JP5875097B2 - 脂質取り込み抑制剤 - Google Patents
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Description
(2)前記化合物が、抗PCTP-L/StarD10タンパク質抗体;PCTP-L/StarD10の塩基配列に相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド;およびPCTP-L/StarD10のポリヌクレオチドに対するsiRNAもしくはshRNAから選択される、(1)に記載の脂質取り込み抑制剤。
(4)以下の工程(a)〜(c):
(a)被検化合物を対象に投与する工程、
(b)前記対象におけるPCTP-L/StarD10遺伝子の発現量および/またはPCTP-L/StarD10タンパク質の活性を測定する工程、
(c)被検化合物を投与しない場合と比して、前記発現量または活性を変動させる化合物を選択する工程、
を含む、脂質代謝調節化合物のスクリーニング方法。
(a)PCTP-L/StarD10遺伝子を導入した対象に被検化合物を投与する工程、
(b)前記対象における脂肪もしくはその代謝物または胆汁酸もしくはその前駆体の量を測定する工程、
(c)被検化合物を投与しない場合と比して、前記量を変動させる化合物を選択する工程、
を含む、脂質代謝調節化合物のスクリーニング方法。
(7)PCTP-L/StarD10遺伝子の発現量またはPCTP-L/StarD10タンパク質の存在量を測定するための化合物を含む、脂質代謝関連疾患の診断剤。
(10)齧歯類である、(9)に記載の非ヒト動物。
(11)マウスである、(10)に記載の非ヒト動物。
(a)PCTP-L/StarD10遺伝子を導入した幹細胞または肝組織に被検化合物を作用させる工程、
(b)前記対象における脂肪もしくはその代謝物または胆汁酸もしくはその前駆体の量を測定する工程、
(c)被検化合物を投与しない場合と比して、前記量を変動させる化合物を選択する工程、
を含む、脂質代謝調節化合物のスクリーニング方法が提供される。
[実施例1]抗PCTP-L/StarD10抗体の作製
マウスPCTP-L/StarD10の部分配列CIKYPEWKQKHQPHF(aa No. 219-233)およびGAGGEGSDDDTSLT(aa No. 278-291)に相当する2種のペプチドを合成し、アミノ末端側のCysを利用するか、あるいはアミノ末端側にCys(SH基)を付加するMBS法でキャリアタンパク質(キーホールリンペットヘモシアニン:KLH)とコンジュゲーションを施し、これらのペプチドをウサギにカクテル免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。
[α−32P]dCTPの存在下で、PCTP-L/StarD10全長の配列をテンプレートとして、ランダムプライマーを用いてPCRを行うことにより、PCTP-L/StarD10のmRNA検出のプローブを作製した。マウス(Swiss Webster mice、雌雄混合で8−10 週齢)の各組織(心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および精巣)のmRNAを泳動させたメンブレン(Clontech)と作製したプローブとをインキュベートし(68℃、1時間)、洗浄後、メンブレンを露光板に設置して一晩露光させ、陽性バンドを画像解析装置(STORM、Amersham)を用いて検出した。結果を図1に示す。上記の各組織のうち、特に、心臓、肝臓、腎臓および精巣においてPCTP-L/StarD10の発現が顕著であった。
マウスの各臓器を摘出後、RIPAバッファー(50 mmol/L Tris (pH 8.0)、1% ノニデット P-40、150 mmol/L NaCl、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、1 mmol/L PMSF、10 μg/ml アプロチニン、10 μg/ml ロイペプチンおよび 2 mmol/L DTT)を加えてホモジェナイズし、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、PVDF膜に転写した。その後、5%スキムミルクを加えたTBS-T バッファー(2.42 g/L Tris、8 g/L NaCl、1.5 ml/L HCl、1 ml/L Tween20)を用いて室温で1時間ブロッキングした。1次抗体としてウサギ抗PCTP-L/StarD10ポリクローナル抗体(抗ペプチド抗体として実施例1に記載の方法により作製)、2次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham)を用いた。抗体陽性のバンドはECL+plus Western Blotting Detection System(Amersham)を用いた化学発光をLAS-1000 plus(冨士フィルム社製)により検出した。泳動タンパク質の量を正規化するための標準タンパク質としてα-tubulinをマウス抗α-tubulinモノクローナル抗体(clone B-5-1-2, Sigma)およびHRP標識抗マウスIgG抗体(Amersham)を用いて検出した。
結果を図1に示す。PCTP-L/StarD10の発現量は、特に肝臓、腎臓、心房などにおいて顕著であることが確認された。
定法に従いターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターをデザインするに当たり、マウス第7染色体(cytoband 7E2)においてPCTP-L/StarD10の直後にcentaurinδ2(別名:ARAP1)の遺伝子があり、centaurinδ2のプロモーター領域がPCTP-L/StarD10のexon1〜3付近に存在する可能性が考えられたため、ターゲッティング領域をexon4〜6とした。
マウスをペントバルビタールで麻酔し、心臓から0.2%ヘパリン生理食塩水溶(20 ml)を灌流し、続いて4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液(20 ml)を灌流して固定した。肝臓などの各臓器を摘出後、さらに4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液に浸して固定した。ミクロトームで凍結切片とし、1% TritonX-100を含むPBSバッファーで細胞膜に透過性を与える処置を施した。2%のロバ血清でブロッキング処理をし、1次抗体としてウサギ抗PCTP-L/StarD10ポリクローナル抗体、2次抗体としてAlexa Fluor 488 抗ウサギIgG抗体(Invitrogen / Molecular Probes)を用いた。洗浄後に、Hoechst染色を行い、Gel/Mount(Biomeda)を用いてスライドガラスにマウントした。蛍光画像の観察はレーザー共焦点顕微鏡(LSM-510 META、カールツァイス社製)を用いて行った。
全長のPCTP-L/StarD10を緑色蛍光タンパク質(GFP)と同時に発現させるアデノウイルスを作製した。pENTRベクター(Invitrogen)のマルチクローニングサイトの後ろにIRES GFPおよびPCTP-L/StarD10を挿入した。pENTRに挿入されたPCTP-L/StarD10およびIRES GFPをGateway system(Invitrongen)によりアデノウイルス作製ベクターpAd/CMV/V-5 DESTにのせ替えた。このプラスミドを制限酵素Pac Iで切断し、直線化したものをHEK 293A細胞にFugene 6(Roche)によりトランスフェクションしてアデノウイルスを増殖させた。得られたウイルス液を引き続きHEK 293A細胞に感染させることを3回繰り返し、4次ウイルス液を得た。Plaque assayにより力価を測定し、得られたウイルス液が1×108〜1×1010pfu/mlであることを確認した。また、pENTRベクター(Invitrogen)にIRES GFPのみを挿入したこと以外は同様の手法により、GFP発現用アデノウイルスも作製した。
ラット(SD 4-5週齢、雄)をペンタバルビタール(50 mg/kg、腹腔内投与)で麻酔した後、心臓を摘出し、ランゲンドルフ法により24 μg/ml コラゲナーゼ S-1(新田ゼラチン)、100 μg/ml ProteaseXIV(Sigma)を含むCa2+-フリータイロードバッファーを灌流した。心室をCa2+ Joklik 培地(50 μM CaCl2、10 mM HEPESを含むJoklik培地(Sigma)、NaOHによりpH 7.4に調整)に切り落とし、37℃で5分間緩やかに振とうし(45回/分)70 μmのセルストレーナーを通して単離心室筋細胞を得た。30分静置後上清を取り除き、3回Ca2+Joklik 培地で洗浄した後、最後にDMEM 1溶液(2.5% FBS、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM培地)に懸濁した。これをマウスラミニン(Gibco)でコートした15 mm丸形カバーガラスにまき、5% CO2、95% O2通気下37℃で2時間培養後、DMEM 2(100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、10-8 M インスリン、5 mM タウリンを含むGln-フリー DMEM培地(Sigma))に培地交換した。この培地交換と同時にPCTP-L/StarD10のアデノウイルスを300 MOIで感染させた。その後、5% CO2、95% O2通気下37℃で48時間培養し、実施例3および5に記載の方法と同様の手法により、ウエスタンブロット法や細胞免疫染色によりPCTP-L/StarD10の発現を確認した。結果を図8に示す。
1)PCTP-L/StarD10のRNAiコンストラクト
内在性のPCTP-L/StarD10をRNAiによりノックダウンすることを目的として、BLOCK-iTTM U6 RNAi Entry Vector Kit (Invitrogen)を利用してPCTP-L/StarD10のshRNA(short hairpin RNA)コンストラクトを作製した。PCTP-L/StarD10のターゲット配列として塩基配列507番目から始まる21 merのオリゴヌクレオチドと、658番目から始まる21 merのオリゴヌクレオチドを選んだ。その配列がヘアピンを巻くように設計したオリゴヌクレオチド507と658を作製し、RNAi発現ベクターpENTRTM/U6(Invitrogen)に挿入した。
PCTPL RNAi oligo 507 Top
CACCGGATCGAACTCTGCACAAGATCGAAATCTTGTGCAGAGTTCGATCC
PCTPL RNAi oligo 507 Bottom
AAAAGGATCGAACTCTGCACAAGATTTCGATCTTGTGCAGAGTTCGATCC
オリゴヌクレオチド658
PCTPL RNAi oligo 658 Top
CACCGCTGACGTAGGATATTATTCCCGAAGGAATAATATCCTACGTCAGC
PCTPL RNAi oligo 658 Bottom
AAAAGCTGACGTAGGATATTATTCCTTCGGGAATAATATCCTACGTCAGC
得られた各コンストラクトを用いて、大腸菌(DH5a)をトランスフォーメーションし、Maxi Kit(Quiagen社製)によりプラスミドを大量に回収したものを培養細胞へのトランスフェクションに用いた。
上記の方法で得られた507、658のpENTRTM/U6をGateway system(Invitrogen)により、RNAiアデノウイルス作製ベクターpAd/BLOCK-iTTM DEST(Invitrogen)にのせ替え、実施例6のアデノウイルス作製と同様にして507、658それぞれのRNAiアデノウイルスの4次ウイルス液を得た。
新生児ラット(SD系ラット、生後1-2日)を氷温麻酔し、心臓を取り出し、氷冷したPBS中で心室と心房に分けた。心房を1mg/mlのコラゲナーゼ S-1(新田ゼラチン)を含むPBSで10分×3回37℃でインキュベートし、単離された心房筋細胞を70 μmのセルストレーナーを通して回収した。800 rpmで5分遠心し、沈殿にDMEM 1(10% FBS、100 U/ml Penicillin、100 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM培地)7 mlを加え懸濁した。混入している線維芽細胞を除くため、細胞培養用10 cmプレートにまき、5% CO2、95% O2通気下37℃で1時間培養し、接着しなかった細胞を70 μmのセルストレーナーを通して心房筋細胞として回収した。35 mmディッシュ1枚に対し細胞数1×106 cellになるようにし、1 μM Ara Cを加えたDMEM1中で5% CO2、95% O2通気下37℃で24時間培養した。翌日、DMEM 2(100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、10-8 M インスリン、5 mM タウリンを含むGln-フリー DMEM培地(Sigma))に置換した。細胞免疫染色に用いる場合はこのまま5% CO2、95% O2通気下37℃で48時間培養しサンプルとした。RNAiアデノウイルスを感染させる場合、DMEM 2で置換する際に300 MOIになるようにRNAiアデノウイルスを感染させた。5% CO2、95% O2通気下37℃で24時間培養後、新しいDMEM 2に置換し、さらに48時間後、ウエスタンブロット法によりPCTP-L/StarD10の発現を確認した。結果を図9に示す。
[実施例9]PCTP-L/StarD10ノックアウトマウスのメタボローム解析
マウスは東邦大学医学部実験動物センターBS室(Barrier System)にて23℃、12時間ごとの明暗サイクルで飼育した。雄15週齢の野生型(WT)およびPCTP-L/StarD10ノックアウトマウス(KO)を2群に分け、下表に示す普通食または高脂肪食を与えて35週齢まで(20週間)飼育した(普通食WT、高脂肪食WT、普通食KO、高脂肪食KO、各4匹)。餌および水(滅菌水)は自由に取らせた。
図5においては、乾燥における胆汁酸の存在量が、高脂肪食条件下では野生型マウスおよびノックアウトマウスのいずれにおいても減少している一方で、ノックアウトマウスでは普通食条件下でも減少していることが確認された。また、図4においては、胆汁酸の前駆体であるグリココール酸の存在量は、高脂肪食条件下では野生型マウスおよびノックアウトマウスのいずれにおいても極度に減少している一方で、普通食条件下でもノックアウトマウスでは減少していることが確認された。
実施例9の飼育後のマウス血清サンプルをゲルろ過HPLC(high-performance liquid chromatography)を用いてリポタンパク質(カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL)を分離してコレステロールおよびリン脂質の含量を測定した。カイロミクロンおよびVLDL中のコレステロールおよびリン脂質の含量は、普通食および高脂肪食のいずれにおいても減少していることが確認された。
実施例9の飼育後のマウスマウス血清のANP濃度を、ANP Eliza kit(Phoenix Pharmaceuticals, Inc社製)を用いて測定した。結果を図7に示す。グラフは左から野生型マウス(普通食)、ノックアウトマウス(普通食)、野生型マウス(高脂肪食)およびノックアウトマウス(高脂肪食)の結果を示す。野生型マウスにおいては高脂肪食の負荷に対してANP濃度が顕著に上昇するのに対し、ノックアウトマウスにおいては高脂肪食の負荷に対するANPの上昇は確認されなかった。
Claims (9)
- PCTP-L/StarD10タンパク質の活性を抑制する化合物を有効成分として含み、前記化合物が、抗PCTP-L/StarD10タンパク質抗体である、脂質取り込み抑制剤。
- 肥満、脂質異常症、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症および胆石症から選択される疾患の治療または予防に使用される、請求項1または2に記載の脂質取り込み抑制剤。
- 以下の工程(a)〜(c):
(a)被検化合物を対象(ヒトを除く)に投与する工程、
(b)前記対象におけるPCTP-L/StarD10遺伝子の発現量および/またはPCTP-L/StarD10タンパク質の活性を測定する工程、
(c)被検化合物を投与しない場合と比して、前記発現量または活性の変動を確認する工程、
を含む、脂質代謝調節化合物のスクリーニング方法。 - 以下の工程(a)〜(c):
(a)PCTP-L/StarD10遺伝子を導入した対象(ヒトを除く)に被検化合物を投与する工程、
(b)前記対象における脂肪もしくはその代謝物、または胆汁酸もしくはその前駆体の量を測定する工程、
(c)被検化合物を投与しない場合と比して、前記量を変動させる化合物を選択する工程、
を含む、脂質代謝調節化合物のスクリーニング方法。 - 対象が、ウイルスを利用してPCTP-L/StarD10遺伝子を導入した動物細胞である、請求項4に記載の方法。
- PCTP-L/StarD10遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体を含む、脂質代謝関連疾患の診断剤。
- exon4−6をターゲティング領域とするPCTP-L/StarD10遺伝子の機能がノックアウトされた非ヒト動物。
- 齧歯類である、請求項7に記載の非ヒト動物。
- マウスである、請求項8に記載の非ヒト動物。
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