% or higher, 95 % Or more is more preferable, and 99% or more is most preferable.

本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることによって、目的のタンパク質を本発明のポリペプチドを介して支持体上に固定化することができるので、基板上に目的のタンパク質を配列させることができ、さらに目的のタンパク質を配列した基板を具備する半導体デバイスを作製することができる。本明細書中において使用される場合、「目的のタンパク質」は、バイオセンサ等の半導体デバイスに用いられる基板上に配列されるべきタンパク質が意図され、精製されたタンパク質(例えば、抗体など)であっても、未精製のタンパク質を細胞外へ提示/露出している細胞であってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることによって、細胞を本発明のポリペプチドを介して支持体上に固定化することができるので、基板上に目的の細胞を配列させることができ、さらに目的の細胞を配列した基板を具備する半導体デバイスを作製することができる。このように、本明細書中において使用される場合、用語「目的のタンパク質」には、「タンパク質(ポリペプチド)」だけでなく「細胞」もまた含まれる。   By using the polypeptide and polynucleotide of the present invention, the target protein can be immobilized on the support via the polypeptide of the present invention, so that the target protein can be arranged on the substrate, Furthermore, a semiconductor device including a substrate on which a target protein is arranged can be manufactured. As used herein, a “target protein” is a protein that is intended to be arranged on a substrate used in a semiconductor device such as a biosensor, and is a purified protein (eg, an antibody). Alternatively, it may be a cell presenting / exposing unpurified protein outside the cell. That is, by using the polypeptide and polynucleotide of the present invention, cells can be immobilized on a support via the polypeptide of the present invention, so that target cells can be arranged on a substrate, Furthermore, a semiconductor device including a substrate on which target cells are arranged can be manufactured. Thus, as used herein, the term “protein of interest” includes not only “protein (polypeptide)” but also “cell”.

第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは、公知の遺伝子工学的手法によって組換え発現ベクターを構築し、好適な宿主細胞にこのベクターを導入して組換えタンパク質として発現させることによって生産し得る。特に、上述した付加的なペプチドは、組換え的なポリペプチド生成によって容易に付加され得る。   The first polypeptide and the second polypeptide can be produced by constructing a recombinant expression vector by a known genetic engineering technique, introducing the vector into a suitable host cell and expressing it as a recombinant protein. In particular, the additional peptides described above can be easily added by recombinant polypeptide production.

組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。   A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.

ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。   The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it.

本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して適宜選択される慣用的なプロモーターを含んでいる。また、発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましく、用いられる系に応じて、当業者によって適宜選択される。発現ベクターの作製および宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。さらに、形質転換された宿主から、慣用的な手法に従って、目的タンパク質を回収/精製することができる。   The expression vector according to the present invention contains a conventional promoter that is appropriately selected depending on the type of host to be introduced. The expression vector preferably contains at least one selectable marker, and is appropriately selected by those skilled in the art depending on the system used. Expression vector preparation and host transformation can also be performed according to conventional techniques. Furthermore, the target protein can be recovered / purified from the transformed host according to a conventional technique.

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。   A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .

本発明のポリペプチドは、酸化ケイ素と窒化ケイ素との識別を可能にする。酸化ケイ素および窒化ケイ素はいずれも半導体表面材料として汎用されている素材であり、半導体加工技術による微細加工が容易である。本発明を用いることによって、半導体デバイス、ナノテクノロジー、MEMS技術などにタンパク質を容易に組み合わせることができる。また、表面上に酸化ケイ素および/または窒化ケイ素のパターニングを施しておくことによって、標的位置にのみタンパク質を固定化することができる。これにより、例えば、バイオセンサの高感度化、センサ上での細胞固定、複数種のタンパク質をナノスケールにて整列させることが可能となる。   The polypeptides of the present invention allow discrimination between silicon oxide and silicon nitride. Silicon oxide and silicon nitride are both materials that are widely used as semiconductor surface materials, and are easily finely processed by semiconductor processing technology. By using the present invention, proteins can be easily combined with semiconductor devices, nanotechnology, MEMS technology, and the like. Further, by patterning silicon oxide and / or silicon nitride on the surface, the protein can be immobilized only at the target position. Thereby, for example, it is possible to increase the sensitivity of the biosensor, fix cells on the sensor, and align multiple types of proteins on the nanoscale.

〔2:組成物、キットおよび方法〕
本発明は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための組成物およびキットを提供する。本発明の組成物は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチドを含有していることを特徴としている。また、本発明のキットは、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチドを備えていることを特徴としている。
[2: Composition, kit and method]
The present invention provides compositions and kits for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride. The composition of the present invention is characterized in that it contains a polypeptide having the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. The kit of the present invention is characterized by comprising a polypeptide having the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride.

本発明の組成物およびキットを用いることによって、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別することができるので、基板の表面上にてタンパク質を所望の形状に配列することができる。すなわち、本発明の組成物およびキットは、位置特異的にタンパク質を固定化する用途に利用可能である。また、本発明の組成物およびキットを用いることによって、所望の形状に配列したタンパク質を表面上に有する基板を作製することができる。   By using the composition and kit of the present invention, it is possible to distinguish between silicon oxide and silicon nitride, so that proteins can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate. That is, the composition and kit of the present invention can be used for the purpose of immobilizing proteins in a position-specific manner. Further, by using the composition and kit of the present invention, a substrate having proteins arranged in a desired shape on the surface can be produced.

本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を、容器(例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど)に内包された態様にて備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましく、指示書には、本発明の目的を達成するための手順(例えば、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための、上記材料の使用手順)が記載されていることが好ましい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた(備えている)」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。本発明のキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。   As used herein, the term “kit” is intended to mean a package comprising a particular material in a form that is contained within a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) Forms containing materials in one substance as a composition are also encompassed by the term “kit”. The kit preferably includes instructions for using each material, including instructions for achieving the objectives of the present invention (eg, for identifying silicon oxide and silicon nitride, It is preferable to describe the use procedures of the above materials. As used herein, in the aspect of a kit, “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit. The kit of the present invention may also comprise a container containing a diluent, solvent, washing solution or other reagent.

本発明の組成物は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するために、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドのいずれか一方を含有していることを特徴としている。また、本発明の組成物は、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドの両方を含有してもよいが、この場合、本発明の組成物は、天然に存在する細胞およびその抽出液ではなく、第1ポリペプチドを含有しかつ第2ポリペプチドを含有しない組成物と、第2ポリペプチドを含有しかつ第1ポリペプチドを含有しない組成物との混合物であることが好ましく、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドの少なくとも一方を備えているキット(第1のキット)として提供されてもよい。   The composition of the present invention is characterized by containing either one of the first polypeptide and the second polypeptide in order to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. Further, the composition of the present invention may contain both the first polypeptide and the second polypeptide. In this case, the composition of the present invention is not a naturally occurring cell and its extract, Preferably, it is a mixture of a composition containing the first polypeptide and not containing the second polypeptide and a composition containing the second polypeptide and not containing the first polypeptide, and the first polypeptide and You may provide as a kit (1st kit) provided with at least one of 2nd polypeptide.

本発明のキット(第2のキット)は、上記組成物または第1のキットを製造するために提供され得、第1ポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチド、および第2ポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドの少なくとも一方を備えていることを特徴としている。あるいは、本発明の第2のキットは、上記組成物または第1のキットを製造するために、第1ポリヌクレオチドを含む第1ベクターおよび第2ポリヌクレオチドを含む第2ベクターの少なくとも一方を備えていることを特徴としている。本発明の第2のキットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましく、指示書には、本発明の目的を達成するための手順(例えば、上記組成物または第1のキットを製造するための、上記材料の使用手順)が記載されていることが好ましい。酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための、第1ポリペプチドの使用手順は、(i)第1ポリペプチドを識別されるべき基材とインキュベートすること、(ii)インキュベート後の基材を回収し、その表面を洗浄すること、(iii)第1ポリペプチドに特異的に結合する因子(例えば抗体)を洗浄後の基材とインキュベートすること、(iv)インキュベート後の基材を回収し、基材の表面を洗浄すること、(v)基材の表面上に上記因子が存在するか否かを確認すること、を含めばよいが、これらに限定されない。例えば、識別可能な標識化合物(例えば、蛍光物質、放射性物質など)を第1ポリペプチドに予め結合させておけば、上記(iii)を省略することができ、上記(v)において、上記因子の代わりに上記標識化合物が存在するか否かを確認すればよい。また、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための、第2ポリペプチドの使用手順は、(vi)第2ポリペプチドを識別されるべき基材とインキュベートすること、(vii)インキュベート後の基材を回収し、その表面を洗浄すること、(viii)第2ポリペプチドに特異的に結合する因子(例えば抗体)を洗浄後の基材とインキュベートすること、(ix)インキュベート後の基材を回収し、基材の表面を洗浄すること、(x)基材の表面上に上記因子が存在するか否かを確認すること、を含めばよいが、これらに限定されない。例えば、識別可能な標識化合物(例えば、蛍光物質、放射性物質など)を第2ポリペプチドに予め結合させておけば、上記(viii)を省略することができ、上記(x)において、上記因子の代わりに上記標識化合物が存在するか否かを確認すればよい。このような手順を実行する方法、すなわち、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する方法もまた、本発明の範疇であることを、当業者は容易に認識する。   The kit of the present invention (second kit) can be provided for producing the above composition or the first kit, and includes a first polynucleotide encoding the first polypeptide, and a second polypeptide encoding the second polypeptide. It comprises at least one of 2 polynucleotides. Alternatively, the second kit of the present invention comprises at least one of a first vector containing the first polynucleotide and a second vector containing the second polynucleotide in order to produce the composition or the first kit. It is characterized by being. The second kit of the present invention preferably includes instructions for using each material, and the instructions include procedures for achieving the object of the present invention (for example, the above composition or the first). It is preferable to describe the use procedure of the above material for producing the kit. The procedure for using the first polypeptide to distinguish between silicon oxide and silicon nitride is: (i) incubating the first polypeptide with the substrate to be identified; (ii) recovering the incubated substrate. Washing the surface; (iii) incubating a factor (eg, antibody) that specifically binds to the first polypeptide with the washed substrate; (iv) recovering the incubated substrate; It may include, but is not limited to, washing the surface of the substrate, and (v) checking whether the above factors are present on the surface of the substrate. For example, if an identifiable labeling compound (for example, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc.) is preliminarily bound to the first polypeptide, (iii) can be omitted, and in (v) above, Instead, it may be confirmed whether or not the labeled compound is present. Also, the procedure for using the second polypeptide to distinguish between silicon oxide and silicon nitride includes: (vi) incubating the second polypeptide with the substrate to be identified, (vii) the substrate after incubation And (viii) incubating a factor (eg, antibody) that specifically binds to the second polypeptide with the washed substrate, and (ix) collecting the incubated substrate. And (x) confirming whether or not the above-described factors are present on the surface of the substrate, but not limited thereto. For example, if a distinguishable labeling compound (for example, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc.) is preliminarily bound to the second polypeptide, the above (viii) can be omitted. Instead, it may be confirmed whether or not the labeled compound is present. One skilled in the art will readily recognize that methods for performing such procedures, ie, methods for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride, are also within the scope of the present invention.

本発明の組成物が溶液形態で提供される場合、本明細書中において、必要に応じて、第1のポリペプチドを含有する溶液を第1溶液、第2のポリペプチドを含有する溶液を第2溶液ともいう。また、後述するように、本発明の組成物およびキット(第1および第2のキット)は、基板を製造するために用いられてもよく、この場合、製造された基板を用いて、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別することができるとともに、基板の表面上にて目的のタンパク質を所望の形状に配列することができる。   When the composition of the present invention is provided in the form of a solution, in the present specification, the solution containing the first polypeptide is referred to as the first solution, and the solution containing the second polypeptide is referred to as the first solution. Also called two solutions. Further, as will be described later, the composition and kit (first and second kits) of the present invention may be used to produce a substrate, in which case silicon oxide is produced using the produced substrate. And silicon nitride can be discriminated, and the target protein can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate.

上述したように、本発明はまた、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する方法を提供する。本発明の方法は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別する能力を有しているポリペプチド、組成物またはキットを用いることを特徴としている。本発明の方法を実行するために第1ポリペプチドを用いる場合、本発明の方法は、(I)第1ポリペプチドを識別されるべき基材とインキュベートする工程、(II)インキュベート後の基材を回収し、その表面を洗浄する工程、(III)第1ポリペプチドに特異的に結合する因子(例えば抗体)を洗浄後の基材とインキュベートする工程、(IV)インキュベート後の基材を回収し、基材の表面を洗浄する工程、(V)基材の表面上に上記因子が存在するか否かを確認する工程、を包含すればよいが、本発明を構成する工程はこれらに限定されない。例えば、識別可能な標識化合物(例えば、蛍光物質、放射性物質など)を第1ポリペプチドに予め結合させておけば、上記(III)を省略することができ、上記(V)において、上記因子の代わりに上記標識化合物が存在するか否かを確認すればよい。もちろん、本発明の方法は、第1ポリペプチドと上記標識化合物とを結合させる工程(すなわち、第1ポリペプチドを標識する工程)をさらに包含してもよい。また、本発明の方法を実行するために第2ポリペプチドを用いる場合、本発明の方法は、(VI)第2ポリペプチドを識別されるべき基材とインキュベートする工程、(VII)インキュベート後の基材を回収し、その表面を洗浄する工程、(VIII)第2ポリペプチドに特異的に結合する因子(例えば抗体)を洗浄後の基材とインキュベートする工程、(IX)インキュベート後の基材を回収し、基材の表面を洗浄する工程、(X)基材の表面上に上記因子が存在するか否かを確認する工程、を含めばよいが、本発明を構成する工程はこれらに限定されない。例えば、識別可能な標識化合物(例えば、蛍光物質、放射性物質など)を第2ポリペプチドに予め結合させておけば、上記(VIII)を省略することができ、上記(X)において、上記因子の代わりに上記標識化合物が存在するか否かを確認すればよい。もちろん、本発明の方法は、第2ポリペプチドと上記標識化合物とを結合させる工程(すなわち、第2ポリペプチドを標識する工程)をさらに包含してもよい。   As mentioned above, the present invention also provides a method for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride. The method of the invention is characterized by using a polypeptide, composition or kit having the ability to distinguish between silicon oxide and silicon nitride. When using the first polypeptide to perform the method of the present invention, the method of the present invention comprises (I) incubating the first polypeptide with the substrate to be identified, (II) the substrate after incubation. And (III) a step of incubating a factor (for example, an antibody) that specifically binds to the first polypeptide with the substrate after washing, and (IV) collecting the substrate after the incubation. And (V) a step of confirming whether or not the above-mentioned factor is present on the surface of the substrate, but the steps constituting the present invention are limited to these steps. Not. For example, if a distinguishable labeling compound (for example, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc.) is preliminarily bound to the first polypeptide, the above (III) can be omitted. Instead, it may be confirmed whether or not the labeled compound is present. Of course, the method of the present invention may further include a step of binding the first polypeptide and the labeling compound (that is, a step of labeling the first polypeptide). Also, when using a second polypeptide to carry out the method of the invention, the method of the invention comprises (VI) incubating the second polypeptide with a substrate to be identified, (VII) after incubation Recovering the substrate and washing its surface; (VIII) incubating a factor (eg, antibody) that specifically binds to the second polypeptide with the washed substrate; (IX) after incubation And (X) a step of confirming whether or not the above-mentioned factor is present on the surface of the substrate, the steps constituting the present invention are included in these steps. It is not limited. For example, if a distinguishable labeling compound (for example, a fluorescent substance, a radioactive substance, etc.) is preliminarily bound to the second polypeptide, (VIII) can be omitted. Instead, it may be confirmed whether or not the labeled compound is present. Of course, the method of the present invention may further include a step of binding the second polypeptide and the labeling compound (that is, a step of labeling the second polypeptide).

〔3:基板および半導体デバイス〕
本発明は、目的のタンパク質を所望の形状に配列するための基板を提供する。本発明の基板を用いれば、バイオセンサ等の半導体デバイスを製造することができる。
[3: Substrate and semiconductor device]
The present invention provides a substrate for arranging a target protein in a desired shape. If the substrate of the present invention is used, a semiconductor device such as a biosensor can be manufactured.

一実施形態において、本発明の第1の基板は、酸化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有しており、該表面に形成された酸化ケイ素に、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドが結合していることを特徴としている。本実施形態を用いれば、第1ポリペプチドを介して、基板の表面上にて目的のタンパク質を所望の形状に配列することができる。本実施形態の第1の基板は、上記表面に、窒化ケイ素が所望の形状にてさらに形成されていてもよく、この場合、該表面に形成された窒化ケイ素に、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドが結合していることが好ましい。この場合、本実施形態を用いれば、第2ポリペプチドを介して、基板の表面上にてさらなる目的のタンパク質を所望の形状に配列することができる。   In one embodiment, the first substrate of the present invention has a surface on which silicon oxide is formed in a desired shape, and specifically binds to silicon oxide on the silicon oxide formed on the surface. And a first polypeptide that does not bind to silicon nitride is bonded. If this embodiment is used, the target protein can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate via the first polypeptide. In the first substrate of this embodiment, silicon nitride may be further formed on the surface in a desired shape. In this case, the silicon nitride formed on the surface specifically binds to silicon nitride. In addition, it is preferable that a second polypeptide that does not bind to silicon oxide is bound. In this case, if this embodiment is used, a further target protein can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate via the second polypeptide.

他の実施形態において、本発明の第2の基板は、窒化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有しており、該表面に形成された窒化ケイ素に、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドが結合していることを特徴としている。本実施形態を用いれば、第2ポリペプチドを介して、基板の表面上にて目的のタンパク質を所望の形状に配列することができる。本実施形態の第2の基板は、上記表面に、酸化ケイ素が所望の形状にて形成されていてもよく、この場合、該表面に形成された酸化ケイ素に、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドが結合していることが好ましい。この場合、本実施形態を用いれば、第1ポリペプチドを介して、基板の表面上にてさらなる目的のタンパク質を所望の形状に配列することができる。   In another embodiment, the second substrate of the present invention has a surface on which silicon nitride is formed in a desired shape, and the silicon nitride formed on the surface is specific to silicon nitride. A second polypeptide that binds and does not bind to silicon oxide is bonded. If this embodiment is used, the target protein can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate via the second polypeptide. In the second substrate of this embodiment, silicon oxide may be formed on the surface in a desired shape. In this case, the silicon oxide formed on the surface specifically binds to silicon oxide. And it is preferable that the 1st polypeptide which is not couple | bonded with silicon nitride has couple | bonded. In this case, if this embodiment is used, a further target protein can be arranged in a desired shape on the surface of the substrate via the first polypeptide.

さらなる実施形態において、本発明の第3の基板は、酸化ケイ素および窒化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有しており、該表面に形成された酸化ケイ素に、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドが結合しており、該表面に形成された窒化ケイ素に、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドが結合していることを特徴としている。   In a further embodiment, the third substrate of the present invention has a surface on which silicon oxide and silicon nitride are formed in a desired shape, and the silicon oxide formed on the surface is specific to silicon oxide. A first polypeptide that binds to the surface and does not bind to silicon nitride is bound, and a second polypeptide that binds specifically to silicon nitride and does not bind to silicon oxide is bound to silicon nitride formed on the surface. It is characterized by that.

上述したように、酸化ケイ素および窒化ケイ素はいずれも半導体表面材料として汎用されている素材であり、半導体加工技術による微細加工が容易である。よって、当業者は、周知技術を用いて、基板の表面上に、酸化ケイ素および窒化ケイ素を任意の形状に適宜形成することができる。   As described above, both silicon oxide and silicon nitride are materials that are widely used as semiconductor surface materials, and are easily finely processed by semiconductor processing technology. Therefore, those skilled in the art can appropriately form silicon oxide and silicon nitride in an arbitrary shape on the surface of the substrate using a well-known technique.

本発明の基板は、上記組成物または第1および第2のキットを用いて製造されてもよい。例えば、本発明の第1の基板は、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有しかつ窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有していない第1溶液を、酸化ケイ素が所望の形状にて形成されている基板表面と接触させる工程を包含する第1の製造方法によって製造され得、第1ポリペプチドは、上記組成物または第1および第2のキットによって提供される。第1の製造方法は、基板表面に、酸化ケイ素を所望の形状にて形成する工程をさらに包含してもよい。   The substrate of the present invention may be manufactured using the above composition or the first and second kits. For example, the first substrate of the present invention contains a first polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride, and includes a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. A first solution that does not contain a peptide can be produced by a first production method comprising the step of bringing a first solution into contact with a substrate surface on which silicon oxide is formed in a desired shape. Or provided by the first and second kits. The first manufacturing method may further include a step of forming silicon oxide in a desired shape on the substrate surface.

また、本発明の第2の基板は、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有しかつ酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有していない第2溶液を、窒化ケイ素が所望の形状にて形成されている基板表面と接触させる工程を包含する第2の製造方法によって製造され得、第2ポリペプチドは、上記組成物または第1および第2のキットによって提供される。第2の製造方法は、基板表面に、窒化ケイ素を所望の形状にて形成する工程をさらに包含してもよい。   Further, the second substrate of the present invention contains a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide, and specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. A second solution that does not contain a peptide can be produced by a second production method comprising a step of bringing a second solution into contact with a substrate surface on which silicon nitride is formed in a desired shape. Or provided by the first and second kits. The second manufacturing method may further include a step of forming silicon nitride in a desired shape on the substrate surface.

本発明の第3の基板は、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有しかつ窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有していない第1溶液と、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有しかつ酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有していない第2溶液とを混合して混合溶液を生成する工程、および、該混合溶液を、酸化ケイ素および窒化ケイ素がそれぞれ所望の形状にて形成されている基板表面と接触させる工程を包含する第3の製造方法によって製造され得、第1および第2ポリペプチドは、上記組成物または第1および第2のキットによって提供される。第3の製造方法は、基板表面に、酸化ケイ素および窒化ケイ素を所望の形状にて形成する工程をさらに包含してもよい。   The third substrate of the present invention contains a first polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride, and includes a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. A first solution that does not contain, and a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide, and that binds specifically to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. Including a step of mixing a second solution not containing to form a mixed solution, and a step of bringing the mixed solution into contact with a substrate surface on which silicon oxide and silicon nitride are formed in a desired shape, respectively. The first and second polypeptides are provided by the above composition or the first and second kits. The third manufacturing method may further include a step of forming silicon oxide and silicon nitride in a desired shape on the substrate surface.

また、本発明の第3の基板は、第1および第2の製造方法によって製造されてもよい。この場合、第1の製造方法は、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有しかつ酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有していない第2溶液を、基板表面と接触させる工程をさらに包含し、第1の製造方法が適用される基板表面には、窒化ケイ素が所望の形状にてさらに形成されているので、基板表面に、窒化ケイ素を所望の形状にて形成する工程をさらに包含してもよい。また、第2の製造方法は、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを含有しかつ窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを含有していない第1溶液を、基板表面と接触させる工程をさらに包含し、第2の製造方法が適用される基板表面には、酸化ケイ素が所望の形状にてさらに形成されているので、基板表面に、酸化ケイ素を所望の形状にて形成する工程をさらに包含してもよい。   Further, the third substrate of the present invention may be manufactured by the first and second manufacturing methods. In this case, the first production method includes a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide, and specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. The method further includes a step of bringing the second solution that does not contain the substrate into contact with the substrate surface, and silicon nitride is further formed in a desired shape on the substrate surface to which the first manufacturing method is applied. You may further include the process of forming silicon nitride in a desired shape on the substrate surface. In addition, the second production method includes a first polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride, and includes a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. The substrate further includes a step of bringing the first solution not contained into contact with the substrate surface, and silicon oxide is further formed in a desired shape on the substrate surface to which the second manufacturing method is applied. A step of forming silicon oxide in a desired shape on the surface may be further included.

本発明の半導体デバイスは、本発明の組成物、本発明の第1および第2のキットのいずれかを用いて製造されてもよく、製造手順の具体例は、上述した基板の製造方法に準じればよい。また、本発明の半導体デバイスは、以下の第3のキットを用いて製造されてもよい。   The semiconductor device of the present invention may be manufactured using any one of the composition of the present invention and the first and second kits of the present invention, and specific examples of the manufacturing procedure conform to the above-described substrate manufacturing method. Just do it. The semiconductor device of the present invention may be manufactured using the following third kit.

本発明はさらに、半導体デバイスを製造するためのキット(第3のキット)を提供する。本発明の第3のキットは、半導体デバイスを製造するために、基板を製造するための組成物または基板を製造するためのキット(第1および第2のキット)と、所定の基板とを備えていることを特徴としている。   The present invention further provides a kit (third kit) for manufacturing a semiconductor device. The third kit of the present invention comprises a composition for producing a substrate or a kit for producing a substrate (first and second kits) and a predetermined substrate for producing a semiconductor device. It is characterized by having.

一実施形態において、本発明の第3のキットは、酸化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有する基板、および、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドを備えている。また、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドをさらに備えていてもよく、この場合、上記表面には、窒化ケイ素が所望の形状にてさらに形成されている。   In one embodiment, the third kit of the present invention comprises a substrate having a surface on which silicon oxide is formed in a desired shape, and a first poly that binds specifically to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. It has a peptide. Further, a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide may be further provided. In this case, silicon nitride is further formed in a desired shape on the surface.

他の実施形態において、本発明の第3のキットは、窒化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有する基板、および、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを備えている。また、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチドをさらに備えていてもよく、この場合、上記表面には、酸化ケイ素が所望の形状にてさらに形成されている。   In another embodiment, the third kit of the present invention includes a substrate having a surface on which silicon nitride is formed in a desired shape, and a second that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide. It has a polypeptide. In addition, a first polypeptide that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride may be further provided. In this case, silicon oxide is further formed in a desired shape on the surface.

さらなる実施形態において、本発明の第3のキットは、酸化ケイ素および窒化ケイ素が所望の形状にて形成されている表面を有する基板、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない第1ポリペプチド、および、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない第2ポリペプチドを備えている。   In a further embodiment, the third kit of the present invention provides a substrate having a surface on which silicon oxide and silicon nitride are formed in a desired shape, a first that specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride. A polypeptide and a second polypeptide that specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide.

〔4:位置特異的にタンパク質を固定化する方法〕
本発明の、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドを用いれば、目的のタンパク質を位置特異的に固定化することができる。すなわち、本発明は、タンパク質の固定化方法を提供するといえる。本発明の固定化方法は、本発明のポリペプチド、本発明の組成物、あるいは本発明のキット(第1のキットまたは第2のキット)を用いることを特徴としている。
[4: Method for immobilizing proteins in a position-specific manner]
If the polypeptide for discriminating between silicon oxide and silicon nitride according to the present invention is used, the target protein can be immobilized in a position-specific manner. That is, it can be said that the present invention provides a protein immobilization method. The immobilization method of the present invention is characterized by using the polypeptide of the present invention, the composition of the present invention, or the kit of the present invention (first kit or second kit).

本明細書中で使用される場合、タンパク質の「固定化」は、支持体の表面にタンパク質が結合されることが意図される。支持体は表面上に酸化ケイ素および/または窒化ケイ素が呈示されていればよく、酸化ケイ素および/または窒化ケイ素そのものであっても、酸化ケイ素および/または窒化ケイ素が表面に結合した基板であってもよい。   As used herein, “immobilization” of a protein is intended to mean that the protein is bound to the surface of the support. The support only needs to be provided with silicon oxide and / or silicon nitride on the surface, and may be silicon oxide and / or silicon nitride itself, or a substrate having silicon oxide and / or silicon nitride bonded to the surface. Also good.

すなわち、本発明の固定化方法は、本発明のポリペプチドを、支持体の表面上に呈示された酸化ケイ素および/または窒化ケイ素と接触させる工程を包含すればよく、本発明のポリペプチドが支持体に固定化されたか否かを、例えば本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて確認する工程をさらに包含してもよい。本発明の固定化方法に用いられるポリペプチドは、精製されていても精製されていなくてもよく、上述した組成物またはキットとして提供されたものであってもよい。   That is, the immobilization method of the present invention may include a step of bringing the polypeptide of the present invention into contact with the silicon oxide and / or silicon nitride presented on the surface of the support, and the polypeptide of the present invention supports it. You may further include the process of confirming whether it was fix | immobilized by the body using the antibody with respect to the polypeptide of this invention, for example. The polypeptide used in the immobilization method of the present invention may be purified or not purified, or may be provided as the above-described composition or kit.

本発明の固定化方法を利用すれば、本発明のポリペプチドを介して、ケイ素化合物と目的のタンパク質との無機有機ハイブリッド素材を容易に作製することが可能となる。例えば、プロテアーゼを結合させたガラスを作製すれば、タンパク質の汚れに強いガラスを提供できる。また、細胞の増殖に必要なタンパク質を結合させたガラスを作製すれば、ガラス表面に細胞を増殖させることができる。これは人工臓器などへの応用が期待される。   If the immobilization method of the present invention is used, an inorganic-organic hybrid material of a silicon compound and a target protein can be easily produced via the polypeptide of the present invention. For example, if a glass to which protease is bound is produced, a glass that is resistant to protein stains can be provided. Moreover, if a glass to which a protein necessary for cell growth is bound is produced, cells can be grown on the glass surface. This is expected to be applied to artificial organs.

また、タンパク質を結合させたシリカナノパーティクルを用いて細菌を検出する技術が報告されており(A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Zhao X, Hilliard LR, Mechery SJ, Wang Y, Bagwe RP, Jin S, Tan W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,15027-15032, 2004)、本発明を用いれば、このような技術に利用可能な量子ドット効果を持つシリカナノパーティクルとタンパク質との複合体を簡便に作製することができる。   In addition, a technique for detecting bacteria using protein-bound silica nanoparticles has been reported (A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Zhao X, Hilliard LR, Mechery SJ, Wang Y, Bagwe RP, Jin S, Tan W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,15027-15032, 2004). By using the present invention, silica nanoparticles having a quantum dot effect that can be used in such a technology and proteins A complex can be easily produced.

さらに、半導体基板上にタンパク質分子を配置させることで、生物と電子機器との間の情報交換を可能とするヒューマンインターフェイステクノロジーの基盤技術への応用が期待される。   Furthermore, by arranging protein molecules on a semiconductor substrate, it is expected to be applied to the basic technology of human interface technology that enables information exchange between living organisms and electronic devices.

〔5:酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドを取得する方法〕
本発明は、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドを取得する方法を提供する。上記ポリペプチドが第1ポリペプチドである場合、本発明の方法は、第1ポリペプチドを取得する方法であり得、添加された窒化ケイ素とともにタンパク質溶液をインキュベートする工程、インキュベート後の該溶液から窒化ケイ素を除去する工程、窒化ケイ素を除去したタンパク質溶液を酸化ケイ素とともにインキュベートする工程、酸化ケイ素を回収する工程、回収した酸化ケイ素を洗浄する工程、洗浄後の酸化ケイ素から結合タンパク質を単離する工程を包含することを特徴としている。必要に応じて、窒化ケイ素の添加、および窒化ケイ素とのタンパク質溶液のインキュベートを複数回行ってもよい。また、単離されたタンパク質が窒化ケイ素に結合しないことを確認する工程をさらに包含してもよい。
[5: Method for obtaining a polypeptide for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride]
The present invention provides a method for obtaining a polypeptide that distinguishes between silicon oxide and silicon nitride. When the polypeptide is the first polypeptide, the method of the present invention may be a method for obtaining the first polypeptide, incubating the protein solution with the added silicon nitride, and nitriding from the solution after incubation. A step of removing silicon, a step of incubating a protein solution from which silicon nitride has been removed with silicon oxide, a step of recovering silicon oxide, a step of washing the recovered silicon oxide, and a step of isolating the binding protein from the washed silicon oxide It is characterized by including. If necessary, addition of silicon nitride and incubation of the protein solution with silicon nitride may be performed a plurality of times. Moreover, you may further include the process of confirming that the isolated protein does not couple | bond with silicon nitride.

タンパク質溶液中のタンパク質は、天然のタンパク質の全長であってもフラグメントであってもよい。また、タンパク質溶液には複数種のタンパク質が含まれていることが好ましく、例えば、細胞や組織からの抽出液または破砕液が挙げられ、ファージライブラリー由来のランダムペプチドライブラリー、合成ペプチドライブラリー等であってもよい。また、タンパク質溶液にはタンパク質以外の物質が含まれていてもよい。   The protein in the protein solution may be the full length or a fragment of the natural protein. In addition, the protein solution preferably contains a plurality of types of proteins, such as an extract or disrupted solution from cells or tissues, such as a random peptide library derived from a phage library, a synthetic peptide library, etc. It may be. In addition, the protein solution may contain substances other than proteins.

タンパク質溶液の調製は、用いる材料に応じて適宜公知の方法を選択すればよい。例えば細胞破砕液を調製する場合には、ホモジナイザー、超音波などによって物理的に細胞を破砕する方法、酵素や界面活性剤を用いて細胞を破砕する方法、酵素や界面活性剤と物理的方法を組み合わせて細胞を破砕する方法などを用いることができる。   The protein solution may be prepared by appropriately selecting a known method depending on the material to be used. For example, when preparing a cell disruption solution, a method of physically disrupting cells using a homogenizer, ultrasonic waves, etc., a method of disrupting cells using an enzyme or a surfactant, and a physical method of enzyme or surfactant A method of disrupting cells in combination can be used.

添加する窒化ケイ素の量は、用いられる反応系に応じて適宜設計され得る。タンパク質溶液に窒化ケイ素を添加した後は、当該タンパク質と窒化ケイ素との混合液を十分混和することによってインキュベートされることが好ましい。混和する条件は特に限定されないが、例えば4℃で15〜30分間転倒混和することが挙げられる。   The amount of silicon nitride to be added can be appropriately designed according to the reaction system used. After adding silicon nitride to the protein solution, it is preferable to incubate by thoroughly mixing a mixed solution of the protein and silicon nitride. The mixing conditions are not particularly limited, and examples include mixing by inversion at 4 ° C. for 15 to 30 minutes.

窒化ケイ素の除去は、例えば上記混合液を窒化ケイ素のみが沈降する程度の回転数で遠心分離し上清を回収することによって行うことができる。また、上記混合液を適当なポアサイズのフィルターを用いてろ過することによって行うことができる。ただし、これらの方法に限定されるものではない。回収操作を行うことによって窒化ケイ素と結合していないタンパク質を回収することができる。   The removal of silicon nitride can be performed, for example, by centrifuging the mixed solution at a rotation speed such that only silicon nitride settles and collecting the supernatant. Moreover, it can carry out by filtering the said liquid mixture using the filter of a suitable pore size. However, it is not limited to these methods. By performing the recovery operation, proteins that are not bound to silicon nitride can be recovered.

引き続き添加される酸化ケイ素の量もまた、用いられる反応系に応じて適宜設計され得る。タンパク質溶液に酸化ケイ素を添加した後は、当該タンパク質と酸化ケイ素との混合液を十分混和することによってインキュベートされることが好ましい。混和する条件は特に限定されないが、例えば4℃で15〜30分間転倒混和することが挙げられる。   The amount of silicon oxide subsequently added can also be appropriately designed depending on the reaction system used. After adding silicon oxide to a protein solution, it is preferable to incubate by thoroughly mixing a mixed solution of the protein and silicon oxide. The mixing conditions are not particularly limited, and examples include mixing by inversion at 4 ° C. for 15 to 30 minutes.

酸化ケイ素の回収は、例えば上記混合液を酸化ケイ素のみが沈降する程度の回転数で遠心分離し上清を除くことによって行うことができる。また、上記混合液を適当なポアサイズのフィルターを用いてろ過することによって行うことができる。ただし、これらの方法に限定されるものではない。回収操作を行うことによって酸化ケイ素と結合していないタンパク質を除くことができる。   Recovery of silicon oxide can be performed, for example, by centrifuging the above mixed solution at a rotation speed such that only silicon oxide settles and removing the supernatant. Moreover, it can carry out by filtering the said liquid mixture using the filter of a suitable pore size. However, it is not limited to these methods. By performing the recovery operation, proteins that are not bound to silicon oxide can be removed.

洗浄は、酸化ケイ素と非特異的に弱く結合しているタンパク質を除外するために行う。洗浄方法としては、例えば上記によって回収した酸化ケイ素に少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液を加え、ピペッティング等によって十分混和した後に、上記と同様に遠心分離やフィルターろ過を行う方法が挙げられる。この操作を数回繰り返すことによって洗浄効果が向上する。また、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液を用いて上記タンパク質溶液を調製することで、洗浄効果(非特異的な結合を除外する効果)を向上させることができる。洗浄用の溶液は、特に限定されないが、pH7.5以上、好ましくはpH8以上の緩衝液が好ましい。   Washing is performed to exclude proteins that are nonspecifically weakly bound to silicon oxide. Examples of the washing method include a method in which a solution containing at least 0.1 M sodium chloride is added to the silicon oxide collected as described above and mixed sufficiently by pipetting or the like, followed by centrifugation or filter filtration in the same manner as described above. It is done. By repeating this operation several times, the cleaning effect is improved. Moreover, the washing | cleaning effect (effect which excludes a nonspecific coupling | bonding) can be improved by preparing the said protein solution using the solution containing 0.1 M or more sodium chloride. The solution for washing is not particularly limited, but a buffer solution having a pH of 7.5 or higher, preferably pH 8 or higher is preferable.

酸化ケイ素と結合しているタンパク質を酸化ケイ素から単離する手順としては、例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を用いる方法、pHを低下させる方法、溶液の塩濃度を上げる(塩化ナトリウム濃度を2M程度にする)方法などが挙げられるが、これらに限定されない。   As a procedure for isolating the protein bonded to silicon oxide from silicon oxide, for example, a method using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate, a method of lowering the pH, and increasing the salt concentration of the solution (sodium chloride concentration is 2M). The method is not limited to these.

取得したタンパク質の同定は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、遊離させたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜にトランスファーし、膜をクマシーブリリアントブルーで染色した後、目的タンパク質のバンドを切り出す。切り出したバンドのトリプシン消化物をマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計(MALDI−TOFMS)によって分析し、ペプチドマスフィンガープリント解析によって同定することができ、公知のタンパク質データベースからアミノ酸配列を取得することができる。また、例えば、自動ペプチドシーケンサを用いてアミノ酸配列を決定することができる。   Identification of the acquired protein can be performed using a known method. For example, the liberated proteins are separated by polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, the membrane is stained with Coomassie Brilliant Blue, and then the target protein band is cut out. The tryptic digest of the excised band can be analyzed with a matrix-assisted laser ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS), identified by peptide mass fingerprint analysis, and the amino acid sequence obtained from a known protein database Can do. For example, an amino acid sequence can be determined using an automatic peptide sequencer.

アミノ酸配列が決定すれば、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、公知の遺伝子データベースから取得することができる。また、当該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、プライマーまたはプローブを設計し、当該タンパク質コードするDNA断片をクローニングして、DNAシーケンサを用いて塩基配列を決定することができる。   If the amino acid sequence is determined, the base sequence of the gene encoding the protein can be obtained from, for example, a known gene database. In addition, based on the amino acid sequence of the protein, a primer or probe can be designed, a DNA fragment encoding the protein can be cloned, and the nucleotide sequence can be determined using a DNA sequencer.

上記ポリペプチドが第2ポリペプチドである場合、本発明の方法は、第2ポリペプチドを取得する方法であり得、添加された酸化ケイ素とともにタンパク質溶液をインキュベートする工程、インキュベート後の該溶液から酸化ケイ素を除去する工程、酸化ケイ素を除去したタンパク質溶液を窒化ケイ素とともにインキュベートする工程、窒化ケイ素を回収する工程、回収した窒化ケイ素を洗浄する工程、洗浄後の窒化ケイ素から結合タンパク質を単離する工程を包含することを特徴としている。必要に応じて、酸化ケイ素の添加、および酸化ケイ素とのタンパク質溶液のインキュベートを複数回行ってもよい。また、単離されたタンパク質が酸化ケイ素に結合しないことを確認する工程をさらに包含してもよい。各工程は、上述した第1ポリペプチドを取得する方法を参照すればよい。   When the polypeptide is the second polypeptide, the method of the present invention can be a method of obtaining the second polypeptide, incubating the protein solution with the added silicon oxide, and oxidizing the solution after the incubation. A step of removing silicon, a step of incubating a protein solution from which silicon oxide has been removed with silicon nitride, a step of recovering silicon nitride, a step of washing the recovered silicon nitride, and a step of isolating binding protein from the washed silicon nitride It is characterized by including. If necessary, addition of silicon oxide and incubation of the protein solution with silicon oxide may be performed a plurality of times. Moreover, you may further include the process of confirming that the isolated protein does not couple | bond with a silicon oxide. Each step may refer to the method for obtaining the first polypeptide described above.

なお、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献の全てが、本明細書中にて参考として援用される。   In addition, all the patent documents and nonpatent literatures described in this specification are used as reference in this specification.

本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。   The invention is illustrated in more detail by the following examples, but should not be limited thereto.

〔1:Bacillus cereus胞子タンパク質の抽出〕
R2A液体培地(0.5g/L 酵母エキス、0.5g/L プロテオースペプトン、0.5g/L カザミノ酸、0.5g/L ブドウ糖、0.5g/L 溶性デンプン、0.3g/L KHPO、0.05g/L MgSO・7HO、0.3g/L ピルビン酸ナトリウム、pH 7.2)で培養したBacillus cereus ATCC 14579株をmR2A液体培地(R2A液体培地+0.2mM CaCl、0.01mM MnCl、0.05mM ZnCl、0.05mM FeSO)に1%植菌し、28℃にて28時間培養した。顕微鏡観察にて内生胞子が形成されていることを確認した後、菌体を遠心分離(3,300×g、10分間、4℃)によって回収し、滅菌水で2回洗浄した。
[1: Extraction of Bacillus cereus spore protein]
R2A liquid medium (0.5 g / L yeast extract, 0.5 g / L proteose peptone, 0.5 g / L casamino acid, 0.5 g / L glucose, 0.5 g / L soluble starch, 0.3 g / L K Bacillus cereus ATCC 14579 strain cultured in 2 HPO 4 , 0.05 g / L MgSO 4 .7H 2 O, 0.3 g / L sodium pyruvate, pH 7.2) was added to mR2A liquid medium (R2A liquid medium + 0.2 mM CaCl 2 , 0.01 mM MnCl 2 , 0.05 mM ZnCl 2 , 0.05 mM FeSO 4 ) 1% inoculated, and cultured at 28 ° C. for 28 hours. After confirming the formation of endospores by microscopic observation, the cells were collected by centrifugation (3,300 × g, 10 minutes, 4 ° C.) and washed twice with sterilized water.

得られた菌体(培養液50mL分)を3mLの破砕液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.5mg/mL リゾチーム)で懸濁して氷上で30分間静置した後、超音波処理によって菌体を破砕した。この破砕液を図1における「Whole−cell lysate」とする。その後、遠心分離(3,300×g、10分間、4℃)によって胞子を回収した。この遠心分離の上清を「Mother cell extract」とする。回収した胞子は洗浄液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1mM EDTA)で3回洗浄した。この胞子を3mLの溶解液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、50mM EDTA、8M 尿素)に懸濁して25℃で16時間撹拌し、胞子タンパク質を抽出した。遠心分離(20,000×g、30分間、4℃)によって未溶解の胞子を除去した抽出液に、最終濃度が0.5%になるようにTween 20(登録商標)を添加し、透析用セルロースチューブに入れて500mLの透析液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標)、4M 尿素)に対して4℃で4時間透析した。尿素濃度を段階的に低下させた各透析液(2M、1M、0.5M)に対して同様の透析操作を行った後、遠心分離(20,000×g、30分間、4℃)によって不溶性の夾雑物を除去し、タンパク質抽出液を得た。この抽出液を「Solubilized spore」とする。   The obtained bacterial cells (for 50 mL of the culture solution) were suspended in 3 mL of disrupted solution (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 mg / mL lysozyme) and allowed to stand on ice for 30 minutes. The bacterial cells were crushed by ultrasonic treatment. This crushed liquid is referred to as “Whole-cell lysate” in FIG. Thereafter, the spores were collected by centrifugation (3,300 × g, 10 minutes, 4 ° C.). The supernatant of this centrifugation is referred to as “Mother cell extract”. The collected spores were washed three times with a washing solution (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA). The spores were suspended in 3 mL of a lysate (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 8M urea) and stirred at 25 ° C. for 16 hours to extract spore proteins. Tween 20 (registered trademark) is added to the extract from which undissolved spores have been removed by centrifugation (20,000 × g, 30 minutes, 4 ° C.) so that the final concentration is 0.5%. It put into a cellulose tube, and dialyzed at 4 degreeC for 4 hours with respect to 500 mL dialysate (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1M NaCl, 0.5% Tween 20 (trademark), 4M urea). The same dialysis operation was performed on each dialysate (2M, 1M, 0.5M) whose urea concentration was lowered stepwise, and then insoluble by centrifugation (20,000 × g, 30 minutes, 4 ° C.). The impurities were removed to obtain a protein extract. This extract is called “Solubilized Spore”.

〔2:酸化ケイ素あるいは窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質の探索〕
得られたタンパク質抽出液を、10mgの酸化ケイ素粒子(Silicon dioxide fine powder ca. 0.8μm、添川理化学)または窒化ケイ素粒子(Silicon nitride、80 nm、和光純薬工業)を含む1mLの緩衝液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))に、終濃度0.5mg/mLになるように添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離(5,000×g、2分間)によって各粒子を回収し、洗浄液(緩衝液と同じ組成)で3回洗浄した。各粒子を100μLのSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離(5,000×g、2分間)によって粒子を沈殿させ、上清を回収した。このときの上清をそれぞれ、「SiO−bound」および「Si−bound」とする。得られた各サンプルをSDS−PAGE(15%)に供した。酸化ケイ素結合画分と窒化ケイ素結合画分とを比較して、明確な差が認められたバンド(図1、A)のN末端アミノ酸配列決定を行い、タンパク質を同定した(表1参照)。
[2: Search for proteins that specifically bind to silicon oxide or silicon nitride]
The obtained protein extract was prepared by adding 1 mL of a buffer solution containing 10 mg of silicon oxide particles (Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 μm, Soekawa Riken) or silicon nitride particles (Silicon nitride, 80 nm, Wako Pure Chemical Industries). To 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1M NaCl, 0.5% Tween 20 (registered trademark)) was added to a final concentration of 0.5 mg / mL, and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Then, each particle | grain was collect | recovered by centrifugation (5,000 * g, 2 minutes), and it wash | cleaned 3 times with the washing | cleaning liquid (the same composition as a buffer solution). Each particle was suspended in 100 μL of sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatant was collected. The supernatants at this time are referred to as “SiO 2 -bound” and “Si 3 N 4 -bound”, respectively. Each sample obtained was subjected to SDS-PAGE (15%). The silicon oxide-bound fraction and the silicon nitride-bound fraction were compared to determine the N-terminal amino acid sequence of a band (FIG. 1, A) in which a clear difference was observed, and the protein was identified (see Table 1).

バンドAのタンパク質のアミノ酸配列を配列番号1に、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号2に示す。   The amino acid sequence of the protein of band A is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 2.

〔3:タンパク質溶液の調製〕
タンパク質溶液として、B. cereusの胞子タンパク質抽出液およびEscherichia coliの菌体内タンパク質抽出液を用いた。B. cereusの胞子タンパク質抽出液を、上述した方法と同様に調製し、E. coliの菌体内タンパク質抽出液を以下の方法で調製した。
[3: Preparation of protein solution]
As a protein solution, B.I. Cereus spore protein extract and Escherichia coli intracellular protein extract were used. B. Cereus spore protein extract was prepared in the same manner as described above. An intracellular protein extract of E. coli was prepared by the following method.

2×YT液体培地(16g/L トリプトン、10g/L 酵母エキス、5g/L NaCl)で培養したE. coli MG1655株を、新鮮な2×YT液体培地に1%植菌し、37℃にて12時間培養した。菌体(培養液500mL分)を遠心分離(8,000×g、10分間、4℃)によって回収した後、9.2mLの破砕用バッファー(25mM Tris−HCl、pH 8.0)に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離(40,000×g、30分間、4℃)し、その上清を大腸菌のタンパク質抽出液として回収した。   E. coli cultured in 2 × YT liquid medium (16 g / L tryptone, 10 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl). E. coli MG1655 strain was inoculated 1% in a fresh 2 × YT liquid medium and cultured at 37 ° C. for 12 hours. The cells (500 mL of the culture solution) were collected by centrifugation (8,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) and then suspended in 9.2 mL of disruption buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.0). The bacterial cells were crushed by ultrasonic treatment. The disrupted solution was centrifuged (40,000 × g, 30 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was recovered as a protein extract of Escherichia coli.

〔4:酸化ケイ素あるいは窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質の探索〕
30mgの窒化ケイ素粒子または120mgの酸化ケイ素粒子を含む1mLの緩衝液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))に、各タンパク質抽出液を最終タンパク質濃度1mg/mLになるように添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離(5,000×g、2分間)によって粒子を沈殿させ、各上清を窒化ケイ素未結合画分および酸化ケイ素未結合画分として回収した。
[4: Search for proteins that specifically bind to silicon oxide or silicon nitride]
Each protein extract was added to 1 mL of buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 0.5% Tween 20 (registered trademark)) containing 30 mg of silicon nitride particles or 120 mg of silicon oxide particles. It added so that it might become a final protein concentration of 1 mg / mL, and it mixed for 30 minutes at 25 degreeC. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and each supernatant was recovered as a silicon nitride-unbound fraction and a silicon oxide-unbound fraction.

得られた窒化ケイ素未結合画分に40mgの酸化ケイ素粒子を、酸化ケイ素未結合画分には10mgの窒化ケイ素粒子を添加し、25℃で30分間混合した。各粒子を遠心分離(5,000×g、2分間)によって回収し、洗浄液(緩衝液と同じ組成)で3回洗浄した。その後、各粒子を100μLのSDS−PAGE用のサンプルバッファーで懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。遠心分離(5,000×g、2分間)によって粒子を沈殿させ、上清を回収した。酸化ケイ素粒子より得られた上清は図中の「SiO」に該当する。窒化ケイ素粒子より得られた上清は図中の「Si」に該当する。得られた各サンプルをSDS−PAGE(15%)に供した。酸化ケイ素結合画分と窒化ケイ素結合画分との比較によって明確な差が認められたバンド(図2、B〜J)部分のアクリルアミドゲルを切り出してゲル内トリプシン消化処理を施した後、飛行時間型質量分析によってタンパク質の同定を行った(表2参照)。40 mg of silicon oxide particles were added to the obtained silicon nitride unbonded fraction, and 10 mg of silicon nitride particles were added to the silicon oxide unbonded fraction, and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Each particle was collected by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes) and washed three times with a washing solution (same composition as the buffer solution). Thereafter, each particle was suspended in 100 μL of a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. The particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatant was collected. The supernatant obtained from the silicon oxide particles corresponds to “SiO 2 ” in the figure. The supernatant obtained from the silicon nitride particles corresponds to “Si 3 N 4 ” in the figure. Each sample obtained was subjected to SDS-PAGE (15%). After cutting out the acrylamide gel of the band (FIG. 2, BJ) where a clear difference was recognized by comparing the silicon oxide-bonded fraction and the silicon nitride-bonded fraction, the time of flight was applied. Proteins were identified by type mass spectrometry (see Table 2).

バンドB〜Jのタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3、5、7、9、11、13、15、17および19に、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号4、6、8、10、12、14、16、18および20に示す。   The amino acid sequences of the proteins in bands B to J are shown in SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19, respectively, and the nucleotide sequences that encode these proteins are shown in SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20.

〔5:Bacillus cereusのタンパク質抽出画分の検討〕
酸化ケイ素または窒化ケイ素に特異的に結合するタンパク質を単離するために、胞子中にケイ素を蓄積することが知られているB. cereusをタンパク質のスクリーニング源として用いた。タンパク質抽出画分としてMother cell extract画分およびSolubilized spore画分を用いた。調製方法は上述したとおりである。
[5: Examination of protein extract fraction of Bacillus cereus]
B. known to accumulate silicon in spores to isolate proteins that specifically bind to silicon oxide or silicon nitride. cereus was used as a protein screening source. As the protein extraction fraction, a Mother cell extract fraction and a solubilized pore fraction were used. The preparation method is as described above.

10mgの酸化ケイ素粒子または窒化ケイ素粒子を含む1mLの緩衝液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))に、各抽出画分を最終タンパク質濃度0.5mg/mLになるように添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離(5,000×g、2分間)によって各粒子を回収し、洗浄液(緩衝液と同じ組成)で3回洗浄した。各粒子を100μLのSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して、95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離(5,000×g、2分)によって粒子を沈殿させ、上清を回収した。得られた各サンプルをSDS−PAGE(15%)に供した。   Each extract fraction was added to the final protein in 1 mL of buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 0.5% Tween 20 (registered trademark)) containing 10 mg of silicon oxide particles or silicon nitride particles. It added so that it might become a density | concentration of 0.5 mg / mL, and it mixed for 30 minutes at 25 degreeC. Then, each particle | grain was collect | recovered by centrifugation (5,000 * g, 2 minutes), and it wash | cleaned 3 times with the washing | cleaning liquid (the same composition as a buffer solution). Each particle was suspended in 100 μL of sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatant was collected. Each sample obtained was subjected to SDS-PAGE (15%).

図3にSDS−PAGEの結果を示す。図3中、レーン1はMother cell extract画分、レーン2および3はそれぞれMother cell extract画分から得られる酸化ケイ素結合タンパク質および窒化ケイ素結合タンパク質、レーン4はSolubilized spore画分、レーン5および6はそれぞれSolubilized spore画分から得られる酸化ケイ素結合タンパク質および窒化ケイ素結合タンパク質を示している。   FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE. In FIG. 3, lane 1 is the Mother cell extract fraction, lanes 2 and 3 are the silicon oxide-binding protein and silicon nitride-binding protein obtained from the Mother cell extract fraction, lane 4 is the solubilized sponge fraction, and lanes 5 and 6 are the lanes 5 and 6, respectively. Figure 2 shows silicon oxide binding protein and silicon nitride binding protein obtained from the solubilized sponge fraction.

図3に示すように、Mother cell extract画分から得られた酸化ケイ素結合タンパク質および窒化ケイ素結合タンパク質のバンドパターンには明確な差は見られず、酸化ケイ素あるいは窒化ケイ素に特異的に結合するタンパク質の単離は困難であった(レーン2および3参照)。一方、Solubilized spore画分から得られた酸化ケイ素結合タンパク質および窒化ケイ素結合タンパク質の比較から、酸化ケイ素にのみ特異的に結合するタンパク質(分子量28kDa)が認められた(レーン5および6参照)。   As shown in FIG. 3, there is no clear difference in the band pattern of the silicon oxide-binding protein and silicon nitride-binding protein obtained from the Mother cell extract fraction, and there is no difference in the protein that specifically binds to silicon oxide or silicon nitride. Isolation was difficult (see lanes 2 and 3). On the other hand, from the comparison of the silicon oxide-binding protein and the silicon nitride-binding protein obtained from the solubilized pore fraction, a protein (molecular weight 28 kDa) that specifically binds only to silicon oxide was observed (see lanes 5 and 6).

〔6:酸化ケイ素粒子および窒化ケイ素粒子結合時における塩濃度、界面活性剤、pHの検討〕
10mgの酸化ケイ素粒子あるいは窒化ケイ素粒子を含む1mLの各種緩衝液に、B. cereusのSolubilized spore画分を最終タンパク質濃度0.5mg/mLになるように添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離(5,000×g、2分)によって各粒子を回収し、各種洗浄液(緩衝液と同じ組成)で3回洗浄した。各粒子を100μLのSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離(5,000×g、2分)によって粒子を沈殿させ、上清を回収した。得られた各サンプルをSDS−PAGE(12.5%あるいは15%)に供した。
[6: Examination of salt concentration, surfactant, pH when silicon oxide particles and silicon nitride particles are bonded]
In 1 mL of various buffer solutions containing 10 mg of silicon oxide particles or silicon nitride particles, The cereus solubilized sponge fraction was added to a final protein concentration of 0.5 mg / mL and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Then, each particle | grain was collect | recovered by centrifugation (5,000 * g, 2 minutes), and it wash | cleaned 3 times with various washing | cleaning liquids (the same composition as a buffer solution). Each particle was suspended in 100 μL of sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatant was collected. Each sample obtained was subjected to SDS-PAGE (12.5% or 15%).

図4にSDS−PAGEの結果を示す。図4中、レーン1はSolubilized spore画分、レーン2および3は緩衝液A(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))中で酸化ケイ素および窒化ケイ素に結合するタンパク質、レーン4および5は緩衝液B(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、2M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))中で酸化ケイ素および窒化ケイ素に結合するタンパク質、レーン6および7は緩衝液C(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標), 0.5% CHAPS)中で酸化ケイ素および窒化ケイ素に結合するタンパク質、レーン8および9は緩衝液D(25mM Tris−リンゴ酸(pH 6.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))中で酸化ケイ素および窒化ケイ素に結合するタンパク質を示している。   FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE. In FIG. 4, lane 1 is a solubilized sponge fraction, lanes 2 and 3 are silicon oxides in buffer A (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 0.5% Tween 20 (registered trademark)). And lanes 4 and 5 bind to silicon oxide and silicon nitride in buffer B (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2M NaCl, 0.5% Tween 20®). Bound proteins, lanes 6 and 7 are silicon oxide and nitride in buffer C (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 0.5% Tween 20®, 0.5% CHAPS). Proteins that bind to silicon, lanes 8 and 9 are buffer D (25 mM Tris-malate ( H 6.0), 1M NaCl, shows a 0.5% Tween 20 (TM)) protein that binds to silicon oxide and silicon nitride in.

図4に示すように、各粒子への結合時における緩衝液の塩濃度および界面活性剤の種類による影響はほとんど見られなかった(レーン2〜7参照)。一方、緩衝液のpHを低下させると各粒子に結合するタンパク質が全体的に減少し、窒化ケイ素に特異的に結合するタンパク質が複数認められた。また、前述の分子量28kDaの酸化ケイ素結合タンパク質がほぼ単一のバンドとして確認できた(レーン8および9参照)。   As shown in FIG. 4, there was almost no effect due to the salt concentration of the buffer solution and the type of surfactant during binding to each particle (see lanes 2 to 7). On the other hand, when the pH of the buffer solution was lowered, the protein binding to each particle was reduced overall, and a plurality of proteins specifically binding to silicon nitride were observed. Moreover, the above-mentioned silicon oxide binding protein having a molecular weight of 28 kDa was confirmed as a substantially single band (see lanes 8 and 9).

〔7:酸化ケイ素粒子および窒化ケイ素粒子へのプレ吸着の回数および粒子量の検討〕
特異性がより高いタンパク質を得るために、予めタンパク質溶液と酸化ケイ素粒子とを混合(プレ吸着)して酸化ケイ素粒子に結合しないタンパク質溶液を調製し、そこへ窒化ケイ素粒子を添加および混合することによって、窒化ケイ素粒子に結合するが酸化ケイ素粒子には結合しないタンパク質を探索した。また、逆の操作を行うことで酸化ケイ素粒子に結合するが窒化ケイ素粒子には結合しないタンパク質を探索した。
[7: Examination of frequency and amount of pre-adsorption on silicon oxide particles and silicon nitride particles]
In order to obtain a protein with higher specificity, a protein solution and a silicon oxide particle are mixed in advance (pre-adsorption) to prepare a protein solution that does not bind to the silicon oxide particle, and silicon nitride particles are added and mixed therein. To search for proteins that bind to silicon nitride particles but not to silicon oxide particles. In addition, the reverse operation was performed to search for proteins that bind to silicon oxide particles but not to silicon nitride particles.

任意の量の窒化ケイ素粒子または酸化ケイ素粒子を含む1mLの緩衝液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、1M NaCl、0.5% Tween 20(登録商標))に、E. coliの菌体内タンパク質抽出液(調製方法は「4:酸化ケイ素あるいは窒化ケイ素特異的に結合するタンパク質の探索」の項を参照)を最終タンパク質濃度1mg/mLになるように添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離(5,000×g、2分)によって粒子を沈殿させ、上清をそれぞれ窒化ケイ素未結合画分および酸化ケイ素未結合画分として回収した。必要に応じて、得られた各画分に任意の量の窒化ケイ素粒子または酸化ケイ素粒子を再度添加して、同様の操作を繰り返した。   In 1 mL of buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 M NaCl, 0.5% Tween 20®) containing any amount of silicon nitride particles or silicon oxide particles, E. coli protein extract (see “4: Search for proteins that specifically bind to silicon oxide or silicon nitride” for the preparation method) to a final protein concentration of 1 mg / mL, at 25 ° C. Mix for 30 minutes. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatants were collected as a silicon nitride-unbound fraction and a silicon oxide-unbound fraction, respectively. If necessary, an arbitrary amount of silicon nitride particles or silicon oxide particles was added again to each of the obtained fractions, and the same operation was repeated.

得られた各画分に、それぞれ40mgの酸化ケイ素粒子および10mgの窒化ケイ素粒子を添加し、25℃で30分間混合した。各粒子を遠心分離(5,000×g、2分)によって回収し、洗浄液(緩衝液と同じ組成)で3回洗浄した。その後、各粒子を100μLのSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。遠心分離(5,000×g、2分)によって粒子を沈殿させ、上清を回収した。得られた各サンプルをSDS−PAGE(15%)に供した。   40 mg of silicon oxide particles and 10 mg of silicon nitride particles were added to each of the obtained fractions and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Each particle was collected by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes) and washed three times with a washing solution (same composition as the buffer solution). Thereafter, each particle was suspended in 100 μL of a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. The particles were precipitated by centrifugation (5,000 × g, 2 minutes), and the supernatant was collected. Each sample obtained was subjected to SDS-PAGE (15%).

図5にSDS−PAGEの結果を示す。図5中、レーン1はE. coliの菌体内タンパク質抽出液、レーン2はプレ吸着操作をしていないタンパク質溶液中の酸化ケイ素結合タンパク質、レーン3はプレ吸着操作をしていないタンパク質溶液中の窒化ケイ素結合タンパク質、レーン4は30mgの窒化ケイ素粒子でプレ吸着操作を行ったタンパク質溶液中の酸化ケイ素結合タンパク質、レーン5は30mgの酸化ケイ素粒子でプレ吸着操作を行ったタンパク質溶液中の窒化ケイ素結合タンパク質、レーン6は120mgの酸化ケイ素粒子でプレ吸着操作を行ったタンパク質溶液中の窒化ケイ素結合タンパク質、レーン7は30mgの窒化ケイ素粒子で2回のプレ吸着操作を行ったタンパク質溶液中の酸化ケイ素結合タンパク質、レーン8は120mgの酸化ケイ素粒子で2回のプレ吸着操作を行ったタンパク質溶液中の窒化ケイ素結合タンパク質を示している。   FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE. In FIG. Escherichia coli intracellular protein extract, lane 2 is a silicon oxide-binding protein in a protein solution not subjected to pre-adsorption operation, lane 3 is a silicon nitride-binding protein in a protein solution not subjected to pre-adsorption operation, lane 4 is 30 mg Lane 5 is a silicon oxide-binding protein in a protein solution pre-adsorbed with silicon nitride particles, lane 5 is a silicon nitride-binding protein in a protein solution pre-adsorbed with 30 mg silicon oxide particles, lane 6 is 120 mg oxidized Silicon nitride-binding protein in a protein solution pre-adsorbed with silicon particles, lane 7 is a silicon oxide-binding protein in a protein solution that has been pre-adsorbed twice with 30 mg silicon nitride particles, lane 8 is 120 mg Tan which was pre-adsorbed twice with silicon oxide particles It shows the silicon nitride binding protein click electrolyte solution.

図5に示すように、プレ吸着操作を行うことで大部分のタンパク質を除去でき、その後に混合する粒子への結合タンパク質量を減らすことができた(レーン2〜5参照)。その減少の程度は混合する粒子量および操作回数に依存し、今回のように初期タンパク質量が1mg程度の場合、30mgの窒化ケイ素粒子あるいは120mgの酸化ケイ素粒子で1回のプレ吸着操作を行うことで、SDS−PAGEにおける検出に好適な数のタンパク質のバンドを得ることができた(レーン6〜8参照)。   As shown in FIG. 5, most of the protein could be removed by performing the pre-adsorption operation, and the amount of protein bound to the particles to be mixed thereafter could be reduced (see lanes 2 to 5). The degree of reduction depends on the amount of particles to be mixed and the number of operations. When the initial protein amount is about 1 mg as in this case, one pre-adsorption operation is performed with 30 mg of silicon nitride particles or 120 mg of silicon oxide particles. Thus, a number of protein bands suitable for detection in SDS-PAGE were obtained (see lanes 6 to 8).

〔8:リコンビナントタンパク質を用いた結合特異性試験1〕
図2および表2におけるバンドBのタンパク質(CbpA;配列番号3)をコードする大腸菌cbpA遺伝子(配列番号4)を、pET−21bベクターに挿入し、CbpA発現用ベクターを構築した(pET−CbpA)。また、得られたpET−CbpAにgfp遺伝子を挿入してCbpA−GFP発現用ベクターを構築した(pET−CbpA−GFP)。その後、構築した各プラスミドを発現用宿主E. coli Rosetta2(DE3)pLysS株(Novagen)に導入して形質転換体を取得し、2×YT培地でOD600が0.5になるまで37℃で培養した後に0.5mM IPTGを添加し、さらに20℃で12時間培養することで各タンパク質を大量発現した菌体を得た。各菌体を緩衝液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、0.5% Tween 20)に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、その上清を大腸菌のタンパク質抽出液として回収した。この抽出液を図6(a)における「Cell extract」とする。
[8: Binding specificity test 1 using recombinant protein]
The E. coli cbpA gene (SEQ ID NO: 4) encoding the band B protein (CbpA; SEQ ID NO: 3) in FIG. 2 and Table 2 was inserted into the pET-21b vector to construct a CbpA expression vector (pET-CbpA). . Further, a gfp gene was inserted into the obtained pET-CbpA to construct a vector for CbpA-GFP expression (pET-CbpA-GFP). Thereafter, each constructed plasmid was transformed into the expression host E. coli. E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS strain (Novagen) was introduced to obtain a transformant, cultured in 2 × YT medium at 37 ° C. until OD600 reached 0.5, 0.5 mM IPTG was added, and further 20 By culturing at 12 ° C. for 12 hours, microbial cells expressing a large amount of each protein were obtained. Each cell was suspended in a buffer solution (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Tween 20), and the cell was disrupted by sonication. The disrupted solution was centrifuged, and the supernatant was recovered as an E. coli protein extract. This extract is referred to as “Cell extract” in FIG.

10mgの酸化ケイ素粒子あるいは窒化ケイ素粒子を含む1mLの緩衝液に、緩衝液で適宜希釈したタンパク質抽出液を添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離により各粒子を回収し、緩衝液で3回洗浄した。各粒子をSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離により粒子を沈殿させ、上清を回収した。得られた上清をそれぞれ、図6(a)における「SiO−bound」および「Si−bound」とする。得られた各サンプルをSDS−PAGEに供した。A protein extract appropriately diluted with a buffer solution was added to 1 mL of a buffer solution containing 10 mg of silicon oxide particles or silicon nitride particles, and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Thereafter, each particle was collected by centrifugation and washed three times with a buffer solution. Each particle was suspended in a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. The obtained supernatants are referred to as “SiO 2 -bound” and “Si 3 N 4 -bound” in FIG. Each obtained sample was subjected to SDS-PAGE.

図6(a)から明らかなように、CbpAおよびCbpA−GFP融合タンパク質は酸化ケイ素粒子に特異的に結合した。   As is clear from FIG. 6 (a), CbpA and CbpA-GFP fusion protein specifically bound to silicon oxide particles.

〔9:リコンビナントタンパク質を用いた結合親和性の測定1〕
上述したように調製した細胞破砕液からHisTrapカラム(GE Healthcare)および陰イオン交換カラムを用いて、CbpA−GFP融合タンパク質を精製した。0.1mgの酸化ケイ素粒子を含む0.3mLの反応液(25mM Tris−HCl(pH 8.0)、0.5% Tween 20)に,適宜希釈したタンパク質溶液を添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離により粒子を沈殿させて上清を得た。反応前の蛍光値から反応後上清の蛍光値を引くことで、結合している融合タンパク質量を求めた。得た値からスキャッチャード解析により親和性(Kd)を求めた。
[9: Measurement of binding affinity using recombinant protein 1]
The CbpA-GFP fusion protein was purified from the cell lysate prepared as described above using a HisTrap column (GE Healthcare) and an anion exchange column. An appropriately diluted protein solution is added to 0.3 mL of a reaction solution (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Tween 20) containing 0.1 mg of silicon oxide particles, and then at 25 ° C. for 30 minutes. Mixed. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation to obtain a supernatant. The amount of the fusion protein bound was determined by subtracting the fluorescence value of the supernatant after the reaction from the fluorescence value before the reaction. The affinity (Kd) was determined from the obtained value by Scatchard analysis.

結果を図6(b)に示した。CbpA−GFPの酸化ケイ素粒子に対するKd値は30nMであった。   The results are shown in FIG. The Kd value of CbpA-GFP for the silicon oxide particles was 30 nM.

〔10:リコンビナントタンパク質を用いた結合特異性試験2〕
図2および表2におけるバンドHのタンパク質(TufB;配列番号15)をコードする大腸菌tufB遺伝子(配列番号16)を、pET−21bベクターに挿入し、TufB発現用ベクターを構築した(pET−TufB)。また、得られたpET−TufBにgfp遺伝子を挿入してTufB−GFP発現用ベクターを構築した(pET−TufB−GFP)。その後、構築した各プラスミドを発現用宿主E. coli Rosetta2(DE3)pLysS株(Novagen)に導入して形質転換体を取得し、2×YT培地でOD600が0.5になるまで37℃で培養した後に0.5mM IPTGを添加し、さらに20℃で12時間培養することで各タンパク質を大量発現した菌体を得た。各菌体を破砕用バッファー(25mM Tris−malate(pH 6.0)、0.5% Tween 20)に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離し、その上清を大腸菌のタンパク質抽出液として回収した。この抽出液を図7(a)における「Cell extract」とする。
[10: Binding specificity test 2 using recombinant protein]
The E. coli tufB gene (SEQ ID NO: 16) encoding the band H protein (TufB; SEQ ID NO: 15) in FIG. 2 and Table 2 was inserted into the pET-21b vector to construct a TufB expression vector (pET-TufB). . In addition, a gfp gene was inserted into the obtained pET-TufB to construct a TufB-GFP expression vector (pET-TufB-GFP). Thereafter, each constructed plasmid was transformed into the expression host E. coli. E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS strain (Novagen) was introduced to obtain a transformant, cultured in 2 × YT medium at 37 ° C. until OD600 reached 0.5, 0.5 mM IPTG was added, and further 20 By culturing at 12 ° C. for 12 hours, microbial cells expressing a large amount of each protein were obtained. Each bacterial cell was suspended in a disruption buffer (25 mM Tris-malate (pH 6.0), 0.5% Tween 20), and the bacterial cell was disrupted by ultrasonication. The disrupted solution was centrifuged, and the supernatant was recovered as an E. coli protein extract. This extract is designated as “Cell extract” in FIG.

10mgの酸化ケイ素粒子あるいは窒化ケイ素粒子を含む1mLの反応液(25mM Tris−malate(pH 6.0)、0.5% Tween 20、1M NaCl)に、破砕用バッファーで適宜希釈したタンパク質抽出液を添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離により各粒子を回収し、洗浄用バッファー(反応液と同じ組成)で3回洗浄した。各粒子をSDS−PAGE用のサンプルバッファーに懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離により粒子を沈殿させ、上清を回収した。得られた上清をそれぞれ、図7(a)における「SiO−bound」および「Si−bound」とする。得られた各サンプルをSDS−PAGEに供した。A protein extract solution appropriately diluted with a crushing buffer in 1 mL of a reaction solution (25 mM Tris-malate (pH 6.0), 0.5% Tween 20, 1M NaCl) containing 10 mg of silicon oxide particles or silicon nitride particles. Added and mixed at 25 ° C. for 30 minutes. Thereafter, each particle was collected by centrifugation and washed three times with a washing buffer (same composition as the reaction solution). Each particle was suspended in a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. The obtained supernatants are referred to as “SiO 2 -bound” and “Si 3 N 4 -bound” in FIG. Each obtained sample was subjected to SDS-PAGE.

図7(a)から明らかなように、TufBおよびTufB−GFP融合タンパク質は窒化ケイ素粒子により強く結合した。   As is apparent from FIG. 7 (a), the TufB and TufB-GFP fusion proteins were strongly bound to the silicon nitride particles.

〔11:リコンビナントタンパク質を用いた結合親和性の測定2〕
上述したように調製した細胞破砕液を用いた。0.5mgの窒化ケイ素粒子を含む0.3mLの反応液(25mM Tris−malate(pH 6.0)、0.5% Tween 20、1 M NaCl)に、適宜希釈した細胞破砕液を添加し、25℃で30分間混合した。その後、遠心分離により各粒子を回収し、洗浄用バッファー(反応液と同じ組成)で3回洗浄した。各粒子をSDS−PAGE用のサンプルバッファーで懸濁して95℃で5分間加熱し、粒子に結合したタンパク質を解離させた。その後、遠心分離により粒子を沈殿させて上清を回収し、得られたサンプルをSDS−PAGEに供した。染色後のゲルを画像解析して各タンパク質濃度における粒子への結合量を算出し、結合平衡グラフを得た。
[11: Measurement of binding affinity using a recombinant protein 2]
The cell disruption solution prepared as described above was used. To a 0.3 mL reaction solution (25 mM Tris-malate (pH 6.0), 0.5% Tween 20, 1 M NaCl) containing 0.5 mg of silicon nitride particles, an appropriately diluted cell disruption solution was added, Mix for 30 minutes at 25 ° C. Thereafter, each particle was collected by centrifugation and washed three times with a washing buffer (same composition as the reaction solution). Each particle was suspended in a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to dissociate the protein bound to the particle. Thereafter, the particles were precipitated by centrifugation, the supernatant was collected, and the obtained sample was subjected to SDS-PAGE. The stained gel was subjected to image analysis to calculate the amount of binding to particles at each protein concentration, and a binding equilibrium graph was obtained.

結果を図7(b)に示した。TufB−GFPの窒化ケイ素粒子に対するKd値は159nMであった。   The results are shown in FIG. The Kd value of TufB-GFP for silicon nitride particles was 159 nM.

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention.

本発明は、酸化ケイ素と窒化ケイ素との識別を可能にするので、基板上でのタンパク質の新たなパターニング技術を提供する。このような技術は、半導体の製造に利用することができるとともに、プロテインチップ、ナノバイオデバイス、医薬品などを製造する広範な技術分野に用いることができる。   Since the present invention enables discrimination between silicon oxide and silicon nitride, it provides a new patterning technique for proteins on a substrate. Such a technique can be used for manufacturing semiconductors and can be used in a wide range of technical fields for manufacturing protein chips, nanobiodevices, pharmaceuticals, and the like.

Claims (5)

第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドのいずれか一方を含有しており、
第1ポリペプチドが、
(A)配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)(A)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(C)(A)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
であり、
第2ポリペプチドが、
(D)配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(E)(D)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(F)(D)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
である、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための組成物。
Containing either the first polypeptide or the second polypeptide,
The first polypeptide is
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(B) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (A) and which specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride; or (C) a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (A) and specifically binding to silicon oxide and not binding to silicon nitride;
The second polypeptide is
(D) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19;
(E) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (D) and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide; or (F) Silicon oxide and silicon nitride, which are polypeptides that have 95% or more identity with the polypeptide according to (D) and that specifically bind to silicon nitride and do not bind to silicon oxide. A composition for identifying.
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドの少なくとも一方を備えており、
第1ポリペプチドが、
(A)配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)(A)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(C)(A)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
であり、
第2ポリペプチドが、
(D)配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(E)(D)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(F)(D)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
である、酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するためのキット。
Comprising at least one of a first polypeptide and a second polypeptide;
The first polypeptide is
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(B) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (A) and which specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride; or (C) a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (A) and specifically binding to silicon oxide and not binding to silicon nitride;
The second polypeptide is
(D) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19;
(E) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (D) and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide; or (F) Silicon oxide and silicon nitride, which are polypeptides that have 95% or more identity with the polypeptide according to (D) and that specifically bind to silicon nitride and do not bind to silicon oxide. Kit for identifying.
酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するための組成物を製造するためのキットであって、
第1ポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチド;および
第2ポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチド
の少なくとも一方、あるいは
第1ポリヌクレオチドを含む第1ベクター;および
第2ポリヌクレオチドを含む第2ベクター
の少なくとも一方を備えており、
第1ポリペプチドが、
(A)配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)(A)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(C)(A)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
であり、
第2ポリペプチドが、
(D)配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(E)(D)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(F)(D)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
である、キット。
A kit for producing a composition for distinguishing between silicon oxide and silicon nitride,
A first polynucleotide encoding a first polypeptide; and at least one of a second polynucleotide encoding a second polypeptide, or a first vector comprising the first polynucleotide; and a second vector comprising a second polynucleotide At least one,
The first polypeptide is
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(B) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (A) and which specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride; or (C) a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (A) and specifically binding to silicon oxide and not binding to silicon nitride;
The second polypeptide is
(D) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19;
(E) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (D) and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide; or (F) A kit, which is a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (D) and specifically binding to silicon nitride and not binding to silicon oxide.
酸化ケイ素および窒化ケイ素の少なくとも一方が所望の形状にて形成されている表面を有し、
該酸化ケイ素には、第1ポリペプチドが結合しており、
該窒化ケイ素には、第2ポリペプチドが結合しており、
第1ポリペプチドが、
(A)配列番号1、3、5または7に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)(A)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(C)(A)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、酸化ケイ素に特異的に結合しかつ窒化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
であり、
第2ポリペプチドが、
(D)配列番号9、11、13、15,17または19に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(E)(D)に記載のポリペプチドにおいて1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加しており、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド;あるいは
(F)(D)に記載のポリペプチドと95%以上の同一性を有し、かつ、窒化ケイ素に特異的に結合しかつ酸化ケイ素に結合しない、ポリペプチド
である、基板。
At least one of silicon oxide and silicon nitride has a surface formed in a desired shape;
A first polypeptide is bound to the silicon oxide,
A second polypeptide is bound to the silicon nitride,
The first polypeptide is
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(B) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (A) and which specifically binds to silicon oxide and does not bind to silicon nitride; or (C) a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (A) and specifically binding to silicon oxide and not binding to silicon nitride;
The second polypeptide is
(D) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 or 19;
(E) a polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide according to (D) and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide; or (F) A substrate which is a polypeptide having 95% or more identity with the polypeptide according to (D) and which specifically binds to silicon nitride and does not bind to silicon oxide.
請求項4に記載の基板を具備している、半導体デバイス。   A semiconductor device comprising the substrate according to claim 4.
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