JP5841304B2 - 培養物観察システム - Google Patents

Description

本発明は、培養物の培養状況を顕微鏡画像にて観察することを可能とする培養物観察システムに関するものである。

近年のバイオ、再生医療関連の分野の発達に伴い、インキュベータ（培養手段）を使用して細胞を培養する作業が、増加傾向にある。細胞の培養を促進するためには、それぞれの細胞に適した培養空間を整備する必要があり、従来より、培養空間の温度制御、湿度制御、雰囲気制御を行うインキュベータが開発されている。

特に、培養条件としてＣＯ₂（二酸化炭素）ガス濃度の厳格な濃度条件を要求する細胞の培養を行い場合には、温度制御及び湿度制御を行うものに加えて、培養空間のＣＯ₂ガス濃度を制御可能とするＣＯ₂インキュベータが用いられている。

一方、当該細胞の培養状態を観察する場合には、該ＣＯ₂インキュベータにおいて培養されている細胞等のサンプルをインキュベータから取り出し、他の位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡、更には、蛍光顕微鏡などにおいて観察した後、再度、培養を継続するため、インキュベータ内に戻される。

しかしながら、細胞の培養状態を観察するたびに、ＣＯ₂インキュベータ内から取り出されると、細胞の培養条件が変化してしまい、場合によっては細胞が死滅してしまうなど、適切な培養を行うことが困難となる。そこで、ＣＯ₂インキュベータ内において細胞の培養を継続しながら、観察することを可能とする培養顕微鏡が開発されている（特許文献１参照）。

この培養顕微鏡は、細胞を培養するインキュベータ室と細胞を観察する顕微鏡部分が一体となって構成されており、インキュベータ室内に配設される回転ベースには、試料容器を設置するトレイが配設されている。トレイは、複数の試料設置穴を有し、回転ベースを回転制御することで、それぞれの試料容器内に収容される試料を顕微鏡を構成する対物レンズから観察可能とされている。

また、顕微鏡室には、照明用のＬＥＤやＣＣＤカメラなどが設置されており、試料からの光は、対物レンズ、倍率変更レンズ等を介してＣＣＤカメラに入射される。ＣＣＤカメラにて撮影されている画像は、コンピュータに取り込まれ、当該コンピュータに接続されるディスプレイにてリアルタイムで表示されている。
特開２００６−１１４１５号公報

しかしながら、上述した如き培養顕微鏡では、細胞を培養するインキュベータ室には、回転ベース上に試料容器を設置する場所が設けられているのみであったため、培養可能とする試料の数（実際には試料を保有する容器の数）が限られていた。

そこで、顕微鏡によって培養状況を観察する細胞等の培養物と同様の条件にて培養を行う他の培養物も同一の装置によって培養することを可能とする装置の開発が望まれている。他方、培養顕微鏡の下部には、インキュベータ室の下方に顕微鏡以外にも光源を収容するための顕微鏡室が形成されているため、培養物の収容量に対し、装置が大型化する問題があった。

また、インキュベータ室内に、観察対象となる培養物以外の培養物を収容する場合には、観察対象となる培養物は、回転ベースに設けられるヒータ（ステージヒータ）によって所定温度に加熱されるが、その他の培養物、即ち、回転ベース上以外のインキュベータ室内に設置される培養物は、インキュベータ室内の温度を制御するためのヒータによって所定温度に加熱されることとなる。これらヒータは独立して制御されることで、所定温度に維持されるが、回転ベース上の温度がインキュベータ室内の温度よりも高いと、回転ベース上に設置される試料容器の上部に結露が発生し、当該結露によって、培養物の観察が不能となってしまう問題が生じる。

そこで、本発明は、従来の技術的課題を解決するためになされたものであり、観察対象となる培養物以外の培養物も培養可能とすることができ、また、当該他の培養物の培養を行いつつ、顕微鏡によって適切に観察することを可能とする培養物観察システムを提供する。

本発明の培養物観察システムは、開閉自在な培養室内に温度及びガス濃度が制御された環境を構成する培養庫と、培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像装置とを備え、撮像対象の培養物と非対象の培養物とを同時に培養室内で培養可能としたものであって、撮像装置は、培養室内に設けられ、撮像対象となる培養物が透光性の容器に収納された状態で保持されるテーブルを備えると共に、培養室内を温める庫内ヒータと、テーブルを温めるステージヒータと、培養室内の温度を検出する庫内温度センサと、テーブルの温度を検出するステージ温度センサと、培養室内の温度及びテーブルの温度を制御する制御手段が設けられ、該制御手段は、庫内温度センサの計測値に基づき、ステージヒータとは独立して庫内ヒータを制御することにより、培養室内の温度を制御すると共に、庫内温度センサとステージ温度センサの計測値に基づき、テーブルの温度を培養室内の温度以下に制御することを特徴とする。

請求項２の発明の培養物観察システムは、上記発明において透光性の容器は、その下部がテーブルに接触した状態で当該テーブルに保持されることを特徴とする。

本発明によれば、開閉自在な培養室内に温度及びガス濃度が制御された環境を構成する培養庫と、培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像装置とを備え、撮像対象の培養物と非対象の培養物とを同時に培養室内で培養可能とした培養物観察システムであって、撮像装置は、培養室内に設けられ、撮像対象となる培養物が透光性の容器に収納された状態で保持されるテーブルを備えると共に、培養室内を温める庫内ヒータと、テーブルを温めるステージヒータと、培養室内の温度を検出する庫内温度センサと、テーブルの温度を検出するステージ温度センサと、培養室内の温度及びテーブルの温度を制御する制御手段が設けられ、該制御手段は、庫内温度センサの計測値に基づき、ステージヒータとは独立して庫内ヒータを制御することにより、培養室内の温度を制御すると共に、庫内温度センサとステージ温度センサの計測値に基づき、テーブルの温度を培養室内の温度以下に制御することにより、テーブルに保持された容器に収納された培養物を培養しつつ、当該容器内面に結露が発生してしまう不都合を抑制することが可能となる。

これにより、当該容器を介して行われる培養物の撮影に結露が邪魔となる不都合を回避することが可能となり、適切な培養物の観察を実行することが可能となる。また、撮像対象の培養物とそれ以外の非対象の培養物とを同時に培養室内で培養することができる利点がある。

特に、請求項２の発明の如く透光性の容器の下部がテーブルに接触した状態で当該容器がテーブルに保持される場合、容器上部の温度（培養室内の空気温度に近似）がテーブルに接触する容器下部の温度（テーブルの温度に近似）より低くなることで、容器内面に結露が発生し易くなる。

このような場合に、本発明の如くテーブルの温度を培養室内の温度以下に制御することで容器内面への結露を効果的に回避することが可能となる。

次に、図面を参照して本発明の実施形態について詳述する。図１は本発明を適用した培養物観察システムＳを構成する培養物観察装置１の部分透視正面図、図２は図１の培養物観察装置１の側面図、図３は図１の培養物観察装置１の縦断側面図、図４は図１の培養物観察装置１の横断平面図、図５は培養物観察システムＳを構成する制御装置の電気ブロック図をそれぞれ示している。

本実施例の培養物観察システムＳは、培養物として例えば、受精卵内に存在する未分化な幹細胞（所謂ＥＳ細胞）である胚性幹細胞や、既にできあがった体内の各器官に存在する未分化な幹細胞、例えば造血幹細胞や神経管細胞などの体性幹細胞等の再生医療等に用いられる細胞のみならず、受精卵などの細胞の培養操作に用いられるシステムであり、培養しつつ、該培養状況を観察可能とするシステムである。

培養物観察システムＳは、培養物としての細胞（以下、培養物として細胞を例に挙げて説明する）の培養に適した環境を構成するための培養庫（培養手段）２と、細胞の顕微鏡画像を撮影するための撮像装置（撮像手段）３と、撮像装置３により撮影された顕微鏡画像を表示するためのディスプレイ（表示手段）４と、これら培養庫２、撮像装置３及びディスプレイ４を制御する制御手段としてのコンピュータ５とを備えるものである。このうち、培養庫２と、撮像装置３により図１に示す如き培養物観察装置１が構成され、コンピュータ５は、汎用のマイクロコンピュータにより構成されるＰＣなどから構成される。

培養物観察装置１は、例えば一面（本実施例では前面）に開口１０を有する断熱性の箱体により本体１２が構成されており、この本体２内（庫内）上部には、培養庫２を構成する培養室１３が形成されている。また、この培養室１３の下方に位置する本体１２内下部には、撮像装置３が配設される撮像室６が形成されている。

そして、本体１２には、前面開口１０を開閉自在に閉塞するための内扉１４が設けられていると共に、更に、内扉１４の外方に位置して断熱扉１５が設けられている。内扉１４は、内部を透視可能とする透明ガラス板などにより構成されており、断熱扉１５を開放し、内扉１４を閉鎖した状態で、培養室１３内を視認可能とされる。また、断熱扉１５の前面には、コントロールパネル１６が設けられていると共に、該断熱扉１５の裏面外周縁には、内扉１４の端面より外側に位置してガスケット１７が取り付けられている。これにより、培養室１３は、外部から密閉可能とされる。

培養室１３を構成する本体１２内壁面には、所定間隔を存して熱良導性の区画壁２０が配設されている。この区画壁２０は、培養室１３を構成する全面、即ち、天面、底面、左右側面、背面に位置して配設されており、当該区画壁２０と本体１２内壁面との間には、庫内ヒータ１９（図５のみ図示する）が配設されている。尚、培養室１３の下方には、撮像装置３が配設されているため、培養室１３の底面は、当該撮像装置３が設けられている部分を除く部分に庫内ヒータ１９が配設されているものとする。また、扉１５を閉じた状態で、培養室１３の前面を構成する断熱扉１５の背面にも、扉ヒータ１８（図５のみ図示する）が配設されている。これにより、培養室１３は、区画壁２０及び内扉１４を介して間接的に六面すべての面から加熱可能とされている。

また、培養室１３の左右側壁を構成する各区画壁２０には、内方に突出して図示しない棚架設部が複数段形成されており、当該棚架設部には、熱良導性、且つ、複数の連通穴が形成される棚板（棚）７が着脱可能に複数段架設されている。尚、詳細は後述する如く、当該培養室１３内後部には、光源４７が配設されているため、本実施例では、棚板７の後端は光源４７の前面より前方となるように架設可能とされているが、これに限定されるものではなく、培養室１３を構成する背面に近接する位置まで延在し、光源４７に対応する位置は、該光源４７を回避する形状（断面Ｕ字状の切欠）としてもよい。

一方、本体１２には、培養室１３内と連通するようにガス供給口２３が設けられており、当該ガス供給口２３には、図示しないガス供給管が接続されている。このガス供給管には、ＣＯ₂ガス電磁弁２４を介してＣＯ₂ガスボンベが接続されている（ＣＯ₂ガス供給手段）と共に、Ｏ₂ガス電磁弁２５を介してＯ₂ガスボンベ（Ｏ₂ガス供給手段）が接続されている。それのガスボンベには、所定純度以上のガスが封入されているものとする。各電磁弁２４、２５は、詳細は後述する培養庫側制御装置Ｃ１にて開閉制御される。尚、当該ガス供給管は、湿度調整手段を備えていても良く、これによって、所定のＣＯ₂濃度、Ｏ₂濃度、湿度のガスを培養室１３に供給可能としても良い。また、本実施例では、ＣＯ₂ガス、Ｏ₂ガスの両者を供給可能としているが、ＣＯ₂ガスのみを供給可能としても良い。

また、本体１２内には、培養室１３の空気温度を検出するための庫内温度センサ２６と、培養室１３のＣＯ₂ガス濃度を検出するためのＣＯ₂ガス濃度センサ２７、培養室１３のＯ₂ガス濃度を検出するためのＯ₂ガス濃度センサ２８が設けられている。これらセンサ２６、２７、２８は、いずれも培養庫側制御装置Ｃ１に接続されており、これらセンサの検出に基づき、上記庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５が制御され、詳細は後述する如く設定された培養環境の温度やガス濃度が制御される。尚、本体１２には、培養室１３内の不要な空気を排出するための排気口２９が設けられており、培養室１３内からの排気が可能とされている。

本体１２内には、培養室１３内の空気を撹拌し、空気の状態を均一とするための図示しない送風機が設けられている。この送風機は送風機用モータ３２により作動するものであり、該送風機用モータ３２は、培養庫側制御装置Ｃ１により制御される。

他方、この本体１２内に形成される培養室１３内には、詳細は後述する撮像室６内に配設される倍率変更レンズ等のレンズ３５やＣＣＤカメラ３６等と共に撮像装置３を構成するテーブル３７が配設されている。このテーブル３７は、熱良導性の材料にて構成されると共に、図４に示されるように本実施例では平面略円形を呈した板状部材である。該テーブル３７には、細胞等の試料を収容した試料容器４２を複数設置するため連通して形成される孔４３が複数形成されている。本実施例では、６個の孔４３が所定間隔を存して形成されると共に、これら孔４３は、いずれもテーブル中心から所定寸法を存して形成される。

試料容器４２は、少なくとも底面及び上面が透光性を有する容器、例えば、透明のガラス又は樹脂製にて構成されており、光源４７からの照射光を透過し、対物レンズ４４により内容物を観察可能なものとされている。また、この試料容器４２の開口は、通気性を有するフィルタを備えた蓋部材にて閉塞可能とされており、容器４２内の湿度、ガス濃度を培養室１３内と同様とすることができる。

また、テーブル３７の中心には、熱良導性材料にて構成される回転軸３８が取り付けられている。この回転軸３８は、一端が撮像室６内に配設される回転移動用ステージモータ３９（図５のみ図示する）に接続され、当該ステージモータ３９の駆動により、水平方向に回転可能とされる。また、この回転軸３８は、直線移動用のステージモータ４０によって、一方向、本実施例では、前後方向に移動可能とされている。これにより、回転移動、直線移動によってテーブル３７を移動させることで、テーブル３７に設置された試料容器４２内の細胞等を移動させることができる。

撮像室６の内側面（実施例では前壁、両側壁の内面）には、ステージヒータ４１が取り付けられており、回転軸３８の一端に取り付けられて撮像室６の直上に位置する熱良導性のテーブル３７を所定の温度に加熱することが可能とされる。尚、テーブル３７には、該テーブル３７の温度を検出するためのステージ温度センサ４６が取り付けられている。

そして、テーブル３７は配設される培養室１３と、撮像装置３が配設される撮像室６内とは、仕切壁４５にて区画されており、培養室１３内の調整された空気が撮像室６内に進入しないように密閉構造とされている。

テーブル３７の下方には、仕切壁４５を介して撮像室６側から突出して対物レンズ４４が設けられている。この対物レンズ４４は、テーブル３７の孔４３に設置された試料容器４２内の細胞等を観察可能とするものであり、回転軸３８（テーブル中心）から所定間隔を存した位置、即ち、孔４３が形成される位置に対応する位置に設けられる。そして、当該対物レンズ４４に対向する位置（対物レンズ４４の上方）には、撮像装置３を構成する光源４７がアーム４８を介して培養室１３内に位置する本体１２に設けられている。

本実施例における光源４７は、ＬＥＤ照明が用いられており、培養室１３内に上下に延在して配設され、上方から対物レンズ４４と該光源４７の照射孔との間に位置する細胞等を照明する。尚、光源４７は、ＬＥＤ照明に限定されるものではなく、例えば水銀ランプや光ファイバーなどであっても良いものとする。

尚、本実施例では、テーブル３７の上方の培養室１３には、複数段の棚板７・・が架設可能とされることから、光源４７は、前面開口１０から行われる培養物（容器に収容された状態の細胞など）の納出作業の邪魔とならない位置、本実施例では培養空間後部に配置されるものとする。また、光源４７の照射孔に対向して設けられる対物レンズ４４も同様に、培養空間後部に位置して配設されるものとする。

そして、これら対物レンズ４４と、光源４７と、テーブル３７と共に、撮像装置３を構成する倍率変更レンズ３５やＣＣＤカメラ３６等は、上述した如きモータ３９、４０と共に、撮像室６内に配設される。尚、当該対物レンズ４４や倍率変更レンズ３５、ＣＣＤカメラ３６等により構成される撮像システムについては、従来の構造と同様のものであるため、詳細な説明は省略する。

次に、図５の電気ブロック図を参照して、本実施例における培養物観察システムＳの制御システム（制御手段）について説明する。上述したように培養物観察システムＳは、培養室１３に培養環境を構成する培養庫２と、該培養庫２内（培養室１３内）において培養される細胞等（培養物）の撮像を実行する撮像装置３とを備えた培養物観察装置１と、該培養物観察装置１と通信線により接続されるコンピュータ５とから構成される。培養物観察装置１は、培養庫側制御装置Ｃ１と、撮像装置側制御装置Ｃ２を備えている。

培養庫側制御装置Ｃ１の入力側には、庫内温度センサ２６、ＣＯ₂ガス濃度センサ２７、Ｏ₂ガス濃度センサ２８、ステージ温度センサ４６、コントロールパネル１６が接続され、出力側には、庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ステージヒータ４１、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５及び送風モータ３２が接続されている。また、培養庫側制御装置Ｃ１には、コンピュータ５とデータ通信を実行するための通信線５０が接続されている。また、培養庫側制御装置Ｃ１は、メモリ５３を内蔵しており、コンピュータ５からの出力及びコントロールパネル１６の操作に基づく出力に基づいて、各設定値をメモリ５３に保存可能とし、当該設定値に基づいて培養室１３の温度、ガス濃度及びテーブル３７の温度が制御される。また、各温度データやガス濃度データは、培養庫側制御装置Ｃ１により、コンピュータ５へ出力される。

撮像装置側制御装置Ｃ２の出力側には、撮像装置３を構成するレンズ３５、ＣＣＤカメラ３６、ステージモータ３９、４０、光源４７等が接続される。また、撮像装置側制御装置Ｃ２には、コンピュータ５とデータ通信を実行するための通信線５１（画像取込用通信線、制御用通信線などから構成される）が接続されている。これにより、コンピュータ５からの出力に基づいて、観察する座標移動や光源２７による照射ＯＮ／ＯＦＦ、輝度調整、ＣＣＤカメラ３６による画像取込などの制御が行われる。また、観察する座標位置データや光源の輝度データは、撮像装置側制御装置Ｃ２により、コンピュータ５へ出力される。

コンピュータ５は、培養物観察装置１の制御及び各種データの取込、そのデータの参照・保存を可能とするアプリケーションプログラム（記憶手段としてのメモリ９を内臓）を備えており、接続されるディスプレイ４の表示画面に各種データや取得画像（顕微鏡画像）を表示可能とする。各種設定は、ディスプレイ４に表示される画面に従って、数値入力や決定操作を行うことによって実行することが可能とされる。また、コンピュータ５には、操作手段としてマウス８が接続されている。

次に、本実施例の培養物観察システムＳの動作について説明する。コントロールパネル１６、又は、コンピュータ５を操作することにより、培養室１３における培養条件、ＯＮ実施例では、庫内温度、庫内ＣＯ₂ガス濃度、Ｏ₂ガス濃度を設定する。ここでは、庫内温度は＋３７．０℃、ＣＯ₂ガス濃度は５．０％、Ｏ₂ガス濃度は５．０％とする。

これに基づき培養庫側制御装置Ｃ１は、庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ステージヒータ４１の通電制御を行い、培養室１３及びテーブル３７の温度を設定温度である＋３７．０℃に維持する。具体的には、庫内温度センサ２６が＋３６．５℃に低下した場合に、庫内ヒータ１９及び扉ヒータ１８を通電し、＋３７．５℃に上昇した場合に庫内ヒータ１９及び扉ヒータ１８を非通電とする。また、ステージ温度センサ４６が＋３６．５℃に低下した場合に、ステージヒータ４１を通電し、＋３７．５℃に上昇した場合にステージヒータ４１を非通電とする。

このように、庫内ヒータ１９と扉ヒータ１８は、ステージヒータ４１とは独立して温度制御が行われる。この場合において、本実施例では、培養庫側制御装置Ｃ１は、テーブル３７の温度を培養室１３内の温度以下であって、培養物としての細胞の培養に適した温度に制御する。即ち、制御装置Ｃ１は、テーブル３７の温度を培養室１３内の温度と同じか、若しくは、培養室１３内の温度よりも低く、且つ、細胞の培養に適した温度（本実施例では＋３６．５℃）より高い温度となるように制御を行う。

これにより、常に培養室１３内の空気温度をテーブル３７の温度以上とすることが可能となる。従って、テーブル３７の孔４３に設置された試料容器４２上部の温度（培養室１３内の空気温度に近似）がテーブル３７に接触する試料容器４２下部の温度（テーブル３７の温度に近似）より低くなることで、試料容器４２内面に結露が発生する不都合を回避することが可能となる。

そのため、テーブル３７に設置された試料容器４２内の細胞の培養に適した温度を維持しつつ、容器内面に発生する結露を回避することが可能となるため、該結露により、試料容器４２を介して行われる細胞の撮影に結露が邪魔となる不都合を回避することができる。これによって、テーブル３７上に設置された細胞を適切に観察することが可能となる。

また、培養庫側制御装置Ｃ１は、ＣＯ₂ガス濃度センサ２７及びＯ₂ガス濃度センサ２８により検出される培養室１３内の各ガス濃度（ＣＯ₂ガス濃度、Ｏ₂ガス濃度）に基づき、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５の開閉制御を行い、培養室１３内を設定ガス濃度（本実施例では、ＣＯ₂ガス濃度は５．０％、Ｏ₂ガス濃度は５．０％）に維持する。

これにより、培養室１３内は、上述した如く設定された温度、ガス濃度等とすることが可能となる。そのため、培養室１３内に設けられるテーブル３７の各孔４３に細胞等を収容した各試料容器４２を設置することで、当該培養条件によって、該細胞の培養を行うことが可能となる。尚、当該テーブル３７に設置された細胞等は、詳細は後述する如く撮像装置３によって、観察可能とされる。また、本実施例では、培養室１３内に複数の棚板７が架設されていることから、当該棚板７に培養物（細胞等）を収容した容器を載置することで、同培養条件によって、該細胞の培養を行うことが可能となる。

従って、撮像装置３による観察対象とされる細胞（培養物）以外の他の細胞（培養物）も同一の装置によって培養することが可能となる。これにより、一度に培養可能とされる細胞（培養物）の収容量拡大を図ることが可能となる。また、格別に培養を行うためだけの装置、即ち、撮像装置を備えていないＣＯ₂インキュベータを設置することなく、培養のみ、及び、培養しつつ該培養状況の観察の両者を実行することが可能となり、利便性の向上を図ることが可能となる。

次に、上記培養条件によって培養が行われている細胞（培養物）の撮像（観察）動作について、図６乃至図１０を参照して説明する。撮像装置３は、コンピュータ５からの出力に基づき制御されるため、以下、コンピュータ５に接続されるディスプレイ４の表示画面に従って、コンピュータ５で実行されるコンピュータプログラムについて説明する。

先ず初めに、コンピュータ５は、コンピュータプログラムを起動することで、ディスプレイ４の表示画面には、図１０に示すような「細胞観察システム」の初期画面が表示される。この「細胞観察システム」の初期画面に表示される「観察設定」を選択し、当該「観察設定」内における図示しない「撮影ポイントの設定」を選択することにより、図６に示されるような「撮影ポイントの設定画面」が表示され、当該画面において、撮影ポイントの設定を行う。この「撮影ポイントの設定画面」には、「撮影ポイントの設定」、「現在位置の画像情報」、「現在位置」などが表示される。

「現在位置の画像情報」には、現在のＣＣＤカメラ３６により撮影された顕微鏡画像が表示される（リアルタイム表示）。「現在位置の画像情報」には、テーブル３７全体の表示に対する現在の撮影位置が表示される。本実施例では、撮像装置３にて撮影される観察対象は、テーブル３７の６つの孔４３に設置される試料容器４２内の細胞である。「現在位置表示」に示すように、テーブル３７は３０°単位で区画される１２ステージで構成されているものとし、「現在位置の画像情報」として、各ステージＮｏ．、Ｘ座標、Ｙ座標、Ｚ座標が表示されると共に、大まかな現在の撮影位置が「＋」として表示される。

ここで、Ｘ座標、Ｙ座標は、テーブル３７を回転移動用ステージモータ３９によって回転駆動、若しくは、直線移動用ステージモータ４０を駆動させることで移動される量（移動量）によって決定されるものであり、Ｚ座標は、対物レンズ４４を上下に移動させることで移動される量（移動量）によって決定されるものである。尚、これら各座標は、画面上の「ステージ初期化」ボタンを操作することで、原点を決定することができ、これに対する移動量を計算することで、現在撮影される位置（移動位置）が決定される。

また、現在撮影位置は、「撮影ポイントの設定画面」に表示される「Ｘ／Ｙ移動」、及び「Ｆｏｃｕｓ」の各矢印ボタンを操作することで、任意に撮影位置を移動させることが可能となる。尚、制御装置Ｃ２は、当該ボタン操作に基づき、各ステージモータ３９、４０等を駆動し、テーブル３７を回転若しくは、前後移動させることで、テーブル３７上の細胞を任意に対物レンズ４４にて観察可能な位置に移動する。

ここで、「Ｆｏｃｕｓ」とは、対物レンズ４４を上下に移動させるボタンであり、０から＋５及び−５段階に分けて移動させることが可能である。これによって、撮影対象となる細胞のピントを任意に選択することが可能となる。また、「ＡＦ」ボタンは、オートフォーカスボタンであり、当該ボタンを操作することによって、自動で対物レンズ４４を上下に移動させ、鮮鋭度の高いＺ座標（位置）の検出してフォーカス（焦点を合わせる）する。

このとき、コンピュータ５は、制御装置Ｃ２を介して対物レンズ４４を上限値から下限値まで移動させ、各Ｚ座標（各位置）における鮮鋭度を検出する。そして、所定の鮮鋭度以上のＺ座標を鮮鋭度と共にメモリ９に記憶する。そして、オートフォーカス終了時には、最も鮮鋭度の高かったＺ座標（位置）においてフォーカス（焦点を合わせ）した顕微鏡画像を「現在位置の画像情報」に表示する。

この「ＡＦ」ボタンの例えば上下には、図示しない「上ＡＦ」ボタン及び／又は「下ＡＦ」ボタンを設ける。「下ＡＦ」ボタンを操作することにより、「現在位置の画像情報」には、メモリ９に記憶されている次に鮮鋭度の高い画像（オートフォーカス操作終了直後の状態では、最も鮮鋭度の高い画像が表示されていたため、次に表示される画像は、二番目に高い鮮鋭度のＺ座標における顕微鏡画像となる）が表示される。

更に「下ＡＦ」ボタンを操作することにより、順次、メモリ９に記憶されている鮮鋭度の低い画像が表示される。尚、「上ＡＦ」ボタンを操作することにより、現在表示されている顕微鏡画像よりも鮮鋭度の高い顕微鏡画像を「現在位置の画像情報」に表示する。

例えば、図１１に示される試料容器４２内には、蓋部分（上面内壁）に水滴や細胞が付着しており、容器４２の底面に細胞がある。この他にも、培地等の液面に細胞があり、培地（液中）に細胞が浮遊している。当該試料容器４２内の細胞を観察対象とし、オートフォーカスボタンを操作すると、複数点、本実施例では６箇所において所定の鮮鋭度以上の座標が取得され、メモリ９に記憶された。ここで、最も鮮鋭度の高かったＺ座標（位置）における顕微鏡画像は、培地等の液面にある細胞を観察したものであり、二番目に鮮鋭度の高かったＺ座標（位置）における顕微鏡画像は、容器４２底面にある細胞を観察したものであった。また、三番目、五番目、六番目のものは培地中に浮遊する細胞を観察したものであり、四番目のものは容器４２の上面内壁に付着した水滴や細胞を観察したものであった。

そのため、オートフォーカス操作終了後における「現在位置の画像情報」には、鮮鋭度の最も高かった培地等の液面にある細胞を観察した顕微鏡画像が表示される。その後、「下ＡＦ」ボタンを操作することにより、「現在位置の画像情報」には、次に鮮鋭度の高かった容器４２底面にある細胞を観察した顕微鏡画像が表示される。更に、「下ＡＦ」ボタンを操作すると、「現在位置の画像情報」には、順次鮮鋭度に応じて顕微鏡画像が表示される。「上ＡＦ」ボタンを操作すると、現在表示されている「現在位置の画像情報」における顕微鏡画像に次いで鮮鋭度の高い顕微鏡画像が表示される。

尚、何れかの鮮鋭度の高いＺ座標に移動した状態で、更に、「Ｆｏｕｃｕｓ」の各矢印ボタンを操作することで、設定された単位ごとに０から＋５及び−５段階に分けて移動させることが可能である。

これにより、同一の撮影位置における奥行き方向に対し、複数の撮像面に対する鮮鋭度の高いＺ座標を自動で検出することが可能となるため、容易にそれぞれのＺ座標における撮影ポイントを選択することが可能となる。そのため、奥行き方向の異なる位置における複数の培養物等の顕微鏡画像を容易に観察することが可能となる。

また、オートフォーカスの操作によって得られた最も鮮鋭度の高い顕微鏡画像のみならず、それよりも低く、且つ所定の鮮鋭度以上の顕微鏡画像を、「上下ＡＦ」ボタンを操作することで、直接表示することが可能となるため、観察対象となる培養物を容易に撮影することが可能となり、利便性が向上される。

通常、所定のＺ座標において撮影された顕微鏡画像には、当該Ｚ座標面上に位置する観察物が鮮明に表示され、これよりも奥行き方向に位置する物体は殆ど表示されない。また、オートフォーカス機能では、最も鮮鋭度の高いＺ座標における顕微鏡画像を直接検出し、フォーカスすることが可能であるが、それよりも低く、且つ所定の鮮鋭度以上の顕微鏡画像を得ることは困難であった。そのため、オートフォーカス機能によって得られた顕微鏡画像では、目的とする細胞が表示されない場合がある。この場合には、オートフォーカス機能を使用することはできず、任意にＺ座標（位置）を移動させ、目的とする細胞を検索しなけばならない。

これに対し、本実施例では、所定の鮮鋭度以上の複数の顕微鏡画像を検出し、フォーカスする機能を備えており、各顕微鏡画像は、「上ＡＦ」「下ＡＦ」ボタンを操作することによって、任意にディスプレイ４の表示画面に表示することが可能となる。これにより、「上ＡＦ」「下ＡＦ」ボタンの操作によって表示される複数の顕微鏡画像から、目的とする観察対象物（細胞）を選択することが可能となる。これにより、観察ポイントの設定操作が簡素化される。

また、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸の各移動を操作する矢印ボタンは、移動量の比較的大きな粗動ボタンと、移動量の比較的小さな微動ボタンの両者を備えている。これら粗動ボタン及び微動ボタンは、「撮影ポイントの設定画面」に表示される「座標移動量の設定」ボタンを操作することで、図７に示す「座標移動量の設定画面」を表示し、当該画面において各移動量単位を設定することが可能となる。この「座標移動量の設定画面」では、「Ｘ軸ステージターン移動量」、「Ｙ軸ステージスライド移動量」、「Ｚ軸フォーカス移動量」のそれぞれについて、粗動ボタン及び微動ボタンを一度操作した際の移動量を数値入力することで設定することができる。尚、本実施例では、各Ｘ座標、Ｙ座標、Ｚ座標は、各ステージモータ３９、４０及び対物レンズ４４を上下動するモータによって変更されるものであり、これらモータはパルス制御によって移動量制御を行うことから、パルス数値にて設定を行う。これにより、観察座標を決定に際し、効率的に座標移動を行うことが可能となる。

また、「撮影ポイントの設定画面」では、「現在位置の画像情報」領域の任意の位置（任意の座標）にマウスカーソル位置移動させ、その状態で、コンピュータ５に接続されるマウス８の左ボタンをダブルクリックすることにより、当該選択位置を「現在位置の画像情報」領域の中央に移動（図８の状態）させる、即ち、当該座標を画像表示領域の中央となるように座標を移動させることが可能となる。これにより、「現在位置の画像情報」領域に、観察対象とする細胞を中央に移動させた顕微鏡画像を表示することが可能となり、観察環境を整備することが可能となる。

更に、この「撮影ポイントの設定画面」では、「現在位置の画像情報」領域内にマウスカーソル位置を移動させ、その状態でマウス８の右ボタンを一度クリックすることにより、「現在位置の画像情報」領域（顕微鏡画像内）にＸ軸とＹ軸のそれぞれのスケール表示を行う十字型スケールが表示される（図９）。この十字型スケールは、Ｘ軸、Ｙ軸共に、例えば、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍごとに、異なる長さ（本実施例では、スケールが大きくなる程長く表示される）の目盛りが表示される。尚、このスケール表示に付される目盛りの単位は、これに限定されるものではなく、同画面において、任意に変更して、例えば、２０μｍ、１００μｍ、２００μｍのように表示可能としても良い。

このスケール表示の原点（Ｘ軸とＹ軸の交点）は、マウス８を操作することにより、表示画面上のマウスカーソル位置を中心に移動可能とされる。そのため、「現在位置の画像情報」領域に表示される任意の細胞の近傍（特定の位置）にスケール表示を移動させることにより、一目で観察対象である細胞の寸法を確認することが可能となる。従って、観察対象である細胞の大体の寸法を推測に依拠することなくスケール表示により確認することが可能となり、適切な細胞（細胞培養）観察を実現することが可能となる。

また、このスケール表示は、撮像装置３によって観察される光学的に可変とされる倍率（撮影倍率）や、ディスプレイ４の表示画面の大きさなどによって変更する。また、コンピュータ５に撮像装置３から取得された画像（顕微鏡画像）をデジタル処理することによって、表示倍率を変更とした場合においても、当該表示画面に表示される大きさに応じてスケール表示の目盛り単位を変更する。表示倍率が大きくなった場合には、スケール表示の各目盛り単位当たりの大きさ（寸法）を大きく表示し、表示倍率が小さくなった場合には、スケール表示の各目盛り単位当たりの大きさ（寸法）を小さく表示する。

そのため、撮像装置３による撮影倍率が変更された場合や、表示倍率が変更された場合であっても、適切なスケール表示を実現することが可能となり、観察対象となる細胞の大体の寸法をより適切に把握することが可能となる。

尚、このスケール表示は、もう一度、マウス８を右クリックすることで、表示位置を固定することが可能であり、更にもう一度右クリックすることで、スケール表示を非表示（解除）することができる。

他方、「撮影ポイントの設定画面」に表示される「撮影ポイントの設定」には、「試料選択」、「使用ステージＮｏ．」、「撮影ポイントの選択」、「Ｚ−Ｓｔａｃｋ」「ＬＥＤ調光」、「白黒／カラー」の選択が表示されている。

「試料選択」には、予め登録された試料名が表示される。図６における表示では、試料名は「１ ＡＡＡ」であり、使用ステージＮｏ．は１２である。そして、「現在位置の画像情報」において、示された現在の撮影位置を撮影ポイントとして登録することが可能であり、「撮影ポイントの選択」には、登録Ｎｏ．ごとに、各撮影ポイントのＸ、Ｙ、Ｚ座標が表示される。

また、「Ｚ−Ｓｔａｃｋ」では、詳細は後述するタイムラプス撮影の観察座標ごとに、各撮影座標（ＸＹ座標）に対するフォーカス（Ｚ座標）を±５ポイントで登録でき、またその間隔距離も設定できる。「ＬＥＤ調光」では、同様にタイムラプス撮影の観察座標ごとに、光源４７であるＬＥＤの輝度設定が可能であり、「白黒」を選択又は非選択とすることで、タイムラプス撮影の観察座標ごとに、撮影形態として白黒であるかカラーであるかを設定することができる。

また、ステージＮｏ．を指定し、そのステージ基点への移動が可能である。また、「選択中の撮影Ｐｔ．への移動」ボタンを操作することによって、予め選択されていた撮影ポイントに直接移動することも可能である。尚、この選択された後の撮影ポイントは、「撮影ポイントの設定」において、Ｘ、Ｙ、Ｚ座標が詳細に表示される。

上述した如き「撮影ポイントの設定画面」において、撮影ポイントを設定した後、当該設定画面が閉じられると、コンピュータ５は、前記「細胞観察システム」画面をディスプレイ４に表示する。そして、この「細胞観察システム」画面に表示される「観察設定」を選択し、当該「観察設定」内における図示しない「観察条件」を選択することにより、図示しない「観察条件入力画面」を表示し、当該画面において、タイムラプスを使用した観察を行うための撮影条件を入力する。

タイムラプス撮影とは、所定の時間間隔で自動的に撮影し、撮影した顕微鏡画像をコンピュータ５のメモリ９に記録する機能であり、生きた細胞の時間的な変化を観察するために適したものである。

この「観察条件入力画面」では、上記「撮影ポイントの設定画面」において設定された各「撮影ポイント」ごとに複数若しくは、単数の撮影時間を設定することが可能である。タイムラプス機能を使用した撮影では、特に、複数の撮影ポイントが同時に設定される多点タイムラプスでは、撮影後におけるステージ移動（テーブル３７の移動）時間や、撮影時間、カメラの露出時間が影響するため、タイムラプスのインターバル時間を考慮して設定が行われるものとする。

「観察条件入力画面」において、撮影条件が設定された後、当該設定画面が閉じられると、コンピュータ５は、前記「細胞観察システム」画面を表示する。そして、設定された撮影条件に従って、コンピュータ５が制御され、これにより、各設定された撮影時間に、設定された撮影ポイントにおける撮影が行われる。

コンピュータ５は、撮影された顕微鏡画像を、撮影日付（撮影時刻）、当該時間における培養庫側制御装置Ｃ１から出力される各温度データ（庫内温度、ステージ温度）、各ガス濃度データ（ＣＯ₂ガス濃度、Ｏ₂ガス濃度）等の培養環境に関する情報と対応させてメモリ９に保存する。

メモリ９に保存された顕微鏡画像、撮影日付、培養環境に関する情報は、「細胞観察システム」画面の「細胞画像シート」において、各顕微鏡画像に対応させて表示される。これにより、タイムラプス撮影において、撮影された各顕微鏡画像を培養環境に関する情報と共に、表示することが可能となるため、それぞれの顕微鏡画像に対応する培養情報を適切に確認することができ、観察資料としての信頼性の向上を図ることが可能となる。

また、当該「細胞観察システム」画面における顕微鏡画像の表示においても、上記「撮影ポイントの設定画面」における「現在位置の画像情報」の表示と同様に、スケール表示を行うことを可能とする。これにより、保存されている顕微鏡画像についても、観察対象である細胞の大体の寸法を推測に依拠することなくスケール表示により確認することが可能となり、適切な細胞（細胞培養）観察を実現することが可能となる。

本発明を適用した培養物観察システムを構成する培養物観察装置の部分透視正面図である。 図１の培養物観察装置の側面図である。 図１の培養物観察装置の縦断側面図である。 図１の培養物観察装置の横断平面図である。 培養物観察システムを構成する制御装置の電気ブロック図である。 ディスプレイに表示される「撮影ポイントの設定」画面を示す図である。 ディスプレイに表示される「座標移動量の設定」画面を示す図である。 ディスプレイに表示される「撮影ポイントの設定」画面を示す図である。 ディスプレイに表示される「撮影ポイントの設定」画面を示す図である。 ディスプレイに表示される「細胞観察システム」画面を示す図である。 試料容器と鮮鋭度との関係を示す図である。

Claims (2)

1. 開閉自在な培養室内に温度及びガス濃度が制御された環境を構成する培養庫と、
   前記培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像装置とを備え、撮像対象の培養物と非対象の培養物とを同時に前記培養室内で培養可能とした培養物観察システムにおいて、
   前記撮像装置は、前記培養室内に設けられ、撮像対象となる前記培養物が透光性の容器に収納された状態で保持されるテーブルを備えると共に、
   前記培養室内を温める庫内ヒータと、前記テーブルを温めるステージヒータと、前記培養室内の温度を検出する庫内温度センサと、前記テーブルの温度を検出するステージ温度センサと、前記培養室内の温度及び前記テーブルの温度を制御する制御手段が設けられ、
   該制御手段は、前記庫内温度センサの計測値に基づき、前記ステージヒータとは独立して前記庫内ヒータを制御することにより、前記培養室内の温度を制御すると共に、
   前記庫内温度センサと前記ステージ温度センサの計測値に基づき、前記テーブルの温度を前記培養室内の温度以下に制御することを特徴とする培養物観察システム。
2. 前記透光性の容器は、その下部が前記テーブルに接触した状態で当該テーブルに保持されることを特徴とする請求項１に記載の培養物観察システム。

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